JP4543168B2 - 海水または海水土壌の生物毒性評価方法 - Google Patents
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石橋信義, 相場聡, 一戸稔, 神崎菜摘, 工藤博恵, 白山義久, 多田功, 名和行文, 長谷川英男, 二井一禎, 真宮靖治, 丸山治彦, 水久保隆之, 三輪錠司, 吉賀豊司 (2003) 線虫の生物学 東京大学出版会 上野俊一, 奥谷喬司 :朝日百科動物たちの地球第二巻無脊椎動物, 1994, pages 94-96 Kamal J. Elnabris (2003) Biological and Ecotoxicological Studieson Free-living Marine Nematodes 九州大学農学部博士論文 若林明子 (2000) 化学物質と生態毒性 社団法人 産業環境環境管理協会 Blaxter, M. L., P. De Ley, J. R. Garey, L. X. Liu, P. Scheldeman, A. Vierstraete, J. R. Vanfleteren, L. Y. Mackey, M. Dorris, L. M. Frisse, J. T. Vida and W. K. Thomas (1998) A molecular evolutionary framework for the phylum Nematode. Nature, 392 : 71-75 Litvaitis, M. K., J. W. Bates, W. D. Hope and T. Moens (2000) Inferring a classification of the Adenophorea (Nematode) from nucleotide sequence of the D3-expansion segment (26/28S rDNA) Can. J. Zool. 78 : 911-922 Litvaitis, M. K., G. Nunn, K. Thomas and T. D. Kocher (1994) A molecular approach for the identification of meiofaunal turbellarians (Platyhelminthes, Turbellaria) Mar. Biol. 120 : 437-442 Nadler, S. A. (1992) Phylogeny of Some Ascaridoid Nematodes, Inferred from Comparison of 18S and 28S rDNA Sequences Mol. Biol. Evol. 19 : 932-94 Fitch, D. H. A., Bugaj-Gaweda, B. and Emmons, S. H. (1994) 18S Ribosomal RNA Gene Phylogeny for Some Rhabditidad Related to Caenorhabditis Mol. Biol. Evol. 12(2) : 346-358 Dorris, M., De Ley, P. and Blaxter M. L. (1999) Molecular Analysis of Nematode Diversity and the Evolution of Parasitism Parasitology Today 15(5) : 188-193 Boyd, A. W. and Williams, L. P. (2003) Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests Environmental Toxicology and Chemistry: Vol. 22, No. 11, pp. 2768 2774. 井上英(2003)海域における有機スズの分布と二枚貝の再生産への影響に関する研究九州大学農学部博士論文 Bogeart, T., Sanoiloff, M. R., and Persoone, G. (1984) Determination the toxicity of four heavy metal compounds and three carcinogens using two marine nematode species , Monohystera microphthalma and Diplolaimella bruciei. In Ecotoxicological testing for the marine environment, pp. 21-30. Ed. By G. Persoone, E. Jasper and C. Cluas Belgium. State University Ghent and Inst. Mar. Sci. Res. Bredene. Howell, R. (1984) Acute Toxicity of Heavy Metals to Two Species of Marine Nematodes Mar. Environ. Res. 11: 153-161 Tietjen, J. H. and Lee, J. J. (1984) The use of Free-Living Nematodes as a Bioassay for Estuarine Sediments Mar. Environ. Res. 11: 233-251 Vranken, G., Vanderhaeghen, R., Van Brussel, D., Heip, C. and Hermans, D., (1984) The toxicity on mercury no the free-living nematode Monohystera disjuncta Bastian, 1885. In, Ecotoxicological Testing for the Marine Environment, Vol. 2, edited by G.persoone et al., State University, Ghent and Inst. Mar. Sci. Res., Bredene, Belgium. 271-291 Vranken, G., Vanderhaeghen, R. & Heip, C. (1985) Toxicity ofcadmium to free-living marine and brackish water nematodes (Monhystera microphthalma, Monhystera disjuncta, Pellioditis marina). Dis. Aquat. Organisms 1: 49 58. Vranken, G., and Heip, C. (1986) Toxicity of Copper, Mercury and Lead to a Marine Nematode Mar. Pollut. Bull. 17(10): 453-457 Vranken, G., Vanderhaeghen, R. & Heip, C. (1991). Effects ofpollutants on life-history parameters of the marine nematode Monhystera disjuncta. J. Mar. Sci. 48: 325-334. 内海誓一郎, 鈴木啓介, 坪田博行, 野田春彦, 妹尾学, 吉田章一郎 (1974) 共立化学ライブラリー(7) 水−生命のふるさと−共立出版株式会社
本発明はさらに、海水および/または海域底質の汚染度の評価方法、特に化学物質による汚染度の評価方法を提供する。
(1) 汚染物質の有無を試験すべき試料および汚染物質を含まない対照試料を用意する;
(2) 海産自由生活性線虫をその餌の存在下に培養して、好ましくは世代サイクルを同調させる;
(3) 工程(2) で世代サイクルを同調させた線虫を、工程(1) で用意した試験試料または対照試料および該線虫の餌と共に、該線虫の生育に適する条件で培養する;
(4) 試験試料の存在下に培養した線虫の世代サイクルおよび生態を観察し、対照試料の存在下に培養した正常な世代サイクルで増殖する線虫に対して、生態および/または世代サイクル時間に異常があるか判断する;
(5) 工程(4) で異常がない場合に試験試料は汚染物質を含まないと判定し、相違がある場合に該試料は汚染物質を含むと判定する。
線形動物門は伝統的な形態分類学的に、側尾腺phasmid と呼ばれる尾部に見られる器官の有無で、幻器綱Secernentea と尾腺綱Adenophorea に大別される。また、それに加えDe Man's ratioや双器amphidの形態や位置、口腔buccal cavity の形態、オスの尾部の形態、また生態学的・行動学的特徴などにより分類が行われている。しかし、1)多様性に富み、種数は1 億種を超えるとも言われている、2)一般的に体が小さく体の構造自体見づらい、と言った線形動物門の一般的な特徴や、3)線虫の分類を出来る熟練した研究者が少ない、4)線虫の形態学的特徴を示した文献・参考資料が少ない、などと言った問題がありその分類は非常に困難である(非特許文献1)。
材料と方法
供試生物
福岡県宗像郡津屋崎町恋の浦より採集・単離・培養に成功し、形態学的特徴により同定を行った海産自由生活性バクテリア食性線虫Pellioditis marina ssp. 、および珪藻食性線虫3種、それぞれProchromadorella sp.1 、Prochromadorella sp.2 、Neochromadora sp. を供試生物として用いた。これらの線虫の形態を図1に示す。
Total DNA の抽出
バクテリア食性線虫
線虫が十分に繁殖したアガー培地に滅菌ASW(The artificial sea water Aquamarine, Yashida pure chemicals, Osaka, Japan)を注ぎ線虫を浮遊さた。その後15mlプラスチックチューブ(Falcon)にASW を回収し、3000rpm 、10分間遠心分離を行い、線虫を回収した。回収した線虫からスクロース洗浄(Sulston and Hodgkin, 1988 )を改良した方法(図2)によりバクテリアの除去を行い線虫のペレットを得た。これをサンプルとしてDneasyTM Tissue Kit(QIAGEN) を用いてtotal DNA の抽出を行った。
珪藻食性線虫
海産植物プランクトン培地である改変SWM‐IIIにより線虫、数千個体が得られるまで大量培養を行った。その後、線虫を培地ごと15mlプラスチックチューブに移し、3000rpm 10分間遠心分離を行い、線虫及び珪藻を回収した。32℃にインキュベートしておいた0.8 % low melting point agaroseを線虫、珪藻を含む培地と等量加え、よく混合し10cm2 のプラスチック製シャーレ(Falcon)の端に静かに注ぎ、アガロースを固めた。その後、何も含有しない0.4 %low melting agarose で線虫、珪藻の入ったアガロースを覆った。10mLの滅菌ASW をシャーレに注ぎ35rpm で振とうし、線虫をASW 中に移動させた。大量に線虫を含んだASW を15mlファルコンチューブに回収し、3000rpm 、10分間遠心分離する事により珪藻を除去し、線虫のペレットを得た。その後、DneasyTM Tissue Kit(QIAGEN) を用いてtotal DNA の抽出を行った。
PCR 法による28S 、18S rRNA遺伝子断片の増幅
マイクロチューブに10μl の10×PCR buffer、10μl の10mM dNTP mixture、68.5μl のddH2O 、5 μl の20μM primer (図3、表1) 、1 μl のサンプル(ng/μl)、0.5 μl のTaq polymeraseを入れ、よく混合した。
ブロムフェノールブルー(BPB) とPCR 反応終了液を1:5の割合で混合し、1.5 %アガロースゲルに注入した。1×TAE (Tris-HCl, Sodium acetate, EDTA)buffer内で100V、30min 電気泳動し、ゲルをエチジウムブロミド溶液(0.5 μl /ml)に30min 浸し、トランスイルミネ―ター上で遺伝子断片の確認を行った。
目的遺伝子断片のサブクローニングおよびプラスミド精製
サブクローニングはTOPO TA Cloning Kit for Sequencing( インビトロゲン社) を用い行った。目的の遺伝子断片の増幅が確認されたPCR 反応終了液を直接ライゲーション反応溶液に混合しover night、室温でインキュベートして目的遺伝子断片のライゲーションを行い、ライゲーション反応終了液をコンピテントセル(Escherichia coli)にトランスフォーメーションした。その後、LB培地( アンピシリン+) に E. coliを植え継ぎ、37℃、over nightインキュベーションしE. coli のコロニーの生育を確認した。生育したE. coli のコロニーをPCR 反応溶液に混合し、上記PCR 条件でDirect PCRを行った後、電気泳動を行いE. coli 中に目的遺伝子断片が存在するか確認を行った。目的遺伝子断片が確認されたE. coli は液体LB培地9ml により大量培養し、QIAGEN Plasmid Mini Kit(QIAGEN社) を用いプラスミド精製を行いサイクルシーケンス反応のサンプルとした。
サイクルシーケンス反応(ジデオキシ法)
0.2ml マイクロチューブに、精製したプラスミド溶液、1.6pM PCR プライマー、BigDyeTMPrimer v3.0 cycle Sequencing Ready Reaction Kit(ABI 社) を4 μl 入れ、滅菌水で全量を10μl にした。その後、プログラムテンプコントロールシステム(PC −701)を用い、96℃ 30sec、50℃ 15sec、60℃ 4min を25サイクル、サイクルシーケンス反応を行い、イソプロパノール沈殿を行った後、デジケーター内で反応物を真空乾燥した。乾燥した反応物に4 μl のローディングバッファー(50mg /ml濃度のブルーデキストランを含んだ25mM EDTA 1 μl とFormamid 5μl の混液) を加えよく混合し、ローディングサンプルとした。
塩基配列の解読
377 オートシーケンサー(ABI社) を用いてローディングサンプルの塩基配列を解読し、SeqEd プログラム(version1.0.3 ;ABI) を用いて5’および3’の両末端方向から解読した塩基配列より最終的な配列を決定した。
解析および遺伝距離の測定
得られた塩基配列および国立遺伝学研究所のDNA データーベースより集めた線虫の塩基配列はClustal W を用いて配列のアライメントを行い、系統解析はPHYLIPを用いて行った。
結果
28S rDNA
実験の結果P. marina ssp.の28S rDNA 295bpの塩基配列を決定し、そのGC含量は52.5%であった(表2)。また、GenBank のBLAST を用い塩基配列の同一性の検索を行った結果Pellioditis marina marina (AF210415)と99.0%で最も高い同一性を示した。両者はバクテリア食で食性が一致しており、形態学的特徴も非常に類似していた(図4、表3)。また、近隣結合法(NJ法)による分子系統樹においてもP. marina marinaが最も近縁種であり、ブーツストラップ値も100 回中100 と分岐が有意であることが確認された(図5)。
実験の結果P. marina ssp.の18S rDNA 1692bp の塩基配列を決定し、そのGC含量は46.6%であった(表2)。また、GenBank のBLAST を用い塩基配列の相同性の検索を行った結果Pellioditis marina mediterranea (AF083020)と97.9%と同一性が最も高く、次いでP. marina marina(AF210415)と96.7%の同一性を示し、これら3 種はバクテリア食で食性が一致し、形態学的特徴も非常に類似していた(図6、表3)。また、近隣結合法による分子系統樹においても、P. marina mediterranea、P. marina marinaと近縁種であり、ブーツストラップ値もP. marina ssp.とP. marina mediterraneaで100 回中100 、その2 種のクラスターとP. marina marinaで99と分岐が有意であることが確認された(図7)。
考察
本研究により得られた塩基配列を用いて、塩基配列の相同性の検索を行った結果、同一の塩基配列を有する線虫は存在しなかった。また、分子系統樹においても分岐が支持された。今回の分子系統樹を作成した結果、バクテリア食性線虫、珪藻食性線虫ともに、それぞれ食性および形態学的特徴の近い線虫が近縁種として確認された。
実施例2. 珪藻−珪藻食性線虫培養系を用いた底質の毒性評価法への応用−1
(重金属(Cd、Cu)を添加した底質を用いた毒性試験)
方法
供試生物
福岡県津屋崎町恋の浦より採取し単離、培養に成功した珪藻食性海産自由生活性線虫Prochromadorella sp.1 および、その餌である付着珪藻Cylindrotheca closteriumの混合培養系を用いた(図8)。
供試底質
福岡県津屋崎町恋の浦より採集してきた底質(砂質)を送風定温乾燥器(Constant temperature oven DK-42, Yamato Scientific Co.,Ltd., Tokyo, Japan) にて100 ℃、24時間、乾燥処理したものを用いた。
毒性物質の作成
本試験で、CdとしてCdCl2.2・1/2 H2O (Wako Pure Chemical Industries, Tokyo, Japan)、またCuとしてCuCl2.2H2O(Wako Pure Chemical Industries, Tokyo, Japan)を用いた。各物質とも脱イオン水により5,000mg/L の濃度のstock solutionを作成した後、希釈し試験に使用した。
世代サイクルの同調
75cmの細胞培養フラスコ(Iwaki Scitech Divison, Asahi Techno Glass, Tokyo, Japan)にて、培地SWM −III 、餌として付着珪藻C. closterium を用い、継代培養を行っているProchromadorella sp.が十分に繁殖した後、僅かに培地が残るように静かに培地の上清を捨てた。その後フラスコをよく振り線虫を集め、25cm細胞培養フラスコ(Iwaki Scitech Divison, Asahi Techno Glass, Tokyo, Japan)に線虫を集めた。12時間、25℃でインキュベーションし線虫が卵を産卵した後、フラスコを激しく振り、線虫を含む培地を捨てた。この作業を何回か繰り返して、卵だけを残し線虫をフラスコから取り除いた。この時、卵はフラスコ底の表面にしっかりと付着しているため捨ててしまう事はない。また、フラスコの中に残った線虫がないかどうかを顕微鏡下で確認し、線虫が確認されたときはプラスチック製のinoculation loopを用い線虫を取り除いた。
試験培地の作成
卵のみになったフラスコにC. closterium を十分に含有するSWM −III を10ml加えた。その後、CdおよびCuを添加した底質を加えた。CdおよびCu濃度はともに(0.15, 0.31, 0.62, 1.25, 2.5, 5.0 mg/L )になるよう調整した。また、control 区として底質を加えない区、sediment control区として重金属を添加していない底質を加えた区を作成した。また、各濃度区とも、3回繰り返して実験を行った。
毒性の評価方法
本試験の毒性評価の方法として、25℃で培養した線虫の世代時間(約半数の卵が孵化し成虫になり次世代の卵を産み、その卵が孵化するまでの時間)を用いた(図9)。また、線虫の状態および餌である珪藻の状態の観察を行った。
重金属濃度、pHおよびECの測定
試験が終了した後の培地10mlをポアサイズ0.45μm メンブレンフィルター(MILLIPORE) により濾過し、分析用硝酸を1 〜2 滴加えバクテリアの増殖を防ぎ保存した。その後、重金属濃度は原子吸光分光光度計(Atomic absorption flame emission AA-670 , Shimadzu Co , Kyoto , Japan )を、pH はpHメーター(Compact pH meter B-212 ,HORIBA ,Ltd , Kyoto, Japan)、ECは伝導率計(Conductivity meter B-173 , HORIBA ,Ltd , Kyoto,Japan)を用い測定を行った。
結果
培地中の重金属濃度の実測値を表6、7に示す。重金属暴露試験においてCdの無作用濃度(NOEC)は0.31 mg/Lであり、最小影響濃度(LOEC )は0.62mg/Lであった。0.62mg/L区から世代時間が6.5 日から7.0 日に延長し、1.25mg/L区で7.0 、7.5 日に延長すること確認され、濃度の上昇に伴い世代時間が延長した。また、2.5mg/L 区で、成虫まで成長する線虫は確認されたものの次世代の卵および線虫は確認されず、5.0mg/L 区で成虫まで成長する線虫は確認されなかった(表8)。
(実環境中の底質を用いた毒性試験)
方法
供試底質
福岡県宗像郡津屋崎町恋の浦沿岸、熊本県玉名郡長洲町有明海沖合(造船所前)、福岡県糸島郡二丈町福吉港内、福岡県福岡市西区唐泊港内、長崎県長崎市長崎港内(造船所前)より採集してきた底質を送風定温乾燥器(Constant temperature oven DK-42 , Yamato Scientific Co.,Ltd. , Tokyo , Japan)により100 ℃、24時間、乾燥処理したものを用いた。
TBT 濃度の測定
TBT 濃度は井上(2003)の方法に従い行った(非特許文献12)。まず、約1 g の堆積物試料を50mL 遠心分離管に入れ,内部標準物質として1 μg ずつのTBTCl-d27 を添加した後,1 M 塩酸含有メタノールおよび0.1%トロポロン含有ヘキサンを加えて振とう抽出を2 回行なった。抽出液は窒素気流下で濃縮し,5 %テトラエチルホウ酸ナトリウム水溶液にてエチル化を行い,フロリジルカートリッジによりクリーンアップを行い,窒素気流下で濃縮を経て,質量選択検出器付ガスクロマトグラフィー(GC-MS )でTBT を測定した。GC-MS はHewlett Packard 社製(Avondale, PA,USA) HP6890 型GCに同社製質量選択検出器(MS)HP5973を装備したものを使用した。TBT 濃度の算出はTBT ピークのエリア面積とTBTCl-d27 のエリア面積を比較することにより行った。
結果
各試験区における培地含有Cd、Cu濃度および底質含有TBT 濃度を測定した結果を(表10)に示す。Cd濃度が顕著に高い試験区はなかったが、Cu濃度およびTBT 濃度はそれぞれ福吉港内(0.4, 17 ppm)、唐泊港内(0.8, 31ppm)および長崎港内(0.7, 64ppm)と非常に高かった。また、汚染が検出されなかった津屋崎の底質ではコントロール区と比較し世代時間の延長は起こらず、Cd、Cu、TBT それぞれ0.01、0.02、0.01ppm と僅かに汚染が確認された有明海の底質では世代時間が1 日延長した。しかし、CuおよびTBT 濃度の高い福吉、唐泊および長崎港内の底質を用いた毒性試験において、珪藻の形が徐々に崩れ、最終的に珪藻が死滅することが観察され(図13)、次世代の卵および次世代の線虫は確認されなかった(表11)。この原因として、餌である珪藻が死滅した結果、線虫の成長阻害が助長されたこと、およびCu、TBT による直接的な線虫の成長阻害が引き起こされたためであると考えられる。また、CuおよびTBT 濃度の高い試験区ほど、珪藻が死滅する時間が短く、また線虫の成長阻害が起こり、成虫まで成長する線虫が観察できなかった。
海産線虫を用いた毒性試験の報告は少なく、底質の毒性評価を行った報告はほとんど報告されていない(非特許文献13−19)。また、これらのほとんどがバクテリア食性線虫を用いており、珪藻食性線虫を用いた毒性試験はこれまで報告がない。
Claims (12)
- 下記の工程を含んでなる、試料中の汚染物質の有無を判定する方法:
(1) 汚染物質の有無を試験すべき試料および汚染物質を含まない対照試料を用意する;
(2) 海産自由生活性線虫をその餌の存在下に培養する;
(3) 工程(2) で培養した線虫を、工程(1) で用意した試験試料または対照試料および該線虫の餌と共に、該線虫の生育に適する条件で培養する;
(4) 試験試料の存在下に培養した線虫の世代サイクルおよび生態を観察し、対照試料の存在下に培養した正常な世代サイクルで増殖する線虫に対して、生態および/または世代サイクル時間に異常があるか判断する;
(5) 工程(4) で異常がない場合に試験試料は汚染物質を含まないと判定し、相違がある場合に該試料は汚染物質を含むと判定する方法であって、線虫が、珪藻食性海産自由生活性線虫Prochromadorella sp.1 である、方法。 - 珪藻が付着珪藻Cylindrotheca closteriumである、請求項1記載の方法。
- 下記の工程を含んでなる、試料中の汚染物質の有無を判定する方法:
(1) 汚染物質の有無を試験すべき試料および汚染物質を含まない対照試料を用意する;
(2) 海産自由生活性線虫をその餌の存在下に培養する;
(3) 工程(2) で培養した線虫を、工程(1) で用意した試験試料または対照試料および該線虫の餌と共に、該線虫の生育に適する条件で培養する;
(4) 試験試料の存在下に培養した線虫の世代サイクルおよび生態を観察し、対照試料の存在下に培養した正常な世代サイクルで増殖する線虫に対して、生態および/または世代サイクル時間に異常があるか判断する;
(5) 工程(4) で異常がない場合に試験試料は汚染物質を含まないと判定し、相違がある場合に該試料は汚染物質を含むと判定する方法であって、線虫が、珪藻食性海産自由生活性線虫であり、珪藻が付着珪藻Cylindrotheca closteriumである、方法。 - 工程(2)において、線虫の世代サイクルを同調させ、そして工程(3)が、工程(2)で世代サイクルを同調させた線虫を培養するものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 線虫の培養に海産植物プランクトン培地SWM-III を用いる、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 海産自由生活性線虫が、その卵が培養器の壁に付着する線虫であり、培養器の内壁に付着した線虫の卵のみを残して培養器を一旦空にし、該容器内に再度培地および珪藻を添加して培養することにより、線虫の世代サイクルの同調を行う、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 培養器が5〜50mlの培養器であり、工程(3) の直前の線虫の数が、100〜1000匹である、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 試料が海水または海域の底質である、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
- 工程(3) で海水試料2〜20mlを用いる、請求項8記載の方法。
- 工程(3) で海域底質試料0.1〜1gを用いる、請求項8記載の方法。
- 汚染物質が、Cd、Cu、TBT及びZnからなる群から選択される重金属を含む化学物質である、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
- 検知感度がCdについて約600 ppb、Cuについて約150 ppb、TBTについて約260ppb、Znについて約2 ppmである請求項11記載の方法。
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CN105866379A (zh) * | 2016-04-11 | 2016-08-17 | 河海大学 | 一种模拟滨海浅层非均质海滩污染物运移的装置及方法 |
CN105866379B (zh) * | 2016-04-11 | 2018-06-08 | 河海大学 | 一种模拟滨海浅层非均质海滩污染物运移的装置及方法 |
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JP2005315631A (ja) | 2005-11-10 |
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