JP4542644B2 - Method for enhancing antibacterial action - Google Patents

Description

【００１０】
【化２】

【００１１】
この発明でいうテリマグランジンＩ骨格を有する化合物及びコリラジン骨格を有する化合物とは、上記に例示されるテリマグランジンＩ及びコリラジンそれぞれの誘導体であって、β−ラクタム系抗生物質などの抗生物質の抗菌作用の増強能を有する化合物全般を意味する。上記に例示される以外のこの発明で用い得る化合物としては、例えば、化１又は化２における水酸基の１個又は２個以上が、それぞれ独立に、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、カルボキシル基、アリール基などの置換基で置換された誘導体を挙げることができる。個々のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基などが、また、個々のアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基などが挙げられる。個々のアリール基としては、例えば、フェニル基、ジフェニル基及びターフェニル基などが挙げられる。
【００１２】
以上のような、この発明で用いるテリマグランジンＩ骨格を有する化合物及びコリラジン骨格を有する化合物（以下、これらの化合物から選ばれる１種又は２種以上を単に「当該化合物」ということがある。）は、調製方法が種々知られている場合があるので、慣用の方法により調製されるこれらの化合物はいずれも有利にこの発明で用いることができる。したがってこの発明の実施において、当該化合物はその給源や調製方法により限定されず、例えば、植物体など天然の給源から得られたものであっても、化学合成などにより人為的に得られたものであってもよい。また、この発明の実施において、当該化合物は精製された実質的に単一の形態で用いても、また、後述する当該化合物による抗菌作用の増強効果を実質的に消失させない範囲で他の成分との混合物としての形態で用いてもよい。医療分野、食品分野、化粧品分野など、ヒトに適用する場合には、天然の給源から比較的高純度に精製された当該化合物を用いるのが望ましい。テリマグランジンＩ骨格を有する化合物はバラの花弁をはじめとするバラの植物体に、また、コリラジン骨格を有する化合物はウワウルシの葉をはじめとするウワウルシの植物体に比較的多く含有されるので、これらの給源から精製された当該化合物は医療、食品、化粧品などの諸分野でのこの発明の実施に有利である。
【００１３】
天然の給源から当該化合物を調製するには、配糖体を含む天然のポリフェノール類の分離・精製に用いられる通常の手段が適宜採用される。斯かる通常の手段としては、例えば、抽出、濃縮、濾過、分液、分別沈澱、結晶化、分蜜、真空乾燥、凍結乾燥、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどが挙げられる。以上のような慣用の方法から選ばれる適宜の方法で当該化合物の給源の抽出物を分画して生成する画分を、後述する抗菌作用の増強効果の判定方法に供して所期の性質を示した画分を選択・合一し、合一した画分を、必要に応じて、さらに適宜の方法により分画し、生成する画分を前記と同様に選択・合一する操作を繰り返せば、所望のレベルにまで精製された当該化合物を得ることができる。斯くして得られる当該化合物は、さらに必要に応じて、適宜の他の成分と混合するなどして組成物の形態に調製して使用することもでき、本発明による抗菌作用の増強方法の実施分野や実施の対象となる微生物の種類に応じて、適宜の精製度・形態の当該化合物の調製物を用いればよい。
【００１４】
斯くして調製される当該化合物は、単独では、医療分野で通常用いられる慣用の抗生物質の抗菌作用と比較すると通常明らかに弱い抗菌作用しか示さない。当該化合物の種類や精製度、対象とする微生物の種類などにもよるが、当該化合物の抗菌作用を最小発育阻止濃度（以下、「ＭＩＣ」という。）で表すと、通常、１００μｇ／ｍｌ程度ないしはそれ以上である。当該化合物は単独ではこのように弱い抗菌作用しか示さないけれども、抗生物質と併用したとき、その抗生物質の抗菌作用を顕著に増強する能力を有している。
【００１５】
この発明による抗菌作用の増強方法で用いる抗生物質は、当該化合物の併用によりその抗菌作用が増強されるものであればいずれでもよい。一般に抗生物質とは、原核細胞及び真核細胞を含む微生物のいずれか１種以上に対する殺菌作用又は静菌作用を示す物質と定義される。この発明においては、このように定義される抗生物質のうち、テリマグランジンＩやコリラジンなどの当該化合物の併用によりその抗菌作用が増強されるものであれば、それらから適宜選ばれる１種又は２種以上はいずれも用いることができ、化学構造や抗菌作用の作用機作、さらには、対象となる微生物の種類により限定されるものではない。抗菌作用の増強の効果は、対象とする抗生物質に応じて選ばれる慣用の抗菌作用の測定系に当該化合物を添加して抗菌作用を調べることにより確認することができる。すなわち、斯かる測定系で抗生物質を当該化合物と併用して求められた抗菌作用の測定値が、同じ測定系でその抗生物質及び当該化合物をそれぞれ単独で用いた場合の抗菌作用の加算値を上回った場合、換言すれば、抗生物質と当該化合物の併用により相乗的に高まった抗菌作用が確認された場合、当該化合物の併用によりその抗生物質の抗菌作用が増強されたと判定される。以上述べた、この発明で用い得る抗生物質（以下、その１種又は２種以上を単に「当該抗生物質」ということがある。）の具体例としては、例えば、オキサシリン、ベンジルペニシリン、アンピシリン、セフメタゾール及びイミペネムをはじめとするβ−ラクタム系抗生物質や、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン及びミノサイクリンをはじめとするテトラサイクリン系抗生物質などが挙げられる。この発明による抗菌作用の増強方法は、β−ラクタム系抗生物質との併用によるときとりわけ著効を発揮する。
【００１６】
この発明による抗菌作用の増強方法は、当該化合物及び／又は当該抗生物質が単独で抗菌作用を発揮する微生物に対して、抗菌作用の増強効果を示す場合もあるが、当該抗生物質が単独では顕著な抗菌作用を示さない微生物に適用するととりわけ顕著な効果を発揮する。したがって、本発明による方法は、従来の抗生物質では対処し得なかった微生物の殺菌ないしは静菌に極めて有効である。当該抗生物質が単独では顕著な抗菌作用を示さない微生物としては、例えば、当該抗生物質に対する耐性を獲得した微生物の変異株が挙げられ、より詳細には、当該抗生物質に対する耐性を獲得した、スタフィロコッカス属又はストレプトコッカス属のグラム陽性菌の変異株や、バクテロイデス属、フコバクテリウム属、シュードモナス属、エシェリヒア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラティア属、シトロバクター属又はアシネトバクター属のグラム陰性細菌の変異株が挙げられる。これらのうち、当該抗生物質のひとつであるβ−ラクタム系抗生物質をはじめとする諸種の抗生物質に対する多剤耐性を獲得したＭＲＳＡ（スタフィロコッカス属）に対し、この発明による抗菌作用の増強方法はとりわけ著効を発揮する。
【００１７】
この発明でいう、当該化合物を当該抗生物質と併用するとは、当該抗生物質を、上記で述べた微生物による汚染・感染が懸念されるか又は確認された対象物に適用する際に、その適用前、適用後及び／又は適用と同時にその対象物に当該化合物を適用することを意味する。いずれの時期の適用によっても所期の効果が得られるけれども、より望ましくは、当該抗生物質の適用前又は適用と同時に適用される。ここでいう適用とは、当該抗生物質及び／又は当該化合物を、必要に応じて適宜の他の成分、例えば、溶解剤、希釈剤、緩衝剤、賦形剤、安定剤などから選ばれる１種又は２種以上との組成物としての形態で、対象物に投与、接種、塗布、添加、噴霧、含浸などすることを意味する。この発明による抗菌作用の増強方法を実施し得る分野としては、例えば、医療分野、畜産分野、水産分野、食品分野、化粧品分野、衛生用品分野、日用品分野、建材分野、情報伝達機器分野などが挙げられ、この発明による方法は、これらの分野における上記で述べた微生物による汚染・感染の予防、処置及び／又は治療に奏効する。当該抗生物質及び当該化合物を併用する際の用量・割合は、上記で述べた、抗菌作用の増強効果の確認方法により求められる、対象微生物に対して有効な両者の濃度と、適用の対象物の種類を勘案して選択される。通常は、当該化合物及び当該抗生物質がそれぞれ単独では抗菌作用を発揮し得ない用量であっても、両者を併用することにより所期の抗菌作用が得られる。使用する当該化合物ならびに当該抗生物質の種類や実施の分野にもよるけれども、例えば、上記のような微生物による感染症に罹患した患者に適用する医療分野においては、患者の症状に応じて、成人患者１人に対して、当該抗生物質を、固形物重量換算で、１日当たり通常１ｍｇ以上、望ましくは１０ｍｇ以上、より望ましくは１００ｍｇ以上の用量を１回又は２回以上に分けて、連日または隔日の頻度で、患部に応じて選択される経口、経皮、皮内、皮下、筋肉内、静脈内などのいずれかの経路で適用し、その際に、当該化合物を、当該抗生物質の１回当たりの適用量に対して固形物重量比で等量以上、望ましくは２倍量以上、より望ましくは５倍量以上に相当する量を、当該抗生物質の適用経路に準じて適用して併用すればよい。また、ヒトを含む生体以外の、例えば、医療関連機器等の諸物品に適用する場合には、該物品の使用前、使用中及び／又は使用後に、通常０．０１ｍｇ／ｍｌ以上、望ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ以上、より望ましくは１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度の溶液に調製した当該抗生物質を該物品に噴霧、塗布、含浸するなどして適用し、その際に、当該抗生物質の濃度に対して通常等濃度以上、望ましくは２倍以上、より望ましくは５倍以上の濃度の溶液に調製した当該化合物を該物品に同様に適用して併用すればよい。
【００１８】
この発明は、上記で述べた当該化合物と当該抗生物質とを含有せしめてなる抗菌剤を提供するものでもある。この発明の抗菌剤は、当該化合物及び当該抗生物質がそれぞれ単独では達成し得ない、増強された抗菌作用を発揮するので、上記で述べた、この発明による方法を実施し得る諸分野において有利に用いることができる。この発明の抗菌剤は、それぞれの使用分野において増強された抗菌作用が発揮されるものであればよく、特定の組成や形態に限定されるものではない。使用分野にもよるが、この発明の抗菌剤は、通常、液状、懸濁状、ペースト状又は固形状に調製され、当該抗生物質を０．００１乃至２０％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０１乃至１０％（ｗ／ｗ）含有するとともに、当該化合物を０．００１乃至８０％（ｗ／ｗ）、望ましくは、０．０１乃至５０％（ｗ／ｗ）含有する。
【００１９】
この発明の抗菌剤は、実質的に当該化合物及び当該抗生物質のみからなる組成のものはもとより、これら以外の、個々の使用分野で許容される、例えば、担体、賦形剤、溶解剤、希釈剤、緩衝剤、安定剤、静菌剤、着香剤、着色剤などとの組成物としての形態をも包含する。担体ないしは賦形剤としては、澱粉、デキストリン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、重炭酸ナトリウム、グリセリンなどが挙げられる。安定剤としては、より具体的には、血清アルブミンやゼラチンなどの蛋白質、グルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、ラクチトールなどの糖質が挙げられる。静菌剤としては、エタノール、イソプロピルアルコールなどのアルコール類や、酢酸、乳酸、安息香酸などの有機酸類が挙げられる。この発明の抗菌剤は、以上のような成分を配合してなる組成物を、使用分野に応じて、注射剤、液剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、点眼剤、点鼻剤、坐剤、軟膏、ローション、スプレー、天花粉などの形態に適宜成形して得ることができる。
【００２０】
以下、実験に基づいて本発明をより詳しく説明する。
【００２１】
【実験１】
〈テリマグランジンＩ骨格を有する化合物の併用による抗菌作用の増強〉
【００２２】
【実験１−１】
〈テリマグランジンＩの精製〉
バラの花弁乾燥物約２００ｇに約４ｌの７０％アセトン／水混液を加えて磨砕して抽出し、濾過して不溶物を除き、溶液部をエバポレーターで濃縮した。この濃縮物に約４００ｍｌのジエチルエーテルを加え分液ロートで抽出し水層を回収した。この水層に約１．５ｌの酢酸エチルを加えてさらに抽出し、酢酸エチル層を回収し、この層を減圧濃縮したところ、酢酸エチル抽出物が固形分として１０．２１ｇ得られた。この酢酸エチル抽出物を適量の蒸留水に溶解した後、『ＤＩＡＩＯＮ ＨＰ２０ゲル』（三菱化学株式会社製造）を充填したガラスカラム（内径４．８ｃｍ、長さ５０ｃｍ）に負荷してゲルに吸着させた後、下記表１に示す、２０％から１００％まで段階的にメタノール濃度を高めたメタノール／水混液を順次カラムに通液し、カラムからのそれぞれの溶出物を分画採取した。採取したそれぞれの画分を常法により減圧濃縮した後、β−ラクタム系抗生物質であるオキサシリン（シグマ社販売）の抗菌作用に与えるそれぞれの画分の併用の影響を以下のように調べた。先ず、試験株として、岡山大学付属病院で単離されたＭＲＳＡの４株（ＯＭ４８１株、ＯＭ５０５株、ＯＭ５８４株、ＯＭ６２３株）それぞれを３２℃で好気的にミュラー・ヒントン培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地、以下「ＭＨ培地」と略記する。）（和光純薬販売）で増殖させた。試験培地として、最終固形分濃度５０μｇ／ｍｌの上記のいずれかの画分と、１，０２４μｇ／ｍｌ以下の順次段階希釈したいずれかの濃度のオキサシリンとを含むＭＨ培地を調製した。また、別の試験培地として、上記のいずれの画分も含まず、同様に段階希釈したオキサシリンのみを含むＭＨ培地も調製した。これらの試験培地に、先に準備した試験株のいずれかを細胞密度１０⁶乃至１０⁷個／ｍｌとなるように加え、３２℃で好気的に２４時間保持した。それぞれの試験培地を生理食塩水で適宜希釈した後、ニュートリエント寒天培地（和光純薬販売）上に塗布し、３２℃で２４時間保持した。寒天培地上に形成したコロニーを肉眼で計測し、オキサシリンの最少生育阻止濃度（ＭＩＣ）を求めた。結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】

【００２４】
表１に示すとおり、４０％メタノール／水混液による溶出画分を併用したときオキサシリンは最も低濃度でＭＲＳＡの発育を阻止した。このことから、この画分がオキサシリンのＭＲＳＡに対する抗菌作用を増強する物質を主として含有すると考えられた。
【００２５】
上記の４０％メタノール／水混液による溶出画分の一部（固形分として９９７ｍｇ）を、『Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ ４０ゲル』（東ソー株式会社販売）を充填したガラスカラム（内径２．２ｃｍ、長さ５２ｃｍ）を用いるゲル濾過カラムクロマトグラフィーに供して分画した。各画分を、オキサシリンの抗菌作用に与えるそれぞれの併用の影響について上記と同様にして試験し、オキサシリンのＭＩＣを顕著に低下させた画分を合一し、凍結乾燥して、精製された成分を固形分重量として３６４ｍｇ得た。得られた精製成分を、上記と同様にして試験した。結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】

【００２７】
表２に示すとおり、バラの花弁抽出物から上記の方法で精製された成分の併用によりオキサシリンによるＭＲＳＡに対するＭＩＣは著しく低下した。より詳細には、この精製成分は最終濃度５０μｇ／ｍｌでオキサシリンと併用すると、ＭＩＣを１／５００程度あるいはそれ以下に低下させた。このことから、この精製成分が抗菌作用の増強能を有していると判断された。
【００２８】
常法にしたがって、重水素化アセトン中で、周波数５００ＭＨｚで、上記で得た精製成分の¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（以下、「¹Ｈ−ＮＭＲ」と略記する。）を調べたところ、図１に示すスペクトルが得られた。この結果観察された化学シフトならびに水素原子の帰属を表３に示す。
【００２９】
【表３】

【００３０】
上記の結果に基づいて、本実験により得た精製成分をテリマグランジンＩ（ｔｅｌｌｉｍａｇｒａｎｄｉｎ Ｉ）、別名、ｃｙｃｌｉｃ ４，６−（４，４’，５，５’，６，６’−ｈｅｘａｈｙｄｒｏｘｙ［１，１'−ｂｉｐｈｅｎｙｌ］−２，２'ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）２，３−ｂｉｓ（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ），（Ｓ）−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅと同定した。本化合物の構造は化１に示している。通常の高速液体クロマトグラフィーにより調べたところ、本実験で精製したテリマグランジンＩの純度は約９０％であった。
【００３１】
【実験１−２】
〈テリマグランジンＩの併用によるオキサシリンの抗菌作用の増強〉
オキサシリンの抗菌作用を増強するテリマグランジンＩによる効果を確認するため以下の実験を行った。テリマグランジンＩは、実験１−１の方法で精製して調製した。試験株として、ＭＲＳＡの単離株ＯＭ５８４株を３２℃で好気的にＭＨ培地で増殖させた。試験培地として、ＭＨ培地、２μｇ／ｍｌのオキサシリンを含むＭＨ培地、５０μｇ／ｍｌのテリマグランジンＩを含むＭＨ培地、２μｇ／ｍｌのオキサシリンと５０μｇ／ｍｌのテリマグランジンＩとを含むＭＨ培地を調製した。これらの試験培地に、先に準備した試験株を細胞密度約１×１０⁷個／ｍｌとなるように加え、３２℃で好気的に２０時間保持した。それぞれの試験培地を生理食塩水で適宜希釈し、ニュートリエント寒天培地（和光純薬販売）に塗布し、３２℃で２４時間保持した。寒天培地上に形成されたコロニーを肉眼で計測し、計測値より、試験培地中で２０時間保持した時点における試験株の生菌数を求めた。結果を図２に示す。なお、本図において、白抜き丸（○）はＭＨ培地におけるＭＲＳＡの生菌数の経時変化を、黒塗り丸（●）はオキサシリン（２μｇ／ｍｌ）のみを含むＭＨ培地におけるＭＲＳＡの生菌数の経時変化を、白抜き三角（△）はテリマグランジンI（５０μｇ／ｍｌ）のみを含むＭＨ培地におけるＭＲＳＡの生菌数の経時変化を、黒塗り三角（▲）はオキサシリン（２μｇ／ｍｌ）とテリマグランジンＩ（５０μｇ／ｍｌ）との両者を含むＭＨ培地におけるＭＲＳＡの生菌数の経時変化をそれぞれ示している。また、本図における縦軸は、コロニーの計測数に基づく生菌数（コロニー・フォーミング・ユニット、図３においては「ｃｆｕ」と表示した。）の対数値（底１０）を示している。
【００３２】
図２に示すとおり、ＭＨ培地、２μｇ／ｍｌのオキサシリンのみを含むＭＨ培地、及び、５０μｇ／ｍｌのテリマグランジンＩのみを含むＭＨ培地では、いずれも培養２０時間後、試験株は１００倍以上の生菌数にまで増殖したのに対して、２μｇ／ｍｌのオキサシリンと５０μｇ／ｍｌのテリマグランジンＩとを含むＭＨ培地中では、試験株は増殖せず死滅してゆき、２０時間後で約１／１００の生菌数となった。これらの結果は、オキサシリンとテリマグランジンＩは併用により相乗的に増強された抗菌作用を発揮し、テリマグランジンＩには抗生物質の抗菌作用を顕著に増強する作用があることを意味している。したがって、それぞれ単独ではＭＲＳＡの増殖を阻止できない程度の濃度のオキサシリンとテリマグランジンＩであっても、これらを併用すると、ＭＲＳＡの増殖を顕著に阻止し、さらに、死滅させることができる。
【００３３】
【実験１−３】
〈抗菌作用の増強に有効なテリマグランジンＩの濃度〉
抗生物質オキサシリンの抗菌作用の増強に奏効するテリマグランジンＩの有効な濃度を検討するために、種々の濃度のテリマグランジンＩ存在下でのオキサシリンの抗菌作用を実験１−１の方法に準じて調べた。結果を表４に示す。
【００３４】
【表４】

【００３５】
表４に示すとおり、いずれの試験株においても、併用するテリマグランジンＩの濃度が２５μｇ／ｍｌ以上の場合は、オキサシリン単独の系と比較して、ＭＩＣが顕著に低下し、ＭＲＳＡに対する抗菌作用が増強されることが判明した。これらの結果は、抗生物質オキサシリンと併用する場合、ＭＲＳＡの抗菌作用を発揮するのに有効なテリマグランジンＩの濃度は、最終濃度として約２５μｇ／ｍｌ以上であり、好ましくは３０μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは４０μｇ／ｍｌ以上であり、テリマグランジンＩの濃度が５０μｇ／ｍｌ以上では特に好ましいことが判明した。これらの結果は、このような濃度となるようにテリマグランジンＩを併用すると、ＭＲＳＡに対する抗生物質の使用濃度あるいは使用量を低減させることができることを意味している。
【００３６】
【実験１−４】
〈テリマグランジンＩの併用による種々の抗生物質の抗菌作用の増強〉
本発明のテリマグランジンＩによる各種の抗生物質の抗菌作用の増強効果を実験１−１の方法に準じて調べた。抗生物質として、β−ラクタム系抗生物質である、オキサシリン、ベンジルペニシリン（米国、シグマ社販売）、アンピシリン（和光純薬販売）、セフメタゾール（米国、シグマ社販売）、イミペネム（萬有製薬販売）を用いた。試験株として、ＭＲＳＡの単離株であるＯＭ４８１株、ＯＭ５０５株、ＯＭ５８４株、ＯＭ６２３株と、メチシリン感受性の黄色ブドウ球菌１株（ＡＴＣＣ ２１０２７）を用いた。結果を表５に示す。なお、本表中の「単独」とは抗生物質を単独で適用した場合を、「併用」とは最終濃度４０μｇ／ｍｌのテリマグランジンＩと抗生物質とを併用して適用した場合をそれぞれ意味する。
【００３７】
【表５】

【００３８】
表５に示すとおり、いずれの抗生物質においても、抗生物質を単独で適用した場合と比較すると、抗生物質とテリマグランジンＩとの併用によって抗生物質のＭＩＣは顕著に低下した。このことから、テリマグランジンＩには、広くβ−ラクタム系の抗生物質の抗菌作用を増強する能力があることが判明した。なお、表５における、オキサシリン及びベンジルペニシリンを用いた実験結果に示されるとおり、テリマグランジンＩは、ＭＲＳＡに対する場合ほど顕著ではないものの、ＭＲＳＡ以外の微生物に対する抗生物質の抗菌作用をも増強することも判明した。また、データは割愛するけれども、同様の実験により、テリマグランジンＩは、テトラサイクリンのＭＲＳＡに対する抗菌作用をも顕著に増強することが確認された。
【００３９】
【実験２】
〈コリラジン骨格を有する化合物の併用による抗菌作用の増強〉
４００ｍｌのウワウルシ葉抽出液『日本薬局方 ウワウルシ流エキス』（司生堂製薬株式会社販売）をエバポレーターで濃縮・乾固して、約８．１ｇの固形物を得た。この固形物を適量の蒸留水に溶解させた後、『Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ４０Ｃゲル』（東ソー株式会社販売）を充填したガラスカラム（内径２．２ｃｍ、長さ５２ｃｍ）に負荷した後、水、２０％メタノール／水混液、６０％メタノール／水混液、メタノール、７０％アセトン／水混液を順次カラムに通液し、カラムからのそれぞれの溶出物を分画採取した。採取したそれぞれの画分を常法により減圧濃縮した後、その一部を用いて、実験１−１に準じて、β−ラクタム系抗生物質であるオキサシリンの抗菌作用に与えるそれぞれの画分の併用の影響を調べた。その結果、６０％メタノール／水混液による溶出画分を併用したときオキサシリンのＭＲＳＡに対するＭＩＣは顕著に低下した。
【００４０】
上記の６０％メタノール／水混液による溶出画分を、常法にしたがって、『ＭＣＩ ＣＨＰ２０Ｐゲル』（三菱化学株式会社製）による逆相カラムクロマトグラフィーに続いて調製用高速液体クロマトグラフィーに供して分画し、実験１−１に準じて、β−ラクタム系抗生物質であるオキサシリンの抗菌作用に与えるそれぞれの画分の併用の影響を調べた。これらの画分のうち、オキサシリンのＭＲＳＡに対するＭＩＣをとりわけ顕著に低下させた画分を採取し、凍結乾燥して、精製された成分を固形分重量として３６４ｍｇ得た。上記の方法に準じて、この精製成分を最終濃度８μｇ／ｍｌ及び１６μｇ／ｍｌで併用したときの、オキサシリンのＭＲＳＡに対するＭＩＣを調べた。結果を表６に示す。
【００４１】
【表６】

【００４２】
表６に示すとおり、ウワウルシの葉抽出物から上記の方法で精製された成分の併用によりオキサシリンのＭＲＳＡに対するＭＩＣは著しく低下した。より詳細には、この精製成分は最終濃度１６μｇ／ｍｌでオキサシリンと併用すると、オキサシリンのＭＲＳＡに対するＭＩＣを１／５０程度あるいはそれ以下に低下させることが判明した。なお、上記の方法に準じて、本実験による精製成分の単独でのＭＲＳＡの単離株４株に対するＭＩＣを調べたところ、いずれの株に対しても１２８μｇ／ｍｌ程度であった。以上の結果は、オキサシリンの抗菌作用は上記の精製成分と併用したとき相乗的に増強され、本実験による精製成分に抗生物質の抗菌作用の顕著な増強作用があることを意味している。
【００４３】
実験１−１に準じて、重水素化アセトン中で、周波数５００ＭＨｚで、上記で得た精製成分の¹Ｈ−ＮＭＲを調べたところ、図３に示すスペクトルが得られた。この結果観察された化学シフトならびに水素原子の帰属を表７に示す。
【００４４】
【表７】

【００４５】
上記の結果に基づいて、本実験により得た精製成分をコリラジン（ｃｏｒｉｌａｇｉｎ）、別名、ｃｙｃｌｉｃ ３，６−（４，４’，５，５’，６，６’−ｈｅｘａｈｙｄｒｏｘｙ［１，１'−ｂｉｐｈｅｎｙｌ］−２，２'ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）１−（３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ），β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅと同定した。本化合物の構造は化２に示している。通常の高速液体クロマトグラフィーにより調べたところ、本実験で精製したコリラジンの純度は約９８％であった。
【００４６】
なお、データは割愛するけれども、上記と同様の実験により、本実験で精製・同定されたコリラジンは、テトラサイクリンのＭＲＳＡに対する抗菌作用をも顕著に増強することが確認された。
【００４７】
【実験３】
〈急性毒性試験〉
常法にしたがって、８週齢のマウスに実験１及び実験２の方法で精製したテリマグランジンＩ及びコリラジンのいずれかを、経皮、経口又は腹腔内の経路で投与し急性毒性を調べた。その結果、いずれの投与経路においても、調べた最大の投与量である１００ｍｇ／ｋｇマウス体重においても死亡例は見られなかった。
この結果は、この発明で用いる化合物のヒトを含む生体への適用が安全であることを裏付けている。
【００４８】
以下、実施例を示してこの発明を説明するが、この発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
【００４９】
【実施例１】
〈錠剤〉
下記の処方にしたがって、（１）、（４）及び（５）の成分と（２）の成分の一部を均一に混合し、圧縮成形した後、粉砕し、（３）の成分及び（２）の成分の残量を加えて混合し、打錠機にて圧縮成形して一錠２００ｍｇの錠剤を得た。

【００５０】
本品は、ＭＲＳＡをはじめとする諸種の微生物による口腔内における感染症を治療・予防するための舌下錠として、また、ＭＲＳＡをはじめとする諸種の微生物による消化器系における感染症を治療・予防するための内服用錠剤などとして有利に利用できる。
【００５１】
【実施例２】
〈錠剤〉
下記の処方にしたがって、（１）、（４）及び（５）の成分と（２）の成分の一部を均一に混合し、圧縮成形した後、粉砕し、（３）の成分及び（２）の成分の残量を加えて混合し、打錠機にて圧縮成形して一錠２００ｍｇの錠剤を得た。

【００５２】
本品は、ＭＲＳＡをはじめとする諸種の微生物による口腔内における感染症を治療・予防するための舌下錠として、また、ＭＲＳＡをはじめとする諸種の微生物による消化器系における感染症を治療・予防するための内服用錠剤などとして有利に利用できる。
【００５３】
【実施例３】
〈軟膏〉
下記の処方にしたがって、（１）、（２）、（５）及び（６）の成分と（３）の成分の一部を均一に混合し、圧縮成形した後、粉砕し、（４）の成分及び（３）の成分の残量を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す軟膏を得た。

【００５４】
本品は、ＭＲＳＡをはじめとする諸種の微生物に対する抗菌作用のみならず、マルトースによる細胞へのエネルギー補給作用も発揮することから、治癒期間が短縮され、創面をきれいに治癒することのできる軟膏として有用である。また、本品は、切り傷、火傷、口内炎など外傷治療の促進に利用することができる。更に、本品をソフトカプセルなどに充填、成形すれば、ＭＲＳＡをはじめとする微生物による直腸内、膣内などにおける感染症の治療・予防のための坐薬としても有利に利用できる。
【００５５】
【実施例４】
〈軟膏〉
下記の処方にしたがって、（１）、（２）、（５）及び（６）の成分と（３）の成分の一部を均一に混合し、圧縮成形した後、粉砕し、（４）の成分及び（３）の成分の残量を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す軟膏を得た。

【００５６】
本品は、ＭＲＳＡをはじめとする諸種の微生物に対する抗菌作用のみならず、マルトースによる細胞へのエネルギー補給作用も発揮することから、治癒期間が短縮され、創面をきれいに治癒することのできる軟膏として有用である。また、本品は、切り傷、火傷、口内炎など外傷治療の促進に利用することができる。更に、本品をソフトカプセルなどに充填、成形すれば、ＭＲＳＡをはじめとする微生物による直腸内、膣内などにおける感染症の治療・予防のための坐薬としても有利に利用できる。
【００５７】
【実施例５】
〈抗菌スプレー〉
イソプロパノール ６８重量部に、精製水 ２６重量部、実験１の方法で得たテリマグランジンＩ ０．９重量部、実験２の方法で得たコリラジン ０．９重量部、オキサシリン ０．２重量部、安息香酸４重量部をそれぞれ加え、常法により分散させて原液を得た。その後、常法にしたがって、１００ｍｌ容スプレー容器に、この原液４０ｍｌと噴射剤としての液化炭酸ガス６０ｍｌをそれぞれ充填して抗菌スプレーを得た。
【００５８】
幅広い抗菌スペクトルを有し、かつ、オキサシリンの抗菌作用が増強された本品は、ＭＲＳＡを含む微生物による汚染・感染を予防、治療又は処置するための抗菌スプレーとして、医療分野、畜産分野、水産分野、食品分野、化粧品分野をはじめとする諸種の分野で有利に利用できる。
【００５９】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明は、抗生物質を適用する際にテリマグランジンＩ及び／又はコリラジンを併用するとその抗生物質の抗菌作用が顕著に増強されるという全く独自の知見に基づき完成されたものである。この発明による抗菌作用の増強方法は、微生物の殺菌及び／又は静菌に著効を発揮し、とりわけ、現在までのところ根本的な対処方法が確立されていなかったＭＲＳＡの殺菌及び／又は静菌に著効を発揮する。この発明による方法ならびに抗菌剤は、ＭＲＳＡを含む微生物による汚染・感染が懸念される諸種の分野において、その予防、治療及び／又は処置に有効である。
【００６０】
斯くも顕著な効果を奏するこの発明は、斯界に貢献すること誠に多大な、意義のある発明であると言える。
【図面の簡単な説明】
【図１】 バラの花弁より抽出・精製したテリマグランジンＩの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）を示す図である。
【図２】 ＭＲＳＡに対するオキサシリンとテリマグランジンＩによる抗菌作用の発現における相乗効果を示す図である。
【図３】 ウワウルシの葉より抽出・精製したコリラジンの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）を示す図である。
【符号の説明】
○ ＭＨ培地におけるＭＲＳＡの生菌数の経時変化
● オキサシリン（２μｇ／ｍｌ）のみを含むＭＨ培地におけるＭＲＳＡの生菌数の経時変化
△ テリマグランジンＩ（５０μｇ／ｍｌ）のみを含むＭＨ培地におけるＭＲＳＡの生菌数の経時変化
▲ オキサシリン（２μｇ／ｍｌ）とテリマグランジンＩ（５０μｇ／ｍｌ）との両者を含むＭＨ培地におけるＭＲＳＡの生菌数の経時変化[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for enhancing antibacterial action, and more specifically, an antibacterial action characterized by using a compound having a telmagrandin I skeleton and / or a compound having a corrazine skeleton together with an antibiotic. It is related with the enhancement method.
[0002]
[Prior art]
Antibiotics have been widely used as chemotherapeutic agents effective in treating infections. However, antibiotics may cause the emergence of resistant bacteria to the antibiotics depending on the type due to abuse in the medical field and the like, and problems related to such resistant bacteria have recently started to occur. For example, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (hereinafter abbreviated as “MRSA”) who has acquired multidrug resistance to various antibiotics including β-lactam antibiotics is a patient due to nosocomial infection. There are also reports of fatal results. Pathogens that have acquired resistance to antibiotics, including MRSA, may infect and spread to animals, birds, reptiles, fish, etc. other than humans, and the problem of antibiotic-resistant bacteria is not limited to the medical field and is a major social issue. It is developing into a problem.
[0003]
At present, such antibiotic-resistant bacteria are generally treated with another antibiotic having a different mechanism of action from that antibiotic. For example, MRSA is generally addressed by applying antibiotics such as vancomycin, which has a different mechanism of action from antibiotics for which resistance has been acquired by MRSA. Such a coping method is effective in sterilization or bacteriostasis of resistant bacteria at an early stage, but if used continuously, it may lead to the emergence of new resistant bacteria against the other antibiotics. Antibiotics such as vancomycin may have side effects on humans. As described above, the problem regarding antibiotic-resistant bacteria has not been fundamentally solved yet. One way to solve this problem is to increase the antibacterial action of antibiotics so that they are effective against bacteria resistant to the antibiotics. For this reason, no sufficiently effective method has been established.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
In view of such circumstances, an object of the present invention is to provide a method for enhancing the antibacterial action of antibiotics and its use.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have extensively searched for various kinds of materials, mainly plants, in search of substances having the ability to enhance the antibacterial action of antibiotics. As a result, we obtained a completely unique finding that rose petal and walnut leaf extract, when used in combination with antibiotics, markedly enhance their antibacterial activity. Subsequently, the inventors fractionated these extracts that showed the potentiating action, and attempted to isolate and identify the main body of the enhancing action. As a result, a compound having a telimaglandin I skeleton was identified as one of the main body of the enhancing action from the rose petal extract, and a compound having a corrazine skeleton was identified as the main body of the enhancing action from the extract of the otter leaf.
[0006]
It has been confirmed that the compounds thus isolated and identified remarkably enhance their antibacterial action when combined with antibiotics, and in particular, remarkably enhance the antibacterial action of β-lactam antibiotics against MRSA. It was done. The present invention has been completed based on the above findings.
[0007]
That is, the present invention relates to a method for enhancing antibacterial action, comprising combining a compound having a telimaglandin I skeleton and / or a compound having a corrazine skeleton with an antibiotic, a compound having a telimaglandin I skeleton, and / or Alternatively, the above problem is solved by an antibacterial agent comprising a compound having a corrazine skeleton and an antibiotic.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for enhancing antibacterial action, which comprises using a compound having a telimaglandin I skeleton and / or a compound having a corrazine skeleton together with an antibiotic. As a specific example of a compound having a telimagrandin I skeleton used in the present invention, a telimaglandin I represented by chemical formula 1 is shown, and as a specific example of a compound having a corrazine skeleton used in the present invention, chemical formula 2 is represented. Each of which can be cited.
[0009]
[Chemical 1]

[0010]
[Chemical formula 2]

[0011]
The compound having a telimaglandin I skeleton and the compound having a corrazine skeleton as referred to in the present invention are the derivatives of telimaglandin I and corrazine exemplified above, and are antibiotics such as β-lactam antibiotics. It means all compounds that have the ability to enhance antibacterial action. Examples of compounds that can be used in the present invention other than those exemplified above include, for example, one or more of the hydroxyl groups in Chemical Formula 1 or Chemical Formula 2 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group, an alkoxy group, a carboxyl group, Examples thereof include derivatives substituted with a substituent such as an aryl group. Examples of individual alkyl groups include methyl, ethyl, propyl, and isopropyl groups. Examples of individual alkoxy groups include methoxy, ethoxy, propoxy, and isopropoxy groups. . Examples of individual aryl groups include a phenyl group, a diphenyl group, and a terphenyl group.
[0012]
The compound having the telimaglandin I skeleton and the compound having the corrazine skeleton used in the present invention as described above (hereinafter, one or more selected from these compounds may be simply referred to as “the compound”). Since various preparation methods may be known, any of these compounds prepared by conventional methods can be advantageously used in the present invention. Therefore, in the practice of the present invention, the compound is not limited by its source and preparation method. For example, even if it is obtained from a natural source such as a plant, it is obtained artificially by chemical synthesis or the like. There may be. In the practice of the present invention, the compound may be used in a purified substantially single form, or with other components as long as the antibacterial enhancing effect of the compound described later is not substantially lost. You may use with the form as a mixture of these. When applied to humans in the medical field, food field, cosmetic field, etc., it is desirable to use the compound purified to a relatively high purity from a natural source. A compound having a terrigaglandin I skeleton is contained in a rose plant such as a rose petal, and a compound having a corilazine skeleton is contained in a relatively large amount in a plant of a otter such as a leaf of a walnut. The compounds purified from these sources are advantageous for the practice of this invention in fields such as medicine, food, and cosmetics.
[0013]
In order to prepare the compound from a natural source, usual means used for separation and purification of natural polyphenols including glycosides are appropriately employed. Such normal means include, for example, extraction, concentration, filtration, separation, fractional precipitation, crystallization, honey, vacuum drying, freeze drying, adsorption chromatography, reverse phase chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration. Examples include chromatography, ion exchange chromatography, and thin layer chromatography. The fraction obtained by fractionating the source extract of the compound by an appropriate method selected from the conventional methods as described above is subjected to a method for determining the antibacterial action enhancement effect described below to obtain the desired properties. If the selected fractions are selected and combined, the combined fractions are further fractionated by an appropriate method as necessary, and the generated fractions are selected and combined in the same manner as described above. The compound can be purified to the desired level. The compound thus obtained can be used in the form of a composition, for example, by mixing with other appropriate components, if necessary, and the antibacterial action enhancing method according to the present invention can be carried out. Depending on the field and the type of microorganism to be implemented, a preparation of the compound with an appropriate degree of purification and form may be used.
[0014]
The compound thus prepared alone, by itself, exhibits a clearly weak antibacterial action as compared to the antibacterial action of conventional antibiotics usually used in the medical field. Depending on the type and degree of purification of the compound, the type of the target microorganism, and the like, the antibacterial action of the compound is usually expressed in terms of the minimum growth inhibitory concentration (hereinafter referred to as “MIC”) of about 100 μg / ml or More than that. Although the compound alone exhibits such a weak antibacterial action, it has the ability to remarkably enhance the antibacterial action of the antibiotic when used in combination with the antibiotic.
[0015]
The antibiotic used in the method for enhancing antibacterial action according to the present invention may be any antibiotic as long as the antibacterial action is enhanced by the combined use of the compound. In general, an antibiotic is defined as a substance that exhibits bactericidal or bacteriostatic action against any one or more of microorganisms including prokaryotic cells and eukaryotic cells. In the present invention, among the antibiotics defined as described above, one or two appropriately selected from those antibiotics whose antibacterial action is enhanced by the combined use of the compound such as telimaglandin I and corilazine. Any species or more can be used, and the species is not limited by the chemical structure, the mechanism of antibacterial action, or the type of the target microorganism. The effect of enhancing antibacterial action can be confirmed by adding the compound to a conventional antibacterial action measurement system selected according to the target antibiotic and examining the antibacterial action. That is, the measured value of the antibacterial action obtained by using an antibiotic together with the compound in such a measurement system is the added value of the antibacterial action when the antibiotic and the compound are each used alone in the same measurement system. In the case of exceeding, in other words, when the antibacterial action synergistically increased by the combined use of the antibiotic and the compound is confirmed, it is determined that the antibacterial action of the antibiotic is enhanced by the combined use of the compound. Specific examples of the antibiotics described above that can be used in the present invention (hereinafter, one or more of them may be simply referred to as “the antibiotics”) include, for example, oxacillin, benzylpenicillin, ampicillin, cefmetazole. And β-lactam antibiotics including imipenem, and tetracycline antibiotics including chlortetracycline, oxytetracycline, tetracycline, doxycycline, and minocycline. The method for enhancing antibacterial action according to the present invention is particularly effective when used in combination with β-lactam antibiotics.
[0016]
The method for enhancing antibacterial action according to the present invention may show an antibacterial action enhancing effect against microorganisms in which the compound and / or the antibiotic alone exhibits an antibacterial action, but the antibiotic alone is remarkable. When applied to microorganisms that do not exhibit any antibacterial action, the effect is particularly remarkable. Therefore, the method according to the present invention is extremely effective for sterilization or bacteriostasis of microorganisms that cannot be dealt with by conventional antibiotics. Examples of microorganisms for which the antibiotic alone does not exhibit a remarkable antibacterial action include mutant strains of microorganisms that have acquired resistance to the antibiotic, and more specifically, those that have acquired resistance to the antibiotic. Gram-positive bacterial mutants of the genus Philococcus or Streptococcus, and mutants of Bacteroides, Fucobacterium, Pseudomonas, Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter or Acinetobacter Is mentioned. Of these, the method for enhancing antibacterial activity according to the present invention for MRSA (genus Staphylococcus) that has acquired multidrug resistance to various antibiotics including β-lactam antibiotics which are one of the antibiotics Is particularly effective.
[0017]
In the present invention, the use of the compound in combination with the antibiotic means that the antibiotic is applied to an object that is concerned or confirmed to be contaminated or infected by the microorganisms described above. Means that the compound is applied to the object after and / or simultaneously with application. Although the desired effect can be obtained by application at any time, it is more preferably applied before or simultaneously with the application of the antibiotic. The term “application” as used herein means that the antibiotic and / or the compound is selected from other components as necessary, for example, a solubilizer, a diluent, a buffer, an excipient, and a stabilizer. Alternatively, it means administration, inoculation, application, addition, spraying, impregnation, etc. to an object in the form of a composition with two or more kinds. Fields in which the method for enhancing antibacterial action according to the present invention can be implemented include, for example, the medical field, livestock field, fishery field, food field, cosmetic field, sanitary goods field, daily necessities field, building materials field, information transmission device field, and the like. The method according to the present invention is effective in preventing, treating and / or treating the contamination and infection by microorganisms described above in these fields. The dose and ratio when the antibiotic and the compound are used in combination are determined by the method for confirming the effect of enhancing the antibacterial action described above, and the concentration of both effective against the target microorganism and the target substance to be applied. It is selected considering the type. Usually, even when the compound and the antibiotic are in doses that cannot exert their antibacterial action alone, the desired antibacterial action can be obtained by using both in combination. For example, in the medical field applied to patients suffering from infectious diseases caused by microorganisms as described above, depending on the patient's symptoms For each person, the antibiotic is usually administered in a solid weight equivalent of 1 mg or more per day, preferably 10 mg or more, more preferably 100 mg or more divided into 1 or 2 doses every day or every other day. Applied by any route, such as oral, transdermal, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, etc., selected according to the affected area, with the compound per dose of the antibiotic If the amount corresponding to the amount of solids applied is equal to or more than the equivalent, preferably 2 times or more, more preferably 5 times or more according to the application route of the antibiotic, Good. In addition, when applied to articles other than living bodies including humans, for example, medical-related equipment, it is usually 0.01 mg / ml or more, preferably 0, before, during and / or after use of the article. The antibiotic prepared in a solution having a concentration of 1 mg / ml or more, more preferably 1 mg / ml or more is applied to the article by spraying, coating, impregnating, etc. The compound prepared in a solution having a concentration equal to or higher than the normal concentration, preferably 2 times or higher, more preferably 5 times or higher may be applied to the article and used in combination.
[0018]
The present invention also provides an antibacterial agent comprising the compound described above and the antibiotic. Since the antibacterial agent of the present invention exerts an enhanced antibacterial action that the compound and the antibiotic cannot each achieve independently, it is advantageous in various fields where the method according to the present invention described above can be performed. Can be used. The antibacterial agent of the present invention is not limited to a specific composition or form as long as it exhibits an enhanced antibacterial action in each field of use. Although depending on the field of use, the antibacterial agent of the present invention is usually prepared in a liquid, suspension, paste or solid form, and the antibiotic is 0.001 to 20% (w / w), preferably In addition to containing 0.01 to 10% (w / w), the compound contains 0.001 to 80% (w / w), preferably 0.01 to 50% (w / w).
[0019]
The antibacterial agent of the present invention is acceptable not only in the composition consisting essentially of the compound and the antibiotic, but also in individual fields of use other than these, for example, carriers, excipients, solubilizers, dilutions The form as a composition with an agent, a buffering agent, a stabilizer, a bacteriostatic agent, a flavoring agent, a coloring agent, etc. is also included. Examples of the carrier or excipient include starch, dextrin, calcium phosphate, calcium carbonate, magnesium oxide, magnesium stearate, aluminum silicate, aluminum hydroxide, sodium bicarbonate, glycerin and the like. Specific examples of the stabilizer include proteins such as serum albumin and gelatin, and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, maltose, trehalose, sorbitol, maltitol, mannitol, and lactitol. Examples of the bacteriostatic agent include alcohols such as ethanol and isopropyl alcohol, and organic acids such as acetic acid, lactic acid, and benzoic acid. The antibacterial agent of the present invention comprises a composition comprising the above-described components, depending on the field of use, injection, liquid, powder, granule, tablet, capsule, sublingual, eye drop, nasal drop It can be obtained by appropriately shaping into a form such as suppository, suppository, ointment, lotion, spray, and natural pollen.
[0020]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on experiments.
[0021]
[Experiment 1]
<Enhancement of antibacterial action by combined use of compounds having terimalangin I skeleton>
[0022]
[Experiment 1-1]
<Purification of Terimaglandin I>
About 200 g of 70% acetone / water mixed solution of about 70 g of dried rose petals was added and ground and extracted, filtered to remove insoluble matters, and the solution portion was concentrated with an evaporator. About 400 ml of diethyl ether was added to this concentrate and extracted with a separatory funnel to recover the aqueous layer. About 1.5 l of ethyl acetate was added to the aqueous layer for further extraction, and the ethyl acetate layer was recovered. The layer was concentrated under reduced pressure to obtain 10.21 g of ethyl acetate extract as a solid content. This ethyl acetate extract is dissolved in an appropriate amount of distilled water, then loaded onto a glass column (inner diameter 4.8 cm, length 50 cm) packed with “DIAION HP20 gel” (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) and adsorbed onto the gel. Thereafter, a methanol / water mixture whose concentration was gradually increased from 20% to 100% shown in Table 1 below was sequentially passed through the column, and each eluate from the column was fractionated. Each collected fraction was concentrated under reduced pressure by a conventional method, and then the influence of the combined use of each fraction on the antibacterial action of oxacillin (sold by Sigma), a β-lactam antibiotic, was examined as follows. First, 4 MRSA strains (OM481 strain, OM505 strain, OM584 strain, OM623 strain) isolated at Okayama University Hospital were each aerobically tested at 32 ° C. as Mueller-Hinton medium (Mueller-Hinton medium). Hereafter, abbreviated as “MH medium.”) (Wako Pure Chemical Sales). As a test medium, an MH medium containing any one of the above fractions having a final solid content concentration of 50 μg / ml and any concentration of oxacillin serially diluted to 1,024 μg / ml or less was prepared. In addition, as another test medium, an MH medium containing none of the above-described fractions and containing only oxacillin serially diluted was also prepared. One of the previously prepared test strains was added to these test media at a cell density of 10 ⁶ Thru 10 ⁷ The solution was added at a rate of 32 / ml and kept aerobically at 32 ° C. for 24 hours. Each test medium was appropriately diluted with physiological saline, and then applied onto a nutrient agar medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and kept at 32 ° C. for 24 hours. Colonies formed on the agar medium were measured with the naked eye to determine the minimum growth inhibitory concentration (MIC) of oxacillin. The results are shown in Table 1.
[0023]
[Table 1]

[0024]
As shown in Table 1, oxacillin inhibited the growth of MRSA at the lowest concentration when the elution fraction with a 40% methanol / water mixture was used in combination. From this, it was considered that this fraction mainly contains a substance that enhances the antibacterial action of oxacillin against MRSA.
[0025]
A glass column (inner diameter: 2.2 cm, length: 52 cm) filled with “Toyopearl HW 40 Gel” (sold by Tosoh Corporation), a part of the fraction eluted from the 40% methanol / water mixture (997 mg as a solid content) And subjected to gel filtration column chromatography. Each fraction was tested in the same manner as above for the effect of each combination on the antibacterial action of oxacillin, and the fractions that significantly reduced the MIC of oxacillin were combined, lyophilized and purified Was obtained as a solid weight. The resulting purified components were tested as described above. The results are shown in Table 2.
[0026]
[Table 2]

[0027]
As shown in Table 2, the MIC against MRSA by oxacillin was significantly reduced by the combined use of the components purified from the petal extract of rose by the above method. More specifically, this purified component, when used in combination with oxacillin at a final concentration of 50 μg / ml, reduced the MIC to about 1/500 or less. From this, it was judged that this purified component has the ability to enhance antibacterial action.
[0028]
According to a conventional method, the purified components obtained above are obtained in deuterated acetone at a frequency of 500 MHz. ¹ H-nuclear magnetic resonance spectrum (hereinafter referred to as “ ¹ Abbreviated as “H-NMR”. ) Was examined, and the spectrum shown in FIG. 1 was obtained. Table 3 shows the chemical shifts and hydrogen atom assignments observed as a result.
[0029]
[Table 3]

[0030]
Based on the above results, the purified component obtained in this experiment was terimagrandin I, also known as cyclic 4,6- (4,4 ′, 5,5 ′, 6,6′-hexahydroxy [1 , 1′-biphenyl] -2,2 ′ dicarboxylate) 2,3-bis (3,4,5-trihydroxybenzoate), (S) -D-Glucose. The structure of this compound is shown in Chemical Formula 1. When examined by ordinary high performance liquid chromatography, the purity of the terimalangin I purified in this experiment was about 90%.
[0031]
[Experiment 1-2]
<Enhancement of antibacterial action of oxacillin by combined use of Terimaglandin I>
The following experiment was conducted to confirm the effect of telimaglandin I which enhances the antibacterial action of oxacillin. Terimaglandin I was prepared by purification by the method of Experiment 1-1. As a test strain, MRSA isolate OM584 was aerobically grown in MH medium at 32 ° C. As the test medium, MH medium, MH medium containing 2 μg / ml oxacillin, MH medium containing 50 μg / ml terimalangin I, MH medium containing 2 μg / ml oxacillin and 50 μg / ml terimaglandin I are used. Prepared. In these test mediums, the previously prepared test strains have a cell density of about 1 × 10 6. ⁷ The solution was added so that the number of particles / ml was reached, and kept aerobically at 32 ° C. for 20 hours. Each test medium was appropriately diluted with physiological saline, applied to a nutrient agar medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and kept at 32 ° C. for 24 hours. The colony formed on the agar medium was measured with the naked eye, and the viable cell count of the test strain at the time when it was kept in the test medium for 20 hours was determined from the measured value. The results are shown in FIG. In this figure, open circles (◯) indicate changes over time in the number of viable MRSA in MH medium, and black circles (●) indicate the number of viable MRSA in MH medium containing only oxacillin (2 μg / ml). The white triangles (Δ) indicate the time-dependent changes in the number of viable MRSA cells in MH medium containing only telimaglandin I (50 μg / ml), and the black triangles (▲) indicate oxacillin (2 μg / ml). 2 shows the time-dependent changes in the number of viable MRSA cells in MH medium containing both of the above and terimagrandin I (50 μg / ml). In addition, the vertical axis in this figure indicates the logarithmic value (base 10) of the number of viable bacteria (colony forming unit, indicated as “cfu” in FIG. 3) based on the counted number of colonies.
[0032]
As shown in FIG. 2, in MH medium, MH medium containing only 2 μg / ml oxacillin, and MH medium containing only 50 μg / ml terimalangin I, the test strains were 100 times or more after 20 hours of culture. In the MH medium containing 2 μg / ml oxacillin and 50 μg / ml terimalangin I, the test strain did not grow and died after 20 hours. The viable count was about 1/100. These results indicate that oxacillin and terimagranin I have a synergistically enhanced antibacterial effect when used in combination, and that terimagranin I has the effect of significantly enhancing the antibacterial action of antibiotics. Yes. Therefore, even when oxacillin and terimalangin I are in concentrations that cannot inhibit the growth of MRSA alone, the combined use of these can remarkably inhibit the growth of MRSA and further kill it.
[0033]
[Experiment 1-3]
<Concentration of terimalangin I effective in enhancing antibacterial action>
In order to investigate the effective concentration of terimalangin I effective in enhancing the antibacterial activity of the antibiotic oxacillin, the antibacterial activity of oxacillin in the presence of various concentrations of terimagranin I was determined according to the method of Experiment 1-1. I investigated. The results are shown in Table 4.
[0034]
[Table 4]

[0035]
As shown in Table 4, in any of the test strains, when the concentration of terimalangin I used in combination was 25 μg / ml or more, the MIC was remarkably reduced compared with the system of oxacillin alone, and antibacterial action against MRSA Was found to be enhanced. These results show that when used in combination with the antibiotic oxacillin, the concentration of terimalangin I effective to exert the antibacterial action of MRSA is about 25 μg / ml or more as a final concentration, preferably 30 μg / ml or more, More preferably, the concentration is 40 μg / ml or more, and it has been found that the concentration of terimalangin I is particularly preferable when the concentration is 50 μg / ml or more. These results indicate that the combined use or use amount of antibiotics against MRSA can be reduced by using terimaglandin I in such a concentration.
[0036]
[Experiment 1-4]
<Enhanced antibacterial action of various antibiotics by combined use of Terimaglandin I>
The effect of enhancing the antibacterial action of various antibiotics by the terimalangin I of the present invention was examined according to the method of Experiment 1-1. As antibiotics, β-lactam antibiotics such as oxacillin, benzylpenicillin (sold by Sigma, USA), ampicillin (sold by Wako Pure Chemical), cefmetazole (sold by Sigma, USA), and imipenem (sold by Sakai Pharmaceutical) Using. As test strains, MRSA isolates OM481, OM505, OM584, and OM623, and one methicillin-sensitive S. aureus (ATCC 21027) were used. The results are shown in Table 5. In this table, “single” means that the antibiotic is applied alone, and “combination” means that the antibiotic is used in combination with the final concentration of 40 μg / ml of terimalangin I. To do.
[0037]
[Table 5]

[0038]
As shown in Table 5, in any antibiotic, the MIC of the antibiotic was significantly reduced by the combined use of the antibiotic and telimaglandin I as compared to the case where the antibiotic was applied alone. From this, it was found that terimagranin I has the ability to enhance the antibacterial action of β-lactam antibiotics widely. In addition, as shown in the experimental results using oxacillin and benzylpenicillin in Table 5, terimagranin I also enhances the antibacterial action of antibiotics against microorganisms other than MRSA, although it is not as prominent as for MRSA. Also turned out. Although the data is omitted, it was confirmed by the same experiment that terimaglandin I also significantly enhanced the antibacterial action of tetracycline against MRSA.
[0039]
[Experiment 2]
<Enhanced antibacterial action by combined use of compounds with corrazine skeleton>
400 ml of a walnut leaf extract “Japanese Pharmacopoeia Uwaurushi-style extract” (sold by Shiseido Pharmaceutical Co., Ltd.) was concentrated and dried with an evaporator to obtain about 8.1 g of a solid. After dissolving this solid in an appropriate amount of distilled water, it was loaded on a glass column (inner diameter 2.2 cm, length 52 cm) filled with “Toyopearl HW40C Gel” (sold by Tosoh Corporation), then water, 20% methanol / Water mixture, 60% methanol / water mixture, methanol, 70% acetone / water mixture were sequentially passed through the column, and each eluate from the column was fractionated. After concentrating each collected fraction under reduced pressure by a conventional method, a portion thereof is used in combination with each fraction to be given to the antibacterial action of oxacillin, a β-lactam antibiotic, according to Experiment 1-1 The influence of was investigated. As a result, the MIC for MRSA of oxacillin markedly decreased when the elution fraction with a 60% methanol / water mixture was used in combination.
[0040]
The elution fraction from the above 60% methanol / water mixture was subjected to reverse phase column chromatography using “MCI CHP20P gel” (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) followed by high performance liquid chromatography for preparation according to a conventional method. In accordance with Experiment 1-1, the effect of combined use of each fraction on the antibacterial action of oxacillin, which is a β-lactam antibiotic, was examined. Among these fractions, a fraction in which the MIC of oxacillin against MRSA was particularly reduced was collected and lyophilized to obtain 364 mg of purified components as solid weight. According to the above method, MIC of oxacillin against MRSA was examined when this purified component was used in combination at final concentrations of 8 μg / ml and 16 μg / ml. The results are shown in Table 6.
[0041]
[Table 6]

[0042]
As shown in Table 6, the MIC for MRSA of oxacillin was remarkably reduced by the combined use of the components purified by the above-described method from the leaf extract of walnut. More specifically, it was found that this purified component, when used in combination with oxacillin at a final concentration of 16 μg / ml, reduces the MIC of oxacillin to MRSA to about 1/50 or less. According to the above method, the MIC of 4 isolates of MRSA isolated by the purified component alone in this experiment was examined and found to be about 128 μg / ml for all strains. The above results indicate that the antibacterial action of oxacillin is synergistically enhanced when used in combination with the above-described purified components, and that the purified components according to this experiment have a significant enhancing action on the antibacterial action of antibiotics.
[0043]
According to Experiment 1-1, the purified components obtained above were deuterated in acetone at a frequency of 500 MHz. ¹ When H-NMR was examined, the spectrum shown in FIG. 3 was obtained. Table 7 shows the chemical shifts and hydrogen atom assignments observed as a result.
[0044]
[Table 7]

[0045]
Based on the above results, the purified component obtained in this experiment was corilazine, also known as cyclic 3,6- (4,4 ′, 5,5 ′, 6,6′-hexahydroxy [1,1′− biphenyl] -2,2′dicboxylate) 1- (3,4,5-trihydroxybenzoate), β-D-Glucose. The structure of this compound is shown in Chemical Formula 2. When examined by ordinary high performance liquid chromatography, the purity of corilazine purified in this experiment was about 98%.
[0046]
Although omitted from the data, it was confirmed by the same experiment as described above that corilazine purified and identified in this experiment also significantly enhanced the antibacterial action of tetracycline against MRSA.
[0047]
[Experiment 3]
<Acute toxicity test>
According to a conventional method, any of terimaglandin I and corilazine purified by the method of Experiment 1 and Experiment 2 was administered to 8-week-old mice by the transdermal, oral or intraperitoneal route to examine acute toxicity. As a result, in any administration route, no death was observed even at the maximum dose of 100 mg / kg mouse body weight examined.
This result supports the safe application of the compounds used in the present invention to living bodies including humans.
[0048]
Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0049]
[Example 1]
<tablet>
According to the following prescription, the components (1), (4) and (5) and a part of the component (2) are uniformly mixed, compression-molded, pulverized, and the components (3) and (2 ) Were added and mixed, and compression-molded with a tableting machine to obtain 200 mg tablets.

[0050]
This product is used as a sublingual tablet to treat and prevent infections in the oral cavity caused by various types of microorganisms including MRSA. It also treats infections in the digestive system caused by various types of microorganisms including MRSA. It can be advantageously used as a tablet for internal use for prevention.
[0051]
[Example 2]
<tablet>
According to the following prescription, the components (1), (4) and (5) and a part of the component (2) are uniformly mixed, compression-molded, pulverized, and the components (3) and (2 ) Were added and mixed, and compression-molded with a tableting machine to obtain 200 mg tablets.

[0052]
This product is used as a sublingual tablet to treat and prevent infections in the oral cavity caused by various types of microorganisms including MRSA. It also treats infections in the digestive system caused by various types of microorganisms including MRSA. It can be advantageously used as a tablet for internal use for prevention.
[0053]
[Example 3]
<ointment>
According to the following prescription, the components (1), (2), (5) and (6) and a part of the component (3) are uniformly mixed, compression-molded, pulverized, and (4) The remaining amount of the component and the component (3) was added and mixed to obtain an ointment having an appropriate extension and adhesion.

[0054]
This product not only has antibacterial activity against various types of microorganisms including MRSA, but also exhibits energy replenishment to cells by maltose, so it is useful as an ointment that shortens the healing period and can heal the wound surface cleanly. It is. This product can also be used to promote the treatment of trauma such as cuts, burns and stomatitis. Furthermore, if this product is filled and molded into a soft capsule or the like, it can be advantageously used as a suppository for the treatment or prevention of infections in the rectum or vagina caused by microorganisms including MRSA.
[0055]
[Example 4]
<ointment>
According to the following prescription, the components (1), (2), (5) and (6) and a part of the component (3) are uniformly mixed, compression-molded, pulverized, and (4) The remaining amount of the component and the component (3) was added and mixed to obtain an ointment having an appropriate extension and adhesion.

[0056]
This product not only has antibacterial activity against various types of microorganisms including MRSA, but also exhibits energy replenishment to cells by maltose, so it is useful as an ointment that shortens the healing period and can heal the wound surface cleanly. It is. This product can also be used to promote the treatment of trauma such as cuts, burns and stomatitis. Furthermore, if this product is filled and molded into a soft capsule or the like, it can be advantageously used as a suppository for the treatment or prevention of infections in the rectum or vagina caused by microorganisms including MRSA.
[0057]
[Example 5]
<Antimicrobial spray>
68 parts by weight of isopropanol, 26 parts by weight of purified water, 0.9 part by weight of telimaglandin I obtained by the method of Experiment 1, 0.9 part by weight of corilazine obtained by the method of Experiment 2, 0.2 part by weight of oxacillin, 4 parts by weight of benzoic acid was added and dispersed by a conventional method to obtain a stock solution. Thereafter, according to a conventional method, an antibacterial spray was obtained by filling each 100 ml spray container with 40 ml of the stock solution and 60 ml of liquefied carbon dioxide gas as a propellant.
[0058]
This product with a broad antibacterial spectrum and enhanced antibacterial action of oxacillin is an antibacterial spray for preventing, treating or treating contamination and infection by microorganisms including MRSA. It can be advantageously used in various fields including the food field and cosmetic field.
[0059]
【The invention's effect】
As described above, the present invention has been completed based on a completely unique finding that when antibiotics are applied, the antibacterial action of the antibiotics is remarkably enhanced when combined with telimaglandin I and / or corilazine. Is. The method for enhancing antibacterial action according to the present invention is effective for sterilization and / or bacteriostasis of microorganisms, and in particular, MRSA sterilization and / or bacteriostasis for which no fundamental countermeasure has been established so far. Demonstrates remarkable effect. The method and the antibacterial agent according to the present invention are effective for prevention, treatment and / or treatment in various fields where there is a concern about contamination and infection by microorganisms including MRSA.
[0060]
It can be said that this invention having such a remarkable effect is a very significant invention that contributes to the world.
[Brief description of the drawings]
[Fig. 1] Terimaglandin I extracted and purified from rose petals ¹ It is a figure which shows a H-NMR spectrum (500 MHz).
FIG. 2 is a diagram showing a synergistic effect in the expression of antibacterial action by oxacillin and telimaglandin I against MRSA.
[Fig.3] Corrazine extracted and purified from walnut leaves ¹ It is a figure which shows a H-NMR spectrum (500 MHz).
[Explanation of symbols]
○ Time-dependent change in the number of viable MRSA cells in MH medium
● Time-dependent change in the number of viable MRSA cells in MH medium containing only oxacillin (2 μg / ml)
Δ Time-dependent change in the number of viable MRSA cells in MH medium containing only telimaglandin I (50 μg / ml)
▲ Time-dependent change in the number of viable MRSA cells in MH medium containing both oxacillin (2 μg / ml) and telimaglandin I (50 μg / ml)

Claims (3)

Terima prostaglandin I及 beauty / or Koriraji emissions and β- lactam antibiotic and antimicrobial agents comprising the additional inclusion of. lactam antibiotics oxacillin beta-, benzylpenicillin, ampicillin, antibacterial agent according to claim 1 which is cefmetazole and imipenem. The antibacterial agent according to claim 1 or 2, which exhibits an antibacterial action against methicillin-resistant staphylococci.

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