JP4524442B2 - 超微小酵素電極 - Google Patents
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で表されるレドックスポリマーと酸化還元酵素との混合物の被膜が被着されて成る酵素電極を提供する。
1. 試薬
以下の試薬を用いた。アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)からのGOD(EC 1.1.3.4; 8 U/mg)は、米国ミズーリ州St. LouisのSigma社から購入した。(NH2)2OsCl6、bpy、ピロール、1-(2-シアノエチル)ピロール及び4,4'-ジメチル-2,2'-ビピリジン(DM-bpy)は、米国ミズーリ州St. LouisのAldrich社から購入した。N-(3-ブロモプロパン-1-イル)ピロールは東京化成社から購入した。4-(4-ピロール-1-イルブチル)4'-メチル-2,2'-ビピリジン(PY-bpy)及び1-ピロールプロピオン酸(PPA)は、公知の方法(文献:J.Am.Chem.Soc.,102(1980)5543)により合成し、精製した。β-D-グルコースは、0.1 mol/LのKClを含む1/15 mol/Lのリン酸緩衝液(PBS)中で予め一夜撹拌した。全ての溶液は、超純水(18 MΩcm)を用いて調製した。
全ての電気化学実験は、BAS-CV50W電気化学分析器(米国Bioanalytical Systems社製)を用いて行なった。この分析器は、従来の三電極セル|Ag|AgCl|KCl(飽和)、参照電極及び白金線対電極を有する。光ファイバー電極(後述)を作用電極として用いた。個々の電極表面の状態は、サイクリックボルタモグラムにより1.1mmol/L ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウム及び0.1mmol/L KCl中で行なった。試料溶液を定温に維持するために、サーモスタットを用いた。
100mLの加熱エタノールに溶解した1.1モル当量のPY-bpyを、50mLの加熱エタノールに溶解した[Os(bpy)2Cl2]に添加した。この溶液をアルゴンで1時間脱気し、8時間還流した。エタノールの大部分は蒸発した。生成物を過剰のNH4PF6に添加すると、暗緑色の沈殿が生成した。粗生成物をろ過により回収し、水及びジエチルエーテルで洗浄し、乾燥し、次いでシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー(溶離液:アセトニトリル:トルエン(1:1))により精製した。生成物をアセトニトリル+水(1:1)に溶解し、Sephadex QAE-25(商品名)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより二塩化物塩に変えた。溶媒を蒸発後、沈殿を少量の無水エタノールに溶解し、ろ過した。溶媒を除去し、錯体をエタノール+エーテルから再結晶させた(収率:25.2%)。
コア部にゲルマニウムがドープされた、コア径2.3μm、外径125μm、長さ5 mの市販のシリカファイバーを、x=1.7のフッ酸緩衝液(組成:40重量%NH4F(フッ化アンモニウム):50重量%HF(フッ酸):H2O(水)=x:1:1体積比)で60分間、x=10のフッ酸緩衝液(組成:NH4F:HF:H2O=x:1:1)で90分間エッチングし、コア部に突起を形成した。形成された突起は、円錐状であり、その基部の直径は、コア径と同じであり、頂角は約17度であった。次に、市販のスパッタリング装置を用い、気圧10Pa、電圧0.4kV、電流15mA、スパッタ時間350s前後の条件でスパッタリングを行い、突起を含む光ファイバーの端面全体上に厚さ約20nmの金層を形成した。
ID = 2πFDCrapp (式1)
(F : ファラデー定数、D: 電極面の拡散定数、C: Fe(CN)6 3-/4-濃度、rapp : 電極半径)
光ファイバー微小電極上での電気誘導重合は、5mmol/Lの[Os(bpy)2PY-bpy]2+錯体、20mmol/L のPPA及び5mmol/Lのピロール及び5mmol/LのGODの存在下、0.1mol/L KCl含有PBS溶液中で、窒素雰囲気下で、-400mV〜1200mV(対Ag|AgCl)の間で100回掃引することにより行なった。得られた電極を蒸留水で洗浄し、PBS中で4℃で保存した。
実施例1で得られた微小GOD電極のグルコース存在下での応答を次のようにして調べた。実験条件は、pH7.4燐酸緩衝溶液中にて行った。測定にはポテンシオスタットALS660A(BAS社製)を用い、作用極に超微小酵素修飾電極、参照極には銀・塩化銀電極、対極には白金電極を用いる3電極方式により行った。なお、測定電位は500mV vs. Ag|AgClの定電位に設定し行った。その結果、1から60mMの濃度範囲おいてグルコースを添加したところ、あきらかに濃度依存性が確かめられた(図1)。またその応答曲線はミカエリシスメンテン型の酵素反応応答であり、この超微小酵素修飾電極においてグルコースの定量が可能であることが示された。
Claims (10)
- 光ファイバーの端面上に形成された突起上に被着された金属層から成る電極上に、下記一般式[I]
で表されるレドックスポリマーと酸化還元酵素との混合物の被膜が被着されて成る酵素電極。 - 前記l、m、nの比率が、1:1〜20:1〜10である請求項1記載の酵素電極。
- R2が低級アルキルカルボキシル基である請求項1又は2記載の酵素電極。
- R1が炭素数1〜6のアルキレン基である請求項1ないし3のいずれか1項に記載の酵素電極。
- 前記酸化還元酵素がオキシダーゼである請求項1ないし4のいずれか1項に記載の酵素電極。
- 前記オキシダーゼがグルコースオキシダーゼである請求項1ないし5のいずれか1項に記載の酵素電極。
- 前記Mがオスミウムイオンである請求項1ないし6のいずれか1項に記載の酵素電極。
- 前記光ファイバー端面上の電極は、前記突起を被覆する前記金属層と、該金属層を被覆する絶縁性電着塗料層とを具備し、前記突起を被覆する金属層の先端部が、前記電着塗料層から露出して電極を形成して成る電極である請求項1ないし9のいずれか1項に記載の酵素電極。
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