JP4504098B2 - Antibodies and their uses - Google Patents
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Description
本発明は、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩に結合特異性を有する新規な抗体に関する。更に詳しくは、抗原抗体反応に基づく該ポリペプチドまたはその塩の定量法、中和活性を利用する該ポリペプチドまたはその塩が関与する疾患（例、拒食症、肥満症、腎性浮腫、抗利尿ホルモン分泌不適症候群、尿崩症、上部消化管疾患、胃酸過多症など）の診断および予防・治療剤の開発に有用な抗体などに関する。 The present invention relates to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. The present invention relates to a novel antibody having binding specificity to a contained polypeptide or a salt thereof. More specifically, a method for quantifying the polypeptide or a salt thereof based on an antigen-antibody reaction, a disease involving the polypeptide or a salt thereof utilizing neutralizing activity (eg, anorexia, obesity, renal edema, antidiuresis) The present invention relates to antibodies useful for diagnosis, prevention and treatment of hormone secretion inappropriate syndrome, diabetes insipidus, upper gastrointestinal tract disease, hyperacidity, etc.
Gタンパク質共役型レセプターであるヒトGPR7およびヒトGPR8（Genomics、28巻、84-91頁、1995年、WO 95/12670号公報）の生体内リガンドとしてGPR8リガンド（本明細書中、NPWまたはニューロペプチドWと記載することがある）が単離同定された（特許文献１ WO 01/98494号公報、WO 02/44368号公報、J. Biol. Chem.、277巻、35826-35832頁、2002年）。NPWは、ラットまたはマウスGPR7（WO 02/44368号公報に記載のTGR26と同一のレセプター）のリガンドであることも示された（WO 02/44368、J. Biol. Chem.、277巻、35826-35832頁、2002年）。NPWの生理作用としては脳室内投与による摂食促進作用、血中プロラクチン分泌促進作用などが知られている（WO 01/98494、J. Biol. Chem.、277巻、35826-35832頁、2002年）。
NPWの生理作用または疾患に対する関与についてのさらなる検討が必要とされており、NPWを簡便かつ高感度に検出、定量する測定系が切望されていた。 Further studies on the physiological action of NPW or its involvement in diseases are required, and a measurement system for detecting and quantifying NPW simply and with high sensitivity has been desired.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、NPWを認識する複数のモノクローナル抗体を作製し、該抗体が優れたNPWの中和活性を有することも見出し、該抗体を用いるNPWの優れた測定法を開発した。そして、さらに研究を行った結果、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have produced a plurality of monoclonal antibodies that recognize NPW, and found that the antibodies have excellent NPW neutralizing activity. We have developed an excellent method for measuring NPW using EDTA. As a result of further research, the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、
（１） 配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、
（２） 配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列の第１〜１３番目のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に反応する上記（１）記載の抗体、
（２ａ） 配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記（２）記載の抗体、
（３） 配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列の第１〜３番目、第１〜４番目、第１〜５番目、第１〜６番目、第１〜７番目、第１〜８番目、第１〜９番目、第２〜４番目、第２〜５番目、第２〜６番目、第２〜７番目、第２〜８番目、第２〜９番目、第３〜５番目、第３〜６番目、第３〜７番目、第３〜８番目、第３〜９番目、第４〜６番目、第４〜７番目、第４〜８番目、第４〜９番目、第５〜７番目、第５〜８番目、第５〜９番目、第６〜８番目、第６〜９番目および第７〜９番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくともひとつを含有するペプチドに特異的に反応する上記（１）記載の抗体、
（３ａ） 配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記（３）記載の抗体、
（４） 配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドを認識しない上記（１）記載の抗体、
（５） 配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記（１）記載の抗体、
（６） 標識化された上記（１）記載の抗体、
（７） モノクローナル抗体である上記（１）記載の抗体、
（８） ＡｈＷ２３Ｎ２Ｇ６Ｄ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８３６３）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＡｈＷ２３Ｎ２Ｇ６Ｄ１ａで標示される上記（７）記載の抗体、
（９） 上記（８）記載の抗体の、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体、
（１０） 配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対して中和活性を有する上記（９）記載の抗体、
（１１） ＡｈＷ２３Ｎ３Ｈ３Ｅ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−８３６４）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＡｈＷ２３Ｎ３Ｈ３Ｅ４ａで標示される上記（７）記載の抗体、
（１２） 上記（１１）記載の抗体の、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体、
（１３） 配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対して中和活性を有する上記（１２）記載の抗体、
（１４） 配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、
（１５） 配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列の第１１〜２３番目のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に反応する上記（１４）記載の抗体、
（１５ａ） 配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記（１５）記載の抗体、
（１６） 配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列の第１６〜２３番目、第１７〜２３番目、第１８〜２３番目、第１９〜２３番目、第２０〜２３番目、第２１〜２３番目、第１６〜２２番目、第１７〜２２番目、第１８〜２２番目、第１９〜２２番目、第２０〜２２番目、第１６〜２１番目、第１７〜２１番目、第１８〜２１番目、第１９〜２１番目、第１６〜２０番目、第１７〜２０番目および第１８〜２０番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくともひとつを含有するペプチドに特異的に反応する上記（１４）記載の抗体、
（１６ａ） 配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記（１６）記載の抗体、
（１７） 配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドを認識しない上記（１４）記載の抗体、
（１８） 配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記（１４）記載の抗体、
（１９） 標識化された上記（１４）記載の抗体、
（２０） モノクローナル抗体である上記（１４）記載の抗体、
（２１） ＡｈＷ２３Ｃ６Ｇ１Ｈ８（ＦＥＲＭ ＢＰ−８３６５）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＡｈＷ２３Ｃ６Ｇ１Ｈ８ａで標示される上記（２０）記載の抗体、
（２２） 上記（２１）記載の抗体の、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体、
（２３） 配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対して中和活性を有する上記（２２）記載の抗体、
（２４） ＡｈＷ２３Ｃ５Ｇ２Ｆ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８３６６）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＡｈＷ２３Ｃ５Ｇ２Ｆ６ａで標示される上記（２０）記載の抗体、
（２５） 上記（２４）記載の抗体の、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体、
（２６） 配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対して中和活性を有する上記（２５）記載の抗体、
（２７） 配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、
（２８） 配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列の第１６〜３０番目のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に反応する上記（２７）記載の抗体、
（２８ａ） 配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記（２８）記載の抗体、
（２９） 配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列の第２３〜３０番目、第２４〜３０番目、第２５〜３０番目、第２６〜３０番目、第２７〜３０番目、第２８〜３０番目、第２３〜２９番目、第２４〜２９番目、第２５〜２９番目、第２６〜２９番目、第２７〜２９番目、第２３〜２８番目、第２４〜２８番目、第２５〜２８番目、第２６〜２８番目、第２３〜２７番目、第２４〜２７番目および第２５〜２７番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくともひとつを含有するペプチドに特異的に反応する上記（２７）記載の抗体、
（２９ａ） 配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記（２９）記載の抗体、
（３０） 配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドを認識しない上記（２７）記載の抗体、
（３１） 配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記（２７）記載の抗体、
（３２） 標識化された上記（２７）記載の抗体、
（３３） モノクローナル抗体である上記（２７）記載の抗体、
（３４） ＡｒＷ３０Ｃ３Ａ１Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−８３６７）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＡｒＷ３０Ｃ３Ａ１Ａａで標示される上記（３３）記載の抗体、
（３５） 上記（３４）記載の抗体の、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体、
（３６） 配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対して中和活性を有する上記（３５）記載の抗体、
（３７） ＡｒＷ３０Ｃ７Ｆ２Ｅ８（ＦＥＲＭ ＢＰ−８３６８）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＡｒＷ３０Ｃ７Ｆ２Ｅ８ａで標示される上記（３３）記載の抗体、
（３８） 上記（３７）記載の抗体の、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体、
（３９） 配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対して中和活性を有する上記（３８）記載の抗体、
（４０） 上記（１）、（１４）または（２７）記載の抗体を含有してなる医薬、
（４１） 不妊症、腎性浮腫、消化性潰瘍または胃酸過多症の予防・治療剤である上記（４０）記載の医薬、
（４２） 上記（１）、（１４）および／または（２７）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（４３） 上記（１）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法、
（４４） さらに上記（１４）または（２７）記載の抗体を用いることを特徴とする上記（４３）記載の定量法、
（４５） 上記（１４）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法、
（４６） 上記（２７）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法、
（４７） 上記（１）記載の抗体と、被検液および標識化された配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩とを競合的に反応させ、上記抗体に結合した上記標識化されたポリペプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする、被検液中の配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法、
（４８） 上記（１４）記載の抗体と、被検液および標識化された配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩とを競合的に反応させ、上記抗体に結合した上記標識化されたポリペプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする、被検液中の配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法、
（４９） 上記（２７）記載の抗体と、被検液および標識化された配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩とを競合的に反応させ、上記抗体に結合した上記標識化されたポリペプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする、被検液中の配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法、
（５０） １）担体上に不溶化した上記（１）記載の抗体、標識化された上記（１４）記載の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定する、または２）担体上に不溶化した上記（１４）記載の抗体、標識化された上記（１）記載の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法、
（５１） １）担体上に不溶化した上記（１）記載の抗体、標識化された上記（２７）記載の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定する、または２）担体上に不溶化した上記（２７）記載の抗体、標識化された上記（１）記載の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法、
（５２） 上記（１）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩が関与する疾患の診断法、
（５３） さらに上記（１４）または（２７）記載の抗体を用いることを特徴とする上記（５２）記載の診断法、
（５４） 上記（１４）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩が関与する疾患の診断法、
（５５） 上記（２７）記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩が関与する疾患の診断法、
（５６） 疾患が、不妊症、腎性浮腫、消化性潰瘍または胃酸過多症である、上記（５２）〜（５５）記載の診断法、
（５７） 上記（７）記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞、
（５８） ＡｈＷ２３Ｎ２Ｇ６Ｄ１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８３６３）またはＡｈＷ２３Ｎ３Ｈ３Ｅ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−８３６４）で標示される上記（５７）記載のハイブリドーマ細胞、
（５９） 上記（５８）記載のハイブリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から上記（７）記載の抗体を採取することを特徴とする上記（７）記載の抗体の製造法、
（６０） 上記（２０）記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞、
（６１） ＡｈＷ２３Ｃ６Ｇ１Ｈ８（ＦＥＲＭ ＢＰ−８３６５）またはＡｈＷ２３Ｃ５Ｇ２Ｆ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８３６６）で標示される上記（６０）記載のハイブリドーマ細胞、
（６２） 上記（６１）記載のハイブリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から上記（２０）記載の抗体を採取することを特徴とする上記（２０）記載の抗体の製造法、
（６３） 上記（３３）記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞、
（６４） ＡｒＷ３０Ｃ３Ａ１Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−８３６７）またはＡｒＷ３０Ｃ７Ｆ２Ｅ８（ＦＥＲＭ ＢＰ−８３６８）で標示される上記（６３）記載のハイブリドーマ細胞、
（６５） 上記（６４）記載のハイブリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から上記（３３）記載のモノクローナル抗体を採取することを特徴とする上記（３３）記載の抗体の製造法、
（６６） 哺乳動物に対し、上記（１）、（１４）または（２７）記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする不妊症、腎性浮腫、消化性潰瘍または胃酸過多症の予防・治療法、
（６７） 不妊症、腎性浮腫、消化性潰瘍または胃酸過多症の予防・治療剤を製造するための上記（１）、（１４）または（２７）記載の抗体の使用などに関する。
That is, the present invention
(1) Contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. An antibody that specifically reacts with a partial peptide on the N-terminal side of the polypeptide or a salt thereof,
(2) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 The antibody according to (1), which specifically reacts with a peptide having the amino acid sequence of 1 to 13;
(2a) Contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. The antibody according to (2), which has neutralizing activity against the peptide
(3) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 1st to 3rd, 1st to 4th, 1st to 5th, 1st to 6th, 1st to 7th, 1st to 8th, 1st to 9th, 2nd to 4th, 2nd to 2nd 5th, 2nd to 6th, 2nd to 7th, 2nd to 8th, 2nd to 9th, 3rd to 5th, 3rd to 6th, 3rd to 7th, 3rd to 8th 3rd to 9th, 4th to 6th, 4th to 7th, 4th to 8th, 4th to 9th, 5th to 7th, 5th to 8th, 5th to 9th, The antibody according to (1) above, which specifically reacts with a peptide containing at least one selected from the sixth to eighth, sixth to ninth, and seventh to ninth amino acid sequences;
(3a) Contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. The antibody according to (3), which has neutralizing activity against the peptide
(4) Contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. The antibody according to (1) above, which does not recognize a partial peptide on the C-terminal side of the polypeptide or a salt thereof,
(5) Contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. The antibody according to (1), which has neutralizing activity against the peptide
(6) the labeled antibody according to (1),
(7) The antibody according to (1) above, which is a monoclonal antibody,
(8) The antibody according to (7), which is indicated by AhW23N2G6D1a, which can be produced from a hybridoma cell indicated by AhW23N2G6D1 (FERM BP-8363),
(9) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: An antibody that specifically reacts with a binding site for a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by 11,
(10) Contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. The antibody according to (9), which has neutralizing activity against the polypeptide
(11) The antibody according to (7), which is indicated by AhW23N3H3E4a, which can be produced from a hybridoma cell indicated by AhW23N3H3E4 (FERM BP-8364),
(12) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: of the antibody described in (11) above An antibody that specifically reacts with a binding site for a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by 11,
(13) Contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. The antibody according to (12), which has neutralizing activity against the polypeptide
(14) An antibody that specifically reacts with a C-terminal partial peptide of a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, or a salt thereof ,
(15) The above (14), which specifically reacts with a peptide having the 11th to 23rd amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10. The described antibodies,
(15a) The antibody according to (15) above, which has neutralizing activity against a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10,
(16) 16th to 23rd, 17th to 23rd, 18th to 23rd, 19th to 19th of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 23rd, 20th to 23rd, 21st to 23rd, 16th to 22nd, 17th to 22nd, 18th to 22nd, 19th to 22nd, 20th to 22nd, 16th to 21st Specific to peptides containing at least one amino acid sequence selected from the 17th to 21st, 18th to 21st, 19th to 21st, 16th to 20th, 17th to 20th and 18th to 20th amino acid sequences The antibody according to (14), which reacts automatically,
(16a) The antibody according to (16) above, which has neutralizing activity against a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10,
(17) The polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, or the partial peptide on the N-terminal side of the salt thereof (14) The described antibodies,
(18) The antibody according to (14) above, which has neutralizing activity against a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10,
(19) The labeled antibody according to (14),
(20) The antibody according to (14), which is a monoclonal antibody,
(21) The antibody according to (20) above, which is indicated by AhW23C6G1H8a, which can be produced from a hybridoma cell indicated by AhW23C6G1H8 (FERM BP-8365),
(22) The antibody according to (21) above specifically reacts with a binding site to a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 Antibody to
(23) The antibody according to (22) above, which has neutralizing activity against a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10,
(24) The antibody according to (20) above, which is indicated by AhW23C5G2F6a, which can be produced from a hybridoma cell indicated by AhW23C5G2F6 (FERM BP-8366),
(25) The antibody according to (24) above specifically reacts with a binding site to a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 Antibody to
(26) The antibody according to (25) above, which has neutralizing activity against a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10,
(27) An antibody that specifically reacts with a C-terminal partial peptide of a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, or a salt thereof ,
(28) The above (27), which specifically reacts with a peptide having the 16th to 30th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. The described antibodies,
(28a) The antibody according to (28) above, which has neutralizing activity against a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11,
(29) SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, amino acid sequence 23-30, 24-30, 25-30, 26-26 30th, 27-30th, 28-30th, 23-29th, 24-29th, 25-29th, 26-29th, 27-29th, 23-28th Specific to peptides containing at least one amino acid sequence selected from 24th to 28th, 25th to 28th, 26th to 28th, 23th to 27th, 24th to 27th and 25th to 27th amino acid sequences The antibody according to (27), which reacts automatically,
(29a) The antibody according to (29) above, which has neutralizing activity against a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11,
(30) The polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 or a partial peptide on the N-terminal side of the salt thereof (27) The described antibodies,
(31) The antibody according to (27), which has neutralizing activity against a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11,
(32) the labeled antibody according to (27),
(33) The antibody according to (27), which is a monoclonal antibody,
(34) The antibody according to (33) above, which is indicated by ArW30C3A1Aa, which can be produced from a hybridoma cell indicated by ArW30C3A1A (FERM BP-8367),
(35) The antibody according to (34) above specifically reacts with a binding site for a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, Antibody to
(36) The antibody according to (35) above, which has neutralizing activity against a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11,
(37) The antibody according to (33), which is represented by ArW30C7F2E8a, which can be produced from a hybridoma cell represented by ArW30C7F2E8 (FERM BP-8368),
(38) The antibody according to (37) above specifically reacts with a binding site for a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, Antibody to
(39) The antibody according to (38), which has neutralizing activity against a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11,
(40) A medicament comprising the antibody according to (1), (14) or (27) above,
(41) The medicament according to the above (40), which is a prophylactic / therapeutic agent for infertility, renal edema, peptic ulcer or hyperacidity,
(42) a diagnostic agent comprising the antibody according to (1), (14) and / or (27),
(43) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: characterized by using the antibody described in (1) above 10 or a method for quantifying a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a salt thereof,
(44) The quantification method according to (43), further using the antibody according to (14) or (27),
(45) A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 10, or a salt thereof, characterized by using the antibody according to (14) Quantitation method,
(46) A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, or a salt thereof, characterized by using the antibody described in (27) above Quantitation method,
(47) The antibody according to (1) above, a test solution and labeled SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, The polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or a salt thereof is competitively reacted, and the ratio of the labeled polypeptide or the salt thereof bound to the antibody is measured. SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: in the test solution, A method for quantifying a polypeptide containing the amino acid sequence represented by No. 11 or a salt thereof;
(48) A polypeptide comprising the antibody according to (14) above and a test solution and a labeled amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10. Alternatively, it is reacted with a salt thereof competitively, and the ratio of the labeled polypeptide bound to the antibody or the salt thereof is measured, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: in the test solution 6, a method for quantifying a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, or a salt thereof,
(49) A polypeptide comprising the antibody according to (27) above, a test solution and a labeled amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. Alternatively, it is reacted with a salt thereof competitively, and the ratio of the labeled polypeptide bound to the antibody or the salt thereof is measured. 7, a method for quantifying a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 or a salt thereof,
(50) 1) After reacting the antibody described in (1) above, the labeled antibody described in (14) above, and a test solution, the activity of the labeling agent is measured, or 2) In the test solution characterized by measuring the activity of the labeling agent after reacting the antibody described in (14) above insolubilized on the carrier, the labeled antibody described in (1) above and the test solution A method for quantifying a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, or a salt thereof,
(51) 1) After reacting the antibody according to (1) above insolubilized on the carrier, the labeled antibody according to (27) above and a test solution, the activity of the labeling agent is measured, or 2) In a test solution characterized by measuring the activity of a labeling agent after reacting the antibody described in (27) above insolubilized on a carrier, the labeled antibody described in (1) above and a test solution A method for quantifying a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 or a salt thereof,
(52) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: characterized by using the antibody described in (1) above A diagnostic method for a disease involving a polypeptide containing the amino acid sequence represented by 10 or SEQ ID NO: 11 or a salt thereof,
(53) The diagnostic method according to (52) above, further comprising using the antibody according to (14) or (27) above,
(54) A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 10, or a salt thereof, characterized by using the antibody according to (14) Diagnostic methods for diseases involving
(55) A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 11, or a salt thereof, characterized by using the antibody according to (27) Diagnostic methods for diseases involving
(56) The diagnostic method according to the above (52) to (55), wherein the disease is infertility, renal edema, peptic ulcer or hyperacidity,
(57) A hybridoma cell that produces the antibody according to (7) above,
(58) The hybridoma cell according to (57), which is represented by AhW23N2G6D1 (FERM BP-8363) or AhW23N3H3E4 (FERM BP-8364),
(59) The antibody described in (7) above, wherein the hybridoma cell described in (58) above is cultured in vivo or in vitro, and the antibody described in (7) above is collected from the body fluid or culture. Manufacturing method,
(60) A hybridoma cell that produces the antibody according to (20) above,
(61) The hybridoma cell according to (60), which is indicated by AhW23C6G1H8 (FERM BP-8365) or AhW23C5G2F6 (FERM BP-8366),
(62) The antibody according to (20), wherein the hybridoma cell according to (61) is cultured in vivo or in vitro, and the antibody according to (20) is collected from the body fluid or culture. Manufacturing method,
(63) A hybridoma cell that produces the antibody according to (33) above,
(64) The hybridoma cell according to (63), which is represented by ArW30C3A1A (FERM BP-8367) or ArW30C7F2E8 (FERM BP-8368),
(65) The antibody according to (33), wherein the hybridoma cell according to (64) is cultured in vivo or in vitro, and the monoclonal antibody according to (33) is collected from the body fluid or culture. Manufacturing method,
(66) Prevention of infertility, renal edema, peptic ulcer or hyperacidity, which comprises administering an effective amount of the antibody according to (1), (14) or (27) to a mammal ·Treatment,
(67) Use of the antibody according to (1), (14) or (27) for producing a prophylactic / therapeutic agent for infertility, renal edema, peptic ulcer or hyperacidity.
本発明の抗体は、極めて高いNPWへの結合能を有し、NPWの細胞内cAMP産生抑制活性を中和することができ、摂食促進作用、プロラクチン産生抑制作用、利尿作用、胃酸分泌抑制作用も有する。
従って、本発明の抗体は、NPWの作用を抑制することにより、例えば拒食症、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常、腎性浮腫、尿排出障害（例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など）、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適症候群（SIADH）、高血圧、上部消化管疾患（例、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Zollinger-Ellison症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、NUD（Non Ulcer Dyspepsia）、胃癌、胃MALTリンパ腫、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、胃酸過多、潰瘍など）などの予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤などの安全な医薬として使用することができる。
本発明の抗体を用いる測定法、好ましくはNPWのＣ端部を特異的に認識するモノクローナル抗体とNPWのＮ端部を特異的に認識するモノクローナル抗体とを用いるサンドイッチ法による免疫学的測定法などにより、NPWを感度よく特異的に定量することができるため、例えば、NPWが関与する疾患〔例、拒食症、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常、腎性浮腫、尿排出障害（例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など）、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適症候群（SIADH）、高血圧、蓄尿障害（例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など）、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカリローシス、低カリウム血症、Cushing症候群、上部消化管疾患（例、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Zollinger-Ellison症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、NUD（Non Ulcer Dyspepsia）、胃癌、胃MALTリンパ腫、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、胃酸過多、潰瘍など）、消化不良症（例、下垂体性消化不良症、腎性消化不良症など）、骨代謝障害（例、骨粗しょう症、骨軟化症など）、貧血症（例、鉄欠乏性貧血など）など〕などの診断ができる。また、本発明の抗体は、NPWの免疫組織染色にも使用可能である。
The antibody of the present invention has an extremely high ability to bind to NPW, and can neutralize the intracellular cAMP production inhibitory activity of NPW. It promotes feeding, suppresses prolactin production, diuresis, and suppresses gastric acid secretion. Also have.
Therefore, the antibody of the present invention suppresses the action of NPW, for example, anorexia, pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormality, autoimmune disease, prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage , Acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenesis, renal edema, urinary drainage disorders (eg, bladder contraction disorder, urethral passage disorder, Dysuria, pain, urinary obstruction, etc., hyponatremia, antidiuretic hormone inadequate secretion syndrome (SIADH), hypertension, upper gastrointestinal tract disease (eg, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer) , Zollinger-Ellison syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia), gastric cancer, gastric MALT lymphoma, ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs Hyperacidity, such as ulcerative) prophylactic or therapeutic agent such as, can be used as a safe pharmaceutical, such as eating (appetite) accelerator.
Measurement method using the antibody of the present invention, preferably immunoassay by sandwich method using monoclonal antibody specifically recognizing the C-terminal part of NPW and monoclonal antibody specifically recognizing the N-terminal part of NPW NPW can be quantified with high sensitivity and specificity. For example, diseases involving NPW [eg, anorexia, obesity (eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulin obesity, Plasma obesity, pituitary obesity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic obesity, childhood obesity, upper body obesity, dietary obesity, hyposexual obesity, systemic Mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc.), pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormality, autoimmune disease, prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari Flow Mel syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenic abnormality, renal edema, urinary discharge disorder (eg, bladder contraction disorder, urethral passage disorder, dysuria, pain in urination, urine Road obstruction, etc., hyponatremia, antidiuretic hormone inappropriate syndrome (SIADH), hypertension, urinary storage disorder (eg, frequent urination, urinary incontinence (eg, urge incontinence, stress urinary incontinence, functional urinary incontinence) )), Polyuria, diabetes insipidus (eg, pituitary diabetes insipidus, nephrogenic diabetes insipidus), hypernatremia, metabolic alkaline rhosis, hypokalemia, Cushing syndrome, upper digestion Tract disease (eg, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-Ellison syndrome), gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia), gastric cancer, gastric MALT lymphoma, non-steroidal Caused by anti-inflammatory drugs Ulcers, hyperacidity, ulcers), dyspepsia (eg, pituitary dyspepsia, renal dyspepsia), bone metabolism disorders (eg, osteoporosis, osteomalacia, etc.), anemia ( Diagnosis such as iron deficiency anemia). The antibody of the present invention can also be used for immunohistochemical staining of NPW.
本明細書におけるタンパク質（ポリペプチド）は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはエステルの何れであってもよい。
配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、（1）配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列に数（1〜5）個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（2）配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列に数（1〜5）個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（3）配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列中の数（1〜5）個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有するポリペプチドなどが用いられる。
配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、または有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
In the present specification, the protein (polypeptide) has the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (carboxyl terminus) at the right end in accordance with the convention of peptide designation. The protein used in the present invention including the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may have any of a carboxyl group, a carboxylate, an amide, or an ester at the C-terminus.
As a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. Is represented by, for example, (1) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. Amino acid sequence with several (1-5) amino acids added to the amino acid sequence, (2) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 , SEQ ID NO: 10 or amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 in which several (1-5) amino acids are inserted, (3) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 Alternatively, a polypeptide containing an amino acid sequence in which several (1-5) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 are substituted with other amino acids is used.
Polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. As the salt, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid) or a base (eg, alkali metal) is used, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. . Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドとしては、例えば、
（a）配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列の
（i）第１〜３番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ii）第１〜４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iii）第１〜５番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iv）第１〜６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（v）第１〜７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（vi）第１〜８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（vii）第１〜９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（viii）第２〜４番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ix）第２〜５番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（x）第２〜６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xi）第２〜７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xii）第２〜８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xiii）第２〜９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xiv）第３〜５番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xv）第３〜６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xvi）第３〜７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xvii）第３〜８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xviii）第３〜９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xix）第４〜６番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xx）第４〜７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xxi）第４〜８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xxii）第４〜９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xxiii）第５〜７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xxiv）第５〜８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xxv）第５〜９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xxvi）第６〜８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xxvii）第６〜９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに
（xxviii）第７〜９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
（b）配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列の第１〜５番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが挙げられる。
Polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. Or, as a partial peptide on the N-terminal side of the salt, for example,
(A) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 ( i) a polypeptide having the first to third amino acid sequences,
(Ii) a polypeptide having the first to fourth amino acid sequences,
(Iii) a polypeptide having the first to fifth amino acid sequences,
(Iv) a polypeptide having the first to sixth amino acid sequences,
(V) a polypeptide having the first to seventh amino acid sequences,
(Vi) a polypeptide having the first to eighth amino acid sequences,
(Vii) a polypeptide having the first to ninth amino acid sequences,
(Viii) a polypeptide having the second to fourth amino acid sequences,
(Ix) a polypeptide having the second to fifth amino acid sequences,
(X) a polypeptide having the second to sixth amino acid sequences,
(Xi) a polypeptide having the second to seventh amino acid sequences,
(Xii) a polypeptide having the second to eighth amino acid sequence,
(Xiii) a polypeptide having the second to ninth amino acid sequences,
(Xiv) a polypeptide having the third to fifth amino acid sequences,
(Xv) a polypeptide having the third to sixth amino acid sequences,
(Xvi) a polypeptide having the 3rd to 7th amino acid sequence,
(Xvii) a polypeptide having the 3rd to 8th amino acid sequence,
(Xviii) a polypeptide having the third to ninth amino acid sequences,
(Xix) a polypeptide having the fourth to sixth amino acid sequences,
(Xx) a polypeptide having the 4th to 7th amino acid sequence,
(Xxi) a polypeptide having the fourth to eighth amino acid sequence,
(Xxii) a polypeptide having the fourth to ninth amino acid sequences,
(Xxiii) a polypeptide having the 5th to 7th amino acid sequence,
(Xxiv) a polypeptide having the 5th to 8th amino acid sequence,
(Xxv) a polypeptide having the 5th to 9th amino acid sequence,
(Xxvi) a polypeptide having the sixth to eighth amino acid sequence,
(Xxvii) a polypeptide having the sixth to ninth amino acid sequence, and (xxviii) a polypeptide having the seventh to ninth amino acid sequence, and (b) represented by SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 Examples thereof include a polypeptide having the first to fifth amino acid sequences in the amino acid sequence.
配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドとしては、例えば、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列の、
（i）第１６〜２３番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ii）第１７〜２３番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iii）第１８〜２３番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iv）第１９〜２３番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（v）第２０〜２３番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（vi）第２１〜２３番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（vii）第１６〜２２番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（viii）第１７〜２２番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ix）第１８〜２２番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（x）第１９〜２２番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xi）第２０〜２２番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xii）第１６〜２１番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xiii）第１７〜２１番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xiv）第１８〜２１番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xv）第１９〜２１番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xvi）第１６〜２０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xvii）第１７〜２０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
（xviii）第１８〜２０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが挙げられる。
As a partial peptide on the C-terminal side of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, or a salt thereof, for example, SEQ ID NO: 4, Of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10,
(I) a polypeptide having the 16th to 23rd amino acid sequence,
(Ii) a polypeptide having the 17th to 23rd amino acid sequence,
(Iii) a polypeptide having the 18th to 23rd amino acid sequence,
(Iv) a polypeptide having the 19th to 23rd amino acid sequence,
(V) a polypeptide having the 20th to 23rd amino acid sequence,
(Vi) a polypeptide having the 21st to 23rd amino acid sequence,
(Vii) a polypeptide having the 16th to 22nd amino acid sequence,
(Viii) a polypeptide having the 17th to 22nd amino acid sequence,
(Ix) a polypeptide having the 18th to 22nd amino acid sequence,
(X) a polypeptide having the 19th to 22nd amino acid sequence,
(Xi) a polypeptide having the 20th to 22nd amino acid sequence,
(Xii) a polypeptide having the 16th to 21st amino acid sequence,
(Xiii) a polypeptide having the 17th to 21st amino acid sequence,
(Xiv) a polypeptide having the 18th to 21st amino acid sequence,
(Xv) a polypeptide having the 19th to 21st amino acid sequence,
(Xvi) a polypeptide having the 16th to 20th amino acid sequence,
(Xvii) a polypeptide having the 17th to 20th amino acid sequence and (xviii) a polypeptide having the 18th to 20th amino acid sequence.
配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドとしては、例えば、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列の、
（i）第２３〜３０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ii）第２４〜３０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iii）第２５〜３０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iv）第２６〜３０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（v）第２７〜３０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（vi）第２８〜３０番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（vii）第２３〜２９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（viii）第２４〜２９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ix）第２５〜２９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（x）第２６〜２９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xi）第２７〜２９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xii）第２３〜２８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xiii）第２４〜２８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xiv）第２５〜２８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xv）第２６〜２８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xvi）第２３〜２７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（xvii）第２４〜２７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および
（xviii）第２５〜２７番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが挙げられる。
As the partial peptide on the C-terminal side of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 or a salt thereof, for example, SEQ ID NO: 5, Of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11,
(I) a polypeptide having the 23rd to 30th amino acid sequence,
(Ii) a polypeptide having the 24th to 30th amino acid sequence,
(Iii) a polypeptide having the 25th to 30th amino acid sequence,
(Iv) a polypeptide having the 26th to 30th amino acid sequence,
(V) a polypeptide having the 27th to 30th amino acid sequence,
(Vi) a polypeptide having the 28th to 30th amino acid sequence,
(Vii) a polypeptide having the 23rd to 29th amino acid sequence,
(Viii) a polypeptide having the 24th to 29th amino acid sequence,
(Ix) a polypeptide having the 25th to 29th amino acid sequence,
(X) a polypeptide having the 26th to 29th amino acid sequence,
(Xi) a polypeptide having the 27th to 29th amino acid sequence,
(Xii) a polypeptide having the 23rd to 28th amino acid sequence,
(Xiii) a polypeptide having the 24th to 28th amino acid sequence,
(Xiv) a polypeptide having the 25th to 28th amino acid sequence,
(Xv) a polypeptide having the 26th to 28th amino acid sequence,
(Xvi) a polypeptide having the 23rd to 27th amino acid sequence,
(Xvii) a polypeptide having the 24th to 27th amino acid sequence, and (xviii) a polypeptide having the 25th to 27th amino acid sequence.
配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、例えば該ポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応するものであればよく、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。具体的には、配列番号：４で表されるアミノ酸配列の第１〜１３番目までのアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号：４で表されるアミノ酸配列の第１〜１３番目までのアミノ酸配列を有し、かつこのアミノ酸配列の第１４番目をCys-NH2に置換したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）などが用いられる。
このうち好ましくは、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドを認識しないものである。
さらに好ましくは、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の活性を中和する抗体である。
具体的には、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩に対して１〜１０００倍、好ましくは１〜１００倍、さらに好ましくは１〜１０倍のモル比で添加した際に、上記ポリペプチドまたはその塩の活性〔例、ヒトＧＰＲ８、ヒトＧＰＲ７、ラットＧＰＲ７またはマウスＧＰＲ７を発現する細胞に対する細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成および抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性など）など〕を１０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上抑制する抗体などである。
好ましい具体例としては、ＡｈＷ２３Ｎ２Ｇ６Ｄ１ａで標示されるモノクローナル抗体、ＡｈＷ２３Ｎ３Ｈ３Ｅ４ａで標示されるモノクローナル抗体などが挙げられる。
さらに、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、（a）配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列の（i）第１〜３番目のアミノ酸配列、（ii）第１〜４番目のアミノ酸配列、（iii）第１〜５番目のアミノ酸配列、（iv）第１〜６番目のアミノ酸配列、（v）第１〜７番目のアミノ酸配列、（vi）第１〜８番目のアミノ酸配列、（vii）第１〜９番目のアミノ酸配列、（viii）第２〜４番目のアミノ酸配列、（ix）第２〜５番目のアミノ酸配列、（x）第２〜６番目のアミノ酸配列、（xi）第２〜７番目のアミノ酸配列、（xii）第２〜８番目のアミノ酸配列、（xiii）第２〜９番目のアミノ酸配列、（xiv）第３〜５番目のアミノ酸配列、（xv）第３〜６番目のアミノ酸配列、（xvi）第３〜７番目のアミノ酸配列、（xvii）第３〜８番目のアミノ酸配列、（xviii）第３〜９番目のアミノ酸配列、（xix）第４〜６番目のアミノ酸配列、（xx）第４〜７番目のアミノ酸配列、（xxi）第４〜８番目のアミノ酸配列、（xxii）第４〜９番目のアミノ酸配列、（xxiii）第５〜７番目のアミノ酸配列、（xxiv）第５〜８番目のアミノ酸配列、（xxv）第５〜９番目のアミノ酸配列、（xxvi）第６〜８番目のアミノ酸配列、（xxvii）第６〜９番目のアミノ酸配列もしくは（xxviii）第７〜９番目のアミノ酸配列、または（b）配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列の第１〜５番目のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体などが用いられる。
Polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. Alternatively, the antibody that specifically reacts with the partial peptide on the N-terminal side of the salt thereof may be any antibody that specifically reacts with the partial peptide on the N-terminal side of the polypeptide or the salt thereof, preferably a monoclonal antibody. Is mentioned. Specifically, a peptide comprising the first to thirteenth amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and the first to thirteenth amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 And an antibody (preferably a monoclonal antibody) that specifically reacts with a polypeptide having an amino acid sequence in which the 14th amino acid sequence is substituted with Cys-NH 2 .
Among these, preferably, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. Which does not recognize a partial peptide on the C-terminal side of a polypeptide containing a salt or a salt thereof.
More preferably, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 is used. An antibody that neutralizes the activity of the polypeptide or salt thereof.
Specifically, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. 1 to 1000 times, preferably 1 to 100 times, more preferably 1 to 10 times the molar ratio of the polypeptide or its salt, and the activity of the polypeptide or its salt [eg, Cell stimulating activity against cells expressing human GPR8, human GPR7, rat GPR7 or mouse GPR7 (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation and suppression, intracellular cGMP generation, inositol phosphate Activity that promotes production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, GTPγS binding activity, etc. Etc.), etc.] 10% or more, such as preferably 50% or more, more preferably inhibits 80% antibody.
Preferable specific examples include a monoclonal antibody indicated by AhW23N2G6D1a, a monoclonal antibody indicated by AhW23N3H3E4a, and the like.
Furthermore, it contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. As an antibody that specifically reacts with a partial peptide on the N-terminal side of a polypeptide or a salt thereof, (a) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, (I) the first to third amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11, (ii) the first to fourth amino acid sequences, and (iii) the first -5th amino acid sequence, (iv) 1st to 6th amino acid sequence, (v) 1st to 7th amino acid sequence, (vi) 1st to 8th amino acid sequence, (vii) 1st to 9th amino acid sequence (Viii) 2nd to 4th amino acid sequence, (ix) 2nd to 5th amino acid sequence (X) 2nd to 6th amino acid sequence, (xi) 2nd to 7th amino acid sequence, (xii) 2nd to 8th amino acid sequence, (xiii) 2nd to 9th amino acid sequence Sequence, (xiv) 3rd to 5th amino acid sequence, (xv) 3rd to 6th amino acid sequence, (xvi) 3rd to 7th amino acid sequence, (xvii) 3rd to 8th amino acid sequence, (Xviii) the third to ninth amino acid sequences, (xix) the fourth to sixth amino acid sequences, (xx) the fourth to seventh amino acid sequences, (xxi) the fourth to eighth amino acid sequences, (xxii) ) 4th to 9th amino acid sequence, (xxiii) 5th to 7th amino acid sequence, (xxiv) 5th to 8th amino acid sequence, (xxv) 5th to 9th amino acid sequence, (xxvi) 6th-8th amino acid sequence, (xxvii) 6th-9th amino acid sequence or (xxviii) 7th-9th amino acid sequence Acid sequence, or (b) SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: such antibody that specifically recognizes the first to fifth amino acid sequence of the amino acid sequence represented by 11 is used.
また、ＡｈＷ２３Ｎ２Ｇ６Ｄ１ａで標示されるモノクローナル抗体またはＡｈＷ２３Ｎ３Ｈ３Ｅ４ａで標示されるモノクローナル抗体の、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体（例、モノクローナル抗体）も、本発明に含まれる。中でも、上記ポリペプチドに対して中和活性を有する抗体（例、モノクローナル抗体）である。
上記「結合部位」としては、ＡｈＷ２３Ｎ２Ｇ６Ｄ１ａで標示されるモノクローナル抗体またはＡｈＷ２３Ｎ３Ｈ３Ｅ４ａで標示されるモノクローナル抗体が結合する部位であればよく、好ましくは、特異的に結合する部位、エピトープである。
Further, the monoclonal antibody indicated by AhW23N2G6D1a or the monoclonal antibody indicated by AhW23N3H3E4a, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, sequence An antibody (eg, monoclonal antibody) that specifically reacts with a binding site for a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 is also included in the present invention. Among them, an antibody (eg, monoclonal antibody) having neutralizing activity against the above polypeptide.
The “binding site” may be a site to which a monoclonal antibody indicated by AhW23N2G6D1a or a monoclonal antibody indicated by AhW23N3H3E4a binds, and is preferably a site or epitope that specifically binds.
配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体は、例えば、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応するものであればよく、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。
具体的には、例えば、配列番号：４で表されるアミノ酸配列の第１１〜２３番目までのアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号：４で表されるアミノ酸配列の第１１〜２３番目までのアミノ酸配列を有し、かつこのアミノ酸配列の第１１番目にCysを付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）などが用いられる。
このうち好ましくは、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドを認識しないものである。
さらに好ましくは、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の活性を中和する抗体である。
具体的には、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩に対して１〜１０００倍、好ましくは１〜１００倍、さらに好ましくは１〜１０倍のモル比で添加した際に、上記ポリペプチドまたはその塩の活性〔例、ヒトＧＰＲ８、ヒトＧＰＲ７、ラットＧＰＲ７またはマウスＧＰＲ７を発現する細胞に対する細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成および抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性など）など〕を１０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上抑制する抗体などである。
好ましい具体例としては、ＡｈＷ２３Ｎ２Ｇ６Ｄ１ａで標示されるモノクローナル抗体、ＡｈＷ２３Ｎ３Ｈ３Ｅ４ａで標示されるモノクローナル抗体などが挙げられる。
さらに、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列の、（i）第１６〜２３番目のアミノ酸配列、（ii）第１７〜２３番目のアミノ酸配列、（iii）第１８〜２３番目のアミノ酸配列、（iv）第１９〜２３番目のアミノ酸配列、（v）第２０〜２３番目のアミノ酸配列、（vi）第２１〜２３番目のアミノ酸配列、（vii）第１６〜２２番目のアミノ酸配列、（viii）第１７〜２２番目のアミノ酸配列、（ix）第１８〜２２番目のアミノ酸配列、（x）第１９〜２２番目のアミノ酸配列、（xi）第２０〜２２番目のアミノ酸配列、（xii）第１６〜２１番目のアミノ酸配列、（xiii）第１７〜２１番目のアミノ酸配列、（xiv）第１８〜２１番目のアミノ酸配列、（xv）第１９〜２１番目のアミノ酸配列、（xvi）第１６〜２０番目のアミノ酸配列、（xvii）第１７〜２０番目のアミノ酸配列または（xviii）第１８〜２０番目のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体などが用いられる。
An antibody that specifically reacts with a C-terminal partial peptide of a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 or a salt thereof, for example, A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 or a partial peptide on the C-terminal side of a salt thereof. A monoclonal antibody is preferable.
Specifically, for example, a peptide containing the amino acid sequence from the 11th to the 23rd position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, the amino acid from the 11th to the 23rd position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 An antibody (preferably a monoclonal antibody) that specifically reacts with a polypeptide having a sequence and having an amino acid sequence in which Cys is added to the 11th amino acid sequence is used.
Among these, the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 or a partial peptide on the N-terminal side of the salt thereof is preferably not recognized. is there.
More preferred is an antibody that neutralizes the activity of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, or a salt thereof.
Specifically, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, or 1 to 1000 times, preferably 1 to 1000 times the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or a salt thereof. When added at a molar ratio of 100 times, more preferably 1 to 10 times, the activity of the polypeptide or a salt thereof [eg, cell stimulating activity against cells expressing human GPR8, human GPR7, rat GPR7 or mouse GPR7 ( Examples, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation and suppression, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, activity that promotes GTPγS binding activity, etc.)] is more than 10%, preferably more than 50%, more preferably Ku is such inhibiting antibodies more than 80%.
Preferable specific examples include a monoclonal antibody indicated by AhW23N2G6D1a, a monoclonal antibody indicated by AhW23N3H3E4a, and the like.
Furthermore, as an antibody that specifically reacts with a C-terminal partial peptide of a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, or a salt thereof Are (i) the 16th to 23rd amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, and (ii) the 17th to 23rd amino acids. Amino acid sequence, (iii) 18th to 23rd amino acid sequence, (iv) 19th to 23rd amino acid sequence, (v) 20th to 23rd amino acid sequence, (vi) 21st to 23rd amino acid sequence (Vii) 16th to 22nd amino acid sequence, (viii) 17th to 22nd amino acid sequence, (ix) 18th to 22nd amino acid sequence, (x) 19th to 22nd amino acid sequence, xi) 20th to 22nd net Acid sequence, (xii) 16th to 21st amino acid sequence, (xiii) 17th to 21st amino acid sequence, (xiv) 18th to 21st amino acid sequence, (xv) 19th to 21st amino acid sequence (Xvi) the 16th to 20th amino acid sequence, (xvii) the 17th to 20th amino acid sequence, or (xviii) the 18th to 20th amino acid sequence.
また、ＡｈＷ２３Ｎ２Ｇ６Ｄ１ａで標示されるモノクローナル抗体またはＡｈＷ２３Ｎ３Ｈ３Ｅ４ａで標示されるモノクローナル抗体の、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体（例、モノクローナル抗体）も、本発明に含まれる。中でも、上記ポリペプチドに対して中和活性を有する抗体（例、モノクローナル抗体）である。
上記「結合部位」としては、ＡｈＷ２３Ｎ２Ｇ６Ｄ１ａで標示されるモノクローナル抗体またはＡｈＷ２３Ｎ３Ｈ３Ｅ４ａで標示されるモノクローナル抗体が結合する部位であればよく、好ましくは、特異的に結合する部位、エピトープである。
Further, against a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, of the monoclonal antibody indicated by AhW23N2G6D1a or the monoclonal antibody indicated by AhW23N3H3E4a Antibodies that specifically react with the binding site (eg, monoclonal antibodies) are also included in the present invention. Among them, an antibody (eg, monoclonal antibody) having neutralizing activity against the above polypeptide.
The “binding site” may be a site to which a monoclonal antibody indicated by AhW23N2G6D1a or a monoclonal antibody indicated by AhW23N3H3E4a binds, and is preferably a site or epitope that specifically binds.
配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体は、例えば、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応するものであればよく、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。
具体的には、例えば、配列番号：７で表されるアミノ酸配列の第１６〜３０番目までのアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号：７で表されるアミノ酸配列の第１６〜３０番目までのアミノ酸配列を有し、かつこのアミノ酸配列の第１６番目にCysを付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）などが用いられる。
このうち好ましくは、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドを認識しないものである。
さらに好ましくは、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の活性を中和する抗体である。
具体的には、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩に対して１〜１０００倍、好ましくは１〜１００倍、さらに好ましくは１〜１０倍のモル比で添加した際に、上記ポリペプチドまたはその塩の活性〔例、ヒトＧＰＲ８、ヒトＧＰＲ７、ラットＧＰＲ７またはマウスＧＰＲ７を発現する細胞に対する細胞刺激活性（例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成および抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性など）など〕を１０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上抑制する抗体などである。
好ましい具体例としては、ＡｒＷ３０Ｃ３Ａ１Ａａで標示されるで標示されるモノクローナル抗体、ＡｒＷ３０Ｃ７Ｆ２Ｅ８で標示されるモノクローナル抗体などが挙げられる。
さらに、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列の、（i）第２３〜３０番目のアミノ酸配列、（ii）第２４〜３０番目のアミノ酸配列、（iii）第２５〜３０番目のアミノ酸配列、（iv）第２６〜３０番目のアミノ酸配列、（v）第２７〜３０番目のアミノ酸配列、（vi）第２８〜３０番目のアミノ酸配列、（vii）第２３〜２９番目のアミノ酸配列、（viii）第２４〜２９番目のアミノ酸配列、（ix）第２５〜２９番目のアミノ酸配列、（x）第２６〜２９番目のアミノ酸配列、（xi）第２７〜２９番目のアミノ酸配列、（xii）第２３〜２８番目のアミノ酸配列、（xiii）第２４〜２８番目のアミノ酸配列、（xiv）第２５〜２８番目のアミノ酸配列、（xv）第２６〜２８番目のアミノ酸配列、（xvi）第２３〜２７番目のアミノ酸配列、（xvii）第２４〜２７番目のアミノ酸配列または（xviii）第２５〜２７番目のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体などが用いられる。
An antibody that specifically reacts with a C-terminal partial peptide of a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 or a salt thereof, for example, Any one that specifically reacts with a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 or a partial peptide on the C-terminal side of a salt thereof. A monoclonal antibody is preferable.
Specifically, for example, a peptide containing the amino acid sequence from the 16th to the 30th of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and the amino acid from the 16th to the 30th of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 An antibody (preferably a monoclonal antibody) that specifically reacts with a polypeptide having a sequence and having an amino acid sequence obtained by adding Cys to the 16th position of the amino acid sequence is used.
Among these, the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 or a partial peptide on the N-terminal side of the salt thereof is preferably not recognized. is there.
More preferred is an antibody that neutralizes the activity of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, or a salt thereof.
Specifically, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, or 1 to 1000 times, preferably 1 to 1000 times the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a salt thereof. When added at a molar ratio of 100 times, more preferably 1 to 10 times, the activity of the polypeptide or a salt thereof [eg, cell stimulating activity against cells expressing human GPR8, human GPR7, rat GPR7 or mouse GPR7 ( Examples, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation and suppression, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, activity that promotes GTPγS binding activity, etc.)] is more than 10%, preferably more than 50%. Ku is such inhibiting antibodies more than 80%.
Preferable specific examples include a monoclonal antibody labeled with ArW30C3A1Aa, a monoclonal antibody labeled with ArW30C7F2E8, and the like.
Furthermore, as an antibody that specifically reacts with the C-terminal partial peptide of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, or a salt thereof Are the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, (i) the 23rd to 30th amino acid sequence, and (ii) the 24th to 30th amino acid sequences. Amino acid sequence, (iii) 25th to 30th amino acid sequence, (iv) 26th to 30th amino acid sequence, (v) 27th to 30th amino acid sequence, (vi) 28th to 30th amino acid sequence (Vii) the 23rd to 29th amino acid sequence, (viii) the 24th to 29th amino acid sequence, (ix) the 25th to 29th amino acid sequence, (x) the 26th to 29th amino acid sequence, xi) 27th to 29th net Acid sequence, (xii) 23-28th amino acid sequence, (xiii) 24-28th amino acid sequence, (xiv) 25-28th amino acid sequence, (xv) 26-28th amino acid sequence , (Xvi) the 23rd to 27th amino acid sequence, (xvii) the 24th to 27th amino acid sequence, or (xviii) the 25th to 27th amino acid sequence.
また、ＡｒＷ３０Ｃ３Ａ１Ａａで標示されるモノクローナル抗体またはＡｒＷ３０Ｃ７Ｆ２Ｅ８で標示されるモノクローナル抗体の、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体（例、モノクローナル抗体）も、本発明に含まれる。中でも、上記ポリペプチドに対して中和活性を有する抗体（例、モノクローナル抗体）である。
上記「結合部位」としては、ＡｒＷ３０Ｃ３Ａ１Ａａで標示されるモノクローナル抗体またはＡｒＷ３０Ｃ７Ｆ２Ｅ８で標示されるモノクローナル抗体が結合する部位であればよく、好ましくは、特異的に結合する部位、エピトープである。
In addition, a monoclonal antibody labeled with ArW30C3A1Aa or a monoclonal antibody labeled with ArW30C7F2E8 is against a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11. Antibodies that specifically react with the binding site (eg, monoclonal antibodies) are also included in the present invention. Among them, an antibody (eg, monoclonal antibody) having neutralizing activity against the above polypeptide.
The “binding site” may be a site to which a monoclonal antibody indicated by ArW30C3A1Aa or a monoclonal antibody indicated by ArW30C7F2E8 binds, and is preferably a site or epitope that specifically binds.
以下に、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、および配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（以下、これらを合わせて本発明の抗体と称することもある）の抗原の調製法、および該抗体の製造法について説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、例えば、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩（以下、NPWと称することもある）と同一の抗原決定基を1種または2種以上有する合成ペプチドなど何れのものも使用することができる（以下、これらを単にNPW抗原と称することもある）。
NPWは、（a）例えばヒト、サル、ラット、マウスなどの哺乳動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（b）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（c）NPWをコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによっても製造される。
（a）該哺乳動物の組織または細胞からNPW抗原を調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、酸、またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
（b）化学的にNPW抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述した天然より精製したNPW抗原と同一の構造を有するもの、配列番号：４で表されるアミノ酸配列において3個以上、好ましくは8個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を1種あるいは2種以上含有するペプチドなどが用いられる。
（c）DNAを含有する形質転換体を用いてNPWを製造する場合、該DNAは、公知のクローニング方法〔例、Molecular Cloning（2nd ed.；J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法など〕に従って作成することができる。該クローニング方法とは、（1）NPWのアミノ酸配列に基づきデザインしたDNAプローブまたはDNAプライマーを用い、cDNAライブラリーからハイブリダイゼーション法によりNPWをコードするDNAを含有する形質転換体を得る方法、または（2）NPWのアミノ酸配列に基づきデザインしたDNAプライマーを用い、PCR法によりNPWをコードするDNAを含有する形質転換体を得る方法などが挙げられる。
Contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11. An antibody that specifically reacts with a partial peptide on the N-terminal side of a polypeptide to be synthesized or a salt thereof, a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 An antibody that specifically reacts with a partial peptide on the C-terminal side of a peptide or a salt thereof, and a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 Alternatively, a method for preparing an antigen of an antibody that specifically reacts with a partial peptide on the C-terminal side of the salt (hereinafter, these may be collectively referred to as the antibody of the present invention) and a method for producing the antibody will be described.
(1) Preparation of antigen Antigens used for preparing the antibody of the present invention include, for example, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, and sequence. One or more of the same antigenic determinants as the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or a salt thereof (hereinafter sometimes referred to as NPW) Any synthetic peptide can be used (hereinafter, these may be simply referred to as NPW antigens).
NPW is (a) prepared from a tissue or cell of a mammal such as a human, monkey, rat or mouse using a known method or a method equivalent thereto, and (b) a known peptide synthesis method using a peptide synthesizer, etc. (C) It is also produced by culturing a transformant containing DNA encoding NPW.
(A) When preparing an NPW antigen from the mammalian tissue or cells, the tissue or cells are homogenized, and then extracted with an acid or alcohol, and the extract is subjected to salting out, dialysis, gel filtration, It can be purified and isolated by combining chromatography such as reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
(B) When chemically preparing an NPW antigen, the synthetic peptide includes, for example, those having the same structure as the above-described naturally purified NPW antigen, 3 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 Preferably, a peptide containing one or more amino acid sequences identical to the amino acid sequence at an arbitrary position consisting of 8 or more amino acids is used.
(C) When NPW is produced using a transformant containing DNA, the DNA can be obtained by known cloning methods [eg, Molecular Cloning (2nd ed .; J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press , 1989), etc.]. The cloning method includes (1) a method of obtaining a transformant containing DNA encoding NPW from a cDNA library by hybridization using a DNA probe or DNA primer designed based on the amino acid sequence of NPW, or ( 2) A method of obtaining a transformant containing DNA encoding NPW by PCR using a DNA primer designed based on the amino acid sequence of NPW.
NPW抗原としてのペプチドは、（1）公知のペプチドの合成法に従って、または（2）配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０または配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
該ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の（i）〜（ii）に記載された方法等が挙げられる。
（i）Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966年)
（ii）The Peptide, Academic Press, New York (1965年)
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて該ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
ペプチドのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２',４'-ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、目的のペプチドを取得する。あるいはクロロトリチル樹脂、オキシム樹脂、４−ヒドロキシ安息香酸系樹脂等を用い、部分的に保護したペプチドを取り出し、更に常套手段で保護基を除去し目的のペプチドを得ることもできる。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはＤＣＣ、Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが挙げられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔなど）とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜約５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常約１．５〜約４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＣ1-6アルキル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ7-14アラルキル基、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシルおよびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばＢｚｌ、Ｃｌ−Ｂｚｌ，２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、Ｂｏｍ、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル］などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられる。
Peptides as NPW antigens are (1) according to known peptide synthesis methods, or (2) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9. It can be produced by cleaving a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 with an appropriate peptidase.
As a method for synthesizing the peptide, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the peptide of interest can be produced by condensing a partial peptide or amino acid that can constitute the peptide and the remaining part, and removing the protective group when the product has a protective group. Examples of known condensation methods and protecting group removal include the methods described in the following (i) to (ii).
(I) Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(Ii) The Peptide, Academic Press, New York (1965)
Further, after the reaction, the peptide can be purified and isolated by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization and the like. When the peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted into an appropriate salt by a known method. Conversely, when it is obtained as a salt, it can be converted into a free form by a known method. .
As the amide form of the peptide, a commercially available resin for peptide synthesis suitable for amide formation can be used. Examples of such resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenyl. Examples include acetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. . Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin according to various known condensation methods according to the sequence of the target peptide. At the end of the reaction, the peptide is excised from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed to obtain the desired peptide. Alternatively, a partially protected peptide can be taken out using chlorotrityl resin, oxime resin, 4-hydroxybenzoic acid resin, and the like, and the protective group can be removed by conventional means to obtain the target peptide.
For the above-mentioned condensation of protected amino acids, various activating reagents that can be used for peptide synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. Examples of carbodiimides include DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like. For activation by these, a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (eg, HOBt, HOBt, etc.), or a preprotected amino acid as a symmetric anhydride or HOBt ester or HOBt ester. Can be added to the resin after activation. The solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents that are known to be usable for the peptide condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, and sulfoxides such as dimethyl sulfoxide. , Tertiary amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof. The reaction temperature is appropriately selected from a range that is known to be usable for peptide bond formation reaction, and is usually selected appropriately from a range of about -20 to about 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in an excess of about 1.5 to about 4 times. As a result of the test using the ninhydrin reaction, when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation is not obtained even after repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated with acetic anhydride or acetylimidazole so as not to affect the subsequent reaction.
Examples of the protecting group for the amino group of the raw material amino acid include Z, Boc, tertiary pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, trifluoro Acetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like can be mentioned. Examples of the protecting group for the carboxyl group include a C 1-6 alkyl group, a C 3-8 cycloalkyl group, a C 7-14 aralkyl group, 2-adamantyl, 4-nitrobenzyl, 4-methoxybenzyl, 4-chlorobenzyl, Examples include phenacyl and benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxycarbonyl hydrazide, and trityl hydrazide.
The hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification. Examples of groups suitable for esterification include lower (C 1-6 ) alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl groups and ethoxycarbonyl groups. . Examples of groups suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a tertiary butyl group.
Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bzl, Cl-Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, tertiary butyl and the like.
Examples of the protecting group for imidazole of histidine include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, Bom, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like.
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include the corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, cyano Methyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOBt)] and the like. Examples of the activated amino group of the raw material include the corresponding phosphoric acid amide.
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばＰｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチドのアミド体を得ることができる。
ペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ペプチドのアミド体と同様にして所望のペプチドのエステル体を得ることができる。
NPW抗原は、不溶化したものを直接免疫することもできる。また、NPW抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。該担体（キャリアー）とNPW抗原（ハプテン）との混合比は、担体に結合または吸着させたNPW抗原に対して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあたり常用されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。天然の高分子担体としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のチログロブリン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニンなどが用いられる。合成の高分子担体としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または供重合物などの各種ラテックスなどを用いることができる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同志を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同志を架橋するＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同志を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、ＳＰＤＰなど）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
Examples of the method for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, and anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethane. Examples include acid treatment with sulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and reduction with sodium in liquid ammonia. The elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of -20 to 40 ° C. In the acid treatment, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1, The addition of a cation scavenger such as 2-ethanedithiol is effective. The 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it can also be removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide, dilute ammonia or the like.
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material and the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
As another method for obtaining an amide form of a peptide, first, the α-carboxyl group of the carboxyl terminal amino acid is amidated, then the peptide chain is extended to the amino group side to the desired chain length, and then the N terminal of the peptide chain Of the peptide except for the protecting group of α-amino group and the peptide (or amino acid) except for the protecting group of the C-terminal carboxyl group, and condensing both peptides in a mixed solvent as described above. . The details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above method to obtain the desired crude peptide. This crude peptide can be purified using various known purification means, and the main fraction can be lyophilized to obtain an amide of the desired peptide.
To obtain an ester of a peptide, the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then an ester of the desired peptide can be obtained in the same manner as the peptide amide.
NPW antigens can also be directly immunized with insolubilized ones. Moreover, you may immunize the composite_body | complex which made the NPW antigen couple | bond or adsorb | suck to a suitable support | carrier. The mixing ratio of the carrier (carrier) to the NPW antigen (hapten) is such that any antibody can be bound or adsorbed at any ratio as long as the antibody can be efficiently produced against the NPW antigen bound or adsorbed to the carrier. It is also possible to use a natural or synthetic polymer carrier that is usually used in the production of antibodies against hapten antigens, which is bound or adsorbed at a ratio of 0.1 to 100 to
Various coupling agents can be used for coupling the hapten and the carrier. For example, diazonium compounds such as bisdiazotized benzidine that crosslinks tyrosine, histidine, and tryptophan, dialdehyde compounds such as glutaraldehyde that crosslink amino groups, diisocyanate compounds such as toluene-2,4-diisocyanate, and thiol groups A dimaleimide compound such as N, N′-o-phenylene dimaleimide, a maleimide active ester compound that crosslinks an amino group and a thiol group, a carbodiimide compound that crosslinks an amino group and a carboxyl group, and the like are advantageously used. In addition, when cross-linking amino groups, a thiol group is introduced by reacting one amino group with an active ester reagent having a dithiopyridyl group (for example, SPDP) and then reducing the other amino group. It is also possible to react both after introducing a maleimide group with a maleimide active ester reagent.
（２）モノクローナル抗体の作製
NPW抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入、皮下注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常2〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行われる。温血動物としては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあげられるが、モノクローナル抗体作製にはマウスが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体の作製に際しては、NPW抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、抗NPWモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の抗NPW抗体価の測定は、例えば後記の標識化NPWと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法〔Nature、256巻、495頁（1975年）〕に従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（PEG）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧなどが用いられる。骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられるが、Ｐ３Ｕ１などが好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で、通常１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
抗NPW抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えばNPWまたはその部分ペプチドを直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した抗NPWモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したNPWを加え、固相に結合したNPWモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。抗NPWモノクローナル抗体のスクリーニング、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）で行われる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗NPW抗体価の測定と同様にして測定できる。
抗NPWモノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、DEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など〕に従って行われる。
以上のようにして、ハイブリドーマ細胞を温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、本発明の抗体を製造することができる。
(2) Production of monoclonal antibodies
The NPW antigen is administered to a warm-blooded animal, for example, by itself, together with a carrier or diluent, at a site where antibody production is possible by an administration method such as intraperitoneal injection, intravenous injection, or subcutaneous injection. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, 2 to 10 times in total. Examples of warm-blooded animals include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats and chickens, and mice are preferably used for the production of monoclonal antibodies.
For the production of monoclonal antibodies, select warm-blooded animals immunized with NPW antigens, such as mice from individuals with antibody titers, and collect spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization. An anti-NPW monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared by fusing antibody-producing cells with myeloma cells. The anti-NPW antibody titer in serum is measured, for example, by reacting a labeled NPW described later with antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but preferably PEG is used. Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, etc., and P3U1 is preferably used. The preferred ratio of the number of antibody-producing cells (spleen cells) to be used and the number of bone marrow cells is usually about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably
Various methods can be used for screening anti-NPW antibody-producing hybridomas. For example, the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which NPW or a partial peptide thereof is adsorbed directly or together with a carrier. Add anti-immunoglobulin antibodies labeled with radioactive substances or enzymes (if the cells used for cell fusion are mice, anti-mouse immunoglobulin antibodies are used) or protein A to detect anti-NPW monoclonal antibodies bound to the solid phase A method of adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase adsorbed with an anti-immunoglobulin antibody or protein A, adding NPW labeled with a radioactive substance or enzyme, etc., and detecting a NPW monoclonal antibody bound to the solid phase, etc. Can be given. Screening and breeding of anti-NPW monoclonal antibodies are usually carried out in an animal cell culture medium (eg, RPMI 1640) containing 10-20% fetal calf serum with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) added. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the above-described measurement of the anti-NPW antibody titer in the antiserum.
Separation and purification of the anti-NPW monoclonal antibody can be carried out in the same way as separation and purification of an ordinary polyclonal antibody (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger ( Specific purification, such as adsorption / desorption by DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G, and dissociating the binding to obtain the antibody The law etc.].
As described above, the antibody of the present invention can be produced by culturing the hybridoma cell in vivo or ex vivo of a warm-blooded animal and collecting the antibody from the body fluid or culture.
なお、NPWの一部領域と反応する抗NPW抗体を産生するハイブリドーマおよび、NPWとは反応するがその一部領域とは反応しない抗NPWモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、たとえばその一部領域に相当するペプチドとハイブリドーマが産生する抗体との結合性を測定することにより行うことができる。 Screening for hybridomas that produce an anti-NPW antibody that reacts with a partial region of NPW, and hybridomas that produce an anti-NPW monoclonal antibody that reacts with NPW but does not react with that partial region is, for example, a partial region thereof. Can be performed by measuring the binding between the peptide corresponding to the above and the antibody produced by the hybridoma.
〔１〕本発明の抗体を用いるNPWの定量法およびNPWの関与する疾患の診断法
NPWの定量法（免疫測定法等）について、以下に述べる。
本発明の抗体を用いることにより、NPWの測定または組織染色などによる検出を行なうことができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また抗体分子のF(ab')2、Fab'またはFab画分などを用いてもよい。
本発明の抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、NPW量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、サンドイッチ法、競合法、イムノメトリック法、ネフロメトリーなどが用いられるが、感度、特異性の点で後述するサンドイッチ法、競合法が、特にサンドイッチ法が好ましい。
[1] NPW quantification method using the antibody of the present invention and diagnosis method for diseases involving NPW
The quantification method (immunoassay method, etc.) of NPW is described below.
By using the antibody of the present invention, detection by NPW measurement or tissue staining can be performed. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) 2, Fab ′, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
The measurement method using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of antibody, antigen or antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen (for example, NPW amount) in the solution to be measured is chemically or Any measurement method may be used as long as it is a measurement method that is detected by physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, a sandwich method, a competitive method, an immunometric method, a nephrometry, and the like are used, and the sandwich method and the competitive method described later are particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
（１）サンドイッチ法
担体上に不溶化した本発明の抗体、標識化された本発明の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することにより被検液中のNPWを定量する。好ましくは、
（i）担体上に不溶化したNPWのＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、標識化されたNPWのＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のNPWの定量法、
（ii）担体上に不溶化したNPWのＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、標識化されたNPWのＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のNPWの定量法などが挙げられる。
さらに好ましくは、NPWのＮ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体が、AhW23N2G6D1aで標示されるモノクローナル抗体またはAhW23N3H3E4aで標示されるモノクローナル抗体で、NPWのＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体が、（a）AhW23C6G1H8aで標示されるモノクローナル抗体もしくはAhW23C5G2F6aで標示されるモノクローナル抗体、または（b）ArW30C3A1Aaで標示されるモノクローナル抗体もしくはArW30C7F2E8aで標示されるモノクローナル抗体である定量法である。これらの抗体は、例えば西洋ワサビパーオキシダーゼ（horseradish peroxidase；HRP）で標識化されて用いられるのが好ましい。
(1) Sandwich method After reacting an antibody of the present invention insolubilized on a carrier, a labeled antibody of the present invention and a test solution, NPW in the test solution is quantified by measuring the activity of the labeling agent. To do. Preferably,
(I) reacting an antibody specifically reacting with a partial peptide on the N-terminal side of NPW insolubilized on a carrier, an antibody specifically reacting with a partial peptide on the C-terminal side of labeled NPW, and a test solution. And then measuring the activity of the labeling agent, quantifying NPW in the test solution,
(Ii) reacting an antibody specifically reacting with a partial peptide on the C-terminal side of NPW insolubilized on a carrier, an antibody specifically reacting with a partial peptide on the N-terminal side of labeled NPW, and a test solution. Thereafter, a method for quantifying NPW in a test solution, which comprises measuring the activity of a labeling agent, is mentioned.
More preferably, the antibody that specifically reacts with the partial peptide on the N-terminal side of NPW is a monoclonal antibody labeled with AhW23N2G6D1a or a monoclonal antibody labeled with AhW23N3H3E4a, and specifically with the partial peptide on the C-terminal side of NPW. The reacting antibody is (a) a monoclonal antibody labeled with AhW23C6G1H8a or a monoclonal antibody labeled with AhW23C5G2F6a, or (b) a monoclonal antibody labeled with ArW30C3A1Aa or a monoclonal antibody labeled with ArW30C7F2E8a. These antibodies are preferably used after being labeled with, for example, horseradish peroxidase (HRP).
サンドイッチ法においては、不溶化した本発明の抗体に被検液を反応（１次反応）させ、さらに標識化された本発明の抗体を反応（２次反応）させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のNPW量を定量することができる。１次反応と２次反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体または標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。サンドイッチ法によるNPWの測定法においては、例えば、１次反応で用いられる抗体がNPWのＣ端側の部分ペプチドを認識する場合は、２次反応で用いられる抗体はＣ端側の部分ペプチド以外（即ち、Ｎ端側）を認識する抗体が好ましく、１次反応で用いられる抗体がNPWのＮ端側の部分ペプチドを認識する場合は、２次反応で用いられる抗体は、Ｎ端側の部分ペプチド以外（即ち、Ｃ端側）を認識する抗体が好ましく用いられる。 In the sandwich method, the test solution is reacted (primary reaction) with the insolubilized antibody of the present invention, and the labeled antibody of the present invention is reacted (secondary reaction), followed by the labeling agent on the insolubilized carrier. By measuring the activity of NPW, the amount of NPW in the test solution can be quantified. The primary reaction and the secondary reaction may be performed at the same time or may be performed at different times. The labeling agent and the insolubilization method can be the same as those described above. Further, in the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving the measurement sensitivity. May be. In the NPW measurement method by the sandwich method, for example, when the antibody used in the primary reaction recognizes a partial peptide on the C-terminal side of NPW, the antibody used in the secondary reaction is other than the partial peptide on the C-terminal side ( That is, an antibody that recognizes the N-terminal side is preferable, and when the antibody used in the primary reaction recognizes a partial peptide on the N-terminal side of NPW, the antibody used in the secondary reaction is a partial peptide on the N-terminal side. An antibody that recognizes other than (that is, the C-terminal side) is preferably used.
（２）競合法
本発明の抗体、被検液および標識化されたNPWとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたNPWの割合を測定することにより、被検液中のNPWを定量する。
本反応法は、例えば、固相化法を用いて行う。
具体例としては、抗マウスIgG抗体（ICN/CAPPEL社製）を固相化抗体として用い、この固相化抗体の存在するプレートに、i)本発明の抗体（例、AhW23N2G6D1a、AhW23N3H3E4a、AhW23C6G1H8a、AhW23C5G2F6a、ArW30C3A1Aa、ArW30C7F2E8aなど）、ii）horseradish peroxidase（HRP）で標識化されたNPW、およびiii）被検液を添加し、反応後、固相に吸着したHRP活性を測定し、NPWを定量する。
（３）イムノメトリック法
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化された本発明の抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは被検液中の抗原と過剰量の標識化された本発明の抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化された本発明の抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
（４）ネフロメトリー
ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
(2) Competition method By competitively reacting the antibody of the present invention, the test solution and labeled NPW, and measuring the ratio of labeled NPW bound to the antibody, Quantify NPW.
This reaction method is performed using, for example, a solid phase method.
As a specific example, an anti-mouse IgG antibody (manufactured by ICN / CAPPEL) was used as a solid-phased antibody. AhW23C5G2F6a, ArW30C3A1Aa, ArW30C7F2E8a, etc.), ii) NPW labeled with horseradish peroxidase (HRP), and iii) Add the test solution, measure the HRP activity adsorbed on the solid phase and quantify NPW .
(3) Immunometric method In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of the labeled antibody of the present invention, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Or reacting the antigen in the test solution with an excess amount of the labeled antibody of the present invention, and then adding the immobilized antigen to the unreacted labeled antibody of the present invention on the solid phase. After binding, the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the labeled amount of any phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
(4) Nephrometry In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of antigen-antibody reaction in a gel or solution is measured. Laser nephrometry using laser scattering is preferably used even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate is obtained.
上記（１）〜（４）において、標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、標識剤としては、例えば、放射性同位元素（例、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕、〔32P〕、〔33P〕、〔35S〕など）、蛍光物質〔例、シアニン蛍光色素（例、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなど〕、酵素（例、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、発光物質（例、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）、ビオチン、ランタニド元素などが用いられる。さらに、抗体と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコンなどの合成樹脂あるいはガラスなどが挙げられる。
In the above (1) to (4), as the labeling agent used in the measurement method using a labeling substance, as the labeling agent, for example, a radioisotope (eg, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H ], [ 14 C], [ 32 P], [ 33 P], [ 35 S], etc.), fluorescent materials [eg, cyanine fluorescent dyes (eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Biosciences) Etc.), fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, etc.), enzymes (eg, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc.), luminescent substances (eg, luminol, Luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc.), biotin, lanthanide elements and the like are used. Furthermore, a biotin-avidin system can also be used for the binding between the antibody and the labeling agent.
For insolubilization of an antigen or antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used to insolubilize or immobilize a protein or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
これら個々の免疫学的測定法を本発明法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてNPWの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる［例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和49年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和54年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和53年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第2版）（医学書院、昭和57年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第3版）（医学書院、昭和62年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70（Immunochemical Techniques(Part A)）、同書 Vol. 73（Immunochemical Techniques(Part B)）、同書 Vol. 74（Immunochemical Techniques(Part C)）、同書 Vol. 84（Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays)）、同書 Vol. 92（Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)）、同書 Vol. 121（Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)）（以上、アカデミックプレス社発行）など参照］。したがって、本発明のサンドイッチ免疫測定法によりNPWの測定系を構築する場合、その方法は後述する実施例に限定されない。
以上のように、本発明の抗体は、NPWを感度良く定量することができるので、NPWのさらなる生理機能の解明およびNPWの関与する疾患の診断に有用である。
例えば、本発明の抗体を用いて、体液中（血液、血漿、血清、尿、卵胞液、脊髄液、精液など）に含まれるNPWの量を測定することにより、NPWが関与する疾患〔例、拒食症、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常、腎性浮腫、尿排出障害（例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など）、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適症候群（SIADH）、高血圧、蓄尿障害（例、頻尿、尿失禁（例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など）など）、多尿症、尿崩症（例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など）、高ナトリウム血症、代謝性アルカリローシス、低カリウム血症、Cushing症候群、上部消化管疾患（例、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Zollinger-Ellison症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、NUD（Non Ulcer Dyspepsia）、胃癌、胃MALTリンパ腫、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、胃酸過多、潰瘍など）、消化不良症（例、下垂体性消化不良症、腎性消化不良症など）、骨代謝障害（例、骨粗しょう症、骨軟化症など）、貧血症（例、鉄欠乏性貧血など）など〕に罹患している、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
例えば、胃酸過多症の診断においては、体液中のNPWを定量し、NPWの量が正常時より多い場合、例えば、血中濃度として約10 fmol/ml以上、好ましくは約15 fmol/ml以上の場合、胃酸過多症と診断する。
In applying these individual immunological measurement methods to the method of the present invention, special conditions, operations, and the like are not required to be set. An ordinary NPW measurement system may be constructed by adding ordinary technical considerations to those skilled in the art to the normal conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, refer to reviews, books, etc. [For example, Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie “Continuing radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1979), "Enzyme immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. (Medical Shoin, issued in 1978), "Enzyme immunoassay" edited by Eiji Ishikawa et al. (2nd edition) (Medical Shoin, 57, Showa 57) Published by Eiji Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (3rd edition) (Medical Shoin, published in 1987), “Methods in ENZYMOLOGY” Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal) Antibodies and General Immunoassay Methods)), Vol. 121 (Immunochemic al Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (see above, published by Academic Press)]. Therefore, when an NPW measurement system is constructed by the sandwich immunoassay method of the present invention, the method is not limited to the examples described later.
As described above, since the antibody of the present invention can quantify NPW with high sensitivity, it is useful for elucidating further physiological functions of NPW and diagnosing diseases involving NPW.
For example, using the antibody of the present invention, by measuring the amount of NPW contained in body fluid (blood, plasma, serum, urine, follicular fluid, spinal fluid, semen, etc.), a disease involving NPW [eg, Anorexia, obesity (eg, malignant mastocytosis, extrinsic obesity, hyperinsulinic obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, Symptomatic obesity, childhood obesity, upper body obesity, dietary obesity, hyposexual obesity, systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc.), pituitary gland tumors, diencephalon tumors, menstrual abnormalities, self Immune disease, prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenic dysplasia , Renal edema, urinary discharge disorder (eg, bladder contraction disorder, urethral passage disorder, difficulty urinating, pain in urination, urinary tract obstruction, etc.), hyponatremia, inappropriate antidiuretic hormone secretion syndrome (SIADH), hypertension, urinary storage disorder (Eg, frequent urination, urinary incontinence (eg, urge incontinence, stress urinary incontinence, functional urinary incontinence, etc.)), polyuria, diabetes insipidus (eg, pituitary insipidus, renal urine) Disintegration, etc.), hypernatremia, metabolic alkali lowosis, hypokalemia, Cushing syndrome, upper gastrointestinal disease (eg, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-Ellison syndrome) ), Gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia), gastric cancer, gastric MALT lymphoma, ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs, hyperacidity, ulcers, etc., dyspepsia (eg, pituitary) Dyspepsia, renal dyspepsia, etc.), bone metabolism disorders (eg, osteoporosis) And osteomalacia), anemia (e.g., iron deficiency anemia) suffering from, etc.], or it can be diagnosed that it is highly likely to suffer from these disease in the future.
For example, in the diagnosis of hyperacidity, when NPW in body fluid is quantified and the amount of NPW is higher than normal, for example, the blood concentration is about 10 fmol / ml or more, preferably about 15 fmol / ml or more. If you are diagnosed with gastric hyperacidity.
〔２〕本発明の抗体を含有してなる医薬
本発明の抗体は、NPWの活性（例、GPR7結合活性、GPR8結合活性、GPR7細胞刺激活性、GPR8細胞刺激活性、摂食行動抑制作用、プロラクチン産生作用、抗利尿作用、胃酸分泌促進作用などを中和するため、NPWが関与する疾患、例えば拒食症、下垂体腺腫瘍、間脳腫瘍、月経異常、自己免疫疾患、プロラクチノーマ、不妊症、インポテンス、無月経症、乳汁漏症、末端肥大症、キアリ・フロンメル症候群、アルゴンツ・デル・カスティロ症候群、フォーベス・アルブライト症候群、リンパ腫、シーハン症候群、精子形成異常、腎性浮腫、尿排出障害（例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など）、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適症候群（SIADH）、高血圧、上部消化管疾患（例、消化性潰瘍（例、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、吻合部潰瘍、Zollinger-Ellison症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、NUD（Non Ulcer Dyspepsia）、胃癌、胃MALTリンパ腫、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、胃酸過多、潰瘍など）などの予防・治療剤、摂食（食欲）促進剤などの安全な医薬として使用することができる。中でも不妊症、腎性浮腫、消化性潰瘍、胃酸過多症などの予防・治療剤が好ましい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
[2] Pharmaceutical comprising the antibody of the present invention The antibody of the present invention comprises NPW activity (eg, GPR7 binding activity, GPR8 binding activity, GPR7 cell stimulating activity, GPR8 cell stimulating activity, feeding behavior inhibitory activity, prolactin To neutralize production action, antidiuretic action, gastric acid secretion promoting action, etc., diseases involving NPW, such as anorexia, pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormality, autoimmune disease, prolactinoma, infertility, impotence, Amenorrhea, milk leakage, acromegaly, Chiari Frommer syndrome, Argonz del Castillo syndrome, Forbes Albright syndrome, lymphoma, Sheehan syndrome, spermatogenesis, renal edema, urinary discharge disorder (eg, bladder Constriction disorder, urethral obstruction, difficulty urinating, pain in urination, obstruction of the urinary tract, etc., hyponatremia, inappropriate antidiuretic hormone secretion syndrome (SIADH), hypertension, upper gastrointestinal disease ( Examples, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-Ellison syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia), gastric cancer, gastric MALT lymphoma, non-steroidal anti-inflammatory agent It can be used as a safe medicine for prevention / treatment of ulcers, hyperacidity, ulcers, etc., etc., and feeding (appetite) promoter, etc. Among them, infertility, renal edema, peptic ulcer, gastric acid A prophylactic / therapeutic agent for hyperplasia is preferred.
The antibody of the present invention can be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition used for the administration comprises the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
例えば、非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO-50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mgの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の胃酸過多症の治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、非経口投与するのが好都合である。経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
For example, as a composition for parenteral administration, for example, injections, suppositories and the like are used. Injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like. Includes dosage forms. Such an injection is prepared according to a known method, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injection. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg,
For example, compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules). Syrup, emulsion, suspension and the like. Such a composition is produced by a known method and contains a carrier, diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
The above oral or parenteral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient. Examples of the dosage form of such a dosage unit include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg for each dosage unit dosage form, especially 5 to 100 mg for injections. Other dosage forms preferably contain 10 to 250 mg of the antibody.
Each of the above-described compositions may contain other active ingredients as long as they do not cause an unfavorable interaction by blending with the antibody.
The therapeutic / prophylactic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention has low toxicity, and can be used as a solution or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form as a human or mammal (eg, rat, rabbit, sheep, pig, Cattle, cats, dogs, monkeys, etc.) orally or parenterally. The dose varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc. For example, when used for the treatment of gastric hyperacidity in an adult, the dose of the antibody of the present invention is usually 0.01. About 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1-10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1-5 mg / kg body weight, about 1-5 times a day, preferably about 1-3 times a day, parenterally It is convenient to do. In the case of oral administration, an equivalent amount can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
本発明の明細書において、アミノ酸等を略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸
ＤＭＦ ：N,N−ジメチルホルムアミド
ＳＰＤＰ ：3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-スクシンイミジル
ＧＭＢＳ ：N-(4-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド
ＢＳＡ ：ウシ血清アルブミン
ＢＴＧ ：ウシチログロブリン
ＥＩＡ ：エンザイムイムノアッセイ
ＨＰＬＣ ：逆相高速液体クロマトグラフィー
ＨＲＰ ：西洋ワサビパーオキシダーゼ
ＦＢＳ ：ウシ胎児血清
ｄ−ＦＢＳ ：透析済みウシ胎児血清
ＴＭＢ ：3,3’,5,5’-テトラメチルベンチジン
ＮＭＰ ：N-メチルピロリドン
Ｂｏｃ ： ターシャリブトキシカルボニル
Ｆｍｏｃ ：9-フルオレニルメトキシカルボニル
ＤＣＣ ：N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド
Ｐｂｆ ：2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
ｔＢｕ ：ターシャリブチル
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｔｏｓ ：パラトルエンスルホニル
ＤＩＥＡ ：N, N'-ジイソプロピルエチルアミン
ＨＯＢｔ ：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＡｔ ：1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
ＰｙＡｏｐ ：7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリスピロリジノホス
ホニウム ヘキサフルオロホスフェイト
Ｃｌｔ ：2-クロロトリチル
ＢＨＡ ：ベンツヒドリルアミン
In the specification of the present invention, amino acids and the like are represented by abbreviations based on abbreviations by IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, examples of which are described below. When there are optical isomers with respect to amino acids, L form is shown unless otherwise specified.
Gly: glycine Ala: alanine Val: valine Leu: leucine Ile: isoleucine Ser: serine Thr: threonine Cys: cysteine Met: methionine Glu: glutamate Asp: aspartate Lys: lysine Arg: arginine His: r histidine P : Tryptophan Pro: proline Asn: asparagine Gln: glutamine TFA: trifluoroacetic acid DMF: N, N-dimethylformamide SPDP: 3- (2-pyridyldithio) propionic acid N-succinimidyl GMBS: N- (4-maleimidobutyryloxy) ) Succinimide BSA: Bovine serum albumin BTG: Bovine thyroglobulin EIA: Enzyme immunoassay HPLC: Reversed phase high performance liquid chromatography RP: horseradish peroxidase FBS: fetal bovine serum d-FBS: dialyzed fetal bovine serum TMB: 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine NMP: N-methylpyrrolidone Boc: tertiary riboxycarbonyl Fmoc: 9-fluorenylmethoxycarbonyl DCC: N, N′-dicyclohexylcarbodiimide Pbf: 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl tBu: tertiary butyl Trt: trityl Tos: paratoluenesulfonyl DIEA : N, N'-diisopropylethylamine HOBt: 1-hydroxybenzotriazole HOAt: 1-hydroxy-7-azabenzotriazole PyAop: 7-azabenzotriazol-1-yloxytrispyrrolidinophos
Honium Hexafluorophosphate Clt: 2-Chlorotrityl BHA: Benzhydrylamine
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
以下の実施例１において使用した免疫原作製用のペプチド（本明細書においてpeptide-1と記載することがある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
以下の実施例１において使用した免疫原作製用のペプチド（本明細書においてpeptide-2と記載することがある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
以下の実施例１において使用した免疫原作製用のペプチド（本明細書においてpeptide-3と記載することがある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
ヒトニューロペプチドＷ（１−２３）（本明細書においてヒトＮＰＷ２３と記載することがある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
ヒトニューロペプチドＷ（１−３０）（本明細書においてヒトＮＰＷ３０と記載することがある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕
ラットニューロペプチドＷ（１−２３）（本明細書においてラットＮＰＷ２３と記載することがある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７〕
ラットニューロペプチドＷ（１−３０）（本明細書においてラットＮＰＷ３０と記載することがある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
マウスニューロペプチドＷ（１−２３）（本明細書においてマウスＮＰＷ２３と記載することがある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９〕
マウスニューロペプチドＷ（１−３０）（本明細書においてマウスＮＰＷ３０と記載することがある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０〕
ブタニューロペプチドＷ（１−２３）（本明細書においてブタＮＰＷ２３と記載することがある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１〕
ブタニューロペプチドＷ（１−３０）（本明細書においてブタＮＰＷ３０と記載することがある）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２〕
以下の実施例１において作製したビオチン標識化peptide-1のアミノ酸配列を示す。XaaはBiotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR LABORATORIES)によってビオチン標識されたCys残基を示す。
〔配列番号：１３〕
以下の実施例１において作製したビオチン標識化peptide-2のアミノ酸配列を示す。XaaはBiotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR LABORATORIES)によってビオチン標識されたCys残基を示す。
〔配列番号：１４〕
以下の実施例１において作製したビオチン標識化peptide-3のアミノ酸配列を示す。XaaはBiotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR LABORATORIES)によってビオチン標識されたCys残基を示す。
〔配列番号：１５〕
ヒトＧＰＲ７のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
配列番号：１５で表されるアミノ酸をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
ヒトＧＰＲ８のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１８〕
配列番号：１７で表されるアミノ酸をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
ラットＧＰＲ７（公知文献（ＷＯ０２／４４３６８）に記載のＴＧＲ２６と同一のレセプタータンパク質）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２０〕
配列番号：１９で表されるアミノ酸をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1]
The amino acid sequence of the peptide for immunogen preparation used in Example 1 below (may be referred to as peptide-1 in this specification) is shown.
[SEQ ID NO: 2]
The amino acid sequence of the peptide for immunogen preparation used in Example 1 below (may be described as peptide-2 in this specification) is shown.
[SEQ ID NO: 3]
The amino acid sequence of the peptide for immunogen preparation used in Example 1 below (may be described as peptide-3 in this specification) is shown.
[SEQ ID NO: 4]
1 shows the amino acid sequence of human neuropeptide W (1-23) (sometimes referred to herein as human NPW23).
[SEQ ID NO: 5]
1 shows the amino acid sequence of human neuropeptide W (1-30) (sometimes referred to herein as human NPW30).
[SEQ ID NO: 6]
1 shows the amino acid sequence of rat neuropeptide W (1-23) (in this specification, sometimes referred to as rat NPW23).
[SEQ ID NO: 7]
1 shows the amino acid sequence of rat neuropeptide W (1-30) (in this specification, sometimes referred to as rat NPW30).
[SEQ ID NO: 8]
1 shows the amino acid sequence of mouse neuropeptide W (1-23) (in this specification, sometimes referred to as mouse NPW23).
[SEQ ID NO: 9]
1 shows the amino acid sequence of mouse neuropeptide W (1-30) (sometimes referred to herein as mouse NPW30).
[SEQ ID NO: 10]
1 shows the amino acid sequence of porcine neuropeptide W (1-23) (sometimes referred to herein as porcine NPW23).
[SEQ ID NO: 11]
1 shows the amino acid sequence of porcine neuropeptide W (1-30) (sometimes referred to herein as porcine NPW30).
[SEQ ID NO: 12]
The amino acid sequence of biotin-labeled peptide-1 prepared in Example 1 below is shown. Xaa represents a Cys residue labeled with biotin by Biotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR LABORATORIES).
[SEQ ID NO: 13]
The amino acid sequence of biotin-labeled peptide-2 prepared in Example 1 below is shown. Xaa represents a Cys residue labeled with biotin by Biotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR LABORATORIES).
[SEQ ID NO: 14]
The amino acid sequence of biotin-labeled peptide-3 prepared in Example 1 below is shown. Xaa represents a Cys residue labeled with biotin by Biotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR LABORATORIES).
[SEQ ID NO: 15]
The amino acid sequence of human GPR7 is shown.
[SEQ ID NO: 16]
This shows the base sequence of DNA encoding the amino acid represented by SEQ ID NO: 15.
[SEQ ID NO: 17]
The amino acid sequence of human GPR8 is shown.
[SEQ ID NO: 18]
This shows the base sequence of DNA encoding the amino acid represented by SEQ ID NO: 17.
[SEQ ID NO: 19]
The amino acid sequence of rat GPR7 (the same receptor protein as TGR26 described in known literature (WO02 / 44368)) is shown.
[SEQ ID NO: 20]
This shows the base sequence of DNA encoding the amino acid represented by SEQ ID NO: 19.
後述の実施例１で得られたハイブリドーマ細胞AhW23N2G6D1は、2003年4月23日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号305-8566）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、寄託番号FERM BP-8363として寄託されている。
後述の実施例１で得られたハイブリドーマ細胞AhW23N3H3E4は、2003年4月23日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号305-8566）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、寄託番号FERM BP-8364として寄託されている。
後述の実施例１で得られたハイブリドーマ細胞AhW23C6G1H8は、2003年4月23日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号305-8566）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、寄託番号FERM BP-8365として寄託されている。
後述の実施例１で得られたハイブリドーマ細胞AhW23C5G2F6は、2003年4月23日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号305-8566）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、寄託番号FERM BP-8366として寄託されている。
後述の実施例１で得られたハイブリドーマ細胞ArW30C3A1Aは、2003年4月23日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号305-8566）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、寄託番号FERM BP-8367として寄託されている。
後述の実施例１で得られたハイブリドーマ細胞ArW30C7F2E8は、2003年4月23日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号305-8566）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、寄託番号FERM BP-8368として寄託されている。
各ハイブリドーマ細胞から得られる抗体については細胞名の後に「a」を付けた形で表す。
後述の実施例で得られた抗体、2G6-D1、3H3-E4、5G2-F6、6G1-H8、3A1Aおよび7F2-E8は、それぞれAhW23N2G6D1a、AhW23N3H3a、AhW23C5G2F6a、AhW23C6G1H8a、ArW30C3A1AaおよびArW30C7F2E8aと表されることもある。
The hybridoma cell AhW23N2G6D1 obtained in Example 1 described below is an independent administrative institution, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, from April 23, 2003 Patent No. 305-8566 Deposited at the biological deposit center as deposit number FERM BP-8363.
The hybridoma cell AhW23N3H3E4 obtained in Example 1 described below is an independent administrative institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, from April 23, 2003 Patent No.305-8566 Deposited at the biological deposit center as deposit number FERM BP-8364.
The hybridoma cell AhW23C6G1H8 obtained in Example 1 described below is an independent administrative institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, from April 23, 2003 Patent No. 305-8566 Deposited at the biological deposit center as deposit number FERM BP-8365.
The hybridoma cell AhW23C5G2F6 obtained in Example 1 described below is an independent administrative institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, from April 23, 2003 Patent No. 305-8566 Deposited at the biological deposit center as deposit number FERM BP-8366.
The hybridoma cell ArW30C3A1A obtained in Example 1 described later is an independent administrative institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, from April 23, 2003. Deposited at the biological deposit center as deposit number FERM BP-8367.
The hybridoma cell ArW30C7F2E8 obtained in Example 1, which will be described later, is an independent administrative institution, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, from April 23, 2003. Deposited at the biological deposit center as deposit number FERM BP-8368.
The antibody obtained from each hybridoma cell is expressed by adding “a” after the cell name.
The antibodies, 2G6-D1, 3H3-E4, 5G2-F6, 6G1-H8, 3A1A and 7F2-E8 obtained in the examples described below are AhW23N2G6D1a, AhW23N3H3a, AhW23C5G2F6a, AhW23C6G1H8a, ArWa3E8 There is also.
以下に、実施例および参考例を示し、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
本明細書においてヒトNPW23、ラットNPW23、マウスNPW23およびブタNPW23を総称してNPW23と記載することがある。また、ヒトNPW30、ラットNPW30、マウスNPW30およびブタNPW30を総称してNPW30と記載することがある。さらに、NPW23およびNPW30を総称してNPWと記載することがある。
EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples and reference examples, but these do not limit the scope of the present invention.
In this specification, human NPW23, rat NPW23, mouse NPW23 and porcine NPW23 may be collectively referred to as NPW23. In addition, human NPW30, rat NPW30, mouse NPW30, and porcine NPW30 may be collectively referred to as NPW30. Furthermore, NPW23 and NPW30 may be collectively referred to as NPW.
実施例１
抗NPWモノクローナル抗体の作製
（１）NPWのアミノ末端領域と結合する抗体作製のための免疫原の調製
NPWのアミノ末端領域と結合する抗体を作製するために、ヒトNPW23のアミノ末端13残基ペプチドのカルボキシル末端にシステインを付加したペプチド（peptide-1、配列番号：１）をシステイン残基を介してブタチログロブリンとの複合体とし、免疫原を作製した。
2.5 mlのphosphate-buffered saline (PBS, Nissui Pharma)に溶解した35.0 mgのブタチログロブリン（SIGMA）に、9.1 mgのSulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1 carboxylate (Sulfo-SMCC, PIERCE)を添加し、室温で１時間攪拌した。Sulfo-SMCCと反応したブタチログロブリンをPD-10 (Amersham Biosciences)を利用した分子ふるいクロマトグラフィーにより、大過剰にある未反応のSulfo-SMCCから分離した。Sulfo-SMCCと反応したブタチログロブリンにあらかじめ0.2 mlの0.1％酢酸溶液に溶かした4 mgのpeptide-1（配列番号：１）と1.8 mlのPBSを添加して4℃で16時間攪拌し、peptide-1とブタチログロブリンの複合体を得た。このpeptide-1とブタチログロブリンの複合体をNPWのアミノ末端領域と結合する抗体作製のための免疫原とした。
（２）NPW23のカルボキシル末端領域と結合する抗体作製のための免疫原の調製
NPW23のカルボキシル末端領域と結合する抗体を作製するために、ヒトNPW23のカルボキシル末端13残基ペプチドのアミノ末端にシステインを付加したペプチド（peptide-2、配列番号：２）をシステイン残基を介してブタチログロブリンとの複合体とし、免疫原を作製した。
2.5 mlのPBSに溶解した 35.2 mgのブタチログロブリンに、9.1 mgの Sulfo-SMCCを添加し、室温で１時間攪拌した。Sulfo-SMCCと反応したブタチログロブリンをPD-10を利用した分子ふるいクロマトグラフィーにより、大過剰にある未反応のSulfo-SMCCから分離した。Sulfo-SMCCと反応したブタチログロブリンにあらかじめ0.2 mlの0.1％酢酸溶液に溶かした4 mgのpeptide-2（配列番号：２）と1.8 mlのPBSを添加して4℃で16時間攪拌し、peptide-2とブタチログロブリンの複合体を得た。このpeptide-2とブタチログロブリンの複合体をNPW23のカルボキシル末端領域と結合する抗体作製のための免疫原とした。
Example 1
Production of anti-NPW monoclonal antibody (1) Preparation of immunogen for production of antibody that binds to amino terminal region of NPW
In order to produce an antibody that binds to the amino terminal region of NPW, a peptide (peptide-1, SEQ ID NO: 1) in which cysteine was added to the carboxyl terminal of the amino terminal 13 residue peptide of human NPW23 via the cysteine residue An immunogen was prepared as a complex with porcine thyroglobulin.
To 35.0 mg of porcine thyroglobulin (SIGMA) dissolved in 2.5 ml of phosphate-buffered saline (PBS, Nissui Pharma), 9.1 mg of Sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1 carboxylate (Sulfo-SMCC, PIERCE) Added and stirred at room temperature for 1 hour. Porcine thyroglobulin reacted with Sulfo-SMCC was separated from unreacted Sulfo-SMCC in a large excess by molecular sieve chromatography using PD-10 (Amersham Biosciences). 4 mg peptide-1 (SEQ ID NO: 1) dissolved in 0.2 ml 0.1% acetic acid solution and 1.8 ml PBS were added to butyroglobulin reacted with Sulfo-SMCC in advance and stirred at 4 ° C for 16 hours. A complex of peptide-1 and porcine thyroglobulin was obtained. This complex of peptide-1 and porcine thyroglobulin was used as an immunogen for preparing an antibody that binds to the amino terminal region of NPW.
(2) Preparation of immunogen for production of antibodies that bind to the carboxyl terminal region of NPW23
In order to produce an antibody that binds to the carboxyl terminal region of NPW23, a peptide (peptide-2, SEQ ID NO: 2) in which cysteine was added to the amino terminus of the carboxyl terminal 13-residue peptide of human NPW23 via the cysteine residue An immunogen was prepared as a complex with porcine thyroglobulin.
9.1 mg of Sulfo-SMCC was added to 35.2 mg of porcine thyroglobulin dissolved in 2.5 ml of PBS, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Porcine thyroglobulin reacted with Sulfo-SMCC was separated from unreacted Sulfo-SMCC in a large excess by molecular sieve chromatography using PD-10. 4 mg peptide-2 (SEQ ID NO: 2) dissolved in 0.2 ml of 0.1% acetic acid solution and 1.8 ml of PBS were added to porcine thyroglobulin reacted with Sulfo-SMCC and stirred at 4 ° C for 16 hours. A complex of peptide-2 and porcine thyroglobulin was obtained. This peptide-2 and porcine thyroglobulin complex was used as an immunogen for preparing an antibody that binds to the carboxyl terminal region of NPW23.
（３）NPW30のカルボキシル末端領域と結合する抗体作製のための免疫原の調製
NPW30のカルボキシル末端領域と結合する抗体を作製するために、ラットNPW30のカルボキシル末端15残基ペプチドのアミノ末端にシステインを付加したペプチド（peptide-3、配列番号：３）をシステイン残基を介してブタチログロブリンとの複合体とし、免疫原を作製した。
2.5 mlのPBSに溶解した 20.0 mgのkeyhole limpet hemocyanin (KLH, PIERCE)に、5.0 mgのSulfo-SMCCを添加し、室温で１時間攪拌した。Sulfo-SMCCと反応したKLHをPD-10を利用した分子ふるいクロマトグラフィーにより、大過剰にある未反応のSulfo-SMCCから分離した。Sulfo-SMCCと反応したKLHにあらかじめ0.2 mlの0.1 ％酢酸溶液に溶かした4 mgのpeptide-3（配列番号：３）と1.8 mlのPBSを添加して4℃で16時間攪拌し、peptide-3とブタチログロブリンの複合体を得た。このpeptide-3とブタチログロブリンの複合体をNPW30のカルボキシル末端領域と結合する抗体作製のための免疫原とした。
（４）マウスの免疫
上記（１）、（２）および（３）に記載の方法によって調製した各免疫原にフロイント完全アジュバントを混合し、各ペプチド（peptide-1、peptide-2またはpeptide-3）0.1 mgに相当する混合物をBalb/cマウス（雌、６〜８週齢）の腹腔内にそれぞれ投与した。初回免疫からおよそ４週間後、上記（１）、（２）および（３）に記載の方法によって調製した免疫原とフロイントの不完全アジュバントを混合し、各ペプチド0.05 mgに相当する混合物を初回免疫したBalb/cマウス（雌、６〜８週齢）の腹腔内にそれぞれ投与した。２回目の免疫以降、抗体価が上昇するまで２週間間隔で各ペプチド0.05 mgに相当する免疫原とフロイントの不完全アジュバントの混合物をそれぞれ免疫した。
(3) Preparation of immunogen for production of antibodies that bind to the carboxyl terminal region of NPW30
In order to produce an antibody that binds to the carboxyl terminal region of NPW30, a peptide (peptide-3, SEQ ID NO: 3) in which cysteine was added to the amino terminus of the carboxyl terminal 15-residue peptide of rat NPW30 via a cysteine residue An immunogen was prepared as a complex with porcine thyroglobulin.
To 20.0 mg of keyhole limpet hemocyanin (KLH, PIERCE) dissolved in 2.5 ml of PBS, 5.0 mg of Sulfo-SMCC was added and stirred at room temperature for 1 hour. KLH reacted with Sulfo-SMCC was separated from unreacted Sulfo-SMCC in a large excess by molecular sieve chromatography using PD-10. To KLH reacted with Sulfo-SMCC, 4 mg peptide-3 (SEQ ID NO: 3) dissolved in 0.2 ml 0.1% acetic acid solution and 1.8 ml PBS were added and stirred at 4 ° C for 16 hours. A complex of 3 and porcine thyroglobulin was obtained. This complex of peptide-3 and porcine thyroglobulin was used as an immunogen for preparing an antibody that binds to the carboxyl terminal region of NPW30.
(4) Immunization of mouse Each immunogen prepared by the method described in (1), (2) and (3) above is mixed with Freund's complete adjuvant, and each peptide (peptide-1, peptide-2 or peptide-3 ) Each 0.1 mg of the mixture was administered intraperitoneally to Balb / c mice (female, 6-8 weeks old). Approximately 4 weeks after the first immunization, the immunogen prepared by the method described in (1), (2) and (3) above and Freund's incomplete adjuvant are mixed, and the mixture corresponding to 0.05 mg of each peptide is subjected to the initial immunization. Were administered intraperitoneally to each of Balb / c mice (female, 6-8 weeks old). After the second immunization, each mixture was immunized with an immunogen equivalent to 0.05 mg of each peptide and Freund's incomplete adjuvant at intervals of 2 weeks until the antibody titer increased.
（５）Peptide-1、peptide-2およびpeptide-3のビオチン標識化
Peptide-1（配列番号：１）、peptide-2（配列番号：２）およびpeptide-3（配列番号：３）のシステイン残基をビオチンにより標識してビオチン標識化したpeptide-1、peptide-2およびpeptide-3を合成した。50 nmolの各ペプチドと500 nmolのBiotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR LABORATORIES)を0.5 mlの0.1 Mリン酸緩衝液 (pH 7.0)に溶解し、この溶液を37℃で3時間保温した。Peptide-1、peptide-2およびpeptide-3のシステイン残基のみがビオチンによって標識された生成物をそれぞれHPLCによって分取し、ビオチン標識化peptide-1（配列番号：１２）、ビオチン標識化peptide-2（配列番号：１３）およびビオチン標識化peptide-3（配列番号：１４）を得た。
（６）NPWのアミノ末端領域と結合する抗体の抗体価の測定
NPWのアミノ末端領域と結合する抗体の抗体価はビオチン標識化peptide-1（配列番号：１２）を使用した酵素免疫法により測定した。抗マウスIgG固相化プレートを以下のように作製した。50 mM炭酸緩衝液 (pH 9.6)で10μg/mlに希釈したヤギ抗マウスIgG (Fc)（ICN Biomedicals）を96ウェルイムノプレートに1ウェル当たり100μl添加し、4℃で3日間静置した。ウェル内の溶液を捨て、ブロックエース（雪印乳業）を1ウェル当たり350μl添加し、4℃で3日間静置した。ウェル内の溶液を捨て、3％ショ糖および0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBSを1ウェル当たり350μl添加し、4℃で1日間静置した。ウェル内の溶液を捨て、デシケーター内で3日間乾燥させた後、このプレートを使用するまで4℃で保存した。
上記（１）に記載の方法により調製したpeptide-1とブタチログロブリンの複合体を免疫したマウスから得た血清を0.1％BSAを含むPBSで種々の倍率で希釈した。希釈血清溶液50μl、0.1％BSAを含むPBSまたはNPW23溶液50μlおよび上記（５）に記載の方法により作製したビオチン標識化peptide-1溶液を0.1％ BSAを含むPBSで1000〜64000倍に希釈した溶液50μlを上記のようにして作製した抗マウスIgG固相化プレートのウェルに添加して室温で2〜3時間静置した。ウェル内の溶液を捨て、ウェルを0.9％塩化ナトリウムおよび0.05％ Tween20を含む蒸留水で4回洗浄した。ストレプトアビジン―西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）複合体溶液（Calbiochem）を0.1％ BSAを含むPBSで12000倍に希釈し、この希釈溶液100μlを各ウェルに添加し、室温で１時間静置した。ウェル内の溶液を捨て、ウェルを0.9％塩化ナトリウムおよび0.05％ Tween20を含む蒸留水で4回洗浄した。HRPの基質は、10 mgのオルソフェニレンジアミン錠剤 (SIGMA)を33 mMクエン酸および0.015％過酸化水素を含む66 mMリン酸水素二ナトリウム十二水和物水溶液11 mlに溶解して調製した。この基質溶液100μlをそれぞれのウェルに添加して室温で10〜30分間静置した。100μlの2 N硫酸をそれぞれのウェルに添加して反応を止めた後、基質溶液の492 nmにおける吸光度を測定した。ウェルの吸光度が高い場合は血清中にNPWのアミノ末端領域と結合する抗体が存在することを意味する。また、吸光度が過剰量のNPWの添加によりバックグラウンド程度に低下することはこの抗体とNPWのアミノ末端領域との結合が配列特異的であることを意味する。
(5) Peptide-1, peptide-2 and peptide-3 are labeled with biotin
Peptide-1 (SEQ ID NO: 1), peptide-2 (SEQ ID NO: 2), and peptide-3 (SEQ ID NO: 3) are labeled with biotin and labeled with biotin peptide-1, peptide-2 And peptide-3 were synthesized. 50 nmol of each peptide and 500 nmol of Biotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR LABORATORIES) were dissolved in 0.5 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0), and this solution was incubated at 37 ° C. for 3 hours. Products obtained by labeling only cysteine residues of Peptide-1, peptide-2 and peptide-3 with biotin were fractionated by HPLC, respectively, and biotin-labeled peptide-1 (SEQ ID NO: 12), biotin-labeled peptide- 2 (SEQ ID NO: 13) and biotin-labeled peptide-3 (SEQ ID NO: 14) were obtained.
(6) Measurement of antibody titer of antibody binding to amino terminal region of NPW
The antibody titer of the antibody that binds to the amino terminal region of NPW was measured by enzyme immunization using biotin-labeled peptide-1 (SEQ ID NO: 12). An anti-mouse IgG-immobilized plate was prepared as follows. 100 μl / well of goat anti-mouse IgG (Fc) (ICN Biomedicals) diluted to 10 μg / ml with 50 mM carbonate buffer (pH 9.6) was added to a 96-well immunoplate and allowed to stand at 4 ° C. for 3 days. The solution in the well was discarded, and Block Ace (Snow Brand Milk Products) was added in an amount of 350 μl per well and allowed to stand at 4 ° C. for 3 days. The solution in the well was discarded, and 350 μl of PBS containing 3% sucrose and 0.1% bovine serum albumin (BSA) was added per well, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 1 day. The solution in the wells was discarded, dried in a desiccator for 3 days, and stored at 4 ° C. until use.
Sera obtained from mice immunized with a complex of peptide-1 and porcine thyroglobulin prepared by the method described in (1) above was diluted with PBS containing 0.1% BSA at various magnifications. 50 μl of diluted serum solution, 50 μl of PBS or NPW23 solution containing 0.1% BSA, and a solution obtained by diluting the biotin-labeled peptide-1 solution prepared by the method described in (5) 1000 to 64000 times with PBS containing 0.1
（７）NPW23のカルボキシル末端領域と結合する抗体の抗体価の測定
NPW23のカルボキシル末端領域と結合する抗体の抗体価はビオチン標識化peptide-2（配列番号：１３）を使用した酵素免疫法により測定した。抗マウスIgG固相化プレートは上記（６）に記載の方法で作製した。上記（２）に記載の方法により調製したpeptide-2とブタチログロブリンの複合体を免疫したマウスから得た血清を0.1％ＢＳＡを含むPBSで種々の倍率で希釈した。希釈血清溶液50μl、0.1％ BSAを含むPBSまたはNPW23溶液50μlおよび上記（５）に記載の方法により作製したビオチン標識化peptide-2溶液を0.1％ BSAを含むPBSで1000〜64000倍に希釈した溶液50μlを抗マウスIgG固相化プレートのウェルに添加して室温で2〜3時間静置した。ウェル内の溶液を捨て、ウェルを0.9％塩化ナトリウムおよび0.05％ Tween20を含む蒸留水で4回洗浄した。ストレプトアビジン−HRP複合体溶液を0.1％ BSAを含むPBSで12000倍に希釈し、この希釈溶液100μlを各ウェルに添加し、室温で1時間静置した。ウェル内の溶液を捨て、ウェルを0.9％塩化ナトリウムおよび0.05％ Tween20を含む蒸留水で4回洗浄した。HRPの基質は実施例８と同様にして調製し、基質溶液100μlをそれぞれのウェルに添加して室温で10〜30分間静置した。100μlの2 N硫酸をそれぞれのウェルに添加して反応を止めた後、基質溶液の492 nmにおける吸光度を測定した。ウェルの吸光度が高い場合は血清中にNPW23のカルボキシル末端領域と結合する抗体が存在することを意味する。また、吸光度が過剰量のNPW23の添加によりバックグラウンド程度に低下することはこの抗体とNPW23カルボキシル末端領域との結合が配列特異的であることを意味する。
（８）NPW30のカルボキシル末端領域と結合する抗体の抗体価の測定
NPW30のカルボキシル末端領域と結合する抗体の抗体価はビオチン標識化peptide-3（配列番号：１４）を使用した酵素免疫法により測定した。抗マウスIgG固相化プレートは、上記（６）に記載の方法で作製した。上記（３）に記載の方法により調製したpeptide-3とKLHの複合体を免疫したマウスから得た血清を0.1％ BSAを含むPBSで種々の倍率で希釈した。希釈血清溶液50μl、0.1％ BSAを含むPBSまたはNPW30溶液50μlおよび上記（５）に記載の方法により作製したビオチン標識化peptide-3溶液を0.1％ BSAを含むPBSで1000〜64000倍に希釈した溶液50μlを抗マウスIgG固相化プレートのウェルに添加して室温で2〜3時間静置した。ウェル内の溶液を捨て、ウェルを0.9％塩化ナトリウムおよび0.05％ Tween20を含む蒸留水で４回洗浄した。ストレプトアビジン―HRP複合体溶液を0.1％BSAを含むPBSで12000倍に希釈し、この希釈溶液100μlを各ウェルに添加し、室温で1時間静置した。ウェル内の溶液を捨て、ウェルを0.9％塩化ナトリウムおよび0.05％ Tween20を含む蒸留水で4回洗浄した。HRPの基質は実施例８と同様にして調製し、基質溶液100μlをそれぞれのウェルに添加して室温で10〜30分間静置した。100μlの2 N硫酸をそれぞれのウェルに添加して反応を止めた後、基質溶液の492 nmにおける吸光度を測定した。ウェルの吸光度が高い場合は血清中にNPW30のカルボキシル末端領域と結合する抗体が存在することを意味する。また、吸光度が過剰量のNPW30の添加によりバックグラウンド程度に低下することはこの抗体とNPW30カルボキシル末端領域との結合が配列特異的であることを意味する。
(7) Measurement of antibody titer of antibody binding to carboxyl terminal region of NPW23
The antibody titer of the antibody that binds to the carboxyl terminal region of NPW23 was measured by enzyme immunization using biotin-labeled peptide-2 (SEQ ID NO: 13). The anti-mouse IgG-immobilized plate was prepared by the method described in (6) above. Serum obtained from a mouse immunized with a complex of peptide-2 and porcine thyroglobulin prepared by the method described in (2) above was diluted with PBS containing 0.1% BSA at various magnifications. 50 μl of diluted serum solution, 50 μl of PBS or NPW23 solution containing 0.1% BSA, and a solution obtained by diluting the biotin-labeled peptide-2 solution prepared by the method described in (5) 1000 to 64000 times with PBS containing 0.1
(8) Measurement of antibody titer of antibody binding to carboxyl terminal region of NPW30
The antibody titer of the antibody that binds to the carboxyl terminal region of NPW30 was measured by enzyme immunization using biotin-labeled peptide-3 (SEQ ID NO: 14). The anti-mouse IgG-immobilized plate was prepared by the method described in (6) above. Serum obtained from a mouse immunized with a complex of peptide-3 and KLH prepared by the method described in (3) above was diluted with PBS containing 0.1% BSA at various magnifications. 50 μl of diluted serum solution, 50 μl of PBS or NPW30 solution containing 0.1% BSA, and a solution obtained by diluting the biotin-labeled peptide-3 solution prepared by the method described in (5) 1000 to 64000 times with PBS containing 0.1
（９）細胞融合、抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング、モノクローナル抗体取得と腹水取得
上記（４）に記載の方法によって免疫したマウスの血清の各抗原に対する抗体価を上記（６）、（７）または（８）に記載の方法によって測定し、比較的高い抗体価を示したマウスに対して0.05 mgの免疫原を50μlのPBSに溶解した溶液を静脈内に投与することにより最終免疫を行なった。最終免疫から3〜4日後のマウスから脾臓を摘出し、ステンレスメッシュで圧迫した後、ろ過し、RPMI 1640培地 に浮遊させて脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞としてBalb/c由来ミエローマ細胞P3X63Ag8.653を用いた。細胞融合は原報（Kohler, G. & Milstein, C.、Nature、256巻、495頁、1975年） に準じて行なった。すなわち、脾臓細胞およびP3X63Ag8.653をそれぞれ血清を含有しないRPMI 1640で３度洗浄し、脾臓細胞とP3X63Ag8.653細胞の細胞数の比率を10：1になるよう混合して800回/分の回転数で15分間遠心を行なって細胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽くほぐし、0.2 mlのポリエチレングリコール (HYBRI-MAX, SIGMA)を30秒間かけて加え、次に5 mlのRPMI 1640を2分間かけて加え、最後に5 mlのRPMI 1640を加えた。この混合液を37℃で3分間保温して細胞融合を進行させた。融合後、600回/分の遠心速度で15分間遠心した。この細胞沈殿物にHAT（ヒポキサンチン1×10-4M、アミノプテリン4×10-7M、チミジン1.6×10-3M）および10％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培地を加えてP3X63Ag8.653の細胞数が0.2 ml 当り2〜3×105 個になるように調製し、96ウェルプレートに1ウェルあたり0.2 mlを播種した。培養開始後9〜14日で培養液が黄変したとき上清を採取し、細胞融合されたハイブリドーマの培養上清中の抗体価を上記（６）、（７）または（８）に記載の方法によってそれぞれ測定した。
ハイブリドーマ培養上清中にNPWのアミノ末端、NPW23のカルボキシル末端またはNPW30のカルボキシル末端に対して特異的に結合する抗体の存在を確認した後、これらのハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりクローニングした。1ウェル当たり5×105 個のBalb/cマウス胸腺細胞をあらかじめ播種した96ウェルプレートに平均1個のハイブリドーマを含む100μlの培養液（HATおよび10％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640）をそれぞれ添加した。10日間培養した後、一つのコロニーからなるハイブリドーマが生育したウェルの培養上清中の抗体価を測定し、NPWのアミノ末端、NPW23のカルボキシル末端あるいはNPW30のカルボキシル末端に対してそれぞれ特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択した。
腹腔内に0.5 mlのプリスタンを投与したヌードマウス（Balb/c AnNCrj-nu/nu、雌、6〜8週齢）に、１匹当たり1×106から5×106個の上記のようにして選択したハイブリドーマ細胞を腹腔内投与し、6〜20日後に抗体含有腹水を採取した。得られた腹水よりモノクローナル抗体をプロテインＡカラムにより精製した。即ち、6〜20mlの腹水を等量の結合緩衝液（3.5M NaCl、0.05％ NaN3を含む1.5M グリシン緩衝液（pH9.0））で希釈した後、あらかじめ結合緩衝液で平衡化したプロテインＡ−セルロース（生化学工業）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衝液（0.05％ NaN3を含む0.1Mクエン酸緩衝液、pH3.0）で溶出した。この抗体を含む溶出液を中和した後、Centriplus YM-50 (Amicon)により濃縮した。この抗体濃縮液にPBSを加えて、Centriplus YM-50による濃縮を繰り返すことにより抗体が溶けている緩衝液をPBSに置換した。
(9) Cell fusion, screening of antibody-producing hybridomas, acquisition of monoclonal antibodies and ascites The antibody titer against each antigen of the sera of mice immunized by the method described in (4) above is (6), (7) or (8 The final immunization was performed by intravenously administering a solution in which 0.05 mg of immunogen was dissolved in 50 μl of PBS to mice that showed a relatively high antibody titer. The spleen was removed from the mice 3-4 days after the final immunization, pressed with a stainless mesh, filtered, and suspended in RPMI 1640 medium to obtain a spleen cell suspension. Balb / c-derived myeloma cells P3X63Ag8.653 were used as cells for cell fusion. Cell fusion was performed according to the original report (Kohler, G. & Milstein, C., Nature, 256, 495, 1975). That is, spleen cells and P3X63Ag8.653 were each washed 3 times with RPMI 1640 without serum, and the cell number ratio of spleen cells to P3X63Ag8.653 cells was mixed to 10: 1 and rotated 800 times / min. The cells were precipitated by centrifugation for 15 minutes. After thoroughly removing the supernatant, lightly loosen the precipitate, add 0.2 ml polyethylene glycol (HYBRI-MAX, SIGMA) over 30 seconds, then add 5 ml RPMI 1640 over 2 minutes, and finally 5 ml RPMI 1640 was added. This mixture was incubated at 37 ° C. for 3 minutes to allow cell fusion to proceed. After the fusion, the mixture was centrifuged for 15 minutes at a centrifugal speed of 600 times / minute. P3X63Ag8.653 with RPMI 1640 medium containing HAT (
After confirming the presence of antibodies specifically binding to the amino terminus of NPW, the carboxyl terminus of NPW23, or the carboxyl terminus of NPW30 in the hybridoma culture supernatant, these hybridoma cells were cloned by limiting dilution. Add 100 μl culture medium (RPMI 1640 containing HAT and 10% fetal calf serum) to 96-well plates pre-seeded with 5 × 10 5 Balb / c mouse thymocytes per well did. After culturing for 10 days, the antibody titer in the culture supernatant of a well in which a hybridoma consisting of one colony has grown was measured, and each antibody specific for the amino terminus of NPW, the carboxyl terminus of NPW23, or the carboxyl terminus of NPW30 Were selected.
Nude mice (Balb / c AnNCrj-nu / nu, female, 6-8 weeks old) that received 0.5 ml of pristane intraperitoneally were treated as above with 1 × 10 6 to 5 × 10 6 per mouse. The selected hybridoma cells were intraperitoneally administered, and antibody-containing ascites was collected 6 to 20 days later. A monoclonal antibody was purified from the obtained ascites using a protein A column. That is, 6-20 ml of ascites was diluted with an equal amount of binding buffer (1.5 M glycine buffer (pH 9.0) containing 3.5 M NaCl, 0.05% NaN 3 ), and then equilibrated with the binding buffer in advance. The solution was applied to an A-cellulose (Seikagaku Corporation) column, and the specific antibody was eluted with an elution buffer (0.1 M citrate buffer containing 0.05% NaN 3 , pH 3.0). The eluate containing this antibody was neutralized and then concentrated with Centriplus YM-50 (Amicon). PBS was added to this antibody concentrate, and the buffer solution in which the antibody was dissolved was replaced with PBS by repeating the concentration with Centriplus YM-50.
（１０）NPWのアミノ末端領域と結合するモノクローナル抗体
上記（９）に記載の方法により取得したNPWのアミノ末端領域に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞から得られた4種類のモノクローナル抗体、2G6-D1、3H3-E4、5E6-C3および7F9-E12について酵素免疫法によってpeptide-1（配列番号：１)、ヒトNPW23（配列番号：４）およびヒトNPW30（配列番号：５）を認識することを確認した。マウスIgG固相化プレートを以下のようにして作製した。50 mM炭酸緩衝液 (pH 9.6)で10μg/mlに希釈したヤギ抗マウスIgG (Fc)（ICN Biomedicals）を96ウェルイムノプレートに1ウェル当たり150μl添加し、4℃で1日間静置した。ウェル内の溶液を捨て、ブロックエースを1ウェル当たり200μl添加し、このプレートを使用するまで4℃で保存した。
2G6-D1、3H3-E4、5E6-C3または7F9-E12抗体を産生するハイブリドーマ培養上清をEIA緩衝液（0.1％BSA、0.4％塩化ナトリウム、2 mM EDTA、0.05％ CHAPS (3-((3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propanesulfonate)、20 mMリン酸緩衝液（pH 7.0））によりそれぞれ固定した倍率 (50〜1000倍) で希釈した。これらの抗体溶液50μl、種々の濃度にEIA緩衝液で希釈したpeptide-1（配列番号：１）、ヒトNPW23（配列番号：４）またはヒトNPW30（配列番号：５）溶液50μlおよびEIA緩衝液で75000倍希釈したビオチン標識化peptide-1溶液50μlを上記のマウスIgG固相化プレートに添加した。これらのプレートを4℃で16時間静置した後、それぞれのウェルをPBSで洗浄した。各ウェルにEIA緩衝液で20000倍に希釈したストレプトアビジン−HRP溶液150μl を加えて室温で2時間静置した。PBSで洗浄した後、TMBマイクロウェルパーオキシダーゼ基質（KIRKEGAARD&PERRY LAB, INC）150μl を添加して室温で静置した。反応を1 Mリン酸75μlを加えて停止した後、450 nmにおける吸光度をプレートリーダー（BICHROMATIC、大日本製薬社製）で測定した。この反応系で相対的結合（％）とは、抗体溶液、EIA緩衝液およびビオチン標識化peptide-1溶液を添加したウェルの吸光度からEIA緩衝液とビオチン標識化peptide-1溶液を添加したウェルの吸光度を減じた値を100％結合としたときのそれぞれのウェルにおける吸光度からEIA緩衝液とビオチン標識化peptide-1溶液を添加したウェルの吸光度を減じた値の相対値である。
図１、図２、図３および図４に示すように、2G6-D1、3H3-E4、5E6-C3および7F9-E12抗体とビオチン標識化peptide-1との結合は濃度依存的にpeptide-1、ヒトNPW23およびヒトNPW30によって阻害された。
このことは、2G6-D1、3H3-E4、5E6-C3および7F9-E12抗体は、NPWのアミノ末端領域を認識してNPWと結合することを意味する。
NPWのアミノ末端領域を特異的に認識する抗体である2G6-D1（AhW23N2G6D1a）および3H3-E4（AhW23N3H3a）を産生するハイブリドーマ細胞を、AhW23N2G6D1およびAhW23N3H3E4とそれぞれ命名した。
(10) Monoclonal antibodies that bind to the amino terminal region of NPW Four types of monoclonal antibodies obtained from hybridoma cells that produce antibodies that specifically bind to the amino terminal region of NPW obtained by the method described in (9) above , 2G6-D1, 3H3-E4, 5E6-C3 and 7F9-E12 recognize peptide-1 (SEQ ID NO: 1), human NPW23 (SEQ ID NO: 4) and human NPW30 (SEQ ID NO: 5) by enzyme immunization. Confirmed to do. A mouse IgG-immobilized plate was prepared as follows. 150 μl / well of goat anti-mouse IgG (Fc) (ICN Biomedicals) diluted to 10 μg / ml with 50 mM carbonate buffer (pH 9.6) was added to a 96-well immunoplate and allowed to stand at 4 ° C. for 1 day. The solution in the well was discarded and 200 μl of Block Ace was added per well and the plate was stored at 4 ° C. until use.
Hybridoma culture supernatants that produce 2G6-D1, 3H3-E4, 5E6-C3 or 7F9-E12 antibodies were washed with EIA buffer (0.1% BSA, 0.4% sodium chloride, 2 mM EDTA, 0.05% CHAPS (3-((3 -cholamidopropyl) dimethylammonio) -1-propanesulfonate) and 20 mM phosphate buffer (pH 7.0)), respectively, at a fixed magnification (50 to 1000 times). 50 μl of these antibody solutions, 50 μl of peptide-1 (SEQ ID NO: 1), human NPW23 (SEQ ID NO: 4) or human NPW30 (SEQ ID NO: 5) diluted to various concentrations with EIA buffer and
As shown in FIG. 1, FIG. 2, FIG. 3 and FIG. 4, the binding between 2G6-D1, 3H3-E4, 5E6-C3 and 7F9-E12 antibodies and biotin-labeled peptide-1 depends on the concentration of peptide-1 Inhibited by human NPW23 and human NPW30.
This means that the 2G6-D1, 3H3-E4, 5E6-C3 and 7F9-E12 antibodies recognize the amino terminal region of NPW and bind to NPW.
Hybridoma cells producing 2G6-D1 (AhW23N2G6D1a) and 3H3-E4 (AhW23N3H3a), antibodies that specifically recognize the amino terminal region of NPW, were named AhW23N2G6D1 and AhW23N3H3E4, respectively.
（１１）NPW23のカルボキシル末端領域と結合するモノクローナル抗体
上記（９）に記載の方法により取得したNPW23のカルボキシル末端領域に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞から得られた６種類のモノクローナル抗体、2F1B2A、5A2A、5D6-F10、5G2-F6、6G1-H8および7B4-D2について酵素免疫法によってpeptide-2（配列番号：２)およびヒトNPW23（配列番号：４）を認識することを確認した。マウスIgG固相化プレートは、上記（１０）に従って作製した。2F1B2A、5A2A、5D6-F10、5G2-F6、6G1-H8または7B4-D2抗体を産生するハイブリドーマ培養上清を上記（１０）に記載のEIA緩衝液によりそれぞれ固定した倍率 (30〜1000倍) で希釈した。これらの抗体溶液50μl、種々の濃度にEIA緩衝液で希釈したpeptide-2（配列番号：２)、ヒトNPW23（配列番号：４）またはヒトNPW30（配列番号：５）溶液50μlおよびEIA緩衝液でそれぞれ固定した倍率 (75000〜225000倍) に希釈したビオチン標識化peptide-2溶液50μlをマウスIgG固相化プレートに添加した。これらのプレートを4℃で16時間静置した後、それぞれのウェルをPBSで洗浄した。各ウェルにEIA緩衝液で20000倍に希釈したストレプトアビジン−HRP溶液150μl を加えて室温で2時間静置した。PBSで洗浄した後、TMBマイクロウェルパーオキシダーゼ基質150μl を添加して室温で静置した。反応を1 Mリン酸75μlを加えて停止した後、450 nmにおける吸光度をプレートリーダーで測定した。この反応系で相対的結合（％）とは、抗体溶液、EIA緩衝液およびビオチン標識化peptide-2溶液を添加したウェルの吸光度からEIA緩衝液とビオチン標識化peptide-2溶液を添加したウェルの吸光度を減じた値を100％結合としたときのそれぞれのウェルにおける吸光度からEIA緩衝液とビオチン標識化peptide-2溶液を添加したウェルの吸光度を減じた値の相対値である。
図５、図６、図７、図８、図９および図１０に示すように、2F1B2A、5A2A、5D6-F10、5G2-F6、6G1-H8および7B4-D2抗体とビオチン標識化peptide-2との結合はpeptide-2およびヒトNPW23によって阻害された。
このことは、2F1B2A、5A2A、5D6-F10、5G2-F6、6G1-H8および7B4-D2抗体はNPW23のカルボキシル末端領域を認識してNPW23と結合することを意味する。
NPW23のカルボキシル末端領域を特異的に認識する抗体である5G2-F6（AhW23C5G2F6a）および6G1-H8（AhW23C6G1H8a）を産生するハイブリドーマ細胞をそれぞれAhW23C5G2F6およびAhW23C6G1H8と命名した。
(11) Monoclonal antibodies that bind to the carboxyl terminal region of NPW23 Six monoclonal antibodies obtained from hybridoma cells that produce an antibody that specifically binds to the carboxyl terminal region of NPW23 obtained by the method described in (9) above , 2F1B2A, 5A2A, 5D6-F10, 5G2-F6, 6G1-H8 and 7B4-D2 were confirmed to recognize peptide-2 (SEQ ID NO: 2) and human NPW23 (SEQ ID NO: 4) by enzyme immunization. . A mouse IgG-immobilized plate was prepared according to (10) above. Hybridoma culture supernatants that produce 2F1B2A, 5A2A, 5D6-F10, 5G2-F6, 6G1-H8 or 7B4-D2 antibody were fixed at a magnification (30 to 100 times) respectively with the EIA buffer described in (10) above. Diluted. 50 μl of these antibody solutions, 50 μl of peptide-2 (SEQ ID NO: 2), human NPW23 (SEQ ID NO: 4) or human NPW30 (SEQ ID NO: 5) diluted to various concentrations with EIA buffer and
As shown in FIG. 5, FIG. 6, FIG. 7, FIG. 8, FIG. 9 and FIG. 10, 2F1B2A, 5A2A, 5D6-F10, 5G2-F6, 6G1-H8 and 7B4-D2 antibodies and biotinylated peptide-2 Was inhibited by peptide-2 and human NPW23.
This means that the 2F1B2A, 5A2A, 5D6-F10, 5G2-F6, 6G1-H8 and 7B4-D2 antibodies recognize the carboxyl terminal region of NPW23 and bind to NPW23.
Hybridoma cells producing 5G2-F6 (AhW23C5G2F6a) and 6G1-H8 (AhW23C6G1H8a), which are antibodies that specifically recognize the carboxyl terminal region of NPW23, were named AhW23C5G2F6 and AhW23C6G1H8, respectively.
（１２）NPW30のカルボキシル末端領域と結合するモノクローナル抗体
上記（９）に記載の方法により取得したNPW30のカルボキシル末端領域に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞から得られた３種類のモノクローナル抗体、2A1A、3A1Aおよび7F2-E8について酵素免疫法によってpeptide-3（配列番号：３）およびヒトNPW30（配列番号：５）を認識することを確認した。マウスIgG固相化プレートは、上記（１０）に従って作製した。2A1A、3A1Aまたは7F2-E8抗体を産生するハイブリドーマ培養上清を上記（１０）に記載のEIA緩衝液により100倍希釈した。これらの抗体溶液50μl、種々の濃度にEIA緩衝液で希釈したpeptide-3（配列番号：３）、ヒトNPW23（配列番号：４）またはヒトNPW30（配列番号：５）溶液50μlおよびEIA緩衝液で100000倍希釈したビオチン標識化peptide-3溶液50μlをマウスIgG固相化プレートに添加した。これらのプレートを4℃で16時間静置した後、それぞれのウェルをPBSで洗浄した。各ウェルにEIA緩衝液で20000倍に希釈したストレプトアビジン−HRP溶液150μl を加えて室温で２時間静置した。PBSで洗浄した後、TMBマイクロウェルパーオキシダーゼ基質150μl を添加して室温で静置した。反応を1 Mリン酸75μlを加えて停止した後、450 nmにおける吸光度をプレートリーダーで測定した。この反応系で相対的結合（％）とは、抗体溶液、EIA緩衝液およびビオチン標識化peptide-3溶液を添加したウェルの吸光度からEIA緩衝液とビオチン標識化peptide-3溶液を添加したウェルの吸光度を減じた値を100％結合としたときのそれぞれのウェルにおける吸光度からEIA緩衝液とビオチン標識化peptide-3溶液を添加したウェルの吸光度を減じた値の相対値である。
図１１、図１２および図１３に示すように、2A1A、3A1Aおよび7F2-E8抗体とビオチン標識化peptide-3との結合はpeptide-3およびヒトNPW30によって阻害された。このことは、2A1A、3A1Aおよび7F2-E8抗体はNPW30のカルボキシル末端領域を認識してNPW30と結合することを意味する。
NPW30のカルボキシル末端領域を特異的に認識する抗体である3A1A（ArW30C3A1Aa）および7F2-E8（ArW30C7F2E8a）を産生するハイブリドーマ細胞をそれぞれArW30C3A1AおよびArW30C7F2E8と命名した。
(12) Monoclonal antibodies that bind to the carboxyl terminal region of NPW30 Three types of monoclonal antibodies obtained from hybridoma cells that produce antibodies that specifically bind to the carboxyl terminal region of NPW30 obtained by the method described in (9) above 2A1A, 3A1A and 7F2-E8 were confirmed to recognize peptide-3 (SEQ ID NO: 3) and human NPW30 (SEQ ID NO: 5) by enzyme immunization. A mouse IgG-immobilized plate was prepared according to (10) above. The hybridoma culture supernatant producing 2A1A, 3A1A or 7F2-E8 antibody was diluted 100 times with the EIA buffer described in (10) above. 50 μl of these antibody solutions, 50 μl of peptide-3 (SEQ ID NO: 3), human NPW23 (SEQ ID NO: 4) or human NPW30 (SEQ ID NO: 5) diluted to various concentrations with EIA buffer and
As shown in FIGS. 11, 12, and 13, the binding between 2A1A, 3A1A and 7F2-E8 antibodies and biotin-labeled peptide-3 was inhibited by peptide-3 and human NPW30. This means that the 2A1A, 3A1A and 7F2-E8 antibodies recognize the carboxyl terminal region of NPW30 and bind to NPW30.
Hybridoma cells producing antibodies 3A1A (ArW30C3A1Aa) and 7F2-E8 (ArW30C7F2E8a), which specifically recognize the carboxyl terminal region of NPW30, were named ArW30C3A1A and ArW30C7F2E8, respectively.
実施例２
抗NPWモノクローナル抗体によるNPWのアゴニスト活性の抑制
実施例１−（１０）、１−（１１）および１−（１２）に記載のモノクローナル抗体によるNPWのアゴニスト活性に対する抑制作用を調べた。NPWと抗NPWモノクローナル抗体を室温で１時間反応させた後、この反応液をWO 02/93161号公報記載の方法により作製したヒトGPR7（配列番号：１５）を発現するCHO細胞株、WO 01/98494号公報記載の方法により作製したヒトGPR8（配列番号：１７）を発現するCHO細胞株またはWO 02/44368号公報記載の方法により作製したラットGPR7（WO 02/44368に記載のTGR26と同一のレセプター）（配列番号：１９）を発現するCHO細胞株に添加してフォルスコリン（FSK）刺激によるこれらの細胞のcAMP蓄積を阻害する活性を測定した。
本実施例において用いた各NPWと各抗NPWモノクローナル抗体を希釈するバッファー（以下、希釈バッファーと称する）として20 mM HEPES、0.05％ BSA、2μM FSKおよび0.2 mM 3-isobutyl-1-methylxantine (IBMX)を含むpH 7.4のMEMα培地を用いた。この希釈バッファーで調製した2 nMの各NPWと種々の濃度の各抗NPWモノクローナル抗体IgG混合液を室温で１時間保温した。ヒトGPR7発現CHO細胞株、ヒトGPR8発現CHO細胞株またはラットGPR7発現CHO細胞株は5×104個を24ウェルプレートに播種して2日間培養し、各NPWと各抗NPW抗体の反応液を添加する前に各ウェルを0.5 mlの20 mM HEPES、0.05％ BSAおよび0.2 mM IBMXを含むMEMα培地（以下、洗浄バッファーと称する）で3回洗浄した後、1ウェル当たり0.5 mlの洗浄バッファーを添加した。30分間培養し、さらに0.5 mlの洗浄バッファーで3回洗浄した後、1ウェル当たり0.25 mlの洗浄バッファーと0.25 mlのNPWと抗NPW抗体の反応液を添加した。37℃で30分間保温した後、各ウェルに0.1 mlの20％過塩素酸を添加することによって細胞内のcAMP合成反応を停止させ、次に24ウェルプレートを氷上に1時間置くことでcAMPを抽出した。抽出液中のcAMP量は、cAMP EIAシステム（Amersham Biosciences）で測定した。cAMP蓄積の相対値（％）は、測定試料添加の細胞内のcAMP量からFSK非添加の細胞内cAMP量を減じた値のFSK刺激のみの細胞内cAMP量からFSK非添加の細胞内cAMP量を減じた値に対する相対比率である。
ヒトNPW23（配列番号：４）をNPWアミノ末端認識モノクローナル抗体である2G6-D1、3H3-E4、5E6-C3および7F9-E12と反応させた後、反応液をヒトGPR7発現細胞株またはヒトGPR8発現細胞株に投与した。ヒトNPW23のみの投与によりヒトGPR7発現細胞内のcAMP量はFSK刺激のみの場合に比べ46％に減少したが、ヒトNPW23をモル比で30倍過剰量の2G6-D1、3H3-E4、5E6-C3および7F9-E12と反応させることによりヒトGPR7発現細胞内のcAMP量はFSK刺激のみの場合に比べ97％、93％、69％および81％までそれぞれ回復した。結果を図１４に示す。
一方、ヒトNPW23のみの投与によりヒトGPR8発現細胞内のcAMP量はFSK刺激のみの場合に比べ31％に減少したが、ヒトNPW23をモル比で30倍過剰量の2G6-D1、3H3-E4、5E6-C3および7F9-E12と反応させることによりヒトGPR8発現細胞内のcAMP量はFSK刺激のみの場合に比べ100％、100％、87％および90％までそれぞれ回復した。結果を図１５に示す。
これらの結果は、2G6-D1、3H3-E4、5E6-C3および7F9-E12がヒトNPW23のcAMP合成阻害活性を抑制することを意味する。
ラットNPW23（配列番号：６）をNPWアミノ末端認識モノクローナル抗体である3H3-E4、5E6-C3および7F9-E12と反応させた後、反応液をラットGPR7発現細胞株に投与した。ラットNPW23のみの投与によりラットGPR7発現細胞内のcAMP量はFSK刺激のみの場合に比べ9％に減少したが、ラットNPW23をモル比で30倍過剰量の3H3-E4、5E6-C3および7F9-E12と反応させることによりGPR7発現細胞内のcAMP量はFSK刺激のみの場合に比べ53％、17％および32％までそれぞれ回復した。結果を図１６に示す。
これらの結果は、3H3-E4、5E6-C3および7F9-E12がラットNPW23のcAMP合成阻害活性を抑制することを意味する。
ラットNPW23またはラットNPW30（配列番号：７）をNPWアミノ末端認識モノクローナル抗体である2G6-D1と反応させた後、反応液をラットGPR7発現細胞株に投与した。ラットNPW23あるいはラットNPW30のみの投与によりラットGPR7発現細胞内のcAMP量はFSK刺激のみの場合に比べ8％および31％にそれぞれ減少したが、ラットNPW23あるいはラットNPW30をモル比で30倍過剰量の2G6-D1と反応させることによりGPR7発現細胞内のcAMP量はFSK刺激のみの場合に比べ38％および60％までそれぞれ回復した。結果を図１７に示す。
これらの結果は、2G6-D1がラットNPW23およびラットNPW30のcAMP合成阻害活性を抑制することを意味する。
ラットNPW23をNPW23カルボキシル末端認識モノクローナル抗体である2F1B2A、5A2A, 5D6-F10、5G2-F6、6G1-H8および7B4-D2と反応させた後、反応液をラットGPR7発現細胞株に投与した。ラットNPW23のみの投与によりラットGPR7発現細胞内のcAMP量はFSK刺激のみの場合に比べ7％に減少したが、ラットNPW23をモル比で30倍過剰量の2F1B2A、5A2A、5D6-F10、5G2-F6、6G1-H8および7B4-D2と反応させたところ、5A2A、5G2-F6および7B4-D2と反応させたときにGPR7発現細胞内のcAMP量はFSK刺激のみの場合に比べ16％、71％および73％までそれぞれ回復した。結果を図１８に示す。
これらの結果は、5A2A、5G2-F6および7B4-D2がラットNPW23のcAMP合成阻害活性を抑制することを意味する。
ラットNPW30をNPW30カルボキシル末端認識モノクローナル抗体である3A1Aおよび7F2-E8と反応させた後、反応液をラットＧＰＲ７発現細胞株に投与した。ラットNPW30のみの投与によりラットGPR7発現細胞内のcAMP量はFSK刺激のみの場合に比べ50％に減少したが、ラットNPW30をモル比で150倍過剰量の3A1Aおよび7F2-E8と反応させることによりGPR7発現細胞内のcAMP量はFSK刺激のみの場合に比べ75％および72％までそれぞれ回復した。結果を図１９に示す。
これらの結果は、3A1Aおよび7F2-E8がラットNPW30のcAMP合成阻害活性を抑制することを意味する。
Example 2
Inhibition of NPW Agonist Activity by Anti-NPW Monoclonal Antibody The inhibitory action on the NPW agonist activity by the monoclonal antibodies described in Examples 1- (10), 1- (11) and 1- (12) was examined. After reacting NPW and anti-NPW monoclonal antibody for 1 hour at room temperature, this reaction solution was prepared by the method described in WO 02/93161. A CHO cell line expressing human GPR7 (SEQ ID NO: 15), WO 01 / CHO cell line expressing human GPR8 (SEQ ID NO: 17) prepared by the method described in Japanese Patent No. 98494 or rat GPR7 prepared by the method described in WO 02/44368 (identical to TGR26 described in WO 02/44368) It was added to a CHO cell line expressing the receptor (SEQ ID NO: 19) and the activity of inhibiting cAMP accumulation in these cells by stimulation with forskolin (FSK) was measured.
20 mM HEPES, 0.05% BSA, 2 μM FSK and 0.2 mM 3-isobutyl-1-methylxantine (IBMX) were used as buffers (hereinafter referred to as dilution buffers) for diluting each NPW and each anti-NPW monoclonal antibody used in this example. MEMα medium with pH 7.4 containing was used. Each 2 nM NPW prepared with this dilution buffer and various concentrations of each anti-NPW monoclonal antibody IgG mixed solution were incubated at room temperature for 1 hour. Human GPR7-expressing CHO cell lines, human GPR8-expressing CHO cell line or rat GPR7-expressing CHO cell line is 5 × 10 4 cells were seeded into 24-well plates and cultured for 2 days, the reaction solution of each NPW and each anti-NPW antibody Wash each well 3 times with 0.5 ml of 20 mM HEPES, 0.05% BSA and 0.2 mM IBMX (hereinafter referred to as wash buffer) before adding 0.5 ml wash buffer per well. did. After culturing for 30 minutes and further washing three times with 0.5 ml of washing buffer, 0.25 ml of washing buffer, 0.25 ml of NPW and anti-NPW antibody reaction solution were added per well. After incubation at 37 ° C for 30 minutes, the intracellular cAMP synthesis reaction was stopped by adding 0.1 ml of 20% perchloric acid to each well, and then the cAMP was placed in a 24-well plate on ice for 1 hour. Extracted. The amount of cAMP in the extract was measured with a cAMP EIA system (Amersham Biosciences). The relative value of cAMP accumulation (%) is the amount of intracellular cAMP with no FSK added to the amount of intracellular cAMP with no FSK added to the amount of intracellular cAMP with no FSK added to the amount of intracellular cAMP with no FSK added. The relative ratio to the value obtained by subtracting.
Human NPW23 (SEQ ID NO: 4) was reacted with 2G6-D1, 3H3-E4, 5E6-C3 and 7F9-E12 which are NPW amino-terminal-recognizing monoclonal antibodies, and then the reaction solution was expressed with a human GPR7-expressing cell line or human GPR8. Administered to cell lines. Administration of human NPW23 alone reduced the amount of cAMP in human GPR7-expressing cells to 46% compared to the case of FSK stimulation alone, but human NPW23 was 30-fold excess in molar ratio of 2G6-D1, 3H3-E4, 5E6- By reacting with C3 and 7F9-E12, the amount of cAMP in human GPR7-expressing cells recovered to 97%, 93%, 69%, and 81%, respectively, compared to the case of FSK stimulation alone. The results are shown in FIG.
On the other hand, administration of human NPW23 alone reduced the amount of cAMP in human GPR8-expressing cells to 31% compared to the case of FSK stimulation alone, but human NPW23 was 30-fold excess in molar ratio of 2G6-D1, 3H3-E4, By reacting with 5E6-C3 and 7F9-E12, the amount of cAMP in human GPR8-expressing cells recovered to 100%, 100%, 87% and 90%, respectively, compared to the case of FSK stimulation alone. The results are shown in FIG.
These results mean that 2G6-D1, 3H3-E4, 5E6-C3 and 7F9-E12 suppress the cAMP synthesis inhibitory activity of human NPW23.
Rat NPW23 (SEQ ID NO: 6) was reacted with 3H3-E4, 5E6-C3 and 7F9-E12, which are NPW amino terminal-recognizing monoclonal antibodies, and then the reaction solution was administered to a rat GPR7-expressing cell line. Administration of rat NPW23 alone reduced the amount of cAMP in rat GPR7-expressing cells to 9% compared to the case of FSK stimulation alone, but rat NPW23 was 30-fold molar excess of 3H3-E4, 5E6-C3 and 7F9- By reacting with E12, the amount of cAMP in GPR7-expressing cells recovered to 53%, 17%, and 32%, respectively, compared to the case of FSK stimulation alone. The results are shown in FIG.
These results mean that 3H3-E4, 5E6-C3 and 7F9-E12 suppress the cAMP synthesis inhibitory activity of rat NPW23.
Rat NPW23 or rat NPW30 (SEQ ID NO: 7) was reacted with 2G6-D1, which is an NPW amino terminal-recognizing monoclonal antibody, and then the reaction solution was administered to a rat GPR7-expressing cell line. Administration of rat NPW23 or rat NPW30 alone reduced the amount of cAMP in rat GPR7-expressing cells to 8% and 31%, respectively, compared to the case of FSK stimulation alone, but rat NPW23 or rat NPW30 was in a 30-fold excess by molar ratio. By reacting with 2G6-D1, the amount of cAMP in GPR7-expressing cells recovered to 38% and 60%, respectively, compared to the case of FSK stimulation alone. The results are shown in FIG.
These results mean that 2G6-D1 suppresses cAMP synthesis inhibitory activity of rat NPW23 and rat NPW30.
Rat NPW23 was reacted with 2F1B2A, 5A2A, 5D6-F10, 5G2-F6, 6G1-H8 and 7B4-D2 NPW23 carboxyl terminal-recognizing monoclonal antibodies, and then the reaction solution was administered to a rat GPR7-expressing cell line. The administration of rat NPW23 alone reduced the amount of cAMP in rat GPR7-expressing cells to 7% compared to the case of FSK stimulation alone, but rat NPW23 had a 30-fold molar excess of 2F1B2A, 5A2A, 5D6-F10, 5G2- When reacted with F6, 6G1-H8 and 7B4-D2, the amount of cAMP in GPR7-expressing cells when reacted with 5A2A, 5G2-F6 and 7B4-D2 was 16% and 71% compared to those with FSK stimulation alone. And recovered to 73% respectively. The results are shown in FIG.
These results mean that 5A2A, 5G2-F6 and 7B4-D2 suppress the cAMP synthesis inhibitory activity of rat NPW23.
Rat NPW30 was reacted with 3A1A and 7F2-E8, which are NPW30 carboxyl terminal-recognizing monoclonal antibodies, and then the reaction solution was administered to a rat GPR7-expressing cell line. Administration of rat NPW30 alone reduced the amount of cAMP in rat GPR7-expressing cells to 50% compared to FSK stimulation alone, but by reacting rat NPW30 with a 150-fold excess of 3A1A and 7F2-E8 in a molar ratio The amount of cAMP in GPR7-expressing cells recovered to 75% and 72%, respectively, compared to the case of FSK stimulation alone. The results are shown in FIG.
These results indicate that 3A1A and 7F2-E8 suppress the cAMP synthesis inhibitory activity of rat NPW30.
実施例３
NPW23およびNPW30を定量する2抗体EIA系の設定
（１）NPWのアミノ末端を認識する抗体の酵素標識体の作製
NPWのアミノ末端を認識するモノクローナル抗体である2G6-D1の酵素標識を以下のようにして行った。2 mlのPBSに溶解した4.4 mgの2G6-D1 IgG溶液1リットルの0.1 Mリン酸バッファー（pH 6.7）に対して4℃で16時間透析した。透析したIgG溶液に50μlのN, N-ジメチルホルムアミド（DMF）に溶解した6.4 mMのN-(4-maleimidobutyryloxy)-succinimide（GMBS、同仁化学）を添加した後、この混合液を攪拌しながら室温で40分間静置した。この反応液をSephadex G-25（Amersham Biosciences）カラムに添加し、4℃で分子ふるいクロマトグラフィー（バッファー：0.1 Mリン酸バッファー（pH 6.7）、流速：0.5 ml/min）を行ってIgG画分を得た。これと同時に1.1 mlの0.1 M塩化ナトリウムを含む20 mMリン酸バッファー（pH 6.8）に溶解した7.3 mgのHRP溶液に60μlのDMFに溶解した45.5 mMのN-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate（SPDP、和光純薬）を添加した後、この混合液を攪拌しながら室温で40分間保温した。このHRPとSPDPの反応液に400μlの100 mM酢酸バッファー（pH 4.5）に溶解した5.48 mMのジチオスレイトール（DTT、和光純薬）を添加した後、この混合液を攪拌しながら室温で20分間静置した。この反応液をSephadex G-25 カラムに添加し、4℃で分子ふるいクロマトグラフィー（バッファー：0.2 mM EDTAを含む0.1 Mリン酸バッファー（pH 6.0）、流速：0.5 ml/min）を行ってHRP画分を得た。このHRP画分と先に示したIgG画分の混合液をCentriplus YM-10（MILLIPORE）で約2 mlに濃縮した後、この濃縮混合液を4℃で16時間保温した。この濃縮液をSephacryl S-300（Amersham Biosciences）カラムに添加し、4℃で分子ふるいクロマトグラフィー（バッファー：0.1 Mリン酸バッファー（pH 6.5）、流速：1.0 ml/min）を行なってHRPが結合したIgGを得た。このHRPが結合したIgGを酵素標識抗体(以下、HRP標識2G6-D1と記載する) として二抗体EIAに使用した。
（２）NPW23を測定する二抗体EIA系の設定
NPW23のカルボキシル末端領域と結合する6種類のモノクローナル抗体、2F1B2A、5A2A、5D6-F10、5G2-F6、6G1-H8または7B4-D2を50 mM炭酸緩衝液（pH 9.6）で10μg/mlに調製し、100μlの抗体溶液を96ウェルイムノプレート（NUNC）の各ウェルに添加した。このプレートを4℃で16時間静置した後、ウェル内の溶液を捨て、ブロックエースを1ウェル当たり200μl添加してこのプレートを使用するまで4℃で保存した。実施例１−（１０）に記載のEIA緩衝液により希釈した100μlの種々の濃度のNPW溶液をそれぞれのウェルに添加した後、このプレートを4℃で16時間静置した。プレートをPBSで３回洗浄した後、EIA緩衝液により固定した倍率（300〜1000倍）で希釈した100μlのHRP標識2G6-D1をそれぞれのウェルに添加してこのプレートを4℃で16時間静置した。プレートをPBSで4回洗浄した後、TMBマイクロウェルパーオキシダーゼ基質システム100μlを加えて室温で反応させた。反応を1 Mリン酸50μlを加えて停止させた後、450 nmにおける吸光度をプレートリーダーで測定した。それぞれの二抗体EIA系において添加したヒトNPW23（配列番号：４）、ラットNPW23（配列番号：６）およびマウスNPW23（配列番号：８（配列番号：６と同一））の各ペプチド量に依存して450 nmにおける吸光度の増加を示した。モノクローナル抗体、2F1B2A、5A2A、5D6-F10、5G2-F6、6G1-H8および7B4-D2を用いたときの結果を図２０、図２１、図２２、図２３、図２４および図２５にそれぞれ示す。
これらの二抗体EIA系を用いて最小量0.3fmolのNPW23を検出することができた。なお、これらの二抗体法を用いてブタNPW23（配列番号：１０）を測定することもできる。
Example 3
Setting up a 2-antibody EIA system for quantifying NPW23 and NPW30 (1) Preparation of an enzyme-labeled antibody that recognizes the amino terminus of NPW
Enzyme labeling of 2G6-D1, which is a monoclonal antibody that recognizes the amino terminus of NPW, was performed as follows. Dialysis was performed at 4 ° C. for 16 hours against 1 liter of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.7) of 4.4 mg of 2G6-D1 IgG solution dissolved in 2 ml of PBS. 6.4 mM N- (4-maleimidobutyryloxy) -succinimide (GMBS, Dojindo) dissolved in 50 μl of N, N-dimethylformamide (DMF) was added to the dialyzed IgG solution, and the mixture was stirred at room temperature. Left for 40 minutes. This reaction solution was added to a Sephadex G-25 (Amersham Biosciences) column and subjected to molecular sieve chromatography (buffer: 0.1 M phosphate buffer (pH 6.7), flow rate: 0.5 ml / min) at 4 ° C to obtain an IgG fraction. Got. At the same time, 45.5 mM N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate dissolved in 60 μl DMF in 7.3 mg HRP solution dissolved in 20 mM phosphate buffer (pH 6.8) containing 1.1 ml 0.1 M sodium chloride (SPDP, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and this mixed solution was kept warm at room temperature for 40 minutes while stirring. After adding 5.48 mM dithiothreitol (DTT, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolved in 400 μl of 100 mM acetate buffer (pH 4.5) to the reaction solution of HRP and SPDP, this mixture was stirred at room temperature for 20 minutes. Left to stand. This reaction solution was added to a Sephadex G-25 column, and subjected to molecular sieve chromatography (buffer: 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) containing 0.2 mM EDTA, flow rate: 0.5 ml / min) at 4 ° C. Got the minute. A mixture of this HRP fraction and the IgG fraction shown above was concentrated to about 2 ml with Centriplus YM-10 (MILLIPORE), and then this concentrated mixture was incubated at 4 ° C. for 16 hours. This concentrate is added to a Sephacryl S-300 (Amersham Biosciences) column and subjected to molecular sieve chromatography (buffer: 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5), flow rate: 1.0 ml / min) at 4 ° C to bind HRP. IgG was obtained. This IgG bound with HRP was used as an enzyme-labeled antibody (hereinafter referred to as HRP-labeled 2G6-D1) in the two-antibody EIA.
(2) Setting up a two-antibody EIA system to measure NPW23
Prepare 6 types of monoclonal antibodies, 2F1B2A, 5A2A, 5D6-F10, 5G2-F6, 6G1-H8 or 7B4-D2 that bind to the carboxy terminal region of NPW23 to 10 μg / ml with 50 mM carbonate buffer (pH 9.6). 100 μl of antibody solution was added to each well of a 96 well immunoplate (NUNC). After the plate was allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours, the solution in the well was discarded, and 200 μl of Block Ace was added per well, and the plate was stored at 4 ° C. until use. After adding 100 μl of various concentrations of NPW solution diluted with the EIA buffer described in Example 1- (10) to each well, the plate was allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours. After washing the plate 3 times with PBS, 100 μl of HRP-labeled 2G6-D1 diluted at a magnification (300 to 1000 times) fixed with EIA buffer was added to each well, and the plate was allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours. I put it. After washing the plate 4 times with PBS, 100 μl of TMB microwell peroxidase substrate system was added and allowed to react at room temperature. The reaction was stopped by adding 50 μl of 1 M phosphoric acid, and the absorbance at 450 nm was measured with a plate reader. Depends on the amount of each peptide of human NPW23 (SEQ ID NO: 4), rat NPW23 (SEQ ID NO: 6) and mouse NPW23 (SEQ ID NO: 8 (identical to SEQ ID NO: 6)) added in each two-antibody EIA system Showed an increase in absorbance at 450 nm. The results obtained using the monoclonal antibodies 2F1B2A, 5A2A, 5D6-F10, 5G2-F6, 6G1-H8 and 7B4-D2 are shown in FIGS. 20, 21, 22, 23, 24 and 25, respectively.
A minimum amount of 0.3 fmol NPW23 could be detected using these two antibody EIA systems. In addition, porcine NPW23 (SEQ ID NO: 10) can also be measured using these two antibody methods.
（３）NPW30を測定する二抗体EIA系の設定
NPW30のカルボキシル末端領域と結合する3種類のモノクローナル抗体、2A1A、3A1Aまたは7F2-E8を50 mM炭酸緩衝液（pH 9.6）で10μg/mlに調製し、100μlの抗体溶液を96ウェルイムノプレート（NUNC）の各ウェルに添加した。このプレートを4℃で16時間静置した後、ウェル内の溶液を捨て、ブロックエースを1ウェル当たり200μl添加してこのプレートを使用するまで4℃で保存した。実施例１−（１０）に記載のEIA緩衝液により希釈した100μlの種々の濃度のNPW溶液をそれぞれのウェルに添加した後、このプレートを4℃で16時間静置した。プレートをPBSで3回洗浄した後、EIA緩衝液により固定した倍率（300〜1000倍）で希釈した100μlのＨＲＰ標識2G6-D1をそれぞれのウェルに添加してこのプレートを4℃で16時間静置した。プレートをPBSで4回洗浄した後、TMBマイクロウェルパーオキシダーゼ基質システム100μlを加えて室温で反応させた。反応を1 Mリン酸50μlを加えて停止させた後、450 nmにおける吸光度をプレートリーダーで測定した。それぞれの二抗体EIA系において添加したヒトNPW30（配列番号：５）、ラットNPW30（配列番号：７）、マウスNPW30（配列番号：９）およびブタNPW30（配列番号：１１）の各ペプチド量に依存して450 nmにおける吸光度の増加を示した。モノクローナル抗体2A1A、3A1Aおよび7F2-E8を用いたときの結果を、図２６、図２７および図２８にそれぞれ示す。
これらの二抗体EIA系を用いて最小量1 fmolのNPW30を検出することができた。
(3) Setting up a two-antibody EIA system to measure NPW30
Prepare three monoclonal antibodies, 2A1A, 3A1A, or 7F2-E8, which bind to the carboxyl terminal region of NPW30, at 10 μg / ml with 50 mM carbonate buffer (pH 9.6), and add 100 μl of the antibody solution to a 96-well immunoplate (NUNC). ) Was added to each well. After the plate was allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours, the solution in the well was discarded, and 200 μl of Block Ace was added per well, and the plate was stored at 4 ° C. until use. After adding 100 μl of various concentrations of NPW solution diluted with the EIA buffer described in Example 1- (10) to each well, the plate was allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours. After washing the plate 3 times with PBS, 100 μl of HRP-labeled 2G6-D1 diluted at a magnification (300 to 1000 times) fixed with EIA buffer was added to each well, and the plate was allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours. I put it. After washing the plate 4 times with PBS, 100 μl of TMB microwell peroxidase substrate system was added and allowed to react at room temperature. The reaction was stopped by adding 50 μl of 1 M phosphoric acid, and the absorbance at 450 nm was measured with a plate reader. Depends on the amount of each peptide of human NPW30 (SEQ ID NO: 5), rat NPW30 (SEQ ID NO: 7), mouse NPW30 (SEQ ID NO: 9) and porcine NPW30 (SEQ ID NO: 11) added in each two-antibody EIA system Showed an increase in absorbance at 450 nm. The results when using monoclonal antibodies 2A1A, 3A1A and 7F2-E8 are shown in FIGS. 26, 27 and 28, respectively.
Using these two antibody EIA systems, a minimum amount of 1 fmol of NPW30 could be detected.
Claims (21)
Hybridoma cells of claim 20, wherein culturing in vivo or in vitro, the production of antibodies according to claim 5 or 6, wherein the collecting the monoclonal antibody of claim 5 or 6, wherein from the body fluids or culture Law.
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