JP4501541B2 - Process for producing optically active cyclopropanecarboxylic acid - Google Patents
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Description
本発明は、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸の取得方法等に関する。 The present invention relates to a method for obtaining (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid and the like.
式 化１ Formula 1
で示される（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸は、優れた殺虫効力を有するいわゆる合成ピレスロイドと総称されるエステルの酸成分の中間体となる。
(1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid represented by the formula (1R) is an intermediate between the acid components of esters collectively called so-called synthetic pyrethroids having excellent insecticidal efficacy. Become a body.
当該シクロプロパンカルボン酸にはそのＣ1位及びＣ3位に不斉炭素が存在し、４種の異性体が存在する。このような各異性体により酸成分を構成するピレスロイドの殺虫効力は対象害虫、製剤形の種類等によって異なることから、目的とする上記のシクロプロパンカルボン酸の特定の異性体を工業的に有利に製造する方法の開発が切望されている。 The cyclopropanecarboxylic acid has asymmetric carbons at the C 1 and C 3 positions, and there are four isomers. Since the insecticidal efficacy of pyrethroids that constitute the acid component by such isomers varies depending on the target pest, the type of formulation, etc., the specific isomer of the above-mentioned cyclopropanecarboxylic acid is industrially advantageous. Development of a manufacturing method is eagerly desired.
本発明者らは、このような状況の下、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸の工業的に有利な製造法について鋭意検討を重ねた結果、アルスロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物由来のエステラ−ゼが、下記の一般式 化２で示される２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステルに作用してこれを不斉加水分解しうることを見出し、本発明に至った。 Under these circumstances, the present inventors have intensively studied an industrially advantageous production method of (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid. As a result, an esterase derived from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter was converted to 2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid represented by the following general formula 2 It was found that it can act on an ester to hydrolyze it, leading to the present invention.
即ち、本発明は、
１．一般式 化２
That is, the present invention
1. General formula 2
で示される２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステルに、当該エステルを不斉水解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有し、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素又は当該酵素を産生する微生物（以下、総じて本生物的触媒と記すこともある。）を作用させる工程、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとを分割する工程、分割された（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸を回収する工程、を有することを特徴とする（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸の取得方法（以下、本発明取得方法と記すこともある。）
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列によりコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされるアミノ酸配列；
２．前記アミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素又は当該酵素を産生する微生物が、前記能力を人為的に付与されてなる組み換え体微生物又はその死菌化細胞であることを特徴とする前項１記載の取得方法；
３．組み換え体微生物が、２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステルを不斉水解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有し、前記アミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するプラスミドが導入されてなる組み換え体微生物であることを特徴とする前項２記載の取得方法；
４．組み換え体微生物が大腸菌であることを特徴とする前項２又は３記載の取得方法；
５．２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステルを不斉水解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有する酵素が、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素であることを特徴とする前項１記載の取得方法；
６．２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステルを不斉水解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有する酵素が、配列番号２で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列であることを特徴とする前項１記載の取得方法；
７．一般式化２で示される２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステルを不斉水解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割するための触媒としての、当該２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステルを不斉水解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有し、前記アミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素又は当該酵素を産生する微生物の使用；
８．一般式化２で示される２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステルを不斉水解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割するための触媒としての、当該２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステルを不斉水解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有し、下記の塩基配列群から選ばれる塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するプラスミドが導入されてなる組み換え体微生物又はその死菌化細胞の使用
＜塩基配列群＞
（ｃ’）配列番号２で示される塩基配列
（ｄ’）配列番号２で示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列；
等を提供するものである。
To the 2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester represented by the formula (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- ( (Benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid and its diastereomeric ester , an enzyme having an amino acid sequence selected from the following amino acid sequence group or a microorganism producing the enzyme ( . the following, sometimes referred to as the generally present biological catalyst) step, the action of (1R) - trans -2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) its diastereomer cyclopropane-1-carboxylic acid The step of cleaving the ester with, (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane Recovering the 1-carboxylic acid, and having a (1R) - trans -2,2-dimethyl-3-acquisition method (benzyloxymethyl) cyclopentane-1-carboxylic acid (hereinafter, the present (It may be described as an invention acquisition method.)
<Amino acid sequence group>
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
(B) an amino acid sequence of an enzyme having an amino acid sequence in which one or more amino acid sequences are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
(C) an amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2
(D) an amino acid sequence encoded by a base sequence of a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 ;
2. The preceding item, wherein the enzyme having an amino acid sequence selected from the group of amino acid sequences or the microorganism producing the enzyme is a recombinant microorganism artificially imparted with the ability or a killed cell thereof. The acquisition method according to 1,
3. The recombinant microorganism asymmetrically hydrolyzes 2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester to give (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxy possess the ability to divide into methyl) cyclopropane-1-carboxylic acid and the ester of its diastereomer, a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of the enzyme having the amino acid sequence selected from among the group of amino acid sequences poly The acquisition method according to item 2 above, which is a recombinant microorganism into which a nucleotide-containing plasmid has been introduced;
4). The method according to item 2 or 3, wherein the recombinant microorganism is Escherichia coli;
5 . 2,1-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester is asymmetrically hydrolyzed to give (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane- The obtaining method according to item 1, wherein the enzyme having the ability to resolve 1-carboxylic acid and diastereomeric ester thereof is an enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
6 . 2,1-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester is asymmetrically hydrolyzed to give (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane- The obtaining method according to item 1, wherein the enzyme having the ability to resolve 1-carboxylic acid and diastereomeric ester thereof is an amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
7 . The 2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester represented by the general formula 2 is asymmetrically hydrolyzed to give (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- ( 2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester as a catalyst for resolution into benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid and its diastereomeric ester Having the ability to cleave asymmetrically to (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid and its diastereomeric ester , Use of an enzyme having an amino acid sequence selected from the group of amino acid sequences or a microorganism producing the enzyme ;
8 . The 2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester represented by the general formula 2 is asymmetrically hydrolyzed to give (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- ( 2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester as a catalyst for resolution into benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid and its diastereomeric ester Has the ability to resolve to (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid and its diastereomeric ester , A recombinant microorganism into which a plasmid containing a polynucleotide consisting of a base sequence selected from the group of base sequences is introduced or a killed cell thereof Use
<Base sequence group>
(C ′) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2
(D ′) a base sequence of a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 ;
Etc. are provided.
本発明により、優れた殺虫効力を有するいわゆる合成ピレスロイドと総称されるエステルの酸成分の中間体として有用な（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸を効率的又は簡便に取得することが可能となる。 According to the present invention, (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1 useful as an intermediate of an acid component of an ester collectively called a so-called synthetic pyrethroid having excellent insecticidal efficacy -Carboxylic acid can be obtained efficiently or simply.
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明製造方法で用いられる酵素は、一般式 化２で示される２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステル（以下、本エステルと記すことがある。）を不斉分解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸（以下、本カルボン酸と記すこともある。）とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有する酵素である（以下、本酵素と記すこともある。）。このような酵素は、本酵素を産生する微生物等から通常の生化学的な手法や遺伝子工学的な手法等を利用して調製することができる。例えば、本酵素を産生する微生物が形質転換体である場合には、当該形質転換体としては、本エステルを不斉分解して、本カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含有するプラスミドが少なくとも導入されてなる形質転換体（以下、本形質転換体と記すこともある。）等をあげることができる。また、本酵素を産生する微生物が非形質転換体（即ち、前記能力が人為的に付与されていないにも係わらず、予め当該能力を有する微生物）である場合には、当該非形質転換体としては、後述の実施例のように、市販の微生物又は土壌等から前記能力を指標にしてスクリーニングすることにより単離された微生物等があげられる。このような微生物の例としては、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物等をあげることができる。
このような微生物の具体的な例としては、例えば、アルスロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＳＣ−６−９８−２８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６５８；特開平４−２３４９９１号公報に記載されるＦＥＲＭ Ｐ−１１８５１号に基づき国際寄託へ移管された微生物）等を挙げることができる。また当該微生物が産生する本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子が導入されてなる形質転換体（例えば、特開平５−５６７８７号公報参照）も挙げられる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The enzyme used in the production method of the present invention is 2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester represented by the general formula 2 (hereinafter sometimes referred to as the present ester). To (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid (hereinafter sometimes referred to as the present carboxylic acid) and its diastereoisomers. It is an enzyme that has the ability to split into a mer ester (hereinafter also referred to as the present enzyme). Such an enzyme can be prepared from a microorganism or the like that produces the enzyme using a normal biochemical technique or genetic engineering technique. For example, when the microorganism that produces the enzyme is a transformant, the transformant has the ability to asymmetrically decompose the ester and split it into the carboxylic acid and its diastereomeric ester. And a transformant into which at least a plasmid containing a DNA comprising a base sequence encoding the amino acid sequence of the enzyme is introduced (hereinafter sometimes referred to as the present transformant). In addition, when the microorganism that produces this enzyme is a non-transformant (that is, a microorganism having the ability in advance even though the ability has not been artificially imparted), the non-transformant Examples include microorganisms isolated by screening from commercially available microorganisms or soil using the above ability as an index, as in Examples described later. Examples of such microorganisms include microorganisms belonging to the genus Arthrobacter.
Specific examples of such microorganisms include, for example, Arthrobacter SC-6-98-28 strain (FERM BP-3658; FERM P-11181 described in JP-A-4-234911). And microorganisms transferred to international deposits). In addition, a transformant into which a gene having a base sequence encoding the amino acid sequence of the present enzyme produced by the microorganism is introduced (see, for example, JP-A-5-56787) can be mentioned.
本酵素を産生する微生物が非形質転換体（即ち、前記能力が人為的に付与されていないにも係わらず、予め当該能力を有する微生物）である場合において、本酵素を当該微生物に産生させるには、通常、滅菌された液体培地（ｐＨ：約６〜８の範囲）に当該微生物を接種し、約２０〜４０℃で約１〜８日間、好気条件下で培養するとよい。勿論、培養中に培地を加えるような流加培養法を用いてもよい。尚、詳細な培養方法は、後述する「本形質転換体の培養」に関する説明において記載された方法に準じた方法であればよい。 When the microorganism producing this enzyme is a non-transformant (that is, a microorganism having the ability in advance even though the ability has not been artificially imparted), the microorganism can produce the enzyme. Is usually inoculated with the microorganism in a sterilized liquid medium (pH: in the range of about 6-8) and cultured at about 20-40 ° C. for about 1-8 days under aerobic conditions. Of course, a fed-batch culture method in which a medium is added during the culture may be used. In addition, the detailed culture method should just be the method according to the method described in the description regarding "the culture | cultivation of this transformant" mentioned later.
「一般式化２で示される２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステル（即ち、本エステル）を不斉水解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸（即ち、本カルボン酸）とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力」の具体的な例としては、例えば、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有するエステラーゼが持つ能力をあげることができる。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、かつ、（一般式化２で示される）２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステル（即ち、本エステル）を不斉水解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列によりコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、（一般式化２で示される）２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステル（即ち、本エステル）を不斉水解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有する酵素のアミノ酸配列
“The 2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester represented by the general formula 2 (ie, the present ester) is asymmetrically hydrolyzed to give (1R) -trans-2, Specific examples of “the ability to resolve 2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid (ie, the present carboxylic acid) and its diastereomeric ester” include, for example: The ability of an esterase having an amino acid sequence selected from the amino acid sequence group can be raised.
<Amino acid sequence group>
(A) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (b) an amino acid sequence in which one or more amino acid sequences are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (general formula 2, 2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester (ie, this ester) is asymmetrically hydrolyzed to give (1R) -trans-2,2-dimethyl. An amino acid sequence of an enzyme having the ability to resolve 3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid and its diastereomeric ester (c) amino acid sequence encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 ( d) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a hive under stringent conditions 2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylate (shown by the general formula 2) having an amino acid sequence encoded by the base sequence of the polynucleotide to be soybean That is, the ability of the present ester) to be asymmetrically hydrolyzed to resolve (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid and its diastereomeric ester Amino acid sequence of an enzyme having
本形質転換体を作製する際に用いられる、一般式 化２で示される−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステルを不斉水解して、本カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有する酵素（即ち、本酵素）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、本酵素遺伝子と記すこともある。）は、（１）天然に存在する遺伝子の中からクローニングされたものであってもよいし、（２）天然に存在する遺伝子であっても、このクローニングされた遺伝子の塩基配列において、その一部の塩基の欠失、置換又は付加が人為的に導入されてなる遺伝子（即ち、天然に存在する遺伝子を変異処理（部分変異導入法、突然変異処理等）を行ったものであってもよいし、（３）人為的に合成されたものであってもよい。 Asymmetric hydrolysis of -dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester represented by the general formula 2, which is used in preparing this transformant, yields the carboxylic acid and its dia A gene having a base sequence encoding the amino acid sequence of an enzyme (that is, the present enzyme) having the ability to split into a stereomeric ester (hereinafter also referred to as the present enzyme gene) is (1) naturally present. (2) Even if it is a naturally occurring gene, deletion, substitution or substitution of a part of the bases in the base sequence of the cloned gene A gene obtained by artificially introducing an addition (that is, a naturally occurring gene subjected to mutation treatment (partial mutation introduction method, mutation treatment, etc.), or (3) It may be the one that is for synthesized.
ここで、前記（ｂ）にある「アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」や前記（ｄ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列」には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素が細胞内で受けるプロセシング、該酵素が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
前記（ｂ）にある「（アミノ酸が）欠失、置換若しくは付加（された）」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には1若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、本エステルを不斉水解して、本カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を見出すことのできる範囲であればよい。
また前記欠失、置換若しくは付加のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、(1)グリシン、アラニン；(2)バリン、イソロイシン、ロイシン；(3)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；(4)セリン、スレオニン；(5)リジン、アルギニン；(6)フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
Here, “the amino acid sequence in which an amino acid is deleted, substituted or added” in (b) above or “the base of DNA having complementarity to DNA hybridizing under stringent conditions” in (d) above The “amino acid sequence encoded by the sequence” includes, for example, natural processing due to the processing that the enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 undergoes in the cell, species differences of organisms from which the enzyme is derived, individual differences, differences between tissues, and the like. It includes mutations that occur and artificial amino acid mutations.
As a technique for artificially performing the “(amino acid) deletion, substitution, or addition (done)” in the above (b) (hereinafter sometimes referred to as amino acid modification as a whole), for example, a sequence is used. Examples include a method in which a conventional site-directed mutagenesis is performed on a DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence shown by No. 1, and then this DNA is expressed by a conventional method. Here, as a site-specific mutagenesis method, for example, a method utilizing amber mutation (gapped duplex method, Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)), a PCR method using a mutagenesis primer Etc.
The number of amino acids modified as described above is at least one residue, specifically one or several, or more. The number of such modifications may be within a range in which the present ester can be asymmetrically hydrolyzed to find the ability to resolve the present carboxylic acid and its diastereomeric ester.
Among the deletions, substitutions or additions, modifications relating to amino acid substitution are particularly preferable. The substitution is more preferably substitution with an amino acid having similar properties such as hydrophobicity, charge, pK, and structural features. Examples of such substitution include (1) glycine, alanine; (2) valine, isoleucine, leucine; (3) aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine; (4) serine, threonine; (5) lysine, arginine. And (6) substitution within the group of phenylalanine and tyrosine.
本発明において「（アミノ酸が）欠失、置換若しくは付加（された）」には、例えば、２つの蛋白質間のアミノ酸配列に関する高い配列同一性（具体的には、８０％以上の配列同一性、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性）が存在している必要がある。また「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」には２つのＤＮＡ間の塩基配列に関する配列同一性（具体的には、８０％以上の配列同一性、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性）が存在している必要がある。
ここで「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
前記（ｄ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）に記載される方法や、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９年、農村文化社発行）に記載されているサザンハイブリダイゼーション法等の通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（９００ｍＭ ＮａＣｌ、９０ｍＭ クエン酸三ナトリウムを含む溶液。尚ここでは、ＮａＣｌ175.3g、クエン酸三ナトリウム88.2gを含む溶液を水８００ｍｌで溶解し、10N NaClでpHを調製した後、全量を1000 mlとした溶液を２０×ＳＳＣとする。）中で６５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×ＳＳＣで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．１×ＳＳＣで６５℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
In the present invention, “(amino acid) deletion, substitution, or addition (done)” includes, for example, high sequence identity (specifically, 80% or more sequence identity) between two proteins. Preferably 90% or more, more preferably 95% or more sequence identity) must be present. In addition, “hybridizes under stringent conditions” means sequence identity with respect to the base sequence between two DNAs (specifically, sequence identity of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95%). The above sequence identity) must exist.
As used herein, “sequence identity” refers to sequence identity and homology between two DNAs or two proteins. The “sequence identity” is determined by comparing two sequences that are optimally aligned over the region of the sequence to be compared. Here, the DNA or protein to be compared may have an addition or a deletion (for example, a gap) in the optimal alignment of the two sequences. Such sequence identity can be calculated, for example, by creating an alignment using the ClustalW algorithm (Nucleic Acid Res., 22 (22): 4673-4680 (1994)) using Vector NTI. The sequence identity is measured using sequence analysis software, specifically, an analysis tool provided by Vector NTI, GENETYX-MAC, or a public database, for example, the homepage address http It is generally available at: //www.ddbj.nig.ac.jp.
Regarding “hybridize under stringent conditions” in (d) above, the hybridization used here is, for example, by Sambrook J., Frisch EF, Maniatis T., Molecular Cloning Second Edition (Molecular Cloning 2nd edition), described in Cold Spring Harbor Laboratory press (Cold Spring Harbor Laboratory press) and “Cloning and Sequence” (supervised by Watanabe, edited by Masahiro Sugiura, 1989, published by Rural Bunkasha) It can be performed according to a conventional method such as Southern hybridization. “Stringent conditions” means, for example, 6 × SSC (a solution containing 900 mM NaCl, 90 mM trisodium citrate. Here, a solution containing 175.3 g NaCl and 88.2 g trisodium citrate is added with 800 ml of water. After dissolving and adjusting the pH with 10N NaCl, a solution with a total volume of 1000 ml is made 20 × SSC.) Is hybridized at 65 ° C., and then washed with 2 × SSC at 50 ° C. (Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6). The salt concentration in the washing step can be selected from, for example, conditions of 2 × SSC at 50 ° C. (low stringency conditions) to 0.1 × SSC at 65 ° C. (high stringency conditions). The temperature in the washing step can be selected, for example, from room temperature (low stringency conditions) to 65 ° C. (high stringency conditions). It is also possible to change both the salt concentration and the temperature.
本酵素遺伝子は、例えば、下記のような調製方法に準じて調製すればよい。
アルスロバクター属に属する微生物等から通常の遺伝子工学的手法に準じて染色体ＤＮＡを調製し、調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して本酵素遺伝子を調製する。
ここでアルスロバクター属に属する微生物由来の染色体ＤＮＡを鋳型として、かつ配列番号３に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いてＰＣＲを行う場合には、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡを増幅して本酵素遺伝子を調製することになる。
当該ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２０μＭ、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々１５ｐｍｏｌ、Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．３Ｕ及び鋳型となるｃＤＮＡライブラリーを混合した反応液を９７℃（２分間）に加熱した後、９７℃(０．２５分間)−５０℃−(０．５分間)−７２℃（１．５分間）のサイクルを１０回、次いで９７℃(０．２５分間)−５５℃(０．５分間)−７２℃(２．５分間)のサイクルを２０回行い、さらに７２℃で７分間保持する条件が挙げられる。
尚、当該ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等を付加していてもよい。
上記のようにして増幅されたＤＮＡを、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして組換ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、ｐCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、ｐKK223-3（Pharmacia社製）等が挙げられる。このようにしてベクターに組み込んだ形態で本酵素遺伝子を調製すれば、後の遺伝子工学的手法における使用において便利である。
This enzyme gene may be prepared, for example, according to the following preparation method.
By preparing a chromosomal DNA from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter according to a normal genetic engineering technique and performing PCR using the prepared chromosomal DNA as a template and using appropriate primers, SEQ ID NO: 1 DNA consisting of a base sequence encoding the amino acid sequence shown, DNA consisting of a base sequence encoding an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 The enzyme gene is prepared by amplifying DNA having the base sequence represented by
PCR using chromosomal DNA derived from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter as a template and using the oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 as primers When performing the above, the enzyme gene is prepared by amplifying a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
The PCR conditions include, for example, 20 μM each of 4 types of dNTP, 15 pmol of each of 2 types of oligonucleotide primers, 1.3 U of Taq polymerase, and a reaction solution mixed with a cDNA library as a template at 97 ° C. (2 minutes) ), Followed by 10 cycles of 97 ° C. (0.25 minutes) −50 ° C .− (0.5 minutes) −72 ° C. (1.5 minutes), then 97 ° C. (0.25 minutes) −55 A cycle of 20 ° C. (0.5 minutes) -72 ° C. (2.5 minutes) is carried out 20 times, and the conditions are further maintained at 72 ° C. for 7 minutes.
A restriction enzyme recognition sequence or the like may be added to the 5 ′ end side of the primer used in the PCR.
The amplified DNA as described above, Sambrook J., Frisch EF, Maniatis T. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 nd edition " (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X and the like, and can be cloned into a vector to obtain a recombinant vector. Specific examples of the vector used include pUC119 (Takara Shuzo), pTV118N (Takara Shuzo), pBluescriptII (Toyobo), pCR2.1-TOPO (Invitrogen), pTrc99A (Pharmacia) ), PKK223-3 (manufactured by Pharmacia) and the like. If the enzyme gene is prepared in such a manner that it is incorporated into a vector, it is convenient for use in later genetic engineering techniques.
本形質転換体を調製する方法としては、例えば、本酵素遺伝子及び宿主細胞で機能可能なプロモーターが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡのような、本酵素遺伝子が宿主細胞中で発現できるような組換プラスミド（例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域を本酵素遺伝子に連結して組換プラスミドを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換プラスミド）を作製し、これを宿主細胞に導入することにより作製する方法等があげられる。さらに、本酵素遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入する方法も利用することができる。
上記の組換プラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーを持つ発現ベクターに、本酵素をコードする遺伝子が機能可能な形で導入されたものを好ましく挙げることができる。尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。
ここで、「機能可能な形で」とは、上記の組換プラスミドを宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、本酵素遺伝子が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、又は、tacプロモーターもしくはtrcプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等をあげることができる。またコリネバクテリウム・シュードジフテリティカム、ペニシリウム・シトリナム、バシラス・メガテリウムにおいて本酵素遺伝子の発現を制御しているプロモーターを利用してもよい。
また発現ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、当該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして容易に選択することができる。
さらなる高発現を導くことが必要な場合には、本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Guarente L.ら（Cell 20, p543）や谷口ら（Genetics of Industrial Microorganisms, p202, 講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。
宿主細胞としては、原核生物（例えば、Escherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、Staphylococcus属、Streptomyces属）もしくは真核生物（例えば、Saccharomyces属、Kluyveromyces属、Aspergillus属）である微生物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等を挙げることができる。例えば、本形質転換体の大量調製が容易になるという観点では、大腸菌等を好ましく挙げることができる。
本酵素が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載される塩化カルシウム法や、「Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレーション法等をあげることができる。
宿主細胞において本酵素遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドが導入された形質転換体を選抜するには、前記の如く、例えば、ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
プラスミドが導入された宿主細胞（即ち、形質転換体）が本酵素遺伝子を保有していることは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
As a method for preparing the transformant, for example, the enzyme gene such as DNA in which the enzyme gene and a promoter capable of functioning in the host cell are operably connected can be expressed in the host cell. Recombination plasmids (eg, promoters, terminators, etc.) that are linked to the enzyme gene to construct a recombination plasmid, or to be expressed as an operon containing multiple cistrons such as the lactose operon. And a method of preparing the plasmid by introducing it into a host cell. Furthermore, a method of introducing this enzyme gene into the chromosome of a host cell can also be used.
The above recombinant plasmid contains, for example, genetic information that can be replicated in the host cell, can be propagated autonomously, can be easily isolated and purified from the host cell, and functions in the host cell. Preferable examples include those in which the gene encoding the present enzyme is introduced into a functional form into an expression vector having a detectable promoter and a detectable marker. Various types of expression vectors are commercially available.
Here, “in a functional form” means that the enzyme gene is expressed under the control of a promoter when the host cell is transformed by introducing the recombinant plasmid described above. It means being in a state linked to a promoter. Examples of the promoter include an E. coli lactose operon promoter, an Escherichia coli tryptophan operon promoter, a synthetic promoter capable of functioning in E. coli, such as a tac promoter or a trc promoter, and the like. In addition, a promoter that controls the expression of this enzyme gene in Corynebacterium pseudodiphtheritum, Penicillium citrinum, and Bacillus megaterium may be used.
In addition, when a vector containing a selection marker gene (for example, a gene for imparting antibiotic resistance such as a kanamycin resistance gene or a neomycin resistance gene) is used as an expression vector, the transformant into which the vector has been introduced is used as the selection marker gene. It is possible to easily select a phenotype or the like as an index.
When it is necessary to induce higher expression, a ribosome binding region may be linked upstream of a gene having a base sequence encoding the amino acid sequence of this enzyme. Examples of the ribosome binding region used include those described in reports by Guarente L. et al. (Cell 20, p543) and Taniguchi et al. (Genetics of Industrial Microorganisms, p202, Kodansha).
Host cells include microbial cells, insect cells or mammals that are prokaryotes (eg, Escherichia, Bacillus, Corynebacterium, Staphylococcus, Streptomyces) or eukaryotes (eg, Saccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus). An animal cell etc. can be mentioned. For example, Escherichia coli and the like can be preferably mentioned from the viewpoint that mass preparation of the present transformant becomes easy.
As a method of the present enzyme introduced plasmid that allows expression in the host cell into the host cell may be any ordinary introduction method used depending on the host cell used, for example, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 nd edition "(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press," Current Protocols in Molecular Biology "(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X, etc. Electroporation: Gene Pulser / E. Coli Pulser System ”Bio-Rad Laboratories, (1993), etc.
In order to select a transformant introduced with a plasmid that allows the enzyme gene to be expressed in the host cell in the host cell, for example, as described above, selection is performed using the phenotype of the selection marker gene contained in the vector as an index. do it.
Host cells plasmids were introduced (i.e., transformants) that owns the enzyme gene, for example, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 nd edition " (1989), in Cold Spring Harbor Laboratory Press, etc. It can be confirmed by carrying out confirmation of restriction enzyme sites, analysis of base sequences, Southern hybridization, Western hybridization and the like according to the usual methods described.
本形質転換体の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養、タンク培養等の液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。
培養温度は、本形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１０〜５０℃、好ましくは約２０〜４０℃である。
培地のｐＨは約６〜８の範囲が好ましい。
培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
本形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Corn Steep Liquor）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
さらに、tacプロモーター、trcプロモーター及びlacプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと、本酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子とが機能可能な形で接続されてなるＤＮＡが導入されてなる形質転換体の場合には、本酵素の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、isopropyl thio-β-D-galactoside（IPTG）を培地中に少量加えることもできる。
The transformant can be cultured by a conventional method used for culturing microorganisms, insect cells or mammalian cells. For example, in the case of Escherichia coli, culturing is performed in a medium appropriately containing an appropriate carbon source, nitrogen source, and micronutrients such as vitamins. The culture method may be any of solid culture, test tube shake culture, reciprocating shake culture, jar fermenter culture, liquid culture such as tank culture, and preferably aeration and agitation culture method. A liquid culture can be mentioned.
The culture temperature can be appropriately changed within a range in which the present transformant can grow, but is usually about 10 to 50 ° C, preferably about 20 to 40 ° C.
The pH of the medium is preferably in the range of about 6-8.
The culture time varies depending on the culture conditions, but is usually preferably about 1 day to about 5 days.
As a medium for culturing the transformant, for example, various media appropriately containing a carbon source and a nitrogen source, organic salts, inorganic salts and the like that are usually used for culturing host cells such as microorganisms can be used. .
Examples of the carbon source include sugars such as glucose, dextrin and sucrose, sugar alcohols such as glycerol, organic acids such as fumaric acid, citric acid and pyruvic acid, animal oils, vegetable oils and molasses. The amount of these carbon sources added to the medium is usually about 0.1 to 30% (w / v) with respect to the culture solution.
Nitrogen sources include, for example, natural organic nitrogen sources such as meat extract, peptone, yeast extract, malt extract, soy flour, Corn Steep Liquor, cottonseed flour, dry yeast, casamino acid, and amino acids And ammonium salts of inorganic acids such as sodium nitrate, ammonium salts of inorganic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate and ammonium phosphate, ammonium salts of organic acids such as ammonium fumarate and ammonium citrate, and urea. Of these, ammonium salts of organic acids, natural organic nitrogen sources, amino acids and the like can be used as carbon sources in many cases. The amount of these nitrogen sources added to the medium is usually about 0.1 to 30% (w / v) with respect to the culture solution.
Examples of organic salts and inorganic salts include chlorides such as potassium, sodium, magnesium, iron, manganese, cobalt, and zinc, sulfates, acetates, carbonates, and phosphates. Specifically, for example, sodium chloride, potassium chloride, magnesium sulfate, ferrous sulfate, manganese sulfate, cobalt chloride, zinc sulfate, copper sulfate, sodium acetate, calcium carbonate, monopotassium hydrogen phosphate and dipotassium hydrogen phosphate Is mentioned. The amount of these organic salts and / or inorganic salts added to the medium is usually about 0.0001 to 5% (w / v) with respect to the culture solution.
In addition, DNA is introduced in which allolactose-inducible promoters such as tac promoter, trc promoter, and lac promoter are functionally connected to a gene having a base sequence encoding the amino acid sequence of this enzyme. In the case of the thus obtained transformant, for example, isopropyl thio-β-D-galactoside (IPTG) can be added to the medium in a small amount as an inducer for inducing production of the enzyme.
本形質転換体の取得は、例えば、前記の培養により得られた培養物を遠心分離等により形質転換体を沈殿物として回収すればよい。必要に応じて、回収前に当該形質転換体を、例えば、１００ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ６．５）等の緩衝液等を用いて洗浄してもよい。 The transformant can be obtained, for example, by collecting the transformant as a precipitate by centrifuging the culture obtained by the above culture. As needed, you may wash | clean the said transformant before collection | recovery using buffer solutions, such as a 100 mM phosphate 1 potassium-phosphate 2 potassium buffer (pH 6.5) etc., for example.
本酵素を前記の培養により得られた培養物から精製することができる。その方法としては、通常一般の酵素の精製において使用される方法を適用することができ、具体的には例えば、次のような方法を挙げることができる。
まず、微生物の培養物から遠心分離等により菌体を集めた後、これを超音波処理、ガラスビーズ処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕方法又はリゾチーム等の菌体溶菌酵素処理等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルターろ過等により不溶物を除去して無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クラマトグラフィー、陰イオン交換クラマトグラフィー、疎水クラマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって本酵素を精製することができる。例えば、カルボキシルメチル（ＣＭ）基、ＤＥＡＥ基、フェニル基、またはブチル基等が導入されたセルロース、デキストラン又はアガロース等の樹脂担体が挙げられる。市販の担体充填済みカラムを用いることができ、例えば、Hiload 16/10 Q Sepharose HP、Phenyl-Sepahrose HP（商品名、いずれもアマシャム ファルマシア バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
This enzyme can be purified from the culture obtained by the above culture. As the method, a method generally used in purification of a general enzyme can be applied, and specific examples include the following methods.
First, after collecting bacterial cells from a culture of microorganisms by centrifugation or the like, this is subjected to a physical disruption method such as ultrasonic treatment, glass bead treatment, dynomill treatment, French press treatment, or bacterial lysing enzyme treatment such as lysozyme, etc. Crush. Cell-free extract is prepared by removing insoluble matter from the obtained disrupted solution by centrifugation, membrane filter filtration, etc., and this is prepared by cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel chromatography, etc. This enzyme can be purified by fractionation using the separation and purification method as appropriate. For example, a resin carrier such as cellulose, dextran, or agarose into which a carboxymethyl (CM) group, a DEAE group, a phenyl group, or a butyl group is introduced. Commercially available carrier-filled columns can be used, for example, Hiload 16/10 Q Sepharose HP, Phenyl-Sepahrose HP (trade names, both manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), TSK-gel G3000SW (trade names, manufactured by Tosoh Corporation) ) And the like.
本発明製造方法では、本エステルを不斉水解して、本カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割するための触媒として、当該２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステルを不斉水解して、本カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有する酵素又は当該酵素を産生する微生物、あるいはそれらの処理物が使用される。
本エステルに、当該エステルを不斉水解して、本カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有する酵素を産生する微生物の、本発明取得方法の不斉水解反応に用いる形態には、例えば、（１）培養液をそのまま用いる形態、（２）培養液の遠心分離等により菌体を集め、当該菌体を緩衝液若しくは水で洗浄することにより得られた湿菌体を用いる形態、等の培養により得られた微生物の菌体をその用いる形態が含まれる。
本エステルに、当該エステルを不斉水解して、本カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有する酵素又は当該酵素を産生する微生物の処理物の、本発明取得方法の不斉水解反応に用いる形態には、例えば、培養液の遠心分離等により菌体を集め、当該菌体を緩衝液若しくは水で洗浄した湿菌体を、（１）有機溶媒（アセトン、エタノール等）処理することにより得られたものを用いる形態や（２）凍結乾燥処理することにより得られたものを用いる形態や（３）アルカリ処理することにより得られたものを用いる形態や（４）菌体を物理的に又は酵素的に破砕することにより得られたものを用いる形態、さらには、これらのものを公知の方法により固定化処理することにより得られたものを用いる形態も含まれる。
In the production method of the present invention, the 2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane is used as a catalyst for the asymmetric hydrolysis of the ester to resolve the carboxylic acid and its diastereomeric ester. An enzyme having the ability to asymmetrically hydrolyze the -1-carboxylic acid ester to resolve the carboxylic acid and its diastereomeric ester, a microorganism that produces the enzyme, or a processed product thereof is used.
In the form used for the asymmetric hydrolysis reaction of the method for obtaining the present invention, a microorganism that produces an enzyme having the ability to asymmetrically hydrolyze the ester to the present carboxylic acid and to split it into the ester of the diastereomer thereof. For example, (1) a form in which the culture solution is used as it is, (2) wet cells obtained by collecting cells by centrifugation of the culture solution and washing the cells with a buffer or water. The form which uses the microbial cell of the microorganisms obtained by culture | cultivation of a form etc. is contained.
Asymmetry of the method for obtaining the present invention of an enzyme having the ability to asymmetrically hydrolyze the ester to the ester and splitting the carboxylic acid and its diastereomeric ester or a processed product of a microorganism producing the enzyme The form used for the hydrolysis reaction is, for example, collecting bacterial cells by centrifuging the culture solution and washing the bacterial cells with a buffer or water, and treating the wet cells with (1) organic solvent (acetone, ethanol, etc.) Or (2) a form using a product obtained by lyophilization treatment, (3) a form using a product obtained by alkali treatment, or (4) a microbial cell. The form using what was obtained by crushing physically or enzymatically, and the form using what was obtained by immobilizing these things by a publicly known method are also contained.
本エステルに、当該エステルを不斉水解して、本カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有する酵素若しくは当該酵素を産生する微生物、又はそれらの処理物のうち、本エステルに、当該エステルを不斉水解して、本カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を人為的に付与されてなる形質転換体又はその死菌化細胞が好ましく使用される。 Among the esters, among the enzymes having the ability to asymmetrically hydrolyze the esters into the carboxylic acids and their diastereomeric esters, microorganisms that produce the enzymes, or processed products thereof, A transformant obtained by artificially imparting the ability to asymmetrically hydrolyze the ester to resolve the carboxylic acid and its diastereomeric ester or a killed cell thereof is preferably used.
本形質転換体から、その死菌化細胞を下記の方法により調製することもできる。
死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）をあげることができる。尚、これらの殺菌法のうちできるだけ本酵素の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染などの影響が少ない処理方法を各種の反応条件に応じて適宜選択することがよい。
From the transformant, dead cells can be prepared by the following method.
Examples of killing treatment methods include physical sterilization methods (heating, drying, freezing, light, ultrasonic waves, filtration, energization), and sterilization methods using chemicals (alkali, acid, halogen, oxidizing agent, sulfur, Boron, arsenic, metal, alcohol, phenol, amine, sulfide, ether, aldehyde, ketone, cyan and antibiotics). Of these sterilization methods, a treatment method which does not deactivate the enzyme activity of the present enzyme as much as possible and has little influence on the reaction system, such as residue and contamination, may be appropriately selected according to various reaction conditions.
このようにして調製された形質転換体又はその死菌化細胞は、例えば、凍結乾燥細胞、有機溶媒処理細胞、乾燥細胞等の形態、あるいは、固定化された形態（固定化物）で利用してもよい。 The transformant prepared as described above or the killed cell thereof can be used, for example, in the form of freeze-dried cells, organic solvent-treated cells, dried cells, etc., or in a fixed form (immobilized product). Also good.
固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本形質転換体又はその死菌化細胞を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本形質転換体又はその死菌化細胞を閉じ込める方法）が挙げられる。 Examples of a method for obtaining an immobilized product include a carrier binding method (a method of adsorbing the present transformant or its dead cells on an inorganic carrier such as silica gel or ceramic, cellulose, an ion exchange resin, etc.) and a comprehensive method (polyacrylamide). And a method of confining the present transformant or dead cells thereof in a polymer network such as a sulfur-containing polysaccharide gel (for example, carrageenan gel), alginate gel, or agar gel.
続いて、本発明取得方法における不斉水解反応について説明する。
本発明取得方法において本エステルを不斉水解して、本カルボン酸を生じさせる反応は、本酵素若しくは当該酵素を産生する微生物、又はそれらの処理物を作用させることによって達成される。尚、本エステルとしては、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル等が挙げられるが、メチルエステル、エチルエステルが好適である。
当該反応は、通常、水の存在下で行われる。水は緩衝液の形態であってもよく、この場合に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸のアルカリ金属塩が挙げられる。
尚、緩衝液を溶媒として用いる場合、その量は本エステル１重量部に対して、通常、１〜３００重量倍、好ましくは５〜１００重量倍である。
当該反応に際しては、本エステルを反応系内に連続又は逐次加えてもよい。尚、当該反応中は、本エステルと本生物的触媒とがよく混合するように、攪拌又は振とう等の操作を用いることがよい。
Subsequently, the asymmetric hydrolysis reaction in the method for obtaining the present invention will be described.
In the method for obtaining the present invention, the reaction for asymmetrically hydrolyzing the present ester to produce the present carboxylic acid is achieved by acting the present enzyme, a microorganism producing the enzyme, or a processed product thereof. Examples of the ester include methyl ester, ethyl ester, propyl ester, and butyl ester, and methyl ester and ethyl ester are preferable.
The reaction is usually performed in the presence of water. Water may be in the form of a buffer solution. Examples of the buffer used in this case include alkali metal phosphates such as sodium phosphate and potassium phosphate, and alkali metals of acetic acid such as sodium acetate and potassium acetate. Salt.
In addition, when using a buffer solution as a solvent, the quantity is 1 to 300 weight times normally with respect to 1 weight part of this ester, Preferably it is 5 to 100 weight times.
In the reaction, the ester may be continuously or sequentially added to the reaction system. During the reaction, it is preferable to use an operation such as stirring or shaking so that the ester and the biological catalyst are well mixed.
反応温度としては、本酵素若しくは当該酵素を産生する微生物、又はそれらの処理物に含まれた本酵素の安定性、反応速度の点から２０〜７０℃程度をあげることができ、好ましくは約３０〜６０℃があげられる。
反応ｐＨとしては、反応が進行する範囲内で適宜変化させることができるが、例えば、ｐＨ４〜１１を挙げることができる。好ましくはｐＨ７〜１０が挙げられる。
The reaction temperature may be about 20 to 70 ° C. from the viewpoint of the stability and reaction rate of the present enzyme, the microorganism producing the enzyme, or the present enzyme contained in the processed product, and preferably about 30 ° C. Up to 60 ° C.
The reaction pH can be appropriately changed within the range in which the reaction proceeds, and examples thereof include pH 4 to 11. Preferably pH 7-10 is mentioned.
反応は、水の他に有機溶媒の共存下に行うこともできる。この場合の有機溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、ｔ−ブチルメチルエーテル、イソプロピルエーテル等のエーテル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、イソオクタン、デカン等の炭化水素類、ｔ−ブタノール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等のアルコール類、ジメチルスルホキサイドなどのスルホキサイド類、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられる。
反応に使用する有機溶媒の量は、本エステルに対して、通常、１００重量倍以下であり、好ましくは７０重量倍以下である。
The reaction can be carried out in the presence of an organic solvent in addition to water. Examples of the organic solvent in this case include ethers such as tetrahydrofuran, t-butyl methyl ether and isopropyl ether, hydrocarbons such as toluene, hexane, cyclohexane, heptane, isooctane and decane, t-butanol, methanol, ethanol, Examples thereof include alcohols such as isopropanol and n-butanol, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ketones such as acetone, nitriles such as acetonitrile, and mixtures thereof.
The amount of the organic solvent used for the reaction is usually 100 times by weight or less, preferably 70 times by weight or less based on the ester.
反応の終点は、例えば、反応液中の原料化合物の存在量を液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等により追跡することにより決定することができる。反応時間の範囲としては、通常、５分間〜１０日間、好ましくは３０分間〜４日間の範囲をあげることができる。 The end point of the reaction can be determined, for example, by following the abundance of the raw material compound in the reaction solution by liquid chromatography, gas chromatography, or the like. The range of the reaction time is usually 5 minutes to 10 days, preferably 30 minutes to 4 days.
反応終了後は、触媒として酵素や微生物等を使用して化合物を製造する方法において通常用いられる化合物の分割方法及び回収方法（例えば、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィ−、分別蒸留等）により目的物を採取すればよい。
例えば、まず反応液をヘキサン、ヘプタン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、エ−テル、トルエン等の有機溶媒で未反応のエステルを抽出することにより、当該エステルを分割・回収する。必要に応じて抽出操作で用いられた有機層を乾燥した後、濃縮物として当該化合物を回収することができる。次いで水層をろ過した後、塩酸、硫酸等の無機酸又は酢酸等の有機酸を加えてｐＨを酸性とし、ヘキサン、ヘプタン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル、エ−テル、トルエン等の有機溶媒で目的とするカルボン酸を抽出することにより、当該カルボン酸を分割・回収する。さらに分割・回収されたカルボン酸は、必要に応じて抽出操作で用いられた有機層を乾燥した後、濃縮物として当該化合物を回収することができる。回収された化合物は、さらに必要に応じて、カラムクロマトグラフィー等により高度に精製することもできる。尚、上記の分割・回収工程の一部として、上記抽出操作の前に、例えば、上記反応液を濾過したり、又は遠心分離等の処理により不溶物を除去する操作を実施してもよい。
因みに、未反応のエステルは、ラセミ化等の処理を施した後、本発明取得方法における原料として再利用することができ、また、目的により、これを加水分解等の処理を施した後、ピレスロイドエステルに導くこともできる。
After completion of the reaction, the target product is collected by a compound separation method and a recovery method (for example, solvent extraction, column chromatography, fractional distillation, etc.) usually used in a method for producing a compound using an enzyme, a microorganism, or the like as a catalyst. do it.
For example, first, the unreacted ester is extracted from the reaction solution with an organic solvent such as hexane, heptane, tert-butyl methyl ether, ethyl acetate, ether, toluene, and the ester is divided and recovered. If necessary, after drying the organic layer used in the extraction operation, the compound can be recovered as a concentrate. Next, after filtering the aqueous layer, the pH is made acidic by adding an inorganic acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid or an organic acid such as acetic acid, and organic such as hexane, heptane, tert-butyl methyl ether, ethyl acetate, ether, toluene, etc. By extracting the target carboxylic acid with a solvent, the carboxylic acid is divided and recovered. Further, the separated and recovered carboxylic acid can recover the compound as a concentrate after drying the organic layer used in the extraction operation as necessary. The recovered compound can be further highly purified by column chromatography or the like, if necessary. In addition, as a part of said division | segmentation / collection | recovery process, you may implement operation which removes an insoluble matter by processes, such as filtering the said reaction liquid or centrifugation, for example before the said extraction operation.
Incidentally, the unreacted ester can be reused as a raw material in the method for obtaining the present invention after being subjected to a treatment such as racemization, and depending on the purpose, after being subjected to a treatment such as hydrolysis, pyrethroid It can also lead to an ester.
以下、製造例等により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to production examples and the like, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１ （本カルボン酸の取得方法）
後述の参考例１で製造された死菌化細胞液の希釈液（０．２Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ１０．０）０．９４ｍｌに２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸メチルエステル（１Ｒ体／１Ｓ体＝３２／６８、トランス体／シス体＝６０／４０）５０ｍｇを加えた後、当該混合物を４０℃で２４時間攪拌した。攪拌後、当該混合物に少量の塩酸を加えることにより酸性とした後、トルエン抽出した。当該抽出物に内部標準物質（テトラデカン）を加えた後、これをガスクロマトグラフィ−（カラム：ＤＢ−２１０ ０．５３φ ３０ｍ １ミクロン Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）により生じたカルボン酸の量を測定することにより、上記反応における加水分解率を算出したところ１７％であった。
さらに当該２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸を液体クロマトグラフィ−（カラム：Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＲＰ−１８ｅ ４．６φ×１００ｍｍ メルク製、 ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＤ−ＲＨ ３．０φ×１５０ｍｍ ダイセル製）で分析することにより、その立体異性体比を算出したところ、１Ｒ−トランス体／１Ｓ−トランス体／１Ｒ−シス体／１Ｓ−シス体＝１００／０／０／０であった。
Example 1 (Method for Obtaining the Present Carboxylic Acid)
2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1 was added to 0.94 ml of a diluted solution (0.2 M glycine buffer, pH 10.0) of the killed cell solution produced in Reference Example 1 described later. -Carboxylic acid methyl ester (1R isomer / 1S isomer = 32/68, trans isomer / cis isomer = 60/40) was added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 24 hours. After stirring, the mixture was acidified by adding a small amount of hydrochloric acid, and extracted with toluene. After adding an internal standard substance (tetradecane) to the extract, this was measured by measuring the amount of carboxylic acid generated by gas chromatography (column: DB-210 0.53φ 30m 1 micron, manufactured by J & W Scientific). It was 17% when the hydrolysis rate in reaction was computed.
Further, the 2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid was subjected to liquid chromatography (column: Chromolith Performance RP-18e 4.6φ × 100 mm, manufactured by Merck, CHIRALCEL OD-RH 3.0φ × The ratio of the stereoisomers was calculated by analyzing with 150 mm (Daicel), and it was 1R-trans isomer / 1S-trans isomer / 1R-cis isomer / 1S-cis isomer = 100/0/0/0. .
次に、実施例１で使用された死菌化細胞液の製造について、参考例を示す。
参考例１ （死菌化細胞液の製造方法）
上記の実施例１で使用されたアルスロバクタ−ＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラ−ゼ遺伝子が導入された組み換え体大腸菌株は、特開平５−５６７８７号公報記載の方法に準じて調製された。即ち、特開平５−５６７８７号公報記載のアルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＡＧＥ−１を、制限酵素Ｎｓｐ(7524)Ｖ及びＨｉｎｄIIIで消化することにより、エステラーゼ遺伝子の翻訳領域を含むＤＮＡ断片を切り出した。切り出されたＤＮＡ断片と、特開平５−５６７８７号公報記載のように、エステラーゼ遺伝子の開始コドン、その近傍のＤＮＡ配列を変換するために合成したＤＮＡ断片及びｌａｃプロモーターが挿入された発現ベクターｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社）の制限酵素ＢａｍＨI−ＨｉｎｄIII消化物とをライゲーションした。この様にして、ｌａｃプロモーターの下流にアルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラーゼ遺伝子を有する大腸菌用発現プラスミドを調製し、これをエシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０５株に導入した。
５００ｍｌ三角フラスコに入れて滅菌された１００ｍｌの液体培地（調製法：水１Ｌにグリセロ−ル５ｇ、酵母エキス６ｇ、リン酸１カリウム９ｇ及びリン酸2カリウム４ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）に、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌになるように加えた。これに、上記で調製されたアルスロバクタ−ＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラ−ゼ遺伝子が導入された組み換え体大腸菌株（斜面培養物）１白金耳を接種し、３０℃で２４時間回転振とう培養した。次に３Ｌ容の小型培養槽（丸菱バイオエンジ社製、ＭＤＬ型）に入れて滅菌された１５００ｍｌの液体培地（調製法：水１Ｌにグリセロ−ル１５ｇ、酵母エキス２５ｇ、リン酸１カリウム０．４ｇ、硫酸マグネシウム２ｇおよび硫酸第一鉄０．１ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）に、上記のようにして得られた１５ｍｌの培養液を接種し、３０℃で通気攪拌培養した。培養途中、対数増殖期中期（培養開始１０〜１５時間後）にＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度１ｍＭとなるように液体培地に添加した後、滅菌された上記の液体培地を培養槽内に流加しながら４０時間培養することにより、培養液を得た。この培養液に２８％アンモニア水３００ｇを加えてｐＨ９．６となるように調整しながら２８℃で２４時間攪拌することにより、死菌化細胞液を得た。
Next, a reference example is shown about manufacture of the killed cell liquid used in Example 1. FIG.
Reference Example 1 (Method for producing killed cell fluid)
A recombinant Escherichia coli strain into which the esterase gene derived from Arthrobacter-SC-6-98-28 used in Example 1 was introduced was prepared according to the method described in JP-A-5-56787. It was. That is, by digesting plasmid pAGE-1 containing the esterase gene derived from Arthrobacter SC-6-98-28 described in JP-A-5-56787 with restriction enzymes Nsp (7524) V and HindIII, esterase A DNA fragment containing the gene translation region was excised. As described in JP-A-5-56787, the excised DNA fragment, the start codon of the esterase gene, the DNA fragment synthesized to convert the DNA sequence in the vicinity thereof, and the expression vector pUC118 ( Takara Shuzo Co., Ltd.) was ligated with the restriction enzyme BamHI-HindIII digest. Thus, an expression plasmid for Escherichia coli having an esterase gene derived from Arthrobacter SC-6-98-28 strain was prepared downstream of the lac promoter, and this was introduced into Escherichia coli JM105 strain.
100 ml liquid medium sterilized in a 500 ml Erlenmeyer flask (Preparation method: Dissolve 5 g of glycerol, 6 g of yeast extract, 9 g of 1 potassium phosphate and 4 g of 2 potassium phosphate in 1 L of water to pH 7.0. ) Was added to make 50 μg / ml of ampicillin. This was inoculated with 1 platinum loop of recombinant Escherichia coli strain (slope culture) introduced with the esterase gene derived from the above-prepared Arthrobacter-SC-6-98-28 strain, and rotated at 30 ° C. for 24 hours. Cultured with shaking. Next, 1500 ml of liquid medium (preparation method: 15 g of glycerol in 1 L of water, 25 g of yeast extract, 1 potassium phosphate 0 in a 3 L small culture tank (manufactured by Maruhishi Bioengine, MDL type) 4 g, 2 g of magnesium sulfate and 0.1 g of ferrous sulfate are dissolved to pH 7.0), and 15 ml of the culture solution obtained as described above is inoculated and cultured at 30 ° C. with aeration and stirring. . IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside) is added to the liquid medium to a final concentration of 1 mM in the middle of the culture and in the middle of the logarithmic growth phase (10 to 15 hours after the start of the culture), and then the sterilized liquid medium The culture solution was obtained by culturing for 40 hours while feeding into the culture tank. The culture broth was stirred at 28 ° C. for 24 hours while adding 300 g of 28% aqueous ammonia to adjust the pH to 9.6 to obtain a dead cell solution.
本発明により、優れた殺虫効力を有するいわゆる合成ピレスロイドと総称されるエステルの酸成分の中間体として有用な（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸を効率的又は簡便に取得することが可能となる。 According to the present invention, (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1 useful as an intermediate of an acid component of an ester collectively called a so-called synthetic pyrethroid having excellent insecticidal efficacy -Carboxylic acid can be obtained efficiently or simply.
配列番号３
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 3
Oligonucleotide SEQ ID NO: 4 which is a primer designed for PCR
Oligonucleotides are primers designed for PCR
Claims (8)
で示される２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステルに、当該エステルを不斉水解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有し、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素又は当該酵素を産生する微生物を作用させる工程、
（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとを分割する工程、
分割された（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸を回収する工程、
を有することを特徴とする（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸の取得方法。
＜アミノ酸配列群＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列によりコードするアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされるアミノ酸配列 General formula
To the 2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester represented by the formula (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- ( An enzyme having an amino acid sequence selected from the following amino acid sequence group or a microorganism producing the enzyme, having the ability to split into (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid and its diastereomeric ester A process of acting ;
Cleaving (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid and its diastereomeric ester;
Recovering the resolved (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ;
Characterized in that it has a (1R) - trans -2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) method for obtaining a cyclopropane-1-carboxylic acid.
<Amino acid sequence group>
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
(B) an amino acid sequence of an enzyme having an amino acid sequence in which one or more amino acid sequences are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
(C) an amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2
(D) an amino acid sequence encoded by a base sequence of a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2
で示される２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステルを不斉水解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割するための触媒としての、当該２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステルを不斉水解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有し、下記のアミノ酸配列群の中から選ばれるアミノ酸配列を有する酵素又は当該酵素を産生する微生物の使用。2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester represented by formula (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) The 2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester is asymmetrically hydrolyzed as a catalyst for resolving cyclopropane-1-carboxylic acid and its diastereomeric ester. And having the ability to resolve (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid and its diastereomeric ester, Use of an enzyme having an amino acid sequence selected from the above or a microorganism producing the enzyme.
＜アミノ酸配列群＞<Amino acid sequence group>
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素のアミノ酸配列(B) an amino acid sequence of an enzyme having an amino acid sequence in which one or more amino acid sequences are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列によりコードするアミノ酸配列(C) an amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされるアミノ酸配列(D) an amino acid sequence encoded by a base sequence of a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2
で示される２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステルを不斉水解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割するための触媒としての、当該２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸エステルを不斉水解して、（１Ｒ）−トランス−２，２−ジメチル−３−（ベンジルオキシメチル）シクロプロパン−１−カルボン酸とそのジアステレオマーのエステルとに分割する能力を有し、下記の塩基配列群から選ばれる塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するプラスミドが導入されてなる組み換え体微生物又はその死菌化細胞の使用。2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester represented by formula (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) The 2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid ester is asymmetrically hydrolyzed as a catalyst for resolving cyclopropane-1-carboxylic acid and its diastereomeric ester. And having the ability to resolve (1R) -trans-2,2-dimethyl-3- (benzyloxymethyl) cyclopropane-1-carboxylic acid and its diastereomeric ester, Use of a recombinant microorganism into which a plasmid containing a polynucleotide having a nucleotide sequence selected from the above is introduced or a dead cell thereof.
＜塩基配列群＞<Base sequence group>
（ｃ’）配列番号２で示される塩基配列(C ′) the base sequence represented by SEQ ID NO: 2
（ｄ’）配列番号２で示される塩基配列に対し相補性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列(D ′) a nucleotide sequence of a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2
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