JP4496593B2 - Protein, its gene and its use - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノ基転移反応を立体選択的に触媒する能力を有する蛋白質、その遺伝子及びその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般式（３）
で示される光学活性アミノ化合物は各種の用途で利用される化合物の合成中間体として有用な化合物である。例えば、
一般式（１０）
で示されるアミノ基含有化合物の光学活性体は、糖尿病治療薬、抗肥満薬、気管支拡張剤等の医薬品や抗カビ剤、除草剤等の農薬などの合成中間体として有用な化合物であり、また、一般式（８）
で示される光学活性アミノ化合物は血液凝固阻止剤、抗ガン剤、成長障害抑制剤等の医薬品の合成中間体として有用な化合物である。
かかる光学活性アミノ化合物の製造に用いられる生体触媒としては、例えば、ある種のケトン化合物を原料とする光学活性アミン化合物の製造において触媒作用を有するアルスロバクター属の微生物に由来するトランスアミナーゼ（ＷＯ９７／１５６８２、ＷＯ９８／４８０３０）が知られている。さらにはある種のケト酸化合物を原料とする光学活性Ｄ−アミノ酸の製造において触媒作用を有するバシルス属の微生物に由来するＤ−アミノ酸トランスアミナーゼ（特公平５−５４７２）等が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、光学活性アミノ化合物を効率良く製造するための優れた触媒能力を有する新たな蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子及びその利用を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、光学活性アミノ化合物の製造のための生体触媒について鋭意検討した結果、アミノ基転移反応を立体選択的に触媒する能力を有する新規な蛋白質および該蛋白質をコードする遺伝子等を見出し、本発明に至った。
【０００５】
すなわち本発明は、
１．下記（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のアミノ酸配列のいずれかを有する蛋白質。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。
（ｃ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｄ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｅ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するMycobacterium属に属する微生物から得られうる蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列；
２．配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質；
３．配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号２であるスレオニン（Ｔｈｒ）がアラニン（Ａｌａ）に置換されたアミノ酸配列を有する蛋白質；
４．Mycobacterium aurum SC−S423から得られうるモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質であって、かつラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質；
【０００６】
５．下記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸配列のいずれかを有する蛋白質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列のうち塩基番号１〜１０１７で表される塩基配列に対応するアミノ酸配列。
（ｃ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｄ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｅ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するMycobacterium属に属する微生物から得られうる蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列；
６．下記（ａ’）〜（ｃ’）の塩基配列のいずれかを有する遺伝子
（ａ’）配列番号２で示される塩基配列のうち塩基番号１〜１０１７で表される塩基配列。
（ｂ’）配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜１０１７のうち、塩基番号４であるアデニン（ａ）がグアニン（ｇ）に置換された塩基配列。
（ｃ’）配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜２８で示される塩基配列又は配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号９９９〜１０２０で示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとし、かつMycobacterium属に属する微生物由来の染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下の方法によるＰＣＲによって増幅する１０２０ｂｐからなる塩基配列；
７．配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜２８で示される塩基配列又は配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号９９９〜１０２０で示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとし、かつMycobacterium属に属する微生物由来の染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下の方法によるＰＣＲによって増幅する１０２０ｂｐからなる塩基配列。
＜ＰＣＲ方法＞
４種類のｄＮＴＰを各々終濃度が２００μＭとなるよう含み、上記の2種類のプライマーを各々終濃度が２００ｎＭとなるよう含み、ＴａｑＤＮＡ ポリメラーゼ及びＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを合計２６ｍＵ／μｌ含み、鋳型となる染色体ＤＮＡを終濃度が１ｎｇ／μｌになるよう含む反応液を用い、95℃にて２分間保温した後、96℃にて15秒間次いで60℃にて15秒間さらに72℃にて1分間の保温を1サイクルとしてこれを25サイクル繰り返し、さらに72℃にて10分間保温する。；
８．配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜１０１７のうち、塩基番号４であるアデニン（ａ）がグアニン（ｇ）に置換された塩基配列を有する遺伝子；
９．宿主細胞で機能可能なプロモーターと、５．記載の遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子；
【０００７】
１０．５．記載の遺伝子を含むベクター；
１１．５．記載の遺伝子が宿主細胞に導入されてなる形質転換体；
１２．１０．記載のベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体；
１３．宿主細胞が微生物の細胞である１１．または１２．記載の形質転換体；
【０００８】
１４．５．記載の遺伝子または１０．記載のベクターを宿主細胞に導入することを特徴とする形質転換体の製造方法；
１５．５．記載の遺伝子を有する微生物を培養する工程を含むことを特徴とする、請求項１記載の蛋白質の製造方法；
１６．１１．または１２．記載の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする、蛋白質の製造方法；
を提供するものである。
【０００９】
１７．一般式（１）
で示されるアミノ基含有化合物のＲ−体の存在下、請求項１記載の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（３）
で示される光学活性アミノ化合物の製造方法；
１８．ケトン化合物（１）のＲ１がカルボキシル基である１７．に記載の方法；
【００１０】
１９．一般式（４）
で示されるケトン化合物に、
で示されるアミノ基含有化合物のＲ−体の存在下、請求項１記載の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（６）
で示される光学活性アミノ化合物の製造方法；
【００１１】
２０．一般式（７）
で示されるケトン化合物に、一般式（２）
で示されるアミノ基含有化合物のＲ−体の存在下、請求項１記載の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（８）
で示される光学活性アミノ化合物の製造方法；
【００１２】
２１． 一般式（１３）
で示されるアミノ基含有化合物（以下、アミノ基含有化合物（１３）と記す）に、一般式（１１）
で示されるケトン化合物（１１）の存在下、請求項１記載の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（９）
で示されるアミン化合物異性体（以下、アミン化合物異性体（９）と記す）の比率向上方法；
【００１３】
２２． 一般式（１０）
で示されるアミノ基含有化合物（以下、アミノ含有化合物（１０）と記す）に、ケトン化合物（１１）の存在下、請求項１の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（１２）
で示されるアミノ化合物異性体（以下、アミノ化合物異性体（１２）と記す）の比率の向上方法；
を提供するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明蛋白質には、下記（ａ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のアミノ酸配列のいずれかを有する蛋白質（ａ）配列番号1で示されるアミノ酸配列、（ｃ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列、（ｄ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列、（ｅ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するMycobacterium属に属する微生物から得られうる蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列、を含む。具体的には、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質や、Mycobacterium aurum SC−S423から得られうるモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質であって、かつラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質等をあげることができる。
【００１５】
上記の蛋白質は、ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を消失しない限りにおいて、そのアミノ酸配列を適当な長さのアミノ酸配列に短くすることができ、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号２３〜３３９で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質とすることも可能である。本蛋白質は、アミノ基転移反応を立体選択的に触媒する能力として、少なくともラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有している。例えば、本蛋白質を含有する１ｍｌの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）中に、ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミン、アセトフェノン及びピリドキサール−５−リン酸（ＰＬＰ）を最終濃度がそれぞれ４００ｍＭ、１０ｍＭ、２０μＭとなるように添加することにより反応液を調整し、この反応液を約３０℃から約４０℃にて、約２時間から４日間保温した後、当該反応液中に生成した光学活性１−フェニルエチルアミンの量を分析すれば、当該能力の有無を判定することができる。尚、１−フェニルエチルアミンのＲ−体の定量分析方法については実施例の欄等において一例を記載する。
【００１６】
本蛋白質が立体選択的に触媒するアミノ基転移反応としては、例えばアミノ基含有化合物（２）の存在下にケトン化合物（１）を光学活性アミノ化合物（３）に変換する反応、アミノ基含有化合物（２）の存在下にケトン化合物（４）を光学活性アミノ化合物（６）に変換する反応、アミノ基含有化合物（２）の存在下にケトン化合物（７）を光学活性化合物（８）に変換する反応、ケトン化合物（１１）の存在下にアミノ基含有化合物（１３）に含まれる光学活性アミノ化合物（９）の比率を向上させる反応、ケトン化合物（１１）の存在下にアミノ基含有化合物（１０）に含まれる光学活性アミノ化合物（１２）の比率を向上させる反応等をあげることができる。本発明において配列番号１で示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸同一性とは、９５％以上のアミノ酸同一性をあげることができる。
【００１７】
本発明の遺伝子には、下記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸配列のいずれかを有する蛋白質をコードする遺伝子
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号２で示される塩基配列のうち塩基番号１〜１０１７で表される塩基配列に対応するアミノ酸配列、（ｃ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列、（ｄ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列、（ｅ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するMycobacterium属に属する微生物から得られうる蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列；及び下記（ａ’）〜（ｃ’）の塩基配列のいずれかを有する遺伝子
（ａ’）配列番号２で示される塩基配列のうち塩基番号１〜１０１７で表される塩基配列、
（ｂ’）配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜１０１７のうち、塩基番号４であるアデニン(a)がグアニン(g)に置換された塩基配列、
（ｃ’）配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜２８で示される塩基配列又は配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号９９９〜１０２０で示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとし、かつMycobacterium属に属する微生物由来の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲによって増幅する約１０２０ｂｐからなる塩基配列；を含む。具体的には、例えば、配列番号２で示される塩基配列のうち塩基番号１〜１０１７で表される塩基配列等をあげることができる。
【００１８】
上記の遺伝子としては、天然の遺伝子であってもよいし、例えば、部位特異的変異導入法やランダム変異導入法等によって、天然の遺伝子に変異を導入することにより作出された遺伝子であってもよい。天然の遺伝子を検索する場合には、ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する微生物を対象にすればよく、例えばMycobacterium aurum、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium chubuense等のMycobacterium属に属する微生物を好ましい対象としてあげることができる。
【００１９】
本遺伝子は、例えば以下のようにして調製することができる。
マイコバクテリウム・オーラム(Mycobacterium aurum)SC-S423株[通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７００９（原寄託日：平成１０年３月３０日）としてブタペスト条約に基づき国際寄託されている。]などのマイコバクテリウム属に属する微生物等から、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc.等に記載される通常の遺伝子工学的方法に準じた方法により染色体ＤＮＡを調製する。次いで、調製された染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜２８で示される塩基配列又は配列番号１１で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号９９９〜１０２０で示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて下記の反応条件にてポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）を行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡや、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ等を増幅することができる。
ここで、ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々終濃度が２００μＭとなるよう含み、上記の2種類のプライマーを各々終濃度が２００ｎＭとなるよう含み、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ 及び Ｐｗｏ ＤＮＡ ポリメラーゼを合計２６ｍＵ／μｌ含み、鋳型となる染色体ＤＮＡを終濃度が１ｎｇ／μｌになるよう含む反応液を用い、95℃にて２分間保温した後、96℃にて15秒間次いで60℃にて15秒間さらに72℃にて1分間の保温を1サイクルとしてこれを25サイクル繰り返し、さらに72℃にて10分間保温する条件をあげることができる。
【００２０】
また、このようなＰＣＲのプライマーに用いるオリゴヌクレオチドを、例えば、配列番号２で示される塩基配列に基づいて適宜設計して合成し、上記の条件に準じてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡ、具体的には例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号23〜339で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡや、かかるＤＮＡの塩基配列において１もしくは複数の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ等を増幅することができる。尚、このようにしてＰＣＲに用いられるプライマーの５’末端側には、制限酵素認識配列等が付加されていてもよい。具体的には、例えば配列番号１１又は配列番号１２で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド等をあげることができる。また、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡがベクターに挿入されてなるＤＮＡライブラリーを鋳型とする場合には、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列から選ばれる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の5'末端側の約14塩基程度以上の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）と、ライブラリー構築に用いられたベクターのＤＮＡ挿入部位近傍の塩基配列に相補的な塩基配列を有する約１４塩基程度以上のオリゴヌクレオチドとをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅することもできる。
上記のようにして増幅されたＤＮＡは、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc.等に記載されている通常の遺伝子工学的方法に準じた方法によりベクターにクローニングすることができる。具体的には、例えばInvitrogen社のTAクローニングキットに含まれるプラスミドベクターやStratagene社のpBluescriptIIなどのプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。
【００２１】
また、本遺伝子は、例えばMycobacterium属に属する微生物等由来の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーに、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する約１５塩基以上の塩基からなるＤＮＡをプローブとして後述する条件にてハイブリダイズさせ、該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出することによって取得することもできる。
【００２２】
染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択するとよい。使用されるライブラリーがプラスミドベクターを用いて構築されている場合には、コロニーハイブリダイゼーションを行う。具体的にはまず、ライブラリーのＤＮＡを、ライブラリーの作製に用いられたプラスミドベクターが複製可能な微生物に導入して形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈して寒天培地にまき、コロニーが現れるまで培養を行う。ライブラリーがファージベクターを用いて作製されている場合には、プラークハイブリダイゼーションを行う。具体的にはまず、ライブラリーの作製に用いられたファージベクターが複製可能な微生物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混合した後、更に軟寒天培地と混合し、これを寒天培地にまく。その後、プラークが現れるまで培養を行う。
次いで、前記のいずれのハイブリダイゼーションの場合も、前記の培養を行った寒天培地の表面にメンブレンを載せ、形質転換体またはファージを該メンブレンに転写する。このメンブレンをアルカリ処理した後、中和処理し、次いで、DNAを該メンブレンに固定する処理を行う。より具体的に例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地の上にニトロセルロースメンブレンまたはナイロンメンブレン等、具体的には例えば、Hybond-N+(アマシャム社登録商標)等を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着させる。次に、該メンブレンをアルカリ溶液（1.5M 塩化ナトリウム、0.5N NaOH）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させてファージDNAをメンブレン上に溶出させた後、中和溶液（1.5M 塩化ナトリウム、0.5Mトリス-塩酸緩衝液pH7.5）に約５分間浸す。該メンブレンを洗浄液（0.3M塩化ナトリウム、30 mMクエン酸ナトリウム、0.2M トリス-塩酸緩衝液pH7.5）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間ベーキングすることによりファージDNAをメンブレンに固定する。
【００２３】
このように調製されたメンブレンを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press等の記載に準じて行うことができる。
【００２４】
プローブに用いるＤＮＡを放射性同位元素により標識するには、例えば、ベーリンガー社または宝酒造社製のRandom Labeling Kit等を用いることができ、通常のPCR反応液中のdCTPを(α-32P)dCTPに替えて、プローブに用いるDNAを鋳型にしてPCRを行うことにより、標識することもできる。また、プローブに用いるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には例えば、アマシャム製のECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System等を用いることができる。
ハイブリダイゼーションを行う際の試薬及び温度条件は多種存在するが、例えば、450〜900mMの塩化ナトリウムおよび45〜90mMのクエン酸ナトリウムを含み、ドデシル硫酸ナトリウム(以下、SDSと記す。)を0.1〜1.0%の濃度で含み、変性した非特異的DNAを0〜200μg/mlの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ0〜0.2%の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液、好ましくは、900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム、1.0%のSDSおよび100μg/mlの変性Calf-thymus DNAを含むプレハイブリダイゼーション液を、上記のようにして作製したメンブレン1cm2当たり50〜200μlの割合で準備し、該溶液に前記メンブレンを浸して42〜65℃で1〜4時間、好ましくは、65℃で2時間保温する。次いで例えば、450〜900mMの塩化ナトリウムおよび45〜90mMのクエン酸ナトリウムを含み、SDSを0.1〜1.0%の濃度で含み、変性した非特異的DNAを0〜200μg/mlの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ0〜0.2%の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液、好ましくは、900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム、1.0%のSDSおよび100μg/mlの変性Calf-thymus DNAを含むハイブリダイゼーション溶液と、前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン1cm2当たり1.0x104〜2.0x106cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン1cm2当たり50〜200μlの割合で準備し、該溶液にメンブレンを浸し42〜65℃で12〜20時間、好ましくは、65℃で16時間保温しハイブリダイゼーション反応を行う。該ハイブリダイゼーション反応後、メンブレンを取り出し、15〜300mMの塩化ナトリウム、1.5〜30mMクエン酸ナトリウムおよび0.1〜1.0 %のSDS等を含む42〜65℃の洗浄液等を用い、好ましくは、15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸ナトリウムおよび1.0 %のSDSを含む65℃の洗浄液で15分間の洗浄を2回行う。さらに、メンブレンを2xSSC溶液（300mM塩化ナトリウム、30mMクエン酸ナトリウム）で軽くすすいだ後乾燥させる。このメンブレンを、例えば、オートラジオグラフィーなどに供してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするDNAのメンブレン上の位置を検出する。検出されたDNAのメンブレン上の位置に相当するクローンをもとの寒天培地上で特定しこれを釣菌することにより、当該DNAを有するクローンを単離することができる。
【００２５】
上述のようにして得られるＤＮＡは、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc.等に記載されている通常の遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。ベクターとしては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、ｐCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、ｐKK331-1（Pharmacia社製）などを利用することができる。
また、上述のようにして得られるＤＮＡの塩基配列は、F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著、Proceeding of National Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等の市販の試薬を用いてもよい。
【００２６】
上述のようにして得られるＤＮＡにコードされる蛋白質の、アミノ基転移反応を立体選択的に触媒する能力の確認は、例えば以下のようにして行うことができる。まず、該ＤＮＡを後述のように、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、これを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。次いで、該形質転換体の培養物を、ケトン化合物（１）にアミノ基含有化合物（２）の存在下作用させ、その結果生じた反応生成物を分析する。このようにして光学活性アミノ化合物（３）を優先的に生成する能力を有する形質転換体を特定することができ、当該形質転換体はかかる能力を有する蛋白質をコードする本遺伝子を保有していると判断することができる。より具体的には、例えば、１０ｍＭアセトフェノン、４００ｍＭのラセミ体のｓｅｃーブチルアミンおよび２０μＭピリドキサール−５−リン酸を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液(pH６.０)に、上記形質転換体の培養物を最終容量１ｍｌになるよう懸濁し、これを1.５ml容量のサンプルチューブに入れ、振盪機で振盪させながら約３０℃〜４０℃にて約２時間から４日間保温する。保温後の該懸濁液２００μlにメタノール４００μｌを加えて攪拌し、１００００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を回収してフィルターろ過し、得られたろ液をガスクロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと記す。）で分析することにより、１−フェニルエチルアミンの生成量、光学純度を定量することができ、上記形質転換体の光学活性１−フェニルエチルアミン生成能をアミノ基転移反応を立体選択的に触媒する代表的な能力として判定することができる。
【００２７】
本遺伝子を宿主細胞で発現させるには、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本遺伝子とが、機能可能な形で接続されてなる遺伝子、当該遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する。ここで、「機能可能な形で」とは、該遺伝子が宿主細胞に導入された際に、本遺伝子が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、例えば、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、または、tacプロモーターもしくはtrcプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーターなどをあげることができる。また、本遺伝子の元来のプロモーターを利用してもよい。一般的には、宿主細胞で機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本遺伝子を、前述のようなベクターに組込んで、これを宿主細胞に導入する。ベクターとしては、選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子など）を含むベクターを用いると、本遺伝子が導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択する際に便利である。
【００２８】
本遺伝子又は本遺伝子を含むベクターが導入される宿主細胞としては、例えば、Esherichia、Bacillus、Corynebacterium、Staphylococcus、Streptomyces、Saccharomyces、Kluyveromyces、Aspergillus、Mycobacterium属等に属する微生物などの細胞があげられる。遺伝子を宿主細胞へ導入する方法は、宿主細胞に応じて通常用いられる方法であればよく、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc.等に記載される塩化カルシウム法や、「Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレーション法などをあげることができる。
本遺伝子又は本遺伝子を含むベクターが導入された形質転換体は、前述のような本遺伝子が組込まれたベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選抜することができる。形質転換体が本遺伝子又は本遺伝子を含むベクターを保有していることは、該形質転換体からＤＮＡを調製した後、調製されたＤＮＡについて、例えば「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法（制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等）を行うことにより確認することができる。
【００２９】
本蛋白質は、例えば本遺伝子を有する微生物を培養することによって調製することができる。かかる微生物としては、本遺伝子を発現し本蛋白質を産生する能力を有する微生物であって、例えば、本遺伝子を有する微生物の、自然界から分離された野性株、該野生株から薬剤や紫外線等の処理によって誘導された変異株等をあげることができる。さらにまた本遺伝子又は本遺伝子を含むベクターが宿主細胞に導入された形質転換体等をあげることもできる。具体的な例としては、例えば、本発明者らが自然界から分離したマイコバクテリウム・オーラム(Mycobacterium aurum)SC-S423株等があげられる。また、tacプロモーター、trcプロモーターまたはlacプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本遺伝子が宿主細胞に導入された大腸菌株、例えばE.coli JM109/ptrc9等をあげることもできる。
【００３０】
上記のような本遺伝子を有する微生物を培養する為の培地としては、微生物にの培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。例えば、炭素源としては、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン等の糖類、グリセロール、ソルビトール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸等があげられる。これら炭素源の培地への添加量は、培地全量に対し、通常約0.1％(w/v)〜約10％(w/v)程度とするとよい。
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンステイープリカー、綿実粉、乾燥酵母、カゼイン加水分解物等の天然有機窒素源又はアミノ酸類等があげられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は、多くの場合、炭素源としても使用することができる。窒素源の添加量は培地全量に対し通常、約０．１％(w/v)〜約１０％(w/v)程度とするとよい。
無機塩類としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム等のリン酸塩、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化コバルト６水和物等の塩化物塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄７水和物、硫酸亜鉛７水和物、硫酸マンガン３水和物等の硫酸金属塩等をあげることができ、その添加量は培地全量に対し通常、約０．０００１％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）程度とするとよい。
【００３１】
また、かかる培地にあらかじめアミノ化合物類、例えばアミノ基含有化合物や光学活性アミノ化合物等を少量添加しておいてもよく、これにより前記した微生物による本蛋白質の生産性が高まることがあり、また、アミノ化合物類は、前記微生物の培養における窒素源および炭素源にもなる。このように添加するアミノ化合物類の量は培地全量に対し、通常約0.001％（ｗ／ｖ）程度以上、好ましくは約0.01％（ｗ／ｖ）〜約1％（ｗ／ｖ）程度である。
さらに、tacプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター等のラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと本遺伝子とが機能可能な形で接続されてなる遺伝子が導入された宿主細胞の場合には、本蛋白質の生産を誘導するための誘導剤として、例えばｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を培地中に少量加えてもよい。
【００３２】
本遺伝子を有する微生物の培養は、微生物の培養に通常使用される方法に準じて行うことができ、例えば旋回振盪培養、往復振盪培養、ジャーファーメンター(Jar Fermenter)培養もしくはタンク培養等の液体培養、または、固体培養等の方法が可能である。ジャーファーメンターを用いる場合には、ジャーファーメンター内に無菌空気を導入する必要があり、通常、培養液容量の約０．１倍〜約２倍／分の通気条件をが用いられる。培養温度は、微生物が生育可能な範囲で適宜変更できるが、約１５℃〜約４０℃の範囲の培養温度が一般的であり、培地のｐＨとしては、約６〜約８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが、通常は約１日間〜約１０日間程度である。
【００３３】
本遺伝子を有する微生物によって産生される本蛋白質は、例えば、本蛋白質を産生する微生物の培養物、本蛋白質を産生する微生物の菌体、かかる菌体の処理物、無細胞抽出液、粗精製蛋白質、精製蛋白質等の種々の形態で光学活性アミノ化合物の製造に用いることができる。ここで菌体の処理物としては、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体のアルカリ処理物、菌体の有機溶媒処理物等をあげることができる。また、上記のような種々の形態の本蛋白質を、例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、ＤＥＡＥ−セルロース等の多糖類の誘導体、もしくはアンバーライトＩＲＡ９３５（商品名：ローム・アンド・ハース社製）等の合成高分子等へ吸着させる担体結合法や、ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲルもしくは寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に閉じ込める包括法などの公知の方法に準じて固定化して光学活性アミノ化合物の製造に用いることもできる。
【００３４】
本蛋白質を前記のような本遺伝子を有する微生物の培養物から精製する方法としては、蛋白質の精製において通常使用される方法を適用することができ、例えば次のような方法をあげることができる。
まず、微生物の培養物から遠心分離等により菌体を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理もしくはフレンチプレス処理等の物理的破砕方法、または界面活性剤もしくはリゾチーム等の菌体溶菌酵素を用いる化学的破砕方法などによって破砕する。得られた破砕液から、遠心分離、メンブレンフィルターろ過等により不溶物を除去して無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって本蛋白質を精製することができる。クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基、もしくはブチル基等を導入したセルロース、デキストランまたはアガロース等の樹脂担体が挙げられる。市販の担体充填済みカラムを用いることもでき、例えば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャム ファルマシア バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等があげられる。
【００３５】
本蛋白質の精製操作の一例を示す。
本蛋白質を産生する微生物の菌体を遠心分離により集めた後、例えば２０ｍＭビストリスプロパン（ｐＨ７．０）等の緩衝液に懸濁する。これを超音波破砕機にて２０分間程度破砕処理し、得られた菌体破砕液を約１３０００×ｇで１５分間程度遠心分離した後、上清を回収してメンブレンフィルターにてろ過して不溶物を除去し、無細胞抽出液を調製する。こうして得られた無細胞抽出液を例えば Q Sepharose FFカラム（商品名、アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に導入し、塩化ナトリウム直線濃度勾配によりカラムへの吸着物を順次溶出させ、分画された溶出液を得る。本蛋白質を含む画分を、次いで、例えば Phenyl-Sepharose HP カラム（商品名、アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に導入し、硫酸アンモニウム直線濃度勾配によりカラムへの吸着物を順次溶出させ、分画された溶出液を得る。本蛋白質を含む画分を、さらに、限外ろ過膜等を用いて濃縮した後、例えばＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラム（600mm×7.5mmID）（商品名、東ソー社製）に導入し、例えば０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液等で溶出させ、分画された溶出液を得ることによって、本蛋白質を精製することができる。尚、本蛋白質を含む画分は、例えば、ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを光学活性１−フェニルエチルアミンに変換する能力を指標にして選択することがよい。
【００３６】
ケトン化合物（１）に、アミノ基含有化合物（２）の存在下、本蛋白質を作用させることにより光学活性アミノ化合物（３）を得ることができる（以下、本製造方法１と記す。）。
ケトン化合物（１）において、Ｘ1は置換されていてもよいＣ１−Ｃ９アルキル基（Ｃ１−Ｃ９アルキル基、置換Ｃ１−Ｃ９アルキル基）、置換されていてもよいＣ６−Ｃ１４アリール基（Ｃ６−Ｃ１４アリール基、置換Ｃ６−Ｃ１４アリール基）、置換されていてもよいＣ７−Ｃ１７アリールアルキル基（Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基、置換Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基）、置換されていてもよいＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基（Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基、置換Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基）、置換されていてもよいＣ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基（Ｃ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基、置換Ｃ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基）、アミノ基、アミノカルボニル基、水酸基、チオール基、グアニジル基、シアノ基、ハロゲン原子又は水素原子を表わす。ここで上記の「置換」とは、Ｃ１−Ｃ９アルキル基、Ｃ６−Ｃ１４アリール基、Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基、Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基またはＣ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基における水素原子の１個以上、通常はＣ１−Ｃ９アルキル基における水素原子の１〜２個、Ｃ６−Ｃ１４アリール基における水素原子の１〜２個、Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基における水素原子の１〜２個、Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基における水素原子の１〜２個またはＣ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基における水素原子の１〜２個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ２ハロゲン化アルキル基、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ２アルキルチオ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基及びハロゲン原子からなる群より選ばれる１種または２種以上の置換基で置換されていることを意味する。
【００３７】
該置換基の好ましい例としては、メチル基、エチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、フッ素原子、塩素原子および臭素原子をあげることができる。
Ｒ1としては、水素原子；メチル基、エチル基、プロピル基等のＣ１〜Ｃ６（直鎖または分岐）アルキル基；カルボキシル基；メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロピルオキシカルボニル基、ブチルオキシカルボニル基等のＣ２〜Ｃ５（直鎖または分岐）アルキルオキシカルボニル基等を挙げることができる。
【００３８】
アミノ基含有化合物（２）において、Ｒ2は置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル基）、置換されていてもよいフェニル基(フェニル基、置換フェニル基)、置換されていてもよいフェニルアルキル基(フェニルアルキル基、置換フェニルアルキル基)を表わす。ここで上記の「置換」とは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、フェニル基またはフェニルアルキル基における水素原子の１個以上、通常はＣ１−Ｃ６アルキル基における水素原子の１〜２個、フェニル基における水素原子の１〜２個またはフェニルアルキル基における水素原子の１〜２個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ２ハロゲン化アルキル基、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、メチルチオ基及びハロゲン原子からなる群より選ばれる１種または２種以上の置換基で置換されていることを意味する。該置換基の好ましい例としては、メチル基、エチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、メチルチオ基、フッ素原子、塩素原子および臭素原子をあげることができる。
【００３９】
Ｃ１−Ｃ６アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、１−メチルプロピル基、２−メチルプロピル基、ペンチル基、ヘキシル基等のＣ１−Ｃ６（直鎖または分岐）アルキル基をあげることができ、Ｃ７−Ｃ１０フェニルアルキル基としては、ベンジル基、２−フェニルエチル基、３−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、α−メチルベンジル基等のＣ７−Ｃ１０フェニル（直鎖または分岐）アルキル基をあげることができる。
【００４０】
置換Ｃ１−Ｃ６アルキル基として具体的には、例えばカルボキシメチル基、カルボキシエチル基、１−アミノエチル基、３−アミノプロピル基、４−アミノブチル基、ヒドロキシメチル基、メチルチオエチル基等を挙げることができ、置換フェニル基として具体的には、例えばｐ−ヒドロキシフェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｍ，ｐ−ジヒドロキシフェニル基等を挙げることができ、置換Ｃ７−Ｃ１０フェニルアルキル基として具体的にはｐ−ヒドロキシフェニルエチル基、ｐ−クロロフェニルメチル基、１−フェニル−１−ヒドロキシメチル基等をあげることができる。
Ｒ3としては、水素原子；メチル基、エチル基、プロピル基等のＣ１〜Ｃ６（直鎖または分岐）アルキル基；カルボキシル基；メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロピルオキシカルボニル基、ブチルオキシカルボニル基等のＣ２〜Ｃ５（直鎖または分岐）アルキルオキシカルボニル基等を挙げることができる。
【００４１】
アミノ基含有化合物（２）として具体的には、例えばアラニン、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、リジン、セリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルセリン等のα−アミノ酸またはその（Ｃ１−Ｃ４アルキル）エステル；プロピルアミン、１，２−ジアミノプロパン、ｎ−ブチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、１，４−ジアミノブタン、２−アミノペンタン、ｎ−ヘキシルアミン、２−アミノヘプタン等の脂肪族アミン類；１−フェニルエチルアミン、２−フェニルエチルアミン、ベンジルアミン、３−アミノ−１−フェニルブタン、４−アミノ−１−フェニルペンタン等のフェニルアルキルアミン類；２−アミノ−１−プロパノール等のアミノアルコール類等が挙げられる。
【００４２】
なお、アミノ基含有化合物（２）において、不斉炭素原子を有する化合物については、光学異性体のうちのいずれか、またはその２種以上の混合物を適宜選択して用いることができるが、通常はアキラルな化合物が用いられる。また、アミノ基含有化合物（２）は光学活性アミノ化合物（３）とは異なる化合物であることが必要である(但し、その異なりが、光学異性、幾何異性等の立体異性のみに基づく場合には、ここでは異なる化合物とは見なさない)。即ち、本製造方法１において選択されるアミノ基含有化合物（２）と光学活性アミノ化合物（３）との組み合わせにおいて、アミノ基含有化合物(２)におけるＲ2と光学活性アミノ化合物(３)におけるＸ1とが同一で、かつアミノ基含有化合物（２）におけるＲ3と光学活性アミノ化合物（３）における−（ＣＨ2）m−Ｒ1基とが同一であることはない。
【００４３】
本製造方法１は通常、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩などの無機酸塩や、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩等を含む水性バッファー液中で行われ、ケトン化合物（１）及びアミノ基含有化合物（２）の本製造方法１の反応液中における濃度はそれぞれ通常３０％（ｗ／ｖ）程度以下が適しており、好ましくは０．０１〜２０％（ｗ／ｖ）程度である。また、ケトン化合物（１）に対するアミノ基含有化合物（２）の重量割合は、一般的には０．０１〜１００程度であるが、ケトン化合物（１）に対するアミノ基含有化合物（２）の重量割合を例えば１０〜１００等のように比較的大きく設定することが、反応速度や光学活性アミノ化合物（３）の収率等の点で有利なことが多い。本蛋白質の量は、例えば反応時間や生成する光学活性アミノ化合物（３）の選択性等を考慮して適宜決めることができる。例えば本蛋白質が精製酵素または粗酵素として用いられる場合、その量はケトン化合物（１）に対して、通常は０．００１〜２重量倍、好ましくは０．００２〜０．５重量倍であり、一方、本蛋白質が微生物の培養物、微生物の菌体、かかる菌体のの処理物等の形態で用いられる場合、微生物の培養物、微生物の菌体、かかる菌体の処理物等の量はケトン化合物（１）に対して、通常は０．０１〜２００重量倍、好ましくは０．１〜５０重量倍である。反応温度は通常、１０〜７０℃程度が適しており、好ましくは２０〜６０℃程度である。反応液のｐＨは通常４〜１２程度が適しており、好ましくは５〜１１程度である。反応時間は、任意に設定することができるが、通常は約１時間〜７日間程度である。
【００４４】
さらに界面活性剤、補酵素、有機溶媒等を補助剤として本製造方法１の反応系内に共存させると、反応時間の短縮や光学活性アミノ化合物（３）の収率等の点で有利な場合があり、必要に応じてこれらの補助剤を単独又は適宜組み合わせて反応液に添加することもできる。使用し得る界面活性剤として具体的には、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、臭化セチルピリジウム等を挙げることができ、また補酵素として具体的には、例えばピリドキサル−５−リン酸（ＰＬＰ）等をあげることができる。また有機溶媒として具体的には、例えば、ｎ−ヘプタン、シクロヘキサン、イソオクタン等のアルカン類、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル等のエーテル類、メタノール、イソプロパノール、ｎ−オクタノール等のアルコール類、ＤＭＳＯ等のスルホキシド類等をあげることができる。
【００４５】
本製造方法１により得られる光学活性アミノ化合物（３）は、公知の処理方法により、反応液から回収することができる。例えば、反応液から遠心分離により微生物の培養物、微生物の菌体、かかる菌体の処理物等を分離後、上清液を酸性に調整し、ジエチルエーテルやトルエン等の有機溶媒で抽出・分液して有機層を除き、次いで水層を塩基性として同様な有機溶媒で抽出・分液し水層を除いた後、該溶媒を減圧留去し、必要によりさらに蒸留等により精製することにより、あるいは前記上清液をイオン交換クロマトグラフィー等の手法により精製することにより光学活性アミノ化合物（３）が得られる。
【００４６】
ケトン化合物（４）に、アミノ基含有化合物（２）の存在下、本蛋白質を作用させることにより光学活性アミノ化合物（６）を得ることができる(以下、本製造方法２と記す。)。
ケトン化合物（４）において、Ｘ2はフェニル基、置換されていてもよいフェニル基(フェニル基、置換フェニル基)、置換されていてもよいナフチル基（ナフチル基、置換ナフチル基）を表わす。ここで、上記の「置換」とは、フェニル基又はナフチル基の水素原子の１個以上、通常はフェニル基の水素原子の１〜２個又はナフチル基の水素原子の１〜２個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ２ハロゲン化アルキル基、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基及びハロゲン原子からなる群より選ばれる１種または２種以上の置換基で置換されていることを意味する。該置換基の好ましい例としては、メチル基、エチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、フッ素原子、塩素原子及び臭素原子をあげることができる。
Ｒ4はＣ１−Ｃ６のアルキル基を表わし、好ましくはＣ１−Ｃ３アルキル基をあげることができ、さらに好ましくはメチル基及びエチル基をあげることができる。
【００４７】
ケトン化合物（４）として具体的には、例えばアセトフェノン、２−メトキシアセトフェノン、３−メトキシアセトフェノン、２，４−ジクロロアセトフェノン、３，４−ジクロロアセトフェノン、３−シアノアセトフェノン、４−ヒドロキシアセトフェノン、４−メトキシアセトフェノン、４-メチルアセトフェノン、４−クロロアセトフェノン、１−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパン−２−オン、１−（４−メトキシフェニル）プロパン−２−オン、１−（４−クロロフェニル）プロパン−２−オン、１−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン−２−オン、１−（４−メチルフェニル）プロパン−２−オン、１−（３，４−メチレンジオキシフェニル）プロパン−２−オン、１−フェニルプロパン−１−オン、α−アセトナフトン、β−アセトナフトン等を挙げることができる。
【００４８】
なお、アミノ基含有化合物（２）は、光学活性アミノ化合物（６）とは異なる化合物であることが必要である（但し、その異なりが、光学異性、幾何異性等の立体異性のみに基づく場合には、ここでは異なる化合物とは見なさない）。即ち、本製造方法２において選択されるアミノ基含有化合物（２）と光学活性アミノ化合物（６）との組み合わせにおいて、アミノ基含有化合物（２）におけるＲ2と光学活性アミノ化合物（６）におけるＸ2−（ＣＨ2）n−基とが同一で、且つアミノ基含有化合物（２）におけるＲ3と光学活性アミノ化合物（６）におけるＲ4とが同一であることはない。
本製造方法２は本製造方法１において記載した条件等に準拠して実施することができる。本製造方法２により得られる光学活性アミノ化合物（６）は、公知の処理方法により、反応液から回収できる。例えば、反応液から遠心分離により微生物の培養物、その処理物等を分離後、上清液を酸性に調整し、ジエチルエーテルやトルエン等の有機溶媒で抽出・分液して有機層を除き、次いで水層を塩基性として同様な有機溶媒で抽出・分液し水層を除いた後、該溶媒を減圧留去し、必要によりさらに蒸留等により精製することにより光学活性アミノ化合物（６）が得られる。
【００４９】
本製造方法２により製造し得る光学活性アミノ化合物（６）としては、一般式（６）において特定された立体配置を有する例えば以下の化合物を挙げることができる。
1−フェニルエチルアミン、１−（２−メトキシフェニル）エチルアミン、１−（３−メトキシフェニル）エチルアミン、１−（２、４−ジクロロフェニル）エチルアミン、１−（３、４−ジクロロフェニル）エチルアミン、１−（３−シアノフェニル）エチルアミン、１−（４−ヒドロキシフェニル）エチルアミン、１−（４−メトキシフェニル）エチルアミン、１-（４-メチルフェニル）エチルアミン、１−（４−クロロフェニル）エチルアミン、１−（３、４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−メトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−クロロフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−メチルフェニル）−２−アミノプロパン、１−（３、４−メチレンジオキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−フェニル−１−アミノプロパン、1−（α−ナフチル）エチルアミン、1−（β−ナフチル）エチルアミン等。
【００５０】
ケトン化合物（７）に、アミノ基含有化合物（２）の存在下、本蛋白質を作用させることにより光学活性アミノ化合物（８）が得られる（以下、該方法を本製造方法３と記す。）。
【００５１】
ケトン化合物（７）において、Ｘ4は置換されていてもよいＣ６−Ｃ１４アリール基（Ｃ６−Ｃ１４アリール基、置換Ｃ６−Ｃ１４アリール基）、置換されていてもよいＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基（Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基、置換Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基）、置換されていてもよいＣ１−Ｃ３アルキル基（Ｃ１−Ｃ３アルキル基、置換Ｃ１−Ｃ３アルキル基）、アミノ基、アミノカルボニル基、水酸基、チオール基、グアニジル基又は水素原子を表わす。
ここで上記の「置換」とは、該アリール基、該ヘテロアリール基又は該アルキル基の水素原子の１個以上、通常はＣ６−Ｃ１４アリール基の水素原子の１〜２個、Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基の水素原子の１〜２個又はＣ１−Ｃ３アルキル基の水素原子の１〜２個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ２ハロゲン化アルキル基、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、メチルチオ基およびハロゲン原子、好ましくは、メチル基、エチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、メチルチオ基、フッ素原子、塩素原子及び臭素原子からなる群より選択される１種または２種以上の置換基で置換されていることを意味する。
また、Ｒ7およびＲ8は互いに同一または相異なって、水素原子、Ｃ１−Ｃ３アルキル基又は水酸基を表わす。
Ｃ１−Ｃ３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基をあげることができる。
ｐは０〜３の整数を表わし、ｑは０〜２の整数を表わす。
【００５２】
Ｃ６−Ｃ１４アリール基としては、例えばフェニル基、ナフチル基等をあげることができ、Ｃ４−Ｃ１２のヘテロアリール基としては例えば２−チエニル基、３−チエニル基等のイオウ原子をその環構造に１個以上含有するヘテロ芳香環、２−インドリル基、３−インドリル基、２−イミダゾリル基、４−イミダゾリル基、５−イミダゾリル基等の窒素原子をその環構造に１〜４個含有するヘテロ芳香環をあげることができ、Ｃ１−Ｃ３アルキル基としてはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基をあげることができる。
【００５３】
ケトン化合物（７）として具体的には、ピルビン酸、β−ヒドロキシピルビン酸、２−ケト−３−メルカプトプロピオン酸、２−ケト−３−ヒドロキシ酪酸、２−ケト−４−（メチルチオ）酪酸、３−メチル−２−オキソ酪酸、４−メチル−２−オキソ吉相酸、３−メチル−２−オキソ吉相酸、トリメチルピルビン酸、フェニルピルビン酸、４−クロロフェニルピルビン酸、４−シアノフェニルピルビン酸、α−ナフチルピルビン酸、β−ナフチルピルビン酸、ｐ−ヒドロキシベンゾイル蟻酸、２−ケト−４−フェニル酪酸、３−（２−チエニル）ピルビン酸、３−ヒドロキシ−３−フェニルピルビン酸、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、インドール−３−ピルビン酸、オキサロ酢酸、２−ケトスクシナミックアシッド、α−ケトグルタル酸、２−ケト−５−アミノ−５−オキソペンタン酸、２−ケト−６−アミノヘキサン酸、２−ケト−５−グアニジノペンタン酸、２−ケト−３−（４−イミダゾリル）プロピオン酸、２−ケト酪酸、３―ケト酪酸、３−ケト−３−フェニルプロピオン酸等が挙げられる。
【００５４】
また、本製造方法３において、アミノ基含有化合物（２）は、本製造方法２に準拠して使用することができる。ただし、光学活性アミノ化合物（８）とは異なる化合物であることが必要である（但し、その異なりが、光学異性、幾何異性等の立体異性のみに基づく場合には、ここでは異なる化合物とは見なさない）。即ち、本製造方法３において選択されるアミノ基含有化合物（２）と光学活性アミノ化合物（８）との組み合わせにおいて、アミノ基含有化合物（２）におけるＲ2と光学活性アミノ化合物（８）におけるＸ4−（ＣＲ7Ｒ8）p−基とが同一で、且つアミノ基含有化合物（２）におけるＲ3と光学活性アミノ化合物（８）における−（ＣＨ2）q−ＣＯＯＨ基とが同一であることはない。
【００５５】
本製造方法３は、本製造方法２において記載した条件等に準拠して実施することができる。
本製造方法３により得られる光学活性アミノ化合物（８）は、公知の処理方法により、反応液から回収できる。例えば、反応液から遠心分離により微生物の培養物、その処理物等を分離後、イオン交換クロマトグラフィー等の手法により光学活性アミノ化合物（８）が得られる。
【００５６】
本製造方法３により製造し得る光学活性アミノ化合物（８）としては、一般式（８）において特定された立体配置を有する例えば以下の化合物を挙げることができる。
アラニン、セリン、システイン、トレオニン、メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、フェニルアラニン、ｐ−クロロフェニルアラニン、ｐ−シアノフェニルアラニン、α−ナフチルアラニン、β−ナフチルアラニン、ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、３−（２−チエニル）アラニン、フェニルセリン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、２−アミノ酪酸等のα−アミノ酸、３−アミノ酪酸、３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸等のβ−アミノ酸等。
【００５７】
アミン化合物（１３）に、ケトン化合物（１１）の存在下、本蛋白質を作用させることにより、アミノ化合物異性体（９）の比率を向上させることができる（以下、本向上方法Ａと記す）。
【００５８】
本向上方法Ａにおいて、アミノ化合物異性体（９）の比率を向上させるとは、アミノ基含有化合物（１３）のアミノ基に結合する不斉炭素に基づく２種の光学異性体のうち、アミノ化合物異性体（９）とは異なる異性体に対するアミノ化合物異性体（９）の比率を向上させることを意味する。
【００５９】
ケトン化合物（１１）におけるＲ10は、置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基（Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換Ｃ１−Ｃ６アルキル基）、置換されていてもよいフェニル基（フェニル基、置換フェニル基）、置換されていてもよいＣ７−Ｃ１０フェニルアルキル基（Ｃ７−Ｃ１０フェニルアルキル基、置換Ｃ７−Ｃ１０フェニルアルキル基）を表わす。
【００６０】
ここで、上記の「置換」とは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、フェニル基またはＣ７−Ｃ１０フェニルアルキル基の水素原子の１個以上、通常はＣ１−Ｃ６アルキル基の水素原子の１〜２個、フェニル基の水素原子の１〜２個あるいはＣ７−Ｃ１０フェニルアルキル基の水素原子の１〜３個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ２ハロゲン化アルキル基、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、メチルチオ基およびハロゲン原子、好ましくは、メチル基、エチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、メチルチオ基、フッ素原子、塩素原子及び臭素原子からなる群より選択される１種または２種以上の置換基で置換されていることを意味する。
【００６１】
Ｃ１−Ｃ６アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、１−メチルプロピル基、２−メチルプロピル基、ペンチル基、ヘキシル基等のＣ１−Ｃ６（直鎖または分岐）アルキル基をあげることができ、Ｃ７−Ｃ１０フェニルアルキル基としては、ベンジル基、２−フェニルエチル基、３−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、α−メチルベンジル基等のＣ７−Ｃ１０フェニル（直鎖または分岐）アルキル基をあげることができる。
【００６２】
置換Ｃ１−Ｃ６アルキル基として具体的には、例えばカルボキシメチル基、カルボキシエチル基、１−アミノエチル基、３−アミノプロピル基、４−アミノブチル基、ヒドロキシメチル基、メチルチオエチル基等を挙げることができ、置換フェニル基として具体的には、例えばｐ−ヒドロキシフェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｍ，ｐ−ジヒドロキシフェニル基等を挙げることができ、置換Ｃ７−Ｃ１０フェニルアルキル基として具体的にはｐ−ヒドロキシフェニルエチル基、ｐ−クロロフェニルメチル基、１−フェニル−１−ヒドロキシメチル基等をあげることができる。
【００６３】
Ｒ11としては、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基等のＣ１−Ｃ６（直鎖または分岐）アルキル基；カルボキシル基；メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロピルオキシカルボニル基、ブチルオキシカルボニル基等のＣ２−Ｃ５（直鎖または分岐）アルキルオキシカルボニル基等をあげることができる。
【００６４】
ケトン化合物（１１）として具体的には、例えばアセトン、２−ブタノン等のケトン類、プロピオンアルデヒド、ベンズアルデヒド等のアルデヒド類、オキサロ酢酸、ピルビン酸、α−ケト酪酸等のケト酸類、ピルビン酸ナトリウム等前記ケト酸類のアルカリ金属塩、ピルビン酸メチル等のケト酸類のアルキルエステル等をあげることができる。
【００６５】
アミノ基含有化合物（１３）において、Ｘ5は置換されていてもよいＣ１−Ｃ９アルキル基（Ｃ１−Ｃ９アルキル基、置換Ｃ１−Ｃ９アルキル基）、置換されていてもよいＣ６−Ｃ１４アリール基（Ｃ６−Ｃ１４アリール基、置換Ｃ６−Ｃ１４アリール基）、置換されていてもよいＣ７−Ｃ１７アリールアルキル基（Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基、置換Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基）、置換されていてもよいＣ４−Ｃ１２ヘテロアリール基（Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基、置換Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基）、置換されていてもよいＣ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基（Ｃ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基、置換Ｃ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基）、アミノ基、アミノカルボニル基、水酸基、チオール基、グアニジル基、シアノ基、ハロゲン原子又は水素原子を表わす。ここで上記の「置換」とは、Ｃ１−Ｃ９アルキル基、Ｃ６−Ｃ１４アリール基、Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基、Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基またはＣ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基における水素原子の１個以上、通常はＣ１−Ｃ９アルキル基における水素原子の１〜２個、Ｃ６−Ｃ１４アリール基における水素原子の１〜２個、Ｃ７−Ｃ１７アリールアルキル基における水素原子の１〜２個、Ｃ４−Ｃ１２ヘテロアリール基における水素原子の１〜２個またはＣ５−Ｃ１５ヘテロアリールアルキル基における水素原子の１〜２個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ２ハロゲン化アルキル基、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ２アルキルチオ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基及びハロゲン原子からなる群より選ばれる１種または２種以上の置換基で置換されていることを意味する。
該置換基の好ましい例としては、メチル基、エチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、フッ素原子、塩素原子及び臭素原子をあげることができる。
【００６６】
本向上方法Ａにおいて用いられるアミノ基含有化合物（１３）における光学異性体の比率は、特に限定されないが、工業的な見地からは、通常、アミノ基含有化合物（１３）がラセミ体で供給されることが多いので、アミノ基含有化合物（１３）としてはラセミ体を用いることが有利である。
【００６７】
本向上方法Ａは通常、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩などの無機酸塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩等を含む水性バッファー液中で行われ、ケトン化合物（１１）及びアミノ基含有化合物（１３）の本向上方法Ａの反応液中における濃度はそれぞれ通常３０％（ｗ／ｖ）程度以下が適しており、好ましくは０．０１〜２０％（ｗ／ｖ）程度である。また、アミノ基含有化合物（１３）に対するケトン化合物（１１）の重量割合は、一般的には０．０１〜１００程度であるが、アミノ基含有化合物（１３）に対するケトン化合物（１１）の重量割合を例えば１〜１０等のように比較的大きく設定することが、反応速度やアミノ化合物異性体（９）の収率等の点で有利なことが多い。本蛋白質の量は、例えば反応時間や生成するアミノ化合物異性体（９）の選択性等を考慮して適宜決めることができる。例えば本蛋白質が精製酵素または粗酵素として用いられる場合、その量はアミノ基含有化合物（１３）に対して、通常は０．００１〜２重量倍、好ましくは０．００２〜０．５重量倍であり、一方、本蛋白質が微生物の培養物、微生物の菌体、かかる菌体の処理物等として用いられる場合、微生物の培養物、微生物の菌体、かかる菌体の処理物等の量はアミノ基含有化合物（１３）に対して、通常は０．０１〜２００重量倍、好ましくは０．１〜５０重量倍である。反応温度は通常、１０〜７０℃程度が適しており、好ましくは２０〜６０℃程度である。反応液のｐＨは通常４〜１２程度が適しており、好ましくは５〜１１程度である。反応時間は、任意に設定することができるが、通常は約１時間〜７日間程度である。一般に反応時間を長くすれば、変換率の増大に伴ってアミノ化合物異性体（９）の比率（光学純度は向上する。
また、予めアミノ基アミノ基含有化合物（１３）を添加した培地に、本蛋白質を産生する微生物を接種し、該微生物を培養しながら培地に添加したアミノ基含有化合物（１３）に本蛋白質を作用させてもよい。
【００６８】
さらに界面活性剤、補酵素、有機溶媒等を補助剤として本向上方法Ａの反応系内に共存させると、反応時間の短縮やアミノ化合物異性体（９）の収率等の点で有利な場合があり、必要に応じてこれらの補助剤を単独又は適宜組み合わせて反応液に添加することもできる。使用し得る界面活性剤として具体的には、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、臭化セチルピリジウム等を挙げることができ、また補酵素として具体的には、例えばピリドキサル−５−リン酸（ＰＬＰ）等を挙げることができる。また有機溶媒として具体的には、例えば、ｎ−ヘプタン、シクロヘキサン、イソオクタン等のアルカン類、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル等のエーテル類、メタノール、イソプロパノール、ｎ−オクタノール等のアルコール類、ＤＭＳＯ等のスルホキシド類等をあげることができる。
【００６９】
本向上方法Ａにより得られるアミノ化合物異性体（９）比率の向上したアミノ含有化合物（１３）は、公知の処理方法により反応液から回収することができる。例えば、反応液から遠心分離により微生物の培養物、微生物の菌体、かかる菌体の処理物を分離後、上清液を酸性に調整し、ジエチルエーテルやトルエン等の有機溶媒で抽出・分液して有機層を除き、次いで水層を塩基性として同様な有機溶媒で抽出・分液し、水層を除いた後、該溶媒を減圧留去し、必要によりさらに蒸留等の精製を加えて、あるいは前記上清液をイオン交換クロマトグラフィー等の手法により精製して回収できる。
【００７０】
アミノ基含有化合物（１０）に、ケトン化合物（１１）の存在下、本蛋白質を作用させることにより、アミノ化合物異性体（１２）の比率を向上させることができる（以下、本向上方法Ｂと記す）。
【００７１】
アミノ基含有化合物（１０）におけるＸ6は置換されていてもよいフェニル基（フェニル基、置換フェニル基）、置換されていてもよいナフチル基（ナフチル基、置換ナフチル基）を表わす。ここで、上記の「置換」とは、フェニル基またはナフチル基の水素原子の１個以上、通常はフェニル基の水素原子の１〜２個またはナフチル基の水素原子の１〜２個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ２ハロゲン化アルキル基、Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基及びハロゲン原子からなる群より選ばれる１種または２種以上の置換基で置換されていることを意味する。該置換基の好ましい例としては、メチル基、エチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、フッ素原子、塩素原子及び臭素原子をあげることができる。
Ｒ12はＣ１−Ｃ６アルキル基を表わし、好ましくはＣ１−Ｃ３アルキル基をあげることができ、さらに好ましくはメチル基及びエチル基をあげることができる。
【００７２】
アミノ基含有化合物（１０）として具体的には、例えば1−フェニルエチルアミン、１−（２−メトキシフェニル）エチルアミン、１−（３−メトキシフェニル）エチルアミン、１−（２、４−ジクロロフェニル）エチルアミン、１−（３、４−ジクロロフェニル）エチルアミン、１−（３−シアノフェニル）エチルアミン、１−（４−ヒドロキシフェニル）エチルアミン、１−（４−メトキシフェニル）エチルアミン、１-（４-メチルフェニル）エチルアミン、１−（４−クロロフェニル）エチルアミン、１−（３、４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−メトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−クロロフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−メチルフェニル）−２−アミノプロパン、１−（３、４−メチレンジオキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−フェニル−１−アミノプロパン、1−（α−ナフチル）エチルアミン、1−（β−ナフチル）エチルアミン等をあげることができる。
【００７３】
本向上方法Ｂにおいて用いられるアミノ基含有化合物（１０）における光学異性体の比率は、特に限定されないが、工業的な見地からは、通常、アミノ基含有化合物（１０）がラセミ体で供給されることが多いので、アミノ基含有化合物（１０）としてはラセミ体を用いることが有利である。
本向上方法Ｂは、本向上方法Ａにおいて記載した条件等に準拠して実施することができる。本向上方法Ｂにおいて、アミノ化合物異性体（１２）の比率を向上させるとは、アミノ基含有化合物（１０）のアミノ基に結合する不斉炭素に基づく２種の光学異性体のうち、アミノ化合物異性体（１２）とは異なる異性体に対するアミノ化合物異性体（１２）の比率を向上させることを意味する。
本向上方法Ｂにより得られるアミノ化合物異性体（１２）比率の向上したアミノ基含有化合物（１０）は、公知の処理方法により反応液から回収することができる。例えば、反応液から遠心分離により微生物の培養物、微生物の菌体、かかる菌体の処理物を分離後、上清液を酸性に調製し、ジエチルエーテルやトルエン等の有機溶媒で抽出・分液して有機層を除き、次いで水層を塩基性として同様な有機溶媒で抽出・分液し、水層を除いた後、該溶媒を減圧留去し、必要によりさらに蒸留等の精製を加えて回収できる。
【００７４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１から８における光学活性アミノ化合物の定量分析は下記（１）の条件にてガスクロマトグラフィーで行い、光学純度分析は下記（２）の条件にてＨＰＬＣで行った。また実施例１２から１５における光学活性アミノ化合物の定量分析および光学純度分析は、下記（３）の誘導化処理の後、下記（４）の条件にてＨＰＬＣで行った。
【００７５】
（１）アミノ化合物の定量分析（ガスクロマトグラフィー）
・カラム：ＤＢ−１７（内径０.２５ｍｍ、膜厚０．２５μｍ、長さ３０ｍ、Ｊ＆Ｗ社製）
・カラム温度条件：８０℃〜２５０℃まで昇温（昇温速度 ５℃／分）
・検出器：ＦＩＤ（検出器温度２５０℃）
（２）アミノ化合物の光学純度分析（ＨＰＬＣ）
・カラム：ＯＡ−４１００またはＯＡ−４８００（住化分析センター(株)製）
・移動相：ｎ−ヘキサン：エタノール：トリフルオロ酢酸＝２４０：１０：１
検出波長：２５４ｎｍ
（３）アミノ化合物の誘導化
反応液５０μｌに、４ｍｇ／ｍｌの2,3,4,6-テトラ−Ｏ−アセチル β−グルコピラノシル イソチオシアネート（ＧＩＴＣ、和光純薬製）のアセトニトリル溶液１００μｌおよび２ｍｇ／ｍｌのトリエチルアミンのアセトニトリル溶液５０μｌを添加し、３０℃で３０分間静置する。０．２μｍフィルターでろ過した後のろ液をＨＰＬＣ用サンプルとする。
（４）アミノ化合物の定量および光学純度分析（ＨＰＬＣ）
・カラム：スミパックスＯＤＳ Ｌ−０３−４６１５（住化分析センター製）
カラム温度：３５℃
流速：１ｍｌ／分
検出波長：ＵＶ２５４ｎｍ
溶出液Ａ：２０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ３．７）
溶出液Ｂ：アセトニトリル
溶出条件：分析化合物により溶出液中のＢの割合を１０〜６０％に変更する
【００７６】
実施例１（本蛋白質の精製）
（１）グリセロール０．２％（ｗ／ｖ）、ピルビン酸ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、（Ｒ）−１−フェニルエチルアミン０．２％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．４５％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム０．３％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム０．０１％（ｗ／ｖ）、硫酸第一鉄７水和物０．０００１％（ｗ／ｖ）、硫酸亜鉛７水和物０．０００１％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン３水和物０．０００１％（ｗ／ｖ）、塩化コバルト６水和物０．０００１％（ｗ／ｖ）の組成の滅菌培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを入れた５００ｍＬ容坂口フラスコに、予め同じ組成の培地にて培養された Mycobacterium aurum ＳＣ−Ｓ４２３株の培養液を１ｍＬ植菌して、30℃で往復振盪しながら７日間培養した。このようにして得られた培養液４Ｌから遠心分離(１０、０００×Ｇ、１０分間)によって菌体を集め、得られた湿菌体を１００ｍＬの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）にて２回洗浄することにより、１８ｇの湿菌体を得た。
【００７７】
（２）該湿菌体１６ｇを、２０μＭ−ピリドキサール−５−リン酸（以下、ＰＬＰと記す。）を含む２０ｍＭビストリスプロパン（ｐＨ７．０）６０ｍｌに懸濁した。これを、超音波破砕機（SONIFIER (Branson Sonic Power社登録商標)）にて２０分間破砕処理し、菌体破砕液を得た。該菌体破砕液を１３、０００×ｇで１５分間遠心分離した後、メンブレンフィルター(０．４５μ)にてろ過し、ろ液を回収してこれを無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液を Q Sepharose FFカラム（２６ｍｍφ×１０ｃｍ、アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に導入し、２０ｍＭビストリスプロパン（ｐＨ７．０）中で塩化ナトリウム直線濃度勾配（濃度勾配０．０１Ｍ／ｍｉｎ 、濃度範囲０Ｍ〜０．６Ｍ 、流速８ｍｌ／ｍｉｎ）により溶出させる陰イオン交換クロマトグラフィーを行った。塩化ナトリウム濃度０．３５Ｍから０．４５Ｍにて溶出された画分８０ｍｌを回収した。この画分のうちの６３ｍｌに終濃度０．８Ｍになるように硫安を添加した後、これをPhenyl-Sepharose HPカラム（１６ｍｍφ×１０ｃｍ、アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に導入し、２０ｍＭビストリスプロパン（ｐＨ７．０）中で硫酸アンモニウム直線濃度勾配（濃度勾配０．００８Ｍ／ｍｉｎ 、濃度範囲０．８Ｍ〜０Ｍ 、流速３ｍｌ／ｍｉｎ ）により溶出させる疎水クロマトグラフィーを行った。硫酸アンモニウム濃度０．４Ｍから０．３５Ｍにて溶出された画分２４ｍｌを回収し、これを酵素液とした。
【００７８】
（３）（２）で得られた酵素液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル：PhastGel Gradient 10-15、バッファーストリップ：PhastGel SDS buffer strip、システム：Phast System（いずれもアマシャム ファルマシア バイオテク社製））で解析したところ、ほぼ単一のバンドが検出された。
また、当該酵素液を、ゲルろ過カラムＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（６００ｍｍ×７．５ｍｍＩＤ、東ソー社製）に導入し、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて溶出したところ、分子量約３１０kDaに相当する位置に光学活性アミノ化合物生成活性が溶出された。
【００７９】
実施例２
実施例１で得られた酵素液２００μｌを、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）で２００μｌに希釈し、これを、１０μｍｏｌのアセトフェノン、１００μｍｏｌのラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミン、０．０２μｍｏｌのＰＬＰを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）溶液８００μｌに添加し、４０℃にて、７１時間保温した。保温後、反応液中の光学活性アミノ化合物の定量分析を行った。その結果、１−フェニルエチルアミン収率は１９．９％であり、その光学異性体の比率はＲ−体が１００％であった。
【００８０】
実施例３
実施例１で得られた酵素液２００μｌを０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）で２００μｌに希釈し、これを、１０μｍｏｌのアセトフェノン、１００μｍｏｌのＤ−アラニン、０．０２μｍｏｌのピリドキサール−５−リン酸（ＰＬＰ）を含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．０）水溶液８００μｌに添加して４０℃にて、３時間保温した。次いで、該反応液の一部を取り、アミノ化合物の定量分析を行った。その結果、１−フェニルエチルアミンの収率は２．６％であり、その光学異性体の比率はＲ−体が１００％であった。
【００８１】
実施例４
表１に示したラセミ体のアミノ化合物５μｍｏｌ、ピルビン酸ナトリウム１０μｍｏｌ、ＰＬＰ０．０１μｍｏｌを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６）３６０μｌに、ラセミ体のアミノ化合物として１−フェニルエチルアミンを用いる場合には実施例１で得られた酵素液１４０μｌを添加し、１−（３，４−ジクロロフェニル）−エチルアミン又は１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンを用いる場合には実施例１で得られた酵素液を０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６）を用いて２倍に希釈したもの１４０μｌを添加して、４０℃で１時間反応させた。反応液中に残存したアミノ化合物の光学異性体の比率を調べた。結果を表１に示す。
【００８２】
【表１】
実施例５
（１） グリセロール０．２％（ｗ／ｖ）、ピルビン酸ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、（Ｒ）−１−フェニルエチルアミン０．２％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．４５％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム０．３％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム０．０１％（ｗ／ｖ）、硫酸第一鉄７水和物０．０００１％（ｗ／ｖ）、硫酸亜鉛７水和物０．０００１％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン３水和物０．０００１％（ｗ／ｖ）、塩化コバルト６水和物０．０００１％（ｗ／ｖ）の組成の滅菌培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを入れた５００ｍＬ容坂口フラスコに、予め同じ組成の培地にて培養された Mycobacterium aurum ＳＣ−Ｓ４２３株培養液を１ｍＬ植菌して、30℃で往復振盪しながら７日間培養した。
【００８４】
（２） この培養液から遠心分離(１００００×ｇ、１０分間)によって菌体を集め湿菌体を得た。
【００８５】
（３） 得られた湿菌体を２ｍＬの１００ｍＭグリシンバッファー（ｐＨ９．０）に懸濁した。０．２％（ｖ／ｖ）ラセミ体の１−フェニルエチルアミン水溶液（ｐＨ９．０）１２６０μＬに対し、２．２％（ｗ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム水溶液２００μＬ、１００ｍＭグリシンバッファー（ｐＨ９．０）４４０μＬを添加し、さらに上記菌体懸濁液を１００μＬ添加し、３０℃、２１．５時間インキュベーションした。反応液の一部を取り、２倍量のメタノールを添加、充分な攪拌の後、遠心分離により菌体を除去した上清液をガスクロマトグラフィーにて分析したところ、５４％の１−フェニルエチルアミンが消失していた。また、残った反応液のｐＨを水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ１２に調整した後、ジエチルエーテルを用いて残存した１−フェニルエチルアミンを抽出した。抽出液中の１−フェニルエチルアミンの光学純度をＨＰＬＣを用いて測定したところ、（Ｒ）体／（Ｓ）体の比は０／１００であった。
【００８６】
実施例６
（１） 実施例５（１）と同じ方法により５００ｍＬ容坂口フラスコ１０本にて培養して得られた培養液１Ｌから遠心分離(１０、０００×ｇ、１０分間)によって菌体を集め、得られた湿菌体を５０ｍＬの蒸留水に懸濁した。
【００８７】
（２） ２００μＬのラセミ体の１−フェニルエチルアミンと９００μＬの２Ｎ硫酸水溶液を蒸留水１００ｍｌに溶解させたラセミ体の１−フェニルエチルアミン水溶液６３０μＬに２．２％（ｗ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム水溶液１００μＬを添加し、そこへ種々のｐＨに調整した１Ｍのバッファー（ｐＨ５〜６はクエン酸バッファー、ｐＨ６〜８はリン酸バッファー、ｐＨ８〜９はトリス塩酸バッファー、ｐＨ９〜１０はグリシンバッファー、ｐＨ１１は炭酸バッファーを使用）１００μｌと蒸留水７０μＬを加えて、さらに上記菌体懸濁液を１００μＬ添加し、反応を開始した。３０℃、１時間インキュベーションしたのち、反応液の一部を取り、２倍量のメタノールを添加し、充分に攪拌した後、遠心分離により菌体を除去し、上清液を分取してガスクロマトグラフィーにて分析した。アミンの消失速度をｐＨ６（クエン酸バッファー）を１００とした相対値で比較した。結果を表２に示す。
【００８８】
【表２】
実施例７
２００μＬのラセミ体の１−フェニルエチルアミンと９００μＬの２Ｎ硫酸水溶液を蒸留水１００ｍｌに溶解させたラセミ体の１−フェニルエチルアミン水溶液６３０μＬに２．２％（ｗ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム水溶液１００μＬを添加し、そこへ１ＭのｐＨ９に調整したグリシンバッファー１００μｌと蒸留水７０μＬとを加えて、さらに実施例６（１）と同様にして得られた菌体懸濁液を１００μＬ添加し、反応を開始した。２０℃〜６０℃の各温度にて、１時間インキュベーションした後、反応液の一部を取り、２倍量のメタノールを添加した。この混合物を充分に攪拌した後、遠心分離により菌体を除去し、上清液を分取してガスクロマトグラフィーにて定量分析した。アミノ化合物の消失速度を５０℃を１００とした相対値で比較した。結果を表３に示す。
【００９０】
【表３】
実施例８
０．０２％（ｖ／ｖ）ラセミ体の１−（２、４−ジクロロフェニル）エチルアミン水溶液（ｐＨ９．０）１３７０μＬに対し、２．２％（ｗ／ｖ）ピルビン酸ナトリウム水溶液２００μＬ、１００ｍＭグリシンバッファー（ｐＨ９．０）２３０μＬを添加し、さらに実施例６（１）で得られた菌体懸濁液のうち２００μＬを添加し、３０℃、１１０時間インキュベーションした。反応液の一部を取り、２倍量のメタノールを添加し、充分に攪拌した後、遠心分離により菌体を除去し、上清液を分取してガスクロマトグラフィーにて定量分析した。その結果４６％の１−（２、４−ジクロロフェニル）エチルアミンが消失していた。また、残った反応液のｐＨを水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ１２に調整した後、ジエチルエーテルを用いて残存した１−（２、４−ジクロロフェニル）エチルアミンを抽出した。抽出液中の１−（２、４−ジクロロフェニル）エチルアミンの光学純度をＨＰＬＣを用いて測定したところ、（Ｒ）体／（Ｓ）体の比は２０／８０であった。
【００９２】
実施例９
実施例１で得られた酵素液２ｍｌを、４回に分けて逆相カラムを用いたＨＰＬＣに供した。該逆相ＨＰＬＣの条件を以下に示す。
[逆相ＨＰＬＣ条件]
カラム：Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＲＰ、２５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ、粒径５μｍ
（YMC（株）製）
カラム温度：室温
流速：１ｍｌ／分
検出：ＵＶ２３０ｎｍ
溶出液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸を含む蒸留水
溶出液Ｂ：０．０８％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル
溶出条件：溶出液Ａで平衡化させたカラムにサンプルをアプライし、以後、４０分間かけて溶出液Ｂの割合を０％から８０％に上げながら、溶出液Ａと溶出液Ｂとの混合液で溶出させる。
【００９３】
溶出液Ｂの割合が６０％付近の溶出液で溶出した画分を分取した。得られた画分約３ｍｌ（約８００μｌ×４回分）を凍結乾燥した後、その一部の凍結乾燥サンプルを気相プロテインシークエンサー４７０Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）に供することにより、本蛋白質のアミノ末端のアミノ酸配列を調べた。その結果、当該蛋白質は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有することが判った。
【００９４】
また、残りの凍結乾燥サンプルを蒸留水に溶解した後、これに１ｍｇ／ｍｌトリプシン溶液を２μｌを加え、３７℃で２４時間保温した。保温後の溶液を逆相ＨＰＬＣに供しトリプシン消化物を分離精製した。逆相ＨＰＬＣの条件を以下に示す。
【００９５】
[逆相ＨＰＬＣ条件]
カラム：ＯＤＳ−Ａ２１１、２５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ、粒径５μｍ
（住化分析センター 製）
カラム温度：室温
流速：１ｍｌ／分
検出：ＵＶ２３０ｎｍ
溶出液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸／水
溶出液Ｂ：０．０８％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル
溶出条件：溶出液Ａが９５％、溶出液Ｂが５％の割合で混合された溶出液で平衡化したカラムにサンプルをアプライし、以後、６０分間かけて溶出液Ｂの割合を６５％まで上げながら、溶出液Ａと溶出液Ｂとの混合液で溶出させる。
【００９６】
得られた各トリプシン消化物について前記と同様の方法によりアミノ酸配列を調べた。その結果、当該消化物は配列番号４で示されるアミノ酸配列及び配列番号５で示されるアミノ酸配列を有することが分かった。
【００９７】
実施例１０
（１）Mycobacterium aurum SC-S4-23株の染色体ＤＮＡの調製
グルコース０．５％（ｗ／ｖ）、ペプトン１．０％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１．２５％（ｗ／ｖ）、マルトエキス１．０％（ｗ／ｖ）および塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ）の組成の滅菌培地（ｐＨ７．０）に、Mycobacterium aurum SC-S4-23株を植菌し、６４時間培養した後、得られた培養液１０００ｍｌから遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を、Ｄ−シクロセリン１００μｇ／ｍｌ、グリシン１．４（ｗ／ｖ）％、ＥＤＴＡ６０ｍＭ、リゾチーム２００μｇ／ｍｌの組成の滅菌培地９００ｍｌに再懸濁し、３０℃、２１時間インキュベートした。
該懸濁液９００ｍｌを遠心分離して菌体を回収した。得られた菌体を、１０ｍｌの緩衝液（ｐＨ8.０、トリス５０ｍＭ、ＥＤＴＡ５０ｍＭ、ＮａＣｌ１００ｍＭを含む）に再懸濁した。これに最終濃度が０．5％となるようＳＤＳを加え、さらに最終濃度が２００μｇ／ｍｌとなるようＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（ベーリンガーマンハイム社製）を加え、５５℃にて１８時間インキュベートした。
インキュベートした懸濁液からフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール法によりＤＮＡを抽出した後、抽出画分に−２０℃に冷却したエタノールを添加し、析出してくるＤＮＡをガラス棒にて巻き取った。このＤＮＡを風乾した後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．0）に溶解させ、これにＲＮＡａｓｅを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるよう添加し、３７℃、１時間保温した。これを染色体ＤＮＡ試料とした。
【００９８】
（２）プライマー合成
配列番号４で示されるアミノ酸配列に基づいて、配列番号６で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物（以下、プライマーＧ２４−１と記す。）を合成した。また、配列番号５で示されるアミノ酸配列に基づきいて、配列番号７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの混合物（以下、プライマーＲＧ３２−１と記す。）を合成した。尚、オリゴヌクレオチドの合成には、ＤＮＡ自動合成装置モデル380A（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。
【００９９】
（３）本遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡのＰＣＲによる増幅とクローニングＩ
（２）で合成されたプライマーＧ２４−１およびプライマーＲＧ３２−１を用い、（１）にて調製した染色体ＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲの条件を以下に示す。反応液の調製には、CLONTECH社製のAdvantage cDNA PCR Kitを使用した。
【０１００】
[反応液組成]
染色体ＤＮＡ試料（1ng／μｌ） １μｌ
プライマー（各10μＭ） 各０．５μｌ×２種
×50 dNTPs ｍｉｘ（各１０ｍＭ ） ０．５μｌ
×10 cDNA PCR Reaction Buffer ２．５μｌ
×50 Advantage cDNA Polymerase Mix ０．５μｌ
超純水 １９．５μｌ
[反応温度条件]
１） ９４℃ １分間
２） ９４℃ ３０秒間
３） ６８℃ ３分間
４） ９４℃ ２０秒間
５） ６８℃ ３分間
６） ６８℃ ３分間
ただし、４）から５）を１サイクルとしてこれを３４サイクル繰り返す。
【０１０１】
反応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して生成物を調べた結果、約８００ｂｐのＤＮＡの増幅が確認された。該ＤＮＡを、TA cloning kit（Invitrogen社製）を用いて、プラスミドベクターｐCR2.1の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、ライゲーションしたＤＮＡをE．coli JM109株に導入し(東洋紡製compitent high JM109を使用)、形質転換体を取得した。
次いで、得られた形質転換体の保有するプラスミドのＤＮＡを調製し、Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kitと自動塩基配列解析装置373A（社）を用いてその塩基配列を決定した。その結果、このプラスミドには、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号２３１〜９６０で表わされる塩基配列（７３０ｂｐ）を有するＤＮＡが含まれることが判明した。
【０１０２】
（４）本遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡのＰＣＲによる増幅とクローニングＩＩ
（３）で得られた７３０ｂｐの塩基配列をもとにして、配列番号８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
（１）に記載の方法にて調製した染色体ＤＮＡを、制限酵素Sau3A1で部分分解し、これをプラスミドベクターpUC118のマルチクローニングサイトにライゲーションした。次いで、ライゲーションしたＤＮＡを鋳型とし、配列番号８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、ＲＶプライマー（宝酒造社製）とをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件を以下に示す。反応液の調製にはCLONTECH社製のAdvantage cDNA PCR Kitを使用した。
[反応液組成]
鋳型ＤＮＡ ５μｌ
プライマー （各１０μＭ） 各１μｌ×２種
×50 dNTPs ｍｉｘ（各１０ｍＭ ） １μｌ
×10 cDNA PCR Reaction Buffer ５μｌ
×50 Advantage cDNA Polymerase Mix １μｌ
超純水 ３６μｌ
［反応条件］
１）94℃（１分）
２）94℃（０．5分）
３）68℃（3分）
４）68℃（3分）
ただし、２）から３）を１サイクルとしてこれを３０サイクル繰り返す。
反応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して生成物を調べた結果、約１ｋｂｐのＤＮＡの増幅が確認された。該ＤＮＡを、TA cloning kit（Invitrogen社製）を用いて、プラスミドベクターｐCR2.1の「PCR Product挿入サイト」にライゲーションし、ライゲーションしたＤＮＡをE．coli JM109株に導入し(東洋紡製compitent high JM109を使用)、形質転換体を取得した。得られた形質転換体の保有するプラスミドのＤＮＡを調製し、（３）と同様の方法で塩基配列を決定した。その結果、このプラスミドには、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜２３０で表わされる塩基配列が含まれることが判明した。
【０１０３】
（５）本遺伝子の部分塩基配列を有するＤＮＡのＰＣＲによる増幅とクローニングＩＩＩ
（３）で得られた７３０ｂｐの塩基配列をもとにして、配列番号９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
（１）に記載の方法にて調製した染色体ＤＮＡを、制限酵素EcoRIで分解し、これをEcoRI Cassette（宝酒造株式会社製）とライゲーションした。反応液調製には宝酒造株式会社製のTakara LA PCR in vitro Cloning Kitを使用した。条件を以下に示す。
[反応液組成]
制限酵素処理ＤＮＡ ５μｌ
EcoRI Cassette ２．５μｌ（２０ｎｇ／μｌ）
ligation kit ver2 solnＩ １５μｌ
ligation kit ver2 solnＩＩ ７．５μｌ
16℃、30分反応後、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し、ＴＥバッファー５μｌに溶解した。
得られたＤＮＡの溶解液１μｌに、超純水１３．５μｌを加え、９４℃、１０分間加熱した。これを鋳型とし、配列番号９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、Cassette Primer C1（宝酒造株式会社製）とをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件を以下に示す。反応液調製には宝酒造株式会社製のTakara LA PCR in vitro Cloning Kitを使用した。
[反応液組成]
鋳型ＤＮＡ １４．5μｌ
プライマー （各１０μＭ） 各１μｌ×２種
dNTPs ８μｌ
×2 GC Buffer ２５μｌ
LA Taq ０．５μｌ（２．５Ｕ）
［反応条件］
１）94℃（０．5分）
２）55℃（2分）
３）72℃（3分）
【０１０４】
ただし、１）から３）を１サイクルとしてこれを３０サイクル繰り返す。
次いで、上記反応後の反応液を１０倍に希釈してその１μｌを鋳型とし、配列番号１０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、Cassette Primer C2（宝酒造株式会社製）とをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件を以下に示す。反応液調製には宝酒造株式会社製のTakara LA PCR in vitro Cloning Kitを使用した。
[反応液組成]
鋳型ＤＮＡ １μｌ
プライマー （各１０μＭ） 各１μｌ×２種
dNTPs ８μｌ
×2 GC Buffer ２５μｌ
LA Taq ０．５μｌ（２．５Ｕ）
超純水 １３．５μｌ
［反応条件］
１）94℃（０．5分）
２）55℃（2分）
３）72℃（3分）
ただし、１）から３）を１サイクルとしてこれを３０サイクル繰り返す。
反応後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供して生成物を調べた結果、ＤＮＡの増幅が確認された。該ＤＮＡ断片をゲルから回収し、pT７blue T-vector（Novagen社製）に゛クローニングした。得られたプラスミドのＤＮＡを調製し、（３）と同様の方法で塩基配列を決定した。その結果、このプラスミドには、配列番号２で示される塩基配列の塩基番号９６１〜１０２０で表わされる塩基配列が含まれることが判明した。
本実施例により、Mycobacterium aurum SC-S423株由来の遺伝子は、配列番号２で示される塩基配列（１０２０ｂｐ）を有することが明らかとなった。
【０１０５】
実施例１１
実施例１０で確認された配列番号２で示される塩基配列に基づき、配列番号１１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、プライマーF-4／NcoIと記す。）および配列番号１２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（以下、プライマーR1030/BamHIと記す。）を合成した。
プライマーF-4/NcoIおよびプライマーR1030/BamH1を用い、実施例１０（１）に記載の方法にて調製した染色体ＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲの条件を以下に示す。反応液の調製には、ベーリンガー マンハイム社製のExpand High Fidelity PCR Systemを使用した。
【０１０６】
[反応液組成]
ゲノムＤＮＡ原液（０．１μｇ／μｌ） １．０μｌ
プライマー（各４ｐｍｏｌ／μｌ ） 各５．０μｌ×２種
ｄＮＴＰｍｉｘ（各２．５ｍＭ） ８．０μｌ
×10 Expand HF buffer with 15mM MgCl2 １０．０μｌ
Expand High Fidelity PCR System enzyme mix ０．７５μｌ
超純水 ７１．０μｌ
［反応条件］
１）95℃（2分）
２）96℃（15秒）
３）60℃（15秒）
４）72℃（１分）
５）72℃（10分）
ただし、２）から４）を１サイクルとしてこれを25サイクル繰り返す。
【０１０７】
反応後のＤＮＡをNcoIおよびBamHIで切断した後、Qiagen purple spin column（キアゲン社製）を用いて精製した。精製されたＤＮＡを、プラスミドベクターpTrc99a（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）のtrcプロモーター下流のNcoI、BamHIサイトにライゲーションし、ライゲーションしたＤＮＡをE．coli JM109株に導入し形質転換体を取得した。得られた形質転換体の有するプラスミドをptrc9と命名した。次いで、該プラスミドptrc9の塩基配列を、ABI Prism sequencung kit（パーキンエルマー社製）を用いて前述と同様の方法により決定した。その結果、ptrc9には配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜１０２０で表わされる塩基配列のうち、塩基番号４のａ（アデニン）がｇ（グアニン）に置換された塩基配列（１０２０ｂｐ）が含まれていることが判明した。
【０１０８】
実施例１２
アンピシリン（50μｇ/ｍｌ）とＩＰＴＧ（1ｍＭ）とを含む滅菌された５０ｍｌのＬＢ培地に、実施例１１にて調製した形質転換体 E.coli JM109/ptrc9を接種し、30℃にて一夜、振とう培養した後、遠心分離により集菌し、得られた菌体を470μlの100ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ6.0）に懸濁した。
前記菌体懸濁液に、１０μｍｏｌのアセトフェノン、４００μｍｏｌのラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミン、０．０２μｍｏｌのＰＬＰを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６）溶液５３０μｌを添加し、１３０ｒｐｍにて４０℃、６時間保温した。保温後、反応液中の１−フェニルエチルアミンの定量分析を行った。その結果、反応液中には０．４５ｍＭの１−フェニルエチルアミンが検出され、その光学異性体の比率はＲ体１００％であった。
【０１０９】
実施例１３
アンピシリン（５０μｇ/ｍｌ）とＩＰＴＧ（1ｍＭ）とを含む滅菌された５ｍｌのＬＢ培地に、実施例１１にて調製した形質転換体 E.coli JM109/ptrc9を接種し、30℃にて一夜、振とう培養した後、遠心分離により集菌し、得られた菌体を280μlの100ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ6.0）に懸濁した。
得られた菌体懸濁液に、１０μｍｏｌのラセミ体の１−フェニルエチルアミン、２０μｍｏｌのピルビン酸ナトリウム、０．０２μｍｏｌのＰＬＰを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６）溶液７２０μｌを添加し、１３０ｒｐｍにて４０℃、６０分保温した。保温後、反応液中の１−フェニルエチルアミンの定量分析を行った。その結果、１−フェニルエチルアミンの回収率は５０％であり、その光学純度はＳ体 99.5％e.e.であった。
【０１１０】
実施例１４
実施例１３と同様の方法で調製した菌体懸濁液２８０μｌに、１０μｍｏｌのＲ−１−フェニルエチルアミン、２０μｍｏｌのピルビン酸ナトリウム、０．０２μｍｏｌのＰＬＰを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６）溶液７２０μｌを添加し、１３０ｒｐｍにて４０℃、７分保温した。保温後、反応液中の光学活性アミノ化合物の定量分析を行ったところ、アラニンが５．９ｍＭ生成しており、その光学純度はＤ体が７３.８％e.e.であった。
【０１１１】
実施例１５
アンピシリン（50μｇ/ｍｌ）とＩＰＴＧ（1ｍＭ）とを含む滅菌された３０ｍｌのＬＢ培地に、実施例１１にて調製した形質転換体 E.coli JM109/ptrc9を接種し、30℃にて一夜振とう培養した後、遠心分離により集菌し、得られた菌体を２００μlの１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ6.0）に懸濁した。
上記菌体懸濁液に、３０μｍｏｌのＲ−１−フェニルエチルアミン、３０μｍｏｌのβ−ヒドロキシピルビン酸リチウム、０．０２μｍｏｌのＰＬＰを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６）溶液８２０μｌを添加し、１３０ｒｐｍにて振とうしながら４０℃、６０分保温した。保温後、反応液中の光学活性アミノ化合物の定量分析を行ったところ、セリンが２４．５ｍＭ生成しており（転換率８２％）、その光学純度はＤ体９９．４％e.e.であった。
【０１１２】
【発明の効果】
本発明によれば、アミノ基転移反応を立体選択的に触媒する能力を有する新規な蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子等が提供可能となる。
【０１１３】
[配列表フリーテキスト]
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【０１１４】
【配列表】
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a protein having the ability to stereoselectively catalyze a transamination reaction, a gene thereof, and use thereof.
[0002]
[Prior art]
General formula (3)
The optically active amino compound represented by is a compound useful as an intermediate for the synthesis of compounds used in various applications. For example,
General formula (10)
The optically active form of the amino group-containing compound represented by is a compound useful as a synthetic intermediate for pharmaceuticals such as antidiabetics, antiobesity agents, bronchodilators, and agricultural chemicals such as antifungal agents and herbicides, and And general formula (8)
The optically active amino compounds represented by are useful compounds as synthetic intermediates for pharmaceuticals such as blood coagulation inhibitors, anticancer agents, growth disorder inhibitors and the like.
Examples of biocatalysts used in the production of such optically active amino compounds include transaminases derived from Arthrobacter microorganisms that have a catalytic action in the production of optically active amine compounds from certain ketone compounds (WO97 / 15682, WO 98/48030). Furthermore, a D-amino acid transaminase derived from a microorganism of the genus Bacillus having a catalytic action in the production of an optically active D-amino acid using a certain keto acid compound as a raw material (Japanese Patent Publication No. 5-5472) is known.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel protein having excellent catalytic ability for efficiently producing an optically active amino compound, a gene encoding the protein, and use thereof.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies on biocatalysts for the production of optically active amino compounds, the present inventors have found a novel protein capable of stereoselectively catalyzing a transamination reaction, a gene encoding the protein, and the like. The present invention has been reached.
[0005]
That is, the present invention
1. Below (a), (C), (d) andA protein having any one of the amino acid sequences of (e).
(A) the amino acid represented by SEQ ID NO: 1An array.
(C)Acetophenone is converted to 1-phenylethylamine in the presence of racemic sec-butylamine.R-bodyAn amino acid sequence of a protein having the ability to convert to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 195An amino acid sequence exhibiting at least% amino acid identity.
(D) 1-phenylethylamine is converted to acetophenone in the presence of racemic sec-butylamine.R-bodyAs a monomer with the ability to convert toMolecular weight 37 kDaAnd the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.95An amino acid sequence exhibiting at least% amino acid identity.
(E) 1-phenylethylamine is converted to acetophenone in the presence of racemic sec-butylamine.R-bodyAn amino acid sequence of a protein obtainable from a microorganism belonging to the genus Mycobacterium having the ability to convert to95An amino acid sequence exhibiting at least% amino acid identity;
2. A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
3. A protein having an amino acid sequence in which threonine (Thr), which is amino acid number 2, is substituted with alanine (Ala) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
4). As a monomer obtainable from Mycobacterium aurum SC-S423Molecular weight 37 kDaAcetophenone in the presence of racemic sec-butylamineR-form of 1-phenylethylamineA protein having the ability to convert to
[0006]
5. Below (a) ~(E)A gene encoding a protein having any one of the amino acid sequences.
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
(B) An amino acid sequence corresponding to the base sequence represented by base numbers 1 to 1017 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(C)Acetophenone in the presence of racemic sec-butylamineR-form of 1-phenylethylamineAn amino acid sequence of a protein having the ability to convert to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 195An amino acid sequence exhibiting at least% amino acid identity.
(D)Acetophenone in the presence of racemic sec-butylamineR-form of 1-phenylethylamineAs a monomer with the ability to convert toMolecular weight 37 kDaAnd the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.95An amino acid sequence exhibiting at least% amino acid identity.
(E)Acetophenone in the presence of racemic sec-butylamineR-form of 1-phenylethylamineAn amino acid sequence of a protein obtainable from a microorganism belonging to the genus Mycobacterium having the ability to convert to95An amino acid sequence exhibiting at least% amino acid identity;
6). Below (a') To (c') Gene having any of the nucleotide sequences
(A') The nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 1017 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B') A base sequence in which adenine (a) of base number 4 is replaced with guanine (g) among base numbers 1 to 1017 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(C') An oligonucleotide having the base sequence represented by base numbers 1 to 28 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 and the base numbers 999 to 1020 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 An oligonucleotide having a base sequence complementary to the base sequence shown as a primer, and a chromosomal DNA derived from a microorganism belonging to the genus Mycobacterium as a template,By the following methodAmplified by PCR1020a base sequence consisting of bp;
7). An oligonucleotide having the base sequence shown by base numbers 1-28 of the base sequence shown by SEQ ID NO: 2 or the base sequence shown by SEQ ID NO: 11 and the base numbers 999-1020 of the base sequence shown by SEQ ID NO: 2 An oligonucleotide having a base sequence complementary to the base sequence to be used as a primer, and a chromosomal DNA derived from a microorganism belonging to the genus Mycobacterium as a template,By the following methodAmplified by PCR1020A nucleotide sequence consisting of bp.
<PCR method>
4 types of dNTPs are included so that the final concentration is 200 μM each, the above two types of primers are each included so that the final concentration is 200 nM, Taq DNA polymerase and Pwo DNA polymerase are included in total 26 mU / μl, Using a reaction solution containing a final concentration of 1 ng / μl, incubate at 95 ° C for 2 minutes, then at 96 ° C for 15 seconds, then at 60 ° C for 15 seconds, then at 72 ° C for 1 minute, 1 cycle This is repeated 25 cycles, and further kept at 72 ° C. for 10 minutes. ;
8). A gene having a base sequence in which adenine (a) of base number 4 is replaced by guanine (g) among base numbers 1 to 1017 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;
9. A promoter capable of functioning in the host cell;5.A gene that is functionally connected to the described gene;
[0007]
10.5.A vector comprising the described gene;
11.5.A transformant obtained by introducing the described gene into a host cell;
1210.A transformant obtained by introducing the vector described above into a host cell;
13. The host cell is a microbial cell11.Or12The transformant described;
[0008]
145.Listed genes or10.A method for producing a transformant, which comprises introducing the vector described above into a host cell;
15.5.The method for producing a protein according to claim 1, comprising a step of culturing a microorganism having the gene described above;
16.11.Or12The transformant describedComprising the step of culturing the protein,Production method;
Is to provide.
[0009]
17. General formula (1)
An amino group-containing compound represented byR-bodyIn which the protein according to claim 1 is allowed to act.
A process for producing an optically active amino compound represented by:
18. R of ketone compound (1)116. is a carboxyl group. The method described in;
[0010]
19. General formula (4)
In the ketone compound represented by
An amino group-containing compound represented byR-bodyThe protein of claim 1 is allowed to act in the presence of
A process for producing an optically active amino compound represented by:
[0011]
20. General formula (7)
A ketone compound represented by general formula (2):
An amino group-containing compound represented byR-bodyIn which the protein according to claim 1 is allowed to act.
A process for producing an optically active amino compound represented by:
[0012]
21. Formula (13)
An amino group-containing compound represented by formula (hereinafter referred to as amino group-containing compound (13)),
The protein according to claim 1 is allowed to act in the presence of the ketone compound (11) represented by the general formula (9):
A method for improving the ratio of an amine compound isomer represented by formula (hereinafter referred to as amine compound isomer (9));
[0013]
22. General formula (10)
The protein of claim 1 is allowed to act on the amino group-containing compound represented by (hereinafter referred to as amino-containing compound (10)) in the presence of the ketone compound (11).
A method for improving the ratio of an amino compound isomer represented by formula (hereinafter referred to as amino compound isomer (12));
Is to provide.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail. The protein of the present invention includes the following (a):, (C), (d) and(E) a protein having any one of the amino acid sequences (a) the amino acid represented by SEQ ID NO: 1Array, (c)Acetophenone is converted to 1-phenylethylamine in the presence of racemic sec-butylamine.R-bodyAn amino acid sequence of a protein having the ability to convert to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 195% Amino acid sequence showing amino acid identity of at least%, (d) acetophenone in the presence of racemic sec-butylamine in the presence of 1-phenylethylamineR-bodyAs a monomer with the ability to convert toMolecular weight 37 kDaAnd the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.95% Amino acid sequence exhibiting amino acid identity of at least%, (e) 1-phenylethylamine with acetophenone in the presence of racemic sec-butylamineR-bodyAn amino acid sequence of a protein obtainable from a microorganism belonging to the genus Mycobacterium having the ability to convert to95% Amino acid sequence exhibiting amino acid identity of at least%. Specifically, for example, a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a monomer that can be obtained from Mycobacterium aurum SC-S423.Molecular weight 37 kDaAcetophenone in the presence of racemic sec-butylamine and 1-phenylethylamineR-bodyExamples thereof include proteins having the ability to convert to
[0015]
The above protein is acetophenone in the presence of racemic sec-butylamine.The1-phenylethylamineR-bodyThe amino acid sequence can be shortened to an amino acid sequence of an appropriate length, for example, the amino acid sequence represented by amino acid numbers 23 to 339 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 It is also possible to make it a protein. This protein has the ability to stereoselectively catalyze the transamination reaction by converting acetophenone to 1-phenylethylamine in the presence of at least racemic sec-butylamine.R-bodyHas the ability to convert. For example, in 1 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 6.0) containing this protein, racemic sec-butylamine, acetophenone and pyridoxal-5-phosphate (PLP) have final concentrations of 400 mM, 10 mM and 20 μM, respectively. The reaction solution was adjusted so as to be added, and the reaction solution was kept at about 30 ° C. to about 40 ° C. for about 2 hours to 4 days, and then optically active 1-phenylethylamine formed in the reaction solution. If the amount is analyzed, the presence or absence of the ability can be determined. 1-phenylethylamineR-bodyAn example of the quantitative analysis method is described in the example column.
[0016]
Examples of the transamination reaction catalyzed by the present protein stereoselectively include, for example, a reaction in which a ketone compound (1) is converted to an optically active amino compound (3) in the presence of an amino group-containing compound (2), an amino group-containing compound Reaction for converting ketone compound (4) to optically active amino compound (6) in the presence of (2), and conversion of ketone compound (7) to optically active compound (8) in the presence of amino group-containing compound (2) A reaction for improving the ratio of the optically active amino compound (9) contained in the amino group-containing compound (13) in the presence of the ketone compound (11), an amino group-containing compound ( The reaction etc. which improve the ratio of the optically active amino compound (12) contained in 10) can be mention | raise | lifted. In the present invention, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1Amino acid identity is greater than 95%Amino acid identity can be raised.
[0017]
The gene of the present invention includes the following (a) to (e) A gene encoding a protein having any of the amino acid sequences
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,b) An amino acid sequence corresponding to the base sequence represented by base numbers 1 to 1017 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2;c) Acetophenone in the presence of racemic sec-butylamine and 1-phenylethylamineR-bodyAn amino acid sequence of a protein having the ability to convert to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 195% Amino acid sequence showing at least amino acid identity, (d) Acetophenone in the presence of racemic sec-butylamine and 1-phenylethylamineR-bodyAs a monomer with the ability to convert toMolecular weight 37 kDaAnd the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.95% Amino acid sequence showing at least amino acid identity, (e) Acetophenone in the presence of racemic sec-butylamine and 1-phenylethylamineR-bodyAn amino acid sequence of a protein obtainable from a microorganism belonging to the genus Mycobacterium having the ability to convert to95% Amino acid sequence exhibiting at least amino acid identity; and (a') To (c') Gene having any of the nucleotide sequences
(A') The nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 1017 among the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(B') Of the base numbers 1 to 1017 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, the base sequence in which adenine (a) which is base number 4 is replaced with guanine (g),
(C') An oligonucleotide having the base sequence represented by base numbers 1 to 28 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 and the base numbers 999 to 1020 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 A base sequence consisting of about 1020 bp amplified by PCR using an oligonucleotide having a base sequence complementary to the base sequence shown as a primer and a chromosomal DNA derived from a microorganism belonging to the genus Mycobacterium as a template. Specifically, for example, the base sequence represented by base numbers 1 to 1017 among the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be exemplified.
[0018]
The gene may be a natural gene, for example, a gene created by introducing a mutation into a natural gene by site-directed mutagenesis or random mutagenesis. Good. When searching for natural genes, acetophenone is replaced with 1-phenylethylamine in the presence of racemic sec-butylamine.R-bodyMicroorganisms having the ability to convert to microbial substances may be targeted, and for example, microorganisms belonging to the genus Mycobacterium such as Mycobacterium aurum, Mycobacterium neoaurum, Mycobacterium chubuense, and the like can be mentioned as preferred objects.
[0019]
This gene can be prepared, for example, as follows.
The Mycobacterium aurum SC-S423 strain (according to the Ministry of International Trade and Industry, Institute of Industrial Science and Technology, Biotechnology Institute of Technology, FERM BP-7909 (original deposit date: March 30, 1998)) Based on international deposits. From microorganisms belonging to the genus Mycobacterium such as “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition” (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, “Current Protocols in Molecular Biology” (1987), John Wiley & Sons, Inc. A chromosomal DNA is prepared by a method according to the usual genetic engineering method described in. Next, using the prepared chromosomal DNA as a template, an oligonucleotide having the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1-28 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polymerase chain reaction (hereinafter referred to as PCR) is performed under the following reaction conditions using an oligonucleotide having a base sequence complementary to the base sequence represented by base numbers 999 to 1020 of the base sequence as a primer. To encode a DNA comprising a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A DNA comprising a base sequence can be amplified.
Here, the PCR conditions include, for example, four kinds of dNTPs each having a final concentration of 200 μM, the above two kinds of primers each having a final concentration of 200 nM, Taq DNA polymerase and Pwo DNA polymerase. Was incubated at 95 ° C. for 2 minutes, then incubated at 95 ° C. for 15 seconds, then at 60 ° C. for 15 seconds. Incubation for 1 minute at 72 ° C. for 1 second is repeated 25 cycles, and the conditions for further 10 minutes at 72 ° C. can be raised.
[0020]
Further, for example, an oligonucleotide used as a primer for PCR is designed and synthesized as appropriate based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and PCR is carried out according to the above conditions. DNA encoding a partial amino acid sequence of the amino acid sequence shown, specifically, for example, DNA encoding the amino acid sequence represented by amino acid numbers 23 to 339 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence of such DNA In 1), DNA having a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted, inserted or added can be amplified. In addition, a restriction enzyme recognition sequence or the like may be added to the 5 ′ end side of the primer used for PCR in this way. Specifically, for example, an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12 can be exemplified. Further, when a DNA library obtained by inserting chromosomal DNA or cDNA into a vector is used as a template, for example, an oligonucleotide having a base sequence selected from the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, An oligonucleotide having a base sequence of about 14 bases or more on the 5 ′ end side of the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1) and a base sequence near the DNA insertion site of the vector used for library construction DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be amplified by performing PCR using an oligonucleotide having a base sequence complementary to about 14 bases or more as a primer. it can.
The DNA amplified as described above is described in “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2”.nd edition "(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press," Current Protocols in Molecular Biology "(1987), John Wiley & Sons, Inc., etc. can do. Specifically, for example, cloning can be performed using a plasmid vector included in the TA cloning kit of Invitrogen or a plasmid vector such as pBluescriptII of Stratagene.
[0021]
In addition, this gene is a probe of chromosomal DNA or cDNA library derived from a microorganism belonging to the genus Mycobacterium, for example, with a DNA consisting of about 15 bases or more having the base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. And can be obtained by detecting the DNA to which the probe specifically binds under the conditions described later.
[0022]
Examples of a method for hybridizing a probe to a library of chromosomal DNA or cDNA include colony hybridization and plaque hybridization. The method may be selected according to the type of vector used for the preparation of the library. When the library to be used is constructed using a plasmid vector, colony hybridization is performed. Specifically, first, the DNA of the library is introduced into a microorganism capable of replicating the plasmid vector used in the preparation of the library to obtain a transformant, and the obtained transformant is diluted to obtain an agar medium. Incubate until the colonies appear. When the library is prepared using a phage vector, plaque hybridization is performed. Specifically, first, a microorganism capable of replicating the phage vector used for the library preparation and the phage of the library were mixed under infectious conditions, and further mixed with a soft agar medium, which was then mixed with an agar medium. Slowly. Thereafter, culture is performed until plaques appear.
Next, in any of the above hybridizations, a membrane is placed on the surface of the agar medium on which the culture has been performed, and the transformant or phage is transferred to the membrane. This membrane is treated with an alkali, then neutralized, and then treated to fix the DNA to the membrane. More specifically, for example, in the case of plaque hybridization, a nitrocellulose membrane or a nylon membrane on the agar medium, specifically, for example, Hybond-N+(Amersham registered trademark) or the like is placed and allowed to stand for about 1 minute to adsorb phage particles to the membrane. Next, the membrane is immersed in an alkaline solution (1.5 M sodium chloride, 0.5 N NaOH) for about 3 minutes to dissolve phage particles and elute the phage DNA on the membrane, and then neutralized solution (1.5 M sodium chloride, Immerse in 0.5M Tris-HCl buffer (pH 7.5) for about 5 minutes. The membrane is washed with a washing solution (0.3 M sodium chloride, 30 mM sodium citrate, 0.2 M Tris-HCl buffer pH 7.5) for about 5 minutes, and then baked at about 80 ° C. for about 90 minutes, for example, to obtain phage DNA Is fixed to the membrane.
[0023]
Using the membrane thus prepared, hybridization is performed using the DNA as a probe. Hybridization can be performed by, for example, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition (1989) "Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[0024]
In order to label DNA used for the probe with a radioisotope, for example, a Random Labeling Kit manufactured by Boehringer or Takara Shuzo can be used, and dCTP in a normal PCR reaction solution can be (α-32In place of P) dCTP, labeling can also be performed by performing PCR using the DNA used for the probe as a template. Further, when the DNA used for the probe is labeled with a fluorescent dye, for example, ECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System manufactured by Amersham can be used.
There are various reagents and temperature conditions for performing hybridization. For example, it contains 450 to 900 mM sodium chloride and 45 to 90 mM sodium citrate, and sodium dodecyl sulfate (hereinafter referred to as SDS) is 0.1 to 1.0. Prehybridization which may contain 0% to 200μg / ml of denatured non-specific DNA and may contain 0% to 0.2% of albumin, ficoll, polyvinylpyrrolidone, etc. A prehybridization solution containing 900 mM sodium chloride, 90 mM sodium citrate, 1.0% SDS and 100 μg / ml denatured Calf-thymus DNA was prepared as described above.2The membrane is immersed in the solution at a rate of 50 to 200 μl, and kept at 42 to 65 ° C. for 1 to 4 hours, preferably at 65 ° C. for 2 hours. Then, for example, containing 450-900 mM sodium chloride and 45-90 mM sodium citrate, SDS at a concentration of 0.1-1.0%, denatured non-specific DNA at a concentration of 0-200 μg / ml, optionally Is a hybridization solution that may contain albumin, ficoll, polyvinylpyrrolidone, etc. at a concentration of 0-0.2% each, preferably 900 mM sodium chloride, 90 mM sodium citrate, 1.0% SDS and 100 μg / ml denaturation Hybridization solution containing Calf-thymus DNA and the probe prepared by the above method (1cm membrane)21.0x10 perFour~ 2.0x1061 cm of membrane2The membrane is immersed in the solution at a rate of 50 to 200 μl, and the hybridization reaction is performed by incubating the membrane at 42 to 65 ° C. for 12 to 20 hours, preferably at 65 ° C. for 16 hours. After the hybridization reaction, the membrane is taken out, and a wash solution of 42 to 65 ° C. containing 15 to 300 mM sodium chloride, 1.5 to 30 mM sodium citrate, 0.1 to 1.0% SDS, etc., preferably 15 mM sodium chloride is used. Wash twice for 15 minutes with a washing solution at 65 ° C. containing 1.5 mM sodium citrate and 1.0% SDS. Further, the membrane is lightly rinsed with 2 × SSC solution (300 mM sodium chloride, 30 mM sodium citrate) and then dried. The membrane is subjected to, for example, autoradiography to detect the position of the probe on the membrane, thereby detecting the position of the DNA on the membrane that hybridizes with the probe used. A clone having the DNA can be isolated by identifying the clone corresponding to the position of the detected DNA on the membrane on the original agar medium and catching it.
[0025]
The DNA obtained as described above is described in “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2”.nd edition "(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press," Current Protocols in Molecular Biology "(1987), John Wiley & Sons, Inc. Can do. Specifically, for example, pUC119 (Takara Shuzo), pTV118N (Takara Shuzo), pBluescriptII (Toyobo), pCR2.1-TOPO (Invitrogen), pTrc99A (Pharmacia), pKK331-1 (manufactured by Pharmacia) or the like can be used.
The base sequence of the DNA obtained as described above is the DNA sequence described in F. Sanger, S. Nicklen, ARCoulson, Proceeding of National Academy of Science USA (1977) 74: 5463-5467, etc. It can be analyzed by the deoxyterminator method or the like. For sample preparation for base sequence analysis, for example, commercially available reagents such as Perkin Elmer ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit may be used.
[0026]
Confirmation of the ability of the protein encoded by the DNA obtained as described above to stereoselectively catalyze the transamination reaction can be performed, for example, as follows. First, as described later, the DNA is inserted into a vector so as to be connected downstream of a promoter that can function in the host cell, and introduced into the host cell to obtain a transformant. Next, the culture of the transformant is allowed to act on the ketone compound (1) in the presence of the amino group-containing compound (2), and the resulting reaction product is analyzed. In this way, a transformant having the ability to preferentially produce the optically active amino compound (3) can be identified, and the transformant possesses the present gene encoding a protein having such ability. It can be judged. More specifically, for example, the culture of the transformant is finally added to a 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 10 mM acetophenone, 400 mM racemic sec-butylamine and 20 μM pyridoxal-5-phosphate. Suspend to a volume of 1 ml, put in a 1.5 ml sample tube, and incubate at about 30 ° C. to 40 ° C. for about 2 hours to 4 days while shaking with a shaker. 400 μl of methanol is added to 200 μl of the suspension after the incubation, and the mixture is stirred and centrifuged at 10,000 × g for 5 minutes. The supernatant is recovered and filtered, and the obtained filtrate is subjected to gas chromatography or high performance liquid chromatography. The amount of 1-phenylethylamine produced and the optical purity can be quantified by analyzing by chromatography (hereinafter referred to as HPLC), and the optically active 1-phenylethylamine producing ability of the above transformant is converted to a transamination reaction. Can be determined as a representative ability to catalyze stereoselectively.
[0027]
In order to express this gene in a host cell, a gene in which a promoter capable of functioning in the host cell and this gene are connected in a functional manner, and a vector containing the gene are introduced into the host cell. Here, “in a functional form” means that when the gene is introduced into a host cell, the gene is in a state linked to a promoter so that the gene is expressed under the control of the promoter. . Examples of the promoter include an E. coli lactose operon promoter, an E. coli tryptophan operon promoter, and a synthetic promoter capable of functioning in E. coli, such as a tac promoter or a trc promoter. In addition, the original promoter of this gene may be used. In general, the present gene, which is operably connected to a promoter that can function in a host cell, is incorporated into a vector as described above and introduced into the host cell. When a vector containing a selection marker gene (for example, an antibiotic resistance-conferring gene such as a kanamycin resistance gene or a neomycin resistance gene) is used as a vector, the transformant into which the gene has been introduced is transformed into the phenotype of the selection marker gene. This is convenient when selecting with the index as the index.
[0028]
Examples of host cells into which this gene or a vector containing this gene is introduced include cells such as microorganisms belonging to the genus Esherichia, Bacillus, Corynebacterium, Staphylococcus, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus, Mycobacterium, and the like. The method for introducing a gene into a host cell may be any method commonly used depending on the host cell. For example, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition "(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press," Current Protocols in Molecular Biology "(1987), John Wiley & Sons, Inc., etc., and" Methods in Electroporation: Gene Pulser / E. and the electroporation method described in, for example, “Coli Pulser System” Bio-Rad Laboratories, (1993).
A transformant introduced with the present gene or a vector containing the present gene can be selected using the phenotype or the like of the selection marker gene contained in the vector into which the present gene is incorporated as an index. The fact that the transformant possesses this gene or a vector containing this gene means that after preparing DNA from the transformant, for example, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition "(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press and the like (confirmation of restriction enzyme site, analysis of base sequence, Southern hybridization, Western hybridization, etc.).
[0029]
This protein can be prepared, for example, by culturing a microorganism having this gene. Examples of such microorganisms are microorganisms having the ability to express the present gene and produce the present protein. For example, wild strains isolated from nature of the microorganism having the present gene, treatment of drugs, ultraviolet rays, etc. from the wild strain And the like, and the like. Furthermore, the transformant etc. which introduce | transduced this gene or the vector containing this gene into the host cell can be mention | raise | lifted. Specific examples include Mycobacterium aurum SC-S423 strain isolated by the present inventors from the natural world. In addition, E. coli strains such as E. coli JM109 / ptrc9 in which the present gene, which is functionally connected to the tac promoter, trc promoter or lac promoter, has been introduced into the host cell can also be mentioned.
[0030]
As a medium for culturing a microorganism having the present gene as described above, various media appropriately containing a carbon source, a nitrogen source, organic or inorganic salts and the like that are usually used for culturing microorganisms can be used. Examples of the carbon source include sugars such as glucose, fructose, sucrose, and dextrin, sugar alcohols such as glycerol and sorbitol, organic acids such as fumaric acid, citric acid, and pyruvic acid. The amount of these carbon sources added to the medium is usually about 0.1% (w / v) to about 10% (w / v) with respect to the total amount of the medium.
Examples of the nitrogen source include ammonium salts of inorganic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate, ammonium salts of organic acids such as ammonium fumarate and ammonium citrate, meat extract, yeast extract, malt extract, soybean flour, corn stea Examples include natural organic nitrogen sources or amino acids such as epreker, cottonseed powder, dry yeast, and casein hydrolyzate. Of these, ammonium salts of organic acids, natural organic nitrogen sources, amino acids and the like can be used as carbon sources in many cases. The addition amount of the nitrogen source is usually about 0.1% (w / v) to about 10% (w / v) with respect to the total amount of the medium.
Examples of inorganic salts include phosphates such as monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, monosodium phosphate and disodium phosphate, chloride salts such as potassium chloride, sodium chloride and cobalt chloride hexahydrate, magnesium sulfate , Metal sulfates such as ferrous sulfate heptahydrate, zinc sulfate heptahydrate, manganese sulfate trihydrate, etc., and the amount added is usually about 0.0001% of the total amount of the medium. It may be set to about (w / v) to about 1% (w / v).
[0031]
In addition, a small amount of amino compounds such as amino group-containing compounds and optically active amino compounds may be added to the medium in advance, which may increase the productivity of the protein by the microorganisms described above. Amino compounds also serve as a nitrogen source and a carbon source in the culture of the microorganism. The amount of amino compounds added in this way is usually about 0.001% (w / v) or more, preferably about 0.01% (w / v) to about 1% (w / v), based on the total amount of the medium. .
Furthermore, in the case of a host cell into which a gene in which this gene is operably connected to a lactose-inducible type promoter such as tac promoter, trc promoter, lac promoter, etc. is produced, this protein is produced. For example, isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) may be added to the medium in a small amount as an inducer for inducing.
[0032]
Culture of a microorganism having this gene can be performed according to a method usually used for culturing microorganisms, for example, liquid culture such as swirl shaking culture, reciprocal shaking culture, jar fermenter culture or tank culture. Alternatively, a method such as solid culture is possible. In the case of using a jar fermenter, it is necessary to introduce aseptic air into the jar fermenter. Usually, an aeration condition of about 0.1 times to about 2 times / minute of the culture solution volume is used. The culture temperature can be appropriately changed within the range in which microorganisms can grow, but the culture temperature is generally in the range of about 15 ° C to about 40 ° C, and the pH of the medium is preferably in the range of about 6 to about 8. The culture time varies depending on the culture conditions, but is usually about 1 day to about 10 days.
[0033]
The present protein produced by a microorganism having the present gene is, for example, a culture of a microorganism that produces the present protein, a microbial cell producing the present protein, a processed product of the microbial cell, a cell-free extract, or a crudely purified protein. In addition, it can be used for the production of optically active amino compounds in various forms such as purified proteins. Here, as the treated product of the microbial cells, for example, freeze-dried microbial cells, acetone-dried microbial cells, pulverized microbial cells, self-digested microbial cells, sonicated microbial cells, alkaline processed microbial cells, microbial cells, etc. Examples of the organic solvent-treated product of the body. In addition, the protein in various forms as described above can be obtained by using, for example, an inorganic carrier such as silica gel or ceramics, a derivative of polysaccharide such as DEAE-cellulose, or Amberlite IRA935 (trade name: manufactured by Rohm and Haas) Well-known methods such as carrier binding methods that adsorb to synthetic polymers such as polyacrylamide, sulfur-containing polysaccharide gels (eg carrageenan gels), entrapment methods confined in polymer network structures such as alginate gels or agar gels And can be used for the production of an optically active amino compound.
[0034]
As a method for purifying the present protein from the culture of the microorganism having the present gene as described above, a method usually used in protein purification can be applied. For example, the following method can be exemplified.
First, after collecting bacterial cells from a culture of microorganisms by centrifugation or the like, this is subjected to a physical disruption method such as ultrasonic treatment, dynomill treatment or French press treatment, or a cell lysis enzyme such as a surfactant or lysozyme. Crush by the chemical crushing method used. From the obtained crushed liquid, insoluble matters are removed by centrifugation, membrane filter filtration, etc. to prepare a cell-free extract, which is subjected to cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography. The protein can be purified by fractionation using an appropriate separation and purification method such as chromatography. Examples of the carrier used for chromatography include a resin carrier such as cellulose, dextran, or agarose into which a carboxymethyl (CM) group, a diethylaminoethyl (DEAE) group, a phenyl group, or a butyl group is introduced. A commercially available carrier-filled column can also be used, for example, Q-Sepharose FF, Phenyl-Sepharose HP (trade name, both manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), TSK-gel G3000SW (trade name, manufactured by Tosoh Corporation), etc. can give.
[0035]
An example of the purification operation of this protein is shown.
The cells of the microorganism producing this protein are collected by centrifugation and then suspended in a buffer solution such as 20 mM Bistrispropane (pH 7.0). This was crushed with an ultrasonic crusher for about 20 minutes, and the resulting microbial cell lysate was centrifuged at about 13000 × g for about 15 minutes, and then the supernatant was recovered and filtered through a membrane filter to make it insoluble. Remove material and prepare a cell-free extract. The cell-free extract thus obtained is introduced into, for example, a Q Sepharose FF column (trade name, manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), and the adsorbate adsorbed on the column is sequentially eluted by a linear sodium chloride concentration gradient. Get. The fraction containing this protein is then introduced into, for example, a Phenyl-Sepharose HP column (trade name, manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), and the adsorbate on the column is eluted sequentially with a linear ammonium sulfate concentration gradient. Obtain a liquid. The fraction containing this protein is further concentrated using an ultrafiltration membrane or the like, and then introduced into, for example, a TSK-gel G3000SW column (600 mm × 7.5 mm ID) (trade name, manufactured by Tosoh Corporation), for example, 0.15 M The protein can be purified by elution with a 50 mM sodium phosphate buffer containing sodium chloride to obtain a fractionated eluate. The fraction containing the present protein is preferably selected using, for example, the ability to convert acetophenone into optically active 1-phenylethylamine in the presence of racemic sec-butylamine.
[0036]
The optically active amino compound (3) can be obtained by allowing the protein to act on the ketone compound (1) in the presence of the amino group-containing compound (2) (hereinafter referred to as the production method 1).
In the ketone compound (1), X1Is an optionally substituted C1-C9 alkyl group (C1-C9 alkyl group, substituted C1-C9 alkyl group), an optionally substituted C6-C14 aryl group (C6-C14 aryl group, substituted C6-C14 aryl) Group), an optionally substituted C7-C17 arylalkyl group (C7-C17 arylalkyl group, substituted C7-C17 arylalkyl group), an optionally substituted C4-C12 heteroaryl group (C4-C12 heteroaryl) Group, substituted C4-C12 heteroaryl group), optionally substituted C5-C15 heteroarylalkyl group (C5-C15 heteroarylalkyl group, substituted C5-C15 heteroarylalkyl group), amino group, aminocarbonyl group, Hydroxyl group, thiol group, guanidyl group, cyano group, halogen atom or hydrogen atom Representing the. Here, the above “substituted” means one or more hydrogen atoms in a C1-C9 alkyl group, a C6-C14 aryl group, a C7-C17 arylalkyl group, a C4-C12 heteroaryl group, or a C5-C15 heteroarylalkyl group. Usually 1-2 of hydrogen atoms in a C1-C9 alkyl group, 1-2 of hydrogen atoms in a C6-C14 aryl group, 1-2 of hydrogen atoms in a C7-C17 arylalkyl group, C4-C12 hetero 1 to 2 hydrogen atoms in the aryl group or 1 to 2 hydrogen atoms in the C5-C15 heteroarylalkyl group are, for example, a C1-C3 alkyl group, a C1-C2 halogenated alkyl group, a C1-C2 alkoxy group, C1 -C2 alkylthio group, hydroxyl group, cyano group, amino group, carboxyl group, thiol group and halogen It means being substituted with one or more substituents selected from the group consisting of the child.
[0037]
Preferable examples of the substituent include methyl group, ethyl group, monochloromethyl group, trifluoromethyl group, methoxy group, methylenedioxy group, hydroxyl group, cyano group, amino group, carboxyl group, fluorine atom, chlorine atom and bromine. Can raise atoms.
R1As a hydrogen atom; a C1-C6 (straight or branched) alkyl group such as a methyl group, an ethyl group, or a propyl group; a carboxyl group; a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a propyloxycarbonyl group, a butyloxycarbonyl group, or the like A C2-C5 (straight or branched) alkyloxycarbonyl group and the like can be mentioned.
[0038]
In the amino group-containing compound (2), R2Is optionally substituted C1-C6 alkyl group (C1-C6 alkyl group, substituted C1-C6 alkyl group), optionally substituted phenyl group (phenyl group, substituted phenyl group), optionally substituted Represents a phenylalkyl group (phenylalkyl group, substituted phenylalkyl group). Here, the above-mentioned “substitution” means one or more hydrogen atoms in the C1-C6 alkyl group, phenyl group or phenylalkyl group, usually 1-2 hydrogen atoms in the C1-C6 alkyl group, hydrogen in the phenyl group. 1 to 2 atoms or 1 to 2 hydrogen atoms in the phenylalkyl group are, for example, a C1-C3 alkyl group, a C1-C2 halogenated alkyl group, a C1-C2 alkoxy group, a hydroxyl group, a cyano group, an amino group, a carboxyl group. It means being substituted with one or more substituents selected from the group consisting of a group, a methylthio group and a halogen atom. Preferred examples of the substituent include methyl, ethyl, monochloromethyl, trifluoromethyl, methoxy, methylenedioxy, hydroxyl, cyano, amino, carboxyl, methylthio, fluorine, chlorine Atoms and bromine atoms can be mentioned.
[0039]
Examples of the C1-C6 alkyl group include C1-C6 (linear or branched) alkyl such as methyl group, ethyl group, propyl group, butyl group, 1-methylpropyl group, 2-methylpropyl group, pentyl group, and hexyl group. Examples of the C7-C10 phenylalkyl group include C7-C10 phenyl (directly) such as benzyl group, 2-phenylethyl group, 3-phenylpropyl group, 4-phenylbutyl group, α-methylbenzyl group and the like. Chain or branched) alkyl groups can be mentioned.
[0040]
Specific examples of the substituted C1-C6 alkyl group include a carboxymethyl group, a carboxyethyl group, a 1-aminoethyl group, a 3-aminopropyl group, a 4-aminobutyl group, a hydroxymethyl group, and a methylthioethyl group. Specific examples of the substituted phenyl group include p-hydroxyphenyl group, p-chlorophenyl group, m, p-dihydroxyphenyl group, and the like, and specific examples of the substituted C7-C10 phenylalkyl group include Examples thereof include a p-hydroxyphenylethyl group, a p-chlorophenylmethyl group, and a 1-phenyl-1-hydroxymethyl group.
RThreeAs a hydrogen atom; a C1-C6 (straight or branched) alkyl group such as a methyl group, an ethyl group, or a propyl group; a carboxyl group; a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a propyloxycarbonyl group, a butyloxycarbonyl group, or the like A C2-C5 (straight or branched) alkyloxycarbonyl group and the like can be mentioned.
[0041]
Specific examples of the amino group-containing compound (2) include α-amino acids such as alanine, phenylalanine, tyrosine, aspartic acid, glutamic acid, methionine, lysine, serine, leucine, isoleucine, phenylserine or the like (C1-C4 alkyl). Esters; aliphatic amines such as propylamine, 1,2-diaminopropane, n-butylamine, sec-butylamine, 1,4-diaminobutane, 2-aminopentane, n-hexylamine, 2-aminoheptane; 1- Phenylalkylamines such as phenylethylamine, 2-phenylethylamine, benzylamine, 3-amino-1-phenylbutane, 4-amino-1-phenylpentane; aminoalcohols such as 2-amino-1-propanol It is done.
[0042]
In the amino group-containing compound (2), for the compound having an asymmetric carbon atom, any one of optical isomers or a mixture of two or more thereof can be appropriately selected and used. Achiral compounds are used. In addition, the amino group-containing compound (2) must be a compound different from the optically active amino compound (3) (provided that the difference is based only on stereoisomerism such as optical isomerism and geometric isomerism). And are not considered different compounds here). That is, in the combination of the amino group-containing compound (2) and the optically active amino compound (3) selected in the production method 1, R in the amino group-containing compound (2)2And X in the optically active amino compound (3)1And R in the amino group-containing compound (2)ThreeAnd — (CH in the optically active amino compound (3)2)m-R1The group is never the same.
[0043]
This production method 1 is usually an aqueous buffer solution containing an inorganic acid salt such as an alkali metal phosphate such as sodium phosphate or potassium phosphate, or an organic acid salt such as an alkali metal salt such as sodium acetate or potassium acetate. The concentration of the ketone compound (1) and the amino group-containing compound (2) in the reaction solution of the production method 1 is usually about 30% (w / v) or less, preferably 0. It is about 01 to 20% (w / v). The weight ratio of the amino group-containing compound (2) to the ketone compound (1) is generally about 0.01 to 100, but the weight ratio of the amino group-containing compound (2) to the ketone compound (1). It is often advantageous in terms of reaction rate, yield of the optically active amino compound (3), and the like to set a relatively large value such as 10 to 100, for example. The amount of the protein can be appropriately determined in consideration of, for example, the reaction time and the selectivity of the optically active amino compound (3) to be produced. For example, when the present protein is used as a purified enzyme or a crude enzyme, the amount thereof is usually 0.001 to 2 times by weight, preferably 0.002 to 0.5 times by weight with respect to the ketone compound (1). On the other hand, when this protein is used in the form of a microbial culture, a microbial cell, a processed product of the microbial cell, etc., the amount of the microbial culture, the microbial cell, the processed product of the microbial cell, etc. It is 0.01-200 weight times normally with respect to a ketone compound (1), Preferably it is 0.1-50 weight times. The reaction temperature is usually about 10 to 70 ° C, preferably about 20 to 60 ° C. The pH of the reaction solution is usually about 4 to 12, and preferably about 5 to 11. The reaction time can be arbitrarily set, but is usually about 1 hour to 7 days.
[0044]
Further, when a surfactant, coenzyme, organic solvent, etc. are coexistent in the reaction system of the present production method 1, it is advantageous in terms of shortening the reaction time and yield of the optically active amino compound (3). These auxiliary agents can be added to the reaction solution alone or in appropriate combination as necessary. Specific examples of the surfactant that can be used include sodium dodecyl sulfate, polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether, cetylpyridium bromide, and the like. And pyridoxal-5-phosphate (PLP). Specific examples of the organic solvent include alkanes such as n-heptane, cyclohexane and isooctane, ethers such as methyl-tert-butyl ether, alcohols such as methanol, isopropanol and n-octanol, and sulfoxides such as DMSO. Etc.
[0045]
The optically active amino compound (3) obtained by this production method 1 can be recovered from the reaction solution by a known treatment method. For example, after separating the microorganism culture, microorganism cells, treated cells of the cells, etc. from the reaction solution by centrifugation, the supernatant is adjusted to acidic and extracted and separated with an organic solvent such as diethyl ether or toluene. After removing the organic layer, and then making the aqueous layer basic and extracting and separating with a similar organic solvent to remove the aqueous layer, the solvent is distilled off under reduced pressure, and further purified by distillation or the like if necessary. Alternatively, the optically active amino compound (3) can be obtained by purifying the supernatant by a technique such as ion exchange chromatography.
[0046]
The optically active amino compound (6) can be obtained by allowing the present protein to act on the ketone compound (4) in the presence of the amino group-containing compound (2) (hereinafter referred to as production method 2).
In the ketone compound (4), X2Represents a phenyl group, an optionally substituted phenyl group (phenyl group, substituted phenyl group), or an optionally substituted naphthyl group (naphthyl group, substituted naphthyl group). Here, the above-mentioned “substitution” refers to one or more hydrogen atoms of a phenyl group or a naphthyl group, usually 1 to 2 hydrogen atoms of a phenyl group or 1 to 2 hydrogen atoms of a naphthyl group, for example, One or more selected from the group consisting of C1-C3 alkyl group, C1-C2 halogenated alkyl group, C1-C2 alkoxy group, methylenedioxy group, hydroxyl group, cyano group, amino group, carboxyl group and halogen atom It is substituted with a substituent of Preferred examples of the substituent include methyl, ethyl, monochloromethyl, trifluoromethyl, methoxy, methylenedioxy, hydroxyl, cyano, amino, carboxyl, fluorine, chlorine and bromine. Can raise atoms.
RFourRepresents a C1-C6 alkyl group, preferably a C1-C3 alkyl group, and more preferably a methyl group and an ethyl group.
[0047]
Specific examples of the ketone compound (4) include acetophenone, 2-methoxyacetophenone, 3-methoxyacetophenone, 2,4-dichloroacetophenone, 3,4-dichloroacetophenone, 3-cyanoacetophenone, 4-hydroxyacetophenone, 4- Methoxyacetophenone, 4-methylacetophenone, 4-chloroacetophenone, 1- (3,4-dimethoxyphenyl) propan-2-one, 1- (4-methoxyphenyl) propan-2-one, 1- (4-chlorophenyl) Propan-2-one, 1- (4-hydroxyphenyl) propan-2-one, 1- (4-methylphenyl) propan-2-one, 1- (3,4-methylenedioxyphenyl) propan-2- ON, 1-phenylpropan-1-one, α-acetonaphthone β- acetonaphthone, etc. can be mentioned.
[0048]
The amino group-containing compound (2) must be a compound different from the optically active amino compound (6) (provided that the difference is based only on stereoisomerism such as optical isomerism and geometric isomerism). Are not considered different compounds here). That is, in the combination of the amino group-containing compound (2) and the optically active amino compound (6) selected in the production method 2, R in the amino group-containing compound (2)2And X in the optically active amino compound (6)2-(CH2)nR in the amino group-containing compound (2) having the same groupThreeAnd R in the optically active amino compound (6)FourAre not the same.
This production method 2 can be carried out in accordance with the conditions described in this production method 1. The optically active amino compound (6) obtained by this production method 2 can be recovered from the reaction solution by a known treatment method. For example, after separating the culture of microorganisms, the treated product, etc. by centrifugation from the reaction solution, the supernatant is adjusted to acidic, extracted and separated with an organic solvent such as diethyl ether or toluene to remove the organic layer, Next, the aqueous layer is made basic and extracted and separated with the same organic solvent to remove the aqueous layer, and then the solvent is distilled off under reduced pressure. If necessary, the optically active amino compound (6) is purified by distillation or the like. can get.
[0049]
Examples of the optically active amino compound (6) that can be produced by the production method 2 include the following compounds having the configuration specified in the general formula (6).
1-phenylethylamine, 1- (2-methoxyphenyl) ethylamine, 1- (3-methoxyphenyl) ethylamine, 1- (2,4-dichlorophenyl) ethylamine, 1- (3,4-dichlorophenyl) ethylamine, 1- ( 3-cyanophenyl) ethylamine, 1- (4-hydroxyphenyl) ethylamine, 1- (4-methoxyphenyl) ethylamine, 1- (4-methylphenyl) ethylamine, 1- (4-chlorophenyl) ethylamine, 1- (3 4-dimethoxyphenyl) -2-aminopropane, 1- (4-methoxyphenyl) -2-aminopropane, 1- (4-chlorophenyl) -2-aminopropane, 1- (4-hydroxyphenyl) -2- Aminopropane, 1- (4-methylphenyl) -2-aminopropane, 1- (3 4- methylenedioxyphenyl) -2-aminopropane, 1-phenyl-1-aminopropane, 1- (alpha-naphthyl) ethylamine, 1- (beta-naphthyl) ethylamine and the like.
[0050]
An optically active amino compound (8) is obtained by allowing the present protein to act on the ketone compound (7) in the presence of the amino group-containing compound (2) (hereinafter, this method is referred to as the present production method 3).
[0051]
In the ketone compound (7), XFourIs an optionally substituted C6-C14 aryl group (C6-C14 aryl group, substituted C6-C14 aryl group), an optionally substituted C4-C12 heteroaryl group (C4-C12 heteroaryl group, substituted C4- C12 heteroaryl group), an optionally substituted C1-C3 alkyl group (C1-C3 alkyl group, substituted C1-C3 alkyl group), amino group, aminocarbonyl group, hydroxyl group, thiol group, guanidyl group or hydrogen atom. Represent.
Here, the above-mentioned “substitution” refers to one or more hydrogen atoms of the aryl group, heteroaryl group or alkyl group, usually 1 to 2 hydrogen atoms of a C6-C14 aryl group, C4-C12 hetero 1 to 2 hydrogen atoms of the aryl group or 1 to 2 hydrogen atoms of the C1-C3 alkyl group are, for example, a C1-C3 alkyl group, a C1-C2 halogenated alkyl group, a C1-C2 alkoxy group, a hydroxyl group, a cyano Group, amino group, carboxyl group, methylthio group and halogen atom, preferably methyl group, ethyl group, monochloromethyl group, trifluoromethyl group, methoxy group, methylenedioxy group, hydroxyl group, cyano group, amino group, carboxyl group Substituted with one or more substituents selected from the group consisting of: a methylthio group, a fluorine atom, a chlorine atom and a bromine atom. It means.
R7And R8Are the same or different from each other and each represents a hydrogen atom, a C1-C3 alkyl group or a hydroxyl group.
Examples of the C1-C3 alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, and an isopropyl group.
p represents an integer of 0 to 3, and q represents an integer of 0 to 2.
[0052]
Examples of the C6-C14 aryl group include a phenyl group and a naphthyl group. Examples of the C4-C12 heteroaryl group include a sulfur atom such as a 2-thienyl group and a 3-thienyl group in its ring structure. Heteroaromatic ring containing 1 or more heteroaromatic rings, 2-indolyl group, 3-indolyl group, 2-imidazolyl group, 4-imidazolyl group, 5-imidazolyl group and the like containing 1 to 4 heteroaromatic rings in the ring structure Examples of the C1-C3 alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, and an isopropyl group.
[0053]
Specific examples of the ketone compound (7) include pyruvic acid, β-hydroxypyruvic acid, 2-keto-3-mercaptopropionic acid, 2-keto-3-hydroxybutyric acid, 2-keto-4- (methylthio) butyric acid, 3-methyl-2-oxobutyric acid, 4-methyl-2-oxo-phamic acid, 3-methyl-2-oxo-phamic acid, trimethylpyruvic acid, phenylpyruvic acid, 4-chlorophenylpyruvic acid, 4-cyanophenylpyruvic acid, α-naphthylpyruvic acid, β-naphthylpyruvic acid, p-hydroxybenzoyl formic acid, 2-keto-4-phenylbutyric acid, 3- (2-thienyl) pyruvic acid, 3-hydroxy-3-phenylpyruvic acid, 4-hydroxy Phenylpyruvic acid, indole-3-pyruvic acid, oxaloacetic acid, 2-ketosuccinamic acid, α-ketoglutar 2-keto-5-amino-5-oxopentanoic acid, 2-keto-6-aminohexanoic acid, 2-keto-5-guanidinopentanoic acid, 2-keto-3- (4-imidazolyl) propionic acid, 2 -Ketobutyric acid, 3-ketobutyric acid, 3-keto-3-phenylpropionic acid and the like.
[0054]
Moreover, in this manufacturing method 3, an amino group containing compound (2) can be used based on this manufacturing method 2. However, it is necessary that the compound be different from the optically active amino compound (8) (however, if the difference is based only on stereoisomerism such as optical isomerism and geometric isomerism, it is regarded as a different compound here). Absent). That is, in the combination of the amino group-containing compound (2) and the optically active amino compound (8) selected in the production method 3, R in the amino group-containing compound (2)2And X in the optically active amino compound (8)Four-(CR7R8)pR in the amino group-containing compound (2) having the same groupThreeAnd — (CH in the optically active amino compound (8)2)qThe —COOH group is not the same.
[0055]
This production method 3 can be carried out in accordance with the conditions described in this production method 2.
The optically active amino compound (8) obtained by this production method 3 can be recovered from the reaction solution by a known treatment method. For example, the optically active amino compound (8) can be obtained by a technique such as ion exchange chromatography after separating a culture of microorganisms, a processed product thereof, and the like from the reaction solution by centrifugation.
[0056]
Examples of the optically active amino compound (8) that can be produced by the production method 3 include the following compounds having the configuration specified in the general formula (8).
Alanine, serine, cysteine, threonine, methionine, valine, leucine, isoleucine, tert-leucine, phenylalanine, p-chlorophenylalanine, p-cyanophenylalanine, α-naphthylalanine, β-naphthylalanine, p-hydroxyphenylglycine, homophenylalanine , Α-amino acids such as 3- (2-thienyl) alanine, phenylserine, tyrosine, tryptophan, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, lysine, arginine, histidine, 2-aminobutyric acid, 3-aminobutyric acid, 3-amino Β-amino acids such as -3-phenylpropionic acid.
[0057]
By allowing this protein to act on the amine compound (13) in the presence of the ketone compound (11), the ratio of the amino compound isomer (9) can be improved (hereinafter referred to as this improvement method A).
[0058]
In the present improvement method A, to improve the ratio of the amino compound isomer (9) means that, among the two optical isomers based on the asymmetric carbon bonded to the amino group of the amino group-containing compound (13), the amino compound The isomer (9) means that the ratio of the amino compound isomer (9) to the different isomer is improved.
[0059]
R in the ketone compound (11)TenAre optionally substituted C1-C6 alkyl group (C1-C6 alkyl group, substituted C1-C6 alkyl group), optionally substituted phenyl group (phenyl group, substituted phenyl group), optionally substituted Represents a good C7-C10 phenylalkyl group (C7-C10 phenylalkyl group, substituted C7-C10 phenylalkyl group).
[0060]
Here, the above-mentioned “substituted” means one or more hydrogen atoms of a C1-C6 alkyl group, a phenyl group or a C7-C10 phenylalkyl group, usually 1-2 hydrogen atoms of a C1-C6 alkyl group, 1-2 hydrogen atoms of the phenyl group or 1-3 hydrogen atoms of the C7-C10 phenylalkyl group are, for example, a C1-C3 alkyl group, a C1-C2 halogenated alkyl group, a C1-C2 alkoxy group, a hydroxyl group, Cyano group, amino group, carboxyl group, methylthio group and halogen atom, preferably methyl group, ethyl group, monochloromethyl group, trifluoromethyl group, methoxy group, methylenedioxy group, hydroxyl group, cyano group, amino group, carboxyl One or more substituents selected from the group consisting of a group, a methylthio group, a fluorine atom, a chlorine atom and a bromine atom Which means that it is conversion.
[0061]
Examples of the C1-C6 alkyl group include C1-C6 (linear or branched) alkyl such as methyl group, ethyl group, propyl group, butyl group, 1-methylpropyl group, 2-methylpropyl group, pentyl group, and hexyl group. Examples of the C7-C10 phenylalkyl group include C7-C10 phenyl (directly) such as benzyl group, 2-phenylethyl group, 3-phenylpropyl group, 4-phenylbutyl group, α-methylbenzyl group and the like. Chain or branched) alkyl groups can be mentioned.
[0062]
Specific examples of the substituted C1-C6 alkyl group include a carboxymethyl group, a carboxyethyl group, a 1-aminoethyl group, a 3-aminopropyl group, a 4-aminobutyl group, a hydroxymethyl group, and a methylthioethyl group. Specific examples of the substituted phenyl group include p-hydroxyphenyl group, p-chlorophenyl group, m, p-dihydroxyphenyl group, and the like, and specific examples of the substituted C7-C10 phenylalkyl group include Examples thereof include a p-hydroxyphenylethyl group, a p-chlorophenylmethyl group, and a 1-phenyl-1-hydroxymethyl group.
[0063]
R11As a C1-C6 (straight or branched) alkyl group such as a hydrogen atom, methyl group, ethyl group, propyl group; carboxyl group; methoxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group, propyloxycarbonyl group, butyloxycarbonyl group, etc. A C2-C5 (straight or branched) alkyloxycarbonyl group and the like can be mentioned.
[0064]
Specific examples of the ketone compound (11) include ketones such as acetone and 2-butanone, aldehydes such as propionaldehyde and benzaldehyde, keto acids such as oxaloacetic acid, pyruvic acid and α-ketobutyric acid, and sodium pyruvate. Examples thereof include alkali metal salts of keto acids and alkyl esters of keto acids such as methyl pyruvate.
[0065]
In the amino group-containing compound (13), XFiveIs an optionally substituted C1-C9 alkyl group (C1-C9 alkyl group, substituted C1-C9 alkyl group), an optionally substituted C6-C14 aryl group (C6-C14 aryl group, substituted C6-C14 aryl) Group), an optionally substituted C7-C17 arylalkyl group (C7-C17 arylalkyl group, substituted C7-C17 arylalkyl group), an optionally substituted C4-C12 heteroaryl group (C4-C12 heteroaryl) Group, substituted C4-C12 heteroaryl group), optionally substituted C5-C15 heteroarylalkyl group (C5-C15 heteroarylalkyl group, substituted C5-C15 heteroarylalkyl group), amino group, aminocarbonyl group, Hydroxyl group, thiol group, guanidyl group, cyano group, halogen atom or hydrogen atom Representing the. Here, the above “substituted” means one or more hydrogen atoms in a C1-C9 alkyl group, a C6-C14 aryl group, a C7-C17 arylalkyl group, a C4-C12 heteroaryl group, or a C5-C15 heteroarylalkyl group. Usually 1-2 of hydrogen atoms in a C1-C9 alkyl group, 1-2 of hydrogen atoms in a C6-C14 aryl group, 1-2 of hydrogen atoms in a C7-C17 arylalkyl group, C4-C12 hetero 1 to 2 hydrogen atoms in the aryl group or 1 to 2 hydrogen atoms in the C5-C15 heteroarylalkyl group are, for example, a C1-C3 alkyl group, a C1-C2 halogenated alkyl group, a C1-C2 alkoxy group, C1 -C2 alkylthio group, hydroxyl group, cyano group, amino group, carboxyl group, thiol group and halogen It means being substituted with one or more substituents selected from the group consisting of the child.
Preferred examples of the substituent include methyl, ethyl, monochloromethyl, trifluoromethyl, methoxy, methylenedioxy, hydroxyl, cyano, amino, carboxyl, fluorine, chlorine and bromine. Can raise atoms.
[0066]
The ratio of the optical isomers in the amino group-containing compound (13) used in this improvement method A is not particularly limited, but from an industrial standpoint, the amino group-containing compound (13) is usually supplied in a racemic form. In many cases, it is advantageous to use a racemate as the amino group-containing compound (13).
[0067]
This improvement method A is usually in an aqueous buffer solution containing inorganic acid salts such as alkali metal phosphates such as sodium phosphate and potassium phosphate, and organic acid salts such as alkali metal salts such as sodium acetate and potassium acetate. The concentration of the ketone compound (11) and the amino group-containing compound (13) in the reaction solution of this improvement method A is usually about 30% (w / v) or less, preferably 0.01 About 20% (w / v). The weight ratio of the ketone compound (11) to the amino group-containing compound (13) is generally about 0.01 to 100, but the weight ratio of the ketone compound (11) to the amino group-containing compound (13). It is often advantageous in terms of reaction rate, yield of the amino compound isomer (9), and the like to set a relatively large value such as 1 to 10, for example. The amount of the protein can be appropriately determined in consideration of, for example, the reaction time and the selectivity of the amino compound isomer (9) to be produced. For example, when the present protein is used as a purified enzyme or a crude enzyme, the amount thereof is usually 0.001 to 2 times by weight, preferably 0.002 to 0.5 times by weight with respect to the amino group-containing compound (13). On the other hand, when this protein is used as a microbial culture, a microbial cell, a treated product of such a microbial cell, etc., the amount of the microbial culture, the microbial cell, the treated product of such a microbial cell, etc. It is 0.01-200 weight times normally with respect to group-containing compound (13), Preferably it is 0.1-50 weight times. The reaction temperature is usually about 10 to 70 ° C, preferably about 20 to 60 ° C. The pH of the reaction solution is usually about 4 to 12, and preferably about 5 to 11. The reaction time can be arbitrarily set, but is usually about 1 hour to 7 days. In general, if the reaction time is lengthened, the ratio of the amino compound isomer (9) (optical purity is improved as the conversion rate increases.
In addition, a microorganism that produces the protein is inoculated into a medium to which the amino group-containing amino compound (13) has been added in advance, and the protein acts on the amino group-containing compound (13) added to the medium while culturing the microorganism. You may let them.
[0068]
Further, when a surfactant, coenzyme, organic solvent, etc. are coexistent in the reaction system of the present improvement method A, it is advantageous in terms of shortening the reaction time and yield of the amino compound isomer (9). These auxiliary agents can be added to the reaction solution alone or in appropriate combination as necessary. Specific examples of the surfactant that can be used include sodium dodecyl sulfate, polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether, cetylpyridium bromide, and the like. And pyridoxal-5-phosphate (PLP). Specific examples of the organic solvent include alkanes such as n-heptane, cyclohexane and isooctane, ethers such as methyl-tert-butyl ether, alcohols such as methanol, isopropanol and n-octanol, and sulfoxides such as DMSO. Etc.
[0069]
The amino-containing compound (13) having an improved ratio of amino compound isomer (9) obtained by the present improving method A can be recovered from the reaction solution by a known processing method. For example, after separating the microorganism culture, the microorganism cells, and the treated product of the cells from the reaction solution by centrifugation, the supernatant is adjusted to acidic, and extracted and separated with an organic solvent such as diethyl ether or toluene. The organic layer is removed, and then the aqueous layer is made basic and extracted and separated with a similar organic solvent. After removing the aqueous layer, the solvent is distilled off under reduced pressure, and further purification such as distillation is added if necessary. Alternatively, the supernatant can be purified and collected by a technique such as ion exchange chromatography.
[0070]
By allowing the present protein to act on the amino group-containing compound (10) in the presence of the ketone compound (11), the ratio of the amino compound isomer (12) can be improved (hereinafter referred to as the present improvement method B). ).
[0071]
X in the amino group-containing compound (10)6Represents an optionally substituted phenyl group (phenyl group, substituted phenyl group) and an optionally substituted naphthyl group (naphthyl group, substituted naphthyl group). Here, the above “substitution” means one or more hydrogen atoms of a phenyl group or a naphthyl group, usually 1 to 2 hydrogen atoms of a phenyl group or 1 to 2 hydrogen atoms of a naphthyl group, for example, One or more selected from the group consisting of C1-C3 alkyl group, C1-C2 halogenated alkyl group, C1-C2 alkoxy group, methylenedioxy group, hydroxyl group, cyano group, amino group, carboxyl group and halogen atom It is substituted with a substituent of Preferred examples of the substituent include methyl, ethyl, monochloromethyl, trifluoromethyl, methoxy, methylenedioxy, hydroxyl, cyano, amino, carboxyl, fluorine, chlorine and bromine. Can raise atoms.
R12Represents a C1-C6 alkyl group, preferably a C1-C3 alkyl group, and more preferably a methyl group and an ethyl group.
[0072]
Specific examples of the amino group-containing compound (10) include 1-phenylethylamine, 1- (2-methoxyphenyl) ethylamine, 1- (3-methoxyphenyl) ethylamine, 1- (2,4-dichlorophenyl) ethylamine, 1- (3,4-dichlorophenyl) ethylamine, 1- (3-cyanophenyl) ethylamine, 1- (4-hydroxyphenyl) ethylamine, 1- (4-methoxyphenyl) ethylamine, 1- (4-methylphenyl) ethylamine 1- (4-chlorophenyl) ethylamine, 1- (3,4-dimethoxyphenyl) -2-aminopropane, 1- (4-methoxyphenyl) -2-aminopropane, 1- (4-chlorophenyl) -2- Aminopropane, 1- (4-hydroxyphenyl) -2-aminopropane, 1- ( -Methylphenyl) -2-aminopropane, 1- (3,4-methylenedioxyphenyl) -2-aminopropane, 1-phenyl-1-aminopropane, 1- (α-naphthyl) ethylamine, 1- (β -Naphthyl) ethylamine and the like.
[0073]
The ratio of the optical isomers in the amino group-containing compound (10) used in this improvement method B is not particularly limited, but from an industrial standpoint, the amino group-containing compound (10) is usually supplied in a racemic form. In many cases, it is advantageous to use a racemate as the amino group-containing compound (10).
This improvement method B can be implemented according to the conditions described in this improvement method A. In the present improvement method B, the ratio of the amino compound isomer (12) is improved when the amino compound is selected from two optical isomers based on the asymmetric carbon bonded to the amino group of the amino group-containing compound (10). The isomer (12) means that the ratio of the amino compound isomer (12) to the different isomer is improved.
The amino group-containing compound (10) having an improved ratio of the amino compound isomer (12) obtained by the present improvement method B can be recovered from the reaction solution by a known treatment method. For example, after separating the microorganism culture, microorganism cells, and treated cells from the reaction solution by centrifugation, the supernatant is acidified and extracted and separated with an organic solvent such as diethyl ether or toluene. The organic layer is removed, and then the aqueous layer is made basic and extracted and separated with a similar organic solvent. After removing the aqueous layer, the solvent is distilled off under reduced pressure, and further purification such as distillation is added if necessary. Can be recovered.
[0074]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited at all by those Examples.
The quantitative analysis of the optically active amino compounds in Examples 1 to 8 was performed by gas chromatography under the following conditions (1), and the optical purity analysis was performed by HPLC under the following conditions (2). In addition, quantitative analysis and optical purity analysis of the optically active amino compounds in Examples 12 to 15 were performed by HPLC under the condition (4) below after the derivatization treatment (3) below.
[0075]
(1) Quantitative analysis of amino compounds (gas chromatography)
Column: DB-17 (inner diameter 0.25 mm, film thickness 0.25 μm, length 30 m, manufactured by J & W)
-Column temperature conditions: Temperature rise from 80 ° C to 250 ° C (temperature rise rate 5 ° C / min)
-Detector: FID (detector temperature 250 ° C)
(2) Optical purity analysis of amino compounds (HPLC)
Column: OA-4100 or OA-4800 (manufactured by Sumika Chemical Analysis Co., Ltd.)
Mobile phase: n-hexane: ethanol: trifluoroacetic acid = 240: 10: 1
Detection wavelength: 254 nm
(3) Derivatization of amino compounds
To 50 μl of the reaction solution, 100 μl of 4 mg / ml 2,3,4,6-tetra-O-acetyl β-glucopyranosyl isothiocyanate (GITC, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) acetonitrile solution and 50 μl of 2 mg / ml triethylamine acetonitrile solution were added. Add and let stand at 30 ° C. for 30 minutes. Let the filtrate after filtering with a 0.2 micrometer filter be a sample for HPLC.
(4) Determination of amino compounds and optical purity analysis (HPLC)
Column: Sumipac ODS L-03-4615 (manufactured by Sumika Chemical Analysis Center)
Column temperature: 35 ° C
Flow rate: 1 ml / min
Detection wavelength: UV254nm
Eluent A: 20 mM KH2POFour(PH 3.7)
Eluent B: Acetonitrile
Elution condition: The ratio of B in the eluate is changed to 10 to 60% depending on the analysis compound.
[0076]
Example 1 (Purification of this protein)
(1) Glycerol 0.2% (w / v), sodium pyruvate 0.1% (w / v), (R) -1-phenylethylamine 0.2% (w / v), dipotassium phosphate 0 .45% (w / v), monopotassium phosphate 0.3% (w / v), magnesium sulfate 0.01% (w / v), ferrous sulfate heptahydrate 0.0001% (w / v) v), zinc sulfate heptahydrate 0.0001% (w / v), manganese sulfate trihydrate 0.0001% (w / v), cobalt chloride hexahydrate 0.0001% (w / v) 1 mL of a culture solution of Mycobacterium aurum SC-S423 previously cultured in a medium having the same composition was inoculated into a 500 mL Sakaguchi flask containing 100 ml of a sterile medium (pH 7.0) having the composition of Cultured for 7 days with shaking. The bacterial cells were collected from 4 L of the culture solution thus obtained by centrifugation (10,000 × G, 10 minutes), and the obtained wet bacterial cells were added with 100 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0). By washing twice, 18 g of wet cells were obtained.
[0077]
(2) 16 g of the wet cells were suspended in 60 ml of 20 mM Bistrispropane (pH 7.0) containing 20 μM-pyridoxal-5-phosphate (hereinafter referred to as PLP). This was crushed for 20 minutes with an ultrasonic crusher (SONIFIER (registered trademark of Branson Sonic Power)) to obtain a cell lysate. The cell lysate was centrifuged at 13,000 × g for 15 minutes and then filtered through a membrane filter (0.45 μ), and the filtrate was collected to obtain a cell-free extract. This cell-free extract was introduced into a Q Sepharose FF column (26 mmφ × 10 cm, manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), and a sodium chloride linear gradient (concentration gradient 0.01 M / min, in 20 mM bistrispropane (pH 7.0)). Anion exchange chromatography eluting with a concentration range of 0 M to 0.6 M and a flow rate of 8 ml / min) was performed. 80 ml fractions eluted at a sodium chloride concentration of 0.35M to 0.45M were collected. After adding ammonium sulfate to 63 ml of this fraction to a final concentration of 0.8 M, this was introduced into a Phenyl-Sepharose HP column (16 mmφ × 10 cm, manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), and 20 mM Bistrispropane ( Hydrophobic chromatography eluting with a linear ammonium sulfate concentration gradient (concentration gradient 0.008 M / min, concentration range 0.8 M to 0 M, flow rate 3 ml / min) in pH 7.0). 24 ml fractions eluted at an ammonium sulfate concentration of 0.4 M to 0.35 M were collected and used as an enzyme solution.
[0078]
(3) The enzyme solution obtained in (2) was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (gel: PhastGel Gradient 10-15, buffer strip: PhastGel SDS buffer strip, system: Phast System (both manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) )), Almost single band was detected.
In addition, the enzyme solution was introduced into a gel filtration column TSK-gel G3000SW (600 mm × 7.5 mm ID, manufactured by Tosoh Corporation), and eluted with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.15 M NaCl. As a result, optically active amino compound-forming activity was eluted at a position corresponding to a molecular weight of about 310 kDa.
[0079]
Example 2
200 μl of the enzyme solution obtained in Example 1 was diluted to 200 μl with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0), and this was diluted with 10 μmol acetophenone, 100 μmol racemic sec-butylamine, 0.02 μmol PLP. Was added to 800 μl of a 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) solution and incubated at 40 ° C. for 71 hours. After the incubation, the optically active amino compound in the reaction solution was quantitatively analyzed. As a result, the yield of 1-phenylethylamine was 19.9%, and the optical isomer ratio was 100% for the R-isomer.
[0080]
Example 3
200 μl of the enzyme solution obtained in Example 1 was diluted to 200 μl with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0), and this was diluted with 10 μmol acetophenone, 100 μmol D-alanine, 0.02 μmol pyridoxal-5-phosphorus. The solution was added to 800 μl of a 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) aqueous solution containing acid (PLP) and kept at 40 ° C. for 3 hours. Next, a part of the reaction solution was taken and quantitative analysis of the amino compound was performed. As a result, the yield of 1-phenylethylamine was 2.6%, and the ratio of optical isomers was 100% for the R-isomer.
[0081]
Example 4
When 1-phenylethylamine is used as the racemic amino compound in 360 μl of 0.1 M phosphate buffer (pH 6) containing 5 μmol of the racemic amino compound, 10 μmol of sodium pyruvate, and 0.01 μmol of PLP shown in Table 1. When 140 μl of the enzyme solution obtained in Example 1 was added and 1- (3,4-dichlorophenyl) -ethylamine or 1- (3,4-dimethoxyphenyl) -2-aminopropane was used, it was obtained in Example 1. 140 μl of the resulting enzyme solution diluted 2-fold with 0.1 M phosphate buffer (pH 6) was added and reacted at 40 ° C. for 1 hour. The ratio of optical isomers of amino compounds remaining in the reaction solution was examined. The results are shown in Table 1.
[0082]
[Table 1]
Example 5
(1) Glycerol 0.2% (w / v), sodium pyruvate 0.1% (w / v), (R) -1-phenylethylamine 0.2% (w / v), dipotassium phosphate 0 .45% (w / v), monopotassium phosphate 0.3% (w / v), magnesium sulfate 0.01% (w / v), ferrous sulfate heptahydrate 0.0001% (w / v) v), zinc sulfate heptahydrate 0.0001% (w / v), manganese sulfate trihydrate 0.0001% (w / v), cobalt chloride hexahydrate 0.0001% (w / v) 1 mL of a Mycobacterium aurum SC-S423 strain culture medium previously cultured in a medium of the same composition was placed in a 500 mL Sakaguchi flask containing 100 ml of a sterile medium (pH 7.0) having the composition of The culture was continued for 7 days.
[0084]
(2) Bacteria were collected from this culture by centrifugation (10000 × g, 10 minutes) to obtain wet cells.
[0085]
(3) The obtained wet cells were suspended in 2 mL of 100 mM glycine buffer (pH 9.0). 0.2% (v / v) racemic 1-phenylethylamine aqueous solution (pH 9.0) 1260 μL, 2.2% (w / v) sodium pyruvate aqueous solution 200 μL, 100 mM glycine buffer (pH 9.0) 440 μL Further, 100 μL of the above cell suspension was added and incubated at 30 ° C. for 21.5 hours. A portion of the reaction solution was taken, 2 volumes of methanol was added, and after sufficient stirring, the supernatant from which the cells were removed by centrifugation was analyzed by gas chromatography. As a result, 54% of 1-phenylethylamine was analyzed. Disappeared. Further, after adjusting the pH of the remaining reaction solution to pH 12 using an aqueous sodium hydroxide solution, the remaining 1-phenylethylamine was extracted using diethyl ether. When the optical purity of 1-phenylethylamine in the extract was measured using HPLC, the ratio of (R) isomer / (S) isomer was 0/100.
[0086]
Example 6
(1) Cell bodies were collected by centrifugation (10,000 × g, 10 minutes) from 1 L of a culture solution obtained by culturing in 10 500 mL Sakaguchi flasks by the same method as in Example 5 (1). The obtained wet cells were suspended in 50 mL of distilled water.
[0087]
(2) 200 μL of racemic 1-phenylethylamine and 900 μL of 2N aqueous sulfuric acid solution dissolved in 100 ml of distilled water were dissolved in 630 μL of racemic 1-phenylethylamine aqueous solution of 100% of 2.2% (w / v) sodium pyruvate aqueous solution. 1M buffer (pH 5-6 is citrate buffer, pH 6-8 is phosphate buffer, pH 8-9 is Tris-HCl buffer, pH 9-10 is glycine buffer, pH 11 is carbonated. 100 μl of distilled water and 70 μL of distilled water were added, and 100 μL of the above cell suspension was further added to start the reaction. After incubating at 30 ° C for 1 hour, take a part of the reaction solution, add 2 volumes of methanol, stir well, remove the cells by centrifugation, separate the supernatant and remove the gas Analyzed by chromatography. The disappearance rate of the amine was compared as a relative value with pH 6 (citrate buffer) as 100. The results are shown in Table 2.
[0088]
[Table 2]
Example 7
100 μL of 2.2% (w / v) sodium pyruvate aqueous solution was added to 630 μL of racemic 1-phenylethylamine aqueous solution in which 200 μL of racemic 1-phenylethylamine and 900 μL of 2N sulfuric acid aqueous solution were dissolved in 100 ml of distilled water. To this, 100 μl of glycine buffer adjusted to 1 M pH 9 and 70 μl of distilled water were added, and 100 μl of the cell suspension obtained in the same manner as in Example 6 (1) was added to initiate the reaction. After incubation at 20 ° C. to 60 ° C. for 1 hour, a part of the reaction solution was taken and twice as much methanol was added. After thoroughly stirring this mixture, the cells were removed by centrifugation, and the supernatant was collected and quantitatively analyzed by gas chromatography. The disappearance rate of the amino compound was compared as a relative value with 50 ° C as 100. The results are shown in Table 3.
[0090]
[Table 3]
Example 8
0.02% (v / v) racemic 1- (2,4-dichlorophenyl) ethylamine aqueous solution (pH 9.0) 1370 μL, 2.2% (w / v) sodium pyruvate aqueous solution 200 μL, 100 mM glycine buffer (PH 9.0) 230 μL was added, and 200 μL of the cell suspension obtained in Example 6 (1) was further added, followed by incubation at 30 ° C. for 110 hours. A part of the reaction solution was taken, and twice the amount of methanol was added and stirred sufficiently. Then, the cells were removed by centrifugation, and the supernatant was collected and quantitatively analyzed by gas chromatography. As a result, 46% of 1- (2,4-dichlorophenyl) ethylamine disappeared. Further, after adjusting the pH of the remaining reaction solution to pH 12 using an aqueous sodium hydroxide solution, the remaining 1- (2,4-dichlorophenyl) ethylamine was extracted using diethyl ether. When the optical purity of 1- (2,4-dichlorophenyl) ethylamine in the extract was measured using HPLC, the ratio of (R) isomer / (S) isomer was 20/80.
[0092]
Example 9
2 ml of the enzyme solution obtained in Example 1 was divided into 4 portions and subjected to HPLC using a reverse phase column. The conditions for the reverse phase HPLC are shown below.
[Reverse phase HPLC conditions]
Column: Protein-RP, 250 mm × 4.6 mm ID, particle size 5 μm
(Manufactured by YMC Corporation)
Column temperature: room temperature
Flow rate: 1 ml / min
Detection: UV230nm
Eluent A: distilled water containing 0.1% trifluoroacetic acid
Eluent B: acetonitrile containing 0.08% trifluoroacetic acid
Elution conditions: The sample was applied to the column equilibrated with Eluent A, and then the mixture of Eluent A and Eluent B was increased from 0% to 80% over 40 minutes. Elute with.
[0093]
The fraction eluted with an eluate having an eluate B ratio of around 60% was collected. About 3 ml (about 800 μl × 4 portions) of the obtained fraction was lyophilized, and then a part of the lyophilized sample was subjected to a gas phase protein sequencer 470A (Applied Biosystems) to obtain the amino terminus of the protein. The amino acid sequence of was examined. As a result, the protein was found to have the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
[0094]
The remaining lyophilized sample was dissolved in distilled water, 2 μl of a 1 mg / ml trypsin solution was added thereto, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 24 hours. The solution after the incubation was subjected to reverse phase HPLC to separate and purify the trypsin digest. The conditions of reverse phase HPLC are shown below.
[0095]
[Reverse phase HPLC conditions]
Column: ODS-A211, 250 mm × 4.6 mm ID, particle size 5 μm
(Manufactured by Sumika Chemical Analysis Center)
Column temperature: room temperature
Flow rate: 1 ml / min
Detection: UV230nm
Eluent A: 0.1% trifluoroacetic acid / water
Eluent B: 0.08% trifluoroacetic acid / acetonitrile
Elution conditions: The sample was applied to a column equilibrated with an eluent mixed with 95% eluent A and 5% eluent B, and then the eluent B ratio was reduced to 65% over 60 minutes. While elevating, elution is performed with a mixture of eluent A and eluent B.
[0096]
Each tryptic digest obtained was examined for amino acid sequence by the same method as described above. As a result, the digest was found to have the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
[0097]
Example 10
(1) Preparation of chromosomal DNA of Mycobacterium aurum SC-S4-23
Glucose 0.5% (w / v), peptone 1.0% (w / v), yeast extract 1.25% (w / v), malto extract 1.0% (w / v) and sodium chloride The Mycobacterium aurum SC-S4-23 strain is inoculated into a sterile medium (pH 7.0) having a composition of 5% (w / v), cultured for 64 hours, and then centrifuged from 1000 ml of the obtained culture solution. Was recovered. The obtained cells were resuspended in 900 ml of a sterilized medium having a composition of D-cycloserine 100 μg / ml, glycine 1.4 (w / v)%, EDTA 60 mM, lysozyme 200 μg / ml, and incubated at 30 ° C. for 21 hours.
Centrifugation was performed on 900 ml of the suspension to collect bacterial cells. The obtained microbial cells were resuspended in 10 ml of buffer (containing pH 8.0, Tris 50 mM, EDTA 50 mM, NaCl 100 mM). SDS was added thereto so that the final concentration was 0.5%, and Proteinase K (manufactured by Boehringer Mannheim) was further added so that the final concentration was 200 μg / ml, followed by incubation at 55 ° C. for 18 hours.
After DNA was extracted from the incubated suspension by the phenol: chloroform: isoamyl alcohol method, ethanol cooled to −20 ° C. was added to the extracted fraction, and the precipitated DNA was wound up with a glass rod. The DNA was air-dried, dissolved in TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0), RNAase was added thereto to a final concentration of 50 μg / ml, and incubated at 37 ° C. for 1 hour. This was used as a chromosomal DNA sample.
[0098]
(2) Primer synthesis
Based on the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, a mixture of oligonucleotides consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 (hereinafter referred to as primer G24-1) was synthesized. Further, based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, a mixture of oligonucleotides consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 (hereinafter referred to as primer RG32-1) was synthesized. For the synthesis of oligonucleotides, an automatic DNA synthesizer model 380A (manufactured by Applied Biosystems) was used.
[0099]
(3) PCR amplification and cloning of DNA having a partial base sequence of this gene I
PCR was performed using primer G24-1 and primer RG32-1 synthesized in (2) and the chromosomal DNA prepared in (1) as a template. The PCR conditions are shown below. For the preparation of the reaction solution, Advantage cDNA PCR Kit manufactured by CLONTECH was used.
[0100]
[Reaction solution composition]
Chromosomal DNA sample (1ng / μl) 1μl
Primer (10 μM each) 0.5 μl each x 2 types
× 50 dNTPs mix (10 mM each) 0.5 μl
× 10 cDNA PCR Reaction Buffer 2.5μl
× 50 Advantage cDNA Polymerase Mix 0.5μl
19.5μl of ultrapure water
[Reaction temperature conditions]
1) 94 ° C for 1 minute
2) 94 ° C for 30 seconds
3) 68 ° C for 3 minutes
4) 94 ° C for 20 seconds
5) 68 ° C for 3 minutes
6) 68 ° C for 3 minutes
However, 4) to 5) are set as one cycle and this is repeated 34 cycles.
[0101]
After the reaction, the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis and the product was examined. As a result, amplification of about 800 bp DNA was confirmed. The DNA was ligated to the “PCR Product insertion site” of plasmid vector pCR2.1 using TA cloning kit (manufactured by Invitrogen). It was introduced into Escherichia coli JM109 strain (using Toyobo's competitor high JM109) to obtain a transformant.
Subsequently, DNA of a plasmid possessed by the obtained transformant was prepared, and its base sequence was determined using a dye terminator cycle sequencing ready reaction kit and an automatic base sequence analyzer 373A (Company). As a result, it was found that this plasmid contained DNA having the base sequence (730 bp) represented by base numbers 231 to 960 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
[0102]
(4) PCR amplification and cloning of DNA having a partial base sequence of this gene II
Based on the 730 bp base sequence obtained in (3), an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 was synthesized.
The chromosomal DNA prepared by the method described in (1) was partially digested with the restriction enzyme Sau3A1 and ligated to the multicloning site of the plasmid vector pUC118. Next, PCR was carried out using the ligated DNA as a template and an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 and an RV primer (Takara Shuzo) as primers. PCR conditions are shown below. For the preparation of the reaction solution, Advantage cDNA PCR Kit manufactured by CLONTECH was used.
[Reaction solution composition]
Template DNA 5μl
Primer (10 μM each) 1 μl each x 2 types
× 50 dNTPs mix (10 mM each) 1 μl
× 10 cDNA PCR Reaction Buffer 5 μl
× 50 Advantage cDNA Polymerase Mix 1μl
36μl of ultrapure water
[Reaction conditions]
1) 94 ° C (1 minute)
2) 94 ° C (0.5 minutes)
3) 68 ℃ (3 minutes)
4) 68 ℃ (3 minutes)
However, 2) to 3) are set as one cycle, and this is repeated 30 cycles.
After the reaction, the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis and the product was examined. As a result, amplification of about 1 kbp of DNA was confirmed. The DNA was ligated to the “PCR Product insertion site” of plasmid vector pCR2.1 using TA cloning kit (manufactured by Invitrogen). It was introduced into Escherichia coli JM109 strain (using Toyobo's competitor high JM109) to obtain a transformant. Plasmid DNA possessed by the obtained transformant was prepared, and the nucleotide sequence was determined in the same manner as in (3). As a result, it was found that this plasmid contains the base sequence represented by base numbers 1-230 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
[0103]
(5) PCR amplification and cloning of DNA having a partial base sequence of this gene III
Based on the 730 bp base sequence obtained in (3), an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 were synthesized.
Chromosomal DNA prepared by the method described in (1) was digested with the restriction enzyme EcoRI and ligated with EcoRI Cassette (Takara Shuzo Co., Ltd.). Takara LA PCR in vitro Cloning Kit manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. was used for preparing the reaction solution. The conditions are shown below.
[Reaction solution composition]
5 μl of restriction enzyme-treated DNA
EcoRI Cassette 2.5μl (20ng / μl)
ligation kit ver2 solnI 15μl
ligation kit ver2 solnII 7.5μl
After reaction at 16 ° C. for 30 minutes, the DNA was recovered by ethanol precipitation and dissolved in 5 μl of TE buffer.
To 1 μl of the obtained DNA lysate, 13.5 μl of ultrapure water was added and heated at 94 ° C. for 10 minutes. Using this as a template, PCR was performed using an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 and Cassette Primer C1 (Takara Shuzo Co., Ltd.) as primers. PCR conditions are shown below. Takara LA PCR in vitro Cloning Kit manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. was used for preparing the reaction solution.
[Reaction solution composition]
Template DNA 14.5 μl
Primer (10 μM each) 1 μl each x 2 types
dNTPs 8μl
× 2 GC Buffer 25μl
LA Taq 0.5μl (2.5U)
[Reaction conditions]
1) 94 ° C (0.5 minutes)
2) 55 ° C (2 minutes)
3) 72 ° C (3 minutes)
[0104]
However, 1) to 3) are set as one cycle, and this is repeated 30 cycles.
Next, the reaction solution after the above reaction is diluted 10-fold, 1 μl thereof is used as a template, and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and Cassette Primer C2 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) are used as primers. PCR was performed. PCR conditions are shown below. Takara LA PCR in vitro Cloning Kit manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. was used for preparing the reaction solution.
[Reaction solution composition]
Template DNA 1 μl
Primer (10 μM each) 1 μl each x 2 types
dNTPs 8μl
× 2 GC Buffer 25μl
LA Taq 0.5μl (2.5U)
Ultrapure water 13.5μl
[Reaction conditions]
1) 94 ° C (0.5 minutes)
2) 55 ° C (2 minutes)
3) 72 ° C (3 minutes)
However, 1) to 3) are set as one cycle, and this is repeated 30 cycles.
After the reaction, the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis and the product was examined. As a result, amplification of DNA was confirmed. The DNA fragment was recovered from the gel and cloned into pT7blue T-vector (Novagen). DNA of the obtained plasmid was prepared, and the base sequence was determined by the same method as (3). As a result, it was found that this plasmid contains the base sequence represented by base numbers 961 to 1020 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
From this example, it was revealed that the gene derived from Mycobacterium aurum SC-S423 has the base sequence (1020 bp) represented by SEQ ID NO: 2.
[0105]
Example 11
Based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 confirmed in Example 10, an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 (hereinafter referred to as primer F-4 / NcoI) and SEQ ID NO: 12 An oligonucleotide consisting of a base sequence (hereinafter referred to as primer R1030 / BamHI) was synthesized.
PCR was performed using the primer F-4 / NcoI and the primer R1030 / BamH1 and the chromosomal DNA prepared by the method described in Example 10 (1) as a template. The PCR conditions are shown below. For the preparation of the reaction solution, an Expand High Fidelity PCR System manufactured by Boehringer Mannheim was used.
[0106]
[Reaction solution composition]
Genomic DNA stock solution (0.1 μg / μl) 1.0 μl
Primer (4 pmol / μl each) 5.0 μl each x 2 types
dNTPmix (2.5 mM each) 8.0 μl
× 10 Expand HF buffer with 15mM MgCl2 10.0 μl
Expand High Fidelity PCR System enzyme mix 0.75μl
71.0μl of ultrapure water
[Reaction conditions]
1) 95 ° C (2 minutes)
2) 96 ° C (15 seconds)
3) 60 ℃ (15 seconds)
4) 72 ° C (1 minute)
5) 72 ° C (10 minutes)
However, 2) to 4) are regarded as one cycle and this is repeated 25 cycles.
[0107]
The DNA after the reaction was cleaved with NcoI and BamHI and then purified using Qiagen purple spin column (Qiagen). The purified DNA was ligated to the NcoI and BamHI sites downstream of the trc promoter of the plasmid vector pTrc99a (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). A transformant was obtained by introducing into E. coli strain JM109. The plasmid possessed by the obtained transformant was designated as ptrc9. Next, the base sequence of the plasmid ptrc9 was determined by the same method as described above using ABI Prism sequencung kit (Perkin Elmer). As a result, ptrc9 has a base sequence (1020 bp) in which a (adenine) in base number 4 is replaced with g (guanine) in the base sequence represented by base numbers 1 to 1020 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. Was found to be included.
[0108]
Example 12
The sterilized 50 ml LB medium containing ampicillin (50 μg / ml) and IPTG (1 mM) was inoculated with the transformant E. coli JM109 / ptrc9 prepared in Example 11 and shaken at 30 ° C. overnight. After incubation, the cells were collected by centrifugation, and the resulting cells were suspended in 470 μl of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0).
530 μl of a 100 mM phosphate buffer (pH 6) solution containing 10 μmol of acetophenone, 400 μmol of racemic sec-butylamine, 0.02 μmol of PLP is added to the cell suspension, and the mixture is incubated at 130 rpm for 40 hours. did. After the incubation, quantitative analysis of 1-phenylethylamine in the reaction solution was performed. As a result, 0.45 mM 1-phenylethylamine was detected in the reaction solution, and the ratio of the optical isomers was 100% of the R isomer.
[0109]
Example 13
The sterilized 5 ml LB medium containing ampicillin (50 μg / ml) and IPTG (1 mM) is inoculated with the transformant E. coli JM109 / ptrc9 prepared in Example 11 and shaken at 30 ° C. overnight. After incubation, the cells were collected by centrifugation, and the resulting cells were suspended in 280 μl of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0).
720 μl of a 100 mM phosphate buffer (pH 6) solution containing 10 μmol of racemic 1-phenylethylamine, 20 μmol of sodium pyruvate, 0.02 μmol of PLP was added to the resulting bacterial cell suspension, and 40 μm at 130 rpm. It was kept at 60 ° C. for 60 minutes. After the incubation, quantitative analysis of 1-phenylethylamine in the reaction solution was performed. As a result, the recovery rate of 1-phenylethylamine was 50%, and the optical purity was 99.5% e.e.
[0110]
Example 14
To 280 μl of the cell suspension prepared in the same manner as in Example 13, 720 μl of a 100 mM phosphate buffer (pH 6) solution containing 10 μmol R-1-phenylethylamine, 20 μmol sodium pyruvate, 0.02 μmol PLP was added. The mixture was added and kept at 40 ° C. for 7 minutes at 130 rpm. After the incubation, the optically active amino compound in the reaction solution was quantitatively analyzed. As a result, 5.9 mM alanine was produced, and the optical purity of the D-form was 73.8% ee.
[0111]
Example 15
Sterilized 30 ml of LB medium containing ampicillin (50 μg / ml) and IPTG (1 mM) is inoculated with the transformant E. coli JM109 / ptrc9 prepared in Example 11 and shaken at 30 ° C. overnight. After culturing, the cells were collected by centrifugation, and the obtained cells were suspended in 200 μl of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0).
820 μl of a 100 mM phosphate buffer (pH 6) solution containing 30 μmol R-1-phenylethylamine, 30 μmol lithium β-hydroxypyruvate, 0.02 μmol PLP is added to the above cell suspension, and shaken at 130 rpm. The temperature was kept at 40 ° C. for 60 minutes. After the incubation, the optically active amino compound in the reaction solution was quantitatively analyzed. As a result, 24.5 mM of serine was formed (conversion rate: 82%), and the optical purity was 99.4% ee in D form.
[0112]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the novel protein which has the capability to catalyze a transamination reaction stereoselectively, the gene which codes this protein, etc. can be provided.
[0113]
[Sequence Listing Free Text]
SEQ ID NO: 6
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 7
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 8
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 9
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 10
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 11
Oligonucleotide primers designed for PCR
SEQ ID NO: 12
Oligonucleotide primers designed for PCR
[0114]
[Sequence Listing]
Claims (22)
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。
（ｃ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｄ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｅ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するMycobacterium属に属する微生物から得られうる蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。A protein having any one of the following amino acid sequences (a), (c), (d), and (e):
(A) The amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(C) an amino acid sequence of a protein having the ability to convert acetophenone to the R-form of 1-phenylethylamine in the presence of racemic sec-butylamine, and 95 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence exhibiting at least% amino acid identity.
(D) the amino acid sequence of a protein having a molecular weight of 37 kDa as a monomer having the ability to convert acetophenone to the R-form of 1-phenylethylamine in the presence of racemic sec-butylamine, and represented by SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence showing 95% or more amino acid identity to the amino acid sequence.
(E) an amino acid sequence of a protein obtainable from a microorganism belonging to the genus Mycobacterium having the ability to convert acetophenone to the R-form of 1-phenylethylamine in the presence of racemic sec-butylamine, and SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence showing 95% or more amino acid identity to the amino acid sequence shown in FIG.
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列のうち塩基番号１〜１０１７で表される塩基配列に対応するアミノ酸配列。
（ｃ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｄ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｅ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するMycobacterium属に属する微生物から得られうる蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。A gene encoding a protein having any one of the following amino acid sequences (a) to (e):
(A) The amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(B) An amino acid sequence corresponding to the base sequence represented by base numbers 1 to 1017 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(C) an amino acid sequence of a protein having the ability to convert acetophenone to the R-form of 1-phenylethylamine in the presence of racemic sec-butylamine, and 95 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence exhibiting at least% amino acid identity.
(D) the amino acid sequence of a protein having a molecular weight of 37 kDa as a monomer having the ability to convert acetophenone to the R-form of 1-phenylethylamine in the presence of racemic sec-butylamine, and represented by SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence showing 95% or more amino acid identity to the amino acid sequence.
(E) an amino acid sequence of a protein obtainable from a microorganism belonging to the genus Mycobacterium having the ability to convert acetophenone to the R-form of 1-phenylethylamine in the presence of racemic sec-butylamine, and SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence showing 95% or more amino acid identity to the amino acid sequence shown in FIG.
（ａ’）配列番号２で示される塩基配列のうち塩基番号１〜１０１７で表される塩基配列。
（ｂ’）配列番号２で示される塩基配列の塩基番号１〜１０１７のうち、塩基番号４であるアデニン（ａ）がグアニン（ｇ）に置換された塩基配列。 A gene having any one of the following base sequences (a ′) and ( b ′ ):
(A ′) A base sequence represented by base numbers 1 to 1017 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B ′) A base sequence in which adenine (a) which is base number 4 is replaced with guanine (g) among base numbers 1 to 1017 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 .
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。
（ｃ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｄ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｅ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するMycobacterium属に属する微生物から得られうる蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。A method for producing a protein having any one of the following amino acid sequences (a), (c), (d), and (e), comprising a step of culturing a microorganism having the gene according to claim 5.
(A) The amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(C) an amino acid sequence of a protein having the ability to convert acetophenone to the R-form of 1-phenylethylamine in the presence of racemic sec-butylamine, and 95 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence exhibiting at least% amino acid identity.
(D) the amino acid sequence of a protein having a molecular weight of 37 kDa as a monomer having the ability to convert acetophenone to the R-form of 1-phenylethylamine in the presence of racemic sec-butylamine, and represented by SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence showing 95% or more amino acid identity to the amino acid sequence.
(E) an amino acid sequence of a protein obtainable from a microorganism belonging to the genus Mycobacterium having the ability to convert acetophenone to the R-form of 1-phenylethylamine in the presence of racemic sec-butylamine, and SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence showing 95% or more amino acid identity to the amino acid sequence shown in FIG.
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列。
（ｃ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有する蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｄ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するモノマーとしての分子量３７ｋＤａの蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。
（ｅ）ラセミ体のｓｅｃ−ブチルアミンの存在下にアセトフェノンを１−フェニルエチルアミンのＲ−体に変換する能力を有するMycobacterium属に属する微生物から得られうる蛋白質のアミノ酸配列であって、かつ配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９５％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列。A method for producing a protein having any one of the following amino acid sequences (a), (c), (d), and (e), comprising a step of culturing the transformant according to claim 11 or 12 .
(A) The amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1.
(C) an amino acid sequence of a protein having the ability to convert acetophenone to the R-form of 1-phenylethylamine in the presence of racemic sec-butylamine, and 95 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence exhibiting at least% amino acid identity.
(D) the amino acid sequence of a protein having a molecular weight of 37 kDa as a monomer having the ability to convert acetophenone to the R-form of 1-phenylethylamine in the presence of racemic sec-butylamine, and represented by SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence showing 95% or more amino acid identity to the amino acid sequence.
(E) an amino acid sequence of a protein obtainable from a microorganism belonging to the genus Mycobacterium having the ability to convert acetophenone to the R-form of 1-phenylethylamine in the presence of racemic sec-butylamine, and SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence showing 95% or more amino acid identity to the amino acid sequence shown in FIG.
で示されるケトン化合物に、一般式（２）
で示されるアミノ基含有化合物のＲ−体の存在下、請求項１記載の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（３）
で示される光学活性アミノ化合物（Ｒ−体）の製造方法。General formula (1)
A ketone compound represented by general formula (2):
The protein of claim 1 is allowed to act in the presence of the R-form of an amino group-containing compound represented by the general formula (3)
The manufacturing method of the optically active amino compound (R-isomer) shown by these.
で示されるケトン化合物に、
で示されるアミノ基含有化合物のＲ−体の存在下、請求項１記載の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（６）
で示される光学活性アミノ化合物（Ｒ−体）の製造方法。General formula (4)
In the ketone compound represented by
The protein according to claim 1 is allowed to act in the presence of the R-form of an amino group-containing compound represented by the general formula (6)
The manufacturing method of the optically active amino compound (R-isomer) shown by these.
で示されるケトン化合物に、一般式（２）
で示されるアミノ基含有化合物のＲ−体の存在下、請求項１記載の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（８）
で示される光学活性アミノ化合物（Ｒ−体）の製造方法。General formula (7)
A ketone compound represented by general formula (2):
The protein according to claim 1 is allowed to act in the presence of the R-form of an amino group-containing compound represented by the general formula (8):
The manufacturing method of the optically active amino compound (R-isomer) shown by these.
で示されるアミノ基含有化合物のＲ−体に、一般式（１１）
で示されるケトン化合物の存在下、請求項１記載の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（９）
で示されるアミノ化合物Ｓ−体の比率の向上方法。Formula (13)
In the R-form of the amino group-containing compound represented by general formula (11)
The protein according to claim 1 is allowed to act in the presence of a ketone compound represented by the general formula (9):
The improvement method of the ratio of the amino- compound S- form shown by these.
で示されるアミノ基含有化合物に、一般式（１１）
で示されるケトン化合物の存在下、請求項１の蛋白質を作用させることを特徴とする一般式（１２）
で示されるアミノ化合物Ｓ−体の比率の向上方法。General formula (10)
An amino group-containing compound represented by the general formula (11)
The protein of claim 1 is allowed to act in the presence of a ketone compound represented by the general formula (12):
The improvement method of the ratio of the amino-compound S- form shown by these.
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