JP4488723B2 - Gene encoding 1,2-α-L-fucosidase - Google Patents
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Description
本発明は、種々のオリゴ糖および糖タンパク質の末端α-(１→２)フコシド結合を特異的に加水分解する１,２-α-Ｌ-フコシダーゼをコードする遺伝子に関する。 The present invention relates to genes encoding 1,2-α-L-fucosidase that specifically hydrolyze terminal α- (1 → 2) fucoside bonds of various oligosaccharides and glycoproteins.
グラム陽性の偏性嫌気性菌であるビフィズス菌(Bifidobacteria)は、宿主に対する多くの有益な共生の効果、例えば下痢の防止、有害細菌および毒性化合物の減少、免疫調節ならびに抗発癌性活性を奏しており、腸管の健康を促進する重要な共生生物であると考えられている。近年、ビフィズス菌は多大な注目を引き付けてきたが、それらの共生効果に存在する正確な機構は、依然としてほとんど不明である。 Bifidobacteria, a Gram-positive obligate anaerobe, has many beneficial symbiotic effects on the host, such as prevention of diarrhea, reduction of harmful bacteria and toxic compounds, immunomodulation and anti-carcinogenic activity. It is considered an important symbiotic organism that promotes intestinal health. In recent years, bifidobacteria have attracted a great deal of attention, but the exact mechanism that exists in their symbiotic effects remains largely unknown.
自然中のビフィズス菌は、単糖類および二糖類の乏しい環境である下部腸管においてコロニーを形成する。なぜなら、このような糖類は、宿主および上部腸管に存在する微生物によって優先的に消費されるからである。下部腸管における栄養制限状態の下で生存するため、ビフィズス菌は、表面結合型および／または細胞外型で、多様な種類のエキソグリコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼ(これによって、ビフィズス菌は多様な炭水化物を利用することができる)を産生することが知られている。 Bifidobacteria in nature form colonies in the lower intestine, a monosaccharide and disaccharide poor environment. This is because such sugars are preferentially consumed by microorganisms present in the host and upper intestinal tract. Bifidobacteria are surface-bound and / or extracellular, so that they survive under nutrient-restricted conditions in the lower intestinal tract, a variety of types of exoglycosidases and endoglycosidases (thus, Bifidobacteria utilize a variety of carbohydrates Can be produced).
一方、ヒトの腸の上皮細胞はムチン糖タンパク質類を発現および／または分泌することが知られている。この糖タンパク質は、化学的損傷および物理的損傷から腸細胞を防御するのにおいて、そして病原体による侵襲を防止するのにおいて、重要な役割を果たすと考えられている。腸のムチン糖タンパク質類は、多数のＯ-結合オリゴ糖類を含み、その非還元末端ではＬ-フコシル残基が頻繁に見出される。Ｌ-フコシル残基は、α-Ｌ-フコシダーゼによって特異的に加水分解され、α-Ｌ-フコシダーゼの糖転移反応の触媒によりα-Ｌ-フコースを含むオリゴ糖の生成に寄与する。いくつかの糞便分解細菌(例えば、ビフィズス菌、クロストリジウム(Clostridia)およびバクテロイデス(Bacteroides))が、α-Ｌ-フコシダーゼを産生することを考慮すれば、α-Ｌ-フコシダーゼがヒト腸管におけるこれらの細菌による選択的なコロニー形成の原因であり得ることが予想される。したがって、ビフィズス菌の有するα-Ｌ-フコシダーゼの遺伝子を得ることができれば、選択的なコロニー形成の原因解明につながるのはもとより、腸内への定着に有利な微生物群、例えば乳酸菌の提供や、ビフィズス菌に対して有利に働く因子となる物質、例えばα-Ｌ-フコースを含む新規なオリゴ糖の提供やその利用、その製造に大きく寄与できる可能性がある。 On the other hand, human intestinal epithelial cells are known to express and / or secrete mucin glycoproteins. This glycoprotein is believed to play an important role in protecting enterocytes from chemical and physical damage and in preventing invasion by pathogens. Intestinal mucin glycoproteins contain a number of O 2 -linked oligosaccharides, and L-fucosyl residues are frequently found at their non-reducing ends. L-fucosyl residues are specifically hydrolyzed by α-L-fucosidase and contribute to the production of oligosaccharides containing α-L-fucose by catalyzing the transglycosylation reaction of α-L-fucosidase. Given that some fecal degrading bacteria (eg, Bifidobacteria, Clostridia and Bacteroides) produce α-L-fucosidase, α-L-fucosidase is one of these bacteria in the human intestine. It is expected that it may be responsible for selective colonization by Therefore, if the gene of α-L-fucosidase possessed by bifidobacteria can be obtained, it will not only lead to elucidation of the cause of selective colonization, but also provide a group of microorganisms advantageous for colonization in the intestine, such as lactic acid bacteria, There is a possibility that it can greatly contribute to the provision, utilization, and production of a novel oligosaccharide containing a substance that acts favorably against Bifidobacteria, for example, α-L-fucose.
現在まで、α-Ｌ-フコシダーゼはいくつかの原核生物および真核生物の供給源から精製されているが(例えば、特開２０００−１２５８５７号公報や特開平１１−１２３０７５号その他非特許文献１〜５などを参照)、ビフィズス菌からの単離精製は、本願発明者らも述べているように非常に困難であって(本願明細書、実施例の項)、ビフィズス菌由来のα-Ｌ-フコシダーゼが単離精製されたという報告は未だない。また、ビフィズス菌はもとよりその遺伝子のクローニングに関しての報告はほとんどなく、例えば、特開平７−３０８１９２号に開示されたストレプトマイセス(Streptomyces)種由来の１,３-／４-α-Ｌ-フコシダーゼ(ＧＨ２９ファミリー)遺伝子が知られているに過ぎない。
そこで、本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意努力したところ、ビフィズス菌から１,２-α-Ｌ-フコシダーゼをコードする遺伝子を見出し、当該遺伝子構造からビフィズス菌由来の１,２-α-Ｌ-フコシダーゼの構造を特定して、本願発明を完成するに至った。
Accordingly, the present inventors have made intensive efforts to achieve the above object, and found a
本発明は、
(１)配列表の配列番号１に示された塩基配列からなる非還元末端に位置するフコシルα１,２−ガラクトース結合に特異的な１,２-α-Ｌ-フコシダーゼをコードする単離された遺伝子、
(２)上記(１)に記載された遺伝子を含有する組換えベクター、
(３)上記(１)に記載された遺伝子を含有する組換えベクターが導入された組換体、
(４)上記(３)に記載された組換体を用いて非還元末端に位置するフコシルα１,２−ガラクトース結合に特異的な１,２-α-Ｌ-フコシダーゼを生産する方法、
(５)上記(３)に記載された組換体を用いて生産された非還元末端に位置するフコシルα１,２−ガラクトース結合に特異的な１,２-α-Ｌ-フコシダーゼ、
(６)配列表の配列番号２に示されたアミノ酸配列からなる非還元末端に位置するフコシルα１,２−ガラクトース結合に特異的な１,２-α-Ｌ-フコシダーゼ活性を有する酵素タンパク質
に係るものである。
The present invention
(1) An isolated gene encoding 1,2-α-L-fucosidase specific for fucosyl α1,2-galactose binding located at the non-reducing end consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing gene,
(2) a recombinant vector containing the gene described in (1) above,
(3) a recombinant into which a recombinant vector containing the gene described in (1) has been introduced;
(4) A method for producing 1,2-α-L-fucosidase specific for fucosyl α1,2-galactose binding located at the non-reducing end using the recombinant described in (3) above,
(5) 1,2-α-L-fucosidase specific for fucosyl α1,2-galactose binding located at the non-reducing end produced using the recombinant described in (3) above,
(6) It relates to an enzyme protein having 1,2-α-L-fucosidase activity specific for fucosyl α1,2-galactose binding located at the non-reducing end consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 Is.
本発明によれば、ビフィズス菌由来の１,２-α-Ｌ-フコシダーゼをコードする遺伝子が提供される。ビフィズス菌は腸管内におけるフコースオリゴ糖の活用により腸管に定着していると考えられるので、本発明による遺伝子を用いた遺伝子組換え手法によれば、腸管に定着しやすい有利な微生物群、例えば乳酸菌の提供や、ビフィズス菌に対して有利に働く因子となる物質、例えばα-Ｌ-フコースを含む新規なオリゴ糖の提供、α-Ｌ-フコースを含むオリゴ糖の新たな利用、その製造に大きく寄与できる可能性がある。そして、これらの微生物群や新規なオリゴ糖がヒトや動物の整腸作用を発揮、増進し、ヒトや動物の健康の維持促進に貢献する。 According to the present invention, a gene encoding 1,2-α-L-fucosidase derived from Bifidobacterium is provided. Since bifidobacteria are believed to have settled in the intestinal tract by utilizing fucose oligosaccharides in the intestinal tract, according to the genetic recombination technique using the gene according to the present invention, an advantageous group of microorganisms that are likely to settle in the intestinal tract, such as lactic acid bacteria And the provision of new oligosaccharides containing α-L-fucose, substances that can be a beneficial factor for bifidobacteria, such as α-L-fucose, There is a possibility to contribute. These microbial groups and novel oligosaccharides exert and enhance the intestinal action of humans and animals and contribute to the promotion of the maintenance of human and animal health.
本発明の１,２-α-Ｌ-フコシダーゼをコードする遺伝子(以下「ａｆｕＡ遺伝子」と称する)は、ビフィズス属に属するビフィズス菌(Bifidobacteria)から単離されたものである。この遺伝子は、配列表の配列番号１に示された塩基配列を有する。ａｆｕＡ遺伝子は６１２０の塩基対からなり、配列表の配列番号２に示された１９５９アミノ酸残基からなる分子量約２０万のタンパク質をコードする。ａｆｕＡ遺伝子は、図３に示すように、１３１〜１３７番塩基にＳＤ配列を有し、１４４〜６０２３番塩基に、配列番号２のアミノ酸配列で示されたタンパク質をコードする塩基配列を有する。 The gene encoding 1,2-α-L-fucosidase of the present invention (hereinafter referred to as “ afuA gene”) has been isolated from Bifidobacteria belonging to the genus Bifidobacteria. This gene has the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The afuA gene consists of 6120 base pairs and encodes a protein having a molecular weight of about 200,000 consisting of 1959 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. As shown in FIG. 3, the afuA gene has an SD sequence at bases 131 to 137, and a base sequence encoding the protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 at bases 144 to 6023.
当該タンパク質(以下「ＡｕｆＡタンパク質」と称する)は１,２-α-Ｌ-フコシダーゼ活性を有するものではあるが、従来から知られているグリコシド加水分解酵素ファミリーとは相同性を示さない。また、従来から知られているフコシダーゼとはそのアミノ酸配列を異にするものである。
当該タンパク質において、１,２-α-Ｌ-フコシダーゼ活性を担うドメインは、配列番号４のアミノ酸配列で示され、当該フコシダーゼの５７７〜１４７４番目のアミノ酸残基、ａｕｆＡ遺伝子の２６３９〜５３３２番目(配列番号１における１８７２−４５６５番目)の塩基に対応する。この塩基配列は配列番号３で示される。
本発明において、配列番号２に示されたＡｕｆＡタンパク質をコードする範囲内であれば、配列番号１の塩基配列のうち少なくとも１個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたものであってもよい。
The protein (hereinafter referred to as “AufA protein”) has 1,2-α-L-fucosidase activity, but does not show homology with the conventionally known glycoside hydrolase family. Further, it differs from the conventionally known fucosidase in its amino acid sequence.
In the protein, the domain responsible for 1,2-α-L-fucosidase activity is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the
In the present invention, at least one base in the base sequence of SEQ ID NO: 1 is deleted, substituted, inserted or added within the range encoding the AufA protein shown in SEQ ID NO: 2. Also good.
本発明の遺伝子がコードするタンパク質は、１,２-α-Ｌ-フコシダーゼ活性を損なわない程度に、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたものであってもよい。この欠失、置換等が行われる場所は、配列番号４に示されたドメイン領域であるかどうかを問わない。このような変異体としては、ＡｌａとＶａｌとの間、ＬｅｕとＩｌｅとの間、ＳｅｒとＴｈｒとの間、ＡｓｐとＧｌｕとの間、ＬｙｓとＡｒｇとの間等で置換の起こったものや、立体構造保持に不必要なルーツの部分が欠失したもの等が挙げられる。一般的には、このドメインが保存されていればよく、本発明には、例えば実施例において後述するように、例えば図４に示すｐＳＡ２０、ｐＳＡ８６、ｐＳＡ１１７で示されたプラスミドや当該プラスミドが導入された大腸菌などの組換体、当該プラスミドから発現された酵素タンパクが含まれる。 The protein encoded by the gene of the present invention may be one in which at least one amino acid is deleted, substituted, inserted or added to such an extent that the 1,2-α-L-fucosidase activity is not impaired. It does not matter whether the deletion, substitution or the like is performed in the domain region shown in SEQ ID NO: 4. Such mutants include those in which substitution occurs between Ala and Val, between Leu and Ile, between Ser and Thr, between Asp and Glu, between Lys and Arg, etc. , Roots unnecessary for maintaining the three-dimensional structure are deleted, and the like. Generally, this domain only needs to be conserved, and the present invention is introduced with, for example, the plasmids indicated by pSA20, pSA86, and pSA117 shown in FIG. Recombinants such as Escherichia coli, and enzyme proteins expressed from the plasmid.
配列番号２のアミノ酸配列で示されたＡｕｆＡタンパク質は、配列番号１の塩基配列の発現により得られるものであるので、配列番号１の塩基配列あるいはそのドメインに対応する塩基配列４などをベクターに導入して発現させることができる。すなわち、塩基配列が導入された組換えベクターを例えば大腸菌などの宿主に形質転換して組換体とし、その後、該組換体を用いて培養する。そして、培養された細胞からは、細胞破壊、塩析、溶媒沈澱、クロマトグラフィーによる分離精製など常法に従ってタンパク質を精製すればよい。これらの組換えベクターには、公知の発現系を有する遺伝子操作宿主細胞由来のプラスミドやファージ、コスミド等に本発明の遺伝子を挿入したものが用いられる。遺伝子操作宿主細胞由来のプラスミドとしては、例えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１９、サルモネラ菌由来のｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９などが挙げられる。組換えベクターを細胞に導入する形質転換についても特に制限されるものではなく、一般的な方法、例えば塩化カルシウム法などが利用できる。
Since the AufA protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is obtained by expressing the base sequence of SEQ ID NO: 1, the base sequence of SEQ ID NO: 1 or the
配列番号１の塩基配列は、例えば、以下の実施例に記載されたように標準的なクローニング法により単離される。もちろん、ＤＮＡ合成によってもよい。また、クローニングにおいては、レポータープラスミドとして、β-ガラクトシダーゼ遺伝子(ｌａｃＺ遺伝子)を連結したレポータプラスミドを用い、イソプロピル-β-D-ガラクトピラノシド(IPTG)の添加によってその発現を誘導するのが、効率的である。なお、クローニングに際しては一般的に使用される抗生物質耐性遺伝子やマーカ遺伝子等を、適宜選択して使用するベクターに組み込めばよい。
組換えベクターによる形質転換体作製も常法に従って行えばよい。このとき宿主細胞として、宿主内に挿入された遺伝子を維持、増殖、発現させ得るものであればいずれも使用可能である。宿主には、例えば、大腸菌、ストレプトコッカス属細菌、スタフィロコッカス属細菌、枯草菌、酵母、動物細胞が挙げられる。
The base sequence of SEQ ID NO: 1 is isolated, for example, by standard cloning methods as described in the examples below. Of course, DNA synthesis may be used. In cloning, a reporter plasmid linked with a β-galactosidase gene ( lacZ gene) is used as a reporter plasmid, and its expression is induced by adding isopropyl-β-D-galactopyranoside (IPTG). It is efficient. In cloning, commonly used antibiotic resistance genes, marker genes, etc. may be appropriately selected and incorporated into a vector to be used.
Preparation of a transformant using a recombinant vector may be performed according to a conventional method. At this time, any host cell that can maintain, proliferate, and express a gene inserted into the host can be used. Examples of the host include Escherichia coli, Streptococcus bacteria, Staphylococcus bacteria, Bacillus subtilis, yeast, and animal cells.
本発明のＡｕｆＡタンパク質は、種々のオリゴ糖および糖タンパク質の末端α-(１→２)フコシド結合、特にフコースとガラクトース間のα１→２β結合の加水分解に寄与する。また、フコシダーゼは、フコースとオリゴ糖を含む水溶液とからそのリバースハイドロリシス反応により、α-(１→２)フコシド結合を生じさせることも報告されており(例えば特開２０００−２４５４９６号公報参照)、フコシルオリゴ糖の合成や新規なフコシルオリゴ糖の合成にも応用できる。 The AufA protein of the present invention contributes to the hydrolysis of terminal α- (1 → 2) fucoside bonds of various oligosaccharides and glycoproteins, particularly the α1 → 2β bond between fucose and galactose. In addition, fucosidase has also been reported to generate an α- (1 → 2) fucoside bond from an aqueous solution containing fucose and an oligosaccharide by a reverse hydrolysis reaction (see, for example, JP-A No. 2000-245496). It can also be applied to the synthesis of fucosyl oligosaccharides and the synthesis of novel fucosyl oligosaccharides.
腸内コロニ-形成株であるBifidobacterium bifidumから、１,２-α-L-フコシダーゼをコードする遺伝子を単離し、塩基配列を決定した。ビフィズス菌の細胞培養液または細胞壁画分のいずれかからこの酵素を精製するいくつかの試みは失敗し、ビフィズス菌から１,２-α-L-フコシダーゼを単離できず、単離されたタンパク質からアミノ酸配列や遺伝子配列を決定しえなかった。そこで、遺伝子の単離には、非フコシダーゼ産生細菌である大腸菌ＤＨ５α株を用いる発現クローニング戦略によった。
A
Ａ．材料および方法
(１)細菌の株およびプラスミド
ビフィズス菌として、Bifidobacterium breve203およびJCM119、B.bifidum ATCC29251、JCM1254およびJCM7004、B.infantis JCM1222、B.longum 33RおよびJCM1217を用いた。また、クローニングには大腸菌Escherichia coli ＤＨ５α(Woodcock,D.M.et al., Quantitative evaluation of Escherichia coli host strains for tolerance to cytosine methylation in plasmid and phage recombinants. Nucleic Acids Res.17(1989):3469-3478)を用いた。クローニング用のプラスミドには、ｐＢＲ３２２(Sutcliffe, J. G. Nucleotide sequence of the ampicillin resistance gene of Escherichia coli plasmid pBR322. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75(1978):3737-3741)、ｐＭＷ１１８(ニッポンジーン社製)、ｐＭＷ１１９（同），ｐＭＷ２１９（同）を用い、必要に応じて常法によって必要なプラスミドを作製した。なお、表１〜表３に、上記の大腸菌や以下の実験で使用されたプラスミドの特徴を示した。また、ドメイン決定のためのＮ末端欠失株およびＣ末端欠失株作製のために用いられたプライマー対の塩基配列を配列番号５〜１６に示した。
A. Materials and methods
(1) Bacterial strains and plasmids Bifidobacterium breve 203 and JCM119, B. bifidum ATCC29251, JCM1254 and JCM7004, B.infantis JCM1222, B.longum 33R and JCM1217 were used as bifidobacteria. In addition, Escherichia coli DH5α (Woodcock, DM et al., Quantitative evaluation of Escherichia coli host strains for tolerance to cytosine methylation in plasmid and phage recombinants. Nucleic Acids Res. 17 (1989): 3469-3478) was used for cloning. . The plasmids for cloning are pBR322 (Sutcliffe, JG Nucleotide sequence of the ampicillin resistance gene of Escherichia coli plasmid pBR322. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978): 3737-3741), pMW118 (manufactured by Nippon Gene) PMW119 (same as above) and pMW219 (same as above) were used, and necessary plasmids were prepared by a conventional method as necessary. Tables 1 to 3 show the characteristics of the above-mentioned E. coli and plasmids used in the following experiments. In addition, the base sequences of the primer pairs used for preparing the N-terminal deletion strain and the C-terminal deletion strain for domain determination are shown in SEQ ID NOs: 5 to 16, respectively.
(２)培地および化学物質
大腸菌の培養には、ルリア-ベルターニ(Luria-Bertani)ブロスを慣用的に用いた。ビフィズス菌の培養には、アネロパック(登録商標、三菱ガス化学社製)による嫌気下でＧＡＭ培地(ニッスイ社製)を用いた。それぞれの培地には、１００μg／mlおよび３０μg／mlの最終濃度でアンピシリンおよびカナマイシンを添加した。
基質として、２´-フコシルラクトース(Fucα１→２Galβ１→４Glc、協和発酵工業株式会社の寄贈による)、６-フコシル-Ｎ,Ｎ´-ジアセチルキトビオース(GlcNAcβ１→４(Fucα１→６)GlcNAc、シグマ社製)、３-フコシルラクトース(Galα1→4(Fucα1→3)Glc、シグマ社製)、３-フコシルガラクトース(Fucα1→3Gal、フナコシ社製)、血液型物質Ｈ(II)(Fucα1→2Galβ1→4GlcNAc、同社製)、血液型Ａ物質(GalNAcα1→3(Fucα1→2)Gal)、血液型Ｂ物質(Galα1→3(Fucα1→2)Gal、同社製)、ラクト-Ｎ-フコペンタオースＩ(Fucα1→2Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glc)、ラクト-Ｎ-フコペンタオースII(Galβ1→3(Fucα1→4)GlcNAcβ1→3Galβ1→4Glc)、ラクト-Ｎ-フコペンタオースＶ(Galβ1→3GlcNAcβ1→3Galβ1→4(Fucα1→3)Glc)を含む乳汁オリゴ糖類（フナコシ社製）、ｐ-ニトロフェニル(pNP)-α-Ｌ-フコシド、ｐNP-β-Ｌ-フコシド、および４-メチルウンベリフェリル-フコシド(和光純薬工業社製)、そして、ピリジルアミノ(PA)オリゴ糖類(タカラバイオ株式会社製)を用いた。これらの化学物質は、特記したものを除いてすべて市販品を用い、いずれもさらに精製はしなかった。
(2) Medium and chemical substances Luria-Bertani broth was conventionally used for the culture of E. coli. For the culture of bifidobacteria, GAM medium (manufactured by Nissui) was used under anaerobic conditions with Aneropack (registered trademark, manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company). To each medium, ampicillin and kanamycin were added at final concentrations of 100 μg / ml and 30 μg / ml.
As a substrate, 2'-fucosyllactose (Fucα1 → 2Galβ1 → 4Glc, Kyowa Hakko Kogyo donated by Ltd.), 6-fucosyl - N, N'- diacetylchitobiose (GlcNAcβ1 → 4 (Fucα1 → 6 ) GlcNAc, Sigma 3-fucosyl lactose (Galα1 → 4 (Fucα1 → 3) Glc, manufactured by Sigma), 3-fucosylgalactose (Fucα1 → 3Gal, manufactured by Funakoshi), blood group substance H (II) (Fucα1 → 2Galβ1 → 4GlcNAc, manufactured by the company), blood group A substance (GalNAcα1 → 3 (Fucα1 → 2) Gal), blood group B substance (Galα1 → 3 (Fucα1 → 2) Gal, manufactured by the company), lacto- N -fucopentaose I (Fucα1 → 2Galβ1 → 3GlcNAcβ1 → 3Galβ1 → 4Glc), lacto- N -fucopentaose II (Galβ1 → 3 (Fucα1 → 4) GlcNAcβ1 → 3Galβ1 → 4Glc), lacto- N -fucopentaose V (Galβ1 → 3GlcNAcβ1 → 3Gucβ1 → 3Guc milk oligosaccharides containing Glc) (Funakoshi), p - nitrophenyl (p NP) -α-L- fucoside, p NP-beta- - fucoside, and 4-methylumbelliferyl - fucoside (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and was used pyridylamino (PA) oligosaccharides (manufactured by Takara Bio Inc.). All of these chemicals were commercially available except as noted, and were not further purified.
(３)２´-フコシルラクトースのピリジルアミノ化
長谷ら(Hase,S.,et al. Structure analysis of oligosaccharides by tagging of the reducing end sugars with a fluorescent compound. Biochem. Biophys. Res. Commun. 85(1978):257-263)の方法によって、２-アミノピリジンを用いた２´-フコシルラクトース(２´-ＦＬ)の蛍光標識を行った(ＰＡ化)。カップリング反応後、その生成物を還元して、Sephadex G-25(Pharmacia社製)上のゲル濾過によって精製し、１ｍｇの出発材料から約０.５ｍｇのＰＡ-２´-ＦＬを得た。
(3) Pyridylamination of 2'-fucosyl lactose Hase et al. (Hase, S., et al. Structure analysis of oligosaccharides by tagging of the reducing end sugars with a fluorescent compound. Biochem. Biophys. Res. Commun. 85 (1978) : 257-263), 2'-fucosyl lactose (2'-FL) was labeled with 2-aminopyridine (PA). After the coupling reaction, the product was reduced and purified by gel filtration on Sephadex G-25 (Pharmacia) to give about 0.5 mg PA-2'-FL from 1 mg starting material.
(４)フコシダーゼアッセイ
ビフィズス菌の培養液および細胞壁画分ならびにE.coliの無細胞抽出液は、スポロットらの方法(Sprott,G.D,et al., Cell fracitonation Methods for general and molecular bacteriology. American Society for Microbiology,73-103(1994))に従って調整した。フコシダーゼ活性測定のための標準的な溶液には、１００ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ７.５)、２ｍＭの基質および１０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ６.５)で透析したタンパク質サンプルを全量１００μｌとしたものを用いた。３７℃で適切な時間インキュベーションした後、沸騰している水槽中で３分間加熱することによって反応を停止した。そして、以下に記載した３つの方法のうちのいずれかによって、α-Ｌ-フコシダーゼ活性を測定した。
(ｉ)薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)法
シリカゲルプレート(Silica gel 60，メルク社製)上でのＴＬＣによって反応生成物を分析した。プレートを、クロロホルム／メタノール／水＝３／３／１の溶媒系で展開し、乾燥させた。そしてオルシノール-Ｈ2ＳＯ4試薬を噴霧した後、このプレートを１２０℃で加熱して可視化した(Holmes,E.W.,et al. Separation of glycoprotein-derived oligosaccharides by thin-layer chromatography. Anal. Biochem.93(1979):167-170)。
(ii)高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)法
ＴＳＫ-ゲルアミド-80カラム(4.6×250mm)(東ソー社製)およびＦ-1050蛍光分光光度計を備えたHitachi Ｌ-6200クロマトグラフシステムを用いて、ＰＡ-オリゴ糖類を含む反応混合物を、ＨＰＬＣによって分析した。カラムに反応混合物をインジェクションした後、０.３％酢酸を含有する９０％〜６０％の直線的に漸減する勾配のアセトニトリル(アンモニアでｐＨ７.０に調整した)を用いて、４０℃、３０分間、流速０.５ml／分で溶出させた。３１５ｎｍおよび３８０ｎｍの励起波長および放出波長を用いてモニタリングし、その蛍光強度からＰＡ-オリゴ糖類の濃度を求めた。
(iii)フコースデヒドロゲナーゼ(ＦＤＨ)アッセイ
コヘンフォードらの方法(Cohenford,M.A.,et al. Colorimetric assay for free and bound Ｌ-fucose. Anal. Biochem. 177(1989):172-177)に従い、ＦＤＨ-ＮＡＤＰ＋システムによって、オリゴ糖類および糖タンパク質から遊離されたＬ-フコースの量を測定した。すなわち、反応混合物８０μｌに対して、１２８μｌの１５０ｍＭ Tris-ＨＣｌ(ｐＨ８.５)、１６μｌの５０ｍＭ ＮＡＤＰ＋、および１６μｌのＦＤＨ溶液(１mU／μl、シグマ社製)を添加した。３７℃で５０分間インキュベーションした後、発色のために２４０μｌのネオクプロイン-Ｃｕ２＋試薬を添加し、次いでこれを４５５ｎｍでの分光光度測定によって定量した。基質から１分間あたり１μmolのフコースを放出する酵素の量を、酵素活性１単位(unit)として規定した。
(4) Fucosidase Assay Bifidobacteria culture and cell wall fractions and E. coli cell-free extract were prepared according to the method of Sprott, GD, et al., Cell fracitonation Methods for general and molecular bacteriology. American Society for Microbiology, 73-103 (1994)). A standard solution for measuring fucosidase activity was a protein sample dialyzed with 100 mM sodium phosphate (pH 7.5), 2 mM substrate and 10 mM sodium phosphate (pH 6.5) in a total volume of 100 μl. Using. After an appropriate time incubation at 37 ° C., the reaction was stopped by heating in a boiling water bath for 3 minutes. Then, α-L-fucosidase activity was measured by any one of the three methods described below.
(i) Thin Layer Chromatography (TLC) Method The reaction product was analyzed by TLC on a silica gel plate (Silica gel 60, manufactured by Merck). The plate was developed with a solvent system of chloroform / methanol / water = 3/3/1 and dried. Then, after spraying orcinol-H 2 SO 4 reagent, the plate was visualized by heating at 120 ° C. (Holmes, EW, et al. Separation of glycoprotein-derived oligosaccharides by thin-layer chromatography. Anal. Biochem. 93). 1979): 167-170).
(ii) High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method Using a Hitachi L-6200 chromatograph system equipped with a TSK-Gelamide-80 column (4.6 × 250 mm) (manufactured by Tosoh Corporation) and an F-1050 fluorescence spectrophotometer, The reaction mixture containing PA-oligosaccharide was analyzed by HPLC. After injecting the reaction mixture into the column, a 90% to 60% linearly decreasing gradient of acetonitrile (adjusted to pH 7.0 with ammonia) containing 0.3% acetic acid was used for 30 minutes at 40 ° C. And eluted at a flow rate of 0.5 ml / min. Monitoring was performed using excitation and emission wavelengths of 315 nm and 380 nm, and the concentration of PA-oligosaccharide was determined from the fluorescence intensity.
(iii) Fucose dehydrogenase (FDH) assay According to the method of Cohenford et al. (Cohenford, MA, et al. Colorimetric assay for free and bound L-fucose. Anal. Biochem. 177 (1989): 172-177) The amount of L-fucose released from oligosaccharides and glycoproteins was measured by the NADP + system. Specifically, 128 μl of 150 mM Tris-HCl (pH 8.5), 16 μl of 50 mM NADP + , and 16 μl of FDH solution (1 mU / μl, manufactured by Sigma) were added to 80 μl of the reaction mixture. After 50 minutes incubation at 37 ° C., 240 μl of neocuproin-Cu 2+ reagent was added for color development, which was then quantified by spectrophotometry at 455 nm. The amount of enzyme that releases 1 μmol of fucose per minute from the substrate was defined as one unit of enzyme activity.
(５)遺伝子手法
遺伝子手法は、基本的にSambrookらの方法(Sambrook,J.,et al. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989)に従って行った。
(5) Genetic technique The genetic technique was basically performed according to the method of Sambrook et al. (Sambrook, J., et al. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1989). .
Ｂ．１,２-α-Ｌ-フコシダーゼ遺伝子(ａｆｕＡ遺伝子)のクローニング
(１)１,２-α-Ｌ-フコシダーゼ生産能
ゲノムライブラリーの構築に先立ち、上記ビフィズス菌８菌種を用いてフコシダーゼ活性を測定した。各培養液および細胞壁画分から試験液を調製し、基質として２´-フコシルラクトース(２´-ＦＬ)を用いて、α-(１→２)-Ｌ-フコシド結合の加水分解能について試験した。その結果、B.infantis株およびB.bifidum株は１,２-α-Ｌ-フコシダーゼを産生することが見出されたが、B.breve株およびB.longum株は、１,２-α-Ｌ-フコシダーゼを産生しなかった。中でもB.bifidum JCM1254株が、最高の活性を示した。しかし、培養液または細胞壁画分のいずれもからこの酵素を精製することができなかった。
B. Cloning of 1,2-α-L-fucosidase gene ( afuA gene)
(1) 1,2-α-L-fucosidase production ability Prior to the construction of the genomic library, fucosidase activity was measured using the above-mentioned 8 species of bifidobacteria. Test solutions were prepared from each culture and cell wall fraction and tested for hydrolytic ability of α- (1 → 2) -L-fucoside bonds using 2′-fucosyl lactose (2′-FL) as a substrate. As a result, B.infantis and B.bifidum strains were found to produce 1,2-α-L-fucosidase, while B.breve and B.longum strains were 1,2-α- L-fucosidase was not produced. Among them, B. bifidum JCM1254 strain showed the highest activity. However, this enzyme could not be purified from either the culture medium or the cell wall fraction.
(２)ゲノムライブラリーの構築
ゲノムライブラリーの構築には、最高のフコシダーゼ活性を認めたB.bifidum JCM1254株を用いた。ライブラリーの構築は、片山らの方法(Katayama,T.,et al. Cloning and random mutagenesis of the Erwinia herbicola tyrR gene for high-level expression of tyrosine phenollyase. Appl.Environ.Microbiol.66(2000):4764-4771)に従って行った。すなわち、B.bifidum JCM1254からゲノムＤＮＡを単離し、Sau3AIを用いて部分的に消化した後、アガロースゲル電気泳動によって分画して、９〜１０ｋｂのフラグメントを得た。回収したＤＮＡフラグメントをｐＢＲ３２２の互換性のあるBamHI部位に挿入し(Takara社製 「Ligation Kit Version II」を用いた)、そしてこれを用いてE.coli株ＤＨ５αを形質転換して、ＬＢ培地上で約８００のコロニーを形成した。
(2) Construction of genomic library B. bifidum JCM1254 strain with the highest fucosidase activity was used for the construction of the genomic library. Library construction is the method of Katayama et al. (Katayama, T., et al. Cloning and random mutagenesis of the Erwinia herbicola tyrR gene for high-level expression of tyrosine phenollyase.Appl.Environ.Microbiol. 66 (2000): 4764 -4771). That is, genomic DNA was isolated from B. bifidum JCM1254, partially digested with Sau3AI, and fractionated by agarose gel electrophoresis to obtain a 9 to 10 kb fragment. The recovered DNA fragment was inserted into the compatible Bam HI site of pBR322 (using “Ligation Kit Version II” manufactured by Takara) and used to transform E. coli strain DH5α to prepare LB medium. Approximately 800 colonies formed above.
(３)１,２-α-Ｌ-フコシダーゼ遺伝子(ａｆｕＡ遺伝子)のクローニング
上記で得た各コロニーを、小容積のBugBusterタンパク質抽出試薬(ノバゲン社製)中に懸濁して溶解し、２´-ＦＬとともにインキュベートした。そして、この反応混合物をＴＬＣによって分析して、１,２-α-Ｌ-フコシダーゼ活性を求めた。その中から、２´-ＦＬからフコースを放出する能力を高度に有するＳＡ３と命名した１つのクローンを候補として選択した。そして、選択したコロニーによる反応混合物を対象に、ＰＡ化した２´-ＦＬを基質とするフコースデヒドロゲナーゼ(ＦＤＨ)アッセイおよびＨＰＬＣ分析によって酵素活性を測定した。ＨＰＬＣによる分析結果を図１に示す。
ＰＡ-２´-ＦＬ(２ｍＭ)を、ＳＡ３株の無細胞抽出液(１００ｍＭのリン酸緩衝液(ｐＨ７.５))とともにインキュベートした場合、ＰＡ-２´-ＦＬのピークは低下し、そして代わりに、ＰＡ-ラクトース(ＰＡ-Ｌａｃ)に正確に対応する新しいピークが出現した(図１(ｄ))。一方でＰＡ-２´-ＦＬを、ｐＢＲ３２２を有するE.coli株ＤＨ５αの無細胞抽出液とともにインキュベートした場合は、ピークの変化は観察されなかった(図１(ｃ))。ＳＡ３抽出物を利用したＰＡ-２´-ＦＬからのＬ-フコース生成における時間依存性、用量依存性は、ＦＤＨ-ＮＡＤＰ＋アッセイシステムを用いても同様に観察された(データ示さず)。なお、フコースの量は、前記コヘンホードらの方法に従って産生されたＮＡＤＰＨの量として求められた。こうして、１,２-α-Ｌ-フコシダーゼ遺伝子が、B.bifidum JCM1254から首尾よくクローニングされ、そしてE.coliにおいて発現されたことが確認された。
(3) Cloning of 1,2-α-L-fucosidase gene ( afuA gene) Each colony obtained above is suspended and dissolved in a small volume of BugBuster protein extraction reagent (manufactured by Novagen). Incubated with FL. The reaction mixture was then analyzed by TLC to determine 1,2-α-L-fucosidase activity. Among them, one clone named SA3 having a high ability to release fucose from 2′-FL was selected as a candidate. Then, the enzyme activity was measured by a fucose dehydrogenase (FDH) assay and HPLC analysis using PA-converted 2′-FL as a substrate for the reaction mixture of the selected colonies. The analysis result by HPLC is shown in FIG.
When PA-2'-FL (2 mM) was incubated with cell-free extract of SA3 strain (100 mM phosphate buffer (pH 7.5)), the peak of PA-2'-FL decreased and instead A new peak exactly corresponding to PA-lactose (PA-Lac) appeared (FIG. 1 (d)). On the other hand, when PA-2′-FL was incubated with a cell-free extract of E. coli strain DH5α having pBR322, no change in peak was observed (FIG. 1 (c)). The time dependence and dose dependence of L-fucose production from PA-2'-FL using SA3 extract were observed similarly using the FDH-NADP + assay system (data not shown). The amount of fucose was determined as the amount of NADPH produced according to the method of Kohenhod et al. Thus, it was confirmed that the 1,2-α-L-fucosidase gene was successfully cloned from B. bifidum JCM1254 and expressed in E. coli .
Ｃ．１,２-α-Ｌ-フコシダーゼ遺伝子(ａｆｕＡ遺伝子)の詳細
(１)ａｆｕＡ遺伝子の塩基配列
上記ＳＡ３と命名した１つのクローン細胞からａｆｕＡ遺伝子の塩基配列を決定した。BigDyeターミネーターv3.0サイクル配列決定即時反応キット(BigDye Terminator v3.0 cycle sequencing ready reaction kit)、およびＡＢＩプリズム遺伝子アナライザアナライザー(Applied Biosystems社)を用い、サンガーらの方法（Sanger,F.,et al. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74(1977):5463-5467）に従って、両方の鎖についてＤＮＡ配列を決定した。このとき用いられた合成オリゴヌクレオチドは、プロリゴ社から市販されているものを用いた。配列データのコンパイルには、GENETYA-MAC 10.1ソフトウェア(ソフトウェア開発株式会社製)を用いた。この結果、ｐＳＡ３からクローニングされた遺伝子は、Ｎ末端に対応する領域が欠けた下流域(１７２１番目以降の塩基配列；図４参照)であることが判明した。
C. Details of the 1,2-α-L-fucosidase gene ( afuA gene)
(1) from one clonal cell, designated nucleotide sequence above SA3 of afuA gene to determine the nucleotide sequence of afuA gene. Using the BigDye Terminator v3.0 cycle sequencing ready reaction kit and the ABI Prism Gene Analyzer Analyzer (Applied Biosystems), the method of Sanger et al. (Sanger, F., et al DNA sequencing was determined for both strands according to Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977): 5463-5467). The synthetic oligonucleotide used at this time was commercially available from Proligo. GENENET-MAC 10.1 software (manufactured by Software Development Co., Ltd.) was used for compiling the sequence data. As a result, it was found that the gene cloned from pSA3 was a downstream region lacking a region corresponding to the N-terminus (base sequence from the 1721st position; see FIG. 4).
次いで、このａｆｕＡ遺伝子の上流域をクローニングするために、プローブとしてｐＳＡ３の１.１ｋｂ PstI-BamHIフラグメント(図２の破線)を用いて、上記Sambrookらの標準的なハイブリダイゼーション方法に準じて(具体的には、High efficiency hybridization solution(日本ジーン社製)を使用し、そのプロトコールに従った)、B.bifidum JCM1254のゲノムライブラリーをスクリーニングした(図２)。プローブの標識には、製造業者の指示に従って、[α-３２Ｐ]-ｄＡＴＰ(ＩＣＮ)を用いるMegaprime ＤＮＡ標識システム(アマシャムファルマシア社製)を用いた。 Next, in order to clone the upstream region of this afuA gene, a 1.1 kb Pst I- Bam HI fragment of pSA3 (dashed line in FIG. 2) was used as a probe in accordance with the standard hybridization method of Sambrook et al. (Specifically, a high efficiency hybridization solution (manufactured by Gene Japan) was used and the protocol was followed), and the B. bifidum JCM1254 genomic library was screened (FIG. 2). For labeling the probe, a Megaprime DNA labeling system (manufactured by Amersham Pharmacia) using [α- 32 P] -dATP (ICN) was used according to the manufacturer's instructions.
(２)ａｆｕＡ遺伝子の配列分析
上記プラスミドｐＳＡ３の配列分析によって、クローニングされた遺伝子は、３つの可能性のあるオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含むことが明らかになった(図２)。これらのうちの１つ(ＯＲＦ３と命名した)は、タンパク質ファミリーのデータベース(Pfam 03577)におけるペプチダーゼファミリーＵ３４のコンセンサス配列に対して高い同一性(>９０％)を示した。そして、B.longum NCC2705のジペプチダーゼＤ(PepD)に対し、アミノ酸配列において高い類似性(８５％)を示した。ペプチダーゼに対するＯＦＲ３の類似性、およびｐＳＡ３のKpnI-内部フラグメント(２.３ｋｂ)の欠失が、このクローンの１,２-α-Ｌ-フコシダーゼ活性の損失を生じたという事実(データ示さず)によって、２´-ＦＬの加水分解におけるＯＲＦ３産物の関与の可能性が排除された。
(2) Sequence analysis of the afuA gene Sequence analysis of the plasmid pSA3 revealed that the cloned gene contains three potential open reading frames (ORFs) (Figure 2). One of these (designated ORF3) showed high identity (> 90%) to the peptidase family U34 consensus sequence in the protein family database (Pfam 03577). It showed high similarity (85%) in amino acid sequence to B. longum NCC2705 dipeptidase D (PepD). The similarity of OFR3 to peptidase and the fact that deletion of the Kpn I-internal fragment (2.3 kb) of pSA3 resulted in a loss of 1,2-α-L-fucosidase activity of this clone (data not shown) Eliminated the possibility of involvement of the ORF3 product in the hydrolysis of 2'-FL.
ＯＲＦ１およびＯＲＦ２のセンス鎖は、逆方向にかなりの程度重複していた。前記段落番号００２８で示した方法によって得られた上流域２.９ＫＢ KpnI-BamHIフラグメントを低コピー数のプラスミドであるｐＭＷ１１８中にクローニングし(ｐＳＡ１９)、次いでそのＤＮＡ配列を決定した。結果として、２つのＯＲＦが完全な形態で出現した(図２参照)。 The sense strands of ORF1 and ORF2 overlapped considerably in the opposite direction. The upstream region 2.9 KB Kpn I- Bam HI fragment obtained by the method shown in paragraph 0028 was cloned into pMW118, a low copy number plasmid (pSA19), and its DNA sequence was determined. As a result, two ORFs appeared in complete form (see FIG. 2).
どちらのＯＲＦが現実に１,２-α-Ｌ-フコシダーゼをコードするかを決定するために、各々のＯＲＦをlacZプロモーターの制御下に置き、次いでイソプロピル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)の添加によってその発現を誘導した(ＯＲＦ１についてはｐＳＡ２６,そしてＯＲＦ２についてはｐＳＡ２７で示す)。ＩＰＴＧの添加によって、ＯＲＦ２が誘導されたときには、１,２-α-Ｌ-フコシダーゼ活性の増大は観察されなかったが(１.０〜１.１mU/mgの上昇)、ＯＲＦ１が誘導されたときには、１,２-α-Ｌ-フコシダーゼの比活性は有意に上昇した(１.３〜２０mU/mgの上昇)。これにより、ＯＲＦ１が１,２-α-Ｌ-フコシダーゼをコードすることが示された。なお、ａｆｕＡ遺伝子のコドン使用頻度は、そのデータベース(かずさＤＮＡ研究所(Kazusa DNA Research Institute)のコドン使用頻度データベース;http://www.kazusa.or.jp/codon/)におけるB.bifidumの他の遺伝子のコドン使用頻度と極めて類似していた。 To determine which ORF actually encodes 1,2-α-L-fucosidase, each ORF is placed under the control of the lacZ promoter and then isopropyl-β-D-galactopyranoside (IPTG ) To induce its expression (indicated by pSA26 for ORF1 and pSA27 for ORF2). When ORF2 was induced by addition of IPTG, no increase in 1,2-α-L-fucosidase activity was observed (an increase of 1.0-1.1 mU / mg), but when ORF1 was induced The specific activity of 1,2-α-L-fucosidase was significantly increased (an increase of 1.3 to 20 mU / mg). This indicated that ORF1 encodes 1,2-α-L-fucosidase. Incidentally, the codon usage of afuA gene (codon usage database Kazusa DNA Research Institute (Kazusa DNA Research Institute); http : //www.kazusa.or.jp/codon/) that database other B.bifidum in It was very similar to the codon usage of the gene.
Ｄ．ＡｆｕＡタンパク質の構造
(１)ＡｆｕＡタンパク質の一次構造
配列番号２に示されたタンパク質の一次構造を塩基配列とともに図３に示す。図３に示された塩基配列は、配列番号１に相当する。ＡｆｕＡタンパク質のＮ末端およびＣ末端において２つの典型的な膜貫通セグメントの存在が明らかになった。Ｎ末端の１つは、正に荷電した残基と、それに続く２５〜３０アミノ酸の疎水性ストレッチから構成されている。したがって、このことは、そのシグナルペプチドとしての役割を強力に示唆する。Ｃ末端セグメントは、２０〜２３の疎水性アミノ酸残基と、それに続く３つの正に荷電した残基を含み、膜アンカーとして機能すると考えられる。１,２-α-Ｌ-フコシダーゼ活性は、培養液中で、そしてほとんどはB.bifidum JCM1254の細胞壁画分において見出されたことを考慮すれば、これらの構造的特徴はその局在性と一致していた。B.bifidumの培養物の培地中で見出された酵素活性は、細胞表面由来のタンパク質の漏出に起因し得る。シグナルペプチドとしてのＡｆｕＡタンパク質のＮ末端セグメントの重要性はまた、ｐＳＡ２６を保有しているE.coli株(図２参照)が、培養培地中に１,２-α-Ｌ-フコシダーゼをわずかに排出する(データ示さず)という観察によっても強調された。可能性のあるリボソーム結合部位は、有望な開始コドンから６ｂｐ離れて配置されており、そしてプロモーター様配列もまた上流域に見出された(図３参照)。以上述べたように、ＡｆｕＡタンパク質は、配列番号２で示される１,９５９のアミノ酸残基から構成され、これは計算上の分子量が２０５ｋＤａであった。
D. Structure of AfuA protein
(1) Primary structure of AfuA protein FIG. 3 shows the primary structure of the protein shown in SEQ ID NO: 2 together with the base sequence. The base sequence shown in FIG. 3 corresponds to SEQ ID NO: 1. The presence of two typical transmembrane segments at the N-terminus and C-terminus of the AfuA protein was revealed. One of the N-termini is composed of a positively charged residue followed by a hydrophobic stretch of 25-30 amino acids. This therefore strongly suggests its role as a signal peptide. The C-terminal segment contains 20-23 hydrophobic amino acid residues followed by three positively charged residues and is thought to function as a membrane anchor. Considering that 1,2-α-L-fucosidase activity was found in culture and mostly in the cell wall fraction of B. bifidum JCM1254, these structural features are related to their localization and It was consistent. Enzymatic activity found in the culture medium of B. bifidum may be due to leakage of cell surface derived proteins. The importance of the N-terminal segment of the AfuA protein as a signal peptide is also that the E. coli strain carrying pSA26 (see FIG. 2) excretes 1,2-α-L-fucosidase slightly into the culture medium. It was also emphasized by the observation that they did (data not shown). A potential ribosome binding site was located 6 bp away from the promising start codon, and a promoter-like sequence was also found upstream (see Figure 3). As described above, the AfuA protein is composed of 1,959 amino acid residues represented by SEQ ID NO: 2, which has a calculated molecular weight of 205 kDa.
(２)ＡｆｕＡタンパク質のドメイン構造
ＡｆｕＡの一次構造全体は、既知のグリコシダーゼファミリーの一次構造に対して類似性がないので、次に、１,２-α-Ｌ−フコシダーゼ活性について必須であるドメインの位置付けを行った。
(2) Domain structure of AfuA protein Since the entire primary structure of AfuA is not similar to the primary structure of the known glycosidase family, the domain of the domain essential for 1,2-α-L-fucosidase activity is Positioned.
まず、ｐＳＡ３を有するE.coli株(人工的なtet-afuA翻訳融合物を保有する)が、１,２-α-Ｌ-フコシダーゼ活性を示したので、その活性を担うドメインがこのインサート内に局在することが示された(図４参照、１７２１ｂより下流域)。 First, the E. coli strain with pSA3 (which has an artificial tet-afuA translational fusion) showed 1,2-α-L-fucosidase activity, so that the domain responsible for that activity is in this insert. It was shown to be localized (see FIG. 4, downstream region from 1721b).
次に、低コピーベクターであるｐＭＷ２１９に存在するlacZα遺伝子のＮ末端部分に由来する８つのアミノ酸残基との翻訳融合物として発現されたＡｆｕＡタンパク質の欠失変異体を構築した(ｐＳＡ８６、８７、８９、９０、および１０８)。このために、テンプレートとしてｐＳＡ３を用いて、ａｆｕＡ遺伝子のＮ末端部分を増幅するのにおいて、あるプライマー対(ｐＳＡ８６：配列番号７および配列番号１１、ｐＳＡ８７：配列番号８および配列番号１１、ｐＳＡ８９：配列番号９および配列番号１１、ｐＳＡ９０：配列番号１０および配列番号１１、ｐＳＡ１０８：配列番号５および配列番号６)を用いた。HindIIIおよびMluIを用いてこの増幅したフラグメントを消化し、次いでpSA23の8.8kbのHindIII-MluIフラグメントと連結させた。ＤＮＡ配列決定によって確認した後、得られた欠失変異体をフコシダーゼ分析に供した。これらの欠失変異体酵素の発現を、ＩＰＴＧの添加によって誘導し、次いでこれらの変異体が、２´-ＦＬからＬ-フコースを生成する能力を測定した。その結果、図４に示されるように、Ｎ末端の５７６アミノ酸残基(９１１〜２６３８番塩基)は、フコシダーゼ活性の損失なしに除去可能であることが見出された。なお、欠質分析の目的のために、ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡社製)を含む、高忠実度（High-fidelity)ＰＣＲを実施し、そして増幅したフラグメントを完全に配列決定して、計画した塩基の変化以外に塩基の変化が生じなかったことを確認した。 Next, a deletion mutant of the AfuA protein expressed as a translational fusion with 8 amino acid residues derived from the N-terminal part of the lacZ α gene present in the low-copy vector pMW219 was constructed (pSA86, 87 89, 90, and 108). For this purpose, a primer pair (pSA86: SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 11, pSA87: SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 11, pSA89: sequence is used to amplify the N-terminal part of the afuA gene using pSA3 as a template No. 9 and SEQ ID NO: 11, pSA90: SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, pSA108: SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6) were used. This amplified fragment was digested with Hin dIII and Mlu I and then ligated with the 8.8 kb Hin dIII- Mlu I fragment of pSA23 . After confirmation by DNA sequencing, the resulting deletion mutants were subjected to fucosidase analysis. Expression of these deletion mutant enzymes was induced by the addition of IPTG, and then the ability of these mutants to produce L-fucose from 2'-FL was measured. As a result, it was found that the N-terminal 576 amino acid residues (911 to 2638 bases) can be removed without loss of fucosidase activity, as shown in FIG. For the purpose of defect analysis, high-fidelity PCR including KOD polymerase (Toyobo Co., Ltd.) was performed, and the amplified fragment was completely sequenced to determine the planned base. It was confirmed that there was no change in base other than the change.
そして、Ｃ末端欠失株を作製した。このＣ末端欠乏株に関しては、あるプライマー対(ｐＳＡ１１７：配列番号１２および配列番号１３、ｐＳＡ１１３：配列番号１２および配列番号１４、ｐＳＡ１１４：配列番号１５および配列番号１６)を用いた。図４(Ａ)に示した位置に終止コドン(ＴＡＡ＋Ａ)を導入することによって、３つのＣ末端欠失変異体を構築し、次いでその活性を測定した。これらの結果によって、８９８のアミノ酸残基から構成される領域(配列番号４で示される５７７〜１４７４番アミノ酸残基、図４(Ｂ)参照)は、α-(１→２)-フコシド結合の加水分解のために必須のドメインを構成することが確認された。 Then, a C-terminal deletion strain was prepared. For this C-terminal deficient strain, a certain primer pair (pSA117: SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, pSA113: SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 14, pSA114: SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16) was used. Three C-terminal deletion mutants were constructed by introducing a stop codon (TAA + A) at the position shown in FIG. 4 (A), and then their activity was measured. According to these results, a region composed of 898 amino acid residues (577 to 1474 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 4, see FIG. 4 (B)) is α- (1 → 2) -fucoside bond. It was confirmed to constitute an essential domain for hydrolysis.
(３)ドメインの配列類似性
他のタンパク質の配列類似性について、ＢＬＡＳＴによる検討を行った。ＡｆｕＡタンパク質の１４７５〜１８１９番目のアミノ酸残基から構成される配列番号１７で示された領域は、免疫グロブリン(Ｉｇ)様の折り畳みを有するドメイン(いわゆる、細菌Ｉｇ様ドメイン)を構築することが見出された。このドメインは、腸管病原性のE.coli株のインチミンにおいて最初に同定され、細菌の細胞表面タンパク質およびファージに広範に分布していることが知られている。Ｉｇ様の折り畳みを有する他のタンパク質において頻繁に観察されるように、ＡｆｕＡのＩｇ様ドメインは４つの反復性配列(お互いに対して５６％を超える同一性を示す)を含む。図５に、それらのＩｇ様配列を、Pfam02368(細菌のＩｇ様ドメインＢ)のコンセンサス配列と対比して示した。インチミンのＩｇ様ドメインは、転座されたインチミンレセプター(Ｔｉｒ)についてのリガンドとしての機能を果たすとともに、細胞接着分子としての機能を示すことが知られている。３４５アミノ酸長を有する配列番号１７に示されるアミノ酸残基から構成されるドメインは、ＡｆｕＡのフコシダーゼドメインを提示するように少なくとも機能し、これによって細胞表面からＡｆｕＡフコシダーゼドメインを突出させる(これによってB.bifidum細胞は、腸上皮および粘膜の複合糖質に存在するフコース残基に容易に接近し、かつこれを分解し得る)可能性が高い。したがって、ビフィズス菌以外の他の細胞中でこのＩｇ様領域が発現されることにより、腸管内への侵入、定着性が向上されるものと推測される。Ｎ末端ドメインのアミノ酸配列(１〜５７６番目のアミノ酸残基)は、データベース中のいずれの配列に対しても有意な類似性を示さなかった。
(3) Sequence similarity of domains The sequence similarity of other proteins was examined by BLAST. The region shown in SEQ ID NO: 17 composed of
(４)データベース上における特定タンパク質に対するＡｆｕＡのフコシダーゼドメインの構造上の類似性
ＡｆｕＡのフコシダーゼドメインの一次構造を、ＢＬＡＳＴ検索に供したが、上述のように、所定の機能を有するタンパク質(全てのグリコシドハイドラーゼファミリーを含む)の一次構造に対して類似性は観察されなかった。ＧＨ２９ファミリーの保存的モチーフ(α-Ｌ-フコシダーゼ)に関連するＡｆｕＡ配列の調査によっても、ＡｆｕＡの構造におけるこのファミリーのいかなる痕跡の知見も得られなかった。しかし、ＢＬＡＳＴ検索においては、いくつかのタンパク質について高スコアが得られた。かなりの類似性(スコア、>３０７ビット;および期待値<５ｅ−８２(ＢＬＡＳＴ))を示した特定タンパク質のアミノ酸配列をフコシダーゼドメインと対比し、相同性が高い領域について図６に示した。中でも、Clostridium perfringens株１３(Shimizu,T. Complete genome sequence of Clostridium perfringens, an anaerobic flesh-eater. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(2002):996-1001)は、培養培地中で高分子量（約２００ｋＤａ）のα-Ｌ-フコシダーゼを産生することが示されており（Aminoff,D,et al. Enzymes that destroy blood group specificity. I. Purification and properties of α-Ｌ-fucosidase from Clostridium perfrigens. J. Biol.Chem. 245(1970):1659-1669）、その相同体(CPE1875)を見出すためである。CPE1875の推定アミノ酸配列は、Ｎ末端に典型的なシグナル配列を有しており、その分子量は１６５,３３２Ｄａであると見積もられている。
(4) Structural similarity of the fucosidase domain of AfuA to a specific protein in the database The primary structure of the fucosidase domain of AfuA was subjected to BLAST search. As described above, proteins having a predetermined function (all Similarity was not observed for the primary structure (including the glycoside hydrase family). Investigation of the AfuA sequence associated with the conserved motif of the GH29 family (α-L-fucosidase) did not give any evidence of this family in the structure of AfuA. However, high scores were obtained for some proteins in the BLAST search. The amino acid sequence of a specific protein that showed considerable similarity (score,> 307 bits; and expected value <5e-82 (BLAST)) was compared to the fucosidase domain and the regions of high homology are shown in FIG. Among them, Clostridium perfringens strain 13 (Shimizu, T. Complete genome sequence of Clostridium perfringens, an anaerobic flesh-eater. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002): 996-1001) has a high molecular weight in the culture medium. (About 200 kDa) has been shown to produce α-L-fucosidase (Aminoff, D, et al. Enzymes that destroy blood group specificity. I. Purification and properties of α-L-fucosidase from Clostridium perfrigens. J Biol. Chem. 245 (1970): 1659-1669), its homologue (CPE1875). The deduced amino acid sequence of CPE1875 has a typical signal sequence at the N-terminus, and its molecular weight is estimated to be 165,332 Da.
これ以外にも、Streptococcus pneumoniae R6(Hoskins,L. et al. Genome of the bacterium Streptococcus pseudomoniae strain R6. J.Bacteriol. 183(2001)):5709-5717)、Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482(Xu,J. et al. A genomic view of the human-Bacteroides thetaiotaomicron symbiosis. Science 299(2003):2074-2076)、Microbulbifer degradans 2-40、Bacillus halodurans(Takami,H. et al. Complete genome sequence of the alkaliphilic bacterium Bacillus halodurans and genomic sequence comparison with Bacillus subtilis. Nucleic Acids Res.28(2000):4317-4331)、Xanthomonas campestris pv.campestris ATCC33913(da Silva,A.C.R., Comparison of the genomes of two Xanthomonasu pathogens with differing host specficities. Nature 417(2002):45-463)、およびArabidopsis thalianaのゲノム配列から、他の相同なタンパク質が発見された。B.thetaiotaomicron VPI-5482、M.degradans 2-40、X.campestris pv.campestris ATCC33913、およびArabidopsis thalianaのタンパク質は分泌タンパク質であると予想される。これらの相同体がα-Ｌ-フコシダーゼ活性を有するか否かは実験的には依然として解明されておらず、ＧＨ２９以外の新規なα-Ｌ-フコシダーゼファミリーの存在が示唆されるにすぎない。 Besides this, Streptococcus pneumoniae R6 (Hoskins, L. et al. Genome of the bacterium Streptococcus pseudomoniae strain R6. J. Bacteriol. 183 (2001)): 5709-5717), Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 (Xu, J. et al. A genomic view of the human- Bacteroides thetaiotaomicron symbiosis. Science 299 (2003): 2074-2076), Microbulbifer degradans 2-40, Bacillus halodurans (Takami, H. et al. Complete genome sequence of the alkaliphilic bacterium Bacillus halodurans . and genomic sequence comparison with Bacillus subtilis Nucleic Acids Res.28 (2000):.. 4317-4331), Xanthomonas campestris pv campestris ATCC33913 (da Silva, ACR, Comparison of the genomes of two Xanthomonasu pathogens with differing host specficities Nature 417 ( 2002): 45-463), and other homologous proteins were found from the Arabidopsis thaliana genomic sequence. B.thetaiotaomicron VPI-5482, M.degradans 2-40, X.campestris pv. Campestris ATCC33913, and Arabidopsis thaliana proteins are predicted to be secreted proteins. Whether these homologues have α-L-fucosidase activity has not been elucidated experimentally yet only suggests the existence of a novel α-L-fucosidase family other than GH29.
(５)ＡｆｕＡの基質特異性
最後に、α-Ｌ-フコシダーゼの基質特異性を調べた。
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ-ｐＥＴ(Novagen)またはｔａｃプロモーター系を用いて酵素を過剰発現させ、精製することを試みた。しかし、おそらく過剰に大きいタンパク質の毒性、またはコドン選択性により、E.coli細胞におけるＡｆｕＡタンパク質の発現レベル(α-Ｌ-フコシダーゼの比活性)は、B.bifidum JCM1254細胞におけるタンパク質発現レベル(培養液、および細胞壁画分)よりも低かった。そこで、天然に存在する基質(血液型物質およびヒト乳汁オリゴ糖類を含む)とともにクローン(ＳＡ２６:ｐＳＡ２６プラスミドを含む)の無細胞抽出物を用いて、基質特異性を試験した。それ以外に、人工基質、ｐ-ニトロフェニル(pNP)-α-Ｌ-フコシド、pNP-β-Ｌ-フコシド、および４-メチルウンベリフェリル-α-Ｌ-フコシドについても同様に試験した。ｐＭＷ１１８(空のベクター)を保有するE.coli株の無細胞抽出物は、試験したいずれの基質をも加水分解しなかった。その結果を表４に示す。
(5) Substrate specificity of AfuA Finally, the substrate specificity of α-L-fucosidase was examined.
An attempt was made to overexpress and purify the enzyme using T7 RNA polymerase-pET (Novagen) or tac promoter system. However, probably due to excessively large protein toxicity or codon selectivity, the expression level of AfuA protein in E. coli cells (specific activity of α-L-fucosidase) is increased in protein expression levels in B. bifidum JCM1254 cells (culture medium). , And cell wall fraction). Thus, substrate specificity was tested using a cell-free extract of a clone (including SA26: pSA26 plasmid) together with naturally occurring substrates (including blood group substances and human milk oligosaccharides). In the other, an artificial substrate, p - nitrophenyl (p NP) -α-L- fucoside were similarly tested p NP-β-L- fucoside, and 4-methylumbelliferyl-.alpha.-L-fucoside . A cell-free extract of E. coli strain carrying pMW118 (empty vector) did not hydrolyze any of the substrates tested. The results are shown in Table 4.
E.coliにおいて発現されたＡｆｕＡタンパク質は，ｐＨ７.５で最大の１,２-α-Ｌ-フコシダーゼ活性を示し、そして４５℃未満で安定であり、これは、B.bifidum JCM1254からわずかに精製された１,２-α-Ｌ-フコシダーゼの特性とほぼ等しいものであった。表４にE.coliにおいて発現されたＡｆｕＡタンパク質の種々の基質に対する活性(２´-ＦＬを１００とした相対活性)を示した。試験した乳汁のオリゴ糖類のうち、最も容易に影響を受けやすいのは、２´-ＦＬ、ラクト-Ｎ-フコペンタオースＩ、および２-フコシルガラクトース(Fucα1→2Gal)であると考えられる(後者のデータは示さず)。その全てが、非還元末端のα-(１→２)結合において、ガラクトースに対して結合したＬ-フコースを含んでいる。この酵素は、３-ＦＬ、ラクト-Ｎ-フコペンタオースＶ、および３-フコシルガラクトース(Fucα1→3Gal)のα-(１→３)結合Ｌ-フコース残基において非常に限定された作用を有しており(３-フコシルガラクトースについてはデータ示さず)、そしてラクト-Ｎ-フコペンタオースIIおよび４-フコシル-Ｎ-アセチル−グルコサミン(Fucα1→4GlcNAc)のα-(１→４)結合において作用しなかった(Fucα1→4GlcNAcについてはデータ示さず)。また、この酵素は、試験した全ての人工的な基質において不活性であった。血液型Ｈ(II)活性基質(Fucα1→2Galβ1→4GlcNAc)は、ＡｆｕＡタンパク質の良好な基質であることが見出されたが、非還元末端のＧａｌ残基に別の置換基が存在する場合、この活性は、血液型ＡおよびＢの活性物質について観察されたとおり、劇的に低下した。６-フコシル-Ｎ,Ｎ´-ジアセチルキトビオースのα-(１→６)結合は、この酵素によって切断されなかった。このように、ＡｆｕＡタンパク質は、α-(１→２)結合でのみ活性であった。 The AfuA protein expressed in E. coli shows maximum 1,2-α-L-fucosidase activity at pH 7.5 and is stable below 45 ° C., which is slightly purified from B. bifidum JCM1254 The properties of 1,2-α-L-fucosidase produced were almost equal. Table 4 shows the activity of AfuA protein expressed in E. coli against various substrates (relative activity with 2'-FL as 100). Of the milk oligosaccharides tested, the most easily affected are considered to be 2′-FL, lacto- N -fucopentaose I, and 2-fucosylgalactose (Fucα1 → 2Gal) (the latter data). Is not shown). All of them contain L-fucose attached to galactose at the non-reducing end α- (1 → 2) linkage. This enzyme has a very limited effect on the α- (1 → 3) linked L-fucose residues of 3-FL, lacto- N -fucopentaose V, and 3-fucosylgalactose (Fucα1 → 3Gal). (Data not shown for 3-fucosylgalactose) and did not act on α- (1 → 4) binding of lacto- N -fucopentaose II and 4-fucosyl- N -acetyl-glucosamine (Fucα1 → 4GlcNAc) ( Data is not shown for Fucα1 → 4GlcNAc). This enzyme was also inactive on all artificial substrates tested. The blood group H (II) active substrate (Fucα1 → 2Galβ1 → 4GlcNAc) has been found to be a good substrate for the AfuA protein, but when there is another substituent at the non-reducing terminal Gal residue, This activity was dramatically reduced as observed for blood group A and B actives. 6-fucosyl - N, N'- of diacetylchitobiose α- (1 → 6) bond was not cleaved by this enzyme. Thus, the AfuA protein was only active at α- (1 → 2) bonds.
フコース含有オリゴ糖に加えて、末端のα-(１→２)結合したＬ−フコース残基を有する高分子量の糖タンパク質(例えば、ブタの胃のムチン(Ｈ))は、酵素の標的であることが示された(データ示さず)。これらの結果によって、B.bifidum細胞は、表面に露出したＡｆｕＡを利用して、腸上皮および粘膜に存在する末端のα-(１→２)-連結フコシル残基を保有するいくつかのタイプの基質を分解し得ることが示唆された。この能力によって、B.bifidum細胞は、栄養制限された下部腸管において生存することが可能になり得る。そして、腸管に定着するとされるC.perfringensによるα-Ｌ-フコシダーゼの基質特異性と全く同様の基質特異性を示すことが見出された。 In addition to fucose-containing oligosaccharides, high molecular weight glycoproteins with terminal α- (1 → 2) linked L-fucose residues (eg, porcine stomach mucin (H)) are enzyme targets. (Data not shown). These results indicate that B. bifidum cells utilize surface-exposed AfuA to make several types of terminal α- (1 → 2) -linked fucosyl residues present in the intestinal epithelium and mucosa. It was suggested that the substrate could be degraded. This ability may allow B. bifidum cells to survive in the nutritionally restricted lower intestine. It was found that the substrate specificity was exactly the same as the substrate specificity of α-L-fucosidase by C. perfringens , which is supposed to settle in the intestinal tract.
したがって、ヒトの病原性細菌(C.perfringensおよびS.pneumoniae)やヒト共生細菌(B.thetaiotaomicron)が、それら細菌の生育環境に広がるには、α-Ｌ-フコシダーゼが重要であって、ビフィズス菌の有するα-Ｌ-フコシダーゼ産生能を他の細菌、例えば乳酸菌に付与することにより、腸管内にて生存のしやすい乳酸菌を提供できる。特に、ビフィズス菌の産生する１,２-α-Ｌ-フコシダーゼは、細胞接着分子としての機能を示す領域を有するので、腸管内への定着には有利なものであると言える。そして、当該ビフィズス菌によるＡｆｕＡタンパク質の酵素特異性を追求することにより、ビフィズス菌の生育環境を整えるための種々の物質を探索することができる。 Therefore, α-L-fucosidase is important for human pathogenic bacteria ( C. perfringens and S. pneumoniae ) and human symbiotic bacteria ( B. thetaiotaomicron ) to spread in the growth environment of these bacteria, and bifidobacteria By imparting the α-L-fucosidase-producing ability possessed by to other bacteria such as lactic acid bacteria, it is possible to provide lactic acid bacteria that are easy to survive in the intestinal tract. In particular, 1,2-α-L-fucosidase produced by bifidobacteria has a region exhibiting a function as a cell adhesion molecule, and thus can be said to be advantageous for colonization in the intestinal tract. By pursuing the enzyme specificity of the AfuA protein by the bifidobacteria, various substances for adjusting the growth environment of the bifidobacteria can be searched.
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