JP4487066B2 - 酵母変異体およびその利用 - Google Patents
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本発明の酵母変異体は、細胞内でS‐アデノシルメチオニンを蓄積しうる酵母であって、メチオニン代謝系酵素が変異している酵母変異体である。
図1に、メチオニン代謝経路の概略を示す。生体内で、メチオニンは、以下の反応により、代謝される。
(a)S‐アデノシルメチオニン(AdoMet)のメチル基転移により、S‐アデノシルホモシステイン(AdoHcy)に変換する。
(b)S‐アデノシルホモシステイン(AdoHcy)が、アデノシンおよびホモシステインに加水分解される。
(c)ホモシステインからメチオニンになる。
(d)メチオニンが、生体内のATPからアデノシル基を受け、S‐アデノシルメチオニン(AdoMet)になる。
本発明にかかる酵母変異体は、上記メチオニン代謝系酵素が変異している。変異しているメチオニン代謝系酵素としては、上記メチオニン代謝に関与する酵素であれば特に限定されるものではなく、メチオニン代謝系酵素が変異している酵母変異体であればよい。かかるメチオニン代謝系酵素の変異は、当該酵素をコードする遺伝子に変異が起こった結果として生ずる。すなわち本発明にかかる酵母変異体は、変異型メチオニン代謝系酵素遺伝子を有するがゆえに、変異型メチオニン代謝系酵素を有するといえる。本発明にかかる酵母変異体は、変異型メチオニン代謝系酵素に変異を有することによって、メチオニン代謝系に異常が起こり、その結果メチオニン代謝産物の一つであるAdoMetが細胞内に蓄積することとなる。なお、ここでいう「変異」とは、起源を同一にする細胞あるいはその集団間で見られる形質の相違のことをいう。すなわち、変異とは、遺伝子の点突然変異や、転座・重複もしくは欠失などの染色体異常を含む遺伝子構成の相違により生じる形質をいう。それゆえ、「酵母変異体」とは、上記変異が生じた酵母細胞、または、酵母細胞の集団を意味する。また、上記酵母変異体は、1つの遺伝子に変異が生じたものに限定されず、複数の遺伝子に変異が生じた多重酵母変異体も含まれる。また変異は、UV照射、エチルメタンスルホン酸(EMS)処理等の変異誘導を行なう変異であっても、自然変異であってもよいし、遺伝子組み換え法を用いた場合であってもよい。またかかる変異によるメチオニン代謝系酵素活性への影響は、特に限定されるものではなく、低下または欠失または増加してもよい。なお、変異を有するタンパク質/遺伝子等を「変異型タンパク質/遺伝子」と称し、反対に変異を有しないタンパク質/遺伝子等を「野生型タンパク質/遺伝子」と称する。さらには酵素タンパク質をコードする遺伝子のことを「酵素遺伝子」と称する。
本発明にかかる酵母変異体は、変異型メチオニン代謝系酵素遺伝子(例えばS-アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子)および変異型メチオニン代謝系酵素(例えばS-アデノシルホモシステイン加水分解酵素)を有するためにメチオニン代謝系に異常が生じている。それゆえ、細胞内でメチオニンの生成が行なわれない状態になり、酵母変異体は、通常野生型酵母が生育に必要なメチオニンの量が存在する状態で生育できなくなる。その結果、酵母変異体は、酵母野生体と相違した表現型になる。ただし、このような酵母変異体は、野生型酵母が通常必要とする量よりもメチオニンが多く存在した状態、すなわちメチオニン存在下では表現型が回復する。
本発明者は、出芽酵母において、上記細胞周期変異体として、カルシウム存在下でG2期遅延を引き起こすZDS1遺伝子変異体を用いた。このZDS1遺伝子変異体は、カルシウム存在下で、バッドが伸長するという細胞形態異常を示すと共に、細胞周期のG2期の進行が遅延する。このZDS1遺伝子変異体のカルシウム感受性表現型の抑圧変異体として、S-アデノシルホモシステイン加水分解酵素をコードする遺伝子に変異がかかった酵母変異体(zds1Δsah1−1;詳細については後述する)を取得した。
本発明にかかるスクリーニング方法は、AdoMet高生産酵母のスクリーニングを目的としている。ここで「AdoMet高生産酵母」とは、上述のごとくメチオニン代謝系酵素が変異することによってメチオニン代謝系に異常が生じ、その結果、AdoMetの細胞内蓄積量が野生型酵母に比して増加した酵母のこと、すなわち上記(1)にて説示した本発明にかかる酵母変異体のことである。なおAdoMetの蓄積量の増加量(率)は特に限定されるものではなく、野生型酵母のAdoMet蓄積量を超えるものであればよい。
本発明にかかるAdoMetの生産方法は、上述の酵母変異体(AdoMet高生産酵母)を培養することにより、AdoMetを調製するものである。本発明の酵母変異体は、細胞内にAdoMetを蓄積しているので、培養した酵母変異体からAdoMetを抽出および精製することで、AdoMetの大量生産を実現できる。以下に、上記AdoMetの生産方法について、具体的に説明する。
本発明にかかるS-アデノシルホモシステイン加水分解酵素は、配列番号3に示される野生型S-アデノシルホモシステイン加水分解酵素のアミノ酸配列において、1個またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/又は付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とする変異型S-アデノシルホモシステイン加水分解酵素、例えば配列番号4に示されるアミノ酸配列を有する変異型S-アデノシルホモスシテイン加水分解酵素である。一方、本発明にかかるS-アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子は、上記変異型S-アデノシルホモシステイン加水分解酵素をコードする遺伝子、例えば配列番号2に示される塩基配列からなることを特徴とするものである。
本発明の変異型S-アデノシルホモシステイン加水分解酵素を取得する方法(生産方法)としては、まず本発明の変異型S-アデノシルホモシステイン加水分解酵素を発現する細胞、組織などから単純精製する方法を挙げることができる。精製方法も特に限定されるものではなく、公知の方法で細胞や組織から細胞抽出液を調製し、この細胞抽出液を公知の方法、例えばカラム等を用いて精製すればよい。
本発明にかかる変異型S-アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子の取得方法としては、特に限定されるものではないが、例えば上述した本発明にかかる酵母変異体を用いた取得方法が挙げられる。より具体的には、例えばPCR法による取得方法が挙げられる。該方法では、まず野生型のS-アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子の塩基配列情報より5’側および3’側の配列(又はその相補配列)の中からそれぞれプライマーを設計する。次にこれらプライマーを用いてゲノムDNA(又はcDNA)等を鋳型にしてPCR等を行い、両プライマー間に挟まれるDNA領域を増幅することで、本発明の変異型遺伝子を含むDNA断片を大量に取得することができる。このとき取得された変異型遺伝子についてシークエンシングを行うことにより、容易に、本発明の変異型遺伝子のどこに変異が起こっているのか、すなわち、本発明の変異型遺伝子の変異点を同定することができる。
(5-1)本発明にかかる組み換え発現ベクター
本発明にかかる組換え発現ベクターは,上記変異型S-アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子を含むものである。例えば、cDNAが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。
本発明にかかる形質転換体の生産方法は、上記変異型S-アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子が宿主に導入することを特徴としている。当該遺伝子の宿主細胞への導入方法は特に限定されるものではなく、上記本発明の組み換えベクター等を用いて公知の方法により導入を行なえばよい。公知の遺伝子導入方法、すなわち形質転換方法としては、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法、酢酸リチウム法等を好適に用いることができる。
本発明にかかる形質転換体は、上記本発明にかかる形質転換体の生産方法によって得られた形質転換体である。すなわち本発明にかかる変異型S-アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法(遺伝子操作技術)により、対象細胞(宿主細胞)内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。本発明にかかる形質転換体、特にS-アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子が欠失した宿主細胞(酵母)に変異型S-アデノシルホモシステイン加水分解酵素遺伝子が導入されてなる形質転換細胞(酵母)を培養することによって、AdoMetを高生産することが可能となる。
本発明にかかる酵母変異体,AdoMetの生産方法,AdoMet高生産酵母のスクリーニング方法,変異型S-アデノシルホモシステイン加水分解酵素および該遺伝子,組み換え発現ベクター,形質転換方法並びに形質転換体は、いずれもAdoMetの大量生産に利用が可能である。また、細胞内のAdoMetと細胞の増殖(細胞周期)との関連の解明に利用できる。本発明によって生産されるAdoMetの利用方法について以下に説明する。
このように、AdoMetは、肝臓障害や肝臓腫瘍などの肝臓疾患の治療におけて、重要な役割を果たす。
本実施例では、SAH1酵母変異体の取得について説明する。SAH1酵母変異体は、ZDS1酵母変異体のカルシウム感受性表現型の抑圧変異体として取得された。
本実施例では、細胞の増殖(細胞周期)におけるsah1-1とzds1Δとの関連を解析した。その結果を図3に示す。
上述のSAH1遺伝子は、データベース検索の結果、S‐アデノシル‐L‐ホモシステイン加水分解酵素をコードすることがわかった。もしそうであれば、sah1-1の細胞内では、ホモシステインの前駆体物質であるAdoHcyが蓄積していると予想される。そこで、YPD培地、またはO培地で対数増殖期にまで培養した酵母野生体、およびsah1-1について、キャピラリー電気泳動法を用いて、細胞内のAdoMet、およびAdoHcyを測定し、wild typeとsah1-1とで比較した。その結果を表1に示す。
上記実施例3で、S‐アデノシル‐L‐ホモシステイン(AdoHcy)加水分解酵素の活性に欠損があることが明らかになったので、sah1-1では、メチオニン代謝経路に欠陥が生じていると予想される。そこで、上記メチオニン代謝経路における生成産物である、メチオニン、AdoMet、または、AdoHcy存在下でのsah1-1の生育を調べた。具体的には、メチオニン、AdoMet、または、AdoHcy存在下における、25℃での生育を、wild typeとsah1-1とで比較した。その結果を図4に示す。なお、図4中に記載されている「‐」は、培地中にメチオニンを全く含まない培地を意味する。
本実施例では、AdoMetと細胞の増殖(細胞周期)との関連を解析した。すなわち本実施例では、メチオニン、AdoMet、または、AdoHcy存在下における、wild typeの細胞周期進行の影響を調べた。その結果を図5に示す。
sah1-1が、細胞周期のどの時期で欠損があるのかをより詳細に調べるために、上記のα‐ファクターを用いて酵母細胞をG1期に同調し、その後α‐ファクターを含まない培地にシフトして、37℃での細胞周期進行をFACS解析により調べた。同様にDNA合成阻害剤であるハイドロキシウレア(HU)を用いて酵母細胞をS期に同調し、その後HUを含まない培地にシフトして、37℃での細胞周期進行をFACS解析により調べた。その結果を図6に示す。
上述の実施例1〜6の結果より、細胞内S‐アデノシルメチオニンは、酵母細胞内において細胞周期G1期を遅延させることがわかった。また、S‐アデノシルメチオニンは、細胞周期調節因子SWE1を不安定化させることがわかった。そこで、S‐アデノシルメチオニンは、zds1破壊株の示すカルシウム培地における増殖不能を回復させることができるかを検討した。その結果、図7に示すように、実際に、S‐アデノシルメチオニンは、zds1破壊株の300mMカルシウム培地における増殖不能を回復させることができた。
Claims (11)
- 細胞内でS‐アデノシルメチオニンを蓄積しうる酵母であって、配列番号4に示されるアミノ酸配列である変異型S‐アデノシルホモシステイン加水分解酵素を有することを特徴とする酵母変異体。
- 上記変異型S‐アデノシルホモシステイン加水分解酵素をコードする遺伝子を有することを特徴とする請求項1に記載の酵母変異体。
- 上記変異型S‐アデノシルホモシステイン加水分解酵素をコードする遺伝子が、配列番号2に示される塩基配列からなることを特徴とする請求項2に記載の酵母変異体。
- 上記酵母変異体が、サッカロミセス・セルビシェ(Sacharomyces cerevisiae)FERMP‐19715であることを特徴とする請求項1ないし3のいずれか1項に記載の酵母変異体。
- 請求項1〜4の何れか1項に記載の酵母変異体を培養することにより、S‐アデノシルメチオニンを生産することを特徴とするS‐アデノシルメチオニンの生産方法。
- アミノ酸配列が、配列番号4に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする変異型S‐アデノシルホモシステイン加水分解酵素。
- 請求項6に記載の変異型S‐アデノシルホモシステイン加水分解酵素をコードする遺伝子。
- 上記変異型S‐アデノシルホモシステイン加水分解酵素をコードする遺伝子が、配列番号2に示される塩基配列からなることを特徴とする請求項7に記載の遺伝子。
- 請求項7または8に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
- 請求項7または8に記載の遺伝子を宿主細胞に導入することを特徴とする形質転換体の生産方法。
- 請求項10に記載の形質転換体の生産方法によって得られた形質転換体。
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