JP4471687B2 - Biochemical analysis methods and biochemical analysis apparatus - Google Patents

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武彦 北森
俊則 大橋
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日立化成工業株式会社
財団法人神奈川科学技術アカデミー
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この出願の発明は、マイクロチップの微細流路において、高い精度で効率的に生化学分析を行うことができる、新しい生化学分析方法および生化学分析装置に関するものである。 The invention of this application, the micro-channel of the microchip, can be performed efficiently biochemical analysis with high accuracy, it relates to a new biochemical analysis method and biochemical analysis apparatus.

抗原抗体反応を利用した免疫分析法の場合には、試料中の微量な分析対象物質の存在やその濃度を、酵素標識した抗体により基質を反応させて生成される酵素反応生成物の生成量を吸光光度計、蛍光光度計、熱レンズ顕微鏡法、電気化学法、発光法等を利用して測定することにより知ることができる。 If the immunoassay method utilizing an antigen-antibody reaction, the presence and concentration of trace amounts of analyte in a sample, the production of the enzyme reaction product produced by reacting a substrate with an enzyme-labeled antibody absorptiometer, fluorometers, thermal lens microscopy, electrochemical methods, can be known by measuring using a luminescence method or the like.

この出願の発明者らは、このような免疫反応による微量物質の検出を、マイクロチップに形成した微細流路(マイクロチャンネル)において行うことを既に提案している(特許文献1)。 The inventors of this application, the detection of trace substances by such immunoreactivity, the fine passage formed microchip has already proposed to make the (microchannel) (Patent Document 1). この方法では、分析対象物質の検出や濃度測定を試料中の分析対象物質に対する抗体等を固相化したビーズ体を、ダム様構造を有する微細流路中で堰き止めて、試料溶液および分析対象物質に対する酵素標識物質を送液し、ついで、酵素の反応基質を送液することで発色、発光、熱レンズ顕微鏡法、もしくは、蛍光性の酵素反応物を蛍光光度計等を利用して測定することによって行っている。 In this method, the detection and concentration measurement of an analyte immobilized bead bodies antibody against the analyte in the sample, and dammed by the fine flow path having a dam-like structure, the sample solution and the analyte the enzyme-labeled substance was fed to a substance, then color development by feeding a reaction substrate for the enzyme, luminescent, thermal lens microscopy, or measuring the fluorescence of the enzyme reaction using a fluorometer etc. It is going by.

マイクロチャンネルを用いるこの方法には、分析対象物質を含有する微量な試料溶液であっても高い精度での分析が簡便に実現されるという特徴がある。 The method of using the micro-channel, is characterized in that analysis by high even small amount of sample solution containing an analyte precision is easily achieved.

また、発明者らが展開してきた上記の熱レンズ顕微鏡法では、微小領域をレーザー光で照射することでレーザー光に吸収を持つ物質が存在すると、その微小領域が暖められ、その結果屈折率の変化が生じ、微小凹レンズを形成することにより、焦点距離が変化して、結果として一定面積のディレクターに入射する光量が変化することを利用していることから、超微量分析が可能になる。 Further, the inventors have thermal lens microscopy methods described above have been developed, the substance is present having an absorption in the laser beam by irradiating a microscopic region by the laser beam, the minute area is warmed, the resulting refractive index changes occur, by forming a minute concave lens, and the focal length changes, since the amount of light incident on the director of the predetermined area as a result is by utilizing the change allows ultra microanalysis.

このように熱レンズ顕微鏡法では、微小領域の検出ができることから、流路幅100μm以下の微細流路であっても、その中の流体を直接測定することが可能であり、マイクロチップに適用しやすい原理を有している。 In this way, thermal lens microscopy, because it can be detected very small area, even less of the micro channel passage width 100 [mu] m, it is possible to measure the fluid therein directly applied to the microchip It has an easy principle. そこで、一般的には、標識酵素に反応する基質を一定速度でマイクロチップの微細流路に送液しながら、基質の発色反応物を熱レンズ顕微鏡によって、マイクロチップに設けられた堰き止め部の下流で信号強度の変化を検出している。 Therefore, in general, while a substrate that reacts to the labeling enzyme was fed to the micro-channel of the microchip at a constant speed, the chromogenic substrate reaction thermal lens microscope, damming portion provided on the microchip It detects the change in signal intensity in the downstream.

一方、蛍光による分析法では、蛍光物質を基質として、酵素標識した抗体により基質を反応させることで蛍光性反応生成物の生成量を熱レンズ顕微鏡と同様に堰き止め部の下流を直接蛍光分析することで定量することができる。 On the other hand, in the analysis by fluorescence, a fluorescent material as a substrate, directly fluorescence analysis downstream portion dammed Like the thermal lens microscope production of fluorescent reaction product by reacting a substrate with an enzyme-labeled antibody it can be quantified by.

このように優れた特徴のあるマイクロチップ微細流路中での免疫反応を利用した生化学分析方法ではあるが、この方法では、通常、送液の下流で反応生成物(酵素反応生成物)の濃度を測定することから、反応基質と酵素と接触する時間が送液の流速に依存し、また、ビーズ体が充填されている微細流路の体積は数nl以下と極めて小さいことから、反応基質と酵素とを十分に反応させるためには、流速を遅くする必要があり、また、流量の変化は、反応に直接影響を及ぼすことから検出精度の向上のためには、送液のポンプの高い精度での制御が必要とされる。 Although this way is a good biochemical analysis method utilizing immune reaction in microchip micro flow path having a characteristic, in this method, typically, downstream the reaction product of feeding the (enzymatic reaction product) since the measuring concentration, time to contact with the reaction substrate and the enzyme is dependent on the flow rate of liquid feed, the volume of the micro channel to the bead material is filled is extremely small and less than a few nl, reaction substrate and in order to sufficiently react with the enzyme, it is necessary to slow down the flow rate, also the change in flow rate is due to the improvement in the detection accuracy from directly affecting the reaction, high liquid feed pump control accuracy is required. しかも、反応性の低い基質では、十分な反応シグナルを得るためには酵素との接触時間を一定、かつ、長くする必要があり、流速を極めて遅くする必要がある。 Moreover, the less reactive substrate, in order to obtain a sufficient reaction signal constant contact time with the enzyme, and, it is necessary to increase, it is necessary to very slow flow rate.

しかしながら、流速を遅くすることは、僅かな気泡の混入や僅かな目詰まり等の影響を受けやすいため、一定の流量を得ることによって、安定した反応シグナルを得ることが必ずしも容易ではなかった。 However, slowing the flow rate, and is easily affected by such contamination or slight clogging of small bubbles, by obtaining a constant flow rate, to obtain a stable reaction signal was not always easy.
WO 03/062823 A1 WO 03/062823 A1

そこで、この出願の発明は、以上のとおりの背景から、従来のような流量制御についての特別の配慮を要することなく、簡便な操作によって、マイクロチップを用いて、酵素反応に依存したシグナルを選択的に、しかも鋭い信号強度として得ることのできる、高い精度でも効率的な生化学分析のための新しい生化学分析方法および生化学分析装置を提供することを課題としている。 Therefore, the invention of this application, the background as described above, without requiring special consideration for a conventional such flow control, by a simple operation, select the signal by using the microchip, depending on the enzymatic reaction manner, yet can be obtained as a sharp signal strength, and aims to provide a new biochemical analysis method and biochemical analysis apparatus for also efficient biochemical analysis with high accuracy.

この出願の発明は、上記の課題を解決する手段として、以下の生化学分析方法および生化学分析装置を提供する。 The invention of this application as a means to solve the above problems, provides the following biochemical analysis method and biochemical analysis apparatus.
<1>ビーズ担体の流れ堰き止め部が設けられたマイクロチップ微細流路に充填されたビーズ担体上で、試料液中の分析対象物質が特異的に結合する反応物質Aと、前記分析対象物質並びにこの分析対象物質と特異的に結合する酵素が標識された反応物質Bとによる複合体が、前記酵素の基質が反応するときに生じる酵素量に依存したシグナルから分析対象物質の濃度を測定する生化学分析方法において、微細流路中への基質溶液の送液を一定時間停止し、引き続き一定速度で基質溶液を送液することにより、流れ堰き止め部の下流で、酵素反応生成物の検出シグナルを半値幅数秒のピークとして捉える生化学分析方法。 <1> on bead carrier filled in the microchip microchannel flow blocking unit is provided in the bead carrier, and the reactant A to analyte in the sample liquid to specifically bind the analyte and the analyte specifically complex enzyme bound by the reactant B labeled is a substrate of the enzyme to measure the concentration of the analyte from the signal dependent on the amount of enzyme which occurs when reacting in biochemical analysis method, feed solution was stopped for a certain time of the substrate solution into the fine flow path, by feeding a substrate solution subsequently at a constant rate, downstream of the flow blocking unit, the detection of the enzymatic reaction product biochemical analysis method to capture the signal as the peak full width at half maximum of seconds.
<2>分析対象物質含有の試料液を、反応物質Aを支持させたビーズ担体充填の微細流路内に送液し、これと同時に、もしくは次いで反応物質Bを送液し、その後、前記反応物質Bの酵素と反応する基質溶液を一定時間の送液停止と引き続いての一定速度での送液により微細流路内に供給する前記第1の生化学分析方法。 <2> The analyte sample solution containing, reaction of bead carrier filling material A was supported was fed to the micro flow channel, and at the same time, or subsequently feeding a reactant B, then the reaction the first biochemical analysis method for supplying liquid feed by the micro-channel at a constant speed of the substrate solution that reacts with the enzyme of the material B subsequently the liquid delivery stops for a predetermined time.
<3>送液の停止と送液とをバルブ制御手段によるバルブの切り換えにより行う前記第1または2の生化学分析方法。 <3> the first or second biochemical analysis method and feeding stop and feeding performed by switching the valve according to the valve control means.
<4>送液の停止と送液とをポンプ制御手段によるポンプの停止と運動の切り換えにより行う前記第1または2の生化学分析方法。 <4> the first or second biochemical analysis methods performed by switching the liquid feed stopping the feeding and stopping of the pump by the pump control means movement.
<5>分析対象物質は抗原であり、反応物質Aは抗体であり、また反応物質Bは抗体である前記第1から4の生化学分析方法。 <5> analyte is an antigen, the reactant A is an antibody, and the reaction material B is the biochemical analysis method of the first four is an antibody.
<6>分析対象物質は抗体であり、反応物質Aは抗抗体であり、また反応物質Bは抗原、抗抗体または抗原と抗体との結合物である前記第1から4の生化学分析方法。 <6> analyte is an antibody, the reactant A is an anti-antibody, and the reaction material B antigen, biochemical analysis method of the first to fourth is a conjugate of an anti-antibody or an antigen and an antibody.
<7>分析対象物質は抗体であり、反応物質Aは抗原であり、また反応物質Bは抗抗体である前記第1から4の生化学分析方法。 <7> analyte is an antibody, the reactant A is an antigen and Reactant B is the biochemical analysis method first to fourth is anti-antibody.
<8>酵素との反応によるシグナルを、吸光度、蛍光および熱レンズ信号の少なくとも1つをもって検出する前記第1から7の生化学分析方法。 <8> signal by reaction with an enzyme, absorbance, fluorescence and at least one said biochemical analysis method of the first from 7 to detect with a thermal lens signal.
<9>ビーズ担体の流れ堰き止め部が設けられたマイクロチップ微細流路に充填されたビーズ担体上で、試料液中の分析対象物質が特異的に結合する反応物質Aと、前記分析対象物質並びにこの分析対象物質と特異的に結合する酵素が標識された反応物質Bとによる複合体が、前記酵素の基質が反応するときに生じる酵素量に依存したシグナルから分析対象物質の濃度を測定する生化学分析装置において、微細流路中への基質溶液の送液を一定時間停止し、引き続き一定速度で基質液を送液する送液手段および検出シグナルを半値幅数秒のピークとして捉える検出手段とを備えている生化学分析装置。 <9> on bead carrier filled in the microchip microchannel flow blocking unit is provided in the bead carrier, and the reactant A to analyte in the sample liquid to specifically bind the analyte and the analyte specifically complex enzyme bound by the reactant B labeled is a substrate of the enzyme to measure the concentration of the analyte from the signal dependent on the amount of enzyme which occurs when reacting in biochemical analysis unit, a detection unit to capture liquid delivery was stopped for a certain time of the substrate solution into the fine flow path, the liquid supply means and the detection signal feeding a substrate solution subsequently at a constant rate as the peak half width seconds and are biochemical analyzer equipped with a.
<10>反応物質Aを支持させたビーズ担体が微細流路内に充填されている前記第9の生化学分析装置。 <10> reaction the material A beads carrier is supported is filled microchannel ninth biochemical analyzer.
<11>送液手段は、バルブ切り換え制御装置を備えている前記第9または10の生化学分析装置。 <11> feeding means, the biochemical analysis apparatus of the ninth or 10 and a valve switching control device.
<12>送液手段は、ポンプ切り換え制御装置を備えている前記第9または10の生化学分析装置。 <12> feeding means, the biochemical analysis apparatus of the ninth or 10 and a pump switching control device.
<13>分析対象物質が抗原であり、反応物質Aが抗体であり、また反応物質Bが抗体である前記第9から12の生化学分析装置。 <13> analyte is an antigen, the reactant A is an antibody, and the reaction substance B biochemical analysis apparatus of the ninth to 12 is an antibody.
<14>分析対象物質が抗体であり、反応物質Aが抗抗体であり、また反応物質Bが抗原、抗抗体または抗原と抗体との結合物である前記第9から12の生化学分析装置。 <14> a analyte antibody, the reactant A is an anti-antibody, and the reaction substance B antigen, the ninth from 12 biochemical analyzer is a conjugate of an anti-antibody or an antigen and an antibody.
<15>分析対象物質が抗体であり、反応物質Aが抗原であり、また反応物質Bが抗抗体である前記第9から12の生化学分析装置。 <15> analyte is an antibody, the reactant A is an antigen and Reactant B is a biochemical analysis apparatus of the ninth to 12 which is an anti-antibody.
<16>検出手段として、吸光光度計、蛍光測定装置および熱レンズ顕微鏡の少なくとも1つを備えている前記第9から15の生化学分析装置。 <16> as detecting means, absorptiometer, fluorescence measuring device and at least in that the ninth to 15 biochemical analysis apparatus which comprises one of thermal lens microscope.

上記第1の発明の生化学分析方法によれば、基質溶液を常に新鮮な状態で送液することで、酵素反応に依存したシグナルを取得し、しかも、基質送液を一定時間停止した後、再度送液することで、流速や流量変化による信号強度への影響を抑え、酵素反応を送液停止時間に比例した鋭いシグナル(信号)として得ることができる。 According to biochemical analysis method of the first invention, by feeding a substrate solution always fresh, obtains a signal that depends on the enzyme reaction, moreover, after stopping the substrate feeding a predetermined time, by feeding back, it is possible to suppress the influence of the signal intensity due to flow velocity and flow rate changes, obtained by the sharp signal proportional to enzyme reaction liquid supply stop time (signal). すなわち、酵素反応は送液停止時間に比例した鋭いシグナル(信号)として得られ、停止時間を制御することで酵素反応生成物の濃度を自由に制御することが可能になり、高い精度で効率的な生化学分析を行うことができる。 That is, the enzyme reaction is obtained as a sharp signal proportional to the feeding stop time (signal), it is possible to freely control the concentration of the enzyme reaction product by controlling the stop time, efficiently with high precision biochemical analysis, such can be carried out. 具体的には、反応生成物はほとんど拡散することがないため、シグナルは、半値幅数秒の鋭いピークとして検出される。 Specifically, since there is no possible reaction products that hardly diffused, the signal is detected as a sharp peak half width seconds.

第2の発明の生化学分析方法によれば、上記第1の発明と同様の効果が得られ、分析対象物質と反応物質Aとの反応が確実にすることができ、より明瞭で、鋭いピークが検出することができ、高い精度で効率的な生化学分析を行うことができる。 According to biochemical analysis method of the second invention, the first invention and the same effect can be obtained, it can be reacted with the analyte and reactant A is ensured, clearer, sharp peaks There can be detected, it is possible to perform efficient biochemical analysis with high accuracy.

第3の発明の生化学分析方法によれば、上記第1の発明および第2の発明と同様の効果が得られるとともに、送液の停止および送液の制御が、安定、かつ、スムーズに行うことができる。 According to biochemical analysis method of the third invention, together with the first and second inventions and the same effect can be obtained, the control of liquid feed stopping and feeding, stable and smoothly be able to.

第4の発明の生化学分析方法によれば、上記第1の発明および第2の発明と同様の効果が得られるとともに、送液の停止および送液の制御が、安定、かつ、スムーズに行うことができる。 According to biochemical analysis method of the fourth invention, together with the first and second inventions and the same effect can be obtained, the control of liquid feed stopping and feeding, stable and smoothly be able to.

の発明の生化学分析方法によれば、上記第1の発明から第の発明と同様の効果に加え、さらに、より簡便で高精度な生化学分析を行うことができる。 According to biochemical analysis method of the fifth invention, in addition to the fourth aspect the same advantages from the first invention, it is possible to further perform a more simple and accurate biochemical analysis.

の発明の生化学分析方法によれば、上記第1の発明から第の発明と同様の効果に加え、さらに、より簡便で高精度な生化学分析を行うことができる。 According to biochemical analysis method of the sixth invention, in addition to the fourth aspect the same advantages from the first invention, it is possible to further perform a more simple and accurate biochemical analysis.

の発明の生化学分析方法によれば、上記第1の発明から第の発明と同様の効果に加え、さらに、より簡便で高精度な生化学分析を行うことができる。 According to biochemical analysis method of the seventh invention, in addition to the fourth aspect the same advantages from the first invention, it is possible to further perform a more simple and accurate biochemical analysis.

の発明の生化学分析方法によれば、上記第1の発明から第の発明と同様の効果が得られ、しかも、より高精度なシグナルの検出が可能となる。 According to biochemical analysis method of the eighth invention, the seventh same effects as the invention of the first invention can be obtained. Moreover, it is possible to more accurate signal detection.

第9の発明の生化学分析装置によれば、基質送液を一定時間停止、また再び一定速度で送液することが安定簡単にでき、酵素反応を送液停止時間に比例した鋭いシグナル(信号)として得ることができるため、停止時間を制御することで酵素反応生成物の濃度を自由に制御することができ、明瞭で鋭いピーク高さを検出、測定することができる。 According to the biochemical analysis apparatus of the ninth invention, it stops substrate feeding predetermined time and can have stable easy to feed again at a constant speed, a sharp signal (signal proportional to enzyme reaction liquid feeding downtime ) and it is possible get, it is possible to freely control the concentration of the enzyme reaction product by controlling the stop time, clear and sharp peak height detection can be measured. 具体的には、反応生成物はほとんど拡散することがないため、シグナルは、半値幅数秒の鋭いピークとして検出される。 Specifically, since there is no possible reaction products that hardly diffused, the signal is detected as a sharp peak half width seconds.

10の発明の生化学分析装置によれば、上記第の発明と同様の効果が得られ、また、分析対象物質と反応物質Aとの反応が確実にすることができ、しかも、操作の簡便性、再使用性、分析精度の向上を実現することができる。 According to the biochemical analysis apparatus of the tenth aspect of the invention, the ninth same effect as the invention can be obtained and can be reacted with the analyte and reactant A is ensured, moreover, the operation simplicity, reusability, it is possible to realize an improvement in analytical accuracy.

11の発明の生化学分析装置によれば、上記第の発明および第10の発明と同様の効果が得られるとともに、送液の停止および送液の制御が、安定、かつ、スムーズに行うことができる。 According to the biochemical analysis apparatus of the eleventh aspect, with the ninth invention and the tenth same effect as the invention can be obtained, the control of liquid feed stopping and feeding, stable and smoothly be able to.

12の発明の生化学分析装置によれば、上記第の発明および第10の発明と同様の効果が得られるとともに、送液の停止および送液の制御が、安定、かつ、スムーズに行うことができる。 According to the biochemical analysis apparatus of the twelfth invention, together with the ninth invention and the tenth same effect as the invention can be obtained, the control of liquid feed stopping and feeding, stable and smoothly be able to.

13の発明の生化学分析装置によれば、上記第から第12の発明と同様の効果に加え、さらに、より簡便で高精度な生化学分析を行うことができる。 According to the biochemical analysis apparatus of the thirteenth invention, in addition to the 12 same effect as the invention from the ninth, it is possible to further perform a more simple and accurate biochemical analysis.

14の発明の生化学分析装置によれば、上記第から第12の発明と同様の効果に加え、さらに、より簡便で高精度な生化学分析を行うことができる。 According to the biochemical analysis apparatus of the fourteenth invention, in addition to the 12 same effect as the invention from the ninth, it is possible to further perform a more simple and accurate biochemical analysis.

15の発明の生化学分析装置によれば、上記第から第12の発明と同様の効果に加え、さらに、より簡便で高精度な生化学分析を行うことができる。 According to the biochemical analysis apparatus of the fifteenth invention, in addition to the 12 same effect as the invention from the ninth, it is possible to further perform a more simple and accurate biochemical analysis.

16の発明の生化学分析装置によれば、上記第の発明と同様の効果が得られ、しかも、より高精度なシグナルの検出が可能となる。 According to the biochemical analysis apparatus of the invention of a 16, the ninth same effect as the invention can be obtained. Moreover, it is possible to more accurate signal detection.

この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。 The invention of this application but those having the features of as described above, will be described in detail embodiments thereof below.

この出願の発明は、マイクロチップの微細流路における担体上で、試料液中の分析対象物質が特異的に結合する反応物質Aと、前記分析対象物質並びにこの分析対象物質と特異的に結合する酵素が標識された反応物質Bとによる複合体が、前記酵素の基質が反応するときに生じる酵素量に依存したシグナルから分析対象物質の濃度を測定する生化学分析方法である。 The invention of this application on a support in the micro-channel of the microchip, and the reactant A to analyte in the sample liquid to specifically bind the analyte as well as the analyte specifically binds complex by a reactant B which enzyme labeled is a substrate of the enzyme is a biochemical analytical method for measuring the concentration of analyte from the dependent signal to the amount of enzyme that occurs when the reactions. そして、この生化学分析方法において、微細流路中への基質溶液の送液を一定時間停止して、引き続き一定速度で基質溶液を送液(Stop/Flow)することにより、検出シグナルを明暸で鋭いピークとして検出装置等で捉えることができる。 Then, in the biochemical analysis method, a liquid feed of the substrate solution into the fine flow path and stopped for a certain time, by the substrate solution is pumped (Stop / Flow) continue at a constant speed, a detectable signal Akira暸it can be captured by the detection device such as a sharp peak. この結果、基質溶液を常に新鮮な状態で送液することができ、酵素反応に依存したシグナルを取得することができる。 As a result, it is possible to feed a substrate solution always fresh, it is possible to obtain a signal which depends on the enzymatic reaction. しかも、基質送液を一定時間停止した後、再度送液することで、液量変化による信号強度への影響を抑え、酵素反応を送液停止時間に比例した鋭い信号として得ることができるため、従来よりも高い精度で効率的に生化学分析を実施することができる。 Moreover, after stopping the substrate feeding a predetermined time, by feeding back, it is possible to suppress the influence of the signal intensity due to liquid quantity variation is obtained as a sharp signal proportional to enzyme reaction liquid feeding stop time, it can be carried out efficiently biochemical analysis with higher accuracy than before.

また、この出願の発明の生化学分析方法においては、反応物質Aを支持させるための担体としては各種のもの、そして各種形状のものであってよく、ビーズ状、ブロック状、板状等の各種の形態のプラスチック、無機物等のものであってよい。 In the biochemical analysis method of the invention of this application, the reaction things as various types of material A as a carrier for supporting and may be of various shapes, beads, block-shaped, the various plate-shaped like plastic in the form of, be of inorganic, or the like. 微細流路の内壁、あるいは、これを表面修飾した表面であってもよい。 The inner wall of the micro channel or, this may be a surface-modified surfaces.

なかでも、操作の簡便性、再使用性、分析精度等の観点からは、ビーズ状のものが好適な例として示される。 Among them, ease of operation, reusability, and preferable from the standpoint of a analytical precision, those beads are shown as preferable examples. たとえば、このビーズ担体を用いる場合には、分析対象物質含有の試料液を、反応物質Aを支持させたビーズ担体充填の微細流路内にチップジョイントから送液して、これと同時に、もしくは、ついで反応物質Bを送液し、その後、前記反応物質Bの酵素と反応する基質溶液を一定時間の送液停止と引き続いての一定速度での送液により微細流路内に供給することで、より簡便に、分析対象物質の生化学分析方法を行うことができる。 For example, when using this bead carrier will analyze a sample solution of the target substance-containing, and feeding from the tip joint reaction bead carrier filled in the minute flow path of material A is supported, and at the same time, or, then reaction material B was fed, then, by supplying the reactant microchannel by liquid feed at a constant speed of the substrate solution that reacts with the enzyme of B subsequently the liquid delivery stops for a predetermined time, more conveniently, biochemical analysis method of an analyte can be performed.

なお、この場合のビーズ担体は、反応物質Aが固定化されることができるものであればよく、ガラスビーズや高分子ビーズ等が例示することができるが、特に制限されるものではない。 Incidentally, bead carrier In this case, reactant A is as long as it can be immobilized, may be glass beads or polymer beads or the like are exemplified, but the invention is not particularly limited. また、この出願の発明の生化学分析方法における、送液の「停止状態」とは、たとえば、後述の図1におけるチップジョイント(6)でのキャピラリー(微細流路)内圧力(P )と排出部(9)の(微細流路)での圧力(P )とが略同一、すなわち、相互の圧力はP ≒P の状態にあることを意味している。 Also, in the biochemical analysis method of the invention of this application, "stopped" state of the liquid feed, for example, a capillary (fine channel) internal pressure (P 0) in the chip joint (6) in Figure 1 below the pressure (P 1) and is substantially the same at the discharge portion (9) (micro-channel), i.e., the pressure of each other means that in the state of P 0 ≒ P 1.

送液の停止と送液のための手段、すなわち送液手段としては、たとえば、バルブ制御手段によるバルブの切り換えを可能とするものや、ポンプ制御手段によるポンプの停止と運動の切り換えを可能とするものが好適に考慮される。 Means for stopping and feeding the liquid feed, that is, as the feeding means, for example, those that allow switching of the valve by the valve control means and to allow the switching movement and stopping of the pump by the pump control means what it is suitably considered. この出願の発明の生化学分析方法における送液の停止および送液を安定、かつ、スムーズに行うためには、上記のようなバルブ制御手段、または、ポンプ制御手段を利用することが好ましい。 Stopping and feeding the liquid feed in the biochemical analysis method of the invention of this application stability, and, in order to perform the smooth, the valve control means as described above, or, it is preferable to use a pump control means.

この出願の発明の生化学分析方法に用いることのできるマイクロチップの微細流路内にビーズ担体の流れ堰き止め部を設けて、検出位置をその下流位置とすることも好適に考慮される。 This in the microchip in the microchannel that may be used in biochemical analysis method of the invention of application provided a flow damming portion of bead carrier, are also preferably contemplated that the detection position and a downstream position. この場合には、反応生成物はほとんど拡散することなく、半値幅数秒の鋭いピークとして検出することが可能になる。 In this case, the reaction product without almost diffusing, it is possible to detect as a sharp peak half width seconds.

また、この出願の発明の生化学分析方法では、分析対象物質、反応物質Aおよび反応物質Bとの反応において、免疫反応を利用することで、より簡便で高精度な生化学分析を行うことができる。 Further, in the biochemical analysis method of the invention of this application, analyte, the reaction in the reaction with the substance A and reactant B, by utilizing an immune reaction, be performed more simple and accurate biochemical analysis it can. たとえば、分析対象物質が抗原である場合、反応物質Aは分析対象物質と特異的に結合する抗体、また反応物質Bについても抗体であることが好ましい。 For example, if the analyte is an antigen, reactant A is preferably an antibody that binds to analyte and specific, also the reactant B is an antibody.

さらに、分析対象物質が抗体である場合は、反応物質Aは分析対象物質と特異的に結合する抗抗体であり、また反応物質Bはこれら抗原や抗抗体または抗原と抗体との結合物であることが好ましい。 Furthermore, if the analyte is an antibody, the reactant A is an anti-antibody specifically binds to the analyte, also the reactant B is a binding of these antigens or anti-antibody or an antigen and an antibody it is preferable. なお、分析対象物質が抗体である場合、反応物質Aが抗体である分析対象物質の抗原、また反応物質Bが抗抗体であってもよい。 In the case analyte is an antibody, antigen analyte reactant A is an antibody, also is reactant B may be an anti-antibody.

この出願の発明において分析対象となりうる物質は、たとえば、蛋白質、核酸、化学物質等、より具体的には、たとえば、生理活性物質や食品等に含まれる内分泌攪乱物質等が挙げられ、特に制限されるものではない。 Substances that can be analyzed in the invention of this application, for example, proteins, nucleic acids, chemical substances, more specifically, for example, endocrine disrupting chemicals and the like contained in the physiologically active substance and foods, particularly limited not shall. このため、この出願の発明は、医学、薬学、生物学、化学、食品学等の諸分野において利用することができ、分析対象物質の測定やスクリーニング等に利用することができる。 Therefore, the invention of this application, medicine, pharmacy, biology, chemistry, can be utilized in various fields of food science, etc., it can be utilized to measure and screening, etc. analyte. また、使用できる反応物質Aも特に制限されるものではなく、分析対象物質と特異的に結合するものであればよい。 Also, reactant A which can be used is also not particularly limited, as long as it specifically binds to the analyte. さらに、反応物質Bについても、分析対象物質および/または反応物質Aと特異的に結合するものであればよく、さらに、反応物質Bに標識される酵素の種類等も特に制限されるものではない。 Furthermore, for the reactant B, analyte and / or reactant A specifically as long as it binds further it is not particularly limited kind of enzyme labeled reactant B .

たとえば、分析対象物質が、免疫グロブリンE(IgE)である場合には、反応物質Aは抗IgE抗体であることが好ましく、反応物質Bは、酵素が標識された抗1gE抗体であることが好ましい例として示される。 For example, analyte is, when it is immunoglobulin E (IgE), it is preferred that the reactants A is an anti-IgE antibody, the reactant B is preferably an anti-1gE antibody enzyme labeled It is shown as an example. また、反応物質Bに標識されている酵素についても、β−ガラクトシターゼ(β−Gal)、アルカリフォスファターゼ(AP)やペルオキシターゼ(POD)、ホースラディッシュパーオキシターゼ(HRP)等のいずれかが標識されていることが好適な例として考慮される。 As for the enzymes that are labeled reactant B, beta-galactosidase (beta-Gal), alkaline phosphatase (AP) and peroxidase (POD), or the like horseradish peroxidase (HRP) is labeled it is considered as a preferred example is. そして、これら酵素と反応することのできる各種の基質溶液を導入することで、基質溶液中の基質物質が酵素と反応して、蛍光性物質、あるいは、吸光性物質等に変換されてシグナルを発することとなる。 Then, by introducing various substrate solution capable of reacting with these enzymes, substrate material of substrate solution reacts with an enzyme, fluorescent substance or emits a signal is converted into light absorbing substances and thus.

具体例としても各種の場合が考慮されてよい。 For various it may be considered as a specific example. たとえば、イボニシ等の海産巻き貝に含まれる、内分泌攪乱物質の一種とされる性ホルモン17β−estradiolを分析対象物質とすることもできる。 For example, it included in the marine snails such as Thais clavigera, a kind and is the hormone 17ß-Estradiol endocrine disrupters can be analyzed substances. この場合には、反応物質Aは抗17β−estradiol抗体を用い、反応物質Bは、HRP標識された抗17β−estradiol抗体を用い、そして、HRPと反応する基質溶液を導入することにより、酵素反応に依存したシグナルを取得することができるため、17β−estradiolを高精度に分析することができる。 In this case, reactant A is using an anti-17ß-Estradiol antibody, the reactant B is using an anti-17ß-Estradiol antibody HRP labeled and, by introducing the substrate solution that reacts with HRP, enzyme reaction it is possible to obtain a signal which depends on, it can be analyzed 17ß-Estradiol with high accuracy.

そして、上記のとおりの生化学分析において、得られた酵素との反応によるシグナルを、たとえば、吸光度、蛍光および熱レンズ信号の内、少なくともいずれか1つのシグナルをもって検出装置等による検出手段で検出することができる。 Then, in a biochemical analysis as described above, the signal due to the reaction between the obtained enzyme, for example, absorbance, of fluorescence and thermal lens signal is detected by the detection means by the detection device or the like with at least one of the signals be able to.

図1は、上記のような生化学分析を行うためのシステム構成(装置)を例示したものであって、マイクロチップ(1)の微細流路(1A)において、抗原抗体免疫反応を行うための自動化された送液制御部(2)と、これにより制御されている試薬を選択し送液するための送液ポンプ(3)とともに、バルブ(4)、そして、検出時に一定時間の停止(ストップ)および引き続いての一定速度の送液(フロー)を行うバルブ(5)を備えている。 Figure 1 is a an illustration of a system configuration (device) for performing biochemical analysis, such as described above, in the micro-channel of the microchip (1) (1A), for performing the antigen-antibody immune reaction the automated liquid feed control section (2), the liquid feed pump for selecting a sending reagents is controlled by this (3), the valve (4), and, stopping for a predetermined time upon detection (stop and a valve (5) to perform) and subsequent constant speed of feeding of the (flow). また、このマイクロチップ(1)には、分析対象物質含有の試料液(8)や各種試薬類を送液、装入するためのチップジョイント(6)と廃液(91)を排出するための排出部(9)とを備えている。 Further, this microchip (1), the discharge for discharging the analyte-containing sample solution (8) and various reagents feeding, the tip joint for loading (6) effluent (91) and a part (9).

チップジョイント(6)の微細流路内圧力(P )と、排出部(9)での圧力(P )とがP ≒P となるように送液を「停止」するこの出願の発明においては、上記のバルブ(4)(5)等による送液上流側での制御手段だけでなく、排出部(9)における下流側の流れ(圧力)制御のためのバルブ等の手段を用いてもよいもちろん、上流下流で、これら流れ(圧力)制御手段を併用してもよい。 A microchannel pressure tip joint (6) (P 0), the pressure at the discharge portion (9) (P 1) and is in this application to "stop" the liquid feed so that P 0 ≒ P 1 in the invention, not only the control means in the above valve (4) (5) feeding the upstream side by the like, using means such as a valve for the downstream flow (pressure) control in the discharge section (9) and may of course, upstream downstream, these may be used in combination flow (pressure) control means.

この検出時における基質溶液の送液の一定時間の停止および引き続き一定速度の送液(Stop/Flow)の制御には、バルブの切り換えによる制御を行うことのできるバルブ切り換え制御装置やポンプの運動および停止による制御を行うことのできるポンプ切り換え制御装置を備えることによって、安定、かつ、スムーズに送液の停止および送液をすることができる。 The control of the liquid feed a certain time of stopping and subsequent constant speed feeding of the substrate solution in the detection time (Stop / Flow), movement and valve switching control device and a pump that can be controlled by the switching of the valve by providing a pump switching control device capable of performing control by stopping, stabilization, and it is possible to smoothly feeding stop and feeding.

なお、この出願の発明における「一定時間の停止」の「時間」については、分析対象物質の検出系によって得られる好適なシグナルのピーク高さ等を考慮して、適宜に設定、変更することができる。 Note that the "time" in the "stop a certain time" in the invention of this application, taking into account the preferred peak height of the signal such as obtained by the detection system analyte, appropriately setting, to change it can.

前記送液ポンプ(3)には、たとえば、試薬を送液するための複数のマイクロシリンジ(図示せず)が備えられている。 The liquid feed pump (3) is, for example, a plurality of micro-syringe for sending a reagent (not shown) is provided. また、たとえば、試薬は分析対象物質に特異的に結合する酵素標識抗体(反応物質B)と、検体(分析対象物質)を含む試料液(8)中の夾雑物および余分な酵素標識抗体(反応物質B)を洗浄するための洗浄液、そして、酵素反応により蛍光性物質、あるいは、吸光性物質に変換される基質からなっている。 Further, for example, reagents and analysis target substance specifically binds to the enzyme-labeled antibody (reactant B), the sample contaminants and excess enzyme-labeled antibody in the sample solution (8) containing the (analyte) (reaction cleaning liquid for cleaning a substance B) Then, a fluorescent substance by an enzymatic reaction or, consists of substrate converted into light absorbing material.

上記の微細流路(1A)(マイクロチャンネル)については、およそ幅500μm以下、深さ300μm以下が目安となる。 The above micro-channel (1A) (microchannel), approximately the width 500μm or less, the depth 300μm or less as a guide. このような微細流路(1A)は、ガラス、プラスチック、シリコン、その他各種のセラミックスや無機質材、あるいは金属等の適宜な素材のマイクロチップ(1)基板に微細加工技術によって形成したもの、あるいは、さらに、その表面を修飾したものとしたもの等とすることができる。 Such micro-channel (1A) are those formed of glass, plastic, silicon, various other ceramics or inorganic material, or an appropriate material of the microchip (1) substrates such as metal substrates by microfabrication techniques, or, Furthermore, it is possible to like those with a modified version of the surface.

そして、この微細流路(1A)の平面流路パターンは、分析の目的等に応じて様々な合流部や分岐部を持つものであってよい。 The planar flow path pattern of the fine channel (1A) may be those having various merging portion and the branch portion in accordance with the purpose or the like of the analysis. その断面形状を適宜に様々なパターンとすることができる。 It may be suitably different patterns sectional shape.

なお、反応・分析時には、微細流路(1A)(マイクロチャンネル)やビーズ担体のチップジョイント(6)に気泡が混入すると分析上好ましくない場合があることから、たとえば、マイクロチャンネル上部のマイクロチップ(1)表面に配置する透明カバー体やマイクロチップ(1)(基板)に微小孔や微小排気路を設けることや、図2の平面Y字型のマイクロチャンネル流路の一方に試料や試薬を供給する際に、他方のマイクロチャンネル流路にまでこれらが流れ込むように気泡の混入を抑えること等のことが、そして、そのための流路設計が考慮されることになる。 At the time of reaction and analysis, since there are cases analyzed undesirable bubbles are mixed into the fine channel (1A) of (microchannel) and bead carrier chip joint (6), for example, microchannels top of the microchip ( 1) and providing a small hole or fine exhaust passage to the transparent cover and microchip arranging (1) (substrate) to the surface, supplying a sample and a reagent on one microchannel passage plane Y-shaped 2 when, to the other of the microchannel flow paths that such suppressing the mixing of air bubbles so that they flow and so that the flow path design therefor is considered.

また、定量分析のために一定量のビーズ担体(1B)を導入することが必要な場合には、ビーズ担体(1B)の個数を数えるのではなく、流路設計により体積、すなわち流路長さにより判定できるようにすることも考慮されている。 Further, in the case for quantitative analysis required to introduce an amount of bead carrier (1B), rather than counting the number of beads carrier (1B), the volume by passage design, namely the channel length It is also considered to be able to determine the.

もちろん図1、図2は、システムの構成例を説明したものであって、これに限定されることはない。 Of course 1 and 2, there is described an example of the configuration of the system, but is not limited thereto. たとえば一枚の基板(マイクロチップ(1))上に、複数の反応流路部と複数の検出流路部が配設されていてもよいし、さらには、たとえば図2に例示したように、検出点を一点にし、一つの検出流路部に、並列配置した複数の流路部の各々が連通されるようにしてもよい。 For example, on a single substrate (microchip (1)), to a plurality of the reaction flow path portion and a plurality of detection flow passage section may be disposed, further, as illustrated for example in FIG. 2, the detection points to one point, one of the detection flow passage unit, each of the plurality of flow path portion in parallel arrangement may be communicated. この場合には、同時に他種類の分析を行うことを目的とし、まず初めに各々の流路部のチャンネルに反応に必要な試薬溶液などを同時に導入して一斉に反応させた後、酵素反応基質溶液を各チャンネルごとに順次導入して、反応生成物を合流部より下流で検出することができる。 After this case, reacted simultaneously introduced at the same time aims to make other types of analysis, such as the simultaneous reagent solution necessary for the reaction in the channel of the channel portion of the First each enzyme reaction substrate the solution was sequentially introduced into each channel can be detected downstream of the joining portion of the reaction product.

この検出する際には、図2に例示したように、ビーズ担体(1B)の流れを堰き止める堰き止め部(1C)を設けたマイクロチップ(1)を使用することによって、検出位置をその下流位置とし、反応生成物をほとんど拡散させることなく、半値幅数秒の鋭いピークとして検出することが可能になり、好ましい。 When this detection, as illustrated in FIG. 2, by using blocking portion blocking the flow of bead carrier (1B) a microchip provided with (1C) (1), downstream of the detection position and position, the reaction product without hardly diffused, it is possible to detect as a sharp peak half width seconds, preferably.

また、各チャンネルの分析結果を一カ所の検出点で測ることができ、検出装置(7)を複数準備したり、検出装置(7)もしくはマイクロチップ(1)を移動させたりする必要がないため、簡便で迅速な分析が可能となる。 Further, the analysis result of each channel can be measured at one place of the detection points, or a plurality preparing a detection device (7), the detection device (7) or the microchip (1) because there is no need or to move the , it is possible to simple and rapid analysis. この検出については、非接触で、たとえば光学的に行うことなどが可能である。 This detection is a non-contact, for example, it is carried out optically and the like are possible. たとえば、吸光光度計、蛍光測定装置、熱レンズ顕微鏡等の検出装置を使用することができ、これら検出装置を複数組み合わせて使用してもよい。 For example, absorption photometer, a fluorescence measurement apparatus, it is possible to use a detection device such as a thermal lens microscope may be used in combination of a plurality of these detection devices. また、特に熱レンズ顕微鏡については、この出願の発明者らが開発してきた熱レンズ顕微鏡(TLM)システムを有効に用いることができる。 Further, particularly for thermal lens microscope can be used to enable thermal lens microscope (TLM) system we have developed for this application.

以上のようなシステム構成(装置)を利用することによって、試薬送液の流速および流量を安定に制御することができ、高い精度で効率的に生化学分析を行うことができることとなる。 By utilizing the system configuration (device) as described above, it is possible to stably control the flow rate and the flow rate of the reagent feeding, it becomes possible to efficiently perform biochemical analysis with high accuracy.

そこで以下に実施例を示し、さらに詳しくこの出願の発明について説明する。 Therefore the following examples, further detailed explanation for the invention of this application. もちろん、以下の例によってこの出願の発明が限定されることはない。 Of course, never following examples the invention of this application is limited.

実施例1:生化学分析 分析対象物質をIgEとし、反応物質Aとしては抗IgE抗体を、また反応物質Bとしてはホースラディッシュパーオキシターゼ(Horseradish peroxidase、HRP)標識された抗IgE抗体を用いた。 Example 1: The biochemical analysis analyte and IgE, anti-IgE antibodies as reactants A, and as the reactant B with horseradish peroxidase (Horseradish peroxidase, HRP) labeled anti-IgE antibody. また、基質溶液としては、HRPと反応するAmplex Red(モルキュラープローブ社製)を用いた。 As the substrate solution, using the Amplex Red to react with HRP (manufactured by mole Molecular Probes). また、マイクロチップとしてはパイレックス(登録商標)ガラス製で、幅250μm、深さ100μmの微細流路および中央部のみビーズ担体を堰き止めるために深さを10μmにした堰き止め部を有するものを用いた。 Further, in Pyrex glass as a microchip, use those having a damming portion in which the depth 10μm to block the width 250 [mu] m, only the fine flow path and the central portion of the depth 100μm bead carrier It had. ビーズ担体としては、直径15−50μm程度のポリスチレンビーズを用いた。 The bead carrier, using polystyrene beads of diameter about 15-50Myuemu.

図1および図2に概要を説明したシステム構成(装置)において、抗IgE抗体が吸着保持されたポリスチレンビーズ(10μg/ml)をマイクロチップの微細流路内に導入して、各種濃度(0ng/ml、15.6ng/ml、31.3ng/ml、62.5ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)の分析対象物質であるIgEをそれぞれ送液した。 1 and system configuration outlined in Figure 2 (apparatus), by introducing polystyrene beads anti-IgE antibody is held adsorb (10 [mu] g / ml) to the microchip in the microchannel, various concentrations (0 ng / ml, 15.6ng / ml, 31.3ng / ml, 62.5ng / ml, 125ng / ml, 250ng / ml, 500ng / ml, the IgE is analyte of 1000 ng / ml) was fed respectively. つぎに、HRP−抗IgE抗体(10μg/ml)を送液し、洗浄した。 Then feeding anti-IgE antibody (10μg / ml) HRP-, and washed. そして、Amplex Redを4分間マイクロチップの微細流路内に送液して、その後30秒間隔で送液の停止および送液とを繰り返すことにより、Amplex Redの蛍光性反応生成物をピークとして蛍光検出した。 Then, fluorescence was fed the Amplex Red microchip in the microchannel 4 minutes, by subsequently repeating the liquid delivery stops and fed by a 30 second intervals, a peak fluorescent reaction product of Amplex Red It was detected.

結果は、図3および図4それぞれに示したとおりであって、検出されるピークの高さはIgE濃度に依存しており、図4の検量線で示したように良好な直線性を示すことが確認された。 The results, be as shown in Figures 3 and 4, the height of the peaks detected is dependent on IgE concentration, exhibit good linearity as indicated by the calibration curve of FIG. 4 There has been confirmed.
実施例2:生化学分析2 Example 2: Biochemical analysis 2
実施例1と同様にして、基質溶液には、HRPと反応するテトラメチルベンジジン(TMB)を用い、熱レンズ顕微鏡で検出される熱レンズ信号を検出し、検量線を作成評価した。 In the same manner as in Example 1, the substrate solution, using tetramethylbenzidine (TMB) to react with HRP, detects the thermal lens signal detected by the thermal lens microscope, it was prepared evaluate a calibration curve.

結果は、図5に示したとおりであった。 The results were as shown in FIG. TMBを用いた場合でも、IgEの濃度依存的に検出されるピークが高くなっていることが確認された。 Even with TMB, it was confirmed that peak concentration-dependent manner the detection of IgE is high.
実施例3:Stop/FlowによるシグナルとContinuous Flowによるシグナルの比較 実施例2において、この出願の発明のStop/Flowによるシグナルと従来のContinuous Flowによるシグナルとの比較した。 Example 3: Stop / Flow Comparative Example 2 of the signal by the signal and Continuous Flow by, and compared with the signals due to Stop / Flow by Signal and conventional Continuous Flow of the invention of this application. 図6に示したとおり、Stop/Flow(上段)では、シグナル強度が鋭く、かつ、明確なシグナルが検出された。 As shown in FIG. 6, the Stop / Flow (top), the signal strength is sharp and clear signal was detected. 一方、従来のContinuous Flow(下段)では、シグナル強度がポンプの脈流により凸凹のあるシグナルを示した。 On the other hand, in the conventional Continuous Flow (lower), signal intensities showed signals with uneven by pulsating flow of pump.
実施例4:流速の変動によるシグナル強度の変動 非酵素的シグナルとして、熱レンズ信号を得ることのできる熱レンズ標準色素溶液であるサンセットイエロー(Sunset Yellow、SY)を濃度1×10 −4 Mで流速1−3μ/minの間で変動させた。 Example 4: As a variation non-enzymatic signal of the signal intensity due to variations in flow rate, a thermal lens standard dye solution which can be obtained thermal lens signal sunset yellow (Sunset Yellow, SY) concentration 1 × 10 -4 M in it varied between a flow rate of 1-3μ / min. 図7上段に示したように、流速に依存せずにほぼ同じ程度の信号を確認することができた(左側)。 Figure 7 As shown in the upper part, it was possible to confirm almost the same degree of signal without depending on the flow rate (left).

これに対して、実施例3にて行った従来のContinuous Flowにおいては、流速に逆比例したシグナル強度が得られた(右側)。 In contrast, in the conventional Continuous Flow was performed in Example 3, signal intensity was inversely proportional to the flow velocity was obtained (right).

これをこの出願の発明のStop/Flowで検出するとき、流速を2μ/minと5μ/minとの間で変動させた場合では、図7下段に示したように、流速が2.5倍の差があるにも関わらず、流速の変動には影響されず、ピーク高さに大きな差は認められなかった。 When detecting this in Stop / Flow of the invention of this application, in the case of varying between a flow rate 2.mu. / min and 5 [mu] / min, as shown in FIG. 7 the lower part, the flow rate is 2.5 times the despite differences, without being affected by the fluctuation of the flow rate, a large difference in peak height was observed.
実施例5:停止時間の変動によるシグナル強度 実施例2において、Stop/Flowにおける停止時間(Stop)を30秒、20秒、10秒と変動させ、この停止時間に合わせて送液時間(Flow)を30秒、40秒、50秒と変動させた場合のシグナル強度を検討した。 Example 5: in signal strength Example 2 due to the variation of the stopping time, Stop / stop time in Flow to (Stop) 30 seconds, 20 seconds, 10 seconds and was varied, together liquid delivery time to the stop time (Flow) 30 seconds, 40 seconds, and examined the signal intensity when varying 50 seconds.

結果は、図8に示したとおり、停止時間に比例して、ピーク高さを得ることができた。 The results, as shown in FIG. 8, it was possible in proportion to the stop time, to obtain a peak height. このことから、停止時間を制御することで、シグナル強度を簡単に加減できることが確認された。 Therefore, by controlling the stop time, it was confirmed that the signal intensity can be easily acceleration.
実施例6:IgE濃度の変動におけるシグナル強度 実施例2において、分析対象物質であるIgEの濃度を250ng/mlと125ng/mlの2つの濃度条件で比較検討した。 Example 6: In signal intensities Example 2 in variation of IgE concentrations were compared to the concentration of IgE is analyte in two concentrations conditions 250 ng / ml and 125 ng / ml.

実施例3で示したように、本来、ベースラインのシグナル(信号)強度もIgE濃度に依存すると考えられるが、結果としては、図9に示したとおり、250ng/mlのベースライン(L1)よりも125ng/mlのベースライン(L2)の方が高くなっている。 As shown in Example 3, originally, the signal (signal) intensity of the baseline is also believed to be dependent on IgE levels but, as a result, as shown in FIG. 9, the baseline (L1) of 250 ng / ml It is higher towards even 125 ng / ml baseline (L2). このことは、基質溶液は、時間経過とともに一部分解(光分解)して着色される性質を有していることから、250ng/mlの測定後に125ng/mlの測定を行う場合には、その間に基質物質が上記のとおり一部分解したことに起因している。 This substrate solution, since it has a property to be colored with some degradation (photolysis) with time, when the measurement of 125 ng / ml after measurement of 250 ng / ml is in between substrate material is resulted from the decomposition part as described above. しかしながら、このような影響にも関わらず、Stop/Flowで得られるピーク高さは、IgE濃度に比例したピーク高さを示していることから、この出願の発明では、Stop/Flowにより明瞭で鋭いピークとしてシグナル(信号)を得ることができる特長を示している。 However, despite these effects, Stop / Flow peak heights obtained, since showing the peak height which is proportional to the IgE concentration, in the invention of this application, a sharp clear by Stop / Flow It shows the advantage that can be obtained a signal (signal) as a peak.

この出願の発明のためのシステム構成(装置)を例示した模式図である。 It is a schematic view system configuration (device) illustrated for the invention of this application. 図1の部分断面図である。 It is a partial cross-sectional view of FIG. この出願の発明の生化学分析をIgEの濃度変動におけるシグナル検出を比較した結果を示した図であり、IgEの濃度ごとにおけるシグナルのピーク高さを示している。 The biochemical analysis of the invention of this application is a graph showing the results of comparing the signal detected in the density variation of IgE, it shows the peak height of the signal at each concentration of IgE. 図3の結果を検量線として示している図である。 The results of FIG. 3 is a diagram that illustrates a calibration curve. この出願の発明の生化学分析をIgEの濃度変動におけるシグナル検出を比較した結果を示した図であり、TMBを基質溶液として用い、またシグナル検出には熱レンズ顕微鏡を用いた結果を検量線として示している。 The biochemical analysis of the invention of this application is a graph showing the results of comparing the signal detected in the density variation of IgE, using TMB as the substrate solution, also results in a signal detection using a thermal lens microscope as a calibration curve shows. IgE濃度の変動とともにStop/FlowとContinuous Flowとの比較検討した結果を示した図であり、上段がStop/Flowの結果を、下段がContinuous Flowの結果を示している。 Is a diagram showing the results of comparison between the Stop / Flow and Continuous Flow with variation of IgE concentrations, the results of the upper stage Stop / Flow, the lower part shows the results of Continuous Flow. 図6において、流速を変動させた場合の結果を示した図であり、上段はContinuous Flowの結果を、下段はStop/Flowの結果を示している。 6 is a diagram that shows the results of varying the flow rate, upper row the results of Continuous Flow, and the lower part shows the results of Stop / Flow. Stop/Flowにおいて、停止時間の変動によるシグナル(信号)強度の変動を検討した結果を示した図である。 In Stop / Flow, a diagram showing the results of examination of the variation of the signal (signal) intensity due to variations in the stopping time. Stop/Flowにおいて、低濃度IgEと高濃度IgE間におけるベースラインのシグナルが逆転している場合における、シグナル強度のIgEの濃度依存性を検討した結果を示した図である。 In Stop / Flow, a diagram in a case where the baseline between the low concentration IgE and the high-concentration IgE signal is reversed, showing the results of examination of the concentration dependence of IgE in signal intensity.

符号の説明 DESCRIPTION OF SYMBOLS

1 マイクロチップ 1A 微細流路 1B ビーズ担体 1C 堰き止め部 2 送液制御部 3 送液ポンプ 4、5 バルブ 6 チップジョイント 7 検出装置 8 試料液 9 排出部 91 廃液 L1、L2 ベースライン 1 microchip 1A micro channel 1B bead carrier 1C damming portion 2 feed control section 3 liquid feed pump 4, 5 a valve 6 chip joint 7 detecting apparatus 8 sample solution 9 discharge unit 91 waste L1, L2 baseline

Claims (16)

  1. ビーズ担体の流れ堰き止め部が設けられたマイクロチップ微細流路に充填されたビーズ担体上で、試料液中の分析対象物質が特異的に結合する反応物質Aと、前記分析対象物質並びにこの分析対象物質と特異的に結合する酵素が標識された反応物質Bとによる複合体が、前記酵素の基質が反応するときに生じる酵素量に依存したシグナルから分析対象物質の濃度を測定する生化学分析方法において、微細流路中への基質溶液の送液を一定時間停止し、引き続き一定速度で基質溶液を送液することにより、流れ堰き止め部の下流で、酵素反応生成物の検出シグナルを半値幅数秒のピークとして捉えることを特徴とする生化学分析方法。 On bead carrier flow damming portion of bead carrier was filled in a microchip fine flow path provided a reaction substance A analyte in the sample liquid to specifically bind the analyte as well as the analysis biochemical analysis target substance specifically complex by the reactant B which enzyme labeled binding is a substrate of the enzyme to measure the concentration of the analyte from the signal dependent on the amount of enzyme which occurs when reacting in the method, feed solution was stopped for a certain time of the substrate solution into the fine flow path and subsequently by feeding a substrate solution at a constant rate, downstream of the flow blocking unit, half the detection signal of the enzymatic reaction product biochemical analysis wherein the considered as the peak of the width of seconds.
  2. 分析対象物質含有の試料液を、反応物質Aを支持させたビーズ担体充填の微細流路内に送液し、これと同時に、もしくは次いで反応物質Bを送液し、その後、前記反応物質Bの酵素と反応する基質溶液を一定時間の送液停止と引き続いての一定速度での送液により微細流路内に供給することを特徴とする請求項1の生化学分析方法。 The analyte sample solution containing the reactants A was fed to the fine flow path of the bead carrier filling was supported, and at the same time, or subsequently feeding a reactant B, then the reactant B biochemical analysis method according to claim 1, characterized in that the supply to the liquid feed by the micro-channel at a constant speed of the substrate solution that reacts with the enzyme and subsequently the liquid delivery stops for a predetermined time.
  3. 送液の停止と送液とをバルブ制御手段によるバルブの切り換えにより行うことを特徴とする請求項1または2の生化学分析方法。 Biochemical analysis method according to claim 1 or 2, characterized in that the feeding of the stop and feeding by switching the valve according to the valve control means.
  4. 送液の停止と送液とをポンプ制御手段によるポンプの停止と運動の切り換えにより行うことを特徴とする請求項1または2の生化学分析方法。 Biochemical analysis method according to claim 1 or 2, characterized in that the feeding of the stop and feeding by switching the movement and stopping of the pump by the pump control means.
  5. 分析対象物質は抗原であり、反応物質Aは抗体であり、また反応物質Bは抗体であることを特徴とする請求項1ないし4のいずれかの生化学分析方法。 Analyte is an antigen, the reactant A is an antibody, and the reaction material B is one of biochemical analysis method of claims 1 to 4, characterized in that an antibody.
  6. 分析対象物質は抗体であり、反応物質Aは抗抗体であり、また反応物質Bは抗原、抗抗体または抗原と抗体との結合物であることを特徴とする請求項1ないし4のいずれかの生化学分析方法。 Analyte is an antibody, the reactant A is an anti-antibody, and the reaction material B antigens, according to claim 1 to 4, characterized in that the binding of the anti-antibody or an antigen and an antibody either biochemical analysis methods.
  7. 分析対象物質は抗体であり、反応物質Aは抗原であり、また反応物質Bは抗抗体であることを特徴とする請求項1ないし4のいずれかの生化学分析方法。 Analyte is an antibody, the reactant A is an antigen and Reactant B is one of biochemical analysis method of claims 1 to 4, characterized in that an anti-antibody.
  8. 酵素との反応によるシグナルを、吸光度、蛍光および熱レンズ信号の少なくとも1つをもって検出することを特徴とする請求項1ないし7いずれかの生化学分析方法。 Signal by reaction with an enzyme, absorbance claims 1 to 7 or biochemical analysis methods and detecting with a least one fluorescence and thermal lens signal.
  9. ビーズ担体の流れ堰き止め部が設けられたマイクロチップ微細流路に充填されたビーズ担体上で、試料液中の分析対象物質が特異的に結合する反応物質Aと、前記分析対象物質並びにこの分析対象物質と特異的に結合する酵素が標識された反応物質Bとによる複合体が、前記酵素の基質が反応するときに生じる酵素量に依存したシグナルから分析対象物質の濃度を測定する生化学分析装置において、微細流路中への基質溶液の送液を一定時間停止し、引き続き一定速度で基質液を送液する送液手段および検出シグナルを半値幅数秒のピークとして捉える検出手段とを備えていることを特徴とする生化学分析装置。 On bead carrier flow damming portion of bead carrier was filled in a microchip fine flow path provided a reaction substance A analyte in the sample liquid to specifically bind the analyte as well as the analysis biochemical analysis target substance specifically complex by the reactant B which enzyme labeled binding is a substrate of the enzyme to measure the concentration of the analyte from the signal dependent on the amount of enzyme which occurs when reacting in the apparatus, and a detection means for capturing liquid delivery was stopped for a certain time of the substrate solution into the fine flow path, the liquid supply means and the detection signal feeding a substrate solution subsequently at a constant rate as the peak half width seconds biochemical analysis apparatus characterized by there.
  10. 反応物質Aを支持させたビーズ担体が微細流路内に充填されていることを特徴とする請求項9の生化学分析装置。 Biochemical analysis apparatus according to claim 9, bead carrier to the reactant A was supported is characterized in that it is filled in the micro flow channel.
  11. 送液手段は、バルブ切り換え制御装置を備えていることを特徴とする請求項9または10の生化学分析装置。 Feeding means, the biochemical analysis apparatus according to claim 9 or 10, characterized in that it comprises a valve switching control device.
  12. 送液手段は、ポンプ切り換え制御装置を備えていることを特徴とする請求項9または10の生化学分析装置。 Feeding means, the biochemical analysis apparatus according to claim 9 or 10, characterized in that it comprises a pump switching control device.
  13. 分析対象物質が抗原であり、反応物質Aが抗体であり、また反応物質Bが抗体であることを特徴とする請求項9ないし12のいずれかの生化学分析装置。 Analyte is an antigen, the reactant A is an antibody, and the reaction substance B or biochemical analyzer to 9 claims, characterized in that an antibody 12.
  14. 分析対象物質が抗体であり、反応物質Aが抗抗体であり、また反応物質Bが抗原、抗抗体または抗原と抗体との結合物であることを特徴とする請求項9ないし12のいずれかの生化学分析装置。 Analyte is an antibody, the reactant A is an anti-antibody, and the reaction substance B antigen to 9 claims, characterized in that the binding of the anti-antibody or an antigen and an antibody 12 of any biochemical analysis apparatus.
  15. 分析対象物質が抗体であり、反応物質Aが抗原であり、また反応物質Bが抗抗体であることを特徴とする請求項9ないし12のいずれかの生化学分析装置。 Analyte is an antibody, the reactant A is an antigen and Reactant B is one of the biochemical analysis apparatus according to claim 9 to 12, characterized in that an anti-antibody.
  16. 検出手段として、吸光光度計、蛍光測定装置および熱レンズ顕微鏡の少なくとも1つを備えていることを特徴とする請求項9ないし15のいずれかの生化学分析装置。 As detection means, absorption photometer, or biochemical analyzer according to claim 9 to 15, characterized in that it comprises at least one fluorescent measuring device and a thermal lens microscope.
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