JP4463877B2 - Synthetic peptides and vaccines containing them - Google Patents

Abstract

The present invention relates generally to chimeric peptides comprising one or more protective epitopes in a conformation enabling inmunological interactivity and to vaccine compositions comprising same. The present invention is particularly directed to a chimeric peptide capable of inducing protecting antibodies against Group A streptococci.

Description

もしくは、これらのアミノ酸残基の一つ以上の機能的および／または化学的等価物の内部のＢ細胞配座エピトープを含む第一のアミノ酸配列を用いて、以下に例示する。
従って、本願発明の特に好ましい実施態様は、以下の配列

の内部から選択された少なくとも３つのアミノ酸を備えた第一のアミノ酸配列を含むキメラペプチドに向けられ、前記少なくとも３つのアミノ酸は、連鎖球菌属のＭタンパク質の配座Ｂ細胞エピトープを構成し、前記第一のアミノ酸配列は、α-ヘリックスコイルドコイルコンホメーションに保持することができる第二のアミノ酸配列の内部に挿入されている。好ましくは、第一のアミノ酸配列は、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、そしてさらに好ましくは少なくとも１５の連続するアミノ酸残基を含む。
あるいは、ヘリックスの外表面上等であって、活性に必要もしくは十分である様な、不連続のアミノ酸を選択してもよい。
フレームワークペプチドの構成は、七つのアミノ酸残基の繰り返し
（a-b-c-d-e-f-g）_n
に基づくものであって、
ａとｄの位置は好ましくは大きな無極性残基を備え、ｂ、ｃおよびｆの位置は一般的に極性かつ帯電しており、ｅおよびｇの位置は一般的に鎖間のイオン相互作用に寄与する。特に好ましいフレームワークペプチドは、ＧＣＮ４ロイシンジッパー（O′Sheaら，1989;1991）もしくはそのトリマー（Harburyら，1994）またはテトラマー（Harburyら，1993）およびα-スペクトリンの繰り返しモチーフ（Yan,1993）に対応するペプチドの構造に基づく。ＧＣＮ４ロイシンジッパーは特に好ましく、ＧＣＮ４ロイシンジッパーペプチドに共通の特徴から誘導された模範的な７つの繰り返し（a model heptad repeat）は、以下の配列：

を含み、これは、ここで（ＧＣＮ４）₄と称される４つの７つの繰り返しのフレームワークペプチドを与える。要求されるものは、フレームワークペプチドが、もはや４つの繰り返しより長くすることができること、もしくはそうする必要があるかもしれないことである。
最初のアミノ酸配列は、キメラペプチドを与えるフレームワークコイルドコイルペプチドの内部に埋め込まれる。
本願発明のキメラペプチドは、組換え手段で産生することができ、また、例えば、固相ペプチド合成技術を用いて、決められた順番で一つ以上のアミノ酸残基を段階的に付加して化学的に合成しても良い。ペプチドを他のタンパク質と組み合わせて合成し、次いで化学的切断によって単離してもよく、また、ペプチドもしくは多価ペプチドを多重繰り返しユニットで合成してもよい。ペプチドは、未変性に生じるアミノ酸残基を含んでもよく、また、Ｄ型異性体もしくは化学的に修飾された未変性残基のように未変性には産生されないアミノ酸残基を含んでも良い。未変性には生じないアミノ酸残基は、例えば、ペプチドに配座の束縛および／または限定を促進または提供する必要があるかもしれない。主題のペプチドを産生する方法の選択は、ペプチドの所望のタイプ、量および純度等のファクター、並びに産生の簡便さおよび便利さによる。
ペプチドそのものが十分に長い血清および／または組織半減期を備えていないために、本願発明のキメラペプチドは、in vivoで用いるための化学的な修飾を最初に必要とするかもしれない。主題のペプチドの化学的修飾は、ペプチドのある領域が、Ｂおよび／またはＴ細胞エピトープとして作用する能力を含めた抗原性を改良するためにも重要である。このように化学的に修飾されたキメラペプチドは、ここでは“類似体(analogues)”と称する。用語“類似体”は、本願発明のキメラペプチドのあらゆる機能的な化学的もしくは組換え等価物にまで拡張され、最も好ましい実施態様では、ＧＡＳのＭタンパク質の少なくとも一つのＢ細胞エピトープを備え、かつ、Ｂ細胞エピトープに反応する抗体がヒトの心臓の組織と最小限に反応することを特徴とする。用語“類似体”は、上記ペプチドのあらゆるアミノ酸誘導体にまで拡張して用いられる。
ここで考慮されるキメラペプチドの類似体は、側鎖の修飾、ペプチド合成中における未変性に生じないアミノ酸および／またはその誘導体の取り込み、並びにペプチドもしくはその類似体における配座を束縛する架橋剤および他の方法の使用を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明で考慮される側鎖修飾の例は、アルデヒドとの反応の後にＮａＢＨ₄を用いて還元する還元的アルキル化；メチルアセチミダート(methylacetimidate)を用いたアミジネーション(amidination)；無水酢酸を用いたアシル化；シアナートを用いたアミノ基のカルバモイル化；２，４，６-トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いたアミノ基のトリニトロベンジル化；無水スクシン酸および無水テトラヒドロフタル酸を用いたアミノ基のアシル化；およびピリドキサル-５’-ホスファートでリシンをピリドキシル化した後にＮａＢＨ₄を用いて還元する等のアミノ基の修飾を含む。
アルギニン残基のグアニジン基を、２，３-ブタンジオン、フェニルグリオキサルおよびグリオキサル等の試薬を用いて複素環縮合生成物を形成することによって修飾しても良い。
カルボキシル基を、Ｏ-アシリソウレア(O-acylisourea)形成を介したカルボジイミド活性化の後に、例えば対応するアミドをデリビチゼーション(derivitisation)することによって修飾しても良い。
スルフヒドリル基を、ヨード酢酸もしくはヨードアセトアミドを用いたカルボキシメチル化；システイン酸の過ギ酸酸化；他のチオール化合物を用いた混合ジスルヒドの形成；マレイミド、無水マレイン酸もしくは他の置換されたマレイミドとの反応；４-クロロメルクリベンゾアート、４-クロロメルクリフェニルスルホン酸、フェニルメルクリクロリド、２-クロロメルクリ-４-ニトロフェノールおよび他のメルクリアルを用いたメルクリアル誘導体の形成；アルカリ性ｐＨにおけるシアナートを用いたカルバモイル化等の方法で修飾してもよい。
トリプトファン残基を、例えば、Ｎ-ブロモスクシンイミドを用いた酸化、あるいは、２-ヒドロキシ-５-ニトロベンジルブロミドまたはハロゲン化スルフェニルを用いたインドール環のアルキル化で修飾してもよい。一方、チロシン残基を、テトラニトロメタンでニトロ化して３-ニトロチロシン誘導体を形成してもよい。
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾を、ヨード酢酸誘導体を用いたアルキル化もしくはジエチルピロカルボナートを用いたＮ-カルボエトキシル化(N-carbethoxylation)によって行っても良い。
ペプチド合成中における未変性にないアミノ酸および誘導体の取り込みの例は、ノルロイシン、４-アミノ酪酸、４-アミノ-３-ヒドロキシ-５-フェニルペンタン酸、６-アミノヘキサン酸、ｔ-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４-アミノ-３-ヒドロキシ-６-メチルヘプタン酸、２-チエニルアラニン(thienyl alanine)および／またはアミノ酸のＤ型異性体を含むが、これらに限定されるものではない。
架橋結合材を、例えば、３次元コンホメーションを安定化させるために用いることができ、ｎ＝１からｎ＝６の（ＣＨ₂）_nスペーサー基を備えた二価性のイミドエステル等のホモ二価性架橋結合材、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、およびＮ-ヒドロキシスクシンイミド等のアミノ反応部と、マレイミドもしくはジチオ部（ＳＨ）またはカルボジイミド（ＣＯＯＨ）等の他の基に特異的な反応部を含むヘテロ二価性試薬が用いられる。さらに、ペプチドを配座的に強制させることもできる。例えば、Ｃ_αおよびＮ_α-メチルアミノ酸の取り込み、アミノ酸のＣ_αとＣ_β原子間の二重結合の導入、ＮおよびＣ末端の間、二つの側鎖の間、もしくは側鎖とＮまたはＣ末端との間にアミド結合を形成するなどして、共有結合を導入することによって環状ペプチドまたは類似体を形成することもできる。
しかして本願発明は、エピトープが免疫学的に相互作用し得る機能的配座状態で提供されるようなハイブリッド分子における連鎖球菌属のＭタンパク質等の配座エピトープを提供する。
しかして本願発明は、抗原ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の最小エピトープを決定する方法に係り、この方法は、前記ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、もしくはエピトープを保有すると推定されるこれらの一部の未変性のコンホメーションを決定すること；前記ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質のペプチドフラグメントを調製すること；前記ペプチドフラグメントを、最初に言及されたペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質と似た未変性のコンホメーションを備えた別のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質から誘導もしくは基づいて得られた第二ペプチド中に挿入もしくは提示して、ペプチドフラグメントの推定上のエピトープを、免疫学的相互作用が可能なコンホメーションで提示されるようにすること；および免疫学的相互作用について前記ペプチドフラグメントを調べることを含む。
本願発明に関連する態様としては、抗体に認識されるペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質における両親媒性ヘリックスの領域をマッピングする方法を提供することであり、この方法は、前記ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、もしくはエピトープを保有すると推定されるこれらの一部の未変性のコンホメーションを決定すること；前記ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質のペプチドフラグメントを調製すること；前記ペプチドフラグメントを、最初に言及されたペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質と似た未変性のコンホメーションを備えた別のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質から誘導もしくは基づいて得られた第二ペプチド中に挿入もしくは提示して、ペプチドフラグメントの推定上のエピトープを、免疫学的相互作用が可能なコンホメーションで提示されるようにすること；および免疫学的相互作用について前記ペプチドフラグメントを調べることを含む。
抗体に認識される両親媒性ヘリックスは、価値あるワクチン候補となり得る。両親媒性ヘリックスは、タンパク質における一般的な構造部であり、表面に曝されるか（抗原性）もしくは他のタンパク質と相互作用しうる。螺旋のコイルドコイルは、ホモダイマー、トリマーおよびテトラマーに相互作用するヘリックスのより複雑な形態である。
“免疫学的相互作用”は、免疫細胞または免疫エフェクター細胞との相互作用のあらゆる形態、および／またはあらゆる形態の免疫応答を意味する。一般的に、免疫学的相互作用は、抗体結合もしくはペプチドフラグメントとの相互作用によって測定される。しかしながら、免疫学的相互作用は、細胞性免疫応答を測定することにも拡張される。
治療および診断の開発においては、免疫学的相互作用を提供することができ、かつ、治療において保護免疫反応を誘導し得る最小エピトープを決定することが重要である。従って、本願発明のキメラペプチドは、その製造方法も含めて、特にワクチンの開発に使用することができる。その例示的かつ好ましい形態では、本願発明は、ＧＡＳに対するワクチンに使用するためのキメラペプチドを提供する。しかしながら、これは、本願発明が、バクテリア、寄生虫、酵母、真菌および原生動物を含む病原性微生物、もしくはレトロウイルス、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルスおよびＨＩＶ等の免疫不全ウイルス等のウイルスに対する保護免疫応答を誘導するのに使用できるキメラペプチドにも拡張することができるという理解のもとに行われる。
従って、本願発明の好ましい態様は、グループＡ連鎖球菌属に対して使用できるワクチンを提供するものであり、このワクチンは、以下の配列；

の内部から選択された少なくとも３つのアミノ酸を備えた第一のアミノ酸配列を含むキメラペプチドを含み、前記の少なくとも３つのアミノ酸は、連鎖球菌属のＭタンパク質の配座Ｂ細胞エピトープを構成し、前記第一のアミノ酸配列はα-ヘリックスコイルドコイルコンホメーションをとり得る第二のアミノ酸配列の内部に挿入され、前記ワクチンは、一つ以上の薬学的に使用可能なキャリアおよび／または希釈剤をさらに含む。このワクチンは、アジュバントおよび／または他の免疫刺激分子をさらに含んでも良い。好ましくは、第二のアミノ酸配列が、ＧＣＮ４から誘導されたフレームワークペプチドを形成する。上述したように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の連続もしくは非連続なアミノ酸を選択することもできる。
本願発明の別の態様は、Ｍタンパク質に対する体液性免疫の開発に使用できるが、心臓の組織と最小限に交差反応するワクチンであって、このワクチンは、Ｍタンパク質の少なくとも一つのＢ細胞エピトープを有する第一のアミノ酸配列を含むキメラペプチドを含み、前記Ｂ細胞エピトープと反応する抗体は心臓の組織と最小限に反応する。前記第一のアミノ酸配列は、α-ヘリックスコイルドコイル形態をとり得る第二のアミノ酸配列の内部に挿入され、前記ワクチンは、一つ以上の薬学的に使用可能なキャリアおよび／または希釈剤をさらに含む。
ワクチンは、一種類のペプチドもしくは別異もしくは類似のエピトープをカバーするある範囲のペプチドを含んでもよい。さらに、もしくは、単一のポリペプチドに多重のエピトープが設けられてもよい。この場合のワクチンは、多価ワクチンと称される。多重エピトープは、二つ以上の繰り返しエピトープを含む。
ワクチンの作製は、当該技術分野で一般に既知であり、Remington′s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania,USAを参照することができる。
本願発明は、薬学的組成物もしくはワクチン組成物であり、体液性免疫の発達に有効量のキメラペプチド（上記の通り）またはその誘導体、類似体もしくは相同体および／またはこれらの組み合わせを含み、他の活性分子および一つ以上の薬学的に使用できるキャリアおよび／または希釈剤を含む。キメラペプチドを含む薬学的組成物の活性成分は、例えば、特定のケースに依存した量で投与された場合に、連鎖球菌属のＭタンパク質に対する抗体の発達において優れた治療活性を示すが、これらの抗体が心臓組織とは最小限の反応性を示すと考えられる。例えば、一日に体重一キログラム当たり約０．５μｇ〜２０ｍｇを投与してもよい。
投与方法は、最適な治療反応を提供できるように調製しても良い。例えば、投与量をいくつかに分けて毎日投与してもよく、治療状況に示されるように比例的に減少させることもできる。活性化合物は、経口、静脈内（水溶性）、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮膚内もしくは座薬経路あるいは移植（例えば、核酸遅延分子を用いる）等の慣例的な方法で投与することができる。投与経路によっては、キメラペプチドを含む活性成分を、酵素、酸、並びに成分を不活性化する別の自然の条件の作用から前記成分を保護する材料で被覆する必要があるかもしれない。例えば、キメラペプチドの親油性が低いと、ペプチド結合を切断することのできる酵素によって胃腸で破壊され、または胃で酸加水分解される。非経口投与以外でキメラペプチドを投与するために、その不活性化を妨げるための材料で被覆するか、もしくは共に投与される。例えば、キメラペプチドを、アジュバントで投与しても、酵素阻害剤と共に投与しても、リポソームで投与してもよい。アジュバントはその最も広い意味で用いられ、インターフェロン等のあらゆる免疫刺激化合物を含む。ここで言及されるアジュバントは、レゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ-ヘキサデシルポリエチレンエーテル等の非イオン界面活性剤を含む。酵素阻害剤は、膵臓のトリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスファート（ＤＦＰ）およびトラシロールを含む。リポソームは、ウォーター・イン・オイル・イン・ウォーター型エマルションおよび従来のリポソームを含む。
活性化合物は、非経口的もしくは腹膜内に投与することもできる。分散物を、グリセロール、液状ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物中に、かつ油中に調製することもできる。貯蔵および使用の通常の条件下では、微生物の成長を妨げるために、これらの調製物は防腐剤を含む。
注入に適した薬学的形態は、無菌の注入可能な溶液または分散物の即席の調製のための、無菌の水溶液（水溶性）もしくは分散物および無菌のパウダーを含む。どの場合でも、その形態は無菌でなければならず、容易に注入できるように液体でなくてはならない。製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、バクテリアや真菌等の微生物の混入作用に対して保護されていなければならない。キャリアは、溶剤もしくは分散物媒体とすることができ、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコール等）、これらの適切な混合物および植物油である。例えば、リシチン(licithin)等の被覆を使用することにより、分散物の場合には必要な粒子サイズを維持することにより、また、界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用を妨げることは、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チルメロサル(thirmerosal)等の種々の抗菌および抗カビ試薬によってもたらすことができる。多くの場合に、糖もしくは塩化ナトリウム等の等張試薬を含むことが好ましい。注入可能な組成物の長い吸収は、例えばアルミニウムモノステアラートおよびゼラチン等の吸収遅延試薬を組成物中に用いることによってもたらされる。
無菌の注入可能な溶液は、上記とは別の種々の成分を含んだ適切な溶剤に必要量の活性化合物を取り込み、必要であれば、濾過された滅菌を行うことによって調製される。一般的に、分散物は、種々の無菌活性成分を無菌ビヒクルに導入することによって調製され、基礎的な分散媒体と上記とは別の必要な成分を含む。無菌の注入可能な溶液の調製のための無菌パウダーの場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、活性成分のパウダーと前記無菌濾過溶液のさらなる所望の成分が得られる。
キメラペプチドを上記のように適切に保護した場合には、例えば、不活性な希釈剤もしくは吸収できる食用キャリアと共に活性化合物を経口投与することができ、硬いもしくは柔軟な殻のゼラチンカプセルに内包することもでき、タブレットに圧縮してもよく、食事の食品に直接取り込まれても良い。経口治療投与では、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれてもよく、摂取できるタブレット、頬のタブレット(buccal tablets)、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハース等の形態で用いられても良い。このような組成物および調製物は、少なくとも１重量％の活性化合物を含むべきである。組成物及び調製物のパーセントは、もちろん、変えることができ、ユニットの約５〜８０重量％の間とすることができる。このような治療に用いられる組成物の活性化合物の量は、適切な投与量が得られるものである。本願発明に係る好ましい組成物もしくは調製物は、経口投与ユニット形態が０．１μｇ〜２０００ｍｇの間の活性化合物を含むように調製される。
タブレット、トローチ、丸薬、カプセル等は以下を含んでも良い。トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチもしくはゼラチン等の結合材；リン酸ジカルシウム等の賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸等の分解試薬；ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；およびスクロース、ラクトースもしくはサッカリン等の甘味料を添加しても良く、ペパーミント、ウィンターグリーン油、もしくはチェリー香料等の香料を添加しても良い。投与ユニット形態がカプセルである場合には、上記のタイプの材料に液状キャリアを含んでも良い。種々の他の材料が、コーティングとして、あるいは投与ユニットの物理的形態を修飾するために含有されてもよい。例えば、タブレット、丸薬もしくはカプセルを、セラック、糖、またはその両方で被覆しても良い。シロップまたはエリクサが、活性化合物、甘味料としてスクロース、防腐剤としてメチルおよびプロピルパラベン、チェリーまたはオレンジの香料等の着色料および香料を含んでも良い。もちろん、あらゆる投与ユニット形態の調製に用いられる全ての材料は、薬学的に純粋で、用いられる分量で実質的に無毒であるべきである。さらに、活性化合物を、放出持続調製物および薬剤に取り込まれてもよい。
ここで用いられる“薬学的に使用できるキャリアおよび／または希釈剤”とは、あらゆる、そして全ての溶剤、分散媒体、コーティング、抗菌および抗カビ剤、等張および吸収遅延剤等を含む。このような媒体および試薬の薬学的活性物質における使用は当該技術分野において周知である。活性成分に適さない従来の媒体以外は、治療組成物においてそれらを使用することが考えられる。補足的活性成分も組成物中に取り込むことができる。
投与しやすく、かつ、一定量で投与できる投与ユニット形態をとる非経口組成物を調剤することが特に有利である。ここで用いられる投与ユニット形態とは、処置される哺乳動物への一回の投与に適した物理的に独立したユニットを指す。各ユニットは、必要とされる薬学的キャリアとともに、所望の薬学的効果を生じるように計算された所定量の活性剤を含む。本発明の新規の投与ユニット形態についての明細は、（ａ）活性剤の独特の特徴および達成される特定の治療効果と、（ｂ）ここで詳細に記載したように、健康が害される疾患状態にある患者における疾患を治療するための活性物質等を含む当該技術分野における固有の限定によって決められ、これらに直接的に依存する。
主な活性成分は、都合よくかつ効果的な投与のために、上記のような投与ユニット形態で適切な薬学的に利用できるキャリアと共に有効量で調合される。ユニット投与形態は、たとえば、０．５μｇ〜約２０００ｍｇの範囲の量で主な活性化合物を含むことができる。比率で表すと、活性化合物は一般的に約０．５μｇ〜約２０００ｍｇ／ｍｌキャリアで存在する。補足的活性成分を含む組成物の場合には、投与量は、通常の投与量および前記成分の投与方法を参照して決定される。
本願発明の別の態様は、キメラペプチドに対する抗体に向けられている。このような抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、Ｍタンパク質に対して自然に生じた抗体から選択されても、また、キメラペプチドに対して特異的に生じたものであってもよい。後者の場合には、最初に、ペプチドをキャリア分子と結合する必要があるかもしれない。本願発明の抗体および／またはキメラペプチドは、特に免疫治療および予防接種に使用することができ、感染の診断、または予防接種もしくは治療体制の進行を観察するための道具として用いることもできる。
例えば、キメラペプチドは、Ｍタンパク質に対して自然に生じた抗体を調べるために用いることができる。あるいは、特異的抗体はＭタンパク質を調べるために用いることができる。このようなアッセイ技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、サンドウィッチアッセイやＥＬＩＳＡを含む。
本願発明のこの態様に基づいて、キメラペプチドはＭタンパク質に対する抗体を調べるのに特に使用可能であり、連鎖球菌属の感染を検出する診断プロトコルを提供する。また、血清、唾液、組織および組織抽出物等の生物学的サンプルを、Ｍタンパク質について、キメラペプチドに対して生じた抗体を用いて直接的に調べることができる。
従って、抗体−キメラペプチド複合体を形成するのに十分な時間および条件下で有効量のキメラペプチドを結合する抗体と、患者の生物学的サンプルとを接触させ、次いで前記複合体を検出することを含む、患者の連鎖球菌属の感染の診断方法を提供する。
患者の血清、組織、組織抽出物もしくは他の体液中のＭタンパク質抗体の存在を、米国特許第４０１６０４３、４４２４２７９および４０１８６５３に記載されているような広範囲の免疫アッセイ技術を用いて検出することができる。これは、非競合型の、一および二つの両方の部位の、すなわち“サンドウィッチ”アッセイと、慣例の競合結合アッセイを含む。サンドウィッチアッセイは、最も使用でき、かつ一般に用いられるアッセイであり、本願発明においても使用することが望ましい。多数の種類のサンドウィッチアッセイ技術が存在し、その全てを本願発明に取り込む。簡単に、典型的な先のアッセイでは、キメラペプチドを固相に固定して最初の複合体を形成し、Ｍタンパク質抗体について調べるサンプルをその結合分子と接触させる。インキュベーションに適した時間、すなわち、キメラペプチド−抗体の第二の複合体を形成するのに十分な時間でインキュベーションする。検出可能なシグナルを生じうるレポーター分子でラベルされた抗イムノグロブリン抗体を添加して十分にインキュベートして、キメラペプチド−抗体−ラベルされた抗体の第三の複合体を形成させる。全ての未反応の物質を洗浄し、レポーター分子によって生じるシグナルを観察することによって、第一抗体の存在を調べる。その結果は、視認できるシグナルを単に観察することによっても、あるいは、既知の量のハプテンを含む対照サンプルと比較することによっても定量することができる。先のアッセイの変化は、サンプルとラベルされた抗体の両方を結合抗体に同時に添加する同時アッセイ、もしくは、ラベルされた抗体と調べるサンプルを最初に結合させ、インキュベートして、結合抗体に同時に添加するリバースアッセイを含む。これらの技術は当業者に周知であり、小さい変更の可能性は容易に明らかである。類似したアプローチをＭタンパク質の検出に適用してもよい。用いられる抗体は、モノクローナルであっても、ポリクローナルであってもよい。
固相基質は、典型的にガラスまたはポリマーであり、最も一般に用いられるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルもしくはポリプロピレンである。固相支持体は、チューブ、ビーズ、円盤もしくはミクロプレート、あるいはイムノアッセイを行うのに適したあらゆる他の表面の形態をとることができる。結合方法は当該技術分野で周知であり、一般的に架橋結合、共有結合、もしくは不溶性キャリアに分子を物理的に吸着することからなる。
本願明細書で用いられる“レポーター分子”とは、その化学的性質により、抗原−結合抗体を検出する分析的に同定可能なシグナルを生じる分子を意味する。検出は定量的であっても定性的であってもよい。この種のアッセイで最も一般的に用いられるレポーター分子は、酵素、フルオロフォア（fluorophores）、もしくは放射性核種含有分子（すなわち、放射性同位元素）である。酵素イムノアッセイの場合には、グルタルアルデヒドもしくは過ヨウ素酸塩によって、酵素を第二抗体に接合する。しかしながら、容易に認識されるように、当業者に容易に利用できる広範囲の種々の接合技術が存在する。一般的に用いられる酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼ等を含む。特異的な酵素と共に用いられる基質は、一般的に、対応する酵素による加水分解により、検出可能な色の変化を生じるように選択される。また、蛍光生成物を生じる蛍光基質を用いることもできる。
また、フルオレセインやローダミン等の蛍光化合物を、抗体の結合力を変えずに抗体に化学的に結合させてもよい。特定の波長の光を照射して活性化した際に、蛍光色素ラベルされた抗体が光エネルギーを吸収し、分子の励起状態を誘導し、光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色の光を発する。ＥＩＡでは、蛍光ラベルされた抗体は第一抗体−ハプテン複合体に結合する。未結合試薬を洗浄した後に、残存した３つの複合体を適切な波長の光に曝し、観察された蛍光が関心のハプテンの存在を示す。免疫蛍光法およびＥＩＡ技術は共に当該技術分野でよく確立されており、現行の方法では特に好ましい。しかしながら、放射性同位元素、化学発光分子もしくは生物学的発光分子等の他のレポーター分子も用いることができる。必要な目的に合うように方法をどのように変えるかは、当業者には容易に明らかであろう。キメラペプチドをラベルするため、並びにＭタンパク質抗体の検出に直接的に同じものを使用するために、前述のことが用いられることも明らかであろう。
本願発明のさらなる態様は、ＧＡＳに対するワクチンとして使用される医薬の製造において記載されるキメラペプチドの使用である。
関連する実施態様では、本願発明は、ＧＡＳに対するワクチンとして使用できることが記載されたキメラペプチドを含む試薬を提供する。
本願発明を、以下の非限定的な図面および実施例によってさらに記載する。
図面において：
図１ キメラペプチドのアミノ酸配列。示された全ての配列は、以下に示された、α-ヘリックスコイルドコイルの７つの繰り返し（a-b-c-d-e-f-g）に関係する。Ａ．α-ヘリックスコイルドコイルＧＣＮ４ロイシンジッパーペプチド（O′Sheaら．1991）から得られたモデルＧＣＮ４ペプチドの配列。Ｂ．推定上のコイルドコイル７つの繰り返しをそろえた連鎖球菌属のＭタンパク質ペプチドｐ１４５（Pruksakornら．1992）の配列。Ｃ．キメラＪペプチド（Ｊ１−９）の配列。ｐ１４５ペプチドの重複する１２マーフラグメントが太字で示されている。保存されたアミノ酸残基に下線が付されている。Ｄ．対照ＧＣＮ４モデルペプチドＪｃｏｎ（Ｇ）の配列。
図２ Ｊペプチドに対する抗ｐ１４５マウス血清の反応性、反応性は４０５ｎｍの波長における平均吸収値としてプロットされている。血清は１：１００に希釈され、代表値が示されている。ジフテリアトキソイド（ＤＴ）に接合した血清を示した。ＮＭＳ、正常なマウス血清。
図３ Ｊペプチドに対する高力価抗ｐ１４５ヒト血清の反応性。平均吸収値（４５０ｎｍ）は１：１００に希釈された血清についてプロットされている。代表的なサンプルが示されている（ＧＢＤ、ＭＴ、ＭＹ、ＦＬ、ＴＢ、ＭＧ）。ＮＨＳ、正常なヒト血清。
図４は、αヘリックス誘導溶剤、５０％のトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）の存在下におけるペプチドの円偏光二色性スペクトル(circular dichroisum spectra)を図示したものである。Ａ，Ｊ_I１；Ｂ，Ｊ２；Ｃ，Ｊｃｏｎ；Ｄ，ｐ１４５。Θ，モル楕円率。ペプチドは、水溶液中ではαヘリックス形態を示さなかった。ペプチドＪ１，Ｊ３およびＪ４も試験され、これらはＪ２に似たプロフィールを示した。
図５は、未変性エピトープマッピングＥＬＩＳＡを示す図である。C.elegans unc-15の合成ペプチドフラグメント（表７Ｂ）をミクロタイタープレート上に被覆し（ウェル当たり２μｇ）、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＮＥ１−６Ｂ２と共にインキュベートし、結合抗体を抗マウス抗体と４５０ｎｍにおけるＯＰＤ比色アッセイで検出した。
図６は、キメラエピトープマッピングＥＬＩＳＡを示す図である。モデルヘリックスペプチドに埋め込まれたC.elegans unc-15の重複フラグメント（表８）をミクロタイタープレート上に被覆し（ウェル当たり２μｇ）、ｍＡｂ ＮＥ１−６Ｂ２と共にインキュベートし、結合抗体を抗マウス抗体と４５０ｎｍにおけるＯＰＤ比色アッセイで検出した。ペプチドｂｄ１０、ｂｄ１１、ｂｃ１８、ｂｃ２３、ｂｄ１４、ｂｄ１５は５残基ずつずれている。ペプチドｂｃ１７からｂｃ２５は１残基ずつずれている。対照ペプチドａｖ８５、ａｖ８６およびｂａ４８は、モデルヘリックスペプチド残基のみを含む。
図７Ａは、キメラ最小エピトープマッピングＥＬＩＳＡを示す図である。モデルヘリックスペプチドに埋め込まれたC.elegans unc-15の切断フラグメント（表９Ａ）をミクロタイタープレート上に被覆し（ウェル当たり２μｇ）、ｍＡｂ ＮＥ１−６Ｂ２と共にインキュベートし、結合抗体を抗マウス抗体と４５０ｎｍにおけるＯＰＤ比色アッセイで検出した。ペプチドｃ１は、１５マーのエピトープのみからなる。対照ペプチドａｖ８５、ａｖ８６およびｂａ４８は、モデルヘリックスペプチド残基のみを含む。
図７Ｂは、キメラエピトープ置換マッピングＥＬＩＳＡを示す図である。保存された置換によって代わって置換された各残基を備えたｂｃ２０から誘導されたキメラペプチド（表９Ｂ）をミクロタイタープレート上に被覆し（ウェル当たり２μｇ）、ｍＡｂ ＮＥ１−６Ｂ２と共にインキュベートし、結合抗体を抗マウス抗体と４５０ｎｍにおけるＯＰＤ比色アッセイで検出した。
図８Ａは、ＭＡｂ ＮＥ１−６Ｂ２で認識されたＣ.elegans unc-15エピトープのマップである。推定上の７つの繰り返し位置ａとｂは、上記の未変性のunc-15配列を示唆した。ｍＡｂ ＮＥ１−６Ｂ２で認識されたエピトープは太字で示されている。
図８Ｂは、極性表面を示すターン当たり３．５残基を備えたＣ.elegans unc-15ヘリックスの円筒状のネット（net）を示す。ヘリックスは左から右に走っている。影付きの残基は、ｍＡｂ ＮＥ１−６Ｂ２と相互作用する。実線の円は決定的な残基を示し、点線の円は決定的ではない残基である。
図９は、キメラペプチドに対する抗体反応のＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。キメラペプチドｂｃ２０、ｂａ３９、ｂｄ１、ｂｄ２およびペプチドｃ１をミクロタイタープレート上に被覆し（ウェル当たり２μｇ）、ｂｄ１に対するマウス抗血清（抗ｂｄ１）もしくはｂｄ２に対するマウス抗血清（抗ｂｄ２）、もしくは予め採取したマウスの血清（予め採取）と共にインキュベートした。結合抗体を抗マウス抗体と４５０ｎｍにおけるＯＰＤ比色アッセイで検出した。
以下の一および三文字略号をアミノ酸残基に用いた。

実施例１
化学薬品
以下の実施例で用いられる全ての化学薬品および溶剤は、別に言及しない限り分析用である。ポリスチレン（１％ｖ／ｖジビニルベンゼン）ｐ-メチルベンズヒドリルアミンヒドロクロリド樹脂（０．８１ｍｅｑ／ｇまたは樹脂置換）、tert-ブチルオキシカルボニル（ｔ-Ｂｏｃ）アミノ酸、１,３-ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ-ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をAuspep（オーストラリア）から購入した。
実施例２
患者
原住民患者であって、あるものは現在もしくは過去においてＲＦ／ＲＨＤの経歴をもつ、オーストラリアのノーザンテリトリーの連鎖球菌属の風土の地域の居住者を研究した。これらの患者の９０％以上が、ｐ１４５に対する未変性に生じる抗体を備えていることが見いだされた（Pruksakornら，1994a）。ドナーからの血清は、使用まで−２０℃で貯蔵した。
実施例３
マウス
ｐ１４５に応答することがわかっているＢ１０．ＢＲマウス（Animal Resources Centre,Willetton,Western Australia）を免疫化の研究のために用いた。
実施例４
ペプチド合成
ペプチドを、Houghten（1985）の同時多重ペプチド合成“ティーバッグ”法を用いた手動の固相技術で合成した。出発樹脂はｐ-メチルベンズヒドリルアミンヒドロクロリドであり、慣例的なＮ-tert-ブチルオキシカルボニル（ｔ-Ｂｏｃ）化学物質を用いた（Merrifield,1963）。全てのアミノ酸基をそのαアミノ位においてｔ-Ｂｏｃ基で保護し、以下の側鎖保護基、すなわちベンジルエステル（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、２-クロロベンジルオキシカルボニル（Ｌｙｓ）、ベンジル（Ｓｅｒ）、トシル（Ａｒｇ）を用いた。
アミノ酸カップリングを、ジクロロメタン中の１,３-ジイソプロピルカルボジイミドを用いて行い、ｔ-Ｂｏｃ基を５５％ｖ／ｖのＴＦＡ／ジクロロメタンを用いて各サイクルにおいて除去した。Ｎ-ヒドロキシベンゾトリアゾールをＡｓｎとＧｌｎを用いたカップリングに添加した。ペプチドを、フッ化水素で処理して樹脂から切断し、ジエチルエーテルで沈降させ、１０％ｖ／ｖ酢酸から凍結乾燥させた。
粗なペプチドを、水中に２％ｖ／ｖアセトニトリルから１００％ｖ／ｖアセトニトリル（両方の溶剤が０．１％ｖ／ｖＴＦＡを含む）の線形勾配を使用した半調製用Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（Biorad）で精製した。精製されたペプチドは逆相ＨＰＬＣおよびフライトマススペクトロメトリー(flight mass spectrometry)のレーザー脱着時間（LaserMat,FinniganMat,UK）で調べたところ均一であった。
本願発明に基づいて合成されたペプチドは、表１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示されている。ペプチド１４４、１４５および１４６は、Ｍタンパク質の保存されたＣ末端領域内に含まれた重複ペプチドである。Ｊｃｏｎは、７つの繰り返し酵母タンパク質、ＧＣＮ４に基づいたモデルペプチドである。ペプチドＪ１−Ｊ９はＪｃｏｎペプチドとｐ１４５に基づいたハイブリッドペプチドである。１４５．１−１４５．５およびＪ_I１−Ｊ_I９は、ｐ１４５配列内部の短い配列を示す。ペプチド１６９と１７１は、それぞれヒト心筋ミオシン（Liewら，1990）およびヒト骨格筋ミオシン（Saezら，1986）から誘導され、これらのタンパク質とｐ１４５との間の優れた相同性を示した。
実施例５
Ｔ細胞増殖アッセイ
マウスのＴ細胞を刺激するために、動物を３０μｇの乳濁したペプチドで尾の付け根において免疫し、排出されたリンパ節細胞を８日目に採取して、先に記載した抗原でin vitroで刺激した（Pruksakornら、1994b）。４日後、増殖の程度を調べるために０．５μＣｉの³Ｈ-チミジンを培養に加えた。リンパ球の活性化を、刺激インデックス［ＳＩ］を評価することによって測定した（特異的ペプチドの存在下における増殖／ペプチドを欠いた増殖）。
ヒトペプチド特異的Ｔ細胞増殖を、ペプチドを含む（もしくは対照のためにペプチドを含まない）ヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）を培養し、かつ、記載の通りに（Pruksakornら，1994b）、６日後にリンパ球の増殖を評価することによって調べた。リンパ球の活性化を、マウスアッセイについて上述したようにして調べた。
実施例６
タンパク質配列の比較
ヒト心筋ミオシンとヒト骨格筋ミオシンのタンパク質配列を、ＧＣＧ（Wisconsin）プログラム、ＢＥＳＴＦＩＴを用いてｐ１４５について２０アミノ酸配列との相同性を調べた。ｐ１４５と相同な領域は二つのペプチド１６９と１７１（表１Ｃ）で表されている。
実施例７
円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル(CIRCULAR DICHROISM SPECTRA)
これらは、室温で、Aviv 62DS CDスペクトロメーター（Lakewood,NJ）を用いて記録された。ペプチドは、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０、５０％ｖ／ｖトリフルオロエタノール中に２０ｍＭもしくは４０ｍＭの濃度とされた。データは、２５０ｎｍ〜１９０ｎｍの間で１ｎｍごとに収集した。楕円率は、平均残基楕円率［Θ］として表示されている。
実施例８
マウス抗血清の調製
Ｂ１Ｏ．ＢＲおよびＢ１Ｏ．Ｄ２マウスを尾の付け根において皮下に免疫した（Pruksakornら，1992）。ＰＢＳに溶解され完全フロイントアジュバントに乳濁された３０μｇのペプチドを含む５０μｌの全量を与えた。ペプチド１４５．１−１４５．５を、免疫の前に、グルタルアルデヒド固定を用いてジフテリアトキソイド（ＤＴ）に接合させたが、他の全てのペプチドは未接合のまま投与された。マウスにＰＢＳ中の３０μｇの接合ペプチドを与えた。
実施例９
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡのプロトコルは先に記載されている（Pruksakornら，1992;1994a）。ペプチドを、ペプチド１４５．１−１４５．５を除いて０．５μｇ／ｍｌの濃度で被覆し、Ｊ_I１−Ｊ_I９は１μｇ／ｍｌを用いた。
正常なマウス血清の平均もしくはヒト血清のバックグラウンド（血清含まず）以上の３つの標準偏差より大きければ意味があるとして、マウスおよびヒト血清に対する力価を計算した。ペプチド特異的抗体枯渇アッセイを、特異的結合がほぼ消耗されるまで、ペプチド（ｐ１４５）被覆プレート中でインキュベーションすることによってヒト血清を用いて行った。負の対照として、血清を、無関係の住血吸虫属（schistosoma）ペプチドで被覆されたプレート中で同様にインキュベートした。ｐ１４５を欠いた、もしくは住血吸虫属を欠いた血清を、テストペプチドに対する抗体の存在について調べるためにテストペプチドで被覆されたプレートに移した。全ての反応をＯＰＤ基質キット（Sigma Chemical Co）で現像し、４５０ｎｍにおいて吸収を読みとった。
実施例１０
オプソニン作用のペプチド阻害
ヒト血清を、６０℃、１５分間で、加熱不活性化した。ＧＡＳと新鮮なドナーの全体のヘパリン処理した血液とを添加する前に３０分間１００μｇのペプチドもしくはＰＢＳと共にインキュベートした。阻害率を、ペプチドの存在および非存在下で生育するコロニー形成ユニットと無添加ヒト血清の対照とを比較することによって計算した。
実施例１１
キメラペプチドの設計原理
もしエピトープがαヘリックスコイルドコイル等の特定のタンパク質構造コンホメーション内に存在することがわかっているなら、このコンホメーションを保持するようにモデルペプチドを合成することができる。このペプチドはフレームワークペプチドとなる。αヘリックスコイルドコイルに保持するモデルペプチドが研究されている。平行な二本鎖コイルドコイルモチーフの設計において、７つの一般的な考察が重要である（CohenとParry,1990）。ａとｄ位は、大きな非極性残基を備え、ｂ、ｃおよびｆ位は、一般的に極性かつ帯電しており、ｅおよびｇ位は、通常鎖間イオン相互作用を支持する（すなわち、Ｇｌｕ／Ｌｙｓの酸／塩基対）。ａおよびｄ位がＶとＬ、もしくはＩとＬに占有されたときには、コイルドコイルダイマーが支持されるが、ＩとＩはトリマーの形成を支持し、ＬとＩはテトラマー相互作用を支持することもわかっている（Harburyら，1994）。
モデルαヘリックスコイルドコイルペプチドはＧＣＮ４ロイシンジッパーに対応するペプチドの構造に基づいて設計された（O′Sheaら1989;1991）。このペプチドは７残基ロイシン繰り返し（ｄ位）とａ位に共通のＶａｌを備えている。最初の７つは以下の配列を含む。

この配列は安定なコイルドコイル７つの繰り返しに見られるいくつかの特徴を含む。これらは、ｅおよびｇ位に酸／塩基対（Ｇｌｙ／Ｌｙｓ）を含み、ｂ、ｃおよびｆ位に極性基を含む（Lupasら(1991)の推定と一致する）。モデル７つの繰り返しは、ＧＣＮ４ロイシンジッパーペプチドの共通の特徴から誘導される。

繰り返しがモデルペプチド（ＶＫＱＬＥＤＫ）_nを与えた場合に、αヘリックスコイルドコイルを形成する能力を備える。４つの７つの繰り返しからなるこのようなモデルペプチドは（ＧＣＮ４）₄と称される［図１Ａ］。研究中の配位エピトープの重複フラグメントは、モデルコイルドコイルペプチドの内部に埋め込まれ、７つの繰り返しと共に登録され、キメラペプチドを与える。
実施例１２
連鎖球菌属のＭタンパク質ペプチド
連鎖球菌属のＭタンパク質ペプチドｐ１４５を、先に記載されているように調製し（Pruksakornら，1992，国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ９３／００１３１［ＷＯ９３／２１２２０］）、表１Ａおよび１Ｂに示された切断されたフラグメント１４５．１、１４５．２、１４５．４、１４５．５、１４５．１２、１４５．１３、１４５．１４（Pruksakorn,1994）を調製した。
ペプチドｐ１４５の領域における連鎖球菌属のＭタンパク質の配列を、コイルドコイル７つの繰り返しについて分析し、推定される７つの位置ａからｇを指定した（図１Ｂ）。ペプチドｐ１４５を１残基が重複する９つの１２マーペプチドに分け、隣接するＧＣＮ４ペプチドを添加することによって、図１Ｃに示すように９つのＪキメラペプチド（Ｊ１−Ｊ９）を与えるために（ＧＣＮ４）₄に埋め込んだ。同じ残基がＧＣＮ４モデルペプチドとｐ１４５配列の両方に見いだされた場合は常に、保存的アミノ酸置換をＪペプチド中に取り込んだ。対照ペプチド（Ｊｃｏｎ）を、図１Ａに示されたＧＣＮ４モデルペプチドに基づいて合成し、これは、前記の全ての保存的アミノ酸置換も含有されている（図１Ｄ）。
キメラペプチドＪ１−４および対照ペプチドＪｃｏｎを、ＨＰＬＣで精製した。ペプチドＪ５−９を合成されたものとして使用した。
実施例１３
ペプチド１４５の免疫優勢エピトープは配座である
ｐ１４５内部の重複する８マーおよび１２マー（ペプチド１４５．１−１４５．５、Ｊ_I１、Ｊ_I５、Ｊ_I７（表１Ａおよび１Ｂ））を用いてｐ１４５内部の最小エピトープをマップすることを最初に試みた。ジフテリアトキソイドに接合した二つの短いペプチド（１４５．１、１４５．５）を用いるとｐ１４５特異的免疫応答をマウスに生じさせることができるにも関わらず、マウス抗ｐ１４５抗血清は、重複するｐ１４６（表１Ｃ）も、ｐ１４５内部の短いペプチドのいずれをも認識しなかった（表２）。結果は、免疫するペプチドがジフテリアトキソイドに接合されているか未接合であるかによらず類似していた。ＧＡＳに高度に曝される地域に生活する９０％以上のヒトがｐ１４５に対する抗体を備えているが、ｐ１４５に対して高い力価（＞６４００）を備えたヒト血清の大半は、より短いペプチド（Ｊ_I１−Ｊ_I９）と反応しなかった（表１Ｂ、３）。これらの結果は、ｐ１４５の内部に一つ以上の線形エピトープがあるが、ｐ１４５で免疫した後もしくはＧＡＳに対する未変性の暴露の後に認識される優勢配位エピトープもあることを示している。円偏光二色性は、ｐ１４５がヘリックス傾向を備えるが（５０％ＴＦＥ中）、短い１２マーペプチド（Ｊ_I１：ＬＲＲＤＬＤＡＳＲＥＡＫ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３］）は備えていないこと（図４）ことを示し、ｐ１４５によって示される免疫優勢エピトープは配位であることを示唆した。
実施例１４
配位エピトープのマッピング
疎水性およびヘリックス形成残基を備えたＭタンパク質に類似した７つの周期性を示す無関係のタンパク質を用い、かつ、他のペプチドの内部にｐ１４５の配列を埋め込むための方法を開発した。選択されたペプチドはＧＣＮ４のロイシンジッパーモチーフ、酵母のＤＮＡ結合タンパク質に基づくものである（O′Sheaら，1991）。ＧＣＮ４に存在する７つの繰り返しの共通配列は、Ｖａｌ-Ｌｙｓ-Ｇｌｎ-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-Ａｓｐ-Ｌｙｓであり、この繰り返しに基づく２８アミノ酸ペプチドは、“Ｊｃｏｎ”と称されるペプチドを与えるためにいくつか置換して設計された（表１Ｂ）。ペプチド１４５配列の１２アミノ酸ウィンドウは、あらゆる潜在的ヘリックス構造を保存するようにＪｃｏｎペプチドに挿入された。このウィンドウは、完全なｐ１４５配列を示す９つのペプチド（Ｊ１→Ｊ９）を与えるように一度に一つの残基がずれている。対応する１２アミノ酸挿入配列（Ｊ_I１→Ｊ_I９）も、対照とする目的のために合成した（表１Ｂ）。
ｐ１４５は、Ｊキメラペプチドに対するある程度の反応性を示した（図２）。これらのＪペプチドのあるもの（すなわちＪ７，Ｊ８）は、上記（それぞれ、１４５．１２、１４５．１３、１４５．１４）と同じ１２マー配列を含むが、ＧＣＮ４フレームワーク内部にある。ある血清は、ｐ１４５のＮ末端残基を示すＪペプチドと反応し（すなわちＪ１、Ｊ２）、あるものはＣ末端残基と反応し、そしてあるものは両方と反応した（すなわちＪ１、Ｊ２、Ｊ４、Ｊ７、Ｊ８）（図２）。どの血清もＪｃｏｎ配列とは反応しなかった。
高力価１４５抗体を含むヒト血清は、ペプチド特異的抗体の“フィンガープリント”を与えるＪペプチドに対する特異性の類似したスペクトルを示した。全てのヒト血清はＪ２と反応した（図３）。二つの血清は、全てのＪペプチドおよびＪｃｏｎペプチドと反応した。これらの場合では、Ｊペプチドに対する特異的反応が、ＧＣＮ４様構造に対する交差反応性によって覆い隠されるかもしれない。全ての残りのヒト血清は、ｐ１４５配列に特異的応答を示すＧペプチドと反応できなかった。
高い連鎖球菌属の暴露の地域にすむヒトおよびｐ１４５で免疫されたマウスからの血清を、これらのキメラペプチドを結合する能力について調べた。６４００以上のペプチド１４５に対する力価を備えた２３人の血清を調べた（表３）。これらの血清の１９の抗体が、同様に高い力価で一つ以上のキメラペプチドを結合したが、重複する８マーペプチド１４５．１→１４５．５のいずれも全く認識しなかった。４つの血清が、＞３２００の力価で、９つの重複する１２マー試験ペプチド（Ｊ_I１→Ｊ_I９）の一つ（Ｊ_I３）と反応した（表３）。ｐ１４５に対する抗体を含まない１１の試験血清は、あらゆるキメラペプチドに対する抗体を含んでおらず、ｐ１４５と反応する抗体がキメラペプチドとも反応していることを強力に示唆した。抗ペプチド１４５＋ｖｅ抗血清によって最も広く認識されたキメラペプチドはＪ２であり、Ｊ１とＪ３はいくらか認識された（表３）。ｐ１４５特異的抗体がＪ２を認識していることを確かめるために、ｐ１４５吸収研究を行い、ｐ１４５涸渇ヒト血清が、本来認識されたＪ２キメラペプチドに結合する能力を失ったことが示された（表４）。しかして認識された核心の残基は、ＲＲＤＬＤＡＳＲＥＡＫＫ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４］からなるが、ある人（Ｊ１またはＪ３ではなくＪ２を認識したヒト）では、核心の残基はＲＤＬＤＡＳＲＥＡＫ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５］であった。この距離はαヘリックスの３と３．３ターンの間に対応する。抗体フットプリントは、ペプチドのヘリックス保持によってもたらされる不連続な残基を認識するようである。円偏光二色性は、キメラペプチドＪ１→Ｊ４が５０％ＴＦＥ中でヘリックス形成の傾向を備えることを示した。
ミオシンもコイルドコイル分子であり、ヒトの筋肉から誘導されたペプチドがｐ１４５と類似した配列を備えているため（表１Ｂ）、これらのヒト血清は交差反応エピトープを認識する可能性を備えている。たった二つの血清しかこれらのペプチド（１６９と１７１）と反応しなかったので（表３）、ｐ１４５およびＪ２を認識する抗体とｐ１６９およびｐ１７１との間の交差反応はほとんどない。
実施例１５
配座が維持されたペプチドＪ２はオプソニン作用を備えた抗体と結合することができる
ペプチドＪ２に特異的なヒト抗体がオプソニン作用を仲介するか否かを決めるため、遊離したＪ２ペプチドがヒト抗血清によるオプソニン作用を阻害できるか否かを調べた。このアッセイは、ｐ１４５そのものがオプソニン作用を備えたヒト抗体の標的であることを調べるために用いられた。オプソニン作用に与える影響を調べるためにｐ１４５に対する高力価の抗体を含む血清にＪ２（１００μｇ／ｍｌ）を添加し、Ｊ２に対する抗体を含有した３つの血清のうちの３つによるオプソニン作用を阻害することがわかったが（表５）、抗Ｊ２抗体を含まない血清ではそのようにならなかった。非連鎖球菌属の配列をコピーする２０マーの無関係のペプチドは、オプソニン作用を阻害しなかった。
実施例１６
ペプチド１４５上のＴ細胞エピトープは、Ｂ細胞エピトープから区別することができる
Ｔ細胞が、同じ領域のペプチドを決定的な抗体結合ペプチドとして認識するか否かを調べるために、応答するＢ１０．ＢＲマウスをｐ１４５で免疫し、排出されたリンパ節細胞をｐ１４５，Ｊ２およびＪ_I２で刺激した。これらはほとんどＪ２およびＪ_I２を認識しなかった（表６）。２１人のＲＨＤ原住民患者および８人の対照原住民患者の末梢血液Ｔ細胞もペプチドＪ２に対する反応を試験した。対照群からはペプチドに対して全く反応がなかった、そしてペプチドＪ２には応答しなかった。
実施例１７
Ｐ１４５、Ｊ２およびＪ７に対するヒト抗体は、ヒト好中球の存在下において、グループＡ連鎖球菌属をオプソナイズ(opsonise)する
ｐ１４５に対する抗体を、ｐ１４５の多重コピーを示すカラムを用いて親和精製した。プロテインＡ精製抗体をカラムに通して、ｐ１４５特異的抗体を溶出した。カラムを通す前に、ｐ１４５を認識した抗体と破傷風トキソイドをイムノグロブリン調製に存在させた。通過後、ｐ１４５に対する抗体はまだ存在するが、破傷風トキソイドに対する抗体はもはや検出できなかった。これらの抗体と、ｐ１４５への反応性のない等量のヒト抗体の対照調製物をオプソニン作用アッセイに用いた。表１０に示されているように、精製された抗ｐ１４５抗体は、対照イムノグロブリンと比較して５８〜９４％（平均８０％）の間でタイプ５グループＡ連鎖球菌属のコロニーの総数を減少することができた。
種々の合成ペプチドをこれらの精製された抗体に添加し、オプソニン作用に与える影響を調べた（表１１）。使用されたペプチドは、ｐ１４５，Ｊ２，Ｊ７および住血吸虫の配列をコピーする非特異的ペプチドであった。遊離したｐ１４５は、非特異的ペプチドと比べて７３−８８％（平均８３％）でオプソニン作用を阻害することができ、遊離のＪ２は８９−９３％（平均９２％）でオプソニン作用を阻害することができ、遊離のＪ７は８２−８６％（平均８４％）でオプソニン作用を阻害することができた。これらのデータは、ｐ１４５，Ｊ２およびＪ７に特異的なヒト抗体がグループＡ連鎖球菌属をオプソナイズすることができることを示している。
実施例１８
αヘリックスコイルドコイルタンパク質内部のエピトープをマッピングする試みを説明するために、Caenorhabditis elegansパラミオシンタンパク質内部のある領域を詳細に研究した。他のコイルドコイル含有タンパク質に共通するように、ネマトーダパラミオシンは、分子の大部分がコイルドコイルコンホメーションをとることを強力に示唆する７残基の周期性を含む。多くの無脊椎動物の太いフィラメントの中心タンパク質であるパラミオシンは、C.elegansに単一遺伝子ｕｎｃ−１５によってコードされている（Waterstonら，1977）。いくつかのｕｎｃ−１５変異体は、高度に組織化されていない筋構造において見られる変わった表現形を有する。これらの一つである対立遺伝子ｅ１２１５は、弱い未修飾の表現形を備えていることが示され、遺伝子の解析は⁸⁰⁹ＱからＲへの一つのアミノ酸置換を示唆した（Gengyo-Andoと：Kagawa,1991）。ｅ１２１５変異体のパラミオシンと反応しないモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＮＥ１-６Ｂ２によって認識されたエピトープは、このポイント変異にマッピングされた。
用いられたアプローチは、αヘリックスコイルドコイルコンホメーションエピトープから誘導された重複ペプチドを用いて、類似した未変性のコンホメーションを備えた完全に無関係のタンパク質から誘導されたヘリックス隣接ペプチド間にこれらのペプチドを埋め込むことである。得られたキメラペプチドを、免疫活性、すなわち抗原性（ｍＡｂによる認識）もしくは免疫原性（適切な抗体応答の生成）について調べることができる。C.elegansパラミオシンタンパク質であるｕｎｃ−１５の場合には、構造はαヘリックスコイルドコイルであると考えられ、このコンホメーションはｍＡｂによって認識されるエピトープに関して最適な免疫学的応答をするために存在する必要があるのかもしれない。ｕｎｃ−１５に基づいた一連のキメラペプチドは、ｍＡｂ ＮＥ１-６Ｂ２によって認識された最小Ｂ細胞エピトープの細かいマッピングを可能にした。このアプローチは、配位エピトープをマッピングし、かつワクチン候補として用いるための最小エピトープを設計する可能性を備えている。
（ｉ）キメラペプチドの設計原理
もし、エピトープがαヘリックス等のある特定のタンパク質構造コンホメーションの内部に存在することがわかっているなら、このコンホメーションを保持するようにモデルペプチドを合成することができる。このペプチドはフレームワークペプチドとなる。αヘリックスコイルドコイルに保持するモデルペプチドが研究されている。平行な二本鎖コイルドコイルモチーフ（a-b-c-d-e-f-g）_nの設計において、７つの一般的な考察が重要である（CohenとParry,1990）。ａとｄ位は、大きな非極性残基を備え、ｂ、ｃおよびｆ位は、一般的に極性かつ帯電しており、ｅおよびｇ位は、通常鎖間イオン相互作用を支持する（すなわち、Ｇｌｕ／Ｌｙｓの酸／塩基対）。ａおよびｄ位がＶとＬ、もしくはＩとＬに占有されたときには、コイルドコイルダイマーが支持されるが、ＩとＩはトリマーの形成を支持し、ＬとＩはテトラマー相互作用を支持することもわかっている（Harburyら，1994）。
モデルαヘリックスコイルドコイルペプチドはＧＣＮ４ロイシンジッパーに対応するペプチドの構造に基づいて設計された（O′Sheaら1989;1991）。このペプチドは７残基ロイシン繰り返し（ｄ位）とａ位に共通のＶａｌを備えている。最初の７つは以下の配列：ＭＫＱＬＥＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を含む。この配列は安定なコイルドコイル７つの繰り返しに見られるいくつかの特徴を含む。これらは、ｅおよびｇ位に酸／塩基対（Ｇｌｙ／Ｌｙｓ）を含み、ｂ、ｃおよびｆ位に極性基を含む。モデル７つの繰り返しは、ＧＣＮ４ロイシンジッパーペプチドの共通の特徴から誘導される：ＶＫＱＬＥＤＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。繰り返しがモデルペプチド（ＶＫＱＬＥＤＫ）_nを与えた場合に、αヘリックスコイルドコイルを形成する能力を備える。研究中の配位エピトープの重複フラグメントは、モデルコイルドコイルペプチドの内部に埋め込まれ、キメラペプチドを与える。
（ii）ｕｎｃ−１５の重複フラグメントをマッピングする未変性ペプチドエピトープ
ｍＡｂ ＮＥ１−６Ｂ２によって認識されたエピトープの領域におけるC.elegans ｕｎｃ−１５パラミオシンタンパク質の配列を、コイルドコイルの７つの繰り返しについて分析し、推定される７つの位置ａからｇを指定した（表７Ａ）。
ｕｎｃ−１５タンパク質内部のｍＡｂ ＮＥ１−６Ｂ２エピトープをマップする最初の試みにおいて、１つのアミノ酸残基がずれた重複する２１マーのペプチドを合成し（表７Ｂ）、ＥＬＩＳＡでアッセイした。ペプチドｂａ３９は、最も高度なＥＬＩＳＡ活性を備えており、２１マーのペプチドがエピトープの認識に十分な長さであることを示唆している。モノクローナル抗体の反応性は、ペプチドｂａ３７〜ｃ９に制限された（図５）。ペプチドｂａ３６のｍＡｂの負の反応性は、タンパク質のＣ末端に対するエピトープの範囲を描写し、エピトープ内部の⁸⁰⁹Ｑ残基の必要性を確実にする（Gengyo-AndoとKagawa,1991）。抗体反応性は、ペプチドがＮ末端から切断されるにつれて減少し、ペプチドｃ９では弱く認識されるのみであり、このことは、最小エピトープ残基がペプチドｂａ３７とｃ８の重複の間の１４マーペプチドＡＤＲＬＴＥＫＬＮＩＱＫＲＱ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６］であることを示唆している。しかしながら、最大の反応性はペプチドｂａ３９に見いだされ、ずっと長い２１マーペプチドＭＡＱＤＴＡＤＲＬＴＥＫＬＮＩＱＫＲＱＬＡ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３］であり、最適な未変性のエピトープであると考えられる。
（iii）ｕｎｃ−１５のキメラペプチドエピトープマッピング
ｍＡｂ ＮＥ１−６Ｂ２エピトープを含むｕｎｃ−１５タンパク質領域は、５残基ずつずれた６つの１５マーペプチドに分けられており、ヘキサマーヘリックス隣接ペプチドの添加によって、キメラペプチドｂｄ１０，ｂｄ１１，ｂｃ１８，ｂｃ２３，ｂｄ１４およびｂｄ１５を与えるべくαヘリックスコイルドコイルフレームワークに埋め込まれている（表８Ａ）。この変化するウィンドウの１５残基は、αヘリックスの４つ以上の完全なターンを含む（ターン当たり３．５残基）。ペプチドｂｃ１８，ｂｃ２３およびｂｄ１４は、必須残基⁸⁰⁹Ｑを含む。ヘリックス隣接ペプチドは、模範的なαヘリックスコイルドコイルペプチド（ＶＫＱＬＥＤＫ）_nに基づいており、ｕｎｃ−１５のコイルドコイルタンパク質の７つの繰り返し周期を備えたフレームに添加された。ヘリックスモデルペプチドとｕｎｃ−１５配列の両方に同じ残基が見いだされた場合には、保存アミノ酸置換をキメラペプチドに取り込んだ。これらの置換は、正しいヘリックスコイルドコイルコンホメーションを確実にするように設計された（CohenとParry,1990）。以下の置換を用いた：位置ａ、ＶからＩ（疎水性残基、ダイマー支持）；ｂ、ＫからＲ（類似したチャージの官能基）；ｃ、ＱからＮ（同じ官能基）；ｄ、ＬからＡ（疎水性残基）；ｅ、ＥからＱ（類似したサイズの残基）；ｆ、ＤからＥ（同じチャージの官能基）；ｇ、ＫからＲ（類似したチャージの官能基）。これらの置換残基の全ては、コイルドコイルタンパク質のそれぞれの位置において共通して見いだされる（Lupasら，1991）。キメラペプチドｂｃ１８のみが、ｍＡｂ ＮＥ１−６Ｂ２によるＥＬＩＳＡで認識された（図６）。この粗なエピトープマッピングは、ペプチドｂｄ１１とｂｃ２３から誘導された⁷⁹⁰Ｖと⁸¹⁴Ｅの間に２５マーペプチドが重複し、エピトープを含むことを示唆した。（ＶＫＱＬＥＤＫ）_nモデルペプチドと（ＶＫＱＬＥＤＫ）₃（ペプチドｂａ４８）に基づく対照ペプチドａｖ８５とａｖ８６は、ｍＡｂ ＮＥ１−６Ｂ２に認識されなかった。
ｕｎｃ−１５タンパク質は、より正確にｍＡｂ ＮＥ１−６Ｂ２エピトープをマップするように１残基ずつずれた１５マーペプチドに分けられている。表８Ｂに挙げたキメラペプチドを与えるように、各フラグメントをヘリックス隣接ペプチド内部に埋め込んだ。ｍＡｂ ＮＥ１−６Ｂ２との最大のＥＬＩＳＡ反応性を、ペプチドｂｃ２０に対して得た（図６）。キメラペプチド内部に埋め込まれたｕｎｃ−１５ペプチドのＣ末端に⁸⁰⁹Ｑ残基を移動（ペプチドｂｃ１７）およびＮ末端に⁷⁹⁸Ｒ残基を移動（ペプチドｂｃ２２）した後は、活性は最小であった。このことは、残基⁷⁹⁸Ｒと⁸⁰⁹Ｑとの間に最小エピトープ、１２マーペプチド：ＲＬＴＥＫＬＮＩＱＫＲＱ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７］があることを示している。このエピトープは上記の未変性のエピトープマッピングから調べられたものより２残基短い（図５）。
（iv）ｕｎｃ−１５のキメラペプチド最小エピトープマッピング
キメラペプチドアプローチを用いて、ｍＡｂ ＮＥ１−６Ｂ２に認識される最小エピトープをよりよく調べるために、ペプチドｂｃ２０内部に含まれた最適エピトープを切りつめた。合成されたキメラペプチドは表９Ａに挙げられている。Ｎ末端の切りつめ（ペプチドｂｅ３９）と同様に、Ｃ末端の埋め込まれたエピトープの切りつめ（ペプチドｂｄ３、ｂｄ４）は、ＥＬＩＳＡ活性を低減させた（図７Ａ）。エピトープのＮまたはＣ末端の残基のさらなる切りつめ（ペプチドｂｄ５，ｂｄ６，ｃ４，ｃ５）は、耐性がなかった。しかしながら、残基⁸⁰¹Ｅから⁸¹¹Ａを含むペプチドｃ６は、まだＥＬＩＳＡに反応性があった。しかして、重複フラグメントエピトープマッピングは、ＲＬＴＥＫＬＮＩＱＫＲＱが最小エピトープであることを示唆したが、切りつめマッピングは、この領域に隣接する残基⁷⁹⁷Ｄ、⁸¹⁰Ｌおよび⁸¹¹Ａが重要であることを示している。これは、配列ＤＲＬＴＥＫＬＮＩＱＫＲＱＬＡ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５］が最小の最適なエピトープであることを定義する。さらに、最適なエピトープ⁷⁹⁷Ｄから⁸¹¹Ａからなる１５マーペプチド（ペプチドｃ１）は、キメラペプチドｂｃ２０に埋め込まれた同じペプチドより低い度合いに認識された。これは、最大の反応性を確実にするために隣接領域が必要であることを強調する。
ＥＬＩＳＡ反応性のためにｍＡｂ ＮＥ１−６Ｂ２エピトープに要求される決定的な残基のマッピングを、各残基の保存的置換によって行った。置換マッピングはキメラペプチドｂｃ２０（最適なエピトープを含む）に基づいており、合成されたペプチドは表９Ｂに挙げられている。ヘリックスフレームワーク残基を、上記モデルペプチドルール；位置ａ，Ｖ；ｂ，Ｋ；ｃ，Ｑ；ｄ，Ｌ；ｅ，Ｅ；ｆ，Ｄ；ｇ，Ｋに基づいてエピトープ残基に代えて置換した。フレームワークペプチドとエピトープ配列との間に同じ位置に同一の残基が見いだされる場合には、保存的置換残基を置換した（上記キメラペプチドエピトープマッピングを参照）。置換が、それぞれペプチドｂｅ４０，ｂｅ４３，ｂｅ４７，ｂｅ５０およびｂｅ５１の残基⁷⁹⁸Ｒ，⁸⁰¹Ｅ，⁸⁰⁵Ｉ，⁸⁰⁸Ｒおよび⁸⁰⁹Ｑに対してなされた場合には、ＥＬＩＳＡ反応性は廃止された（図７Ｂ）。エピトープ反応性の減少は、二つの別の置換、すなわちペプチドｂｅ３９とｂｅ５３における⁷⁹⁷Ｄと⁸¹¹Ａに対しても見いだされた。興味深いことに、⁸⁰²Ｋ（ＫからＤ）および⁸¹⁰Ｌ（ＬからＶ）における置換は反応性を増大させた。これらの結果は図８Ａに示されている。ｍＡｂ ＮＥ１−６Ｂ２エピトープを含むｕｎｃ−１５の配列を円筒状ネットとして図示すると（図８Ｂ）、全ての決定的な残基がヘリックスの親水性の表面に見いだされる。
（ｖ）キメラペプチドの免疫原性
エピトープ特異的抗体反応を誘導する能力を調べるために、Quackenbushマウスをキメラペプチドで免疫した。キメラペプチドｂｃ２０を、ＭＣＳリンケージを介してジフテリアトキソイドにカップリングさせるためにＮ末端システイン残基を用いて合成した（ペプチドｂｄ１，ＣＫＱＬＥＥＫＶＤＲＬＴＥＫＬＮＩＱＫＲＱＬＡＱＬＱＤＫＶＫ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８］）。マウスを、ジフテリアトキソイドに接合され、完全フロイントアジュバントに乳濁された１２５μｇのペプチドを用いて腹腔内に免疫した。不完全フロイントアジュバント中の１２５μｇの等価のペプチド−ジフテリア接合体の追加免疫を４週間後に投与した。ペプチドｂｄ１に対して生じた抗血清は、ペプチドｂｃ２０を認識したが、ペプチドｂａ３９もしくはペプチドｃ１を認識しなかった（図９）。一方、適切にアミノ酸が置換されたモデルヘリックスペプチドに基づく対照キメラペプチド（ペプチドｂｄ２，ＣＫＱＬＥＥＫＶＤＲＬＴＥＫＬＮＩＱＫＲＱＬＡＱＬＱＤＫＶＫ）に対して生じた抗血清は、ペプチドｂｃ２０を認識したが、ペプチドｂａ３９もしくはペプチドｃ１を認識しなかった。しかして、キメラペプチドｂｄ１を用いて生じた抗体反応は、ペプチドｂｃ２０およびｂａ３９に見いだされる配位エピトープに対してのみであった。
当業者であれば、ここに記載された本願発明に、特に記載されたもの以外の変更および修飾を行うことができることを理解するであろう。本願発明はそのような変化および修飾の全てを含むことが理解される。また本発明は、本明細書に、個々にもしくは集合的に記載もしくは示唆された全ての段階、特徴、組成物および化合物、そして前記段階もしくは特徴のあらゆる二つ以上のあらゆる組み合わせも含む。

【配列表】
（１）一般情報
（i）出願人：
（米国以外の国）
THE COUNCIL OF THE QUEENSLAND INSTITUTE OF MEDICAL RESEARCH
（米国のみ）
COOPER,J A;RELF,W A;GOOD,M F;およびSAUL A J
（ii）発明の名称： 合成ペプチドとそれを含むワクチン
（iii）配列の数： ９４
（IV）該当する住所
（Ａ）受信人：DAVIES COLLISON CAVE
（Ｂ）街名：1 LITTLE COLLINS STREET
（Ｃ）都市名：メルボルン
（Ｄ）州：ビクトリア
（Ｅ）国名： オーストラリア
（Ｆ）郵便番号（ZIP）： 3000
（v）コンピューターが読み込むことのできる形態：
（Ａ）媒体種： フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター： ＩＢＭ ＰＣ互換機
（Ｃ）オペレーティングシステム： ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア： パテントイン（PatentIn）リリース＃１．０、バージョン＃１．２５
（vi）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：ＰＣＴインターナショナル
（Ｂ）出願日：１９９５年１０月１６日
（vii）優先日：
（Ａ）出願番号：ＰＭ８８５１
（Ｂ）出願日：１９９４年１０月１４日
（viii）代理人の情報：
（Ａ）名称：HUGHES DR,E JOHN L
（Ｃ）参照番号：EJH/EK
（ix）通信情報：
（Ａ）電話：+61 3 9254 2777
（Ｂ）ＦＡＸ：+61 3 9254 2770
（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２０アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ７アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ７アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： １２アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： １２アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： １２アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１７の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１９の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： １２アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： １２アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： １２アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： １４アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２７の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： １２アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ３０アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２９の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： １２アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： １２アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： １２アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： １２アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： １２アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： １２アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２０アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２０アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３７の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２０アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２０アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３９の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ３５アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２１アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２１アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２１アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２１アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２１アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２１アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２１アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４７の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２１アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２１アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４９の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２１アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２１アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５７の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：５９の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸残基
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６７の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２８アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２１アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：６９の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７７の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：７９の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： １５アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８５の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８６の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８７の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸残基
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８８の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８９の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９０の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸残基
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９１の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９２の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９３の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３：

（２）配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：９４の情報：
（i）配列の特徴：
（Ａ）長さ： ２９アミノ酸
（Ｂ）型： アミノ酸
（Ｃ）鎖の数： 一本鎖
（Ｄ）トポロジー： 直鎖状
（ii）配列の種類： ペプチド
（xi）配列： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４：

The present invention relates to chimeric peptides comprising one or more protective epitopes in a form that allows immunological interactions, and vaccine compositions comprising the same. The present invention is particularly directed to chimeric peptides comprising protective antibodies against group A Streptococcus.
Details of the references described in this application are summarized at the end of this description. The SEQ ID NO of the amino acid sequence described in the specification is defined next to the reference.
Throughout this specification, unless the context demands otherwise, the term “comprise”, or variations thereof, “comprises” or “comprising”, shall be defined elements or complete Alternatively, it is meant to include an element or a complete group, but is not meant to imply the exclusion of other elements or complete groups or elements or complete groups.
Many vaccine candidates that can be used against several diseases have a coiled-coil structure, and structurally important biologically rich motifs Found in a group of proteins (Cohen and Parry, 1990, 1986). It is estimated that over 200 proteins contain a coiled-coil domain (Lupas et al., 1991). These include certain bacterial surface proteins such as streptococcal protein A and M proteins; viral hemagglutinin such as influenza; human immunodeficiency virus (HIV) glycoprotein gp45; and trypanosomes VSG Contains protozoa. All coiled-coil motifs have a characteristic seven amino acid residue repeat (a-b-c-d-e-f-g)_nHave X-ray structures of several coiled-coil domains are obtained, which contain the leucine zipper site (O'Shea et al., 1991) α-spectrin repeat motif (Yan, 1993) of the enzyme transcription factor GCN4 dimer, and GCN4 With leucine zipper trimer (Harbury et al., 1994) and tetramer (Harbury et al., 1993) variants.
In developing subunit vaccines based on these proteins, it is generally difficult to map epitopes within coiled-coil structures. Furthermore, the protective epitope needs to be present in the correct conformation for immunological recognition such as antibody binding. This is particularly important in defining a stable minimal epitope as well as in using it as a vaccine.
Group A Streptococcus (hereinafter referred to as “GAS”) is responsible for several human diseases and can lead to acute rheumatic fever causing severe fever. Rheumatoid fever represents an autoimmune disease initiated by a cross-interaction between streptococcal M protein and cardiac antigens (Beachey et al., 1988). The M protein contains a seven-residue cycle, which strongly suggests that the central rod region of this molecule is a coiled-coil conformation (Manula and Fischetti, 1980). Overlapping peptides have been made that span this region (see International Patent Application PCT / AU93 / 00131 [WO93 / 21220]), and synthetic 20-mer peptides derived from highly conserved C-terminal regions ("p145") Murine antibodies produced against the GAS) can promote opsonization and kill multiple isolates of GAS. Furthermore, p145 can inhibit in vitro killing mediated by human serum. Importantly, p145 also stimulates cardiac cross-reactive T cells (Pruksakorn et al., 1992; 1994b). Since the cleaved peptide is unable to elicit a protective antibody response, it is thought that the B cell epitope within p145 is conformational (Pruksakorn, 1994). It is therefore necessary to define the minimal region of p145 required to induce antibodies with opsonization, which can form the basis of the vaccine. Such a method makes it possible to identify the minimal epitope region from a certain region of the pathogen protein.
One method that has been used to map minimal epitopes from antigens is the PEPSCAN method (Geysen et al., 1987). However, when short peptides are used, they only show a continuous epitope. Another way to determine conformational epitopes, ie epitopes formed by the three-dimensional structure of a protein, is by the mimotope strategies. Mimotopes are mimicking epitopes that induce antibodies. Peptides are a full repertoire of octapeptides that can be made using 20 common amino acids, ie 20⁸It can be synthesized into polypropylene pins covering the peptide (Geysen et al., 1987).
Alternatively, epitope libraries consisting of a vast mixture of filamentous phage clones, each showing one peptide sequence on the virion surface, can be examined for antibody recognition (Scott and Smith, 1990).
According to the present invention, overlapping peptides derived from conformational epitopes are embedded inside peptides with a similar native conformation. This approach has the potential to be used to map conformational epitopes in certain regions and to design minimal epitopes as vaccine candidates against GAS and various other pathogens.
Accordingly, one aspect of the present invention is a chimeric peptide comprising a first amino acid sequence comprising a conformational epitope inserted into a second amino acid sequence, wherein the first and second amino acid sequences are similar Derived from peptides, polypeptides or proteins with a denatured conformation.
According to an aspect of the invention, the second amino acid sequence constitutes a “framework peptide” and provides a suitable conformation for the chimeric peptide. Framework peptides are selected or designed to provide a conformation similar to the original amino acid sequence in the naturally occurring form. In the most preferred embodiment, the framework peptide is in the α-helix coiled coil conformation and is therefore present in the first amino acid sequence in a similar conformation, ie, the α-helix coiled coil conformation. Can be used to present epitopes.
According to a preferred embodiment of the present invention, there is provided a chimeric peptide comprising a first amino acid sequence comprising a conformational epitope inserted within a second amino acid sequence, wherein the second amino acid sequence is an α-helical coiled coil conformer. Retained in the formation.
The present invention is derived from streptococcal M protein, in particular the following amino acid sequences (using single letter abbreviations of amino acid residues):

Alternatively, a first amino acid sequence comprising a B cell conformational epitope within one or more functional and / or chemical equivalents of these amino acid residues is exemplified below.
Accordingly, a particularly preferred embodiment of the present invention comprises the following sequence:

Directed to a chimeric peptide comprising a first amino acid sequence comprising at least three amino acids selected from within, wherein said at least three amino acids constitute a conformational B cell epitope of an M protein of Streptococcus; The first amino acid sequence is inserted within a second amino acid sequence that can be retained in the α-helical coiled-coil conformation. Preferably, the first amino acid sequence comprises at least 5, preferably at least 10, and more preferably at least 15 consecutive amino acid residues.
Alternatively, discontinuous amino acids may be selected such as on the outer surface of the helix that are necessary or sufficient for activity.
Framework peptide is composed of 7 amino acid residues
(A-b-c-d-e-f-g)_n
Based on
The a and d positions preferably comprise large nonpolar residues, the b, c and f positions are generally polar and charged, and the e and g positions are generally responsible for ionic interactions between chains. Contribute. Particularly preferred framework peptides are the GCN4 leucine zipper (O'Shea et al., 1989; 1991) or its trimer (Harbury et al., 1994) or tetramer (Harbury et al., 1993) and the repeat motif of α-spectrin (Yan, 1993) Based on the structure of the peptide corresponding to The GCN4 leucine zipper is particularly preferred, and an exemplary seven repeat derived from features common to GCN4 leucine zipper peptides is the following sequence:

This is where (GCN4)_FourGives four seven-repeat framework peptides called What is required is that the framework peptide can no longer be longer than 4 iterations, or may need to do so.
The first amino acid sequence is embedded inside the framework coiled coil peptide that gives the chimeric peptide.
The chimeric peptide of the present invention can be produced by recombinant means. For example, using a solid phase peptide synthesis technique, one or more amino acid residues are added stepwise in a predetermined order. May be synthesized. Peptides may be synthesized in combination with other proteins and then isolated by chemical cleavage, or peptides or multivalent peptides may be synthesized in multiple repeat units. Peptides may contain native amino acid residues or may contain amino acid residues that are not natively produced, such as D-form isomers or chemically modified native residues. Amino acid residues that do not occur natively may need to promote or provide conformational constraints and / or limitations to the peptide, for example. The choice of method for producing the subject peptide depends on factors such as the desired type, amount and purity of the peptide, as well as the ease and convenience of production.
Because the peptides themselves do not have a sufficiently long serum and / or tissue half-life, the chimeric peptides of the present invention may first require chemical modification for use in vivo. Chemical modification of the subject peptides is also important to improve antigenicity, including the ability of certain regions of the peptide to act as B and / or T cell epitopes. Such chemically modified chimeric peptides are referred to herein as “analogues”. The term “analog” extends to any functional chemical or recombinant equivalent of the chimeric peptide of the invention, and in a most preferred embodiment comprises at least one B cell epitope of the M protein of GAS, and An antibody that reacts with B cell epitopes is minimally reactive with human heart tissue. The term “analog” is used to extend to any amino acid derivative of the peptide.
Chimeric peptide analogs considered here include side chain modifications, incorporation of amino acids and / or derivatives thereof that do not occur natively during peptide synthesis, and cross-linking agents that constrain conformations in the peptide or analog thereof. This includes, but is not limited to the use of other methods.
Examples of side chain modifications considered in the present invention are NaBH after reaction with aldehydes._FourReductive alkylation using acetylene; amidination with methylacetimidate; acylation with acetic anhydride; carbamoylation of amino group with cyanate; 2, 4, 6 -Trinitrobenzylation of amino groups using trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS); acylation of amino groups using succinic anhydride and tetrahydrophthalic anhydride; and pyridoxylation of lysine with pyridoxal-5'-phosphate NaBH_FourModification of the amino group such as reduction with
The guanidine group of the arginine residue may be modified by forming a heterocyclic condensation product using reagents such as 2,3-butanedione, phenylglyoxal and glyoxal.
Carboxyl groups may be modified after carbodiimide activation via O-acylisourea formation, for example by derivitization of the corresponding amide.
Carboxymethylation of sulfhydryl groups with iodoacetic acid or iodoacetamide; performic acid oxidation of cysteic acid; formation of mixed disulfides with other thiol compounds; reaction with maleimide, maleic anhydride or other substituted maleimides Formation of mercurial derivatives with 4-chloromercuribenzoate, 4-chloromercuriphenyl sulfonic acid, phenylmercuryl chloride, 2-chloromercuryl-4-nitrophenol and other mercuryls; using cyanate at alkaline pH It may be modified by a method such as carbamoylation.
Tryptophan residues may be modified, for example, by oxidation with N-bromosuccinimide or alkylation of the indole ring with 2-hydroxy-5-nitrobenzyl bromide or halogenated sulfenyl. On the other hand, tyrosine residues may be nitrated with tetranitromethane to form 3-nitrotyrosine derivatives.
Modification of the imidazole ring of a histidine residue may be carried out by alkylation with iodoacetic acid derivatives or N-carbethoxylation with diethylpyrocarbonate.
Examples of incorporation of non-native amino acids and derivatives during peptide synthesis are norleucine, 4-aminobutyric acid, 4-amino-3-hydroxy-5-phenylpentanoic acid, 6-aminohexanoic acid, t-butylglycine, norvaline , Phenylglycine, ornithine, sarcosine, 4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoic acid, 2-thienyl alanine and / or D-form isomers of amino acids, including but not limited to Absent.
Cross-linking materials can be used, for example, to stabilize the three-dimensional conformation, where n = 1 to n = 6 (CH₂)_nHomobivalent cross-linking material such as a bivalent imide ester having a spacer group, amino-reactive part such as glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide ester, and N-hydroxysuccinimide, and maleimide or dithio part (SH) or Heterobivalent reagents containing reactive moieties specific to other groups such as carbodiimide (COOH) are used. In addition, peptides can be conformationally forced. For example, C_αAnd N_α-Methylamino acid incorporation, amino acid C_αAnd C_βIntroducing a double bond between atoms, introducing a covalent bond, such as by forming an amide bond between the N and C terminus, between two side chains, or between a side chain and the N or C terminus. Can also form cyclic peptides or analogs.
The present invention thus provides conformational epitopes such as streptococcal M proteins in hybrid molecules such that the epitope is provided in a functional conformational state in which it can interact immunologically.
The present invention thus relates to a method for determining the minimal epitope of an antigenic peptide, polypeptide or protein, which comprises the native of said peptide, polypeptide or protein or some of these presumed to possess the epitope. Preparing a peptide fragment of said peptide, polypeptide or protein; said peptide fragment having a native conformation similar to the first mentioned peptide, polypeptide or protein. Inserted or presented in a second peptide derived or derived from another peptide, polypeptide or protein with which the putative epitope of a peptide fragment is in a conformation capable of immunological interaction Presented It is so; and the immunological interaction comprises determining the peptide fragment.
An aspect related to the present invention is to provide a method for mapping a region of an amphipathic helix in a peptide, polypeptide or protein that is recognized by an antibody, the method comprising: Or determining the native conformation of some of these presumed to carry the epitope; preparing a peptide fragment of said peptide, polypeptide or protein; said peptide fragment being the peptide referred to initially Putative or put into a second peptide derived or derived from another peptide, polypeptide or protein with a native conformation similar to the polypeptide or protein to putatively estimate a peptide fragment Epi The-loop, it is to be presented in conformation capable immunological interactivity; for and immunological interaction comprises determining the peptide fragment.
Amphipathic helices recognized by antibodies can be valuable vaccine candidates. An amphipathic helix is a common structure in proteins and can be exposed to the surface (antigenic) or interact with other proteins. Helical coiled coils are more complex forms of helices that interact with homodimers, trimers and tetramers.
“Immunological interaction” means any form of interaction with immune cells or immune effector cells and / or any form of immune response. In general, immunological interactions are measured by antibody binding or interaction with peptide fragments. However, immunological interactions are also extended to measuring cellular immune responses.
In therapeutic and diagnostic development, it is important to determine the minimal epitope that can provide immunological interactions and that can induce a protective immune response in therapy. Therefore, the chimeric peptide of the present invention can be used particularly for the development of a vaccine, including its production method. In its exemplary and preferred forms, the present invention provides chimeric peptides for use in vaccines against GAS. However, this is because the present invention has a protective immune response against pathogenic microorganisms including bacteria, parasites, yeast, fungi and protozoa, or viruses such as retrodeficient viruses such as retroviruses, influenza viruses, hepatitis viruses and HIV. This is done with the understanding that it can also be extended to chimeric peptides that can be used to derive.
Accordingly, a preferred embodiment of the present invention provides a vaccine that can be used against Group A Streptococcus, which vaccine has the following sequence:

A chimeric peptide comprising a first amino acid sequence comprising at least three amino acids selected from within, wherein said at least three amino acids constitute a conformational B cell epitope of an M protein of Streptococcus, The first amino acid sequence is inserted within a second amino acid sequence that can assume an α-helical coiled-coil conformation, and the vaccine further comprises one or more pharmaceutically usable carriers and / or diluents. . The vaccine may further comprise an adjuvant and / or other immunostimulatory molecules. Preferably, the second amino acid sequence forms a framework peptide derived from GCN4. As described above, a continuous or discontinuous amino acid of SEQ ID NO: 1 can also be selected.
Another aspect of the present invention is a vaccine that can be used to develop humoral immunity against M protein, but minimally cross-reacts with heart tissue, wherein the vaccine contains at least one B cell epitope of M protein. An antibody comprising a chimeric peptide comprising a first amino acid sequence having and reacting with said B cell epitope reacts minimally with heart tissue. The first amino acid sequence is inserted within a second amino acid sequence that can take the form of an α-helical coiled coil, and the vaccine further comprises one or more pharmaceutically usable carriers and / or diluents. .
A vaccine may contain a peptide or a range of peptides covering different or similar epitopes. In addition, or alternatively, multiple epitopes may be provided in a single polypeptide. The vaccine in this case is called a multivalent vaccine. Multiple epitopes include two or more repeating epitopes.
The production of vaccines is generally known in the art and reference can be made to Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USA.
The present invention is a pharmaceutical composition or vaccine composition comprising an effective amount of a chimeric peptide (as described above) or a derivative, analog or homologue thereof and / or a combination thereof in the development of humoral immunity, Active molecules and one or more pharmaceutically usable carriers and / or diluents. The active ingredients of the pharmaceutical composition comprising the chimeric peptide exhibit excellent therapeutic activity in the development of antibodies against Streptococcus M protein, for example when administered in an amount dependent on the particular case. It is believed that the antibody exhibits minimal reactivity with heart tissue. For example, about 0.5 μg to 20 mg per kilogram of body weight per day may be administered.
Dosage regimens may be adjusted to provide the optimum therapeutic response. For example, the dose may be divided and administered daily, or may be reduced proportionally as indicated by the treatment status. The active compounds can be administered by conventional methods such as oral, intravenous (water-soluble), intramuscular, subcutaneous, intranasal, intradermal or suppository route or transplantation (eg, using nucleic acid delay molecules). Depending on the route of administration, it may be necessary to coat the active ingredient, including the chimeric peptide, with materials that protect the ingredient from the action of enzymes, acids, and other natural conditions that inactivate the ingredient. For example, when the lipophilicity of the chimeric peptide is low, it is broken down in the gastrointestinal tract or acid hydrolyzed in the stomach by an enzyme capable of cleaving peptide bonds. To administer the chimeric peptide other than parenteral administration, it is coated with a material to prevent its inactivation or administered together. For example, the chimeric peptide may be administered with an adjuvant, with an enzyme inhibitor, or with a liposome. Adjuvant is used in its broadest sense and includes any immune stimulating compound such as interferon. Adjuvants mentioned herein include nonionic surfactants such as resorcinol, polyoxyethylene oleyl ether and n-hexadecyl polyethylene ether. Enzyme inhibitors include pancreatic trypsin inhibitor, diisopropyl fluorophosphate (DFP) and trasilol. Liposomes include water-in-oil-in-water emulsions and conventional liposomes.
The active compound can also be administered parenterally or intraperitoneally. Dispersions can also be prepared in glycerol, liquid polyethylene glycols and mixtures thereof, and in oils. Under normal conditions of storage and use, these preparations contain a preservative to prevent the growth of microorganisms.
Pharmaceutical forms suitable for injection include sterile aqueous solutions (water soluble) or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersion. In all cases, the form must be sterile and must be fluid to allow easy injection. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. The carrier can be a solvent or dispersion medium such as water, ethanol, polyol (for example, glycerol, propylene glycol, and liquid polyethylene glycol, and the like), suitable mixtures thereof, and vegetable oils. Maintain proper fluidity, for example, by using a coating such as licithin, by maintaining the required particle size in the case of dispersions, and by using surfactants. Can do. Interfering with the action of microorganisms can be brought about by various antibacterial and antifungal reagents such as, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thirmerosal. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, such as sugars or sodium chloride. Long absorption of injectable compositions is brought about by using absorption delaying reagents in the composition, such as, for example, aluminum monostearate and gelatin.
Sterile injectable solutions are prepared by incorporating the required amount of the active compound in a suitable solvent containing various ingredients other than those described above and, if necessary, performing filtered sterilization. Generally, dispersions are prepared by introducing various sterile active ingredients into a sterile vehicle and contain a basic dispersion medium and the required ingredients other than those described above. In the case of sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions, the preferred method of preparation is vacuum drying and lyophilization techniques, yielding the active ingredient powder and further desired components of the sterile filtered solution.
If the chimeric peptide is adequately protected as described above, for example, the active compound can be administered orally together with an inert diluent or an edible edible carrier and enclosed in a hard or soft shell gelatin capsule. It can also be compressed into a tablet or taken directly into a food product. For oral therapeutic administration, the active compound may be incorporated with excipients and used in the form of ingestible tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc. Also good. Such compositions and preparations should contain at least 1% by weight of active compound. The percentage of compositions and preparations can, of course, vary and can be between about 5-80% by weight of the unit. The amount of active compound in such compositions used for such treatment is such that a suitable dosage will be obtained. Preferred compositions or preparations according to the present invention are prepared so that an oral dosage unit form contains between 0.1 μg and 2000 mg of active compound.
Tablets, troches, pills, capsules and the like may include: Binders such as tragacanth gum, acacia, corn starch or gelatin; excipients such as dicalcium phosphate; degradation reagents such as corn starch, potato starch and alginic acid; lubricants such as magnesium stearate; and sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin A fragrance such as peppermint, winter green oil, or cherry fragrance may be added. Where the dosage unit form is a capsule, the above type of material may include a liquid carrier. Various other materials may be included as coatings or to modify the physical form of the dosage unit. For instance, tablets, pills, or capsules may be coated with shellac, sugar or both. A syrup or elixir may contain the active compound, sucrose as a sweetening agent, methyl and propylparabens as preservatives, a coloring and flavoring such as cherry or orange flavor. Of course, all materials used in preparing any dosage unit form should be pharmaceutically pure and substantially non-toxic in the amounts employed. In addition, the active compound may be incorporated into sustained-release preparations and medicaments.
As used herein, “pharmaceutically usable carrier and / or diluent” includes any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents and the like. The use of such media and reagents in pharmaceutically active substances is well known in the art. Except for conventional media that are not suitable for the active ingredient, it is contemplated to use them in therapeutic compositions. Supplementary active ingredients can also be incorporated into the compositions.
It is particularly advantageous to formulate parenteral compositions that are easy to administer and take the form of dosage units that can be administered in certain amounts. As used herein, dosage unit form refers to a physically independent unit suitable for a single administration to a treated mammal. Each unit contains a predetermined quantity of active agent calculated to produce the desired pharmaceutical effect, along with the required pharmaceutical carrier. The specifications for the novel dosage unit form of the present invention include: (a) the unique characteristics of the active agent and the specific therapeutic effect to be achieved; Determined by and inherently dependent on inherent limitations in the art, including active substances for treating diseases in certain patients.
The main active ingredient is formulated in an effective amount with a suitable pharmaceutically available carrier in dosage unit form as described above for convenient and effective administration. A unit dosage form can, for example, contain the principal active compound in amounts ranging from 0.5 μg to about 2000 mg. Expressed in proportions, the active compound is generally present in about 0.5 μg to about 2000 mg / ml carrier. In the case of a composition comprising supplementary active ingredients, the dosage is determined with reference to the usual dosage and method of administration of said ingredients.
Another aspect of the present invention is directed to an antibody against the chimeric peptide. Such antibodies may be monoclonal or polyclonal, may be selected from antibodies naturally raised against the M protein, or may be specifically raised against the chimeric peptide. In the latter case, it may be necessary to first bind the peptide to a carrier molecule. The antibodies and / or chimeric peptides of the present invention can be used particularly for immunotherapy and vaccination, and can also be used as a tool for diagnosing infection or observing the progress of vaccination or treatment regimes.
For example, chimeric peptides can be used to examine naturally occurring antibodies to M protein. Alternatively, specific antibodies can be used to examine M protein. Such assay techniques are well known in the art and include, for example, sandwich assays and ELISAs.
Based on this aspect of the present invention, the chimeric peptide can be used specifically to test antibodies against the M protein, providing a diagnostic protocol for detecting Streptococcus infections. In addition, biological samples such as serum, saliva, tissue and tissue extracts can be examined directly for M protein using antibodies raised against the chimeric peptide.
Thus, contacting the patient's biological sample with an antibody that binds an effective amount of the chimeric peptide for a time and under conditions sufficient to form an antibody-chimeric peptide complex, and then detecting said complex A method for diagnosing a Streptococcus infection in a patient is provided.
The presence of M protein antibodies in patient serum, tissue, tissue extracts or other body fluids can be detected using a wide range of immunoassay techniques such as those described in US Pat. Nos. 4016043, 4424279 and 4018653. . This includes non-competitive, both one and two site or “sandwich” assays and conventional competitive binding assays. The sandwich assay is the most usable and generally used assay, and is desirably used in the present invention. There are many types of sandwich assay techniques, all of which are incorporated herein. Briefly, in a typical previous assay, the chimeric peptide is immobilized on a solid phase to form an initial complex, and a sample to be tested for M protein antibodies is contacted with its binding molecule. Incubation is carried out for a period of time suitable for incubation, i.e., sufficient to form a second chimeric peptide-antibody complex. An anti-immunoglobulin antibody labeled with a reporter molecule capable of producing a detectable signal is added and incubated well to form a third complex of chimeric peptide-antibody-labeled antibody. All unreacted material is washed and the presence of the first antibody is examined by observing the signal generated by the reporter molecule. The result can be quantified either by simply observing the visible signal or by comparing it to a control sample containing a known amount of hapten. A change in the previous assay is either a simultaneous assay in which both sample and labeled antibody are added simultaneously to the bound antibody, or the labeled antibody and sample to be tested are first bound, incubated, and added simultaneously to the bound antibody. Includes reverse assay. These techniques are well known to those skilled in the art and the possibility of minor changes is readily apparent. A similar approach may be applied to the detection of M protein. The antibody used may be monoclonal or polyclonal.
The solid phase substrate is typically glass or a polymer, and the most commonly used polymers are cellulose, polyacrylamide, nylon, polystyrene, polyvinyl chloride or polypropylene. The solid support can take the form of a tube, bead, disk or microplate, or any other surface suitable for performing an immunoassay. Coupling methods are well known in the art and generally comprise cross-linking, covalent bonding, or physically adsorbing molecules to an insoluble carrier.
As used herein, a “reporter molecule” refers to a molecule that, by its chemical nature, produces an analytically identifiable signal that detects an antigen-binding antibody. Detection may be quantitative or qualitative. The most commonly used reporter molecules in this type of assay are enzymes, fluorophores, or radionuclide-containing molecules (ie, radioisotopes). In the case of an enzyme immunoassay, the enzyme is conjugated to the second antibody with glutaraldehyde or periodate. However, as will be readily appreciated, there are a wide variety of joining techniques that are readily available to those skilled in the art. Commonly used enzymes include horseradish peroxidase, glucose oxidase, β-galactosidase and alkaline phosphatase. Substrates used with specific enzymes are generally selected to produce a detectable color change upon hydrolysis by the corresponding enzyme. It is also possible to use a fluorescent substrate that produces a fluorescent product.
In addition, a fluorescent compound such as fluorescein or rhodamine may be chemically bound to the antibody without changing the binding force of the antibody. When activated by irradiation with light of a specific wavelength, the fluorescent dye-labeled antibody absorbs light energy, induces an excited state of the molecule, and has a characteristic color that can be visually detected with an optical microscope. Emits light. In EIA, the fluorescently labeled antibody binds to the first antibody-hapten complex. After washing away unbound reagent, the remaining three complexes are exposed to light of the appropriate wavelength and the observed fluorescence indicates the presence of the hapten of interest. Both immunofluorescence and EIA techniques are well established in the art and are particularly preferred for current methods. However, other reporter molecules such as radioisotopes, chemiluminescent molecules or biological luminescent molecules can also be used. It will be readily apparent to those skilled in the art how to change the method to suit the required purpose. It will also be apparent that the foregoing is used to label chimeric peptides as well as to use the same directly for detection of M protein antibodies.
A further aspect of the present invention is the use of the chimeric peptide described in the manufacture of a medicament for use as a vaccine against GAS.
In a related embodiment, the present invention provides a reagent comprising a chimeric peptide described as being usable as a vaccine against GAS.
The present invention is further described by the following non-limiting drawings and examples.
In the drawing:
FIG. 1 Amino acid sequence of the chimeric peptide. All sequences shown are related to the seven repeats (a-b-c-d-e-f-g) of the α-helical coiled coil shown below. A. Sequence of model GCN4 peptide obtained from α-helical coiled-coil GCN4 leucine zipper peptide (O'Shea et al. 1991). B. Sequence of the streptococcal M protein peptide p145 (Pruksakorn et al. 1992) with seven putative coiled-coil repeats. C. Sequence of chimeric J peptide (J1-9). The overlapping 12-mer fragment of the p145 peptide is shown in bold. Conserved amino acid residues are underlined. D. Sequence of control GCN4 model peptide Jcon (G).
FIG. 2 Reactivity of anti-p145 mouse serum to J peptide, reactivity is plotted as an average absorption value at a wavelength of 405 nm. Serum is diluted 1: 100 and representative values are shown. Serum conjugated to diphtheria toxoid (DT) is shown. NMS, normal mouse serum.
Figure 3. Reactivity of high titer anti-p145 human serum against J peptide. Average absorbance values (450 nm) are plotted for sera diluted 1: 100. Representative samples are shown (GBD, MT, MY, FL, TB, MG). NHS, normal human serum.
FIG. 4 illustrates the circular dichroisum spectra of the peptides in the presence of the α helix-derived solvent, 50% trifluoroethanol (TFE). A, J_I1; B, J2; C, Jcon; D, p145. Θ, molar ellipticity. The peptide did not show the α-helix form in aqueous solution. Peptides J1, J3 and J4 were also tested and showed a profile similar to J2.
FIG. 5 shows a native epitope mapping ELISA. Synthetic peptide fragments of C. elegans unc-15 (Table 7B) were coated on microtiter plates (2 μg per well) and incubated with monoclonal antibody (mAb) NE1-6B2, and the bound antibody was combined with anti-mouse antibody and OPD at 450 nm. Detected with a colorimetric assay.
FIG. 6 shows a chimeric epitope mapping ELISA. Overlapping fragments of C. elegans unc-15 embedded in the model helix peptide (Table 8) were coated on microtiter plates (2 μg per well) and incubated with mAb NE1-6B2, and the bound antibody was combined with anti-mouse antibody at 450 nm. In the OPD colorimetric assay. Peptides bd10, bd11, bc18, bc23, bd14, and bd15 are shifted by 5 residues each. Peptides bc17 to bc25 are shifted by one residue. Control peptides av85, av86 and ba48 contain only model helix peptide residues.
FIG. 7A shows a chimeric minimal epitope mapping ELISA. A cleaved fragment of C. elegans unc-15 embedded in the model helix peptide (Table 9A) was coated on a microtiter plate (2 μg per well) and incubated with mAb NE1-6B2, and the bound antibody was combined with anti-mouse antibody at 450 nm. In the OPD colorimetric assay. Peptide c1 consists only of a 15-mer epitope. Control peptides av85, av86 and ba48 contain only model helix peptide residues.
FIG. 7B shows a chimeric epitope substitution mapping ELISA. A chimeric peptide derived from bc20 with each residue replaced by a conserved substitution (Table 9B) was coated on a microtiter plate (2 μg per well), incubated with mAb NE1-6B2, and bound The antibody was detected with anti-mouse antibody and OPD colorimetric assay at 450 nm.
FIG. 8A is a map of the C. elegans unc-15 epitope recognized by MAb NE1-6B2. The putative seven repeat positions a and b suggested the native unc-15 sequence described above. The epitope recognized by mAb NE1-6B2 is shown in bold.
FIG. 8B shows a cylindrical net of C. elegans unc-15 helix with 3.5 residues per turn indicating a polar surface. The helix runs from left to right. Shaded residues interact with mAb NE1-6B2. Solid circles indicate critical residues, and dotted circles are non-critical residues.
FIG. 9 is a diagram showing an ELISA assay of an antibody response to a chimeric peptide. Chimeric peptides bc20, ba39, bd1, bd2 and peptide c1 were coated on microtiter plates (2 μg per well) and mouse antisera against bd1 (anti-bd1) or mouse antiserum against bd2 (anti-bd2) or pre-collected Incubated with mouse serum (previously collected). Bound antibody was detected with anti-mouse antibody and OPD colorimetric assay at 450 nm.
The following one and three letter abbreviations were used for amino acid residues.

Example 1
chemicals
All chemicals and solvents used in the following examples are analytical unless otherwise stated. Polystyrene (1% v / v divinylbenzene) p-methylbenzhydrylamine hydrochloride resin (0.81 meq / g or resin substitution), tert-butyloxycarbonyl (t-Boc) amino acid, 1,3-diisopropylcarbodiimide (DIC) ), N-hydroxybenzotriazole (HOBT), trifluoroacetic acid (TFA) were purchased from Auspep (Australia).
Example 2
patient
An indigenous patient, one who studied a resident of an Australian Territory streptococcal region, now or in the past with a history of RF / RHD. More than 90% of these patients were found to have native antibodies against p145 (Pruksakorn et al., 1994a). Serum from the donor was stored at −20 ° C. until use.
Example 3
mouse
B10 known to respond to p145. BR mice (Animal Resources Centre, Willetton, Western Australia) were used for immunization studies.
Example 4
Peptide synthesis
Peptides were synthesized by manual solid phase technology using the Houghten (1985) simultaneous multiple peptide synthesis “tea bag” method. The starting resin was p-methylbenzhydrylamine hydrochloride using conventional N-tert-butyloxycarbonyl (t-Boc) chemistry (Merrifield, 1963). All amino acid groups are protected at their α-amino positions with a t-Boc group and the following side chain protecting groups: benzyl ester (Glu, Asp), 2-chlorobenzyloxycarbonyl (Lys), benzyl (Ser), tosyl (Arg) was used.
Amino acid coupling was performed using 1,3-diisopropylcarbodiimide in dichloromethane and the t-Boc group was removed in each cycle using 55% v / v TFA / dichloromethane. N-hydroxybenzotriazole was added to the coupling using Asn and Gln. The peptide was cleaved from the resin by treatment with hydrogen fluoride, precipitated with diethyl ether and lyophilized from 10% v / v acetic acid.
The crude peptide was purified from a semi-preparative C18 reverse phase HPLC column using a linear gradient from 2% v / v acetonitrile to 100% v / v acetonitrile (both solvents containing 0.1% v / v TFA) in water ( Biorad). The purified peptide was homogeneous as determined by reverse phase HPLC and flight mass spectrometry laser desorption time (LaserMat, FinniganMat, UK).
Peptides synthesized according to the present invention are shown in Tables 1A, 1B and 1C. Peptides 144, 145 and 146 are overlapping peptides contained within the conserved C-terminal region of the M protein. Jcon is a model peptide based on seven repeated yeast proteins, GCN4. Peptides J1-J9 are hybrid peptides based on Jcon peptide and p145. 145.1-145.5 and J_I1-J_I9 shows a short sequence within the p145 sequence. Peptides 169 and 171 were derived from human cardiac myosin (Liew et al., 1990) and human skeletal muscle myosin (Saez et al., 1986), respectively, and showed excellent homology between these proteins and p145.
Example 5
T cell proliferation assay
To stimulate mouse T cells, animals were immunized with 30 μg of emulsion peptide at the base of the tail, and drained lymph node cells were harvested on day 8 and in vitro with the antigens described above. Stimulated (Pruksakorn et al., 1994b). After 4 days, 0.5 μCi to examine the extent of proliferation^ThreeH-thymidine was added to the culture. Lymphocyte activation was measured by assessing the stimulation index [SI] (proliferation in the presence of specific peptides / proliferation lacking peptides).
Human peptide-specific T cell proliferation was cultured for human peripheral blood lymphocytes (PBL) with peptide (or without peptide for control) and as described (Pruksakorn et al., 1994b), 6 days It was later examined by assessing lymphocyte proliferation. Lymphocyte activation was examined as described above for the mouse assay.
Example 6
Protein sequence comparison
The protein sequences of human cardiac myosin and human skeletal muscle myosin were examined for homology with the 20 amino acid sequence of p145 using the GCG (Wisconsin) program, BESTFIT. The region homologous to p145 is represented by two peptides 169 and 171 (Table 1C).
Example 7
Circular dichroism (CD) spectrum (CIRCULAR DICHROISM SPECTRA)
These were recorded at room temperature using an Aviv 62DS CD spectrometer (Lakewood, NJ). Peptides were brought to a concentration of 20 mM or 40 mM in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0, 50% v / v trifluoroethanol. Data was collected every 1 nm between 250 nm and 190 nm. The ellipticity is displayed as the average residue ellipticity [Θ].
Example 8
Preparation of mouse antiserum
B1O. BR and B1O. D2 mice were immunized subcutaneously at the base of the tail (Pruksakorn et al., 1992). A total volume of 50 μl containing 30 μg of peptide dissolved in PBS and emulsified in complete Freund's adjuvant was given. Peptide 145.1-145.5 was conjugated to diphtheria toxoid (DT) using glutaraldehyde fixation prior to immunization, while all other peptides were administered unconjugated. Mice were given 30 μg of conjugated peptide in PBS.
Example 9
ELISA
The protocol for the ELISA has been described previously (Pruksakorn et al., 1992; 1994a). The peptide was coated at a concentration of 0.5 μg / ml except for peptide 145.1-145.5, and J_I1-J_I9 used 1 μg / ml.
Titers against mouse and human sera were calculated as meaningful if greater than three standard deviations above the mean of normal mouse sera or human serum background (no serum). Peptide specific antibody depletion assays were performed with human serum by incubating in peptide (p145) coated plates until specific binding was nearly depleted. As a negative control, sera were similarly incubated in plates coated with an irrelevant schistosoma peptide. Sera lacking p145 or lacking Schistosoma was transferred to plates coated with test peptides to test for the presence of antibodies against the test peptides. All reactions were developed with OPD substrate kit (Sigma Chemical Co) and absorbance was read at 450 nm.
Example 10
Peptide inhibition of opsonization
Human serum was heat inactivated at 60 ° C. for 15 minutes. GAS and fresh donor whole heparinized blood were incubated with 100 μg peptide or PBS for 30 minutes before addition. Inhibition rates were calculated by comparing colony forming units that grew in the presence and absence of peptide to a control with no added human serum.
Example 11
Chimeric peptide design principles
If it is known that the epitope is present in a particular protein structural conformation, such as an α-helical coiled coil, a model peptide can be synthesized to retain this conformation. This peptide becomes a framework peptide. Model peptides retained in α-helical coiled coils have been studied. Seven general considerations are important in the design of parallel double-stranded coiled-coil motifs (Cohen and Parry, 1990). The a and d positions comprise large non-polar residues, the b, c and f positions are generally polar and charged, and the e and g positions usually support interchain ionic interactions (ie, Glu / Lys acid / base pairs). Coiled coil dimers are supported when the a and d positions are occupied by V and L, or I and L, but I and I support trimer formation, and L and I also support tetramer interactions. I know (Harbury et al., 1994).
A model α-helical coiled-coil peptide was designed based on the structure of the peptide corresponding to the GCN4 leucine zipper (O'Shea et al. 1989; 1991). This peptide has a 7-residue leucine repeat (d position) and a common Val at the a position. The first seven contain the following sequences:

This arrangement includes several features found in seven stable coiled coil repeats. These contain acid / base pairs (Gly / Lys) at the e and g positions, and polar groups at the b, c and f positions (in agreement with the Lupas et al. (1991) estimate). The seven model repeats are derived from the common features of the GCN4 leucine zipper peptide.

Iteration is a model peptide (VKQLEDK)_nIs provided with the ability to form an α-helical coiled coil. Such a model peptide consisting of four seven repeats is (GCN4)_Four[FIG. 1A]. Overlapping fragments of the coordinating epitope under study are embedded within the model coiled coil peptide and registered with seven repeats to give the chimeric peptide.
Example 12
M protein peptide of Streptococcus
The Streptococcus M protein peptide p145 was prepared as previously described (Pruksakorn et al., 1992, International Patent Application No. PCT / AU93 / 00131 [WO93 / 21220]) and shown in Tables 1A and 1B. The truncated fragments 145.1, 145.2, 145.4, 145.5, 145.12, 145.13, 145.14 (Pruksakorn, 1994) were prepared.
The sequence of the Streptococcus M protein in the region of peptide p145 was analyzed for 7 coiled-coil repeats and assigned 7 predicted positions a to g (FIG. 1B). In order to give nine J chimeric peptides (J1-J9) as shown in FIG. 1C by dividing peptide p145 into nine 12-mer peptides with overlapping one residue and adding adjacent GCN4 peptides (GCN4)_FourEmbedded in. Whenever the same residue was found in both the GCN4 model peptide and the p145 sequence, conservative amino acid substitutions were incorporated into the J peptide. A control peptide (Jcon) was synthesized based on the GCN4 model peptide shown in FIG. 1A, which also contains all the conservative amino acid substitutions described above (FIG. 1D).
Chimeric peptide J1-4 and control peptide Jcon were purified by HPLC. Peptide J5-9 was used as synthesized.
Example 13
The immunodominant epitope of peptide 145 is the conformation
Overlapping 8 and 12 mers within p145 (peptide 145.1-145.5, J_I1, J_I5, J_I7 (Tables 1A and 1B)) was first attempted to map the minimal epitope within p145. Although two short peptides (145.1, 145.5) conjugated to diphtheria toxoid can generate a p145-specific immune response in mice, the mouse anti-p145 antiserum is duplicated p146 ( Table 1C) also did not recognize any of the short peptides within p145 (Table 2). The results were similar regardless of whether the immunizing peptide was conjugated to diphtheria toxoid or unconjugated. Over 90% of humans living in areas that are highly exposed to GAS have antibodies to p145, but the majority of human sera with high titers (> 6400) to p145 are made with shorter peptides ( J_I1-J_IIt did not react with 9) (Table 1B, 3). These results indicate that there are one or more linear epitopes within p145, but there are also dominant coordinating epitopes that are recognized after immunization with p145 or after native exposure to GAS. Circular dichroism indicates that p145 has a helix tendency (in 50% TFE), but a short 12-mer peptide (J_I1: LRRDLDASREAK [SEQ ID NO: 23]) is not provided (FIG. 4), suggesting that the immunodominant epitope indicated by p145 is coordinated.
Example 14
Coordination epitope mapping
A method was developed to embed p145 sequences inside other peptides, using an unrelated protein with seven periodicities similar to the M protein with hydrophobic and helix-forming residues. The selected peptides are based on the leucine zipper motif of GCN4, a yeast DNA binding protein (O'Shea et al., 1991). The common sequence of seven repeats present in GCN4 is Val-Lys-Gln-Leu-Glu-Asp-Lys, and a 28 amino acid peptide based on this repeat is given to give a peptide called "Jcon" Were designed (Table 1B). A 12 amino acid window of the peptide 145 sequence was inserted into the Jcon peptide to preserve any potential helix structure. This window is shifted one residue at a time to give nine peptides (J1 → J9) representing the complete p145 sequence. Corresponding 12 amino acid insertion sequence (J_I1 → J_I9) was also synthesized for control purposes (Table 1B).
p145 showed some reactivity to the J chimeric peptide (FIG. 2). Some of these J peptides (ie, J7, J8) contain the same 12-mer sequence as above (145.12, 145.13, 145.14, respectively), but are within the GCN4 framework. Some sera reacted with the J peptide representing the N-terminal residue of p145 (ie, J1, J2), some reacted with the C-terminal residue, and some reacted with both (ie, J1, J2, J4). , J7, J8) (FIG. 2). None of the sera reacted with the Jcon sequence.
Human sera containing high titer 145 antibodies showed a similar spectrum of specificity for the J peptide giving a “fingerprint” of peptide specific antibodies. All human sera reacted with J2 (Figure 3). The two sera reacted with all J and Jcon peptides. In these cases, the specific response to the J peptide may be masked by cross-reactivity to the GCN4-like structure. All remaining human sera failed to react with the G peptide that showed a specific response to the p145 sequence.
Sera from humans living in areas of high streptococcal exposure and mice immunized with p145 were examined for their ability to bind these chimeric peptides. 23 sera with titers against 6400 or more peptides 145 were examined (Table 3). Nineteen antibodies of these sera bound one or more chimeric peptides with similar high titers, but did not recognize any of the overlapping 8-mer peptides 145.1 → 145.5. Four sera with nine overlapping 12-mer test peptides (J_I1 → J_I9) (J_I3) (Table 3). Eleven test sera that did not contain antibodies to p145 did not contain antibodies to any chimeric peptides, strongly suggesting that antibodies reacting with p145 also reacted with the chimeric peptides. The chimeric peptide most widely recognized by the anti-peptide 145 + ve antiserum was J2, with some J1 and J3 recognized (Table 3). To confirm that p145-specific antibodies recognize J2, p145 absorption studies were performed and showed that p145-depleted human serum lost the ability to bind to the originally recognized J2 chimeric peptide (Table 1). 4). The core residue thus recognized consists of RRDLDAREAKKK [SEQ ID NO: 24], but in some people (humans who recognized J2 rather than J1 or J3), the core residue is RDLDASREAK [SEQ ID NO: 25]. This distance corresponds to between 3 and 3.3 turns of the α helix. The antibody footprint appears to recognize discontinuous residues resulting from peptide helix retention. Circular dichroism showed that the chimeric peptide J1 → J4 had a tendency to form a helix in 50% TFE.
Myosin is also a coiled-coil molecule, and peptides derived from human muscle have a sequence similar to p145 (Table 1B), so these human sera have the potential to recognize cross-reactive epitopes. Since only two sera reacted with these peptides (169 and 171) (Table 3), there is little cross-reactivity between antibodies that recognize p145 and J2 and p169 and p171.
Example 15
Conformationally maintained peptide J2 can bind to antibodies with opsonization
In order to determine whether a human antibody specific for peptide J2 mediates opsonization, it was examined whether the released J2 peptide could inhibit opsonization by human antiserum. This assay was used to determine that p145 itself is a target for a human antibody with opsonization. To examine the effect on opsonization, J2 (100 μg / ml) was added to serum containing a high titer antibody against p145 to inhibit opsonization by three of the three sera containing antibody to J2. It was found (Table 5) that this was not the case with sera without anti-J2 antibody. A 20-mer irrelevant peptide that copies non-streptococcal sequences did not inhibit opsonization.
Example 16
T cell epitopes on peptide 145 can be distinguished from B cell epitopes
B10. Responds to see if T cells recognize peptides in the same region as critical antibody binding peptides. BR mice were immunized with p145 and drained lymph node cells were immunized with p145, J2 and J_IStimulated with 2. These are mostly J2 and J_I2 was not recognized (Table 6). The peripheral blood T cells of 21 RHD native patients and 8 control native patients were also tested for response to peptide J2. There was no response to the peptide from the control group and no response to peptide J2.
Example 17
Human antibodies against P145, J2 and J7 opsonize group A streptococci in the presence of human neutrophils
The antibody against p145 was affinity purified using a column showing multiple copies of p145. Protein A purified antibody was passed through the column to elute the p145 specific antibody. Prior to passing through the column, antibodies that recognized p145 and tetanus toxoid were present in the immunoglobulin preparation. After passage, antibodies to p145 still exist, but antibodies to tetanus toxoid could no longer be detected. A control preparation of these antibodies and an equal amount of human antibody with no reactivity to p145 was used in the opsonization assay. As shown in Table 10, purified anti-p145 antibody reduced the total number of type 5 group A streptococcal colonies between 58-94% (average 80%) compared to control immunoglobulin. We were able to.
Various synthetic peptides were added to these purified antibodies and examined for their effect on opsonization (Table 11). The peptides used were non-specific peptides that copied p145, J2, J7 and schistosome sequences. Released p145 can inhibit opsonization by 73-88% (average 83%) compared to non-specific peptides, and free J2 inhibits opsonization by 89-93% (average 92%). And free J7 was able to inhibit opsonization at 82-86% (average 84%). These data indicate that human antibodies specific for p145, J2 and J7 can opsonize group A streptococci.
Example 18
To illustrate attempts to map epitopes within the α-helical coiled-coil protein, a region within the Caenorhabditis elegans paramyosin protein was studied in detail. As is common to other coiled-coil-containing proteins, nematoda paramyosin contains a seven-residue periodicity that strongly suggests that the majority of the molecule adopts a coiled-coil conformation. Paramyosin, the central protein of many invertebrate thick filaments, is encoded by C. elegans by a single gene unc-15 (Waterston et al., 1977). Some unc-15 mutants have an unusual phenotype found in highly unorganized muscle structures. One of these, allele e1215, has been shown to have a weak unmodified phenotype,⁸⁰⁹A single amino acid substitution from Q to R was suggested (Gengyo-Ando and Kagawa, 1991). The epitope recognized by the monoclonal antibody (mAb) NE1-6B2 that does not react with the e1215 mutant paramyosin was mapped to this point mutation.
The approach used is to use overlapping peptides derived from α-helical coiled-coil conformational epitopes, and between these helix flanking peptides derived from completely unrelated proteins with similar native conformations. Embedding peptides. The resulting chimeric peptides can be examined for immunological activity, ie antigenicity (recognition by mAb) or immunogenicity (generation of appropriate antibody response). In the case of unc-15, a C. elegans paramyosin protein, the structure is thought to be an α-helical coiled coil, and this conformation exists for an optimal immunological response with respect to the epitope recognized by the mAb. Maybe you need to. A series of chimeric peptides based on unc-15 allowed fine mapping of the minimal B cell epitope recognized by mAb NE1-6B2. This approach has the potential to map coordinating epitopes and design minimal epitopes for use as vaccine candidates.
(I) Chimeric peptide design principle
If the epitope is known to exist within a particular protein structural conformation such as an α helix, a model peptide can be synthesized to retain this conformation. This peptide becomes a framework peptide. Model peptides retained in α-helical coiled coils have been studied. Parallel double-stranded coiled-coil motif (a-b-c-d-e-f-g)_nSeven general considerations are important in the design of (Cohen and Parry, 1990). The a and d positions comprise large non-polar residues, the b, c and f positions are generally polar and charged, and the e and g positions usually support interchain ionic interactions (ie, Glu / Lys acid / base pairs). Coiled coil dimers are supported when the a and d positions are occupied by V and L, or I and L, but I and I support trimer formation, and L and I also support tetramer interactions. I know (Harbury et al., 1994).
A model α-helical coiled-coil peptide was designed based on the structure of the peptide corresponding to the GCN4 leucine zipper (O'Shea et al. 1989; 1991). This peptide has a 7-residue leucine repeat (d position) and a common Val at the a position. The first seven contain the following sequence: MKQLEDK (SEQ ID NO: 3). This arrangement includes several features found in seven stable coiled coil repeats. These contain acid / base pairs (Gly / Lys) at the e and g positions and polar groups at the b, c and f positions. The model 7 iterations are derived from the common characteristics of the GCN4 leucine zipper peptide: VKQLEDK (SEQ ID NO: 3). Iteration is a model peptide (VKQLEDK)_nIs provided with the ability to form an α-helical coiled coil. Overlapping fragments of the coordinating epitope under study are embedded inside the model coiled coil peptide, giving a chimeric peptide.
(Ii) native peptide epitope mapping overlapping fragments of unc-15
The sequence of the C. elegans unc-15 paramyosin protein in the region of the epitope recognized by mAb NE1-6B2 was analyzed for seven repeats of the coiled coil and assigned seven predicted positions a to g (Table 7A). .
In the first attempt to map the mAb NE1-6B2 epitope within the unc-15 protein, overlapping 21-mer peptides shifted by one amino acid residue were synthesized (Table 7B) and assayed by ELISA. Peptide ba39 has the highest ELISA activity, suggesting that the 21-mer peptide is long enough for epitope recognition. The reactivity of the monoclonal antibody was limited to peptides ba37-c9 (FIG. 5). The negative reactivity of the peptide ba36 mAb delineates the extent of the epitope to the C-terminus of the protein and⁸⁰⁹Ensure the need for Q residues (Gengyo-Ando and Kagawa, 1991). Antibody reactivity decreases as the peptide is cleaved from the N-terminus and is only weakly recognized by peptide c9, indicating that the minimal epitope residue is the 14-mer peptide ADRLTEKLNIQKRQ between the duplication of peptides ba37 and c8. [SEQ ID NO: 26]. However, the greatest reactivity was found with peptide ba39, which is the much longer 21mer peptide MAQDTADRLTEKLNIQKRQLA [SEQ ID NO: 43], which is considered to be the optimal native epitope.
(Iii) Chimeric peptide epitope mapping of unc-15
The unc-15 protein region containing the mAb NE1-6B2 epitope is divided into six 15-mer peptides shifted by 5 residues, and the addition of hexamer helix flanking peptides results in chimeric peptides bd10, bd11, bc18, bc23, Embedded in the α-helical coiled coil framework to give bd14 and bd15 (Table 8A). The 15 residues of this changing window contain 4 or more complete turns of the α helix (3.5 residues per turn). Peptides bc18, bc23 and bd14 are essential residues⁸⁰⁹Q is included. The helical flanking peptide is an exemplary α-helical coiled-coil peptide (VKQLEDK)_nAnd was added to a frame with 7 repeat periods of unc-15 coiled-coil protein. If the same residue was found in both the helix model peptide and the unc-15 sequence, a conservative amino acid substitution was incorporated into the chimeric peptide. These substitutions were designed to ensure correct helix coiled coil conformation (Cohen and Parry, 1990). The following substitutions were used: positions a, V to I (hydrophobic residue, dimer support); b, K to R (functional group of similar charge); c, Q to N (same functional group); d, L to A (hydrophobic residue); e, E to Q (residue of similar size); f, D to E (functional group of the same charge); g, K to R (functional group of similar charge) . All of these substitution residues are commonly found at each position of the coiled-coil protein (Lupas et al., 1991). Only the chimeric peptide bc18 was recognized by ELISA with mAb NE1-6B2 (FIG. 6). This crude epitope mapping was derived from peptides bd11 and bc23.⁷⁹⁰V and⁸¹⁴A 25-mer peptide overlapped between E, suggesting that it contains an epitope. (VKQLEDK)_nModel peptide and (VKQLEDK)_ThreeControl peptides av85 and av86 based on (peptide p48) were not recognized by mAb NE1-6B2.
The unc-15 protein is divided into 15-mer peptides that are offset by one residue to more accurately map the mAb NE1-6B2 epitope. Each fragment was embedded inside the helix flanking peptide to give the chimeric peptides listed in Table 8B. Maximal ELISA reactivity with mAb NE1-6B2 was obtained against peptide bc20 (FIG. 6). At the C-terminus of the unc-15 peptide embedded inside the chimeric peptide⁸⁰⁹Move Q residue (peptide bc17) and to the N-terminus⁷⁹⁸The activity was minimal after moving the R residue (peptide bc22). This means that the residue⁷⁹⁸R and⁸⁰⁹It shows that there is a minimal epitope, 12-mer peptide: RLTKLNIQKRQ [SEQ ID NO: 27] between Q and Q. This epitope is 2 residues shorter than that examined from the native epitope mapping above (FIG. 5).
(Iv) Chimeric peptide minimal epitope mapping of unc-15
Using a chimeric peptide approach, the optimal epitope contained within peptide bc20 was truncated to better investigate the minimal epitope recognized by mAb NE1-6B2. The synthesized chimeric peptides are listed in Table 9A. Similar to the N-terminal truncation (peptide be39), the C-terminal embedded epitope truncation (peptides bd3, bd4) reduced ELISA activity (FIG. 7A). Further truncation of the N- or C-terminal residues of the epitope (peptides bd5, bd6, c4, c5) was not resistant. However, the residue⁸⁰¹From E⁸¹¹Peptide c6 containing A was still reactive to ELISA. Thus, while overlapping fragment epitope mapping suggested that RLTKLNIQKRQ was the minimal epitope, truncation mapping revealed residues adjacent to this region.⁷⁹⁷D,⁸¹⁰L and⁸¹¹A indicates that it is important. This defines that the sequence DRLTEKKLNIQKRQLA [SEQ ID NO: 95] is the smallest optimal epitope. In addition, the optimal epitope⁷⁹⁷From D⁸¹¹The 15-mer peptide consisting of A (peptide c1) was recognized to a lesser degree than the same peptide embedded in the chimeric peptide bc20. This highlights the need for adjacent regions to ensure maximum reactivity.
The critical residue mapping required for the mAb NE1-6B2 epitope for ELISA reactivity was performed by conservative substitution of each residue. The substitution mapping is based on the chimeric peptide bc20 (which contains the optimal epitope) and the synthesized peptides are listed in Table 9B. Substitution of helix framework residues in place of epitope residues based on the above model peptide rules; positions a, V; b, K; c, Q; d, L; e, E; f, D; did. When identical residues were found at the same position between the framework peptide and the epitope sequence, conservative substitution residues were substituted (see chimeric peptide epitope mapping above). The substitutions are residues of peptides be40, be43, be47, be50 and be51, respectively.⁷⁹⁸R,⁸⁰¹E,⁸⁰⁵I,⁸⁰⁸R and⁸⁰⁹When made to Q, ELISA reactivity was abolished (FIG. 7B). Reduced epitope reactivity is due to two alternative substitutions, namely in peptides be39 and be53.⁷⁹⁷D and⁸¹¹Also found for A. Interestingly,⁸⁰²K (K to D) and⁸¹⁰Substitution at L (L to V) increased reactivity. These results are shown in FIG. 8A. Illustrating the sequence of unc-15 containing the mAb NE1-6B2 epitope as a cylindrical net (FIG. 8B), all critical residues are found on the hydrophilic surface of the helix.
(V) The immunogenicity of the chimeric peptide
To examine the ability to induce an epitope specific antibody response, Quackenbush mice were immunized with the chimeric peptide. The chimeric peptide bc20 was synthesized with an N-terminal cysteine residue for coupling to diphtheria toxoid via MCS linkage (peptide bd1, CKQLEEKVDRLTEKLNIQKRQLAQLQDKVK [SEQ ID NO: 28]). Mice were immunized intraperitoneally with 125 μg of peptide conjugated to diphtheria toxoid and emulsified in complete Freund's adjuvant. A booster of 125 μg equivalent peptide-diphtheria conjugate in incomplete Freund's adjuvant was administered 4 weeks later. Antisera raised against peptide bd1 recognized peptide bc20 but not peptide ba39 or peptide c1 (FIG. 9). On the other hand, the antiserum raised against a control chimeric peptide (peptide bd2, CKQLEEKVDRLTEKLNIQKRQLAQLQDKVK) based on a model helix peptide with appropriately substituted amino acids recognized peptide bc20 but not peptide ba39 or peptide c1. Thus, the antibody response generated with the chimeric peptide bd1 was only against the coordinating epitope found in peptides bc20 and ba39.
Those skilled in the art will appreciate that the invention described herein is susceptible to variations and modifications other than those specifically described. It is understood that the present invention includes all such changes and modifications. The invention also includes all steps, features, compositions and compounds described or suggested herein individually or collectively, and any combination of any two or more of the steps or features.

[Sequence Listing]
(1) General information
(I) Applicant:
(Countries outside the US)
THE COUNCIL OF THE QUEENSLAND INSTITUTE OF MEDICAL RESEARCH
(US only)
COOPER, J A; RELF, W A; GOOD, MF; and SAUL A J
(Ii) Title of invention: Synthetic peptide and vaccine containing the same
(Iii) Number of sequences: 94
(IV) Applicable address
(A) Recipient: DAVIES COLLISON CAVE
(B) Street name: 1 LITTLE COLLINS STREET
(C) City name: Melbourne
(D) State: Victoria
(E) Country: Australia
(F) Zip code (ZIP): 3000
(V) Computer-readable form:
(A) Media type: floppy disk
(B) Computer: IBM PC compatible machine
(C) Operating system: PC-DOS / MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.25
(Vi) Current application data:
(A) Application number: PCT International
(B) Application date: October 16, 1995
(Vii) Priority date:
(A) Application number: PM8851
(B) Application date: October 14, 1994
(Viii) Agent information:
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(I) Sequence features:
(A) Length: 12 amino acids
(B) Type: Amino acid
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(2) Information of SEQ ID NO: 35:
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(2) SEQ ID NO: 36 information:
(I) Sequence features:
(A) Length: 20 amino acids
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(2) Sequence number (SEQ ID NO): 38 information:
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(2) SEQ ID NO: 66 information:
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(Ii) Sequence type: peptide
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(2) Sequence number (SEQ ID NO): 67 information:
(I) Sequence features:
(A) Length: 28 amino acids
(B) Type: Amino acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: peptide
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(2) SEQ ID NO: 68 information:
(I) Sequence features:
(A) Length: 21 amino acids
(B) Type: Amino acid
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(Ii) Sequence type: peptide
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(2) Sequence number (SEQ ID NO): 69 information:
(I) Sequence features:
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(B) Type: Amino acid
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(B) Type: Amino acid
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(I) Sequence features:
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(I) Sequence features:
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(B) Type: Amino acid
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(Ii) Sequence type: peptide
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(2) Sequence number (SEQ ID NO): 74 information:
(I) Sequence features:
(A) Length: 29 amino acids
(B) Type: Amino acid
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(2) SEQ ID NO: 75 information:
(I) Sequence features:
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(B) Type: Amino acid
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(2) Information of SEQ ID NO: 76:
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(2) Information of SEQ ID NO: 77:
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(I) Sequence features:
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(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: peptide
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(2) SEQ ID NO: 80 information:
(I) Sequence features:
(A) Length: 15 amino acids
(B) Type: Amino acid
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(2) Information of SEQ ID NO: 81:
(I) Sequence features:
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(B) Type: Amino acid
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(2) Sequence number (SEQ ID NO): 82 information:
(I) Sequence features:
(A) Length: 29 amino acids
(B) Type: Amino acid
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(2) Information of SEQ ID NO: 83:
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(B) Type: Amino acid
(C) Number of chains: single chain
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(2) Information of SEQ ID NO: 84:
(I) Sequence features:
(A) Length: 29 amino acids
(B) Type: Amino acid
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(2) Information of SEQ ID NO: 85:
(I) Sequence features:
(A) Length: 29 amino acids
(B) Type: Amino acid
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(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Sequence: SEQ ID NO: 85:

(2) Sequence number (SEQ ID NO): 86 information:
(I) Sequence features:
(A) Length: 29 amino acids
(B) Type: Amino acid
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(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Sequence: SEQ ID NO: 86:

(2) Sequence number (SEQ ID NO): 87 information:
(I) Sequence features:
(A) Length: 29 amino acid residues
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(2) Sequence number (SEQ ID NO): 88 information:
(I) Sequence features:
(A) Length: 29 amino acids
(B) Type: Amino acid
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(Ii) Sequence type: peptide
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(2) Sequence number (SEQ ID NO): 89 information:
(I) Sequence features:
(A) Length: 29 amino acids
(B) Type: Amino acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Sequence: SEQ ID NO: 89:

(2) SEQ ID NO: 90 information:
(I) Sequence features:
(A) Length: 29 amino acid residues
(B) Type: Amino acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Sequence: SEQ ID NO: 90:

(2) Information of SEQ ID NO: 91:
(I) Sequence features:
(A) Length: 29 amino acids
(B) Type: Amino acid
(C) Number of chains: single chain
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(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Sequence: SEQ ID NO: 91:

(2) SEQ ID NO: 92 information:
(I) Sequence features:
(A) Length: 29 amino acids
(B) Type: Amino acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Sequence: SEQ ID NO: 92:

(2) Sequence number (SEQ ID NO): 93 information:
(I) Sequence features:
(A) Length: 29 amino acids
(B) Type: Amino acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Sequence: SEQ ID NO: 93:

(2) Sequence number (SEQ ID NO): 94 information:
(I) Sequence features:
(A) Length: 29 amino acids
(B) Type: Amino acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Sequence type: peptide
(Xi) Sequence: SEQ ID NO: 94:

Claims (8)

(I) The first amino acid sequence that shows a coordinating (structural) epitope in a native conformation that includes a B cell epitope derived from a portion of LRRDLDASREAKQQVEKALE [SEQ ID NO: 1] or NFVMAQDTADLTEKLNIQKRQLAESESVTMQNLQ [SEQ ID NO: 39] And (ii) a second amino acid sequence that adopts an α-helical coiled-coil conformation that is identical to the native conformation of the first amino acid sequence;
A chimeric peptide comprising
The first amino acid sequence so that the first amino acid sequence and the second amino acid sequence are derived from different peptides, polypeptides, or proteins, and the first amino acid sequence indicates the coordination epitope chimeric peptide but which is inserted in the second α-helical coiled coil configuration in conformation of the amino acid sequence. The chimeric peptide according to claim 1, wherein the first amino acid sequence is derived from an M protein of Streptococcus. 3. The chimeric peptide of claim 2, wherein the first amino acid sequence comprises a B cell coordinating epitope derived from the amino acid sequence LRRDLDASREAKQQVEKALE [SEQ ID NO: 1], or a portion of its analogs. The chimeric peptide according to claim 1, wherein the first amino acid sequence is derived from Caenorhabditis elegans. 5. The chimeric peptide of claim 4, wherein the first amino acid sequence comprises a coordinating B cell epitope derived from the amino acid sequence CKQLEEKVDRLTEKLNIQKRQLAQLQDKVK [SEQ ID NO: 28], or a portion of its analogs. 5. The chimeric peptide of claim 4, wherein the first amino acid sequence comprises a coordinating B cell epitope derived from a portion of the amino acid sequence MAQDTADRLTEKLNIQKRQLA [SEQ ID NO: 43]. 5. The chimeric peptide of claim 4, wherein the first amino acid sequence comprises a coordinating B cell epitope derived from the amino acid sequence ADRLTEKLNIQKRQ [SEQ ID NO: 26], or a portion of its analogs. A chimeric peptide comprising a first amino acid sequence comprising an amino acid sequence selected from a portion of the amino acid sequence LRRDLDASREAKQQVEKALE [SEQ ID NO: 1], wherein said amino acid constitutes a coordinated B cell epitope of an M protein of Streptococcus Wherein the first amino acid sequence is inserted within a second amino acid sequence capable of being held in an α-helical coiled-coil conformation, and further comprises one or more pharmaceutically usable carriers and / or diluents A vaccine used against A Streptococcus.

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