JP4453869B2 - Mutant xylitol dehydrogenase enzyme, microorganism producing the same, method for converting xylitol into xylulose using the enzyme or microorganism - Google Patents
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Description
本発明は、キシリトールを高効率でキシルロースへ変換することができる変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ(Xylitol dehydrogenase; 以下XDH)酵素、これをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター、該ベクターを含む微生物、及び該酵素または該微生物を用いてキシリトールを高効率でキシルロースに変換する方法を提供するものである。さらに詳細には本発明は、木質などに含まれるセルロース、ヘミセルロースのうち、これまで利用する手段が少なかったヘミセルロース中に多量に含まれているキシロースを、バイオマス液体燃料として注目されているエタノールへと変換する酵素系の中で、これまでキシリトールからキシルロースへの変換効率が低かったキシリトールデヒドロゲナーゼ(XDH)酵素のアミノ酸配列を変異させ、補酵素要求性をニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)からニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)要求性へと改良し、および／または、構造安定化亜鉛結合部位を導入して耐熱性を改良したXDHを提供すること、これを用いてキシリトールからキシルロースへの高効率変換を可能とし、これによりキシロースを高効率でエタノールへと変換する方法を提供するものである。 The present invention relates to a mutant xylitol dehydrogenase (XDH) enzyme capable of converting xylitol into xylulose with high efficiency, a gene encoding the same, a vector including the gene, a microorganism including the vector, and the enzyme Alternatively, the present invention provides a method for converting xylitol into xylulose with high efficiency using the microorganism. More specifically, the present invention relates to xylose contained in a large amount in hemicellulose, which has been used in a small amount of cellulose and hemicellulose contained in wood and the like, to ethanol which has been attracting attention as a biomass liquid fuel. Among the enzyme systems to be converted, the amino acid sequence of xylitol dehydrogenase (XDH) enzyme, which had previously had a low conversion efficiency from xylitol to xylulose, was mutated, and the coenzyme requirement was changed from nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ) to nicotinamide Providing XDH with improved heat resistance by introducing adenine dinucleotide phosphate (NADP + ) requirements and / or introducing structure-stabilized zinc binding sites, which can be used to convert xylitol to xylulose Enables high-efficiency conversion, which makes xylose highly efficient to ethanol And provide a method of conversion.
地球上のバイオマスの大部分を占める木質系バイオマスは、リグノセルロースから構成されており、リグノセルロースはセルロース(約45％)とヘミセルロース(約30％)、リグニン(約25％)に分類される。このうち、セルロースやリグニンは短時間で超臨界水を用いたグルコースへの変換などにより、近年、盛んにそのエネルギー利用が研究されている。ヘミセルロースは酸加水分解あるいは酵素分解によって容易にキシロースなどの単糖類に分解することが出来る。また、ヘミセルロースの大部分（非特許文献１参照）を占め、容易に調達できるキシロースを液体燃料へと効率よく変換させることは、エネルギー問題の点からも重要な課題と考えられている。
これまで、酵母などの多くの微生物を用いてセルロースなどのヘキソースをエタノールへと嫌気的に効率よく変換させることには成功しているが、キシロースなどのペントースは高い効率で変換できないことが知られている。
Woody biomass, which occupies most of the biomass on the earth, is composed of lignocellulose. Lignocellulose is classified into cellulose (about 45%), hemicellulose (about 30%), and lignin (about 25%). Among these, cellulose and lignin have been actively studied for their energy use in recent years by conversion to glucose using supercritical water in a short time. Hemicellulose can be easily broken down into monosaccharides such as xylose by acid hydrolysis or enzymatic degradation. In addition, it is considered to be an important issue from the viewpoint of energy problems to efficiently convert xylose which occupies most of hemicellulose (see Non-Patent Document 1) and can be easily procured into liquid fuel.
So far, we have succeeded in anaerobically and efficiently converting hexoses such as cellulose to ethanol using many microorganisms such as yeast, but it is known that pentoses such as xylose cannot be converted with high efficiency. ing.
キシロースをエタノールへと変換する経路として、図１に示したように、主に二つの経路が知られている。一つは、キシロースからキシルロースへとキシロースイソメラーゼ(Xylose isomerase; 以下XI)により補酵素に依存せずに一段階で変換する方法である。もう一つは、キシロースリダクターゼ(Xylose reductase; 以下XR)によりキシロースをキシリトールへと変換させた後、キシリトールをキシリトールデヒドロゲナーゼ(XDH)によりキシルロースへと変換する方法である。この時、変換には補酵素を必要とする。両方法とも、キシロースをキシルロースへと変換する事が出来れば、ペントース・リン酸回路を経由してエタノールへと容易に変換することが出来る。 As shown in FIG. 1, there are mainly two known routes for converting xylose into ethanol. One is a method in which xylose is converted to xylulose in one step by using xylose isomerase (hereinafter referred to as XI) without depending on a coenzyme. The other is a method in which xylose is converted to xylitol by xylose reductase (XR), and then xylitol is converted to xylulose by xylitol dehydrogenase (XDH). At this time, a coenzyme is required for the conversion. In both methods, if xylose can be converted to xylulose, it can be easily converted to ethanol via a pentose-phosphate circuit.
数多くのバクテリアや菌類で、キシロースからキシルロースへとXIにより一段階で変換する経路を通って、キシロースをエタノールへと変換できることが知られている。例えば、Streptomyces sp.（ストレプトミセス）やActinoplanes sp.（アクチノプラネス）のようなバクテリアは、XIによりキシロースをキシルロースへと変換した後、ペントース・リン酸回路を経てエタノールへと変換できることが知られている(非特許文献2参照)。しかし、その効率は非常に低い(特許文献1参照)。これは、有機酸が副生成物として生成することが原因ではないかと考えられている（特許文献2参照）。これらのことから、キシロースからキシルロースへとXIにより一段階で変換する方法は工業的に利用されるには至っていない。 In many bacteria and fungi, it is known that xylose can be converted to ethanol through a pathway in which XI converts from xylose to xylulose in one step. For example, bacteria such as Streptomyces sp. And Actinoplanes sp. Are known to be able to convert xylose to xylulose with XI and then to ethanol via the pentose-phosphate cycle. (See Non-Patent Document 2). However, the efficiency is very low (see Patent Document 1). This is thought to be caused by the formation of organic acids as by-products (see Patent Document 2). From these facts, the method of converting from xylose to xylulose by XI in one step has not been industrially utilized.
二段階でキシロースからキシルロースへと変換する微生物として、Pichia stipitis（ピチア スチピチス）、Candida shehatae（カンジダ シェハタエ）、Pachysolen tannophilus（パチソレン タンフィルス）等が知られている(非特許文献3，4参照)。これらの微生物を用いることで、キシロースをエタノールへと変換することにある程度の成功をしている。しかし、これらの微生物もしくは酵素を用いた方法は、純粋なキシロースを用いた場合の結果であり、キシロース以外の化学物質の存在下で、キシロースをキシルロースへと変換させた場合、その収率は大きく低下することが知られている（非特許文献5，6参照）。通常、木質などからキシロースを生産する際、種々の化学物質を使用する。これらの物質を取り除くことは不可能ではないが、この操作により、大幅なコスト増となる。
微生物を用いてキシロースをキシリトールへと変換させることは、これまでに多くの成功例がある（非特許文献7，8参照）。従って、キシリトールからキシルロースを効率よく変換できる酵素系もしくはその酵素系を有する微生物を用いれば、高効率でキシロースをエタノールへと変換できる可能性がある。
Pichia stipitis, Candida shehatae, Pachysolen tannophilus, and the like are known as microorganisms that convert xylose to xylulose in two steps (see Non-patent
There have been many successful examples of converting xylose into xylitol using a microorganism (see Non-Patent
遺伝子工学的手法により酵母の遺伝子を変異させ、キシロースをエタノールへと高効率で変換させる検討も行われてきた。例えば、C. S. Gongら(特許文献3参照)は、紫外線照射により遺伝子を変異させた酵母を用いて、キシロースを代謝させることに成功している。しかし、どの遺伝子を変異させたかなどの遺伝子工学的な情報は何ら開示されていない。
キシロースをエタノールに変換させるために、キシロースをキシルロースへと補酵素に依存せずに直接変換できるXI遺伝子を大腸菌や酵母に導入した例も報告されている(非特許文献9参照）。しかし、大腸菌や酵母に、これらの遺伝子を導入し、発現させた場合の変換効率は非常に低かった。
Studies have been carried out to mutate yeast genes by genetic engineering techniques to convert xylose into ethanol with high efficiency. For example, CS Gong et al. (See Patent Document 3) succeeded in metabolizing xylose using yeast whose gene has been mutated by ultraviolet irradiation. However, no genetic engineering information such as which gene was mutated is disclosed.
In order to convert xylose into ethanol, an example in which an XI gene capable of directly converting xylose into xylulose without depending on a coenzyme is introduced into Escherichia coli or yeast has been reported (see Non-Patent Document 9). However, when these genes were introduced into E. coli and yeast and expressed, the conversion efficiency was very low.
酵母、Saccharomyces cerevisiae（サッカロミセス セレビシエ）は、グルコースを高効率でエタノールに変換できることが知られているが、出発原料としてキシロースを用いた時には、エタノールに変換することは出来ない。これは、S. cerevisiaeがキシロースをキシルロースに代謝することが出来ないことが原因であり、もしこれを代謝することが出来れば、この微生物が持つ高いエタノール生産能力、高いエタノール耐性能力を用い、非常に効率良くキシロースをエタノールに変換できるのではないかと考えられ、キシロースをキシルロースへと変換する際の酵素系の改良が種々検討されてきた。しかし、S. cerevisiaeのXR（非特許文献10，11参照）およびP. stipitisのXDH(非特許文献12参照)の遺伝子を変異させ、その遺伝子を酵母に導入し、嫌気性条件下でキシロースからエタノールを得ることに成功したことが報告されているが(非特許文献13−15参照)(特許文献4，5参照)、その変換効率は低く、工業的生産にまでは至っていない。
Yeast, Saccharomyces cerevisiae, is known to convert glucose into ethanol with high efficiency, but when xylose is used as a starting material, it cannot be converted into ethanol. This is because S. cerevisiae is unable to metabolize xylose to xylulose, and if it can be metabolized, it uses this microorganism's high ethanol production ability and high ethanol tolerance ability, Therefore, it is thought that xylose can be efficiently converted to ethanol, and various improvements of the enzyme system for converting xylose to xylulose have been studied. However, the genes of S. cerevisiae XR (see
タンパク質、特に工業的に有用な酵素の安定化は実用化に向けた至上命題の1つである。無機触媒に比べて生体高分子である酵素は一般に熱に弱く、その失活の多くは不可逆である。安定性を上昇させ耐久寿命を延ばすことで頻繁な酵素の添加を防ぐことができ、大幅な経費節減を実現できる。安定化した酵素は、種々の分野に応用されている。例えば、洗剤などに添加するタンパク質分解酵素、固定化酵素、アフィニティークロマトグラフィーなどである。安定化を行う方法としては、アミノ酸配列を無作為に変異させた後、高い安定性を持つ酵素をスクリーニングする方法、耐熱性を有する酵素のアミノ酸配列、構造などを参考に酵素のアミノ酸配列を改変させる方法、固定支持体に酵素を結合させる方法、高分子架橋型ゲルで酵素を包み込む方法等、種々の方法が考案されている。 Stabilization of proteins, especially industrially useful enzymes, is one of the most important propositions for practical application. Compared to inorganic catalysts, enzymes that are biopolymers are generally vulnerable to heat, and many of their deactivations are irreversible. By increasing the stability and extending the durable life, frequent enzyme additions can be prevented, resulting in significant cost savings. Stabilized enzymes are applied in various fields. For example, proteolytic enzymes added to detergents, immobilized enzymes, affinity chromatography and the like. Stabilization is performed by randomly mutating the amino acid sequence, then screening for highly stable enzymes, and modifying the amino acid sequence of the enzyme with reference to the amino acid sequence and structure of the enzyme having heat resistance. Various methods have been devised, such as a method of binding an enzyme to a fixed support, a method of encapsulating an enzyme with a polymer cross-linked gel.
アミノ酸配列を変異させることで酵素の改変を行う方法は、大きく2つに分類できる。
第一の方法は、無作為にアミノ酸を置換させるランダム変異(Random mutagenesis)である。遺伝子シャフリング（gene-shuffling）やエラープローン（error-prone）PCRを用いて膨大な酵素変異体プールを構築し、その中から目的の性質に改変された変異体をスクリーニングする方法である。この方法の最大の利点は多くの変異体集団が効率的に得られる点にあり、ターゲット酵素の活性部位等の情報が全く無い場合にも適応できる可能性さえある。一方で、適切なスクリーニング系が必須なのが欠点である。例えば、安定化した中温性酵素変異体を得る場合であれば、そのホモログ酵素をコードする遺伝子の欠損した好熱菌株に構築した変異体プールを導入し、高温下での栄養要求性の復帰等でセレクション（選択）する。
Methods for modifying enzymes by mutating amino acid sequences can be broadly classified into two.
The first method is a random mutation (Random mutagenesis) that randomly substitutes amino acids. This is a method for constructing a huge pool of enzyme mutants using gene-shuffling or error-prone PCR, and screening for mutants that have been modified to the desired properties. The greatest advantage of this method is that many mutant populations can be obtained efficiently, and there is a possibility that it can be applied even when there is no information such as the active site of the target enzyme. On the other hand, it is a drawback that an appropriate screening system is essential. For example, if a stable mesophilic enzyme mutant is to be obtained, a mutant pool constructed in a thermophilic strain deficient in the gene encoding the homologous enzyme is introduced to restore auxotrophy at high temperatures, etc. Select (select) with.
第二の方法は、変異させる部位を最初から特定する部位特異的変異（Site-directed mutagenesis）である。この方法では、ターゲット酵素そのものか少なくともそのホモログの高次構造や反応機構に関する情報に基づいて、変異させるべき部位を決定する。ランダム変異に比べて変異体作製の効率は大幅に下がり変異体の性質が予想通りに改変される保証もないが、上記のようなセレクション系が無い場合や他の類似酵素で成功例がある場合はランダム変異よりもむしろ近道なケースもある。
部位特異的変異による酵素の熱安定性の向上の研究は、主に異なる温度で生育する生物から単離されたホモログ酵素のアミノ酸配列の比較から始まった。好熱性生物由来の酵素には、特定のアミノ酸残基の含有率の偏りや全体の電荷の分布、またループの挿入や欠損などに一定の特徴が見られる。また最近では好熱性、中温性、好冷性酵素の結晶構造の比較から、水素結合や疎水性コアなどの分子内相互作用や分子表面の面積や電荷分布の詳細な比較が可能になり、こうした情報に基づいて部位特異的変異体が設計されるようになっている。しかしながら、現在のところではそうした改変の統一原理というものはなく、ターゲット酵素ごとに安定性向上に使われる戦略は異なっている。
The second method is site-directed mutagenesis that specifies the site to be mutated from the beginning. In this method, the site to be mutated is determined based on the target enzyme itself or at least information on the higher order structure and reaction mechanism of its homolog. Compared to random mutations, the efficiency of mutant production is greatly reduced, and there is no guarantee that the properties of the mutants will be modified as expected, but there are no such selection systems or successful cases with other similar enzymes. In some cases, there are shortcuts rather than random mutations.
The study of improving the thermal stability of enzymes by site-directed mutagenesis began mainly by comparing the amino acid sequences of homologous enzymes isolated from organisms growing at different temperatures. Enzymes derived from thermophilic organisms have certain characteristics such as uneven content of specific amino acid residues, overall charge distribution, and loop insertion and deletion. Recently, comparison of crystal structures of thermophilic, mesophilic, and psychrophilic enzymes has made it possible to make detailed comparisons of intramolecular interactions such as hydrogen bonds and hydrophobic cores, as well as molecular surface area and charge distribution. Site-specific mutants are designed based on information. However, there is currently no unified principle of such modification, and the strategy used to improve stability differs for each target enzyme.
部位特異的変異の“決め打ち”として最も成功を収めた例としては、バクテリオファージ・T4リゾチームへのジスルフィド結合の導入を挙げることができる。構造情報から注意深く選ばれた部位に最終的に3本のジスルフィド結合を導入し、野生型酵素に比べて23℃もTm値(含まれるα-へリックス構造の半分が崩壊する温度)の上昇した変異体を得ることに成功した（非特許文献16）。このような共有結合の導入は、ランダム変異ではまず起こり得ないであろうし、その期待できる効果は少数の水素結合の追加に比べてずっと大きいだろう。これに準ずるような変異導入の戦略は、安定性の向上した部位特異的変異体の効率的な構築に応用可能である。 The most successful example of site-specific mutation is the introduction of disulfide bonds into bacteriophage T4 lysozyme. Finally, three disulfide bonds are introduced at sites carefully selected from the structural information, and the T m value (temperature at which half of the α-helix structure is destroyed) increases by 23 ° C compared to the wild-type enzyme. Succeeded in obtaining the mutant (Non-patent Document 16). Such introduction of covalent bonds would not likely occur with random mutations, and the expected effect would be much greater than the addition of a few hydrogen bonds. Such a mutation introduction strategy can be applied to the efficient construction of site-specific mutants with improved stability.
アルコール脱水素酵素(ADH)は、最も大きなタンパク質ファミリーの1つである。この酵素が触媒する化学反応はいたって簡単である。基質のアルコールは、そのヒドロキシル基が結合している炭素原子の水素が酸化型補酵素NAD(P)+へ転移し(hydryl-transfer)、ヒドロキシル基からプロトンが除去されアルデヒドに酸化される。この酵素は亜鉛原子を活性中心に持ち（触媒亜鉛(catalytic zinc)）、これは3つの高度に保存されたアミノ酸残基と1つの水分子によって配位している。この3つの残基はどれか1つが欠けてもその酵素活性に致命的な影響がある。一方、この触媒亜鉛（catalytic zinc）に加えてもう1つの亜鉛分子を持つADHが数多く知られている。この亜鉛には4つの保存されたシステイン残基が配位しており、構造亜鉛（structural zinc）（この明細書においては「構造安定化亜鉛」と称することもある。）と呼ばれる。構造亜鉛（structural zinc）の有無と、ADHの由来となる生物種やその高次構造の間には明瞭な関係はない。触媒亜鉛（catalytic zinc）に比べて構造亜鉛（structural zinc）の役割はよく分かっていない。実際、構造亜鉛（structural zinc）の有無によらずその結合しているループの構造は高度に保存されている。しかしながら、2つのADHファミリー酵素で4つのシステイン残基のどれかひとつを変異させても、触媒亜鉛同様その酵素活性に致命的な影響があることが報告されており、何らかの高次構造維持に役立っていると考えられてきた。 Alcohol dehydrogenase (ADH) is one of the largest protein families. The chemical reaction catalyzed by this enzyme is quite simple. In the alcohol of the substrate, the hydrogen of the carbon atom to which the hydroxyl group is bonded transfers to the oxidized coenzyme NAD (P) + (hydryl-transfer), and the proton is removed from the hydroxyl group to be oxidized to an aldehyde. The enzyme has a zinc atom at the active center (catalytic zinc) coordinated by three highly conserved amino acid residues and a water molecule. The loss of any one of these three residues has a fatal effect on the enzyme activity. On the other hand, many ADHs having another zinc molecule in addition to the catalytic zinc are known. This zinc is coordinated by four conserved cysteine residues and is called structural zinc (sometimes referred to herein as “structure-stabilized zinc”). There is no clear relationship between the presence or absence of structural zinc and the species and higher-order structures from which ADH is derived. The role of structural zinc is not well understood compared to catalytic zinc. In fact, the structure of the connected loop is highly conserved with or without structural zinc. However, it has been reported that mutating any one of the four cysteine residues with two ADH family enzymes has a fatal effect on the enzyme activity as well as catalytic zinc, which helps to maintain some higher-order structures. It has been thought that
木質などのバイオマス資源のうち、30％以上を占めるヘミセルロースを加水分解することによって容易に得ることが出来るキシロースを、高効率でエタノールへと変換し、エネルギー問題を解決するための1つの手段を提供することは重要な課題である。そのためには、セルロースなどのヘキソースを高効率でエタノールへと変換でき、エタノール耐性の高い酵母に、キシロースなどのペントースを原料として高効率でエタノールへと変換できる能力を与えるのが最も理想的である。これまでに、キシロースをキシリトールへと高効率で変換できる酵母は開発されているが、キシリトールをキシルロースへと高効率で変換するXDHおよび酵母は開発されていない。 Provides a means to solve energy problems by converting xylose, which can be easily obtained by hydrolyzing hemicellulose, which accounts for more than 30% of woody and other biomass resources, to ethanol with high efficiency It is an important task. For that purpose, it is most ideal to give the ability to convert hexoses such as cellulose into ethanol with high efficiency, and to give yeast with high ethanol tolerance the ability to convert pentose such as xylose into ethanol with high efficiency. . So far, yeast that can convert xylose into xylitol with high efficiency has been developed, but XDH and yeast that convert xylitol into xylulose with high efficiency have not been developed.
本発明の課題は、野生型のXDHを参考に高効率でキシリトールをキシルロースへと変換するXDHを開発することである。XRは、前述のように、高効率でキシロースをキシリトールに変換することが出来るが、この際に補酵素として、NADP+を使用する。しかし、XDHは補酵素としてNAD+を使用する。この様に両酵素の補酵素に対する要求性が異なっていることが、補酵素供給の量的バランスを崩し、その結果、キシリトールからキシルロースへの変換が効率よく進行せず、最終的にキシロースからエタノールへの変換効率が低くなると推定される。これらのことを考慮すると、XDHの補酵素要求性を変えて、XRと同じNADP+要求性にすれば、高効率でキシリトールをキシロースに変換でき、この部分が効率よく進行すれば、キシロースをエタノールに高い効率で変換できると考えられる。
従って、本発明の第１の目的は、XDH遺伝子を遺伝子工学的に変異させて、補酵素NADP+要求性の変異型XDHを提供すること、及び該変異型XDHをコードする遺伝子を提供することである。
An object of the present invention is to develop XDH that converts xylitol into xylulose with high efficiency with reference to wild-type XDH. As described above, XR can convert xylose to xylitol with high efficiency. In this case, NADP + is used as a coenzyme. However, XDH uses NAD + as a coenzyme. This difference in the requirements for the coenzymes of both enzymes breaks the quantitative balance of coenzyme supply. As a result, the conversion of xylitol to xylulose does not proceed efficiently, and eventually xylose to ethanol. It is estimated that the conversion efficiency to is low. Considering these things, if the coenzyme requirement of XDH is changed to the same NADP + requirement as XR, xylitol can be converted to xylose with high efficiency, and if this part progresses efficiently, xylose can be converted to ethanol. Can be converted with high efficiency.
Therefore, the first object of the present invention is to provide a mutant XDH that requires coenzyme NADP + by genetically engineering the XDH gene, and to provide a gene that encodes the mutant XDH. It is.
また、酵素を工業的規模で使用する場合には、その酵素の安定性を向上させることは、非常に重要な課題と考えられる。これは、酵素を微生物中に組み込んで使用する場合でも、酵素を固定支持担体に結合させて使用する固定化酵素として使用する場合でも同様である。酵素は、化学物質、例えば、本発明の場合、キシロース、キシリトールやエタノール等や熱に安定である方が好ましい。特に、熱に対する安定性は、系の反応温度が高いほど一般的に反応速度が高く、単位時間あたりの収量が多くなるので重要である。また、微生物に酵素を組み込んだ場合、一般に代謝の進行に伴って培養槽の温度が高くなり、温度上昇に伴って酵素が失活するので、この点からも高い耐熱能力を酵素に持たせることは非常に重要である。
従って本発明の第２の目的は、高い耐熱性を持つ変異型XDHを提供すること、及び該変異型XDHをコードする遺伝子を提供することである。
本発明の他の目的は、キシリトールを高効率でキシルロースへ変換することができる変異型XDHをコードする遺伝子を含むベクター、該ベクターを含む微生物、及び該酵素または該微生物を用いてキシリトールをキシルロースに高効率で変換する方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、該変異型XDHを含むキシロースをエタノールに変換するための酵素系、該酵素系を産生する微生物、該酵素系または該微生物を使用することを特徴とするキシロースをエタノールに変換する方法を提供することである。
Further, when an enzyme is used on an industrial scale, it is considered to be a very important issue to improve the stability of the enzyme. This is the same even when the enzyme is used by being incorporated in a microorganism, or when the enzyme is used as an immobilized enzyme used by being bound to a fixed support. The enzyme is preferably stable to a chemical substance, for example, in the case of the present invention, xylose, xylitol, ethanol or the like or heat. In particular, the stability to heat is important because the higher the reaction temperature of the system, the higher the reaction rate and the higher the yield per unit time. In addition, when an enzyme is incorporated into a microorganism, the temperature of the culture tank generally increases as the metabolism progresses, and the enzyme is deactivated as the temperature rises. Is very important.
Therefore, the second object of the present invention is to provide mutant XDH having high heat resistance and to provide a gene encoding the mutant XDH.
Another object of the present invention is to provide a vector containing a gene encoding a mutant XDH capable of converting xylitol into xylulose with high efficiency, a microorganism containing the vector, and xylitol to xylulose using the enzyme or the microorganism. It is to provide a method of converting with high efficiency.
Still another object of the present invention is to provide an enzyme system for converting xylose containing the mutant XDH into ethanol, a microorganism producing the enzyme system, the enzyme system or the microorganism using the microorganism. It is to provide a method for converting to ethanol.
１．野生型キシリトールデヒドロゲナーゼの少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換し、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が使用可能となるように変異させた変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ。
２．野生型キシリトールデヒドロゲナーゼが、Pichia stipitis（ピチア スチピチス）由来のものである上記１記載の変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ。
３．野生型キシリトールデヒドロゲナーゼの207番目から211番目に対応するアミノ酸の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換した上記２記載の変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ。
４．野生型キシリトールデヒドロゲナーゼの207番目のアスパラギン酸をアラニン、208番目のイソロイシンをアルギニン、および209番目のフェニルアラニンをセリンもしくはスレオニンに置換した上記３記載の変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ。
５．野生型キシリトールデヒドロゲナーゼの207番目のアスパラギン酸をアラニン、208番目のイソロイシンをアルギニン、および209番目のフェニルアラニンをセリン、および211番目のアスパラギンをアルギニンに置換した上記３または４記載の変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ。
６．野生型キシリトールデヒドロゲナーゼの少なくとも１つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換し、構造安定化亜鉛結合部位が導入されたことを特徴とする変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ。
７．他のアミノ酸がシステインである上記６記載の変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ。
８．野生型キシリトールデヒドロゲナーゼの96番目のセリン、99番目のセリン、および102番目のチロシンの少なくとも１つをシステインに置換した上記７記載の変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ。
９．野生型キシリトールデヒドロゲナーゼの96番目のセリン、99番目のセリン、および102番目のチロシンのすべてをシステインに置換した上記７記載の変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ。
１０．野生型キシリトールデヒドロゲナーゼの少なくとも２つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換し、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が使用可能となるように変異させ、かつ構造安定化亜鉛結合部位が導入されたことを特徴とする変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ。
１１．野生型キシリトールデヒドロゲナーゼが、Pichia stipitis（ピチア スチピチス）由来のものである上記１０記載の変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ。
１２．野生型キシリトールデヒドロゲナーゼの207番目から211番目に対応するアミノ酸の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換し、かつ96番目のセリン、99番目のセリン、および102番目のチロシンの少なくとも１つをシステインに置換した上記１１記載の変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ。
１３．野生型キシリトールデヒドロゲナーゼの207番目のアスパラギン酸をアラニン、208番目のイソロイシンをアルギニン、209番目のフェニルアラニンをセリンもしくはスレオニン、96番目のセリンをシステイン、99番目のセリンをシステイン、および102番目のチロシンをシステインにそれぞれ置換した上記１２記載の変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ。
１４．野生型キシリトールデヒドロゲナーゼの207番目のアスパラギン酸をアラニン、208番目のイソロイシンをアルギニン、209番目のフェニルアラニンをセリン、211番目のアスパラギンをアルギニン、96番目のセリンをシステイン、99番目のセリンをシステイン、および102番目のチロシンをシステインにそれぞれ置換した上記１２記載の変異型キシリトールデヒドロゲナーゼ。
１５．上記１〜１４のいずれか１項記載の変異型キシリトールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子。
１６．上記１５記載の遺伝子を含むベクター。
１７．上記１６記載のベクターにより形質転換された微生物。
１８．微生物が酵母または大腸菌である上記１７記載の微生物。
１９．上記１〜１４のいずれか１項記載の変異型キシリトールデヒドロゲナーゼを使用することを特徴とするキシリトールをキシルロースに変換する方法。
２０．上記１７または１８記載の微生物を使用することを特徴とするキシリトールをキシルロースに変換する方法。
２１．上記１〜１４のいずれか１項記載の変異型キシリトールデヒドロゲナーゼを含むキシロースをエタノールに変換するための酵素系。
２２．上記２１記載の酵素系を産生する微生物。
２３．微生物が酵母または大腸菌である上記２２記載の微生物。
２４．上記２２または２３記載の微生物を使用することを特徴とするキシロースをエタノールに変換する方法。
1. A mutant xylitol dehydrogenase obtained by substituting at least one amino acid of a wild-type xylitol dehydrogenase with another amino acid and mutating it so that nicotinamide adenine dinucleotide phosphate can be used as a coenzyme.
2. 2. The mutant xylitol dehydrogenase according to 1 above, wherein the wild-type xylitol dehydrogenase is derived from Pichia stipitis (Pichia stipitis).
3. 3. The mutant xylitol dehydrogenase according to 2 above, wherein at least one of the amino acids corresponding to the 207th to 211st positions of the wild type xylitol dehydrogenase is substituted with another amino acid.
4). 4. The mutant xylitol dehydrogenase according to 3 above, wherein the 207th aspartate of the wild type xylitol dehydrogenase is substituted with alanine, the 208th isoleucine with arginine, and the 209th phenylalanine with serine or threonine.
5). 5. The mutant xylitol dehydrogenase according to the above 3 or 4, wherein the 207th aspartate of the wild type xylitol dehydrogenase is substituted with alanine, the 208th isoleucine with arginine, the 209th phenylalanine with serine, and the 211th asparagine with arginine.
6). A mutant xylitol dehydrogenase, wherein at least one amino acid of wild-type xylitol dehydrogenase is substituted with another amino acid, and a structure-stabilized zinc binding site is introduced.
7). 7. The mutant xylitol dehydrogenase according to 6 above, wherein the other amino acid is cysteine.
8). 8. The mutant xylitol dehydrogenase according to 7 above, wherein at least one of 96th serine, 99th serine, and 102th tyrosine of wild type xylitol dehydrogenase is substituted with cysteine.
9. 8. The mutant xylitol dehydrogenase as described in 7 above, wherein all of the 96th serine, 99th serine and 102th tyrosine of the wild type xylitol dehydrogenase are replaced with cysteine.
10. That at least two amino acids of wild-type xylitol dehydrogenase are substituted with other amino acids, mutated so that nicotinamide adenine dinucleotide phosphate can be used as a coenzyme, and a structure-stabilized zinc binding site has been introduced. A characteristic mutant xylitol dehydrogenase.
11. 13. The mutant xylitol dehydrogenase according to the above 10, wherein the wild type xylitol dehydrogenase is derived from Pichia stipitis (Pichia stipitis).
12 Replace at least one of the amino acids corresponding to positions 207 to 211 of wild-type xylitol dehydrogenase with another amino acid, and replace at least one of 96th serine, 99th serine, and 102th tyrosine with cysteine. 12. The mutant xylitol dehydrogenase described in 11 above.
13. Wild-type xylitol dehydrogenase 207 aspartate, alanine, 208 isoleucine, arginine, 209 phenylalanine, serine or threonine, 96th serine, cysteine, 99th serine, cysteine, and 102th tyrosine,
14 Wild-type xylitol dehydrogenase 207 aspartic acid alanine, 208 isoleucine arginine, 209 phenylalanine serine, 211 asparagine arginine, 96th serine cysteine, 99th serine cysteine, and 102 13. The mutant xylitol dehydrogenase according to 12 above, wherein the second tyrosine is substituted with cysteine.
15. 15. A gene encoding the mutant xylitol dehydrogenase according to any one of 1 to 14 above.
16. 16. A vector comprising the gene according to 15 above.
17. A microorganism transformed with the vector according to 16 above.
18. 18. The microorganism according to 17 above, wherein the microorganism is yeast or E. coli.
19. 15. A method for converting xylitol into xylulose, wherein the mutant xylitol dehydrogenase according to any one of 1 to 14 is used.
20. 19. A method for converting xylitol into xylulose, using the microorganism according to 17 or 18 above.
21. 15. An enzyme system for converting xylose containing the mutant xylitol dehydrogenase according to any one of 1 to 14 to ethanol.
22. A microorganism that produces the enzyme system according to 21 above.
23. 23. The microorganism according to the above 22, wherein the microorganism is yeast or Escherichia coli.
24. 24. A method for converting xylose into ethanol, which comprises using the microorganism according to 22 or 23 above.
本発明によって改良された変異型XDHは、高効率で、キシリトールをキシルロースへと変換できる。従って、この酵素をコードする遺伝子が組み込まれ、該酵素を産生する酵母を用いることで、キシロースからエタノールへと効率よく変換でき、バイオマスとしてこれまで利用されることが少なかったヘミセルロースを次世代の液体エネルギーとして期待されているエタノールへと高効率で変換することが出来る。 The mutant XDH improved according to the present invention can convert xylitol into xylulose with high efficiency. Therefore, by using a yeast that incorporates the gene encoding this enzyme and produces the enzyme, it is possible to efficiently convert xylose to ethanol, and to convert hemicellulose, which has been rarely used as biomass, into a next-generation liquid. It can be converted to ethanol, which is expected as energy, with high efficiency.
種々の微生物由来のXDHおよびソルビトールデヒドロゲナーゼ(sorbitol dehydrogenase; 以下SDH)のアミノ酸配列および補酵素依存性を比較したところ(図2B)、昆虫Bemisia argentifolii（ベミシア アルゲンチフォリ）由来のSDHのみが補酵素としてNADP+を使用していた。そのアミノ酸配列を比較したところ、種々特徴的なアミノ酸配列が見られた。最も特徴的なのが、この昆虫が持つSDHの199番目のアミノ酸に対応する部分で、NAD+を補酵素とするXDHあるいはSDHの場合にはアスパラギン酸が使用されているが、NADP+を補酵素とするSDHの場合には、アラニンが用いられていることである。そこで、Pichia stipitisのXDHのこの部位のホモロジー対応するアミノ酸、すなわち、アスパラギン酸をアラニンに、イソロイシンをアルギニンに変えることによって、P. stipitisのXDHがNADP+を補酵素として使用できるのではないかと考えた。
構造亜鉛（structural zinc）を含まないADHの場合、4つのシステイン残基は他の残基に置換されているか、特定の置換される数や置換後の残基に特定のパターンはない。この残基を再びシステインに置き換えた時、野生型酵素に新たな亜鉛原子を導入でき、それに伴う安定性の上昇と付加的な活性の上昇が期待できる。
A comparison of the amino acid sequences and coenzyme dependence of XDH and sorbitol dehydrogenase (hereinafter referred to as SDH) derived from various microorganisms (Fig. 2B) shows that only SDH derived from the insect Bemisia argentifolii is used as a coenzyme. NADP + was used. When the amino acid sequences were compared, various characteristic amino acid sequences were found. The most characteristic is the part corresponding to the 199th amino acid of SDH of this insect. Aspartic acid is used in the case of XDH or SDH with NAD + as a coenzyme, but NADP + is a coenzyme. In the case of SDH, alanine is used. Therefore, we thought that XDH of P. stipitis could use NADP + as a coenzyme by changing the amino acid corresponding to the homology of this site of XDH of Pichia stipitis, that is, aspartic acid to alanine and isoleucine to arginine. It was.
In the case of ADH that does not contain structural zinc, the four cysteine residues are replaced with other residues, or there is no specific pattern for the number of specific substitutions or the residues after substitution. When this residue is replaced with cysteine again, a new zinc atom can be introduced into the wild-type enzyme, and the accompanying increase in stability and additional activity can be expected.
XDHは一般に補酵素としてNAD+を要求し、キシリトールをキシルロースに変換する反応を触媒する。P. stipitisのXDH (PsXDH)の亜鉛含有量は報告されていないが、触媒亜鉛及び構造亜鉛（catalyticおよび structural zinc）を含むB. argentifolii由来のSDHと亜鉛結合部位を比較すると(図2A)、触媒亜鉛（catalytic zinc）の結合部位は完全に保存されていることから少なくとも触媒亜鉛（catalytic zinc）は含まれていると思われる。一方、PsXDHの構造亜鉛（structural zinc）結合部位では4つのシステインのうち1つのみ(Cys110)が保存されており、他の3つはそれぞれSer96、Ser99、Tyr102に置換されていた。そこで、これらの残基を全てシステインに置換することを試みた。
本酵素の野生型は完全なNAD+依存性であるが、Pichia stipitisのキシロース還元酵素(キシロースをキシリトールに変換する反応を触媒)はNADPH依存性である。この両酵素の異なる補酵素依存性が、酵母を用いたキシロースからのエタノール生産の効率を低下させているとの知見に基づいて、本発明者はNADP+に補酵素依存性が逆転したXDH変異体を作製した。野生型(WT)に加えて、これらの変異体、特にARSとARSdRにも構造亜鉛（structural zinc）の導入を試みた。
XDH generally requires NAD + as a coenzyme and catalyzes a reaction to convert xylitol to xylulose. The zinc content of P. stipitis XDH (PsXDH) has not been reported, but comparing the zinc binding site with SDH from B. argentifolii containing catalytic zinc and structural zinc (FIG. 2A), Since the binding site of catalytic zinc is completely preserved, it seems that at least catalytic zinc is contained. On the other hand, at the structural zinc binding site of PsXDH, only one of the four cysteines (Cys 110 ) was conserved, and the other three were replaced by Ser 96 , Ser 99 , and Tyr 102 , respectively. . Therefore, an attempt was made to substitute all of these residues with cysteine.
The wild type of this enzyme is completely NAD + dependent, whereas the Pichia stipitis xylose reductase (catalyzing the reaction converting xylose to xylitol) is NADPH dependent. Different coenzyme dependency of this both enzymes, based on the knowledge of that reduces the efficiency of ethanol production from xylose in yeast, the present inventors have XDH mutation reversed coenzyme dependency NADP + The body was made. In addition to the wild type (WT), we attempted to introduce structural zinc into these mutants, especially ARS and ARSdR.
本発明で使用する変異の対象となるXDHは、どの様な生物から得られたものを用いてもかまわない。例えば、同じ酵母であるGalactocandida mastotermitis（ガラクトカンジダ マストテルミシチス）由来のものを用いることが出来る。この中で特に好ましいのは、Pichia stipitisである。それは、S. cerevisiaeに導入されるXRとXDHとしてはP. stipitis由来のものが最もよく用いられており、その発酵条件等が詳細に検討されているからである。また、現時点におけるエタノール生産の最高収率はこの系によって達成されているからである。 The XDH to be mutated used in the present invention may be obtained from any organism. For example, those derived from Galactocandida mastotermitis, which is the same yeast, can be used. Of these, Pichia stipitis is particularly preferable. This is because, as XR and XDH introduced into S. cerevisiae, those derived from P. stipitis are most often used, and their fermentation conditions and the like have been studied in detail. This is because the highest yield of ethanol production at the present time is achieved by this system.
遺伝子増幅法としては、PCR(Polymerase chain reaction)法の他に、リプレゼンテーショナル・ディフェレンス・アナリシス(RDA)法(N. Lisitsynら (1993) Science, 259: 946)、その改良法（N. G. Gurskayaら (1996) Anal. Biochem., 240: 90）、Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA)法(特許文献6参照)等を使用することが出来、遺伝子を増幅することが出来れば特に制限はない。
遺伝子に変異を導入する方法としては、特に限定しないが、合成DNAプライマーを用いたPCR法などを使用することが出来る。
XDHの補酵素要求性はNADP+が使用可能になればよく、特に制限はしないが、補酵素要求性は、NAD+のkcat/Kmに対して、NADP+のkcat/Kmが好ましくは10倍から100倍であれば良く、300倍から1000倍であることがさらに好ましい。
In addition to the PCR (Polymerase chain reaction) method, the gene amplification method includes the representational difference analysis (RDA) method (N. Lisitsyn et al. (1993) Science, 259: 946), and an improved method (NG Gurskaya). (1996) Anal. Biochem., 240: 90), Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA) method (see Patent Document 6), etc. can be used, and there is no particular limitation as long as the gene can be amplified. .
A method for introducing a mutation into a gene is not particularly limited, and a PCR method using a synthetic DNA primer can be used.
Coenzyme requirement of XDH may if the available NADP +, is not particularly limited, coenzyme requirement, relative to NAD + in k cat / K m, NADP + in k cat / K m is It is preferably 10 to 100 times, more preferably 300 to 1000 times.
NADP+を補酵素として使用することが出来れば、そのアミノ酸配列もしくは塩基配列は、特に制限しないが、XDHのアミノ酸配列の207番目から211番目に対応するアミノ酸の少なくとも１つを他のアミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、セリンまたはスレオニンに置換させたものが好ましい。XDHのアミノ酸配列で207番目のアスパラギン酸をアラニンに置換させたもの、208番目のイソロイシンをアルギニンに置換させたもの、アミノ酸配列の209番目のフェニルアラニンをセリンもしくはスレオニンに置換させたもの、およびアミノ酸配列の211番目のアスパラギンをアルギニンに置換させたものが特に好ましい。
XDH遺伝子を組み込む生物は特に限定しないが、生産されるエタノールに対する耐性などの理由から、酵母、特にSaccharomyces属酵母を使用することが好ましい。
本発明で使用する変異の対象となるADHは、構造亜鉛（structural zinc）を含まないものであればどの様な生物から得られたものを用いてもかまわない。この中で特に好ましいのは、酵母Pichia stipitis由来のキシリトール脱水素酵素(XDH)である。その理由として、本酵素が酵母を用いたキシロースからエタノール生産における必須酵素であり工業的有用性が高いことが挙げられる。
If NADP + can be used as a coenzyme, its amino acid sequence or base sequence is not particularly limited, but at least one of the amino acids corresponding to the 207th to 211th amino acid sequence of XDH is replaced with another amino acid, for example, , Alanine, arginine, serine or threonine are preferred. XDH amino acid sequence with 207th aspartic acid substituted with alanine, 208th isoleucine with arginine, amino acid sequence with 209th phenylalanine substituted with serine or threonine, and amino acid sequence Of these, those obtained by substituting arginine for the 211st asparagine are particularly preferred.
The organism into which the XDH gene is incorporated is not particularly limited, but it is preferable to use a yeast, particularly a Saccharomyces genus yeast, for reasons such as resistance to ethanol produced.
The ADH to be mutated for use in the present invention may be obtained from any organism as long as it does not contain structural zinc. Of these, xylitol dehydrogenase (XDH) derived from the yeast Pichia stipitis is particularly preferred. The reason is that this enzyme is an essential enzyme in ethanol production from xylose using yeast and has high industrial utility.
構造安定化亜鉛結合部位の酵素への導入は、酵素の構造、特に、耐熱性を向上させるものであれば、酵素のアミノ酸配列のどの位置に導入しても良いし、システインを少なくとも1つ、好ましくは3つ以上導入することが良い。好ましくは、XDHのアミノ酸配列の96番目のセリン、99番目のセリン及び102番目のチロシンの少なくとも１つをシステインに置換したXDHである。最も好ましいものは、96番目のセリンをシステイン、99番目のセリンをシステイン、及び102番目のチロシンをシステインに置換したXDHである。また、構造を安定化、特に熱に対する安定性を向上させるものであればどの様なものをXDHに導入しても良い。例えば、構造安定化亜鉛結合部位以外にループ領域の可塑性を減少させるためのプロリン残基の導入などがある。 The introduction of the structure-stabilized zinc binding site into the enzyme may be introduced at any position in the amino acid sequence of the enzyme as long as it improves the enzyme structure, particularly heat resistance, and at least one cysteine, Preferably three or more are introduced. XDH in which at least one of 96th serine, 99th serine and 102th tyrosine of the amino acid sequence of XDH is substituted with cysteine is preferable. Most preferred is XDH in which the 96th serine is replaced with cysteine, the 99th serine with cysteine, and the 102nd tyrosine with cysteine. Further, any substance may be introduced into XDH as long as it stabilizes the structure, in particular, improves the stability to heat. For example, in addition to the structure-stabilized zinc binding site, there is introduction of a proline residue for reducing the plasticity of the loop region.
本発明で言うところの、固定支持体上に結合した酵素とは、一般的に固定化酵素もしくはアフィニティクロマトグラフィーとしての使用のことであり、例えば、千畑一郎編集、「固定化酵素」、講談社サイエンティフィク；福井三郎ら編集、「酵素工学」、東京化学同人；山崎誠ら編集、「アフィニティクロマトグラフィー」、講談社サイエンティフィク、等に記されている固定化酵素、アフィニティクロマトグラフィーのことを言う。 In the present invention, an enzyme bound on a fixed support is generally used as an immobilized enzyme or affinity chromatography. For example, edited by Ichiro Chibata, “Immobilized enzyme”, Kodansha Sien Tifik; edited by Saburo Fukui et al., “Enzyme Engineering”, Tokyo Chemical Doujin; edited by Makoto Yamazaki et al., “Affinity Chromatography”, Kodansha Scientific, etc. .
次に、実施例により本発明を説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例1 種々の微生物由来のXDHおよびSDHのアミノ酸配列および補酵素依存性の配列依存性
図2Aおよび図2Bに種々の微生物由来のXDHおよびSDHのアミノ酸配列および補酵素依存性の配列依存性の表を示した。
（１）構造安定化亜鉛結合部位について
図2Aにおいて、構造安定化亜鉛結合部位と予測されるサイト１−４のアミノ酸残基に下線を付した。サイト１−４で示される構造安定化亜鉛結合部位は、下に示した6つのパターンに分類できる。
S-S-Y-C (P. stipitis由来XDH)
D-S-M-D (G. mastotermitis由来XDHの精製酵素の解析から、含まれる亜鉛イオンは1個のみ(触媒亜鉛)であることが既知)
C-C-C-C (B. argentifolii由来SDHの結晶構造解析により構造安定化亜鉛があることが既知)
S-S-T-C
R-D-C-T
R-D-C-S (human（ヒト）由来SDHの結晶構造解析により構造安定化亜鉛がないことが既知)
EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention, the scope of the present invention is not limited to these Examples.
Example 1 XDH and SDH amino acid sequences derived from various microorganisms and sequence dependency depending on coenzyme FIGS. 2A and 2B show amino acid sequences of XDH and SDH derived from various microorganisms and sequence dependency depending on coenzyme. A table is shown.
(1) Structure-stabilized zinc binding site In FIG. 2A, the amino acid residues at sites 1-4 that are predicted to be structure-stabilized zinc binding sites are underlined. The structure-stabilized zinc binding sites shown at sites 1-4 can be classified into the six patterns shown below.
SSYC (XDH from P. stipitis)
DSMD (It is known from analysis of purified enzyme of XDH derived from G. mastotermitis that only one zinc ion (catalytic zinc) is contained)
CCCC (It is known that there is structure-stabilized zinc from the crystal structure analysis of SDH derived from B. argentifolii)
SSTC
RDCT
RDCS (It is known that there is no structure-stabilized zinc from crystal structure analysis of human-derived SDH)
これらの比較から、S-S-Y-C型のP. stipitis由来XDHにはR-D-C-S型のhuman由来SDHと同様に構造安定化亜鉛は存在しないことが推測される。また同時に、C-C-C-C型からの推定、およびこれまでに報告された、他の構造安定化亜鉛を含む酵素の上記4つのシステインの部位特異的変異体の解析の結果、どのシステインが1つでも欠けても酵素活性が著しく減少することが報告されていることを考慮すると、構造安定化亜鉛の結合には4つのシステイン残基が必須であることが示唆される。すなわち、P. stipitis由来XDHの擬似結合部位にB. argentifolii由来SDHと同様に４つのシステイン残基、すなわち、96番目のセリンをシステイン、99番目のセリンをシステイン、102番目のチロシンをシステインに置換することで、3つのシステイン残基を新たに導入することで、新たな亜鉛イオンを導入できる可能性がある。これにより、野生型に比べて構造の安定化が期待できる。
これまでに、構造化亜鉛を導入する試みは全くなされておらず新たな試みである。
From these comparisons, it is presumed that the structure-stabilized zinc does not exist in the SSYC-type P. stipitis-derived XDH as in the case of the RDCS-type human-derived SDH. At the same time, as a result of the CCCC type estimation and the previously reported analysis of site-specific mutants of the above four cysteines of enzymes containing other structure-stabilized zinc, any one cysteine is missing. Considering that it has been reported that enzyme activity is significantly reduced, it is suggested that four cysteine residues are essential for the binding of structure-stabilized zinc. In other words, in the pseudo-binding site of P. stipitis-derived XDH, as in B. argentifolii-derived SDH, four cysteine residues are substituted: cysteine at the 96th serine, cysteine at the 99th serine, and cysteine at the 102nd tyrosine. Thus, new zinc ions may be introduced by newly introducing three cysteine residues. Thereby, stabilization of the structure can be expected compared to the wild type.
To date, no attempt has been made to introduce structured zinc, and this is a new attempt.
（２）補酵素認識部位について
図2Bの配列の比較から下線を付したサイト1−12に特徴的なアミノ酸配列を見出した。これらのサイトの配列から以下のことを考察した。
サイト1-6: NAD+、NADP+依存性酵素によらず共通
サイト7: NAD+依存性酵素→アスパラギン酸、NADP+依存性酵素→アラニン
サイト8: NAD+依存性酵素→疎水性残基、NADP+依存性酵素→塩基性残基(アルギニン)
サイト9: NAD+、NADP+依存性酵素によらずセリンか疎水性残基
サイト10: 統一性なし
サイト11: NAD+依存性酵素→統一性なし、 NADP+依存性酵素→塩基性残基(アルギニン)
サイト12: NAD+、NADP+依存性酵素によらず塩基性残基(リジンかアルギニン)
以上の比較より、新規NADP+依存性XDHの創生のために導入する変異部位のターゲットはサイト7、8、11が適している。さらにサイト9も候補に加えたが、これはサイト7、8の近傍ということで多重変異にしたときの効果を期待した。
(2) Coenzyme recognition site A characteristic amino acid sequence was found at the underlined sites 1-12 from the sequence comparison of FIG. 2B. The following was considered from the arrangement of these sites.
Site 1-6: NAD + , regardless of NADP + dependent enzyme Common site 7: NAD + dependent enzyme → aspartic acid, NADP + dependent enzyme → alanine site 8: NAD + dependent enzyme → hydrophobic residue, NADP + dependent enzyme → basic residue (arginine)
Site 9: Serine or hydrophobic residues regardless of NAD + , NADP + dependent enzymes
Site 10: No uniformity Site 11: NAD + dependent enzyme → no uniformity NADP + dependent enzyme → basic residue (arginine)
Site 12: NAD + , a basic residue (lysine or arginine) independent of NADP + dependent enzymes
From the above comparison,
実施例2 野生型PsXDH遺伝子の作製
GeneBankに登録されているPichia stipitis XDH遺伝子（登録番号X55392）を参考にして、下記の2つのプライマーを設計した。
ATGACTGCTAACCCTTCCTTGGTGTTG (27量体)（配列番号３７）
TTACTCAGGGCCGTCAATGAGACACTTG (28量体)（配列番号３８）
PCRは、KOD-Plus DNAポリメラーゼ(東洋紡株式会社)を用いて行われた。10pmolの各プライマーと100ngのP. stipitisゲノムDNAを使い、変性を94℃で15秒間、アニーリングを50℃で30秒間、伸長反応を68℃で1.5分間の条件でPsXDH遺伝子を増幅した。得られたDNA断片を、プラスミドpBluescript SK(-)のSmaI制限酵素切断部位に導入し、これをpBS-XYL2と名付けた。
次に、PsXDH遺伝子の5'末端にBamHI切断部位、3'末端にPstI切断部位を導入するために、2つのプライマー、
CATACggatccgACTGCTAACCCTTCCTTGG (31量体)（配列番号３９）
CTTGGctgcagTTACTCAGGGCCGTCAATGAGACAC (36量体)（配列番号４０）
を準備し、pBS-XYL2プラスミドを用いてPCRを行った。ここで、上記プライマーの小文字の部位は、それぞれBamHIとPstIの切断部位を示す。増幅したDNA断片は、BamHIとPstIで切断した後、同様に処理したプラスミドpQE81-L (Qiagen)に導入した。このプラスミドは、アミノ酸末端に6個のヒスチジンタグを付けてタンパク質を発現させることができる。
Example 2 Production of wild-type PsXDH gene
The following two primers were designed with reference to the Pichia stipitis XDH gene (registration number X55392) registered in GeneBank.
ATGACTGCTAACCCTTCCTTGGTGTTG (27-mer) (SEQ ID NO: 37)
TTACTCAGGGCCGTCAATGAGACACTTG (28-mer) (SEQ ID NO: 38)
PCR was performed using KOD-Plus DNA polymerase (Toyobo Co., Ltd.). Using 10 pmol of each primer and 100 ng of P. stipitis genomic DNA, the PsXDH gene was amplified under conditions of denaturation at 94 ° C for 15 seconds, annealing at 50 ° C for 30 seconds, and extension reaction at 68 ° C for 1.5 minutes. The obtained DNA fragment was introduced into the SmaI restriction enzyme cleavage site of the plasmid pBluescript SK (−) and named pBS-XYL2.
Next, two primers to introduce a BamHI cleavage site at the 5 ′ end of the PsXDH gene and a PstI cleavage site at the 3 ′ end,
CATACggatccgACTGCTAACCCTTCCTTGG (31-mer) (SEQ ID NO: 39)
CTTGGctgcagTTACTCAGGGCCGTCAATGAGACAC (36-mer) (SEQ ID NO: 40)
Was prepared and PCR was performed using the pBS-XYL2 plasmid. Here, the lower case site of the primer indicates the cleavage site of BamHI and PstI, respectively. The amplified DNA fragment was cleaved with BamHI and PstI and then introduced into the similarly treated plasmid pQE81-L (Qiagen). This plasmid can express a protein with a 6 histidine tag at the amino acid end.
実施例3 変異型PsXDH遺伝子の作製
野生型PsXDH遺伝子の作製と同様の方法でプラスミドを作製した。この時、部位特異的にDNA塩基配列の変異を導入するために、two-round PCR法を用いた。使用したDNAの塩基配列を図3A,Bに示した。以下、図4を用いてtwo-round PCR法の原理を概略する。
（１）まず、置換させたいアミノ酸残基に対応する塩基(●、○で示す)を変異させた2本のプライマー、センス鎖(プライマー3)とアンチセンス鎖(プライマー4)、を用意する。プライマー1、2は、野生型PsXDH遺伝子を発現ベクターに組み込むときに用いたもので、5'と3'末端にそれぞれBamHIとPstIの制限酵素サイトを含む。
（２）「1st PCR」
野生型XDH遺伝子を鋳型として、プライマー1と4、プライマー2と3を用いてそれぞれ独立にPCRを行う。結果として、XDH遺伝子の一部が増幅される(断片1、2)。断片を電気泳動で精製することで、鋳型を完全に除くことが重要である。
「2nd PCR」
2つのDNA断片1、2、およびプライマー1、2を混合してPCRを行う。
（３）2つのDNA断片はプライマー3、4の領域をどちらも含んでいるので、断片1のセンス鎖と断片2のアンチセンス鎖はこの部分でアニーリングする。
（４）それぞれの鎖がプライマーかつ鋳型として伸長反応が起こる。ちなみに、（３）では断片1のアンチセンス鎖と断片2のセンス鎖がアニールしたものも生じるが、DNAポリメラーゼの特性により伸長反応は起きない。
（５）最終的に変異の導入されたXDH遺伝子が生じる。
（６）これは、共存するプライマー1、2によりさらに増幅される。
（７）最終的に両末端に制限酵素切断部位を持つ変異XDH遺伝子が作られる。
Example 3 Production of Mutant PsXDH Gene A plasmid was produced in the same manner as the wild type PsXDH gene. At this time, a two-round PCR method was used to introduce site-specific DNA sequence mutations. The base sequence of the DNA used is shown in FIGS. 3A and 3B. Hereinafter, the principle of the two-round PCR method will be outlined with reference to FIG.
(1) First, prepare two primers, a sense strand (primer 3) and an antisense strand (primer 4), in which bases (indicated by ● and ○) corresponding to the amino acid residue to be substituted are mutated.
(2) “1st PCR”
Using the wild-type XDH gene as a template, PCR is performed independently using
"2nd PCR"
PCR is performed by mixing two
(3) Since the two DNA fragments contain both the regions of
(4) An extension reaction occurs with each strand as a primer and template. By the way, in (3), the antisense strand of
(5) The XDH gene into which mutation is finally introduced is generated.
(6) This is further amplified by coexisting
(7) Finally, a mutant XDH gene having restriction enzyme cleavage sites at both ends is produced.
実施例４ ヒスチジンタグのついたPsXDHの発現と精製
野生型PsXDHもしくは変異型PsXDH遺伝子を含むプラスミドを導入した大腸菌DH5αを、50mg/lのアンピシリンを含むスーパーブロス（Super broth） (1リットル当たり12gのペプトン、24gのイースト・エクストラクト、5mlのグリセロール、3.81gのKH2PO4、12.5gのK2HPO4、pH7.0)を用いて、37℃で600nmの吸光度0.6まで培養した。その後、PsXDHを発現誘導するために、最終濃度1mMになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド (IPTG)を添加しさらに6時間培養を続けた。培養終了後に遠心分離で集菌し、培養液1リットル当たり20mlのバッファーA (2mMのMgCl2、0.3MのNaCl、10mMのキシリトール、10mMの2-メルカプトエタノール、10mMのイミダゾールを含むpH8.0の50mM リン酸ナトリウム) に懸濁した。この懸濁液にニワトリ卵白リゾチームを最終濃度2mg/mlになるように添加し、4℃で2時間緩やかに振盪させ溶菌させた。さらに超音波処理により破砕した後、細胞溶解物を4℃で2時間、105000×gで遠心し、その上澄みを同様の条件でさらに6時間遠心した。
Example 4 Expression and purification of histidine-tagged PsXDH E. coli DH5α introduced with a plasmid containing wild-type PsXDH or a mutant PsXDH gene was transformed into Super broth containing 50 mg / l ampicillin (12 g per liter). Peptone, 24 g of yeast extract, 5 ml of glycerol, 3.81 g of KH 2 PO 4 , 12.5 g of K 2 HPO 4 , pH 7.0) were cultured at 37 ° C. to an absorbance of 0.6 at 600 nm. Thereafter, in order to induce expression of PsXDH, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 1 mM, and the culture was further continued for 6 hours. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, and 20 ml of buffer A (2 mM MgCl 2 , 0.3 M NaCl, 10 mM xylitol, 10 mM 2-mercaptoethanol, 10 mM imidazole, pH 8.0 containing 1 ml of culture medium) 50 mM sodium phosphate). To this suspension, chicken egg white lysozyme was added to a final concentration of 2 mg / ml and lysed by gently shaking at 4 ° C. for 2 hours. After further disruption by sonication, the cell lysate was centrifuged at 105000 × g for 2 hours at 4 ° C., and the supernatant was further centrifuged for 6 hours under the same conditions.
細胞抽出液からのPsXDHの精製は、AKTA purifier system (Amersham Biosciences)のクロマトグラフィーシステムで4℃で行った。バッファーAで平衡化したNi-NTA Superflow column (Qiagen)にアプライした。バッファーAで洗浄した後、バッファーB (10% (v/v) のグリセロールを含み、10mMのイミダゾールの代わりに50mMのイミダゾールを含むバッファーA) で洗浄した。PsXDHは、バッファーC (50mMのイミダゾールの代わりに250mMのイミダゾールを含むバッファーB)で溶出させた。PsXDHを含む分画をCentriplus YM-30 (Millipore)で濃縮し、バッファーD (2mMのMgCl2、10mMのキシリトール、1mMのジチオスレイトール (DTT)、50% (v/v)のグリセロールを含むpH8.0の50mM リン酸ナトリウム)に透析した。精製した酵素は、使うまで−35℃で保存した。精製度の確認は、12% 濃度のアクリルアミドゲルを用いたSDS-ゲル電気泳動によって行った。図5Aに精製したPsXDH (各10μg)の電気泳動を示した。泳動した全てのタンパク質は、XDHの推定分子量である40,000ダルトン付近に唯一のバンドが確認された。これは、全てのタンパク質が十分に精製されたことを示している。
Purification of PsXDH from the cell extract was performed at 4 ° C. using a chromatography system of AKTA purifier system (Amersham Biosciences). This was applied to a Ni-NTA Superflow column (Qiagen) equilibrated with buffer A. After washing with buffer A, it was washed with buffer B (buffer A containing 10% (v / v) glycerol and 50 mM imidazole instead of 10 mM imidazole). PsXDH was eluted with buffer C (buffer B containing 250 mM imidazole instead of 50 mM imidazole). Fractions containing PsXDH were concentrated with Centriplus YM-30 (Millipore) and buffer D (2 mM MgCl 2 , 10 mM xylitol, 1 mM dithiothreitol (DTT),
実施例5 酵素活性の測定
PsXDHの活性測定は、反応によって生成されるNAD(P)Hの特異的な340nmの吸収度の増加を35℃でモニターすることによって行った。適量のPsXDHを、50mM MgCl2、300mMのキシリトールを含む50mM Tris-HClバッファー (900μl) に加えた。酵素反応は、100μlの20mM NAD(P)+を加えることで開始した。この酵素の1ユニットは、1μmolのNAD(P)Hを1分間に生成するために必要な量と定義した。Kmおよびkcatは、種々の濃度の基質、補酵素を用いたLineweaver-Burkプロットから算出した。タンパク濃度は、ウシ血清アルブミンを標準物質としてLowry法によって決定した。
図6Aに酵素比活性の結果を示した。WT、すなわち野生型PsXDHの比活性は、P. stipitisから直接精製したXDH同様 (Rizziら (1989) J. Ferment. Bioeng., 67: 20-24参照) NAD+に極めて高い特異性を示した。NADP+ / NAD+の値は、0.001であった。一方、変異体ARS、ART、ARSdRは逆にNADP+に高い活性を示しNADP+ / NAD+の値はそれぞれ7.3、6.8、9.9であった。さらに、WTのNAD+に対する比活性に比べてARS、ART、ARSdRのNADP+に対する比活性は1.7-2.3倍上昇した。
図6Bに野生型および変異体酵素の代謝効率(kcat/Km)を示した。比活性と同様に、ARS、ART、ARSdRのkcat/Km NADは185、1190、83であり、WT (2760)に比べて十分低かった。一方、ARS、ART、ARSdRのkcat/Km NADPは2830、3100、2700であり、WT (0.6)に比べて4500-5200倍上昇した。これらの変異体のkcat/Km NADPは、WTのkcat/Km NADと同等かそれ以上であった。
最終的に、ARS、ART、ARSdRのNADP+のNAD+に対する代謝効率の比([kcat/Km NADP] / [kcat/Km NAD])は、WTに比べて劇的に上昇した(12000-150000倍)。
Example 5 Measurement of enzyme activity
The activity of PsXDH was measured by monitoring the increase in specific 340 nm absorbance of NAD (P) H produced by the reaction at 35 ° C. An appropriate amount of PsXDH was added to 50 mM Tris-HCl buffer (900 μl) containing 50 mM MgCl 2 and 300 mM xylitol. The enzymatic reaction was started by adding 100 μl of 20 mM NAD (P) + . One unit of this enzyme was defined as the amount required to produce 1 μmol of NAD (P) H per minute. K m and k cat were calculated from Lineweaver-Burk plots using various concentrations of substrate and coenzyme. The protein concentration was determined by the Lowry method using bovine serum albumin as a standard substance.
FIG. 6A shows the result of enzyme specific activity. The specific activity of WT, wild-type PsXDH, was similar to XDH purified directly from P. stipitis (see Rizzi et al. (1989) J. Ferment. Bioeng., 67: 20-24) and showed very high specificity for NAD + . The value of NADP + / NAD + was 0.001. On the other hand, mutants ARS, ART, ARSdR the value of NADP + / NAD + showed high activity NADP + conversely were respectively 7.3,6.8,9.9. Furthermore, the specific activities of ARS, ART, and ARSdR for NADP + increased 1.7-2.3 times compared to the specific activity of WT for NAD + .
FIG. 6B shows the metabolic efficiency (k cat / K m ) of wild-type and mutant enzymes. Similar to the specific activity, the k cat / K m NAD of ARS, ART and ARSdR were 185, 1190 and 83, which was sufficiently lower than that of WT (2760). On the other hand, k cat / K m NADP of ARS, ART, and ARSdR were 2830, 3100, and 2700, 4500-5200 times higher than WT (0.6). The k cat / K m NADP of these mutants was equal to or higher than that of WT k cat / K m NAD .
Finally, the ratio of metabolic efficiency of ARS, ART, and ARSdR to NADP + to NAD + ([k cat / K m NADP ] / [k cat / K m NAD ]) increased dramatically compared to WT (12000-150000 times).
実施例6 変異型PsXDH遺伝子C4の作製
PsXDH遺伝子の擬似構造亜鉛（structural zinc）結合部位に3つのシステイン残基を導入するために、以下の2つのプライマーを設計した。
GGTATTCCATGTAGATTCTGTGACGAATGTAAGAGCGG (38量体)(配列番号５１）
CCGCTCTTACATTCGTCACAGAATCTACATGGAATACC (38量体)(配列番号６２)
ここで、上記プライマーの下線を付した部位は変異導入箇所を示す。
さらに、実施例2でPsXDH遺伝子の5'末端にBamHI切断部位、3'末端にPstI切断部位を導入するため作製した2本のプライマー（配列番号３９および配列番号４０）と、実施例2で作製した野生型PsXDH遺伝子が組み込まれたプラスミドpQE81-Lを用いて、実施例3に従い変異体C4遺伝子を作製した (図3A,B)。この遺伝子はWT遺伝子同様、プラスミドpQE81-Lに導入された。
Example 6 Production of Mutant PsXDH Gene C4
In order to introduce three cysteine residues into the structural zinc binding site of the PsXDH gene, the following two primers were designed.
GGTATTCCA TGT AGATTC TGT GACGAA TGT AAGAGCGG (38-mer) (SEQ ID NO: 51)
CCGCTCTT ACA TTCGTC ACA GAATCT ACA TGGAATACC (38-mer) (SEQ ID NO: 62)
Here, the underlined site of the primer indicates a mutation introduction site.
Furthermore, the two primers (SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 40) prepared in Example 2 for introducing the BamHI cleavage site at the 5 ′ end and the PstI cleavage site at the 3 ′ end of the PsXDH gene were prepared in Example 2. Using the plasmid pQE81-L into which the wild-type PsXDH gene was incorporated, a mutant C4 gene was prepared according to Example 3 (FIGS. 3A and B). This gene, like the WT gene, was introduced into the plasmid pQE81-L.
実施例7 変異型PsXDH遺伝子C4/ARSとC4/ARSdRの作製(図3A,B)
ARSとARSdR変異体にC4と同様の変異を導入するために、以下のようにXDH遺伝子内に存在する制限酵素部位を用いたDNA断片交換を行った。
C4とARS、ARSdRの変異部位の間にはKpnIの切断部位が1箇所ある。これらの遺伝子はBamHIとPstIの制限酵素サイトでプラスミドpQE81-Lに導入されている。
C4、ARS、ARSdRを組み込んだプラスミドpQE81-LをそれぞれBamHIとKpnIで切断する。
ARS、ARSdRの上流半分に相当するDNA断片を、C4の上流半分を除去したプラスミドpQE81-Lに導入し、C4/ARSとC4/ARSdR遺伝子を含むプラスミドpQE81-Lを構築する。
C4、C4/ARS、C4/ARSdR変異型XDHは大腸菌DH5αに形質転換され、実施例4に従い精製した。SDS-ゲル電気泳動の結果は、これらのタンパク質はWT同様に精製されたことを示す(図5A)。
Example 7 Production of mutant PsXDH genes C4 / ARS and C4 / ARSdR (FIGS. 3A, B)
In order to introduce mutations similar to C4 into ARS and ARSdR mutants, DNA fragment exchange was performed using restriction enzyme sites present in the XDH gene as follows.
There is one KpnI cleavage site between C4 and the mutation sites of ARS and ARSdR. These genes are introduced into the plasmid pQE81-L at the restriction enzyme sites of BamHI and PstI.
Plasmid pQE81-L incorporating C4, ARS, and ARSdR is cut with BamHI and KpnI, respectively.
A DNA fragment corresponding to the upstream half of ARS and ARSdR is introduced into a plasmid pQE81-L from which the upstream half of C4 has been removed to construct a plasmid pQE81-L containing C4 / ARS and C4 / ARSdR genes.
C4, C4 / ARS and C4 / ARSdR mutant XDH were transformed into E. coli DH5α and purified according to Example 4. The results of SDS-gel electrophoresis show that these proteins were purified in the same way as WT (FIG. 5A).
実施例8 C4、C4/ARS、C4/ARSdR変異型XDHの酵素活性の測定
実施例4に従いその酵素活性を測定した。C4は、WTと比較してNAD+、NADP+の両方の比活性(図6A)、代謝効率(図6B)に大きな変化を及ぼさなかった。すなわち、NADP+のNAD+に対する代謝効率の比([kcat/Km NADP] / [kcat/Km NAD])は、WTとほぼ同じであり十分にNAD+依存性であった。
一方、C4/ARS、C4/ARSdRのNADP+に対するkcatは、ARS、ARSdRに比べてさらにそれぞれ5倍、4倍上昇し、そのkcat/Km NADPも約2倍増加した。一方で、kcat/Km NADはARS、ARSdR同様低い値を維持した。結局、C4/ARS、C4/ARSdRの([kcat/Km NADP] / [kcat/Km NAD])は、WTに比べて710000倍、510000倍という劇的な上昇となり、これはARS、ARSdRよりさらにNADP+に対する特異性が増したことを示している。
Example 8 Measurement of enzyme activity of C4, C4 / ARS, C4 / ARSdR mutant XDH The enzyme activity was measured according to Example 4. C4 did not significantly change the specific activity of both NAD + and NADP + (FIG. 6A) and metabolic efficiency (FIG. 6B) compared to WT. That is, the ratio of metabolic efficiency of NADP + to NAD + ([k cat / K m NADP ] / [k cat / K m NAD ]) was almost the same as WT and was sufficiently NAD + dependent.
On the other hand, k cat for C4 / ARS and C4 / ARSdR with respect to NADP + increased 5 times and 4 times, respectively, compared with ARS and ARSdR, and k cat / K m NADP also increased about 2 times. On the other hand, k cat / K m NAD maintained a low value like ARS and ARSdR. In the end, C4 / ARS and C4 / ARSdR ([k cat / K m NADP ] / [k cat / K m NAD ]) increased dramatically by 710000 times and 510000 times compared to WT. This shows that the specificity for NADP + is further increased than that of ARSdR.
実施例9 WTおよび変異型PsXDHの円二色性による熱安定性の測定
2mMのMgCl2、10mMのキシリトール、1mMのジチオスレイトール (DTT)、50% (v/v)のグリセロールを含むpH8.0の50mM リン酸ナトリウムバッファー中で−35℃で保存されていた精製酵素は、2mMのMgCl2と1mMのジチオスレイトール (DTT)を含むpH8.0の50mM リン酸ナトリウムバッファーに対して透析された。その後、同じバッファーで1mg/mlのタンパク質濃度に合わせた。温度変化(温度範囲; 10-70℃、温度上昇速度; 1℃/min)に伴う二次構造(特にα-へリックス)の崩壊は、固定波長(220nm)における円二色性(CD)スペクトルによって2mm石英セルを用いて追跡した。熱安定性は、全体のα-ヘリックスの半分が崩壊する温度(Tm)で比較した(図7)。
C4のTmは、WTに比べて4.4℃上昇した。同様に、ARSからC4/ARS、ARSdRからC4/ARSdRへの変異もまたTmの上昇をもたらし、特に前者の場合7.7℃も増加した。これらの結果は、C4の変異の導入は明らかにPsXDHの熱安定性を増加させることを示している。
Example 9 Measurement of thermal stability by circular dichroism of WT and mutant PsXDH
Purified enzyme stored at -35 ° C in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 8.0, containing 2 mM MgCl 2 , 10 mM xylitol, 1 mM dithiothreitol (DTT), 50% (v / v) glycerol Was dialyzed against 50 mM sodium phosphate buffer pH 8.0 containing 2 mM MgCl 2 and 1 mM dithiothreitol (DTT). Thereafter, the protein concentration was adjusted to 1 mg / ml with the same buffer. Collapse of secondary structure (especially α-helix) with temperature change (temperature range; 10-70 ℃, temperature rise rate; 1 ℃ / min) is a circular dichroism (CD) spectrum at a fixed wavelength (220nm) Followed by a 2 mm quartz cell. Thermal stability was compared at the temperature (T m ) at which half of the total α-helix decays (Figure 7).
Tm of C4 increased by 4.4 ° C compared to WT. Similarly, mutations from ARS to C4 / ARS and ARSdR to C4 / ARSdR also resulted in an increase in Tm , especially in the former case by an increase of 7.7 ° C. These results indicate that the introduction of the C4 mutation clearly increases the thermal stability of PsXDH.
実施例10 熱変性に伴う酵素活性の消失の測定
保存されていた精製酵素は、2mMのMgCl2と1mMのジチオスレイトール (DTT)を含むpH8.0の50mM リン酸ナトリウムバッファー中で透析した。その後、同じバッファーで活性測定可能な適当なタンパク質濃度に合わせた。酵素溶液は、いろいろな温度で10分間インキュベート後すみやかに氷上に戻し10分間放置した。その後、WTとC4は2mM NAD+、C4/ARSとC4/ARSdRは2mM NADP+を補酵素として、35℃で残存活性を測定した。測定値は、インキュベートしていない酵素の活性を100%とした相対値で表した(図8)。
例えば、45℃でのインキュベートによってWT(−○−)、ARS(−△−)、ARSdR(−□−)は完全に失活する。一方、同じ処理後でもC4(−●−)、C4/ARS(−▲−)、C4/ARSdR(−■−)は50-70%の活性を維持していた。CDスペクトル解析同様、この結果もまたC4の変異がPsXDHの安定性を上昇させることを示している。
Example 10 Measurement of disappearance of enzyme activity accompanying heat denaturation The stored purified enzyme was dialyzed in a 50 mM sodium phosphate buffer at pH 8.0 containing 2 mM MgCl 2 and 1 mM dithiothreitol (DTT). Thereafter, the protein was adjusted to an appropriate protein concentration capable of measuring the activity in the same buffer. The enzyme solution was incubated at various temperatures for 10 minutes, then immediately returned to ice and left for 10 minutes. Then, WT and C4 are 2mM NAD +, C4 / ARS and C4 / ARSdR as
For example, incubation at 45 ° C. completely inactivates WT (− ◯ −), ARS (−Δ−), and ARSdR (− □ −). On the other hand, even after the same treatment, C4 (-●-), C4 / ARS (-▲-), and C4 / ARSdR (-■-) maintained 50-70% activity. Similar to CD spectral analysis, this result also indicates that C4 mutations increase the stability of PsXDH.
実施例11 WTおよび変異型PsXDHの亜鉛原子の定量
保存していた精製酵素は、微量の混入金属イオンを除くために、50mM リン酸ナトリウムバッファー(pH 8.0)で平衡化したHiLoad 16/60 Superdex 200 pg カラム(Amersham Biosciences)でゲル濾過した。その後、同じバッファーで約0.5mg/mlのタンパク質濃度に合わせた。酵素中の亜鉛の定量は、原子吸光スペクトル(波長; 約214.1nm)で行った。標準亜鉛溶液で検量線を作成し、それに基づいて各酵素溶液の測定値から亜鉛濃度を算出した。これを、各酵素溶液のタンパク質濃度から求めたサブユニット濃度で割ることで、1サブユニットあたりの亜鉛原子の数を算出した(図9)。
WTの亜鉛含有量は、0.93 (mol of zinc / mol of subunit)でありその値は1.0に極めて近かった。同様にARS、ARSdRではそれぞれ0.97、0.90であり、これらの結果はWTには1つのみの亜鉛原子(おそらく触媒亜鉛（catalytic zinc）に相当)が含まれており、またARS、ARSdRの変異ではこれに変化を及ぼさないことを示している。一方、C4、C4/ARS、C4/ARSdRの亜鉛含有量はそれぞれ1.86、1.73、1.86 (mol of zinc / mol of subunit)であり2.0に近かった。これは、C4の変異によってPsXDHが新たな亜鉛原子を獲得したことを強く示唆した。
Example 11 Quantification of zinc atoms in WT and mutant PsXDH The stored purified enzyme was
The zinc content of WT was 0.93 (mol of zinc / mol of subunit) and its value was very close to 1.0. Similarly, ARS and ARSdR are 0.97 and 0.90, respectively, and these results show that WT contains only one zinc atom (probably equivalent to catalytic zinc), and ARS and ARSdR mutations This shows no change. On the other hand, the zinc contents of C4, C4 / ARS, and C4 / ARSdR were 1.86, 1.73, and 1.86 (mol of zinc / mol of subunit), respectively, which were close to 2.0. This strongly suggested that PsXDH acquired a new zinc atom by mutation of C4.
実施例12 WTおよび変異型PsXDHの大腸菌内での発現量の比較
実施例3に従い準備した細胞溶解液を各10μgを、0.1μgの精製されたWT(対照)と共に12% 濃度のアクリルアミドゲルを用いたSDS-ゲル電気泳動によって分離した。ゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜(Hybond-C; Amersham Biosciences)にエレクトロブロッティングした後、WTおよび変異型PsXDHのヒスチジンタグに対するモノクローナル抗体(RGS His HRP antibody; Qiagen)と交差反応させた。本抗体は西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼとのフュージョン抗体であり、ECL-ウエスタンブロッティング定量システム(Amersham Biosciences) による蛍光発色で同定した(図5B)。
大腸菌の中でのC4の発現量は、WTと比べて約3倍となった。一方、ARS、ARSdRの発現量はWTの約1/2だった。この低い発現量はC4変異を導入することで増加に転じ、C4変異体と同程度の高発現になった。これは、in vitroにおける安定性とよく相関していた。
Example 12 Comparison of expression levels of WT and mutant PsXDH in
The expression level of C4 in E. coli was about 3 times that of WT. On the other hand, the expression level of ARS and ARSdR was about 1/2 of WT. This low expression level started to increase with the introduction of the C4 mutation, and became as high as the C4 mutant. This correlated well with in vitro stability.
WT対C4.
この結果は、システインを他の残基に置換することで、構造亜鉛（structural zinc）を除去しようと試みた結果と大きく異なっていた。この場合、4つのシステインのどれか1つの欠損でもその変異体の酵素活性は野生型に比べて全く無くなる(Jelokov痰 1994) Eur. J. Biochem., 225: 1015-1019)か4%以下に落ち込む(Wangら(1999) Biosic. Biotech. Biochem., 63: 2216-2218)。これは、構造亜鉛（structural zinc）が高次構造維持とそれに伴う活性の維持の両方に関与していることを示唆する。一方、WTにもう1つの 亜鉛原子を加えてもその活性には何ら変化が無い。C4の中の付加された亜鉛原子は、安定性のみに寄与する「真の」構造亜鉛（structural zinc）と言うことができる。
WT vs C4.
This result was very different from the results of attempts to remove structural zinc by replacing cysteine with other residues. In this case, deletion of any one of the four cysteines completely eliminates the enzyme activity of the mutant compared to the wild type (Jelokov 1994) Eur. J. Biochem., 225: 1015-1019) or less than 4% Depressed (Wang et al. (1999) Biosic. Biotech. Biochem., 63: 2216-2218). This suggests that structural zinc is involved in both maintaining the higher order structure and the associated activity. On the other hand, adding another zinc atom to WT does not change its activity. The added zinc atom in C4 can be referred to as “true” structural zinc, which contributes only to stability.
ARS対C4/ARSおよびC4/ARSdR
構造亜鉛（structural zinc）の導入は、C4の熱安定性の上昇という性質をそのまま維持しつつARS、ARSdRのNADP+依存性の効果をさらに増強した。加えて、このin vitroでの安定化はin vivoにおける変異体酵素の高発現を導いているように思われる。この傾向は、これらの変異体を酵母内で発現させたときも保持されると思われ、細胞内でのタンパク質の寿命を延ばし、より効率的なエタノール生産に役立つことが期待される。
ARS vs. C4 / ARS and C4 / ARSdR
The introduction of structural zinc further enhanced the NADP + -dependent effect of ARS and ARSdR while maintaining the C4 thermal stability increase. In addition, this in vitro stabilization appears to lead to high expression of the mutant enzyme in vivo. This tendency is expected to be maintained when these mutants are expressed in yeast, and it is expected to extend the life of proteins in cells and contribute to more efficient ethanol production.
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