JP4448947B2 - Peptide having nanofiber forming ability, and peptide nanofiber - Google Patents
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Description
本発明は、ナノファイバー形成能を有するペプチド、当該ペプチドにより構成されるナノファイバー、当該ペプチドの塩、当該ペプチドの誘導体、当該誘導体の塩、及び当該ペプチドをコードする核酸に関する。特に、少ない残基数のペプチドに関する。 The present invention relates to a peptide having nanofiber-forming ability, a nanofiber composed of the peptide, a salt of the peptide, a derivative of the peptide, a salt of the derivative, and a nucleic acid encoding the peptide. In particular, it relates to peptides with a small number of residues.
1．ボトムアップテクノロジーとペプチド／タンパク質自己組織化
近年「ナノテクノロジー」の研究分野が急速に進展しており、大きな物質を削ってナノメートルにまで微細化していく「トップダウン」型の手法を用いた半導体素子や大規模集積回路（LSI）などの研究開発が盛んに行われている。しかしこれとは別に、生物の細胞に見られるような生体分子が自己組織化し、ナノメートルスケールの構造体を構成するシステムをモデルとした材料開発の研究も大変注目を集めている。
1． Bottom-Up Technology and Peptide / Protein Self-Assembly In recent years, the research field of “nanotechnology” has been rapidly developing, and semiconductors using a “top-down” type technique that cuts large materials into nanometers. Research and development of devices and large-scale integrated circuits (LSIs) are actively conducted. However, apart from this, research on material development using a system that forms a nanometer-scale structure by self-organizing biomolecules such as those found in living cells is also attracting a great deal of attention.
2．ペプチド／タンパク質の生分解性
自然界のタンパク質や核酸などの生体分子で材料を形成させる利点としては、物質自体、そしてその自発的な組織化による材料の製法が自然の営みに極めて近いこと、また生分解性であることなどから、地球環境や生物（特に人間）に対して負荷が少ないという点が挙げられる。
2． Peptide / protein biodegradability Advantages of forming materials with biomolecules such as natural proteins and nucleic acids are that the substance itself and the process of producing the material by its spontaneous organization are very close to natural operations. Because of its degradability, it can be mentioned that it has less burden on the global environment and living organisms (especially humans).
3．多様性と合成における単一性
特にタンパク質は構成するアミノ酸の種類が20種類存在し、形成される構造やその機能は多種多様であり、タンパク質を利用したナノテクノロジーは様々な分野において必要になってくると考えられる。
3． Diversity and unity in synthesis In particular, proteins have 20 types of amino acids, and the structures and functions that are formed are diverse. Nanotechnology using proteins is required in various fields. It is thought to come.
4．タンパク質／ペプチドについて
図１は、アミノ酸がペプチド結合してタンパク質を形成し、このタンパク質が最終的な立体構造をとる様子を示した図である。生体高分子であるタンパク質は、20種類のアミノ酸（比較的単純な有機分子）（図１（a））が脱水縮合により一次元的に結合した鎖状構造（図１（b））を有し、これが自発的に折り畳まって複雑な立体構造（図１（c））を形成する。タンパク質は生体中で様々な機能を担う重要な生体物質であり、例としてヒトの場合、およそ数万種類のタンパク質が生体内で機能しているといわれている。またそれぞれのタンパク質はアミノ酸配列に従って固有の立体構造をもっており、比較的規則的な二次構造から構成されている。その主な二次構造はα螺旋構造およびβ-シート構造であり、立体構造中のほとんどがα螺旋になっているもの（αタンパク質）、ほとんどがβ-シートであるもの（βタンパク質）、また両者が混ざったもの（α/βタンパク質）などがある。このようにタンパク質は多種多様な立体構造をもち、その立体構造がそれぞれのタンパク質の機能を決定している。
Four. About Protein / Peptide FIG. 1 is a diagram showing a state in which amino acids form peptide bonds to form a protein, and this protein takes a final three-dimensional structure. Proteins that are biopolymers have a chain structure (Fig. 1 (b)) in which 20 amino acids (relatively simple organic molecules) (Fig. 1 (a)) are linked one-dimensionally by dehydration condensation. This spontaneously folds to form a complex three-dimensional structure (FIG. 1 (c)). Proteins are important biological substances that have various functions in the body. For example, in the case of humans, it is said that approximately tens of thousands of proteins function in vivo. Each protein has a unique three-dimensional structure according to the amino acid sequence, and is composed of a relatively regular secondary structure. Its main secondary structure is α-helical structure and β-sheet structure, most of which are α-helical (α protein), most β-sheet (β protein), There is a mixture of both (α / β protein). Thus, proteins have a wide variety of three-dimensional structures, and the three-dimensional structures determine the functions of the respective proteins.
5．病原性アミロイドについて
ところが最近、１種類あるいは多種類のタンパク質が本来とるべき固有の立体構造に折り畳まれずに、間違って折り畳まれた結果、タンパク質同士が繊維状に凝集する現象が発見された。これらの多くは生体内において毒性をもち、アルツハイマー病やBSE（いわゆる狂牛病）などの疾患と関係しているといわれている。このようなタンパク質やペプチドの自己組織化によって形成されたナノサイズの繊維状集合体をアミロイド線維と呼ぶ。図２はアミロイド線維形成の様子を示す模式図である。複数のタンパク質が繊維状に凝集する現象では、多くの場合、線維を形成している部分はβ-シート構造になっており、本来天然構造においてβ-シートを持たないタンパク質であっても一度線維を形成すると、線維形成に関わる部分はβ-シート構造を持つ。結果として図２（a）、（b）に示すように、分子間の水素結合によりβ-シートが多数連なり線維を形成すると考えられており、アミロイド線維に特徴的な構造である。アミロイド線維はナノメートルスケールで非常に規則正しい構造をしており、工業的または産業的利用が期待されているにもかかわらず、いまだ確立されていないのが現状である。
Five. About pathogenic amyloid Recently, however, a phenomenon has been discovered in which proteins are aggregated in the form of fibers as a result of one or more proteins not being folded into their original three-dimensional structure but folded in error. Many of these have toxicity in vivo and are said to be related to diseases such as Alzheimer's disease and BSE (so-called mad cow disease). A nano-sized fibrous aggregate formed by such self-assembly of proteins and peptides is called amyloid fiber. FIG. 2 is a schematic diagram showing the state of amyloid fibril formation. In the phenomenon where a plurality of proteins aggregate in a fibrous form, in many cases, the portion forming the fiber has a β-sheet structure, and even if the protein originally has no β-sheet in the natural structure, it is once a fiber. The part involved in fiber formation has a β-sheet structure. As a result, as shown in FIGS. 2 (a) and 2 (b), it is considered that a large number of β-sheets are formed by intermolecular hydrogen bonding to form fibers, which is a characteristic structure of amyloid fibrils. Although amyloid fibrils have a very regular structure on the nanometer scale, they are not yet established even though they are expected to be industrially or industrially used.
6．アミロイド線維の性質
一般的に形成されたアミロイド線維の多くは、非常に安定であり、高温状態（百度前後）でも壊れることがない。これはアミロイド線維が形成する際に、水素結合が凝集によって水溶液から隔離され、水素結合が水分子によって壊されにくい状態になっているからであると考えられる。
6． Properties of amyloid fibrils Many of the commonly formed amyloid fibrils are very stable and do not break even at high temperatures (around one hundred degrees). This is considered to be because when amyloid fibrils are formed, hydrogen bonds are segregated from the aqueous solution by aggregation, and the hydrogen bonds are not easily broken by water molecules.
7．アミロイド線維（ペプチドナノファイバー）の産業応用の可能性
この性質は工業的な観点から見ると、繊維状の形態を保ちつつ、さらに種々の加工を行う際に重要である。さらにタンパク質やペプチドにより形成されるナノサイズの繊維状集合体（以下、「ナノファイバー」という）は、生体分子を用いた天然素材であるという観点から生体適合材料としての医療分野、そしてナノサイズであるという観点から電子部品材料やナノスケールの構造材としてエレクトロニクス、ナノテクノロジー分野など、さまざまな応用が今後期待されると考えられる。
7． Possibility of industrial application of amyloid fiber (peptide nanofiber) From an industrial viewpoint, this property is important when various processes are performed while maintaining a fibrous form. Furthermore, nano-sized fibrous aggregates (hereinafter referred to as “nanofibers”) formed by proteins and peptides are natural materials using biomolecules, and are used in the medical field as biocompatible materials, and in nanosize. From a certain point of view, various applications such as electronics and nanotechnology fields are expected in the future as electronic component materials and nanoscale structural materials.
病原性のアミロイド線維は、比較的大きなタンパク質（アミノ酸残基数が数十残基〜数百残基のもの）の一部あるいは全体がβ-シート構造をもって凝集したものであるが、ナノファイバーとして工業的に利用する上ではファイバー形成に必要な部分のみの短いペプチド（アミノ酸残基数が数残基〜数十残基程度連なったもの）のほうが都合良い。その理由の１つはFmoc法等を利用した現行の固相ペプチド合成法では、合成する際に配列が長いほど合成効率が指数関数的に悪くなり、また合成に要する時間も長くなるためである。従って最終的に産業展開を見据えた場合、合成効率と合成時間の点からペプチドの残基数は短いほど都合良いことになる。また２つ目の理由としては合成されたペプチドの精製分離の容易さにある。構成アミノ酸残基数が多くなればなるほど、目的とするペプチドに近い分子量の副生成物も多くなり精製分離が困難になるが、短いペプチドになると副生成物も少なくなり容易に精製分離することができる。 Pathogenic amyloid fibrils are aggregates of part or all of relatively large proteins (having several tens to hundreds of amino acid residues) with a β-sheet structure. For industrial use, a short peptide having only a portion necessary for fiber formation (a sequence in which the number of amino acid residues is several to several tens of residues) is more convenient. One of the reasons is that in the current solid-phase peptide synthesis method using the Fmoc method or the like, the synthesis efficiency becomes exponentially worse as the sequence becomes longer, and the time required for synthesis becomes longer. . Therefore, when looking at the industrial development in the end, the shorter the number of residues of the peptide, the better from the viewpoint of synthesis efficiency and synthesis time. The second reason is the ease of purification and separation of the synthesized peptide. The greater the number of constituent amino acid residues, the more by-products with a molecular weight close to the target peptide and the more difficult the purification separation, but the shorter the peptide, the fewer by-products and the easier purification and separation. it can.
従来の合成高分子などの繊維と比較して、ペプチドナノファイバーはその製造において環境に対して負荷の高い有機溶媒など使用せず、自然環境に極めて近い水溶媒系で製造することができる。さらに外部から熱などのエネルギーを加えることなく常温で自己組織化的にナノファイバーが形成され、またその形成時における副反応もなく、100％に近い効率で目的のナノファイバーが得られることから、無駄のない製造システムであるといえる。さらにファイバーを構成するペプチド自身が生体分子で生分解性であることから、地球環境や生物に対して悪影響を与えることが非常に少ない。 Compared with fibers such as conventional synthetic polymers, peptide nanofibers can be produced in an aqueous solvent system that is very close to the natural environment without using an organic solvent that has a high environmental impact. Furthermore, nanofibers are formed in a self-organized manner at room temperature without applying energy such as heat from the outside, and there is no side reaction at the time of formation, and the target nanofiber can be obtained with an efficiency close to 100%. It can be said that this is a lean manufacturing system. Furthermore, since the peptide itself constituting the fiber is a biomolecule and biodegradable, it has very little adverse effect on the global environment and organisms.
ナノファイバーに種々の機能性分子（酵素、金属または金属イオン、有機ELなどの機能性有機分子など）を付加させる場合、付加が容易な反応性の高い側鎖をもつアミノ酸が多数存在し、それらを含んだペプチド配列からナノファイバーを製造することも可能である。またナノファイバーを単純なペプチドで作ることで、ナノファイバーの構造を比較的容易に類推することができ、ファイバー上の特定位置に機能性分子を付加させることもできると考えられる。さらにナノファイバーはβ-シートが連なった構造をしていると考えられており、これはナノスケールレベルで制御された超精密構造材と考えられ、機能性分子をナノレベルで制御して配列させることも可能であり、工業的および産業的に非常に重要なテクノロジーになると考えられる。 When various functional molecules (enzymes, metals or metal ions, functional organic molecules such as organic EL) are added to nanofibers, there are many amino acids with highly reactive side chains that can be easily added. It is also possible to produce nanofibers from peptide sequences containing. In addition, by making nanofibers with simple peptides, the structure of nanofibers can be estimated relatively easily, and functional molecules can be added to specific positions on the fibers. Furthermore, nanofibers are thought to have a structure in which β-sheets are linked. This is considered to be an ultra-precise structural material controlled at the nanoscale level, and functional molecules are arranged at the nanometer level. It is also possible to become a technology that is very important industrially and industrially.
このようにファイバー形成能を有するペプチドは、ナノファイバーとしての有用性が期待される物質であり、ナノファイバー形成能を有する新規ペプチド配列の発見は、ナノファイバーの応用研究の発展に貢献するところが大きいことは明らかである。本発明は工業的な利用度が高い、比較的短いペプチドでナノファイバー形成能を有する新規ペプチド及び当該ペプチドにより構成されるペプチドナノファイバーを提供することを目的とする。 Thus, peptides having fiber-forming ability are substances that are expected to be useful as nanofibers, and the discovery of novel peptide sequences having nanofiber-forming ability greatly contributes to the development of applied research on nanofibers. It is clear. An object of the present invention is to provide a novel peptide having a nanofiber forming ability with a relatively short peptide having high industrial utility, and a peptide nanofiber composed of the peptide.
本発明は、上記目的を達成するために、次のものを提供する。 In order to achieve the above object, the present invention provides the following.
（１）ナノファイバー形成能を有し、Xaa-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Xaa（配列番号１）（Ｎ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa１であり、Ｃ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa２である。ただしXaa１、Xaa２がともにLysである場合を除く。）のアミノ酸配列からなるペプチド。 (1) It has the ability to form nanofibers, and Xaa-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Xaa (SEQ ID NO: 1) (N-terminal Xaa is an arbitrary amino acid residue Xaa 1 and C-terminal Xaa is Any amino acid residue Xaa 2 ( except when Xaa 1 and Xaa 2 are both Lys)).
（２）Xaa１が酸性アミノ酸残基であり、Xaa２が塩基性アミノ酸残基である（１）に記載のペプチド。 (2) The peptide according to ( 1 ), wherein Xaa 1 is an acidic amino acid residue and Xaa 2 is a basic amino acid residue.
（３）Xaa１がGluまたはAspであり、Xaa２がLys,His,Argのいずれかである（２）に記載のペプチド。 (3) The peptide according to (2), wherein Xaa 1 is Glu or Asp and Xaa 2 is any one of Lys, His, and Arg.
（４）Xaa１及びXaa２がそれぞれAsp,Glu,Lys,His及びArgからなる群から選択される（１）に記載のペプチド。 (4) The peptide according to ( 1 ), wherein Xaa 1 and Xaa 2 are each selected from the group consisting of Asp, Glu, Lys, His, and Arg.
（５）Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号３）、 Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Glu（配列番号４）、His-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-His（配列番号６）、Arg-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg（配列番号７）、Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg（配列番号８）のうち、いずれかのアミノ酸配列からなる（１）に記載のペプチド。 (5) Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys (SEQ ID NO: 3), Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Glu (SEQ ID NO: 4), His-Phe-Ile-Val-Ile -Phe-His (SEQ ID NO: 6), Arg-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg (SEQ ID NO: 7), Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg (SEQ ID NO: 8) The peptide according to (1), comprising any amino acid sequence.
（６）ナノファイバー形成能を有し、Xaa-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Xaa（配列番号１）（Ｎ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa１であり、Ｃ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa２である。）のアミノ酸配列において、Xaa１およびXaa２を以外のアミノ酸残基の１個若しくは数個のアミノ酸残基がCysに置換されたアミノ酸配列からなるペプチド。 (6) Nanofiber-forming ability, Xaa-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Xaa (SEQ ID NO: 1) (N-terminal Xaa is an arbitrary amino acid residue Xaa 1 and C-terminal Xaa is A peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acid residues other than Xaa 1 and Xaa 2 are substituted with Cys in the amino acid sequence of any amino acid residue Xaa 2 .
（７）Glu-Phe-Cys-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号９）、Glu-Phe-Ile-Cys-Ile-Phe-Lys（配列番号１０）、Glu-Phe-Ile-Val-Cys-Phe-Lys（配列番号１１）のうち、いずれかのアミノ酸配列からなる（６）に記載のペプチド。 (7) Glu-Phe-Cys-Val-Ile-Phe-Lys (SEQ ID NO: 9), Glu-Phe-Ile-Cys-Ile-Phe-Lys (SEQ ID NO: 10), Glu-Phe-Ile-Val-Cys The peptide according to (6), comprising any amino acid sequence among -Phe-Lys (SEQ ID NO: 11).
（８）（１）乃至（７）のいずれかに記載のペプチドにより構成されるナノファイバー。 (8) A nanofiber composed of the peptide according to any one of (1) to (7).
（９）ナノファイバー形成能を有する（１）乃至（７）のいずれかに記載のペプチドの塩。 (9) The peptide salt according to any one of (1) to (7), which has nanofiber-forming ability.
（１０）ナノファイバー形成能を有する（１）乃至（７）のいずれかに記載のペプチドの誘導体。 (10) The peptide derivative according to any one of (1) to (7), which has nanofiber-forming ability.
（１１）ナノファイバー形成能を有する（１０）に記載のペプチドの誘導体の塩。 (11) The salt of the peptide derivative according to (10) having nanofiber-forming ability.
（１２）（１）乃至（７）のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。尚、本明細書において、ナノファイバーとは、長さ方向に対して垂直な断面の長径（以下、単に長径ともいう）が１００nm以下である線維をいう。長径の下限値はファイバーが形成され得る値であれば良く限定はないが、例えばナノファイバーの長径が１nmから１００nmであり得る。また、ナノファイバーの長さは限定されない。 (12) A nucleic acid encoding the peptide according to any one of (1) to (7). In this specification, the nanofiber refers to a fiber having a major axis (hereinafter, also simply referred to as a major axis) having a cross section perpendicular to the length direction of 100 nm or less. The lower limit of the major axis is not particularly limited as long as the fiber can be formed. For example, the major axis of the nanofiber can be 1 nm to 100 nm. Further, the length of the nanofiber is not limited.
本発明は、ナノファイバー形成能を有する、新規のペプチドを提供する。かかるペプチドは、７残基のアミノ酸配列からなるので、短く、工業的に利用度が高い。また、かかるペプチドは、広範囲に知られているFmoc法等のペプチド合成法を用いて簡単に合成でき、これは水溶液中で速やかにナノファイバーを形成する。他の高分子の場合、設計した高分子の合成方法、抽出生成方法を設計するごとに開発する必要があるが、本発明のようにペプチドの場合、構成要素であるアミノ酸の配列のみを決定すれば、アミノ酸同士の結合は一定（ペプチド結合）しているため、化学合成法について新たに開発する必要はない。 The present invention provides a novel peptide having the ability to form nanofibers. Since such a peptide consists of an amino acid sequence of 7 residues, it is short and highly industrially useful. In addition, such peptides can be easily synthesized using peptide synthesis methods such as the Fmoc method that are widely known, which rapidly form nanofibers in aqueous solution. In the case of other polymers, it is necessary to develop each time the designed polymer synthesis method and extraction generation method are designed, but in the case of peptides as in the present invention, only the amino acid sequence that is a constituent element should be determined. For example, since the bond between amino acids is constant (peptide bond), it is not necessary to newly develop a chemical synthesis method.
ペプチドナノファイバーは、生物を利用して調製することも可能であり、環境に悪影響を及ぼすことがない。また、生分解性であるため、この点からも環境に配慮した線維であるといえる。 Peptide nanofibers can also be prepared using living organisms and do not adversely affect the environment. Moreover, since it is biodegradable, it can be said that it is an environment-friendly fiber also from this point.
以下、本発明のペプチドについて、実施の形態及び実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the peptide of the present invention will be described in more detail with reference to embodiments and examples, but the present invention is not limited thereto.
本発明は、ナノファイバー形成能を有し、Xaa-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Xaa（配列番号１）で表される配列を有するペプチドである。配列番号１において、Ｎ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa１であり、Ｃ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa２である。ただしXaa１、Xaa２がともにLysである場合を除く。Xaa１、Xaa２がともにLysであるLys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号２）のアミノ酸配列を有するペプチドについての知見は、本願発明者の一人である田村らによって解明されている（特願２００３−３８５６７０）。 The present invention is a peptide having a nanofiber-forming ability and having a sequence represented by Xaa-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Xaa (SEQ ID NO: 1). In SEQ ID NO: 1, the N-terminal Xaa is an arbitrary amino acid residue Xaa 1 , and the C-terminal Xaa is an arbitrary amino acid residue Xaa 2 . However, the case where Xaa 1 and Xaa 2 are both Lys is excluded. The knowledge about the peptide having the amino acid sequence of Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys (SEQ ID NO: 2) in which Xaa 1 and Xaa 2 are both Lys has been elucidated by Tamura et al. (Japanese Patent Application No. 2003-385670).
また、本発明は、ナノファイバー形成能を有し、Xaa-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Xaa（配列番号１）のアミノ酸配列（Ｎ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa１であり、Ｃ末端のXaaは任意のアミノ酸残基Xaa２である。）において、Xaa１およびXaa２以外のアミノ酸残基の１個若しくは数個のアミノ酸残基がCysに置換されたアミノ酸配列からなるペプチドである。 In addition, the present invention has the ability to form nanofibers, and the amino acid sequence of Xaa-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Xaa (SEQ ID NO: 1) (N-terminal Xaa is any amino acid residue Xaa 1) , C-terminal Xaa is any amino acid residue Xaa 2 ), and one or several amino acid residues other than Xaa 1 and Xaa 2 are substituted with Cys. It is.
例えば、本発明は、 Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号３）、 Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Glu（配列番号４）、His-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-His（配列番号６）、Arg-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg（配列番号７）、Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg（配列番号８）、Glu-Phe-Cys-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号９）、Glu-Phe-Ile-Cys-Ile-Phe-Lys（配列番号１０）、Glu-Phe-Ile-Val-Cys-Phe-Lys（配列番号１１）のアミノ酸配列を有するペプチドである。これらのペプチドが、ナノファイバー形成能を有することが実験（下記の実施例で示す）で実証された。 For example, the present invention relates to Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys (SEQ ID NO: 3), Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Glu (SEQ ID NO: 4), His-Phe-Ile- Val-Ile-Phe-His (SEQ ID NO: 6), Arg-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg (SEQ ID NO: 7), Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg (SEQ ID NO: 8) , Glu-Phe-Cys-Val-Ile-Phe-Lys (SEQ ID NO: 9), Glu-Phe-Ile-Cys-Ile-Phe-Lys (SEQ ID NO: 10), Glu-Phe-Ile-Val-Cys-Phe A peptide having the amino acid sequence of -Lys (SEQ ID NO: 11). Experiments (shown in the examples below) demonstrated that these peptides have the ability to form nanofibers.
また、本発明は上記ペプチドにより構成されるナノファイバーである。 Moreover, this invention is a nanofiber comprised by the said peptide.
また、本発明は、上記ペプチドの塩であって、ナノファイバー形成能を有するものを含む。ペプチドの塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リン酸塩、酢酸塩、塩酸塩等が挙げられる。 In addition, the present invention includes salts of the above peptides that have the ability to form nanofibers. Examples of the peptide salt include sodium salt, potassium salt, phosphate, acetate, hydrochloride and the like.
また、本発明は上記ペプチドの誘導体であって、ナノファイバー形成能を有するものを含む。ここでいう「ペプチドの誘導体」とは、ペプチドを構成するアミノ酸の主鎖または／および側鎖に官能基が共有結合したものをいう。ペプチドの誘導体の例としては、ペプチドの主鎖または／および側鎖にメチル基、アセチル基、リン酸基、ホルムアミド基等が共有結合したものが挙げられる。 In addition, the present invention includes derivatives of the above peptides that have nanofiber forming ability. As used herein, “peptide derivative” refers to a peptide in which a functional group is covalently bonded to the main chain or / and the side chain of an amino acid constituting the peptide. Examples of peptide derivatives include those in which a methyl group, acetyl group, phosphate group, formamide group or the like is covalently bonded to the main chain or / and side chain of the peptide.
また、本発明は上記ペプチドの誘導体の塩である。 Further, the present invention is a salt of the above peptide derivative.
ペプチドは、液相法または固相法を用いた化学合成により調製したものであっても、目的の配列をコードするcDNAを用いて大腸菌等により発現、精製して調製したものであっても良い。この際用いるcDNAは通常の化学合成により調製すれば良い。 The peptide may be prepared by chemical synthesis using a liquid phase method or a solid phase method, or may be prepared by expression and purification in Escherichia coli using a cDNA encoding a target sequence. . The cDNA used at this time may be prepared by ordinary chemical synthesis.
（第１のペプチド配列設計法）
ナノファイバー形成能を有する7アミノ酸残基のアミノ酸配列Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号２）からなるペプチドをベース配列とし、理論的にナノファイバー形成能を高めると思われる配列改変を行い、実際にナノファイバー形成能が高まるかどうかを、実験的に実証した。なお、配列番号２のアミノ酸配列自体は、自然界に存在するβシートをもつタンパク質のβシート領域の中から切り出されたものである。
(First peptide sequence design method)
A peptide consisting of the amino acid sequence Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys (SEQ ID NO: 2) of 7 amino acid residues capable of nanofiber formation is considered to increase the nanofiber formation ability theoretically. It was experimentally verified whether or not the ability to form nanofibers actually increased. The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 was cut out from the β sheet region of a protein having a β sheet existing in nature.
配列番号２のアミノ酸配列の両端のLys は親水性のアミノ酸残基であり、それ以外の-Phe-Ile-Val-Ile-Phe- は、疎水性のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列で、これが凝集力を高め、ナノファイバー形成を促進すると考えられた。 The Lys at both ends of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is a hydrophilic amino acid residue, and other -Phe-Ile-Val-Ile-Phe- is an amino acid sequence consisting of hydrophobic amino acid residues, which are aggregated It was thought to increase power and promote nanofiber formation.
本実施例において着目したのは、まず、配列番号２のアミノ酸配列の主鎖の両末端がもつ電荷と、両末端近傍にある残基の側鎖がもつ電荷である。ペプチドのN末端側は、アミノ基（NH3 +）で正の電荷をもち、また、C末端側はカルボン酸（COO-）で負の電荷をもつ。Lys は、側鎖末端に主鎖N末端と同様のアミノ基をもち、正の電荷をもつ。よって、Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys （配列番号２）のアミノ酸配列においては、N末端側では、主鎖N末端のもつ正の電荷と、側鎖のもつ正の電荷が強調する形になっており、一方、C末端側では、主鎖C末端のもつ負の電荷と、側鎖のもつ正の電荷が打ち消しあう結果となっている。ナノファイバーの形成において、両末端の電荷が影響している可能性があるという観点から、負荷電性の側鎖を持つ酸性アミノ酸残基であるGlu、または正荷電性の側鎖を持つ塩基性アミノ酸残基であるHisで配列番号２（ベース配列）の両末端を、またはＮ末端、Ｃ末端のいずれかを置換し、配列を設計した。 In this example, attention was first paid to the charge of both ends of the main chain of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the charge of the side chains of residues near both ends. The N-terminal side of the peptide is positively charged with an amino group (NH 3 + ), and the C-terminal side is negatively charged with a carboxylic acid (COO − ). Lys has an amino group at the end of the side chain similar to the N-terminus of the main chain and has a positive charge. Therefore, in the amino acid sequence of Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys (SEQ ID NO: 2), on the N-terminal side, the positive charge of the main chain N-terminal and the positive charge of the side chain are On the other hand, on the C-terminal side, the negative charge of the main chain C-terminal and the positive charge of the side chain cancel each other. Glu, which is an acidic amino acid residue with negatively charged side chains, or basicity with positively charged side chains, in view of the possibility that the charges on both ends may affect the formation of nanofibers The amino acid residue His was substituted at both ends of SEQ ID NO: 2 (base sequence), or either the N-terminus or C-terminus, and the sequence was designed.
また、ナノファイバーが形成される際には、ペプチドが反平行βシートを構成していると予想され（図２（ａ）、（ｂ）参照）、この予想に基づくと凝集して隣接するペプチド対において、一方のN末端は他方のC末端の近傍にくることになる。したがって、ナノファイバー形成能を高めるためには、一方のN末端と他方のC末端の間に物理的化学的引力が働くようにすることが効果的と考えられる。かかる観点からも、中心部分の５残基の配列は -Phe-Ile-Val-Ile-Phe- で固定し、両末端を、GluまたはHisから選択し、配列を設計した。そして、設計したアミノ酸配列のペプチドに関し、ペプチドを合成し、ナノファイバー形成能を調べた。 In addition, when nanofibers are formed, it is expected that the peptide constitutes an antiparallel β sheet (see FIGS. 2 (a) and (b)). In the pair, one N-terminus will be near the other C-terminus. Therefore, in order to enhance the nanofiber forming ability, it is considered effective to allow physical and chemical attraction between one N-terminus and the other C-terminus. From this point of view, the sequence of 5 residues in the central part was fixed with -Phe-Ile-Val-Ile-Phe-, and both ends were selected from Glu or His to design the sequence. And about the peptide of the designed amino acid sequence, the peptide was synthesize | combined and nanofiber formation ability was investigated.
ここでナノファイバー形成能を調べたペプチドのアミノ酸配列は、以下のとおりである。略号は、各アミノ酸配列を有するペプチドの略号とする。 Here, the amino acid sequences of the peptides examined for the ability to form nanofibers are as follows. The abbreviation is an abbreviation for a peptide having each amino acid sequence.
1) Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号３）：ベース配列のN末端をGlu に置換したもの、略号EK7aaとする。 1) Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys (SEQ ID NO: 3): The base sequence with the N-terminus replaced by Glu, abbreviated as EK7aa.
2) Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Glu（配列番号４）：ベース配列のC末端をGlu に置換したもの、略号KE7aaとする。 2) Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Glu (SEQ ID NO: 4): The base sequence with the C-terminal substituted with Glu, abbreviated as KE7aa.
3) Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Glu（配列番号５）：ベース配列の両末端をGlu に置換したもの、略号EE7aaとする。 3) Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Glu (SEQ ID NO: 5): The base sequence with both ends replaced with Glu, abbreviated as EE7aa.
4) His-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-His（配列番号６）：ベース配列の両末端をHisに置換したもの、略号HH7aaとする。 4) His-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-His (SEQ ID NO: 6): The base sequence with both ends replaced with His, abbreviated as HH7aa.
（実験方法）
1.ペプチド合成
上記各配列のペプチドの合成は、固相合成法に基づきペプチド合成機（peptide synthesis system, Pioneer; Applied Biosystems）で行った。固相合成で用いた支持体レジンはPEG-PS樹脂（Applied Biosystems）でNα-アミノ基の保護に9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) 保護基が付加されており、リジン残基側鎖の保護にはt-butoxycarbonyl (tBoc)保護基、グルタミン酸側鎖の保護にはt-butoxy (OtBu)保護基、アルギニン残基側鎖の保護基には2,2,4,6,7-pentamethyl-dihydrobenzofurane-5-sulfonyl (Pbf)保護基、そしてヒスチジン残基側鎖の保護にはtrityl (Trt)保護基が付加されたものを使用した。アミノ酸のカップリングには保護基が導入されたアミノ酸（ペプチド研究所）を使用し、カップリング試薬としてN-[(Dimethylamino)-1H-1,2,3-triazole[4,5-6]pyridin-1-ylmethylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide (HATU)（Applied Biosystems）を用いた。ペプチド保護基の脱保護反応は、アルギニン残基を含むペプチドでは混合溶液A（0.75g結晶フェノール、0.25mlエタンジチオール（EDT）、0.5mlチオアニソール、0.5ml精製水、8.25トリフルオロ酢酸（TFA））、ヒスチジンやシステイン（後述する実施例４）を含むペプチドでは混合溶液B（0.25ml EDT、0.25ml精製水、9.5ml TFA）、そしてそれ以外のペプチドでは混合溶液C（0.5ml精製水、9.5ml TFA）中で、１時間半〜２時間かけて室温で行った。その後脱保護されたペプチドはt-butyl methyl ether (MTBE)で抽出し、遠心回収後、真空乾燥により得た。
(experimental method)
1. Peptide synthesis The peptides of the above sequences were synthesized by a peptide synthesizer (peptide synthesis system, Pioneer; Applied Biosystems) based on a solid phase synthesis method. The support resin used in the solid-phase synthesis is PEG-PS resin (Applied Biosystems) with a 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) protecting group added to protect the N α -amino group. t-butoxycarbonyl (tBoc) protecting group, t-butoxy (OtBu) protecting group for protecting glutamic acid side chain, 2,2,4,6,7-pentamethyl-dihydrobenzofurane-5 for protecting group of arginine residue side chain A -sulfonyl (Pbf) protecting group and a histidine residue side chain with a trityl (Trt) protecting group added were used. For amino acid coupling, an amino acid with a protecting group introduced (Peptide Institute) was used, and N-[(Dimethylamino) -1H-1,2,3-triazole [4,5-6] pyridin was used as a coupling reagent. -1-ylmethylene] -N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide (HATU) (Applied Biosystems) was used. Peptide protecting group deprotection reaction can be achieved with mixed solution A (0.75 g crystalline phenol, 0.25 ml ethanedithiol (EDT), 0.5 ml thioanisole, 0.5 ml purified water, 8.25 trifluoroacetic acid (TFA) for peptides containing arginine residues. ), Mixed peptide B (0.25 ml EDT, 0.25 ml purified water, 9.5 ml TFA) for peptides containing histidine and cysteine (Example 4 described later), and mixed solution C (0.5 ml purified water, 9.5 ml for other peptides). ml TFA) at room temperature for 1.5 hours to 2 hours. Thereafter, the deprotected peptide was extracted with t-butyl methyl ether (MTBE), collected by centrifugation, and then obtained by vacuum drying.
ペプチドの精製はDevelosil ODS column (Nomura Chemical)を用いてreverse-phase high-pressure liquid chromatography (RP-HPLC)（日立製作所）によって行われた。流速は10ml/minで、溶出の際のグラジエントは溶離液Bの濃度を30分で 20％から50％に変化させて行った。使用した溶離液Aは精製水（0.1％TFA）、溶離液Bはアセトニトリル（0.1％TFA）である。HPLCによって精製されたペプチドの確認は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（matrix-assisted laser desorption ionization; MALDI）法を用いて飛行時間型質量分析機（AXIMA-CFR, 島津製作所）で行った。 The peptide was purified by reverse-phase high-pressure liquid chromatography (RP-HPLC) (Hitachi, Ltd.) using a Develosil ODS column (Nomura Chemical). The flow rate was 10 ml / min, and the gradient during elution was performed by changing the concentration of eluent B from 20% to 50% in 30 minutes. The eluent A used was purified water (0.1% TFA) and the eluent B was acetonitrile (0.1% TFA). Peptides purified by HPLC were confirmed with a time-of-flight mass spectrometer (AXIMA-CFR, Shimadzu Corporation) using a matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) method.
2.ペプチドによるナノファイバー形成反応
両末端がHisのアミノ酸配列（配列番号６）以外のアミノ酸配列（配列番号３〜５）を有する各種ペプチドを秤量し、精製水を加えてそれを溶かし、これを3mMのペプチドストック溶液とした。さらにリン酸緩衝溶液（pH7）（溶液A）と1.11M塩化ナトリウムを含んだリン酸緩衝溶液（pH7）(溶液B)を調製した。ペプチドストック溶液から一定量分取し、溶液Aと溶液Bを加えて、ペプチド濃度を300μMに希釈してナノファイバー形成反応を開始した。この時溶液Aと溶液Bの混合比率を変えることで塩化ナトリウム濃度を調節し、0〜1000mMまで塩化ナトリウム濃度を変化させた。
2. Nanofiber formation reaction by peptides Weigh various peptides having amino acid sequences (SEQ ID NO: 3 to 5) other than His amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) at both ends, add purified water to dissolve it, A 3 mM peptide stock solution was prepared. Further, a phosphate buffer solution (pH 7) (solution B) containing phosphate buffer solution (pH 7) (solution A) and 1.11 M sodium chloride was prepared. A predetermined amount was taken from the peptide stock solution, solution A and solution B were added, and the peptide concentration was diluted to 300 μM to initiate the nanofiber formation reaction. At this time, the sodium chloride concentration was adjusted by changing the mixing ratio of the solution A and the solution B, and the sodium chloride concentration was changed from 0 to 1000 mM.
また両末端にHisをもつアミノ酸配列（配列番号６）を有するペプチドについては、pH4でのナノファイバー形成反応は酢酸緩衝溶液を用い、pH8ではトリス-塩酸緩衝溶液を用いて上記と同様の操作で反応を開始させた。 For the peptide having the amino acid sequence having His at both ends (SEQ ID NO: 6), the nanofiber formation reaction at pH 4 was carried out in the same manner as described above using an acetate buffer solution and at pH 8 using a Tris-hydrochloric acid buffer solution. The reaction was started.
3.ナノファイバー形成能の確認実験
ナノファイバー形成能の確認実験は、AFM観察、CD分光測定、およびコンゴーレッド結合アッセイにより行った。AFM観察によると、ナノファイバーが形成されている様子を画像として観察することができる。CD分光測定によると、測定されるパターンがβシート様の分光パターンであるか否かによって、ナノファイバー形成が促進されているかを確認することができる。ただし、βシート様の分光パターンをとらないナノファイバーもあるので、βシート様の分光パターンをとらないことが、ナノファイバーが形成されていないことを示すことにはならない。有機化合物のコンゴーレッド（CR）はアミロイド線維の検出に使われる染色試薬あり、CRがアミロイド線維に結合すると緑色の複屈折が偏光顕微鏡で確認される。このCRはアミロイド線維に特異的に結合することが知られている。したがって、コンゴーレッド結合アッセイにおける緑色複屈折の確認は、凝集体がアミロイド線維であるという証拠の１つとなる。アミロイド線維はナノファイバーの一種なので、CRにより染色されることが確認された場合は、ナノファイバーであるとの証拠の１つとなる。ただし、全てのナノファイバーがCRにより染色されるわけではないので、CRにより染色されなかったことが、ナノファイバーでないことの証拠とはならない。
3. Confirmation experiment of nanofiber formation ability The confirmation experiment of nanofiber formation ability was performed by AFM observation, CD spectroscopic measurement, and Congo red binding assay. According to AFM observation, it is possible to observe the formation of nanofibers as an image. According to CD spectroscopic measurement, whether or not nanofiber formation is promoted can be confirmed based on whether or not the pattern to be measured is a β sheet-like spectroscopic pattern. However, since some nanofibers do not take a β-sheet-like spectral pattern, not taking a β-sheet-like spectral pattern does not indicate that no nanofibers are formed. Congo red (CR), an organic compound, is a staining reagent used to detect amyloid fibrils. When CR binds to amyloid fibrils, green birefringence is confirmed with a polarizing microscope. This CR is known to specifically bind to amyloid fibrils. Thus, confirmation of green birefringence in the Congo Red binding assay is one piece of evidence that the aggregates are amyloid fibrils. Since amyloid fibrils are a type of nanofiber, if it is confirmed that they are stained by CR, this is one of the evidence that they are nanofibers. However, since not all nanofibers are stained with CR, the fact that they were not stained with CR does not provide evidence that they are not nanofibers.
3a.原子間力顕微鏡（AFM）観察
ナノファイバー形成開始から7日後に各種ペプチド溶液から2μl分取し、それを雲母基板（約1cm四方）上へ滴下し、1〜5分間室温で放置した。その後、基板洗浄のためにマイクロピペットを用いて50μl精製水を傾けた基板の上端から滴下し、これを2回行った後、室温にて完全に乾燥させ、AFM（SPM-9500J2、島津製作所）観察を行った。
3a. Atomic Force Microscope (AFM) Observation Seven days after the start of nanofiber formation, 2 μl of each peptide solution was taken and dropped onto a mica substrate (about 1 cm square) and left at room temperature for 1 to 5 minutes. Then, using a micropipette to clean the substrate, 50 μl of purified water was dropped from the top of the tilted substrate, and this was done twice, followed by complete drying at room temperature. AFM (SPM-9500J2, Shimadzu Corporation) Observations were made.
3b.円ニ色性（CD）分光測定
各種ペプチド溶液を約200μl分取し、それを光路長0.1cmの円筒型石英セルに入れ、250nm〜190nmの遠紫外領域のCD（Jasco J-720 spectropolarimeter、日本分光）測定を行った。
3b. Circular dichroism (CD) spectroscopic measurement About 200 μl of various peptide solutions are taken and placed in a cylindrical quartz cell with an optical path length of 0.1 cm, and a CD (Jasco J-720 spectropolarimeter in the far ultraviolet region of 250 nm to 190 nm). , JASCO) measurement.
3c.コンゴーレッド（CR）結合アッセイ
秤量したCR（ナカライテスク）に80％メタノール水溶液を加えた後、ボルテックスで溶液を懸濁し、残りのCRの塊は1分間超音波をかけて粉砕した。10分間遠心（15000rpm）した後、 その上澄み溶液を孔径0.45μmのフィルター（sartorius）に2回通してCR飽和溶液を作製した。スライドガラス（松浪硝子工業）に試料を10μl滴下し、一度乾燥させた後、先に調製したCR飽和溶液を乾燥した試料の上に10μl滴下し、再度乾燥させた。作製した試料は偏光顕微鏡（Nikon ECLIPSE E600 POL、ニコン）を用いて観察を行った。
3c. Congo red (CR) binding assay 80% methanol aqueous solution was added to weighed CR (Nacalai Tesque), and then the solution was suspended by vortex, and the remaining CR mass was pulverized by applying ultrasonic waves for 1 minute. After centrifugation (15000 rpm) for 10 minutes, the supernatant solution was passed twice through a filter (sartorius) having a pore size of 0.45 μm to prepare a CR saturated solution. 10 μl of the sample was dropped onto a slide glass (Matsunami Glass Industry) and dried once, and then 10 μl of the previously prepared CR saturated solution was dropped onto the dried sample and dried again. The prepared sample was observed using a polarizing microscope (Nikon ECLIPSE E600 POL, Nikon).
（実験結果）
1.EK7aaの結果（図３）
EK7aaの合成とナノファイバー形成反応は上記の実験方法により行った。図３（ａ）はEK7aaを模式的に示し、図３（ｂ）はEK7aaのナノファイバー形成開始から７日後の0mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図３（ｃ）はEK7aa の0mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。図３（ａ）に示すように、EK7aaは、両末端の側鎖電荷が主鎖の電荷を打ち消すアミノ酸配列となっている。タンパク質の二次構造（α螺旋、βシート、ランダムコイル構造）の有無は、CD測定を行うことによって確認することができる。一般にランダムコイル構造のCDスペクトルは約200nm付近に負の極小を持つことが知られているが、このペプチドはいずれの塩濃度条件（0mM,50mM,100mM,250mM,500mM,750mM,1000mM塩化ナトリウム）でもナノファイバー形成開始直後のCDスペクトルは約200nmに正の極大、約225nmに負の極大値を示した。これはβシート構造に特徴的なスペクトルであり、反応直後のペプチドはすでに分子間相互作用によりβシート様の構造を形成している事を示している。その後時間が経過するとともにCDスペクトルも変化し、3日後にはその変化は無くなった。これは3日間かけてナノファイバーが成長していることを示している。なお、この結果は、0mM塩化ナトリウムについては、図３（ｃ）に示すグラフから読み取ることができる。
(Experimental result)
1.Result of EK7aa (Figure 3)
The synthesis of EK7aa and the nanofiber formation reaction were performed by the above experimental method. 3 (a) schematically shows EK7aa, FIG. 3 (b) shows an AFM image of 0 mM sodium chloride 7 days after the start of nanofiber formation of EK7aa, and FIG. 3 (c) shows 0 mM sodium chloride of EK7aa. The graph of CD measured value in is shown. As shown in FIG. 3 (a), EK7aa has an amino acid sequence in which the side chain charges at both ends cancel the main chain charge. Presence or absence of protein secondary structure (α helix, β sheet, random coil structure) can be confirmed by performing CD measurement. In general, the CD spectrum of a random coil structure is known to have a negative minimum at around 200 nm, but this peptide has any salt concentration conditions (0 mM, 50 mM, 100 mM, 250 mM, 500 mM, 750 mM, 1000 mM sodium chloride). However, the CD spectrum immediately after the start of nanofiber formation showed a positive maximum at about 200 nm and a negative maximum at about 225 nm. This is a spectrum characteristic of the β-sheet structure, indicating that the peptide immediately after the reaction has already formed a β-sheet-like structure by intermolecular interaction. Thereafter, the CD spectrum changed with time, and the change disappeared after 3 days. This indicates that the nanofibers are growing over 3 days. In addition, this result can be read from the graph shown in FIG.3 (c) about 0 mM sodium chloride.
また、図３（ｂ）に示すように、AFM観察により形成されたナノファイバーは比較的直線性が高く、その長径は5〜20nm、また長さは1〜10μmであり、どの塩濃度条件でも同様のナノファイバーが形成されていることが確認された。それぞれのナノファイバーを詳細に観察したところ、さらに細いナノファイバーが束になってナノファイバーを形成していることがわかった。 In addition, as shown in FIG. 3 (b), the nanofibers formed by AFM observation have relatively high linearity, the major axis is 5 to 20 nm, and the length is 1 to 10 μm. It was confirmed that similar nanofibers were formed. When each nanofiber was observed in detail, it was found that finer nanofibers were bundled to form nanofibers.
全ての塩濃度（0mM,50mM,100mM,250mM,500mM,750mM,1000mM塩化ナトリウム）でのEK7aaのナノファイバーをCRで染色し、偏光顕微鏡で観察してみると、全ての試料において緑色の複屈折が確認された。これはEK7aaによって形成されたナノファイバーはアミロイド線維であることを示している。 When EK7aa nanofibers are stained with CR at all salt concentrations (0 mM, 50 mM, 100 mM, 250 mM, 500 mM, 750 mM, 1000 mM sodium chloride) and observed with a polarizing microscope, green birefringence is observed in all samples. Was confirmed. This indicates that the nanofibers formed by EK7aa are amyloid fibrils.
2.KE7aaの結果（図４）
KE7aaの合成とナノファイバー形成反応は上記の実験方法により行った。図４（ａ）はKE7aaを模式的に示し、図４（ｂ）はナノファイバー形成開始から７日後の1000mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図４（ｃ）は0mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。図４（ａ）に示すように、KE7aaは、両末端の側鎖電荷が主鎖の電荷を強調するアミノ酸配列となっている。KE7aaの反応直後のCDスペクトルは、どの塩濃度条件下でもEK7aaで確認されたもの（図３（ｃ）参照）と同様の特徴を持つスペクトルを示し、反応直後からβシート様の構造が形成されていると考えられる。しかし7日後のCDスペクトルはその強度が小さく、0ラインに近い波形を示している。0mM塩化ナトリウムについてのかかる結果は、図４（ｃ）のグラフで確認できる。これはペプチドの両末端の静電相互作用が非常に強いためにペプチド同士が速やかに凝集し、その凝集体が沈澱として溶媒から析出したためと考えられる。
2. Results of KE7aa (Figure 4)
The synthesis of KE7aa and the nanofiber formation reaction were carried out by the above experimental method. Fig. 4 (a) schematically shows KE7aa, Fig. 4 (b) shows an AFM image with 1000 mM sodium chloride 7 days after the start of nanofiber formation, and Fig. 4 (c) shows CD measurement with 0 mM sodium chloride. A graph of values is shown. As shown in FIG. 4A, KE7aa has an amino acid sequence in which the side chain charges at both ends emphasize the charge of the main chain. The CD spectrum immediately after the reaction of KE7aa shows a spectrum having the same characteristics as those confirmed with EK7aa under any salt concentration conditions (see Fig. 3 (c)), and a β-sheet-like structure is formed immediately after the reaction. It is thought that. However, the intensity of the CD spectrum after 7 days is small and shows a waveform close to the 0 line. Such a result for 0 mM sodium chloride can be confirmed in the graph of FIG. This is considered to be because the electrostatic interactions at both ends of the peptide are very strong, so that the peptides quickly aggregate together, and the aggregate precipitates from the solvent as a precipitate.
またAFMで形成された凝集体を観察したところナノファイバーを確認することはできたが、その長径や長さは非常に不均一なもので、塩濃度が高くないとそれらナノファイバーを顕著に確認することができなかった。図４（ｂ）のAFM像で確認されるように、1000mM塩化ナトリウムの場合は細くて短いナノファイバーが形成される。またCR結合アッセイを行った結果、形成されたナノファイバーは緑色の複屈折を示したことから、これらのナノファイバーはアミロイド線維であることが確認された。 In addition, when the aggregates formed by AFM were observed, nanofibers could be confirmed, but their major diameters and lengths were very uneven, and these nanofibers were notably confirmed unless the salt concentration was high. I couldn't. As can be seen from the AFM image in FIG. 4B, in the case of 1000 mM sodium chloride, thin and short nanofibers are formed. As a result of the CR binding assay, the formed nanofibers showed green birefringence, confirming that these nanofibers were amyloid fibers.
3.EE7aaの結果
ベース配列の両末端ともにGluに置換したEE7aaの配列では、ペプチド合成抽出の条件が難しく、ナノファイバー形成実験を行うまでにはいたらなかった。
3. Results of EE7aa In the EE7aa sequence in which both ends of the base sequence were substituted with Glu, the conditions for peptide synthesis extraction were difficult, and it was not possible to conduct nanofiber formation experiments.
4.HH7aaの結果（図５、図６）
HH7aaの合成とナノファイバー形成反応は上記の実験方法により行った。Hisの側鎖であるイミダゾール基は他の塩基性アミノ酸側鎖（Arg、Lys）とは異なり、中性付近（pH6）にpKaを持つため比較的中性に近いpH領域でその電荷の有無を制御することができる。そのためナノファイバー形成はpH4（Hisの電荷は＋）とpH8（Hisの電荷はなし）の２つの条件において行った。図５（ａ）はpH4.0におけるHH7aaを模式的に示し、図５（ｂ）は、pH4.0におけるナノファイバー形成開始から７日後の0mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図５（ｃ）はpH4.0における0mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。また、図６（ａ）は、pH8.0におけるHH7aaを模式的に示し、図６（ｂ）は、pH8.0におけるナノファイバー形成開始から７日後の0mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図６（ｃ）はpH8.0における0mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。
4. Results of HH7aa (Figs. 5 and 6)
The synthesis of HH7aa and the nanofiber formation reaction were performed by the above experimental method. Unlike other basic amino acid side chains (Arg, Lys), the imidazole group, which is the side chain of His, has a pKa near neutrality (pH 6). Can be controlled. Therefore, nanofiber formation was performed under two conditions, pH 4 (His charge is +) and pH 8 (His is not charged). FIG. 5 (a) schematically shows HH7aa at pH 4.0, and FIG. 5 (b) shows an AFM image with 0 mM sodium chloride 7 days after the start of nanofiber formation at pH 4.0. ) Shows a graph of CD measurement values with 0 mM sodium chloride at pH 4.0. FIG. 6 (a) schematically shows HH7aa at pH 8.0, and FIG. 6 (b) shows an AFM image with 0 mM sodium chloride 7 days after the start of nanofiber formation at pH 8.0. 6 (c) shows a graph of the measured CD value with 0 mM sodium chloride at pH 8.0.
pH4.0での反応直後のCDスペクトルは、どの塩濃度（0mM,50mM,100mM,250mM,500mM,750mM,1000mM塩化ナトリウム）においてもランダムコイル様のスペクトルとは異なり、210nm付近に正の極大、220nm付近に正の値の肩、そして230nm付近に負の極大を示した。0mM塩化ナトリウムに関しては、図５（ｃ）のグラフで確認できる。この結果は反応直後のペプチドはランダムコイル構造ではなく、分子間相互作用によりなんらかの構造を形成していることを示している。 The CD spectrum immediately after the reaction at pH 4.0 is different from the random coil-like spectrum at any salt concentration (0 mM, 50 mM, 100 mM, 250 mM, 500 mM, 750 mM, 1000 mM sodium chloride). It showed a positive shoulder around 220nm and a negative maximum around 230nm. About 0 mM sodium chloride, it can confirm with the graph of FIG.5 (c). This result shows that the peptide immediately after the reaction does not have a random coil structure, but forms some structure by intermolecular interaction.
また形成された凝集体をAFMで観察したところ特徴的な螺旋状のナノファイバーが確認された。0mM塩化ナトリウムに関しては、図５（ｂ）のAFM像で確認できる。これらのナノファイバーの長径は5〜10nmで、長さは10μmに達するものも存在する。また塩濃度が高くなるにつれてそのナノファイバーの長さは短くなり、ナノファイバー同士が不規則に凝集する傾向が確認された。これは塩濃度が増加するとともに塩化物イオンによってHisの正電荷が遮蔽され、正電荷同士の反発を抑えたためと考えられる。さらにCR結合アッセイを行った結果、形成されたナノファイバーは緑色の複屈折を示したことから、これらのナノファイバーはアミロイド線維であることが確認された。 Moreover, when the formed aggregate was observed with AFM, a characteristic helical nanofiber was confirmed. Regarding 0 mM sodium chloride, it can be confirmed from the AFM image of FIG. Some of these nanofibers have a major axis of 5 to 10 nm and a length of 10 μm. Moreover, the length of the nanofiber became shorter as the salt concentration increased, and the tendency for the nanofibers to aggregate irregularly was confirmed. This is thought to be because the positive charge of His was shielded by chloride ions as the salt concentration increased, and the repulsion between positive charges was suppressed. As a result of further CR binding assay, the formed nanofibers showed green birefringence, confirming that these nanofibers were amyloid fibers.
pH8.0での反応直後のCDスペクトルはどの塩濃度（0mM,50mM,100mM,250mM,500mM,750mM,1000mM塩化ナトリウム）においてもランダムコイル構造とは異なるスペクトルを示し、pH8.0においても反応直後から分子間相互作用により凝集が起こっていることがわかる。0mM塩化ナトリウムに関しては、図６（ｃ）のグラフで確認できる。 The CD spectrum immediately after the reaction at pH 8.0 shows a spectrum different from the random coil structure at any salt concentration (0 mM, 50 mM, 100 mM, 250 mM, 500 mM, 750 mM, 1000 mM sodium chloride). From this, it can be seen that aggregation occurs due to intermolecular interaction. About 0 mM sodium chloride, it can confirm with the graph of FIG.6 (c).
また形成された凝集体のAFMでの観察から、pH8.0でのナノファイバーにはpH4.0で確認されたような目立った螺旋構造はなく、ナノファイバーの長径は非常に不均一なものであった。0mM塩化ナトリウムに関しては、図６（ｂ）のAFM像で確認できる。またどの塩濃度においてもナノファイバー同士の不規則な凝集があり、これはHis側鎖の電荷がはじめからないために起こったものと考えられる。さらにCR結合アッセイを行った結果、形成されたナノファイバーが緑色の複屈折を示すことから、これらのナノファイバーはアミロイド線維であることが確認された。 In addition, from the observation of the formed aggregates with AFM, the nanofibers at pH 8.0 do not have a conspicuous spiral structure as confirmed at pH 4.0, and the major axis of the nanofibers is very uneven. there were. Regarding 0 mM sodium chloride, it can be confirmed from the AFM image of FIG. In addition, there is irregular aggregation of nanofibers at any salt concentration, which is thought to have occurred because the charge on the His side chain was not at the beginning. As a result of further CR binding assay, the formed nanofibers showed green birefringence, confirming that these nanofibers were amyloid fibers.
5.1〜5の結果について
また、これらの実験でAFMによって、EK7aa，KE7aa，HH7aaのそれぞれのペプチドでは、形成されるナノファイバーの形状が異なることも確認できた。配列番号３のアミノ酸配列を有するEK7aaでは、ナノファイバーは針状の太く直線的なものであり、配列番号４のアミノ酸配列を有するKE7aaについては、短いナノファイバーしか確認できなかった。以上により、ナノファイバー形成能、およびナノファイバーの形状はペプチド配列に大きく依存することがわかり、一箇所の改変でも、形成能、形状ともに大きく変化することがわかった。
Regarding the results of 5.1 to 5, it was also confirmed by AFM in these experiments that the shape of the nanofiber formed was different for each of the peptides EK7aa, KE7aa, and HH7aa. In EK7aa having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, the nanofibers were needle-like thick and linear, and for KE7aa having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, only short nanofibers could be confirmed. From the above, it was found that the ability to form nanofibers and the shape of the nanofibers greatly depend on the peptide sequence, and it was found that both the ability to form and the shape change greatly even if modification is made at one place.
（実験結果の解析）
本実施例における第１のペプチド配列設計法によって設計した配列においては、配列番号５のアミノ酸配列を有するEE7aa以外のペプチドは、１日目よりナノファイバーの形成がみられ、いずれの場合もナノファイバーがAFMにより確認できた。EK7aa，KE7aa，HH7aaのそれぞれのペプチドでは、いずれの場合も、塩濃度がゼロの溶媒中で、速やかにナノファイバー形成があることが、CD測定の結果判明した。
(Analysis of experimental results)
In the sequence designed by the first peptide sequence design method in this example, peptides other than EE7aa having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 showed the formation of nanofibers from the first day. Was confirmed by AFM. As a result of CD measurement, in each case, EK7aa, KE7aa, and HH7aa peptides rapidly formed nanofibers in a solvent having a salt concentration of zero.
（第２のペプチド配列設計法）
実施例１の実験結果で得られた定性的な知見を、理論的に解明すべく、タンパク質の立体構造データベースを用い、アミノ酸残基間の相対距離に関する分布を調べた。アミノ酸残基側鎖の末端部分の原子集団間の距離が、7Å以内にある率を、それぞれの側鎖末端原子群の対ごとに測定した。その結果、タンパク質立体構造データベース中から抽出されたおよそ1500種類のタンパク質についての統計的な結果として、Cys側鎖の-CSH 同士（Cβを中心残基とした場合のCβ-Cβ間距離）は、この対のおよそ15％が、7Å内にあることがわかり、またそのほとんどは、3.8Åを中心にした鋭い局所分布の中にあることがわかった。これは、Cysの側鎖の硫黄原子がジスルフィド結合をしていることを表している（ここでの距離は、両残基のCβ間距離であるため、ジスルフィド結合の硫黄原子間距離よりは大きい）。
(Second peptide sequence design method)
In order to theoretically elucidate the qualitative findings obtained from the experimental results of Example 1, the distribution of the relative distance between amino acid residues was examined using a protein tertiary structure database. The rate at which the distance between the atomic groups in the terminal portion of the amino acid residue side chain was within 7 mm was measured for each pair of side chain terminal atom groups. As a result, as a statistical result of about 1500 proteins extracted from the protein three-dimensional structure database, -CSH of Cys side chain (C β -C β distance when C β is the central residue) ) Found that approximately 15% of this pair was within 7 cm, and most of them were in a sharp local distribution centered at 3.8 cm. This indicates that the sulfur atom in the side chain of Cys has a disulfide bond (the distance here is the distance between the C β of both residues, so large).
ジスルフィド結合は、ナノファイバーを形成するものとしてはその原子群間距離からしてふさわしくない。また、Cysは、一般に残基数の少ない小さいタンパク質において頻繁に出現し、構造安定化のためにジスルフィド結合を作るが、残基数の多い大きいタンパク質においては、出現頻度が小さいため、他の残基にくらべて、空間的にも近傍にあることが多い。このことを考えると、Cys-Cysが互いに近傍にある頻度は相対的にみると、それほど高いとはいえない。 Disulfide bonds are not suitable for forming nanofibers because of the distance between their atomic groups. Cys generally appears frequently in small proteins with a small number of residues and forms a disulfide bond to stabilize the structure. However, in large proteins with a large number of residues, the appearance frequency is low, so other residues are present. Compared to the base, it is often close in space. Considering this, the frequency with which Cys-Cys are close to each other is not so high when viewed relatively.
そこで、Cys-Cys 間結合以外の原子群間で互いに７Å以内にある率がもっとも高いものを求めると、Phe側鎖同士がもっとも接近しやすいものであることがわかった。この場合、PheとPheの全ての対のうち、およそ4% が7Å内にある。同じく、Ile側鎖末端の -CH2CH3 同士の場合や、Leu または、Val の側鎖である -CHCH3CH3 同士の場合も互いに近傍にいることが多いことがわかった。これらは、疎水性相互作用によって、側鎖が互いに接近するものであることは明らかである。 Therefore, it was found that the Phe side chains are the closest to each other when the ratio between the atomic groups other than the Cys-Cys bond within 7% of each other is obtained. In this case, approximately 4% of all pairs of Phe and Phe are within 7cm. Similarly, in the case of -CH 2 CH 3 at the end of the Ile side chain, or in the case of -CHCH 3 CH 3 which is the side chain of Leu or Val, it was found that they are often close to each other. It is clear that these side chains are close to each other due to hydrophobic interactions.
以上のことから、Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号２） というアミノ配列における、中央5残基の配列は、疎水性相互作用として、もっとも強いPhe-Phe、 二番目に強いIle-Ile、 そして、三番目に近い Val-Val(あるいはLeu-Leu) を用いていることになり、この部分がナノファイバー形成能の疎水性相互作用による核となっていることが判明した。また、疎水性相互作用以外に強い引力であることが考えられる静電相互作用についてみてみると、データベースからの解析結果では、Arg 側鎖とカルボン酸(COO-、Asp,Gluの側鎖末端)がもっとも相互作用が強く、次に、Lys 側鎖とカルボン酸の間の相互作用が強いことがわかった。 Based on the above, the amino acid sequence Lys-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Lys (SEQ ID NO: 2) has a central 5-residue sequence as the strongest Phe-Phe, second Ile-Ile, which is strong against gallium, and Val-Val (or Leu-Leu), which is the third closest, is found to be the nucleus due to the hydrophobic interaction of nanofiber formation ability did. Also, looking at the electrostatic interactions is considered that a strong attractive force in addition to the hydrophobic interaction, the analysis results from the database, Arg side chain and the carboxylic acid (COO -, Asp, the end of the side chain Glu) Was found to have the strongest interaction, followed by a strong interaction between the Lys side chain and the carboxylic acid.
実験結果とデータベースからの統計解析の結果は互いに矛盾せず、これまで実験的に調べた配列番号３〜６の配列の中では、配列番号３（EK7aa）の配列（あるいは、配列番号４の配列（KE7aa））がもっともナノファイバー形成能が高いことが、実験から判明し、かつデータベースからの統計解析の結果からも裏付けられた。 The experimental results and the results of statistical analysis from the database are consistent with each other. Among the sequences of SEQ ID NOs: 3 to 6 experimentally examined so far, the sequence of SEQ ID NO: 3 (EK7aa) (or the sequence of SEQ ID NO: 4 (KE7aa)) has the highest ability to form nanofibers, and it was proved by experiments and supported by the results of statistical analysis from the database.
以上により、ナノファイバー形成能の高いペプチド配列の設計法として、Phe,Ile,Val(Leu) を疎水性コア形成のためにもち、ペプチド自体がナノファイバー形状をもつように凝集するために、親水性の側鎖をもつ必要性からして、正電荷をもつLysあるいはArgと、負電荷をもつGluあるいはAspによって、静電相互作用によって親水性を保ちながら互いに凝集することが必要とされることがわかった。以上より、理論的にもっともナノファイバー形成能が高いと考えられるのは、7残基からなるペプチドの場合、Glu-Phe-Phe-Phe-Phe-Phe-Arg である。 As described above, Phe, Ile, Val (Leu) is used to form a hydrophobic core as a method for designing a peptide sequence having a high nanofiber-forming ability, and the peptide itself aggregates so as to have a nanofiber shape. In view of the necessity of having a negative side chain, it is necessary for Lys or Arg having a positive charge and Glu or Asp having a negative charge to aggregate with each other while maintaining hydrophilicity by electrostatic interaction. I understood. From the above, it is Glu-Phe-Phe-Phe-Phe-Phe-Arg in the case of a 7-residue peptide that is theoretically considered to have the highest ability to form nanofibers.
そこで、これまでナノファイバー形成能があると判断された配列の中央部の-Phe-Ile-Val-Ile-Phe- を変えず、ナノファイバー形成能が高いと判断される Argで末端を置換したアミノ酸配列を設計した。そして、設計したアミノ酸配列のペプチドに関し、ペプチドを合成し、ナノファイバー形成能を調べた。ここでナノファイバー形成能を調べたアミノ酸配列は、以下のとおりである。 Therefore, Arg, which was judged to have high nanofiber formation ability, was substituted without changing -Phe-Ile-Val-Ile-Phe- at the center of the sequence that was previously judged to have nanofiber formation ability. The amino acid sequence was designed. And about the peptide of the designed amino acid sequence, the peptide was synthesize | combined and nanofiber formation ability was investigated. The amino acid sequences examined for the ability to form nanofibers are as follows.
5) Arg-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg（配列番号７）：ベース配列の両末端を Arg に置換したもの、略号RR7aaとする。 5) Arg-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg (SEQ ID NO: 7): Arg substituted at both ends of the base sequence, abbreviated as RR7aa.
6) Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg（配列番号８）：配列番号３（EK7aa）のＣ末端のLysをArg に置換したもの、略号ER7aaとする。 6) Glu-Phe-Ile-Val-Ile-Phe-Arg (SEQ ID NO: 8): The C-terminal Lys of SEQ ID NO: 3 (EK7aa) is substituted with Arg, and abbreviated as ER7aa.
（実験方法）
実験方法は実施例１と同様である。
(experimental method)
The experimental method is the same as in Example 1.
（実験結果）
1.RR7aaの結果（図７、図８）
RR7aaの合成とナノファイバー形成反応は上記の実験方法により行った。図７（ａ）はRR7aaを模式的に示し、図７（ｂ）は250mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。また、図８（ａ）は500mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図８（ｂ）は500mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。
(Experimental result)
1. Results of RR7aa (Figs. 7 and 8)
The synthesis of RR7aa and the nanofiber formation reaction were carried out by the above experimental method. FIG. 7 (a) schematically shows RR7aa, and FIG. 7 (b) shows a graph of CD measurement values with 250 mM sodium chloride. FIG. 8 (a) shows an AFM image with 500 mM sodium chloride, and FIG. 8 (b) shows a graph of CD measurement values with 500 mM sodium chloride.
RR7aaの場合、0mM以上からβシート様のスペクトルを示しており、さらに250mM以上の塩濃度では明確なβシート様のスペクトルが見られた。この結果はアミノ酸配列の両末端をArgにすることで、Lysの場合と比べて凝集速度が促進されたことを示している。さらにAFM観察からナノファイバー同士が絡み合って凝集していることが確認され、この結果からも非常に凝集力が増加したことが伺える。またCR結合アッセイを行った結果、形成されたナノファイバーは緑色の複屈折を示したことから、これらのナノファイバーはアミロイド線維であることが確認された。 In the case of RR7aa, a β-sheet-like spectrum was shown from 0 mM or more, and a clear β-sheet-like spectrum was observed at a salt concentration of 250 mM or more. This result shows that the aggregation rate was promoted by using Arg at both ends of the amino acid sequence as compared to Lys. Furthermore, it was confirmed from the AFM observation that the nanofibers were entangled and agglomerated, and this result also indicates that the agglomeration force increased greatly. As a result of the CR binding assay, the formed nanofibers showed green birefringence, confirming that these nanofibers were amyloid fibers.
2.ER7aaの結果（図９、図１０）
ER7aaの合成とナノファイバー形成反応は上記の実験方法により行った。統計解析からArg側鎖末端とGlu側鎖末端の相互作用がもっとも強い静電相互作用であると予想された。このペプチドの場合、配列番号３のアミノ酸配列を有するEK7aaよりも凝集力、凝集速度が増加すると予想された。図９（ａ）はER7aaを模式的に示し、図９（ｂ）は0mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図９（ｃ）は0mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。また、図１０（ａ）は100mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図１０（ｂ）は100mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。CDスペクトル（図９（ｃ）、図１０（ｂ）参照）から、全ての塩濃度（0mM,50mM,100mM,250mM,500mM,750mM,1000mM塩化ナトリウム）において反応開始直後から、βシート様の構造を形成していることがわかる。AFM像により形成された凝集体を観察してみると（図９（ｂ）、図１０（ａ）参照）、ナノファイバー同士が束に会合し、さらに太いナノファイバーを形成していることが確認された。これらの結果はＮ末端をArgに置換することでGlu側鎖との静電相互作用が強まり、凝集力が増大したものと考えられ、統計的な解析結果を支持するものである。またCR結合アッセイを行った結果、形成されたナノファイバーは緑色の複屈折を示したことから、これらのナノファイバーはアミロイド線維であることが確認された。
2. Results of ER7aa (Figs. 9 and 10)
The synthesis of ER7aa and the nanofiber formation reaction were performed by the above experimental method. Statistical analysis predicted that the interaction between Arg side chain end and Glu side chain end was the strongest electrostatic interaction. In the case of this peptide, it was expected that the cohesion force and the aggregation rate were increased as compared with EK7aa having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. FIG. 9 (a) schematically shows ER7aa, FIG. 9 (b) shows an AFM image with 0 mM sodium chloride, and FIG. 9 (c) shows a graph of CD measurement values with 0 mM sodium chloride. FIG. 10 (a) shows an AFM image with 100 mM sodium chloride, and FIG. 10 (b) shows a graph of CD measurement values with 100 mM sodium chloride. From the CD spectrum (see FIG. 9 (c) and FIG. 10 (b)), immediately after the start of the reaction at all salt concentrations (0 mM, 50 mM, 100 mM, 250 mM, 500 mM, 750 mM, 1000 mM sodium chloride), a β sheet-like structure It can be seen that is formed. When observing the aggregate formed by the AFM image (see FIG. 9B and FIG. 10A), it is confirmed that the nanofibers are associated with each other to form a thicker nanofiber. It was done. These results suggest that the electrostatic interaction with the Glu side chain is strengthened by substituting the N-terminus with Arg, and the cohesive force is increased, which supports the statistical analysis results. As a result of the CR binding assay, the formed nanofibers showed green birefringence, confirming that these nanofibers were amyloid fibers.
3.1,2の結果について
上記RR7aa、ER7aa の実験結果から、RR7aa、ER7aa のナノファイバー形成能は、RR7aa、ER7aaのアミノ酸配列中のArgの代わりにLysを持つEK7aa（配列番号３）と比べて高いことがわかった。
Regarding the results of 3.1 and 2, based on the above RR7aa and ER7aa experimental results, the nanofiber formation ability of RR7aa and ER7aa is higher than that of EK7aa (SEQ ID NO: 3) having Lys instead of Arg in the amino acid sequences of RR7aa and ER7aa I understood it.
（第３のペプチド配列設計法）
実施例１及び実施例２の実験結果、解析結果の双方から好ましいアミノ酸配列設計法のとして、以下の4点を考慮した設計法を挙げることができる。
(Third peptide sequence design method)
As a preferred amino acid sequence design method from both the experimental results and the analysis results of Example 1 and Example 2, there can be mentioned a design method considering the following four points.
1）１５残基以下のペプチド配列で、特にN末端側に負電荷をもつアミノ酸残基（Asp,Glu）、C末端側に正電荷をもつアミノ酸残基（Lys,Arg）を配し、静電引力によってナノファイバー形成能を高める。 1) Peptide sequence of 15 residues or less, especially amino acid residues with negative charge (Asp, Glu) on the N-terminal side and amino acid residues (Lys, Arg) with positive charge on the C-terminal side. The ability to form nanofibers is enhanced by the attractive force.
2）ペプチドの残基数をNとした場合、ペプチド全体の水溶性をたかめ、ナノファイバー形成を促進させるために、配列全体の20％から50％（両末端を含む）を親水性残基にし、とくに、親水性残基を電荷のある側鎖をもつアミノ酸残基（Asp,Glu,Lys,Arg）にし、k番目の残基と(N+1-k)番目の残基の電荷を逆にする。 2) When the number of residues in the peptide is N, 20% to 50% of the entire sequence (including both ends) is made hydrophilic to increase the water solubility of the entire peptide and promote nanofiber formation. In particular, the hydrophilic residues are changed to amino acid residues with charged side chains (Asp, Glu, Lys, Arg), and the charges of the kth and (N + 1-k) th residues are reversed. To.
3）ペプチド配列において、親水性残基以外の残基を疎水性残基とし、疎水性相互作用による凝集力をたかめるためにPhe,Ile,Valを用いる。 3) In the peptide sequence, residues other than hydrophilic residues are made hydrophobic residues, and Phe, Ile, and Val are used to increase the cohesive force due to hydrophobic interaction.
4）k番目を親水性で電荷をもつアミノ酸残基とした場合、k+1番目を同じ電荷を持たせるか、あるいは、疎水性残基にすることで、k番目とk+1番目の側鎖間に反発力をもたせ、ナノファイバー形成時に、側鎖がベータシートの逆の面に来るようにする。 4) When the kth is a hydrophilic and charged amino acid residue, the k + 1 and the (k + 1) th side can be obtained by making the k + 1th the same charge or making it a hydrophobic residue. Create a repulsive force between the chains so that the side chains are on the opposite side of the beta sheet during nanofiber formation.
（機能性分子付加方法）
ペプチドナノファイバーには反応性の高い側鎖をもつアミノ酸を導入することができ、機能性分子を付加することで様々な機能をもつペプチドナノファイバーを実現することができる。ナノファイバーになんらかの機能性分子を付加する方法としては、次の２つが考えられる。
(Functional molecule addition method)
An amino acid having a highly reactive side chain can be introduced into peptide nanofibers, and peptide nanofibers having various functions can be realized by adding functional molecules. The following two methods are conceivable as methods for adding any functional molecule to the nanofiber.
１）すでに機能をもつタンパク質のN末端、あるいはC末端側にナノファイバー形成能をもつペプチドを追加し、その部分でファイバー形成をさせつつ、機能をもつタンパク質をナノファイバーに固定する方法。 1) A method in which a peptide having a nanofiber forming ability is added to the N-terminal or C-terminal side of a protein that already has a function, and the functional protein is fixed to the nanofiber while forming a fiber at that portion.
２）ファイバー形成するペプチドのうち、ファイバー形成に直接かかわりのないN、C両末端あるいは側鎖の一部に、機能をもつ分子を結合させる方法。図１１にペプチドのN末端、Cys残基側鎖のスルフヒドリル基、そしてリジン残基側鎖のアミノ基に機能性分子を付加した場合の模式図を示す。尚、図１１において、機能性分子１は、主鎖のN末端及びLys残基の側鎖のアミノ基に化学的に結合する分子であり、機能性分子２は、Cys残基の側鎖のスルフヒドリル基に化学的に結合する分子であるとする。
2) A method in which a molecule having a function is bound to both N and C terminal ends or a part of a side chain, which is not directly involved in fiber formation, among peptides that form fibers. FIG. 11 shows a schematic diagram when functional molecules are added to the N-terminus of the peptide, the sulfhydryl group of the Cys residue side chain, and the amino group of the lysine residue side chain. In FIG. 11,
１）の方法では、ナノファイバーはファイバー形成している部分のペプチド鎖間距離（β-ストランド間距離）が4Å〜５Åと短いため、機能をもつタンパク質の大きさも比較的小さいものに限られる。これを回避するためには、ファイバー形成部分のペプチドがヘアピンターンによってファイバー方向に長く連なるような方法をとるしかない。しかしこの場合、ナノファイバーを形成する部分の配列は数十残基の長さに及び、設計が大変困難になる。また付加されたタンパク質がペプチドのファイバー形成に悪影響を与えることもあり得る。さらに付加される機能自身がタンパク質によって実現されるものに限られるため、あまり実用的ではない。 In the method 1), since the nanofibers have a short fiber distance (β-strand distance) of 4 to 5 mm in the part where the fibers are formed, the size of the functional protein is limited to a relatively small size. In order to avoid this, there is no choice but to take a method in which the peptide at the fiber forming part is long in the fiber direction by hairpin turn. However, in this case, the arrangement of the part forming the nanofiber is several tens of residues long, and the design becomes very difficult. In addition, the added protein may adversely affect peptide fiber formation. Furthermore, since the added function itself is limited to that realized by the protein, it is not very practical.
２）の方法は、ナノファイバーを形成するペプチドの主鎖あるいは側鎖に機能性分子と結合する部分を見い出すことになる。比較的結合性の高い官能基としては、アミノ基（NH3 +）やスルフヒドリル基（SH）がある。スルフヒドリル基はCys残基の側鎖末端に存在し、これを用いて様々な機能性分子を付加し、機能性ナノファイバーを作ることができる。またN末端およびLys残基の側鎖末端のアミノ基を利用し、ここに機能をもつ分子を付加することもできる。 In the method 2), a portion that binds to a functional molecule is found on the main chain or side chain of the peptide forming the nanofiber. Examples of functional groups having relatively high binding properties include amino groups (NH 3 + ) and sulfhydryl groups (SH). The sulfhydryl group is present at the end of the side chain of the Cys residue, and can be used to add various functional molecules to make functional nanofibers. In addition, a molecule having a function can be added to the N-terminal and the amino group at the side chain terminal of the Lys residue.
（第４のペプチド配列設計法）
機能性分子の付加法、及び第３の配列設計法を考慮して、下記の配列設計法が導き出される。機能性分子付加が可能なナノファイバー形成能をもつペプチドとして、統計解析からも、また機能性分子を合理的に行ううえでも、7残基の場合は、Glu-Phe-Xaa３- Xaa４- Xaa５-Phe-Lys がもっとも良いことがわかる。ここで、Xaa３、 Xaa４、 Xaa５には、Phe,Ile,Valのいずれかを用いる。また、残基数が6残基以下の場合は安定性の上で問題が残り、また８残基以上では、ペプチド自体の合成に時間がかかり、また収量が悪くなるため、最大でも10残基以下にすることが望ましい。この場合、全体の親水性をコントロールする意味で、全配列中のアミノ酸残基のうち20から40％を親水性アミノ酸にする必要があり、また、その際、凝集力を高めるためには、電荷の正負で側鎖間に引力が働くようにする必要がある。以上の条件から、N残基のナノファイバー形成能をもつペプチドにおいては図１２の概略図にそって、以下の方法で、配列を設計する。
(Fourth peptide sequence design method)
The following sequence design method is derived in consideration of the functional molecule addition method and the third sequence design method. In the case of 7 residues, Glu-Phe-Xaa 3 -Xaa 4 -as a peptide with the ability to form nanofibers, which can be added with functional molecules, from statistical analysis and rational execution of functional molecules It can be seen that Xaa 5 -Phe-Lys is the best. Here, any of Phe, Ile, and Val is used for Xaa 3 , Xaa 4 , and Xaa 5 . In addition, if the number of residues is 6 or less, problems remain in stability, and if it is 8 or more residues, it takes time to synthesize the peptide itself, and the yield decreases. The following is desirable. In this case, in order to control the overall hydrophilicity, 20 to 40% of amino acid residues in the entire sequence must be hydrophilic amino acids. In this case, in order to increase the cohesive force, It is necessary to make attraction between the side chains positive and negative. Based on the above conditions, in the peptide having the ability to form N-residue nanofibers, the sequence is designed by the following method according to the schematic diagram of FIG.
1)１番目の残基をGlu、N番目の残基をLys とする。この場合、N末端のアミノ基、およびN番目（C末端）のLys 側鎖のアミノ基は、機能付加のために利用される。 1) Let Glu be the first residue and Lys the Nth residue. In this case, the amino group at the N-terminal and the amino group at the Nth (C-terminal) Lys side chain are utilized for functional addition.
2) k(1<k<N)番目の残基と(N-k+1)番目の残基は、これを疎水性残基にするならば、Phe,Ile,Val のいずれかにする（Pheであることが望ましい）。 2) The k (1 <k <N) and (N-k + 1) th residues are either Phe, Ile or Val if they are to be hydrophobic residues ( Phe is desirable).
3) k(1<k<N)番目の残基と(N-k+1)番目を親水性残基とする場合には、k番目と(N-k+1)番目を、電荷が反対であるアミノ酸残基を用いる。この場合、用いるアミノ酸残基として正の電荷では、Arg,Lys で、凝集力から考えて、Arg が望ましく、負電荷の場合は、Glu、Asp を用いるが、Asp では、側鎖が短いため、側鎖の長い正の電荷をもつArg,Lys との側鎖結合においてペプチドにゆがみが生ずる可能性がありこれを避けるためには、Glu が望ましい。 3) When the k (1 <k <N) th residue and (N-k + 1) th are hydrophilic residues, the kth and (N-k + 1) th are opposite in charge An amino acid residue is used. In this case, Arg and Lys are positively charged as amino acid residues to be used, and Arg is desirable from the viewpoint of cohesive force, and Glu and Asp are used when negatively charged, but the side chain is short in Asp. Glu is preferred to avoid possible distortion of the peptide during side chain binding to Arg, Lys with a long positive charge on the side chain.
4)また、ペプチド内部において電荷による側鎖の結合が起こらないようにするために、βシート構造では、側鎖がkとk+1 ではβシートの面を中心に互いに逆方向に伸びることを考慮し、ここに側鎖間の反発力を入れ、βシート構造が作りやすくなるように電荷を同じにするか、一方を疎水性、一方を電荷をもつアミノ酸残基とすることで、親水基と疎水基間の弱い反発力を用いることが望ましく、また、kとk+2 番目を電荷をもつアミノ酸残基にした場合は、両者が側鎖結合を起こさないために、電荷を同じにした方が良い。 4) Also, in order to prevent side-chain bonds due to electric charge inside the peptide, in the β-sheet structure, the side chains extend in opposite directions around the β-sheet surface at k and k + 1. Considering this, the repulsive force between the side chains is put here, and the charge is made the same so that the β sheet structure can be easily formed, or one is hydrophobic and one is an amino acid residue having a charge. It is desirable to use a weak repulsive force between the hydrophobic group and the hydrophobic group, and when the k and k + 2nd amino acid residues are charged, the charges are the same so that they do not cause side chain bonding Better.
5)全体として、ナノファイバー形成が障害なく行われるためには、電荷をもつ残基が、全体の20％から50%を占めるようた方が良い。 5) As a whole, in order for nanofiber formation to be performed without hindrance, it is better that the charged residues occupy 20% to 50% of the total.
6)ペプチド合成の容易性から考えて、全体の残基数Nを、最大で15以下にする。 6) Considering the ease of peptide synthesis, the total number of residues N should be 15 or less at maximum.
（機能性分子付加の例）
機能性分子付加の一つの例として、蛍光、あるいは発光素子の固定がある。蛍光分子は、互いに接触して、π電子が重なると蛍光特性を失う。そこで、ナノファイバー上に、広く分散させて、これを固定することで、蛍光特性を保たせることができる。その上で、不織布のようにして、フィルム化することで、蛍光膜を構成することができる。蛍光分子の例として、赤色に蛍光するローダミンが挙げられる。蛍光分子は、部分的に、正または負に荷電する基を持たせることができるので、前記のペプチドナノファイバーのアミノ基に静電相互作用で結合させることが可能である。蛍光分子間距離を長くするために、あらかじめ、ナノファイバーの中の多くのアミノ基をナノファイバー形成後に負イオンで中和しておき、わずかに残った中和されていないアミノ基に蛍光分子が結合するようにする。産業応用としては、LED照明における白色蛍光フィルムとして大きな市場価値がある。
(Example of functional molecule addition)
One example of functional molecule addition is the fixation of fluorescence or light emitting elements. Fluorescent molecules lose their fluorescence properties when they come into contact with each other and π electrons overlap. Therefore, the fluorescent properties can be maintained by widely dispersing the nanofibers and fixing them. Then, the phosphor film can be formed by forming a film like a non-woven fabric. An example of a fluorescent molecule is rhodamine that fluoresces red. Since the fluorescent molecule can partially have a positively or negatively charged group, it can be bonded to the amino group of the peptide nanofiber by electrostatic interaction. In order to increase the distance between fluorescent molecules, many amino groups in the nanofibers are neutralized with negative ions after the nanofibers are formed in advance, and the fluorescent molecules are left on the slightly unneutralized amino groups. Try to combine. For industrial applications, it has great market value as a white fluorescent film in LED lighting.
（機能性分子付加の実験方法）
1)Lys側鎖末端、またはN末端のアミノ基に付加させる場合
ペプチドの遊離のアミノ基（Lys側鎖末端のε−アミノ基やN末端のアミノ基） に機能性分子を結合させるために、弱塩基性（pH7〜8.5）の溶媒条件下で官能基 sulfo-N-hydroxy-succinimide esterを 付加させた機能性分子とペプチドを混合し、数時間（1〜12時間）室温または低温 （〜４℃）で結合 反応を起こさせる。これにより、機能性分子はペプチドのアミノ基に特異的に結合される。
(Experimental method for functional molecule addition)
1) Addition to the Lys side chain end or N-terminal amino group To bind a functional molecule to the free amino group of the peptide (Lys side chain end ε-amino group or N-terminal amino group) A functional molecule to which a functional group sulfo-N-hydroxy-succinimide ester is added and a peptide are mixed under a weakly basic (pH 7 to 8.5) solvent condition, and then at room temperature or low temperature (up to 4 hours). Cause the binding reaction to occur. Thereby, the functional molecule is specifically bound to the amino group of the peptide.
2)Cys側鎖末端のスルフヒドリル基（SH基）に付加させる場合
ペプチドの遊離のスルフヒドリル基（Cys側鎖末端のSH基）に機能性分子を結合させるために、弱酸性（pH6〜7）の溶媒条件下で官能基マレイミドを付加させた機能性分子とペプチドを混合し、数時間（1〜12時間）室温または低温（〜４℃）で結合反応を起こさせる。これにより、機能性分子はペプチドのSH基に特異的に結合される。
2) When adding to the sulfhydryl group (SH group) at the end of Cys side chain In order to bind the functional molecule to the free sulfhydryl group (SH group at the end of Cys side chain) of peptide, it is weakly acidic (pH 6-7) A functional molecule to which a functional group maleimide is added under solvent conditions and a peptide are mixed, and a binding reaction is caused at room temperature or low temperature (˜4 ° C.) for several hours (1 to 12 hours). As a result, the functional molecule is specifically bound to the SH group of the peptide.
（アミノ酸配列設計）
上記機能性分子付加法の2)によりペプチドナノファイバーに機能性分子を付加しうる配列を、第４のアミノ酸配列設計法に従って設計した。比較的均一で分散したナノファイバーを形成する配列番号３の配列を基に、3番目、4番目、そして5番目のアミノ酸残基をそれぞれCysに置換した変異体を３種類設計した。そして、設計した配列のペプチドを合成し、そのナノファイバー形成能を調べた。ここでナノファイバー形成能を調べた配列は、以下のとおりである。
(Amino acid sequence design)
A sequence capable of adding a functional molecule to peptide nanofibers was designed according to the fourth amino acid sequence design method by the functional molecule addition method 2). Based on the sequence of SEQ ID NO: 3 that forms a relatively uniform and dispersed nanofiber, three types of mutants were designed in which the third, fourth, and fifth amino acid residues were substituted with Cys, respectively. And the peptide of the designed arrangement | sequence was synthesize | combined and the nanofiber formation ability was investigated. The arrangement | sequence which investigated nanofiber formation ability here is as follows.
7)Glu-Phe-Cys-Val-Ile-Phe-Lys（配列番号９）：略号EK7aaI3Cとする。 7) Glu-Phe-Cys-Val-Ile-Phe-Lys (SEQ ID NO: 9): The abbreviation EK7aaI3C.
8)Glu-Phe-Ile-Cys-Ile-Phe-Lys（配列番号１０）：略号EK7aaV4Cとする。9)Glu-Phe-Ile-Val-Cys-Phe-Lys（配列番号１１）：略号EK7aaI5Cとする。 8) Glu-Phe-Ile-Cys-Ile-Phe-Lys (SEQ ID NO: 10): The abbreviation EK7aaV4C. 9) Glu-Phe-Ile-Val-Cys-Phe-Lys (SEQ ID NO: 11): The abbreviation EK7aaI5C.
（実験方法）
実験方法は実施例１と同様である。
(experimental method)
The experimental method is the same as in Example 1.
（実験結果）
1.EK7aa13Cの結果（図１３）
図１３（ａ）はEK7aa13Cを模式的に示し、図１３（ｂ）はナノファイバー形成開始から７日後の0mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図１３（ｃ）は0mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。
(Experimental result)
1. Results of EK7aa13C (Figure 13)
FIG. 13 (a) schematically shows EK7aa13C, FIG. 13 (b) shows an AFM image with 0 mM sodium chloride 7 days after the start of nanofiber formation, and FIG. 13 (c) shows CD measurement with 0 mM sodium chloride. A graph of values is shown.
EK7aaI3CのCDスペクトルはどの塩濃度（0mM,50mM,100mM,250mM,500mM,750mM,1000mM塩化ナトリウム）でも配列番号３のアミノ酸配列を有するEK7aaで見られたCDスペクトルと同じような波形を示し、これはEK7aaに類似した構造を形成していると考えられる。このペプチドの凝集体をAFMで観察したところ、形成されたナノファイバーの形態はEK7aaのナノファイバー形態に比較的似ているが、細く短いナノファイバーが多く存在していることが確認された。さらにCR結合アッセイを行った結果、形成されたナノファイバーは緑色の複屈折を示したことから、これらのナノファイバーはアミロイド線維であることが確認された。 The CD spectrum of EK7aaI3C shows a waveform similar to the CD spectrum seen in EK7aa having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 at any salt concentration (0 mM, 50 mM, 100 mM, 250 mM, 500 mM, 750 mM, 1000 mM sodium chloride). Is considered to form a structure similar to EK7aa. When this peptide aggregate was observed by AFM, the form of the nanofiber formed was relatively similar to that of EK7aa, but it was confirmed that there were many thin and short nanofibers. As a result of further CR binding assay, the formed nanofibers showed green birefringence, confirming that these nanofibers were amyloid fibers.
2. EK7aaV4Cの結果（図１４）
図１４（ａ）はEK7aaV4Cの50mM塩化ナトリウムでのAFM像を示し、図１４（ｂ）は50mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。図１４（ａ）からわかるように、EK7aaV4Cでは形成された凝集体は非常に短いナノファイバーであり、それらナノファイバーの存在はEK7aaI3Cの場合と比べて非常に減少していることがわかった。図１４（ｂ）からわかるように、EK7aaV4CのCDスペクトルは、配列番号２〜４、５〜９のアミノ酸配列を有するペプチドとは異なる波形を示した。CR結合アッセイの結果では、ナノファイバーが緑色の複屈折を示したことから、このナノファイバーも同様にアミロイド線維であることがわかった。
2. Results of EK7aaV4C (Figure 14)
FIG. 14 (a) shows an AFM image of EK7aaV4C with 50 mM sodium chloride, and FIG. 14 (b) shows a graph of CD measurement values with 50 mM sodium chloride. As can be seen from FIG. 14 (a), the aggregates formed in EK7aaV4C were very short nanofibers, and the presence of these nanofibers was found to be greatly reduced as compared to EK7aaI3C. As can be seen from FIG. 14B, the CD spectrum of EK7aaV4C showed a waveform different from that of the peptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 4 and 5 to 9. The CR binding assay showed that the nanofibers showed green birefringence, indicating that the nanofibers were amyloid fibrils as well.
3. EK7aaI5Cの結果（図１５）
図１５はEK7aaI5Cの0mM塩化ナトリウムでのCD測定値のグラフを示す。図１５からわかるように、EK7aaV4CのCDスペクトルは、配列番号２〜４、５〜９のアミノ酸配列を有するペプチドとは異なる波形を示した。CR結合アッセイの結果では、ナノファイバーが緑色の複屈折を示したことから、このナノファイバーも同様にアミロイド線維であることがわかった。なお、EK7aa I5Cに関し、AFMではほとんどナノファイバーらしき凝集体は確認することができなかった。
3. Results of EK7aaI5C (Figure 15)
FIG. 15 shows a graph of CD measurement values of EK7aaI5C at 0 mM sodium chloride. As can be seen from FIG. 15, the CD spectrum of EK7aaV4C showed different waveforms from the peptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 4 and 5 to 9. The CR binding assay showed that the nanofibers showed green birefringence, indicating that the nanofibers were amyloid fibrils as well. As for EK7aa I5C, almost no aggregates that seemed to be nanofibers could be confirmed by AFM.
4.1〜3の結果について
上記結果はナノファイバー構造形成において3〜5番目の疎水性残基が重要であることを示すものであり、上記1〜3においては、それらの残基が極性を持つCysに置換されたために疎水性相互作用が弱められナノファイバー形成が阻害されたと思われる。CysとIleの相互作用は、統計解析から見てもIle同士のものよりもかなり弱いことがわかっている。
Regarding the results of 4.1 to 3, the above results indicate that the 3rd to 5th hydrophobic residues are important in the formation of the nanofiber structure. In the above 1 to 3, these residues are polar Cys. It appears that the hydrophobic interaction was weakened and the nanofiber formation was inhibited. The interaction between Cys and Ile is known to be significantly weaker than that between Ile, even from statistical analysis.
ペプチドナノファイバーは、そのままでもさまざまな用途が考えられる。例えば、濾過用のフィルターとして用いることができる。また、親水基を加えて、親水性のナノファイバーとして、水分を吸収する不織布としての利用価値もある。 Peptide nanofibers can be used in various ways as they are. For example, it can be used as a filter for filtration. Moreover, it has a utility value as a nonwoven fabric which absorbs moisture as a hydrophilic nanofiber by adding a hydrophilic group.
本発明にかかるナノファイバーに、機能性分子をつけることで、さまざまな機能をもったナノファイバーを作ることが可能である。アミノ酸残基の側鎖にはさまざまなものが含まれているため、これらの組み合わせ、構造の設計だけでも、十分に幅広い機能をもつものが開発可能である。 By attaching a functional molecule to the nanofiber according to the present invention, it is possible to make nanofibers having various functions. Since various side chains of amino acid residues are included, it is possible to develop those having a sufficiently wide range of functions only by designing these combinations and structures.
例えば、蛍光分子を付加したナノファイバーは、さまざまな色の蛍光灯や、計算機、テレビのディスプレイに利用することができる。また、導電性分子を付加したナノファイバーは微細電子回路の配線に利用できる。また、酵素を付加したナノファイバーは、大規模化学プラントにおいて、酵素を利用した化学反応による化学物質製造に利用できる。 For example, nanofibers to which fluorescent molecules are added can be used for fluorescent lamps of various colors, calculators, and television displays. In addition, nanofibers to which conductive molecules are added can be used for wiring of fine electronic circuits. In addition, nanofibers to which enzymes have been added can be used for the production of chemical substances by chemical reactions using enzymes in large-scale chemical plants.
本発明によって得られるペプチドナノファイバーはナノスケールであるので、量子ドット、トンネル効果、電子軌道等に関連した量子効果のコントロールが可能となる。したがって、新しい物性をもつ材料を開発することができる。 Since the peptide nanofibers obtained by the present invention are nanoscale, it is possible to control quantum effects related to quantum dots, tunnel effects, electron orbits, and the like. Therefore, a material having new physical properties can be developed.
<210>1
<223>１番目の残基のXaaは任意のアミノ酸残基であり、７番目の残基のXaaは任意のアミノ酸残基である。
<210> 1
<223> Xaa of the first residue is an arbitrary amino acid residue, and Xaa of the seventh residue is an arbitrary amino acid residue.
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