JP4448223B2

JP4448223B2 - Bacteria detection method and detection apparatus

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Publication number: JP4448223B2
Application number: JP2000020461A
Authority: JP
Inventors: 勝彦島川; 幸男南保; 勝己高山
Original assignee: Nicca Chemical Co Ltd
Current assignee: Nicca Chemical Co Ltd
Priority date: 1999-01-28
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2010-04-07
Anticipated expiration: 2020-01-28
Also published as: JP2000283945A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌を検出する方法及びその検出に用いる装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細菌等の微生物はあらゆる環境に生存し、人間の生活と密接な関係を有する。微生物の中には病原性微生物として人間あるいは家畜に疾病をもたらすものがある。病原性微生物の中でも特に細菌は、増殖が速く、低温、高温、乾燥などの環境条件に影響を受けにくく、そのため人間の周りに持続的に存在し、一度好条件を得れば爆発的に数を増やして感染症の原因となる。食品や飲料水（水道水を含む）のように、人間の体内に直接摂取されるものについてはもちろんのこと、食品の製造工程で利用される水、食器等の洗浄に利用される水、河川、湖沼、海、プール、浴場等、人が身体を接触させる水、下水放流水など人と接触する機会がある水については、細菌に対する適正な管理が実施されることが望まれる。
【０００３】
ところで、このような食品、飲料水（水道水）、プール水、浴場等についての細菌の検出は、一般的には培養法により従来実施されている。このような従来行われている培養法では、例えば大腸菌や大腸菌群ではこれを他の一般細菌から区別するための工夫が必要であり、したがって、試験に際して用いる検出方法としては、大腸菌や大腸菌群が選択的に増殖する培地、あるいは増殖すると色調が変化したりコロニーの色に特殊な色が生じる工夫がされた培地を用いる場合が多い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上述した培養法では、培養によって菌が増殖するまでの時間に加えて、増殖した細菌が大腸菌あるいは大腸菌群であるかどうかの判定法が煩雑である。すなわち培養法は、大腸菌や大腸菌群による汚染の有無を推定するだけでも１日を要し、混入しているのが大腸菌、大腸菌群であるのか否かを確定するのに２日を要し、更に完全な試験をしようとすれば菌体の特殊染色などの試験を重ねる必要があって判定までに時間がかかる。
【０００５】
このように、培養法による細菌検出は時間を要し、結果が得られるより以前に被害が生じてこれが拡大してしまうケースが懸念される。以上のこととは別に、培養法は寒天培地上あるいはメンブレンフィルター上に形成した特殊な性状を示すコロニーを目で見て数えて定量するか、陽性を示す試料の最大希釈倍率から元の試料に含まれていた菌数を算定する方法が普通であるため、特殊な形状を示すコロニーの判定はあいまいな部分も多く、また最大希釈倍率から求める方法ではおおよその推定値が求められるにすぎず、定量性に乏しいという問題もある。
【０００６】
本発明者は、以上のような問題点を解消すべく鋭意研究し、細菌の細胞膜に存在する酵素の作用に対応してメディエーターを反応させ、該反応したメディエーターを電気化学的に検出することにより、細菌を全体として、又は特定の細菌のみを検出し、また定量することが可能となり、簡易な操作、測定時間の短縮、効率の向上、検出精度の向上を飛躍的に高めることができることを見いだし本発明をなすに至ったものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
Ａ．本発明にかかる細菌の検出方法は、試料中に存在する検出されるべき細菌（生菌を含む）の細胞膜に存在する酵素の作用に対応して反応するメディエーターと反応させ、該反応したメディエーターを電気化学的手法により検出若しくは定量することにより、該細菌を検出若しくは定量することを特徴とする。図１にはかかる本発明の方法を模式的に示す。すなわち、細胞膜に存在する酵素の基質との反応に対し、直接又はリンクして外部に存在するメディエーター（Ｍox）が反応してＭredを生成し、かかるＭredが、電極表面に移動し、電気化学反応により再びＭoxへと変化する。この電気化学反応を高感度な電流測定により検出する。
【０００８】
さらに、本発明にかかる細菌の検出方法は、前記酵素が、前記細菌に特異的な酵素であることを特徴とする。かかる場合、試料中に特定の検出されるべき菌の他に他の菌が共存しても、分離等の前処理をすることなく該特定の検出されるべき菌のみを検出若しくは定量することができる。
【０００９】
Ｂ．本発明にかかる細菌の検出装置は、前記Ａ．の本発明にかかる細菌の検出方法を用いるものであり、試料液に前記酵素に対する基質を添加する手段と、前記試料液に前記メディエーターを添加する手段と、前記反応したメディエーターを検出する電気化学的検出手段とを備えたことを特徴とする。なお、前記酵素が、前記細菌に特異的な酵素である場合、本発明にかかる装置は、試料中に特定の検出されるべき菌の他に他の菌が共存しても、分離等の前処理をすることなく該特定の検出されるべき菌のみを検出若しくは定量することができるものである。
【００１０】
さらに、本発明にかかる細菌の検出装置は、試料として空気又は液に含まれる細菌を膜上に捕捉する捕捉手段と、前記基質と前記メディエーターを該捕捉した細菌に接触させ反応させる手段と、前記反応したメディエーターを検出する電気化学的検出手段とを備えることを特徴とするものである。かかる捕捉された菌はそのまま、若しくは適当な処理をおこなった後検出することを可能とし、検出の感度、取り扱い易さに優れたものとなる。
【００１１】
さらに、本発明にかかる細菌の検出装置は、試料液中の細菌を濃縮する手段と、前記酵素に対する基質と前記メディエーターを該濃縮した細菌に接触させる手段と、前記反応したメディエーターを検出する電気化学的検出手段とを備えたことを特徴とするものである。かかる濃縮手段により試料中の菌の濃度が低く、そのままでは本発明にかかる電気化学的手段による検出方法が難しい場合に有効となる。
【００１２】
また、本発明にかかる細菌の検出装置は、前記濃縮手段が、膜分離装置又は遠心分離装置であることを特徴とするものである。
【００１３】
また、本発明にかかる細菌の検出装置は前記濃縮手段が、試料液中の限定された狭い領域内に細菌誘因物質を供給する手段であることを特徴とするものである。かかる誘因物質により試料中の低い濃度の細菌の濃度を高くすることが可能となりそのままでは本発明にかかる電気化学的手段による検出方法が難しい場合に有効となる。
【００１４】
また、本発明にかかる細菌の検出装置は、細菌を濃厚に含む試料液を希釈する手段と、前記酵素に対する基質と前記メディエーターを該希釈した細菌に接触させる手段と、前記反応したメディエーターを検出する電気化学的検出手段とを備えたことを特徴とするものである。細菌の濃度が高すぎる場合に、前処理として希釈手段により、本発明にかかる電気化学的手法に最適な細菌の濃度にするこが可能となる。
【００１５】
さらに、本発明にかかる細菌の検出装置は、試料液をフローセル中に連続的に通過させる通液手段と、細菌の細胞膜に存在する酵素の基質と、該酵素の作用に対応して反応するメディエーターとを、前記フローセルの前段において試料液に添加する手段と、反応した前記メディエーターをフローセルで検出する電気化学的検出手段とを備えたことを特徴とするものである。細菌の含まれる試料を連続的に、または任意の時間に選択して細菌を検出若しくは定量することが可能である。
【００１６】
さらに、本発明にかかる細菌測定の方法、および細菌測定装置で使用する電気化学的検出手段が、メディエーターの酸化還元反応に基づく定電位測定に基づいたものであることを特徴とするものである。従って、細菌の個数（濃度）に比例した電流値が得られ、その電流値を測定することで試料中の細菌の個数（濃度）が測定可能となる。
【００１７】
以下、本発明を実施の形態に即して詳細に説明する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
Ａ．細菌
本発明にかかる方法または装置により検出、定量可能な菌の種類については特に制限はない。検出されるべき菌がその細胞膜内に酵素を有し、該酵素が該酵素反応条件下で酵素反応を行い、該酵素反応により、さらに本発明にかかるメディエーターと反応するものであればよい。かかる菌は試料中で生きているものも含む。具体的には、本発明により検出可能な菌としては、Escherichia coli、 Pseudomonas denitrificans、 Gluconobacter industrius、 Serratia marcesens、 Lactobacillus casei、 Saccharomyces cerevisiae、Staphylococcus aureus、 Lactobacillus rhamnosusが挙げられる。
【００１９】
さらに、試料中に菌がどのような態様で存在するのかについても特に制限はない。空気中に浮遊して存在する場合、水溶液中に均一に存在する場合、半固形若しくは固形の状態で存在する場合、膜等の固体上に付着して存在する場合等が挙げられる。また、該菌が単独で存在していても、他の菌と混合共存して存在していてもよい。さらに、試料中に存在する濃度についても特に制限はなく、適当な前処理を行うことにより好ましく検出可能となる。
【００２０】
Ｂ．細胞膜、酵素反応、酵素、基質
本発明にかかる検出方法の特徴は、検出されるべき菌の有する細胞膜内に存在する酵素反応を利用するものである。すなわち、検出されるべき菌に対し適当な基質を加えることにより、該酵素反応が進行し、該酵素反応の反応生成物がさらに、存在するメディエーターと反応するものである。この場合、細胞膜内での酵素反応を利用することから、細胞質内での種々の代謝反応を利用する場合に比較して、極めて迅速に応答を測定できるということとなる。かかる細胞膜内に存在する酵素は、検出されるべき菌に特異的に存在する酵素でもよいし、他の複数の菌に共通する酵素であってもよい。特定の菌のみを検出することを目的とする場合には、検出されるべき菌に特異的に存在する酵素を選択することができる。また、試料中に存在する複数の菌の総数を検出する目的においては、該菌に共通する酵素を選択することができる。かかる膜性の酵素の選択は、公知の菌の膜性酵素の知見に基づき当業者により容易に行うことが可能である。具体的には、「高分子錯体−機能と応用８，高分子機能電極、高分子錯体研究会編、学会出版センター、第７章生体分子と電極過程」、「高分子錯体動的相互作用と電子過程、土田英俊偏第４編多電子移動過程の解析」等の記載を参考にすることができ、より具体的には、酵素としては膜結合性の酸化還元酵素の使用が好ましく、特にグルコースデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グルコン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼが挙げられる。
【００２１】
また、該酵素に対する基質についても特に制限はなく、前記選択した酵素の基質であればよい。該基質による該酵素反応と直接、またはそれとリンクしている反応系と、メディエーターと選択的にかつ効率よく反応するものであればよい。
【００２２】
具体的には、前記酵素が酸化還元酵素である場合、該基質による酸化還元反応によりメディエーターが該反応と直接あるいはリンクしている呼吸系と酸化還元反応を起こすものである。
【００２３】
従って、酵素、メディエーターとの組み合わせにより好ましい基質を選択することは当業者にとり容易である。具体的には、「高分子錯体−機能と応用８，高分子機能電極、高分子錯体研究会編、学会出版センター、第７章生体分子と電極過程」、「高分子錯体動的相互作用と電子過程、土田英俊偏第４編多電子移動過程の解析」等を参考にすることができ、より具体的にはグルコース、フルクトース、グリセロール、エタノール等の使用が好ましい。
【００２４】
Ｃ．メディエーター
本発明において使用可能なメディエーターとしては、特に制限はなく、前記酵素反応と直接もしくはリンクして効率よく反応し、安定な反応生成物を与え、かつ該生成物が本発明にかかる電気化学的手法により検出可能であればよい。さらに、本発明においては、メディエーターの反応生成物が低電位で酸化還元反応をし、初めのメディエーターに戻るものであることから、かかる酸化還元電位があまり高くないものが好ましい。この場合、試料中に存在する他の電気化学的活性種によるバックグラウンドを抑制することとなる。さらに、メディエーターは酵素反応に基づく反応と、電気化学的手法による電気化学反応とにより繰り返し用いられるものであり、化学的に安定であるものが好ましい。従って、本発明において好ましく使用可能なメディエ−ターは上の特性を兼ね備えたものであり、具体的には、ベンゾキノン、２，６−ジメチルベンゾキノン、メトキシベンゾキノン、ビタミンＫ₃（メナジオン）等が挙げられ、ベンゾキノン、ビタミンＫ₃（メナジオン）がより好ましく使用可能である。
【００２５】
Ｄ．電気化学的検出装置
本発明においては、前記説明したメディエ−ターの酵素反応生成物との反応による生成物（以下メディエーター生成物）を電気化学的手法により、もとのメディエーターへ変換する際に生じる応答（例えば還元電流）を検出定量するものである。従って、かかる電気化学的反応を可能とする装置であれば特に制限はなく、通常公知の電気化学的検出装置が使用可能である。具体的には、「電気化学測定法（上）藤嶋昭、相澤益男、井上徹」に記載されている種々の電極、および反応装置、または測定系を使用することが可能である。特に好ましい電極の材料としてはグラッシーカーボン、金、銀、白金等が挙げられる。また、反応装置としてはポテンショスタット（高感度測定用）が挙げられる。また測定系としては、一定電圧を与え、当該電気化学的反応により応答する電流値を測定する定電位測定方法が好ましく使用可能である。
【００２６】
Ｅ．また、試料液に基質を添加する手段、メディエーターを添加する手段についても特に制限はなく、通常公知の溶液の定量的添加装置を用いることができる。具体的には、市販の低流量ポンプが挙げられる。
【００２７】
Ｆ．膜上に捕捉する捕捉手段
本発明においては、菌を捕捉する捕捉手段としては、特に制限はないが、活性炭や、中空糸膜，マイクロフィルター，ウルトラフィルター，逆浸透膜等の濾過膜が例示され、吸着手段としては、不織布，繊維状ろ過材，イオン交換樹脂，砂ろ過材など細菌を吸着できるものを用いることができる。これにより、例えば水処理装置中に設置したろ過用のフィルターに被処理水を通水させて細菌をフィルター上に捕捉することが可能となる。高精度で簡易な検出が求められる場合に好適に適用できる。さらに、上記のように試料液（被検水）中の細菌の検出に利用される他、空気中の浮遊細菌の検出にも利用することもできる。例えば細菌が浮遊している気体（空気）を、水中で散気（バブリング）して水中に細菌をトラップしてサンプル液としてもよいし、吸引空気をフィルターでろ過して上記と同様にフィルター上に捕捉し、フィルターに直接ファージ溶液を接触させるか、あるいはフィルターを生理食塩水等に浸漬して細菌を剥離することが可能となる。この方法によれば、例えばエアコンディショナーやその他の空気清浄設備内に設置したフィルターを検査することで、病院，食品工場等の細菌汚染が問題となる環境空間の状態を調べることに好適に適用することができる。
【００２８】
Ｇ．試料液中の細菌を濃縮、希釈等の前処理手段
また、本発明による検出方法において、検出しようとする細菌を希薄に含む試料液中で該細菌を濃縮し、基質、メディエーターと反応させ、電気化学的手段を用いて検出することを特徴とするものである。この濃縮には例えば膜を用いて行うことができ、被検体である細菌の通過を阻止する膜であれば、膜の種類，材質は特に限定されることなく使用できる。このような細菌の濃縮法を用いた装置の具体例としては、例えば、流れるサンプル水を一定時間毎に一定量づつ自動的に採水して膜のある槽に入れて自動的に濃縮し、濃縮したサンプル水を自動的に取出して自動計測するようにする場合を例示できる。試料液中に希薄に存在する細菌を濃縮して検出を有効に行うことができる。
【００２９】
また、細菌の濃縮は、液全体について細菌を濃縮する場合、あるいは液中で細菌を一部に偏在させて部分的に濃縮させる場合のいずれであってもよく、例えば膜分離又は遠心分離により細菌を濃縮することが可能である。
【００３０】
細菌を濃縮する他の方法としては、また、試料液中の狭い領域内に検出しようとする特定細菌の誘因物質を供給することができるし、細菌誘因物質をキャピラリ（毛細管）を用いて供給することもできる。前記誘因物質としては、例えばアミノ酸であればセリン，アスパラギン酸等、糖であればグルコース，ガラクトース，マルトース，リボース等、有機酸であればクエン酸，リンゴ酸等を挙げることができる。また上記有機物質以外にも呼吸鎖の電子受容体となる酸素，フマル酸，硝酸などを挙げることができる。
【００３１】
また、本発明にかかる方法は、検出しようとする細菌を濃厚に含む試料液を希釈し、基質、メディエーターと反応させ、電気化学的手段を用いて検出することを特徴とするものである。試料液の稀釈には、適宜の稀釈液注入装置を用いることができる。すなわち、細菌を濃厚に含む溶液中の活性のある細菌数を検出，測定することができるので、例えば有用細菌を用いた食品製造工程等において、細菌の活性管理などに利用できる。
【００３２】
以下、本発明を実施例に即して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。。
【００３３】
【実施例】
（実施例１）海洋性脱窒細菌の電気化学的計数
菌体はParacoccus denitrificans菌体を選定した。
【００３４】
グラッシーカーボン電極の表面を透析膜で被覆し、リン酸緩衝液（pH7.3、1mM KNO₃含む）に浸してから、窒素ガスにより除酸素した。電極電位を-0.4V(Ag/AgCl)に設定した後、メディエーターとして0.5mMになるようにデュロヒドロキノン(DQH2)を添加した後、任意の濃度になるよう菌体懸濁液を添加して電流値を測定した。
【００３５】
脱窒細菌を溶液中に分散させて測定した場合（懸濁法）の菌体濃度と電極応答の関係を図２に示す。この方法では、1ml中10⁶個が検出限界であることがわかった。
【００３６】
（実施例２）Saccharomyces cerevisiaeの電気化学的計数
菌体はSaccharomyces cerevisiae菌体を選定した。
溶液は0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0)を用いた。この酵母菌をニトロセルロース膜（1.0μmポアーサイズ、150μm厚さ）にトラップし、5mm直径のグラファイトカーボン電極（図３（ｂ）参照）上にのせて電極を構築した（図３（ａ）参照）。電極電位をポテンショスタットにより0.2V(Ag/AgCl)に設定した。電極電流が安定になるまでまち、後0.25mMになるようにメディエーター水溶液を添加し、つづいて0.4mMになるようにグルコース水溶液を添加する。ここでメディエーターはベンゾキノンを使用した。図４に示した応答カーブが得られ、電流応答は菌体の固定量に比例することがわかった。
【００３７】
（実施例３）E.coliの電気化学的計数
菌体はE.coli菌体を選定した。溶液は0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0)を用いた。
3mm直径のグラファイトカーボン電極を用いて、電極電位をポテンショスタットにより0.5V(Ag/AgCl)に設定した。電極電流が安定になるまでまち、後1mMになるように各種メディエーター水溶液を添加した。つづいて大腸菌を含んだ溶液を添加した。
【００３８】
その結果、図５に示すレスポンスカーブが得られた。また、図５に示すように電流応答は10⁶〜10⁷の菌体数範囲で比例する（この場合、メディエーターをベンゾキノンとし、10mM濃度に設定した）。
【００３９】
（実施例４）Escherichia coli、 Staphylococcus aureus、 Lactobacillus rhamnosus、 Saccharomyces cerevisiaeの電気化学的計数
菌体としてEscherichia coli（IAM1264）、Staphylococcus aureus（IAM1011）、Lactobacillus rhamnosus（ATCC7469）の細菌3株と、酵母菌Saccharomyces cerevisiae(IFO0203)を選定した。
（実施例４−１）細菌を電気化学的に検出する方法
電気化学測定には、３電極方式ボルタンメトリーシステム（ＢＡＳ社製：１００ＢＷ）を用いた。参照電極にはAg／AgCl（飽和KCl溶液）を用いた。測定セルには自作のアクリル製容器（1cm³容積）に円盤状の白金対極（直径５mm）を底部に埋め込んだもの用いた。作用電極には金電極（ＢＡＳ社製：直径２mm）にポリカーボネート膜（ミリポア社製：ポアーサイズ0.45μｍ）で被覆したものを用いた。溶液は、全て1／15Mりん酸緩衝液(pH7.0)を用いた。
【００４０】
細菌数の計測は、以下の方法で行った。
すなわち、測定セルに5mMベンゾキノンあるいはメナジオンりん酸緩衝液1cm³を注入し、電極電位を0.5Vに設定した。電極応答が安定するのを待った後、菌体数既知の各種微生物を含んだ懸濁液0.05cm³を添加した。測定中は常時窒素ガス通気により除酸素を行い、溶液はスターラーにより攪拌した。
また、計数盤による直接計数法として、酵母菌についてはThomaの血球計算盤を、細菌についてはPetroff‐Hauser計数盤を用いた。均一な菌体懸濁液を適当に希釈し、これを計数盤上に滴下しカバーグラスをかけ、４００倍にて４区画中の細菌数を数えた。４区画の容積はそれぞれ2.5×10^-7cm³、5×10^-8cm³である。
さらに、平板培養法による計数法として、各菌体に対する平板寒天選択培地を用いて、３５℃、一昼夜培養後、生じたコロニー数から生菌数を見積もった。
【００４１】
（実施例４−２）電気化学的検出におけるメディエーターの選択とその特性
菌体数を顕微鏡による直接計数法と平板培養法により測定した。その結果、Escherichia coli（IAM1264）菌体懸濁液（OD₆₆₀＝1）は直接計数法により1cm³あたり10¹⁰個、平板培養法では10⁹個であることが分かった。以後、菌体培養液の濁度から各手法により測定された菌体数とを対応させることができることとなった。Staphylococcus aureus（IAM1011）、Lactobacillus rhamnosus（ATCC7469）菌体についてもEscherichia coli（IAM1264）菌体とほぼ同様の対応関係が得られた。Saccharomyces cerevisiae(IFO0203)については、菌体懸濁液（OD₆₆₀＝1）に対して、直接計数法、平板培養法共に1cm³あたり10⁸個であることが分かった。
【００４２】
メディエーターとしてベンゾキノンを用いて、セルに菌体数既知のEscherichia coli（IAM1264）菌体とStaphylococcus aureus（IAM1011）菌体懸濁液を添加したときの電流―時間応答曲線を図６に示す。
一方、メナジオンを用いた場合の、Escherichia coli（IAM1264）菌体とStaphylococcus aureus（IAM1011）菌体懸濁液に対する電流―時間応答曲線を図７に示す。ベンゾキノンを用いた場合に比較して、Escherichia coli（IAM1264）菌体よりStaphylococcus aureus（IAM1011）に対する応答が高くなった。Escherichia coliのメディエーターとしてベンゾキノンが、Staphylococcus aureusのメディエーターとしてメナジオンが有効であることが示された。
【００４３】
各細菌を懸濁状態（pH7.0りん酸緩衝液中）で室温下に放置したときの６日間にわたる電極応答の変化を測定した。各測定値は試料添加５００秒後に得られた電流値である。ベンゾキノンを用いた場合（図８（ａ））、Escherichia coli（IAM1264）、Saccharomyces cerevisiae(IFO0203)については、４日目以降から応答が減少を示し、Lactobacillus rhamnosus（ATCC7469）、Staphylococcus aureus（IAM1011）については、６日間にわたりほぼ一定の応答を示した。一方、メナジオンを用いた場合（図８（ｂ））、各菌体とも電極応答は経時的に減少の傾向を示した。
【００４４】
（実施例４−３）電気化学的検出方法による細菌の計数
Escherichia coli（IAM1264）について、ベンゾキノンを用いて菌体数―電流曲線を測定した（図９）。各測定値は試料添加５００秒後に得られる電流値であり、10⁹から5×10¹⁰個／cm³の範囲で直線性が得られた。これにより該電気化学的検出方法の有用性が示された。また、Escherichia coliに対するメディエーターとしてベンゾキノンが有効であることが示された。
【発明の効果】
本発明にかかる細菌の検出方法は、試料中に存在する検出されるべき細菌（生菌を含む）の細胞膜に存在する酵素の作用に対応して反応するメディエーターと反応させ、該反応したメディエーターを電気化学的手法により検出若しくは定量することに基づき、該細菌を検出若しくは定量することが可能とするものであることを特徴とする。また、前記酵素が、前記細菌に特異的な酵素であることを特徴とする。かかる場合、試料中に特定の検出されるべき菌の他に他の菌が共存しても、分離等の前処理をすることなく該特定の検出されるべき菌のみを検出若しくは定量することを可能とするものである。
【００４５】
本発明にかかる細菌の検出装置は、前記本発明にかかる細菌の検出方法を用いるものであり、試料液に前記酵素に対する基質を添加する手段と、前記試料液に前記メディエーターを添加する手段と、前記反応したメディエーターを検出する電気化学的検出手段とを備えたことを特徴とする。なお、前記酵素が、前記細菌に特異的な酵素である場合、本発明にかかる装置は、試料中に特定の検出されるべき菌の他に他の菌が共存しても、分離等の前処理をすることなく該特定の検出されるべき菌のみを検出若しくは定量することができるものである。
【００４６】
以上の構成による本発明の方法によれば、上下水、環境水、食品の細菌検査を迅速にかつ効率的におこなうことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法を模式的に示す図である。
【図２】実施例１の結果を示す図である。Paracoccus denitrificans菌体懸濁液を電気化学法により計測した、菌体数―電流曲線を示すグラフである。
【図３】実施例２で用いた電気化学的検出系を示す図である。
【図４】実施例２の結果を示す図である。Saccharomyces cerevisiae菌体懸濁液を電気化学法により計測した、電流―時間応答曲線を示すグラフである。
【図５】実施例３の結果を示す図である。ここで、ＢＱはベンゾキノンの略である。
【図６】実施例４の結果を示す図である。ベンゾキノンを用いてEscherichia coli（IAM1264）菌体とStaphylococcus aureus（IAM1011）菌体懸濁液を電気化学法により計測した、電流―時間応答曲線を示すグラフである。
【図７】実施例４の結果を示す図である。メナジオンを用いてEscherichia coli（IAM1264）菌体とStaphylococcus aureus（IAM1011）菌体懸濁液を電気化学法により計測した、電流―時間応答曲線を示すグラフである。
【図８】実施例４の結果を示す図である。各細菌を懸濁状態で室温に放置した際の6日間にわたる電極応答の変化をプロットしたものである。（ａ）はメディエーターにベンゾキノンを、（ｂ）はメナジオンを用いたグラフである。
【図９】実施例４の結果を示す図である。ベンゾキノンを用いて電気化学法により計測した、菌体数―電流曲線を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting bacteria and an apparatus used for the detection.
[0002]
[Prior art]
Microorganisms such as bacteria survive in all environments and have a close relationship with human life. Some microorganisms cause diseases to humans or livestock as pathogenic microorganisms. Among pathogenic microorganisms, especially bacteria are fast growing and are not easily affected by environmental conditions such as low temperature, high temperature, and dryness. Increase the cause of infection. Water used for washing foods, dishes, etc., rivers, rivers, as well as foods and drinking water (including tap water) that are directly taken into the human body It is desirable to implement appropriate management of bacteria for water that has the opportunity to come into contact with humans, such as water, lakes, seas, pools, baths, etc.
[0003]
By the way, the detection of bacteria in such foods, drinking water (tap water), pool water, baths and the like is generally performed conventionally by a culture method. In such a conventional culture method, for example, E. coli and coliforms need to be devised to distinguish them from other general bacteria. Therefore, as detection methods used in the test, E. coli and coliforms are In many cases, a selective growth medium, or a medium that has been devised to change its color tone or produce a special color in the colony color is often used.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the culture method described above, in addition to the time until the bacteria grow by the culture, the method for determining whether the grown bacteria are Escherichia coli or coliforms is complicated. That is, the culture method requires one day just to estimate the presence or absence of contamination by E. coli or coliforms, and it takes 2 days to determine whether the contamination is E. coli or coliforms. Furthermore, if a complete test is to be performed, it is necessary to repeat tests such as special staining of bacterial cells, and it takes time to make a determination.
[0005]
As described above, the detection of bacteria by the culture method takes time, and there is a concern that damage may occur before the result is obtained and this may spread. In addition to the above, the culture method is to visually count and quantify colonies with special properties formed on the agar medium or on the membrane filter, or from the maximum dilution rate of the positive sample to the original sample. Since the method of calculating the number of bacteria contained is common, the determination of colonies showing a special shape is often ambiguous, and the method of obtaining from the maximum dilution factor only gives an approximate estimate, There is also a problem of poor quantitativeness.
[0006]
The present inventor has intensively studied to solve the above problems, reacting a mediator in response to the action of an enzyme present in the bacterial cell membrane, and electrochemically detecting the reacted mediator. It has been found that it is possible to detect and quantify bacteria as a whole or only specific bacteria, and to dramatically improve simple operation, measurement time reduction, efficiency improvement, and detection accuracy improvement. The present invention has been achieved.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
A. The method for detecting a bacterium according to the present invention comprises reacting with a mediator that reacts in response to the action of an enzyme present in the cell membrane of a bacterium to be detected (including viable bacteria) present in a sample. The bacterium is detected or quantified by detection or quantification by an electrochemical technique. FIG. 1 schematically shows the method of the present invention. In other words, the mediator (Mox) that is present directly or linked to the reaction with the substrate of the enzyme present in the cell membrane reacts to generate Mred, and this Mred moves to the electrode surface and is subjected to an electrochemical reaction. To Mox again. This electrochemical reaction is detected by highly sensitive current measurement.
[0008]
Furthermore, the bacteria detection method according to the present invention is characterized in that the enzyme is an enzyme specific for the bacteria. In such a case, even if other bacteria coexist in the sample in addition to the specific bacteria to be detected, only the specific bacteria to be detected can be detected or quantified without pretreatment such as separation. it can.
[0009]
B. The bacteria detection apparatus according to the present invention comprises the above-described A. The method for detecting a bacterium according to the present invention comprises: means for adding a substrate for the enzyme to a sample solution; means for adding the mediator to the sample solution; and electrochemical for detecting the reacted mediator And detecting means. When the enzyme is an enzyme specific for the bacterium, the apparatus according to the present invention can be used before separation or the like even if other bacteria coexist in the sample in addition to the specific bacteria to be detected. Only the specific bacteria to be detected can be detected or quantified without any treatment.
[0010]
Furthermore, the bacteria detection apparatus according to the present invention comprises a capturing means for capturing bacteria contained in air or liquid as a sample on a membrane, a means for bringing the substrate and the mediator into contact with the captured bacteria and reacting them, And an electrochemical detection means for detecting the reacted mediator. Such trapped bacteria can be detected as they are or after appropriate treatment, and the detection sensitivity and handling ease are excellent.
[0011]
Furthermore, the bacteria detection apparatus according to the present invention comprises means for concentrating bacteria in a sample solution, means for bringing the substrate for the enzyme and the mediator into contact with the concentrated bacteria, and electrochemical for detecting the reacted mediator. And an automatic detection means. This concentration means is effective when the concentration of bacteria in the sample is low and the detection method using the electrochemical means according to the present invention is difficult as it is.
[0012]
The bacteria detection apparatus according to the present invention is characterized in that the concentration means is a membrane separator or a centrifugal separator.
[0013]
The bacteria detection apparatus according to the present invention is characterized in that the concentration means is means for supplying a bacteria-inducing substance into a limited narrow region in the sample solution. Such an inducer can increase the concentration of low-concentration bacteria in the sample, and is effective when the detection method using the electrochemical means according to the present invention is difficult as it is.
[0014]
In addition, the bacteria detecting apparatus according to the present invention detects means for diluting a sample solution containing bacteria, means for bringing the substrate for the enzyme and the mediator into contact with the diluted bacteria, and the reacted mediator. And an electrochemical detection means. When the concentration of bacteria is too high, it is possible to obtain the optimum concentration of bacteria for the electrochemical technique according to the present invention by means of dilution as a pretreatment.
[0015]
Furthermore, the bacterial detection apparatus according to the present invention comprises a fluid passing means for continuously passing a sample solution through a flow cell, an enzyme substrate present in the bacterial cell membrane, and a mediator that reacts in response to the action of the enzyme. Are added to the sample solution in the previous stage of the flow cell, and electrochemical detection means is used to detect the reacted mediator by the flow cell. A sample containing bacteria can be selected continuously or at any time to detect or quantify the bacteria.
[0016]
Further, the method for measuring bacteria according to the present invention and the electrochemical detection means used in the bacteria measuring apparatus are based on a constant potential measurement based on a redox reaction of a mediator. Therefore, a current value proportional to the number (concentration) of bacteria is obtained, and the number (concentration) of bacteria in the sample can be measured by measuring the current value.
[0017]
Hereinafter, the present invention will be described in detail according to embodiments.
[0018]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
A. Bacteria
There is no particular limitation on the type of bacteria that can be detected and quantified by the method or apparatus according to the present invention. Any bacteria may be used as long as the bacterium to be detected has an enzyme in its cell membrane, the enzyme performs an enzyme reaction under the enzyme reaction conditions, and further reacts with the mediator according to the present invention. Such bacteria include those that are alive in the sample. Specific examples of the bacteria that can be detected by the present invention include Escherichia coli, Pseudomonas denitrificans, Gluconobacter industrius, Serratia marcesens, Lactobacillus casei, Saccharomyces cerevisiae, Staphylococcus aureus, and Lactobacillus rhamnosus.
[0019]
Furthermore, there is no restriction | limiting in particular about what kind of microbe exists in a sample. The case where it exists in air, the case where it exists uniformly in an aqueous solution, the case where it exists in a semi-solid or solid state, the case where it exists attached to a solid such as a film, and the like can be mentioned. Moreover, even if this microbe exists independently, it may exist by mixing and coexisting with another microbe. Further, the concentration present in the sample is not particularly limited, and can be preferably detected by performing an appropriate pretreatment.
[0020]
B. Cell membrane, enzyme reaction, enzyme, substrate
A feature of the detection method according to the present invention is that it utilizes an enzyme reaction that exists in the cell membrane of the bacteria to be detected. That is, by adding an appropriate substrate to the bacteria to be detected, the enzyme reaction proceeds, and the reaction product of the enzyme reaction further reacts with the existing mediator. In this case, since the enzyme reaction in the cell membrane is used, the response can be measured very rapidly compared to the case of using various metabolic reactions in the cytoplasm. The enzyme present in the cell membrane may be an enzyme that exists specifically for the bacterium to be detected, or may be an enzyme common to a plurality of other bacteria. When the purpose is to detect only a specific bacterium, an enzyme specifically present in the bacterium to be detected can be selected. For the purpose of detecting the total number of a plurality of bacteria present in a sample, an enzyme common to the bacteria can be selected. Such a membrane enzyme can be easily selected by a person skilled in the art based on the knowledge of a known membrane enzyme of a fungus. Specifically, “Polymer Complex-Function and Application 8, Polymer Functional Electrode, edited by Polymer Complex Study Group, Society Publishing Center, Chapter 7 Biomolecules and Electrode Process”, “Polymer Complex Dynamic Interaction and For example, the use of membrane-bound oxidoreductase is preferred as the enzyme, particularly glucose. Examples include dehydrogenase, fructose dehydrogenase, gluconate dehydrogenase, and alcohol dehydrogenase.
[0021]
Moreover, there is no restriction | limiting in particular also about the substrate with respect to this enzyme, What is necessary is just the substrate of the said selected enzyme. Any reaction system may be used that selectively and efficiently reacts with the mediator directly or linked to the enzyme reaction with the substrate.
[0022]
Specifically, when the enzyme is an oxidoreductase, the mediator causes a redox reaction with a respiratory system that is directly or linked to the reaction by a redox reaction by the substrate.
[0023]
Therefore, it is easy for those skilled in the art to select a preferable substrate by combining with an enzyme and a mediator. Specifically, “Polymer Complex-Function and Application 8, Polymer Functional Electrode, edited by Polymer Complex Study Group, Society Publishing Center, Chapter 7 Biomolecules and Electrode Process”, “Polymer Complex Dynamic Interaction and "Electronic processes, Hidetoshi Tsuchida, Vol. 4, analysis of multi-electron transfer processes" can be referred to, and more specifically, glucose, fructose, glycerol, ethanol, etc. are preferably used.
[0024]
C. Mediator
The mediator that can be used in the present invention is not particularly limited, and reacts efficiently with direct or linked with the enzyme reaction to give a stable reaction product, and the product is an electrochemical method according to the present invention. As long as it is detectable by Furthermore, in the present invention, since the reaction product of the mediator undergoes a redox reaction at a low potential and returns to the initial mediator, it is preferable that the redox potential is not so high. In this case, the background due to other electrochemically active species present in the sample is suppressed. Furthermore, the mediator is repeatedly used by a reaction based on an enzyme reaction and an electrochemical reaction by an electrochemical method, and is preferably chemically stable. Therefore, the mediator that can be preferably used in the present invention has the above characteristics. Specifically, benzoquinone, 2,6-dimethylbenzoquinone, methoxybenzoquinone, vitamin K _Three (Menadione) and the like, benzoquinone, vitamin K _Three (Menadione) can be used more preferably.
[0025]
D. Electrochemical detector
In the present invention, a response (for example, a reduction current) generated when the product (hereinafter referred to as mediator product) obtained by the reaction of the mediator with the enzyme reaction product described above is converted to the original mediator by an electrochemical method. ) Is detected and quantified. Accordingly, there is no particular limitation as long as it is an apparatus that enables such an electrochemical reaction, and a generally known electrochemical detection apparatus can be used. Specifically, it is possible to use various electrodes, reaction apparatuses, and measurement systems described in “Electrochemical Measurement Method (Upper) Akira Fujishima, Masao Aizawa, Toru Inoue”. Particularly preferred electrode materials include glassy carbon, gold, silver, platinum and the like. An example of the reaction apparatus is a potentiostat (for high sensitivity measurement). Further, as the measurement system, a constant potential measurement method in which a constant voltage is applied and a current value that responds by the electrochemical reaction is measured can be preferably used.
[0026]
E. Further, there is no particular limitation on the means for adding the substrate to the sample solution and the means for adding the mediator, and generally known quantitative addition devices for solutions can be used. Specifically, a commercially available low flow pump is mentioned.
[0027]
F. Capture means for capturing on the membrane
In the present invention, the capturing means for capturing the bacteria is not particularly limited, but examples thereof include activated carbon, filtration membranes such as hollow fiber membranes, microfilters, ultrafilters, and reverse osmosis membranes. In addition, those capable of adsorbing bacteria such as fibrous filter media, ion exchange resins, sand filter media can be used. Thereby, for example, the water to be treated can be passed through a filter for filtration installed in a water treatment apparatus, and bacteria can be captured on the filter. This method can be suitably applied when high-precision and simple detection is required. Furthermore, in addition to being used for detecting bacteria in the sample solution (test water) as described above, it can also be used for detecting airborne bacteria in the air. For example, gas (air) in which bacteria are suspended may be diffused (bubbled) in water to trap the bacteria in the water to make a sample solution, or the suction air is filtered through a filter and filtered on the filter as above. And the phage solution can be directly brought into contact with the filter, or the filter can be immersed in physiological saline or the like to exfoliate the bacteria. According to this method, for example, by examining a filter installed in an air conditioner or other air purification equipment, it is suitably applied to examining the state of an environmental space where bacterial contamination is a problem in hospitals, food factories, etc. be able to.
[0028]
G. Pretreatment means such as concentration and dilution of bacteria in the sample solution
Further, in the detection method according to the present invention, the bacteria are concentrated in a sample solution containing the bacteria to be detected, reacted with a substrate and a mediator, and detected using electrochemical means. It is. This concentration can be performed using, for example, a membrane, and the type and material of the membrane can be used without any particular limitation as long as it is a membrane that prevents the passage of bacteria as the specimen. As a specific example of an apparatus using such a bacterial concentration method, for example, a sample water that flows is automatically sampled at a constant rate every fixed time, and is automatically concentrated in a tank with a membrane. A case where the concentrated sample water is automatically taken out and automatically measured can be exemplified. Detection can be effectively performed by concentrating bacteria present in a sample solution in a dilute manner.
[0029]
Further, the concentration of bacteria may be either when the bacteria are concentrated with respect to the whole liquid, or when the bacteria are partially distributed in the liquid and partially concentrated. For example, the bacteria may be concentrated by membrane separation or centrifugation. Can be concentrated.
[0030]
As another method for concentrating bacteria, it is also possible to supply an inducer of a specific bacteria to be detected in a narrow area in the sample solution, and supply the bacteria inducer using a capillary (capillary). You can also. Examples of the inducer include serine and aspartic acid for amino acids, glucose, galactose, maltose, and ribose for sugars, and citric acid and malic acid for organic acids. In addition to the above organic substances, oxygen, fumaric acid, nitric acid, etc., which are electron acceptors of the respiratory chain, can be mentioned.
[0031]
In addition, the method according to the present invention is characterized in that a sample solution containing a bacterium to be detected is diluted, reacted with a substrate and a mediator, and detected using electrochemical means. For dilution of the sample liquid, an appropriate dilution liquid injection device can be used. That is, since the number of active bacteria in a solution containing a large amount of bacteria can be detected and measured, it can be used for, for example, the activity management of bacteria in food production processes using useful bacteria.
[0032]
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail according to an Example, this invention is not limited to these Examples. .
[0033]
【Example】
(Example 1) Electrochemical counting of marine denitrifying bacteria
The cell body selected Paracoccus denitrificans cell body.
[0034]
The surface of the glassy carbon electrode is covered with a dialysis membrane, and phosphate buffer (pH 7.3, 1 mM KNO) _Three And then deoxidized with nitrogen gas. After setting the electrode potential to -0.4V (Ag / AgCl), add durohydroquinone (DQH2) as a mediator to 0.5 mM, then add the cell suspension to an arbitrary concentration and add current. The value was measured.
[0035]
FIG. 2 shows the relationship between the cell concentration and the electrode response when denitrifying bacteria are dispersed in a solution and measured (suspension method). In this method, 10 in 1 ml ⁶ The individual was found to be the detection limit.
[0036]
(Example 2) Electrochemical counting of Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae cells were selected as the cells.
The solution used was 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0). The yeast was trapped on a nitrocellulose membrane (1.0 μm pore size, 150 μm thickness), and placed on a 5 mm diameter graphite carbon electrode (see FIG. 3B) to construct an electrode (see FIG. 3A). . The electrode potential was set to 0.2 V (Ag / AgCl) with a potentiostat. Until the electrode current becomes stable, an aqueous mediator solution is added to reach 0.25 mM, and then an aqueous glucose solution is added to 0.4 mM. Here, benzoquinone was used as the mediator. The response curve shown in FIG. 4 was obtained, and it was found that the current response was proportional to the fixed amount of cells.
[0037]
Example 3 Electrochemical Counting of E. coli
E. coli cells were selected as the cells. The solution used was a 0.1M phosphate buffer (pH 7.0).
Using a graphite carbon electrode with a diameter of 3 mm, the electrode potential was set to 0.5 V (Ag / AgCl) with a potentiostat. Various mediator aqueous solutions were added until the electrode current became stable until 1 mM. Subsequently, a solution containing E. coli was added.
[0038]
As a result, the response curve shown in FIG. 5 was obtained. Further, as shown in FIG. ⁶ ~Ten ⁷ (In this case, the mediator is benzoquinone and the concentration is set to 10 mM).
[0039]
(Example 4) Electrochemical counting of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Lactobacillus rhamnosus, Saccharomyces cerevisiae
Three bacterial strains, Escherichia coli (IAM1264), Staphylococcus aureus (IAM1011), and Lactobacillus rhamnosus (ATCC7469), and the yeast Saccharomyces cerevisiae (IFO0203) were selected as cells.
(Example 4-1) Electrochemical detection method of bacteria
For electrochemical measurement, a three-electrode voltammetry system (manufactured by BAS: 100 BW) was used. Ag / AgCl (saturated KCl solution) was used for the reference electrode. Self-made acrylic container (1cm) ^Three A disk-shaped platinum counter electrode (diameter 5 mm) embedded in the bottom was used. As the working electrode, a gold electrode (manufactured by BAS: diameter 2 mm) coated with a polycarbonate film (manufactured by Millipore: pore size 0.45 μm) was used. All the solutions used were 1/15 M phosphate buffer (pH 7.0).
[0040]
The number of bacteria was measured by the following method.
In other words, 1 cm of 5 mM benzoquinone or menadione phosphate buffer in the measurement cell ^Three And the electrode potential was set to 0.5V. After waiting for the electrode response to stabilize, 0.05 cm suspension containing various microorganisms with known cell numbers ^Three Was added. During the measurement, oxygen was constantly removed by aeration of nitrogen gas, and the solution was stirred with a stirrer.
As a direct counting method using a counter, a Thoma hemocytometer was used for yeast and a Petroff-Hauser counter was used for bacteria. The uniform cell suspension was appropriately diluted, dropped onto a counting board, covered with a cover glass, and the number of bacteria in 4 compartments was counted at 400 times. Each of the four compartments is 2.5 × 10 ^-7 cm ^Three , 5 × 10 ^-8 cm ^Three It is.
Furthermore, as a counting method by the plate culture method, the number of viable cells was estimated from the number of colonies generated after culturing at 35 ° C. for one day using a plate agar selective medium for each cell.
[0041]
(Example 4-2) Selection of mediator and its characteristics in electrochemical detection
The number of cells was measured by a direct counting method using a microscope and a plate culture method. As a result, Escherichia coli (IAM1264) cell suspension (OD ₆₆₀ = 1) 1cm by direct counting method ^Three Per 10 ^Ten 10 for plate culture ⁹ It turned out to be an individual. Thereafter, the number of cells measured by each method can be made to correspond to the turbidity of the cell culture solution. For Staphylococcus aureus (IAM1011) and Lactobacillus rhamnosus (ATCC7469) cells, the same correspondence as Escherichia coli (IAM1264) cells was obtained. For Saccharomyces cerevisiae (IFO0203), cell suspension (OD ₆₆₀ = 1), 1cm for both direct counting and plate culture ^Three Per 10 ⁸ It turned out to be an individual.
[0042]
FIG. 6 shows a current-time response curve when Escherichia coli (IAM1264) cells and Staphylococcus aureus (IAM1011) cell suspensions with known cell numbers are added to cells using benzoquinone as a mediator.
On the other hand, FIG. 7 shows current-time response curves for Escherichia coli (IAM1264) cells and Staphylococcus aureus (IAM1011) cell suspensions when menadione is used. Compared to the case of using benzoquinone, the response to Staphylococcus aureus (IAM1011) was higher than that of Escherichia coli (IAM1264). It was shown that benzoquinone is effective as a mediator of Escherichia coli and menadione is effective as a mediator of Staphylococcus aureus.
[0043]
Changes in electrode response over 6 days were measured when each bacterium was allowed to stand at room temperature in suspension (pH 7.0 phosphate buffer). Each measured value is a current value obtained 500 seconds after the sample was added. When benzoquinone was used (FIG. 8 (a)), Escherichia coli (IAM1264) and Saccharomyces cerevisiae (IFO0203) showed a decrease in response from day 4 onwards, and Lactobacillus rhamnosus (ATCC7469) and Staphylococcus aureus (IAM1011). Showed an almost constant response over 6 days. On the other hand, when menadione was used (FIG. 8B), the electrode response of each fungus showed a tendency to decrease with time.
[0044]
(Example 4-3) Bacterial counting by electrochemical detection method
For Escherichia coli (IAM1264), the cell number-current curve was measured using benzoquinone (FIG. 9). Each measured value is a current value obtained 500 seconds after sample addition. ⁹ To 5 × 10 ^Ten Piece / cm ^Three Linearity was obtained in the range of. This demonstrated the usefulness of the electrochemical detection method. It was also shown that benzoquinone is effective as a mediator against Escherichia coli.
【The invention's effect】
The method for detecting a bacterium according to the present invention comprises reacting with a mediator that reacts in response to the action of an enzyme present in the cell membrane of a bacterium to be detected (including a living bacterium) present in a sample. The bacterium can be detected or quantified based on detection or quantification by an electrochemical technique. The enzyme is an enzyme specific for the bacterium. In this case, even if other bacteria coexist in the sample in addition to the specific bacteria to be detected, only the specific bacteria to be detected should be detected or quantified without pretreatment such as separation. It is possible.
[0045]
The bacterial detection apparatus according to the present invention uses the bacterial detection method according to the present invention, a means for adding a substrate for the enzyme to a sample liquid, a means for adding the mediator to the sample liquid, And an electrochemical detection means for detecting the reacted mediator. In addition, when the enzyme is an enzyme specific for the bacterium, the apparatus according to the present invention can be used before separation or the like even if other bacteria coexist in the sample in addition to the specific bacteria to be detected. Only the specific bacteria to be detected can be detected or quantified without any treatment.
[0046]
According to the method of the present invention having the above-described configuration, it is possible to quickly and efficiently perform bacteria inspection of water and sewage, environmental water, and food.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 schematically illustrates a method of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing the results of Example 1. It is a graph which shows the microbial cell number-current curve which measured the paracoccus denitrificans microbial cell suspension by the electrochemical method.
3 is a diagram showing an electrochemical detection system used in Example 2. FIG.
4 is a graph showing the results of Example 2. FIG. It is a graph which shows the electric current-time response curve which measured the Saccharomyces cerevisiae cell suspension by the electrochemical method.
5 is a graph showing the results of Example 3. FIG. Here, BQ is an abbreviation for benzoquinone.
6 is a graph showing the results of Example 4. FIG. It is a graph which shows the electric current-time response curve which measured the Escherichia coli (IAM1264) microbial cell and Staphylococcus aureus (IAM1011) microbial cell suspension using the benzoquinone by the electrochemical method.
7 is a graph showing the results of Example 4. FIG. It is a graph which shows the electric current-time response curve which measured the Escherichia coli (IAM1264) microbial cell and Staphylococcus aureus (IAM1011) microbial cell suspension by the electrochemical method using menadione.
8 is a graph showing the results of Example 4. FIG. It is a plot of changes in electrode response over 6 days when each bacterium is left in suspension at room temperature. (A) is a graph using benzoquinone as a mediator, and (b) is a graph using menadione.
9 is a graph showing the results of Example 4. FIG. It is a graph which shows the microbial cell number-electric current curve measured by the electrochemical method using benzoquinone.

Claims

In the method for detecting bacteria, characterized in that a mediator is reacted in response to the action of an oxidoreductase present in a bacterial cell membrane, and the reacted mediator is detected electrochemically. A method for detecting a bacterium, wherein the bacterium is Paracoccus denitrificans and the mediator is durohydroquinone.

In the method for detecting bacteria, characterized in that a mediator is reacted in response to the action of an oxidoreductase present in a bacterial cell membrane, and the reacted mediator is detected electrochemically, wherein the bacterium is Escherichia and the mediator is benzoquinone.

In the method for detecting bacteria, characterized by reacting a mediator in response to the action of an oxidoreductase present in a bacterial cell membrane, and electrochemically detecting the reacted mediator. (Staphylococcus aureus), wherein the mediator is menadione.