JP4443933B2 - Method for measuring vitamin D3 receptor binding activity using fluorescence polarization method - Google Patents

Description

Ｘはリンカー、Ｙは蛍光体を表す、
〔７〕 下記の化学式２で示される構造を有する蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体、

Ｘはリンカー、Ｙは蛍光体を表す、
〔８〕 ビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体との結合の検出方法であって、
（ａ）〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体とを接触させる工程、および
（ｂ）該蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する工程、を含む方法、
〔９〕 試料中に含まれる、ビタミンＤ３受容体の検出方法であって、
（１）〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体に試料を接触させる工程、
（２）該ビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する工程、を含む方法、
〔１０〕 試料中に含まれる、ビタミンＤ３誘導体の検出方法であって、
（１）一定量のビタミンＤ３受容体を、試料、および〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と接触させる工程、
（２）該蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する工程、を含む方法、
〔１１〕 被験化合物のビタミンＤ３受容体に対する結合活性の測定方法であって、
（１）〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体および被験化合物とを接触させる工程
（２）該蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と該ビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する工程、を含む方法、
〔１２〕 〔１１〕に記載の方法によって、被験化合物のビタミンＤ３受容体に対する結合活性を測定し、ビタミンＤ３受容体に対する結合活性を有する化合物を選択する工程を含む、ビタミンＤ３受容体アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、
〔１３〕 〔１２〕に記載のスクリーニング方法によって選択された、ビタミンＤ３受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、
〔１４〕 〔１３〕に記載のビタミンＤ３受容体アゴニストまたはアンタゴニストを有効成分として含有する骨関連疾患治療薬、
〔１５〕 被験化合物のビタミンＤ３誘導体に対する結合活性の測定方法であって、
（１）被験化合物と、〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とを接触させる工程
（２）該被験化合物と該蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体との結合物の蛍光偏光度を測定する工程、を含む方法、
〔１６〕 〔１５〕に記載の方法によって、被験化合物のビタミンＤ３誘導体に対する結合活性を測定し、ビタミンＤ３誘導体に対する結合活性を有する化合物を選択する工程を含む、ビタミンＤ３受容体のスクリーニング方法、
〔１７〕 〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体を含む、〔８〕〜〔１２〕、〔１５〕、または〔１６〕のいずれかに記載の方法に使用するための測定キット、
〔１８〕 （１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール、
〔１９〕 （１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−アミノデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール、
〔２０〕 （１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−ヒドロキシデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール、
〔２１〕 （１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−アミノデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール、を提供するものである。
本発明は、蛍光偏光法を用いた低分子化合物と、該化合物の受容体との結合活性測定方法、および該方法に利用できる蛍光標識された低分子化合物に関する。本発明はまず、該方法に利用できる蛍光標識された低分子化合物を提供する。本発明の好ましい態様においては、本発明は、蛍光体と低分子化合物とがリンカーを介して共有結合を形成している化合物であって、該低分子化合物の受容体に対して結合活性を有し、かつ該低分子化合物の受容体に結合していない際の蛍光偏光度と該低分子化合物の受容体に結合した際の蛍光偏光度の差が検出可能である蛍光標識された低分子化合物を提供する。
本発明において低分子化合物とは、分子量が１０００以下の有機化合物であり、好ましくは分子量が５０〜８００、さらに好ましくは１００〜７００、最も好ましくは２００〜５００である。本発明における低分子化合物の受容体（本明細書においては単に「受容体」とも記載する）とは通常、生体内に天然に存在するタンパク質であって、天然に存在するリガンドと結合する活性を有するタンパク質である。また、天然に存在するリガンドと結合する限り、該タンパク質の一部が人為的あるいは自然に改変されたタンパク質も受容体である。受容体は血液中に存在している受容体であってもよいし、細胞内に存在する受容体であってもよい。細胞内に存在する場合としては、膜受容体、核内受容体、細胞質内受容体が含まれる。なお、本発明のビタミンＤ３受容体には、所謂ビタミンＤ３受容体様化合物も含まれる。
天然に存在するリガンド（受容体と結合活性を有する分子）としては、タンパク質であっても低分子化合物であってもよいが、天然に存在し、生理活性を有することが好ましい。従って、本発明の低分子化合物は、天然に存在し、受容体に結合して生理活性を発揮する化合物である。例えば、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、ビタミンＤ３、女性ホルモン、男性ホルモン、甲状腺ホルモン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、ビタミンＡ等が含まれる。より具体的には、ビタミンＤ３、１−ヒドロキシビタミンＤ３、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、アンドロジェン（テストステロン、ジヒドロテストステロン）、エストロジェン（エストラジオール、エストロン、エストリオール）、アドレナリン、ノルアドレナリン、ヒスタミン、ドーパミン、セロトニン、プロゲステロン、コルチゾール、コルチコステロン、アルドステロン、チロキシン、レチノール、レチノイン酸、プロスタグランジンＥ２、ロイコトリエンＢ４等あるいはこれらの化合物の誘導体を挙げることができる。
本発明における特に好ましい態様においては、低分子化合物としてビタミンＤ３誘導体を挙げることができる。ビタミンＤ３誘導体とは、９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン構造を有する化合物を指す。好ましくは、（５Ｚ，７Ｅ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン構造を有する化合物である。さらに好ましくは（１α，５Ｚ，７Ｅ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１−オール構造を有する化合物、より好ましくは（１α，５Ｚ，７Ｅ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，２５−ジオール構造を有する化合物、さらに好ましくは（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３−ジオール構造を有する化合物、最も好ましくは（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール構造を有する化合物である。本発明のビタミンＤ３誘導体は、上記の構造を有するものであれば特に限定されず、従って、上記の化合物に対して種々の置換基を有する化合物も本発明のビタミンＤ３誘導体に含まれる。また、本発明のビタミンＤ３誘導体には、上記の化合物に対する活性類似体、および構造類似体も含まれる。活性類似体とは、上記生理活性を有する化合物と同様の生物学的活性を有する化合物を指す。活性類似体の当該活性の強弱に関わらず、同様の生物学的活性を有する化合物は、活性類似体に含まれる。また本発明における構造類似体とは、化合物の固有の構造に様々な修飾を施した化合物を言う。構造類似体は人為的に合成することもできるし、天然に存在する化合物であってもよい。
本発明における蛍光体としては特に制限はなく、蛍光を発する分子である限り使用することができる。例えば、フローレセインやテトラメチルローダミン、テキサスレッドを好適に使用することができる。入手が容易であること、蛍光寿命が適当であること、市販の測定機器で測定可能であること等から、フローレセインが好ましい。フローレセインを蛍光体として使用する場合には、フローレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とアミノ基等を反応させればよい。蛍光体と低分子化合物をリンカーを介して共有結合させるには、例えば、後述の実施例に記載の方法に従って行うことができる。
本発明において「リンカー」とは、低分子化合物および蛍光体と共有結合を形成している構造部、または該構造部を形成させるために必要な化合物を指す。リンカーはどのような化学構造を有していても良いが、低分子化合物と該化合物の受容体との結合に実質的に関与しないものが好ましく、種々の溶媒に対して化学的に安定であることが望ましい。たとえば、炭素鎖であってもよいし、ペプチド鎖、糖鎖であってもよい。炭素鎖の場合には、置換されていてもよいアルキル基や無置換のアルキル基であってもよい。また、酸素原子、窒素原子、硫黄原子を炭素鎖中に有していてもよい。例えば、エチル基やプロピル基が酸素原子を介して複数回の繰り返し構造を有していてもよい。置換基としては特に制限はなく、例えば、アルキル基、ハロゲン、水酸基、アミノ基、カルボキシル基等が挙げられるが、蛍光偏光の測定に影響を与えない点で、好ましくは、無置換のアルキル基である。リンカーの末端は、蛍光体および低分子化合物と共有結合を形成できるように、適当な置換基を有することが好ましい。例えば、アミノ基、水酸基、チオール基等が挙げられる。どのような置換基を使用するかは、結合される低分子化合物および蛍光体の官能基との組み合わせで決定すればよいが、好ましくはアミノ基または水酸基である。これらの適切なリンカーの選択や製造は当業者には公知の技術である。
リンカーと共有結合を形成する低分子化合物の部位は、リンカーと結合した低分子化合物が該化合物の受容体と結合する限り、特に制限はない。つまり、低分子化合物がリンカーと共有結合を形成する部位は、該低分子化合物の構造において、受容体あるいは酵素との結合に関与しない部分であればよい。リンカーを結合させる部位もしくは官能基の選定は、例えば受容体あるいは酵素との相互作用の様式を解析すれば決定することができる。受容体や酵素の立体構造をコンピューターで解析し、所望の低分子化合物との結合様式を解析し、結合に関与しない部位を決定すればよい。具体的には、低分子化合物がビタミンＤ３誘導体である場合、好ましくは、１位および／または３位以外の位置である。好ましくはビタミンＤ３骨格の２位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位の炭素原子であり、より好ましくは２位、２５位または２６位の炭素原子である。
リンカーの長さは、低分子化合物と蛍光体との間に、該低分子化合物と該低分子化合物の受容体との結合を妨げず、かつ、該低分子化合物と該低分子化合物の受容体との結合により蛍光体の蛍光偏光度に影響を及ぼすことができる適度な距離を与えるものであることが好ましい。低分子化合物と蛍光体との間の適度な距離とは、炭素鎖に換算して、５以上２５以下、好ましくは５以上２０以下、さらに好ましくは８以上１５以下、最も好ましくは８以上１２以下である。また、必要に応じて、低分子化合物との結合様式をコンピューターにより解析し、リンカーの最適な長さを決定することもできる。
本発明においては、蛍光体と低分子化合物とは、適当な長さのリンカーを介して共有結合を形成していることが好ましい。
本発明の好ましい態様においては、本発明の低分子化合物は、該低分子化合物の受容体に対して結合している場合の蛍光偏光度と、受容体に結合していない場合の蛍光偏光度に有意な差が見られる化合物である。蛍光偏光の測定には、市販の測定機器を使用することができる。例えば、ＰａｎＶｅｒａ社によるＢＥＡＣＯＮ（商品名）を使用すればよい。
本発明の低分子化合物として、好ましくは下記の構造を有する蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体を挙げることができる。

Ｘはリンカー、Ｙは蛍光体を表す。

Ｘはリンカー、Ｙは蛍光体を表す。
本発明の蛍光標識された低分子化合物と受容体との結合活性を測定するためには、受容体は精製されていることが好ましい。従って、精製が容易な点で遺伝子組換えタンパク質は、本発明における好ましい受容体である。遺伝子組換えタンパク質を作成する方法は既に公知であり、適当なベクターと宿主を組み合わせて製造することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，１９８６）。また、遺伝子組換えタンパク質や天然に存在するタンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離方法、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、フィルター、塩析、免疫沈降、電気泳動法等を組み合わせて使用することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。
また本発明は、蛍光偏光法を用いた低分子化合物と該化合物受容体との結合の検出方法に関する。本発明の好ましい態様においては、蛍光偏光法を用いた本発明の上記ビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体との結合の検出方法を提供する。
本発明の上記方法においては、まず、蛍光標識された本発明のビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体とを接触させ（工程（ａ））、次いで、該蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する（工程（ｂ））。
本方法においては、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体とが接触している状態における蛍光偏光度を測定すれば、結合の有無を測定することができる。また、ビタミンＤ３受容体との接触の前後における蛍光偏光度の変化を測定してもよい。
工程（ｂ）における蛍光偏光度の測定は、当業者においては、前述の市販の測定機器を使用することにより行うことができる。
測定に使用する緩衝液の種類は、蛍光を適切に測定できるものであれば特に制限はなく、当業者においては、使用する蛍光体の種類によって適宜決定することができる。例えば、蛍光体としてフローレセインを使用する場合には、蛍光が安定する緩衝液として、ｐＨ７．５以上の緩衝液が好ましい。例えば、ｐＨ７．５〜１０．０であることが好ましく、さらに好ましくはｐＨ７．５〜９．０、最も好ましくは、ｐＨ７．５〜８．５である。また、塩の種類や濃度についても当業者であれば適宜選択することが可能であるが、例えば、ＫＣｌを使用することができる。塩濃度は測定に応じて適宜決定することができるが、例えば、３００〜５００ｍＭの濃度を使用することができる。また、使用する受容体や酵素等のタンパク質の特性によっては、安定化剤を使用することが好ましく、ビタミンＤ３受容体の場合には、ＥＤＴＡを添加するとよい。
本発明の低分子化合物として難水溶性の化合物を使用する場合には、一旦有機溶媒に溶解した後に使用することが好ましい。例えば、有機溶媒としてＤＭＳＯを使用すればよい。例えば、最終濃度として５％以下、好ましくは２％以下、最も好ましくは１％以下のＤＭＳＯを使用することができる。
本発明においては、測定した蛍光偏光度に変化が見られた場合、ビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体とは結合（相互作用）するものと判定される。
本発明によれば、ビタミンＤ３受容体のみならず、試料中に含まれるビタミンＤ３誘導体を測定することもできる。本発明の上記方法においては、一定量のビタミンＤ３受容体を、試料と同時に、または試料との接触の後に、本発明の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体に接触させ、該ビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との結合によって生じた蛍光偏光度を測定する。ビタミンＤ３受容体、試料、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体を接触させる順序はいずれであってもよく、試料と蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体を接触させたのち、ビタミンＤ３受容体を添加してもよい。上記の「一定量」は、その上限または下限を特に制限されるものではないが、通常、１００ｐｇ〜１００ｎｇである。
上記方法では、一定量のビタミンＤ３受容体に対して、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と、試料中に存在するビタミンＤ３誘導体とを競合させることにより、試料中に含まれるビタミンＤ３誘導体を測定することができる。競合反応を行うためには、一定量のビタミンＤ３受容体を、試料の存在下で蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体に接触させるか、または試料との接触の後に、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と接触させる。その結果、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と結合するビタミンＤ３受容体は、試料中に含まれるビタミンＤ３誘導体の濃度と逆比例する。
本発明の別の態様においては、被験化合物のビタミンＤ３受容体に対する結合活性の測定方法を提供する。本発明の方法においては、本発明の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体および被験化合物とを接触させ、次いで、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する。
また本発明は、被験化合物のビタミンＤ３受容体に対する結合活性の検出方法を利用した、ビタミンＤ３受容体アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。該方法においては、被験化合物のビタミンＤ３受容体に対する結合活性を測定し、ビタミンＤ３受容体に対する結合活性を有する化合物を選択する。
本発明のスクリーニング方法に供される被験化合物は、通常ビタミンＤ３誘導体であるが、これに特に限定されない。本発明の上記方法により選択されるビタミンＤ３受容体と結合する化合物は、該ビタミンＤ３受容体に対するアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤、促進剤として有用である。またビタミンＤ３受容体と結合する化合物は、ビタミンＤ３受容体の検出や精製を可能とするリガンドとして有用である。本発明においては、ビタミンＤ３受容体と結合する化合物の探索に用いられる該ビタミンＤ３受容体を特に標的分子と呼ぶ場合がある。すなわち、被験化合物を蛍光標識し、標的分子を反応させた後、標的分子と蛍光標識された被験化合物との反応によって生じる複合体の形成を蛍光偏光度の変化に基づいて測定する。
さらに、本発明の好ましい態様においては、ビタミンＤ３受容体と、該ビタミンＤ３受容体と結合することが予め判明しているビタミンＤ３誘導体との結合に干渉する、ビタミンＤ３受容体に対する結合活性を有する化合物の検出方法に関する。上記方法は、被験化合物のビタミンＤ３受容体に対する結合活性の検出方法であって、以下の工程を含む。
（ｉ）本発明の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体および被験化合物とを接触させる工程
（ｉｉ）該蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との結合物の蛍光偏光度を測定する工程
上記工程（ｉ）の「接触」は、より具体的には、例えば下記のようにして行うことができる。
（Ａ）被験化合物の存在下で、既にビタミンＤ３受容体と複合体を形成することが知られている蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体を接触させる。
（Ｂ）被験化合物とビタミンＤ３受容体を接触させた後に、既にビタミンＤ３受容体と複合体を形成することが知られている蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と接触させる。
（Ｃ）既にビタミンＤ３受容体と複合体を形成することが知られている蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体を接触させた後に、候補化合物と接触させる。
上記（Ａ）は、既にビタミンＤ３受容体と複合体を形成することが知られている蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体との結合反応に対する被験化合物の競合活性（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定するための方法である。被験化合物存在下でビタミンＤ３受容体と、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体との結合が観測されない場合には、該被験化合物はビタミンＤ３受容体に結合する活性を有しており、ビタミンＤ３受容体のアゴニストや促進剤、またはアンタゴニストや阻害剤であると同定することができる。
また、上記（Ｂ）は、既にビタミンＤ３受容体と複合体を形成することが知られているビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体との結合反応に対する被験化合物の阻害活性（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定するための方法である。この方法においても、被験化合物がビタミンＤ３受容体に対する結合活性を有する場合には、ビタミンＤ３誘導体へのビタミンＤ３受容体の結合が阻害される。
そして上記（Ｃ）は、既にビタミンＤ３受容体と複合体を形成することが知られているビタミンＤ３誘導体と、ビタミンＤ３受容体との結合反応に対する被験化合物の置換活性（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定するための方法である。この方法においては、被験化合物がビタミンＤ３受容体に対する結合活性を有する場合には、先にビタミンＤ３誘導体に結合しているビタミンＤ３受容体の一部が、該被験化合物によって置換され、複合体の形成量が低下する。
本発明の上記方法によっても、ビタミンＤ３受容体に対する被験化合物の結合活性を検出することができる。またこの方法によって結合活性を見出された被験化合物を選択することにより、ビタミンＤ３受容体と結合する化合物のスクリーニングを行うことができる。この方法によって選択された化合物は、ビタミンＤ３受容体のアゴニストや促進剤、またはアンタゴニストや阻害剤として有用である。
被験化合物とビタミンＤ３受容体はあらかじめ混合した後に、本発明の蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体との結合を測定してもよいし、一旦ビタミンＤ３受容体と、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とを結合させた後、被験化合物を反応させ、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との結合が、被験化合物によって置き換わることによって生じるビタミンＤ３受容体の解離を蛍光偏光度の変化として検出してもよい。
本発明の方法では、蛍光標識したビタミンＤ３誘導体に直接結合するビタミンＤ３受容体以外に、共結合分子（ｃｏ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を単離、同定することができる。共結合分子とはコファクター（ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ）とも呼ばれ、生理活性分子の活性を調節する活性を有する。例えば、共結合分子が、ビタミンＤ３誘導体とビタミンＤ３受容体との複合体にさらに結合することで生理活性の増強がおこる。この場合当該共結合分子をコファクターと呼ぶ。逆に活性を低下される場合には、コリプレッサー（ｃｏ−ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）と呼ばれることもある。共結合分子はビタミンＤ３受容体とビタミンＤ３誘導体との複合体に結合する場合もあるし、ビタミンＤ３受容体のみに結合する、あるいはビタミンＤ３誘導体のみに結合する場合もある。
本発明の方法によって回収（選択）されたビタミンＤ３受容体は、質量分析、アミノ酸分析等の分析手法により、分析、同定することが可能である（例えば米国特許５９５５７２９を参照）。該方法を用いれば、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体に結合する活性を有する未知のビタミンＤ３受容体を同定することが可能である。本方法によって同定された新たなビタミンＤ３受容体は、薬剤のターゲット分子として有用である。
新たに同定されたビタミンＤ３受容体は、同定するために用いたビタミンＤ３誘導体と同様の活性を有する化合物をスクリーニングする為に用いることができる。すなわち、新たに同定されたビタミンＤ３受容体を用いて、被験化合物との結合を測定する、あるいは同定に用いたビタミンＤ３誘導体との競合反応を測定すればよい。これらのスクリーニング方法は、前述のように、蛍光偏光度の変化を測定することによって行うことができる。
スクリーニングに用いられる被験化合物や被験試料は、特に制限はなく、例えば、ペプチド、精製もしくは粗精製タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、微生物発酵産物、海洋生物抽出液、植物出出液、細胞抽出液等を適宜用いることができる。これらの被験化合物は新規な化合物であってもよいし、既知の化合物であってもよい。
本発明の上記方法によって見出すことができる新たな化合物、例えば、ビタミンＤ３受容体アゴニストもしくはアンタゴニストは医薬品として有用である。特に、該化合物は、骨関連疾患治療薬となることが期待される。骨関連疾患としては、例えば、骨粗鬆症、癌の骨転移等を挙げることができる。本発明の方法によって取得されるビタミンＤ３受容体アゴニストおよびアンタゴニストも本発明に含まれる。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物をヒトや他の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬品として使用する場合、常用される手段に従って実施することができる。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物を有効成分として含有する医薬組成物は、当業者に公知の方法により、薬学的に許容し得る賦形剤、安定剤等と共に製造することができる。
さらに本発明は、本発明の上記方法に使用するための測定キットを提供する。本発明のキットは、少なくとも、本発明の上記蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体が含まれる。該キットには、例えば、蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体、ビタミンＤ３受容体、検体希釈液、測定用試験管またはマイクロプレート、標準品として１α−ヒドロキシビタミンＤ３あるいは１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
また本発明は、後述の実施例において記載された下記（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物を提供する。
（ｉ）（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール
（ｉｉ）（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−アミノデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール
（ｉｉｉ）（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−ヒドロキシデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール
（ｉｖ）（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−アミノデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール
これらの化合物は標識されたビタミンＤ３誘導体、特に蛍光標識されたビタミンＤ３誘導体の製造に有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］アミノアルキルビタミンＤ３誘導体（（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−アミノデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（以下ＥＤ−５３３と称す））の合成（合成までのスキームを図５に示す）
（１）（１α，３β，２０Ｓ）−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２０−ヨードメチル−プレグナ−５−エンの合成
（１α，３β，２０Ｓ）−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）プレグナ−５−エン−２０−メタノール（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３９（１２），３２２１（１９９１），３４．１４ｇ）、トリフェニルホスフィン（１８．６２ｇ）、イミダゾール（５．２４ｇ）およびジクロロメタン（３５０ｍｌ）の混合物に、氷冷下、ヨウ素（１６．５２ｇ）を加え、室温で３０分間攪拌した。反応混合物を、減圧下溶媒を留去し、得た残渣にヘキサンを加え、不溶物を濾別した。得られた濾液をチオ硫酸ナトリウム水溶液、０．５規定塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣をアセトニトリルで洗浄し、（１α，３β，２０Ｓ）−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２０−ヨードメチル−プレグナ−５−エン（３６．６３ｇ，９０％）を白色固体として得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：０．０３（３Ｈ，ｓ），０．０４（３Ｈ，ｓ），０．０５（３Ｈ，ｓ），０．０７（３Ｈ，ｓ），０．７２（３Ｈ，ｓ），０．８８（９Ｈ，ｓ），０．８９（９Ｈ，ｓ），０．９６（３Ｈ，ｓ），２．１３−２．３７（２Ｈ，ｍ），３．１１−３．２１（１Ｈ，ｍ），３．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），３．７７（１Ｈ，ｂｒｓ），３．９１−４．０６（１Ｈ，ｍ），５．４１−５．４９（１Ｈ，ｍ）．
（２）１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５−コレステン−２５−オンの合成
塩化ニッケル６水和物（９ｇ）、亜鉛末（１２．４ｇ）、メチルビニルケトン（１４．８ｇ）およびピリジン（２００ｍｌ）の混合物を６０℃で３０分間攪拌した後、室温に冷却した。室温で（１α，３β，２０Ｓ）−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２０−ヨードメチル−プレグナ−５−エン（２０ｇ）、テトラヒドロフラン（５０ｍｌ）およびピリジン（１００ｍｌ）の混合物を加え、室温で２時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、セライトで濾過した。濾液を０．５規定塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１）で精製し、１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５−コレステン−２５−オン（１６．８ｇ，９１％）を白色固体として得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：０．０３（３Ｈ，ｓ），０．０４（３Ｈ，ｓ），０．０５（３Ｈ，ｓ），０．０７（３Ｈ，ｓ），０．６７（３Ｈ，ｓ），０．８８（９Ｈ，ｓ），０．８８（９Ｈ，ｓ），２．１３（３Ｈ，ｓ），３．７７（１Ｈ，ｂｒｓ），３．９１−４．０６（１Ｈ，ｍ），５．４１−５．４９（１Ｈ，ｍ）．
（３）１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オン ４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体の合成
１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５−コレステン−２５−オン（１６．８ｇ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（６．１４ｇ）、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（１．３ｇ）およびヘキサン（２００ｍｌ）の混合物を１５分間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し、不溶物を濾過した後、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣にトルエン（２００ｍｌ）およびγ−コリジン（１３．３ｍｌ）を室温で順次加え、２．５時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し、不溶物を濾過した後、ヘキサンで希釈し、０．５規定塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍｌ）および４−フェニル−１，２，４−トリアゾール−３，５−ジオン（４．７ｇ）を室温で順次加え、室温で４５分間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：ジクロロメタン＝１０：１：１）で精製し、１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オン ４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（７．８ｇ，３６％）を白色アモルファスとして得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：０．０７（３Ｈ，ｓ），０．０８（３Ｈ，ｓ），０．１０（３Ｈ，ｓ），０．１３（３Ｈ，ｓ），０．８０（３Ｈ，ｓ），０．８８（９Ｈ，ｓ），０．８９（９Ｈ，ｓ），２．１４（３Ｈ，ｓ），３．１８−３．３０（１Ｈ，ｍ），３．８４（１Ｈ，ｂｒｓ），４．６９−４．８５（１Ｈ，ｍ），６．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．３４−７．４９（ｍ，５Ｈ）．
（４）１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オンの合成
１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オン ４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン付加体（５．７ｇ）および１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（５７．１ｍｌ）の混合物をアルゴン雰囲気下、１５０℃で攪拌した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝８：１）で精製し、１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オン（３．３ｇ，７４％）を淡黄色アモルファスとして得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：０．０３−０．０８（９Ｈ，ｍ），０．１０（３Ｈ，ｓ），０．６１（３Ｈ，ｓ），０．８８（９Ｈ，ｓ），０．８８（９Ｈ，ｓ），２．１３（３Ｈ，ｓ），２．６９−２．８２（１Ｈ，ｍ），３．６９（１Ｈ，ｂｒｓ），３．９７−４．１１（１Ｈ，ｍ），５．２５−５．３４（１Ｈ，ｍ），５．５２−５．６１（１Ｈ，ｍ）．
（５）１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オールの合成
マグネシウム末（３．３ｇ）、１０−（（トリエチルシリル）オキシ）デカニルブロミド（４．８ｇ）およびテトラヒドロフラン（３０ｍｌ）の混合物にアルゴン雰囲気下、５０℃でエチレンブロミドを数滴加え、３０分間攪拌した。反応混合物に１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オン（２．２ｇ）およびテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）の混合物を５０℃で加え、同温度で終夜攪拌した。反応混合物を室温に冷却後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１）で精製し、無色油状物（３．９７ｇ）を得た。得られた無色油状物（３．９７ｇ）およびテトラヒドロフラン（５０ｍｌ）の混合物に、テトラブチルアンモニウムフロリド（１Ｍテトラヒドロフラン溶液、１０ｍｌ）を室温で加え、同温度で１５分間攪拌した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オール（１．７４ｇ，６３％）を白色アモルファスとして得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：０．０３−０．０８（９Ｈ，ｍ），０．１１（３Ｈ，ｓ），０．６２（３Ｈ，ｓ），０．８８（９Ｈ，ｓ），０．８９（９Ｈ，ｓ），２．２８−２．４１（２Ｈ，ｍ），２．７１−２．８３（１Ｈ，ｍ），３．５７−３．７４（３Ｈ，ｍ），３．９６−４．１３（１Ｈ，ｍ），５．２６−５．３６（１Ｈ，ｍ），５．５４−５．６２（ｍ，１Ｈ）．
（６）（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールの合成
１α，３β−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−５，７−コレスタジエン−２５−オール（０．５ｇ）およびテトラヒドロフラン（３５０ｍｌ）の混合物をアルゴン気流下、水冷で攪拌しながら、３時間ＵＶ光照射（ウシオ電機（株）製５００Ｗキセノン−水銀ランプ紫外線照射装置２９５ｎｍ干渉フィルター透過光）した。反応混合物にテトラヒドロフラン（１５０ｍｌ）を加えた後アルゴン雰囲気下２時間加熱還流した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−１，３−ビス（（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリル）オキシ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−２５−オールを含む混合物４９３ｍｇを得た。得られた混合物（４９３ｍｇ）、テトラブチルアンモニウムフロリド（１．０Ｍテトラヒドロフラン溶液、１６ｍｌ）およびテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）の混合物をアルゴン雰囲気下、４５℃で２時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈後、０．５規定塩酸、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：エタノール＝５：５：１）で精製し、（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（１５９ｍｇ，４５％）を得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
ＩＲ（ｎｅａｔ）：３３３８，２９２７，２８５０，１７１１，１４６６，１３７７，１２６１，１０５７ｃｍ^−１；^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：０．５４（３Ｈ，ｓ），２．５４−２．６５（１Ｈ，ｍ），２．７６−２．９０（１Ｈ，ｍ），３．６３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），４．２３（１Ｈ，ｂｒｓ），４．４３（１Ｈ，ｂｒｓ），５．００（１Ｈ，ｓ），５．３３（１Ｈ，ｓ），６．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），６．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ）；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ ５４０（Ｍ^＋−Ｈ_２Ｏ）；ＵＶ（ｉｎ ＥｔＯＨ）λ_ｍａｘ２１２．５，２６４．５ｎｍ．
（７）（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−アミノデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールの合成
（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−ヒドロキシデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（１５９ｍｇ）、フタルイミド（６３ｍｇ）トリフェニルホスフィン（８９ｍｇ）およびテトラヒドロフラン（２．８ｍｌ）の混合物にアルゴン雰囲気下、室温でアゾジカルボン酸ジエチルエステル（０．０５ｍｌ）をゆっくり加え、室温で１．５時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：エタノール＝５：５：１）および薄層シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：エタノール＝５：５：１）で精製し、（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−フタルイミドデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールを含む混合物（２４０ｍｇ）を得た。得られた混合物（２４０ｍｇ）およびメチルアミン（４０％メタノール溶液、８ｍｌ）の混合物をアルゴン雰囲気下、室温で１時間攪拌した。反応混合物を薄層シリカゲルクロマトグラフィー（富士シリシア化学製ＮＨ ＴＬＣプレート、ジクロロメタン：エタノール＝１０：１）で精製し、（１α，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２５−（１０−アミノデカニル）−２７−ノル−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールを８．８ｍｇ（５．６％）（ＥＤ−５３３）を白色アモルファスとして得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。また、ＥＤ−５３３の構造を化学式３に示す。
ＩＲ（ｎｅａｔ）：３３５６，２９２７，２８５２，１６４７，１４６６，１３７５，１０５７ｃｍ^−１；^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：０．５４（３Ｈ，ｓ），２．６６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．７７−２．８８（１Ｈ，ｍ），４．１５−４．２８（１Ｈ，ｍ），４．３５−４．４４（１Ｈ，ｍ），４．９８（１Ｈ，ｓ），５．３２（１Ｈ，ｓ），６．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），６．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ）；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ ５３９（Ｍ^＋−Ｈ_２Ｏ）；ＵＶ（ｉｎ ＥｔＯＨ）λ_ｍａｘ２１０．８，２６３．３ｎｍ．

［実施例２］（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−アミノデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（以下ＥＤ−５３２と称す）の合成（合成までのスキームを図６に示す）
（１）（１α，２β，３β）−２−（１０−（（トリエチルシリル）オキシ）デカニル）−５，７−コレスタジエン−１，３，２５−トリオールの合成
マグネシウム末（１．５ｇ）、１０−（（トリエチルシリル）オキシ）デカニルブロミド（５．０ｇ）およびテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）の混合物にアルゴン雰囲気下、室温でエチレンブロミドを数滴加え、３０分間攪拌した。反応混合物に（１α，２α，３β）−１，２−エポキシ−コレスタ−５，７−ジエン−３，２５−ジオール（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４１（６），１１１１（１９９３），６２５ｍｇ）およびテトラヒドロフラン（１５ｍｌ）の混合物を室温で加え、１時間加熱還流した。反応混合物を室温に冷却後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で精製し、（１α，２β，３β）−２−（１０−（（トリエチルシリル）オキシ）デカニル）−５，７−コレスタジエン−１，３，２５−トリオール７１４ｍｇ（６７％）を白色アモルファスとして得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：０．５−０．７（９Ｈ，ｍ），０．９−１．１（１５Ｈ，ｍ），１．９１（１Ｈ，ｍ），２．０−２．２（２Ｈ，ｍ），２．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１４．７，４．６Ｈｚ），２．４９（１Ｈ，ｍ），２．６９（１Ｈ，ｍ），３．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．７８（１Ｈ，ｂｒｓ），４．２０（１Ｈ，ｍ），５．３７（１Ｈ，ｍ），５．６８（１Ｈ，ｍ）．
（２）（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−（（トリエチルシリル）オキシ）デカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールの合成
（１α，２β，３β）−２−（１０−（（トリエチルシリル）オキシ）デカニル）−５，７−コレスタジエン−１，３，２５−トリオール（５００ｍｇ）およびテトラヒドロフラン（３５０ｍｌ）の混合物をアルゴン気流下、水冷で攪拌しながら、３時間ＵＶ光照射（ウシオ電機（株）製５００Ｗキセノン−水銀ランプ紫外線照射装置２９５ｎｍ干渉フィルター透過光）した。反応混合物にテトラヒドロフラン（１５０ｍｌ）を加えた後、アルゴン雰囲気下２時間加熱還流した。減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−（（トリエチルシリル）オキシ）デカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール１２３ｍｇ（２５％）を淡黄色アモルファスとして得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：０．５−０．７（９Ｈ，ｍ），０．８−１．０（１５Ｈ，ｍ），２．４５（２Ｈ，ｍ），２．８１（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ），３．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），３．９−４．２（２Ｈ，ｍ），５．０１（１Ｈ，ｓ），５．３７（１Ｈ，ｓ），６．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），６．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ６８７（Ｍ^＋＋１）；ＵＶ（ｉｎ ＥｔＯＨ）λ_ｍａｘ２１４．１，２６４．５ｎｍ．
（３）（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−ヒドロキシデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールの合成
（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−（（トリエチルシリル）オキシ）デカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（１２３ｍｇ）、テトラブチルアンモニウムフロリド（１．０Ｍテトラヒドロフラン溶液、２ｍｌ）およびテトラヒドロフラン（２ｍｌ）の混合物をアルゴン雰囲気下、室温で１５分間攪拌した。反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：エタノール＝５：５：１）で２回精製し、（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−ヒドロキシデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（８９ｍｇ，８７％）を白色アモルファスとして得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：０．５５（３Ｈ，ｓ），０．９４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），２．４６（２Ｈ，ｍ），２．８１（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），３．６４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），４．０３（１Ｈ，ｍ），４．１４（１Ｈ，ｍ），５．０１（１Ｈ，ｓ），５．３７（１Ｈ，ｓ），６．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ），６．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ５７３（Ｍ^＋＋１）；ＵＶ（ｉｎ ＥｔＯＨ）λ_ｍａｘ２１３．７，２６４．１ｎｍ
（４）（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−アミノデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールの合成
（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−ヒドロキシデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（８９ｍｇ）、フタルイミド（３４ｍｇ）トリフェニルホスフィン（４９ｍｇ）およびテトラヒドロフラン（１．５ｍｌ）の混合物にアルゴン雰囲気下、室温でアゾジカルボン酸ジエチルエステル（０．０３ｍｌ）をゆっくり加え、室温で１．５時間攪拌した。反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：エタノール＝５：５：１）、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）およびシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）で精製し、（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−フタルイミドデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオールを含む混合物（７０ｍｇ）を得た。得られた混合物（７０ｍｇ）およびメチルアミン（４０％メタノール溶液、４ｍｌ）の混合物をアルゴン雰囲気下、室温で３０分間攪拌した。反応混合物を薄層シリカゲルクロマトグラフィー（富士シリシア化学製ＮＨ ＴＬＣプレート、ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）で精製し、（１α，２β，３β，５Ｚ，７Ｅ）−２−（１０−アミノデカニル）−９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−１，３，２５−トリオール（ＥＤ−５３２）を１７．８ｍｇ（２０％）を白色アモルファスとして得た。この化合物の理化学的性状は下記の通りである。また、ＥＤ−５３２の構造を化学式４に示す。

ＩＲ（ｎｅａｔ）：３３６３，２９２５，２８５２，１７１６，１６４５，１５８５，１４６８，１４４１，１３７７，１２１５，１１４９，１０５９ｃｍ^−１；^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ：０．５５（３Ｈ，ｓ），０．９４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），２．６７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．７６−２．８７（１Ｈ，ｍ），４．０１−４．０８（１Ｈ，ｍ），４．１１−４．１７（１Ｈ，ｍ），５．０１（１Ｈ，ｓ），５．３７（１Ｈ，ｓ），６．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ），６．３３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ）；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ ５７２（Ｍ^＋）；ＵＶ（ｉｎ ＥｔＯＨ）λ_ｍａｘ２１３．３，２６４．７ｎｍ．
［実施例３］ＥＤ−５３２およびＥＤ−５３３のフローレセイン標識体の作製（合成までのスキームを図７に示す）
（１）ＥＤ−５３２ＦＬの合成
１ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したＥＤ−５３２のエタノール溶液１２５μＬと０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１１．９）１２５μＬとを混合し、この液に１００ｍｇ／ｍＬとなるように希釈したＦＩＴＣ ｉｓｏｍｅｒＩ（モレキュラープローブス社）のジメチルホルムアミド溶液１０μＬを加え、室温暗所にて９０分間振とうした。この液に１０％（ｖ／ｖ）となるように希釈したエタノールアミンのエタノール溶液を１５μＬ加えたのち、以下の条件にてフローレセイン標識体をＨＰＬＣ精製した。
精製は、ＨＰＬＣカラムとして、関東化学Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８０ＤＳ（７５ｍｍ ｘ ４．６ｍｍ，粒子径３μｍ）を用い、移動相は１０％アセトニトリル（０〜０．５分）、１０〜１００％アセトニトリル直線グラジエント（０．５〜１１．５分）、１００％アセトニトリル（１１．５分〜）とし、流速１ｍＬ／分、注入量：２０μＬ／回で行い、保持時間１２分前後に認められる２６５ｎｍの紫外吸収ピーク部分を０．５ｍＬ取得した。
（２）ＥＤ−５３３ＦＬの合成
ＥＤ−５３２の代わりにＥＤ−５３３を用いて同様の方法により、２５位にリンカーを介してフローレセインが結合しているＥＤ−５３３ＦＬを合成した。尚、精製は、Ｖａｒｉａｎ社Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔｅ Ｃ１８カラムを用い、プレ洗浄としてアセトニトリル２．４ｍＬ、水４ｍＬで順次処理した後、反応産物を水で１０倍容量に希釈した溶液１ｍＬをカラムヘアプライした。１０％アセトニトリル２．４ｍＬ、２０％アセトニトリル２．４ｍＬの条件で順次洗浄した後、３０％アセトニトリル２．４ｍＬにより溶出した。溶出液を遠心濃縮器にて乾固したものを、５００μＬのエタノールに溶解した液を以下の実験に使用した。
［実施例４］ＥＤ−５３２ＦＬによる１．２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３に対する用量反応曲線
実施例３（１）にて得られたフローレセイン標識されたＥＤ−５３２（ＥＤ−５３２ＦＬ）２８μＬに３００ｍＭの塩化カリウム、２ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を７ｍＬ加えた。この液より１９８μＬをＢＥＡＣＯＮテストチューブ（Ｐ２２４４、パンベラ社）に移し、これに２μＬのジメチルスルホキシドを加えてビタミンＤ受容体なし対照試料とした。残りの液には１．７μＬのリコンビナントヒトビタミンＤ３レセプター（５４８−００８７１、和光純薬）を加え、この液１９８μＬをＢＥＡＣＯＮテストチューブに移し、これに所定の濃度となるようにジメチルスルホキシドにて溶解した１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３を２μＬ加えて測定試料とした。ビタミンＤ受容体なし対照試料ならびに測定試料は調製後に室温暗所にて９０分間静置し、これらの試料の２５℃における蛍光偏光度をフルレンジＢＥＡＣＯＮ２０００（パンベラ社）を用いて測定することにより用量反応曲線を得た。
図１に測定結果を示す。この結果は同一実験内の３測定値の平均と標準偏差を示しており、左端の点（ＶＤ（−））は１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３を添加しないときの測定値（ＥＤ−５３２ＦＬとビタミンＤ受容体のみが存在している状態）、右端の点（ＶＤＲ（−））はビタミンＤ受容体なし対照試料の測定値を示している。蛍光の偏光度はビタミンＤ受容体の添加により約１３０ミリ偏光度上昇し、終濃度として１０^−９Ｍ以上の１．２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３を添加することで用量依存的に偏光度が低下した。この結果はＥＤ−５３２ＦＬがビタミンＤ３受容体と結合する活性を有すること、しかも、ビタミンＤ３受容体の１．２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３結合部位に結合することを示すものであり、本法により１．２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３を始めとする種々のビタミンＤ３誘導体の定量が可能であることを示している。
［実施例５］種々のビタミンＤ誘導体に対する用量反応曲線
実施例４と同様の方法にて所定の濃度となるようにジメチルスルホキシドにて溶解した各種ビタミンＤ３誘導体（ＥＤ−７１、ＯＣＴ、ＥＤ−１３０）を測定し、それぞれの用量反応曲線を比較した。ＥＤ−７１、ＯＣＴ、またはＥＤ−１３０の構造を、それぞれ化学式５、６または７に示す。

図２に測定結果を示す。この結果は同一実験内の３測定値の平均を示しており、左端の点（ＶＤ（−））は各種ビタミンＤ３誘導体を添加しないときの測定値、右端の点（ＶＤＲ（−））はビタミンＤ受容体なし対照試料の測定値を示している。ＥＤ−７１、ＯＣＴ、ＥＤ−１３０は１．２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３よりもやや高濃度の終濃度として１０^−８Ｍ以上の添加により用量依存的な偏光度が低下を示した。この結果は我々が発明した方法が種々のビタミンＤ３誘導体の定量に利用可能であること、ならびに各種ビタミンＤ誘導体の受容体結合能を相互に比較可能であることを示している。
［実施例６］種々のビタミンＤ誘導体に対する反応
実施例４と同様の方法にて１０^−７Ｍとなるようにジメチルスルホキシドにて溶解した１．２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３ならびにその誘導体（ＥＤ−７１、ＯＣＴ、ＥＤ−１３０）を測定した。
図３に測定結果を示す。この結果は実施日が異なる３回の実験値の平均と標準偏差を示しており、各実験値は同一実験内の３測定値の平均として求めている。なお、左端の棒（ＶＤ（−））は各種ビタミンＤ３誘導体を添加しないときの測定値、左端より２番目の棒（ＶＤＲ（−））はビタミンＤ受容体なし対照試料の測定値を示している。ＥＤ−７１、ＯＣＴ、ＥＤ−１３０を終濃度として１０^−７Ｍ添加したときの偏光度はビタミンＤ３誘導体を添加しないときと比べて有意に低下するものの同濃度の１．２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３を添加した場合よりも低下の程度は顕著ではなかった。この結果は単一用量における偏光度の大小から各種ビタミンＤ誘導体の受容体結合能を相互に比較可能であることを示すものである。
［実施例７］ＥＤ−５３３ＦＬによる１．２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３に対する用量反応曲線
実施例３（２）にて得られたフローレセイン標識されたＥＤ−５３３（ＥＤ−５３３ＦＬ）３．３μＬに３００ｍＭの塩化カリウム、２ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を１０．４ｍＬ加えた。この液を３本のＢＥＡＣＯＮテストチューブ（Ｐ２２４４、パンベラ社）に１９８μＬづつ移し、それぞれに２μＬのジメチルスルホキシドを加えてビタミンＤ受容体なし対照試料とした。残りの液に２．５μＬのビタミンＤ３レセプター、ヒト、リコンビナント（５４８−００８７１、和光純薬）を加え、この液１９８μＬをＢＥＡＣＯＮテストチューブに移し、これに所定の濃度となるようにジメチルスルホキシドにて溶解した１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３を加えて測定試料とした。ビタミンＤ受容体なし対照試料ならびに測定試料は調製後に室温暗所にて９０分間静置し、これらの試料の２５℃における蛍光偏光度をフルレンジＢＥＡＣＯＮ２０００（パンベラ社）を用いて測定することにより用量反応曲線を得た。
図４に測定結果を示す。この結果は同一実験内の３測定値の平均と標準偏差を示しており、左端の点（ＶＤ（−））は１，２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３を添加しないときの測定値、右端の点（ＶＤＲ（−））はビタミンＤ受容体なし対照試料の測定値を示している。蛍光の偏光度はビタミンＤ受容体の添加により１３６ミリ偏光度上昇し、終濃度として１０^−８Ｍ以上の１．２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３を添加することで用量依存的に偏光度が低下した。この結果はＥＤ−５３３ＦＬがビタミンＤ３受容体と結合する活性を有すること、しかも、ビタミンＤ３受容体の１．２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３結合部位に結合することを示すものであり、本法により１．２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３を始めとする種々のビタミンＤ３誘導体の定量が可能であることを示している。
産業上の利用の可能性
本発明により、蛍光偏光法を用いた低分子化合物と、該化合物の受容体との結合活性を簡便かつ精度高く検出できる新規な方法が提供された。本方法は短時間で測定を終了することが可能であり、放射性同位体元素を用いた結合活性測定試験に比べ被験化合物に用いるタンパク質の結合活性の失活が少なく、信頼性のある実験データを取得することが期待される。また、本方法を利用することにより、ビタミンＤ３受容体と結合する化合物、または新規ビタミンＤ３受容体のスクリーニングが可能となった。本発明のスクリーニング方法によって取得される化合物は、骨関連疾患のための治療薬となるものと大いに期待される。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＥＤ−５３２ＦＬによる１．２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３に対する用量反応曲線を示す図である。縦軸は蛍光偏光度、横軸は被験化合物の濃度を示す。
図２は、各種ビタミンＤ３誘導体（ＥＤ−７１、ＯＣＴ、ＥＤ−１３０）に対する用量反応曲線を示す図である。縦軸は蛍光偏光度、横軸は被験化合物の濃度を示す。
図３は、各種ビタミンＤ３誘導体（ＥＤ−７１、ＯＣＴ、ＥＤ−１３０）を１ｘ１０^−７Ｍ添加した際の偏光度を示す図である。縦軸は蛍光偏光度を示す。
図４は、ＥＤ−５３３ＦＬによる１．２５（ＯＨ）_２ビタミンＤ３に対する用量反応曲線を示す図である。縦軸は蛍光偏光度、横軸は被験化合物の濃度を示す。
図５は、ＥＤ−５３３合成までのスキームを示す図である。
図６は、ＥＤ−５３２合成までのスキームを示す図である。
図７は、ＥＤ−５３２ＦＬおよびＥＤ−５３３ＦＬ合成までのスキームを示す図である。 Technical field
The present invention relates to a method for measuring a binding activity of a low molecular compound to a receptor using fluorescence polarization, and a screening method for a compound that binds to a low molecular compound using the method.
Background art
Vitamin D derivatives have various physiological activities such as osteogenesis and are being developed as pharmaceuticals. It is known that vitamin D derivatives bind to vitamin D receptors (VDR) present in the nucleus and exhibit various physiological activities. Therefore, for the synthesis and development of a novel vitamin D3 derivative, it is extremely important to measure the binding activity between the vitamin D3 derivative and VDR. Several methods are known for measuring the binding activity between vitamin D3 derivatives and VDR, such as a method using a radioisotope, but in recent years, measurement methods using fluorescent labels have been applied for ease of handling. Yes. For example, in a method using a 3-position BODIPY-labeled substance (Anal. Biochem., 229 68-79 (1995)), a tissue staining method using a vitamin D3 derivative previously fluorescently labeled is described. In the method using a 3-position fluorescein amide label (US Pat. No. 6,291,693), an ELISA method using a fluorescently labeled vitamin D3 derivative is described. However, all of these methods are obtained by changing the conventional detection method to fluorescence, and these methods are not methods for measuring the binding activity between a vitamin D3 derivative and VDR with high sensitivity and simply.
On the other hand, recently, a binding activity measurement system using fluorescence polarization has been developed as one of measurement methods using fluorescently labeled molecules. In the fluorescence polarization method, linearly polarized excitation light radiated from a fluorescent molecule is measured by applying linearly polarized excitation light through a polarizing filter. Fluorescence has a lifetime of about nanoseconds. During this period, the fluorescent molecules rotate due to Brownian motion or the like, so that the polarization of the fluorescence gradually disappears. At this time, the speed of the rotating Brownian motion is slow if the fluorescent molecule is large and fast if it is small. Also, since the rotational Brownian motion is limited by the degree of freedom of the fluorescent molecule, the polarization property of the observed fluorescence is different, and it is possible to detect the environment where the fluorescent molecule exists, that is, the presence or absence of interaction with other molecules. .
The fluorescence polarization method uses a fluorescent label to measure a change in the polarization property of the fluorescence caused by the interaction of the fluorescent label with other molecules, and can be measured in a homogeneous system. There are advantages such as being simple, being able to perform measurement while maintaining an equilibrium state, and being capable of being miniaturized because there is no washing step or the like. In addition, the use of non-radioactive isotopes has advantages such as ease of handling, high sensitivity, and the use of small amounts of receptors and fluorescent labels (Japan Spectroscopic Society). Measurement Method Series 3 Fluorescence Measurement Application to Biological Sciences, Kazuhiko Kinoshita and Satoshi Mibata, Academic Publishing Center; Biochemical Experimental Method 13 Chemical Modification of Protein (below), written by Motonori Ohno et al., Academic Publishing Center; Dandriker WB And Saussure VA (1970) "Fluorescence polarization in immunochemistry" Immunochemistry, 7, 799-828; Maeda H. (1979) "Assay of proteolytic chemistry. ation technique "Annal.Biochem., 92,222-227). However, when the molecular weight does not increase sufficiently due to binding or when the movement constraint of the phosphor is weak, the change in the degree of fluorescence polarization is not sufficient and measurement is difficult. It has been used only for the measurement of the binding of molecules such as peptides with fluorescent labels and the binding of these molecules to macromolecules such as DNA, proteins, and antibodies.
However, in the case of using a fluorescent label of a low molecular weight compound, the fluorescence labeled low molecule does not cause a decrease in binding activity due to the fluorescent label and the degree of freedom of the fluorescent label is reflected in the degree of fluorescence polarization. It is difficult to design a compound, and a general fluorescent labeling method has not been established. So far, as an example of measurement of fluorescence polarization using a fluorescent label of a low molecular weight compound, measurement of estrogen receptor binding activity using fluorescently labeled estrogen has been reported. In this method, a fluorescent derivative having a chromophore in the estrogen molecule is used, and the method is not applicable to low molecular weight compounds in general (Steroids 60, 636-645 (1995)).
Therefore, a method for designing and producing a low molecular weight compound having appropriate fluorescence polarization characteristics and receptor binding activity is desired. In particular, for the binding activity between vitamin D3 receptor and vitamin D3, a fluorescently labeled vitamin D derivative that can be used in the fluorescence polarization method has been desired.
Disclosure of the invention
The present invention has been made in view of such a situation, and a method for measuring the binding activity between a low molecular weight compound using a fluorescence polarization method and a receptor of the compound, and a fluorescent label that can be used in the method. The object is to provide a low molecular weight compound. More specifically, a method for measuring the binding activity of vitamin D3 receptor using fluorescence polarization, a method for screening a compound that binds to vitamin D3 receptor using the method, and a fluorescently labeled label that can be used in the method Vitamin D3 derivatives are provided.
As a result of diligent studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have made it possible to achieve both fluorescence polarization properties and receptor binding properties by binding a low-molecular compound as a ligand and a phosphor via a linker. I found it possible. Further, it has been found that a method using a linker can appropriately adjust the length of the linker, and can easily produce a fluorescent label that can be used in the fluorescence polarization method. That is, the present inventors have found that the degree of fluorescence polarization of a low molecular weight compound bound to a phosphor changes when the low molecular weight compound is not bound to the receptor and when the receptor is bound. Therefore, by measuring the degree of fluorescence polarization, it has become possible to measure the binding activity between a low molecular weight compound and the receptor of the compound.
As described above, the present inventors have developed a novel method for measuring the binding activity between a low molecular weight compound using fluorescence polarization and the receptor of the compound, thereby completing the present invention.
In addition, when the low molecular weight compound is a vitamin D3 derivative, the vitamin D3 derivative in which a phosphor is bound to the 2nd or 25th position of the vitamin D3 skeleton via an alkyl group of C10, the ligand and the phosphor accept the ligand. It has been found that the distance to the body is sufficiently far enough not to interfere with binding to the body, but close enough that the movement constraint of the ligand is sufficient to affect the polarization properties of the phosphor. Therefore, such a compound binds to the ligand binding site of VDR and is useful in measuring the binding activity of other vitamin D3 derivatives by competitive inhibition.
Furthermore, by using the above method, it is possible to screen for compounds that bind to the vitamin D3 receptor.
That is, the present invention relates to a method for measuring the binding activity of a low molecular compound to a receptor using fluorescence polarization, and more specifically to a fluorescently labeled low molecular compound that can be used in the method.
[1] A compound in which a fluorescent substance and a low molecular weight compound form a covalent bond via a linker, and has a binding activity to a receptor for the low molecular weight compound and accepts the low molecular weight compound A fluorescently labeled low molecular weight compound capable of detecting a difference between the fluorescence polarization degree when not bound to the body and the fluorescence polarization degree when bound to the receptor of the low molecular weight compound,
[2] The fluorescently labeled low molecular weight compound according to [1], wherein the linker is an alkyl group, an alkyloxy polymer, or a peptide,
[3] The fluorescently labeled low molecular weight compound according to [2], wherein the linker has a length corresponding to C5 to C25.
[4] The fluorescently labeled low molecular weight compound according to any one of [1] to [3], wherein the phosphor is fluorescein,
[5] The fluorescently labeled low molecular weight compound according to any one of [1] to [4], wherein the low molecular weight compound is a vitamin D3 derivative, and the receptor of the low molecular weight compound is a vitamin D3 receptor,
[6] A fluorescently labeled vitamin D3 derivative having a structure represented by the following chemical formula 1,

X represents a linker, Y represents a phosphor,
[7] A fluorescently labeled vitamin D3 derivative having a structure represented by the following chemical formula 2:

X represents a linker, Y represents a phosphor,
[8] A method for detecting the binding between a vitamin D3 derivative and a vitamin D3 receptor,
(A) contacting the fluorescently labeled vitamin D3 derivative according to any one of [5] to [7] with a vitamin D3 receptor; and
(B) measuring the degree of fluorescence polarization of the conjugate of the fluorescently labeled vitamin D3 derivative and the vitamin D3 receptor,
[9] A method for detecting a vitamin D3 receptor contained in a sample,
(1) A step of bringing a sample into contact with the fluorescently labeled vitamin D3 derivative according to any one of [5] to [7],
(2) measuring the fluorescence polarization degree of the conjugate of the vitamin D3 derivative and the vitamin D3 receptor,
[10] A method for detecting a vitamin D3 derivative contained in a sample,
(1) contacting a certain amount of vitamin D3 receptor with the sample and the fluorescently labeled vitamin D3 derivative according to any one of [5] to [7],
(2) measuring the fluorescence polarization degree of the conjugate of the fluorescently labeled vitamin D3 derivative and vitamin D3 receptor,
[11] A method for measuring the binding activity of a test compound to vitamin D3 receptor,
(1) Contacting the fluorescently labeled vitamin D3 derivative according to any one of [5] to [7] with a vitamin D3 receptor and a test compound
(2) measuring a fluorescence polarization degree of a conjugate of the fluorescently labeled vitamin D3 derivative and the vitamin D3 receptor,
[12] A vitamin D3 receptor agonist or antagonist comprising the step of measuring the binding activity of a test compound to vitamin D3 receptor by the method according to [11] and selecting a compound having binding activity to vitamin D3 receptor Screening method,
[13] A vitamin D3 receptor agonist or antagonist selected by the screening method according to [12],
[14] A bone-related disease therapeutic agent comprising the vitamin D3 receptor agonist or antagonist according to [13] as an active ingredient,
[15] A method for measuring the binding activity of a test compound to a vitamin D3 derivative,
(1) A step of bringing a test compound into contact with the fluorescently labeled vitamin D3 derivative according to any one of [5] to [7]
(2) measuring the fluorescence polarization degree of the conjugate of the test compound and the fluorescently labeled vitamin D3 derivative,
[16] A method for screening a vitamin D3 receptor, comprising the step of measuring the binding activity of a test compound to a vitamin D3 derivative by the method described in [15] and selecting a compound having a binding activity to the vitamin D3 derivative,
[17] The method according to any one of [8] to [12], [15], or [16], comprising the fluorescently labeled vitamin D3 derivative according to any one of [5] to [7]. Measuring kit for use,
[18] (1α, 3β, 5Z, 7E) -25- (10-hydroxydecanyl) -27-nor-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25- Triol,
[19] (1α, 3β, 5Z, 7E) -25- (10-aminodecanyl) -27-nor-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol,
[20] (1α, 2β, 3β, 5Z, 7E) -2- (10-hydroxydecanyl) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol,
[21] Provided (1α, 2β, 3β, 5Z, 7E) -2- (10-aminodecanyl) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol To do.
The present invention relates to a method for measuring a binding activity between a low molecular compound using fluorescence polarization and a receptor of the compound, and a fluorescently labeled low molecular compound that can be used in the method. The present invention first provides a fluorescently labeled low molecular weight compound that can be used in the method. In a preferred embodiment of the present invention, the present invention is a compound in which a phosphor and a low molecular weight compound form a covalent bond via a linker, and has a binding activity to the receptor of the low molecular weight compound. Fluorescently labeled low molecular weight compounds capable of detecting the difference between the degree of fluorescence polarization when not bound to the low molecular weight compound receptor and the degree of fluorescence polarization when bound to the low molecular weight compound receptor I will provide a.
In the present invention, the low molecular weight compound is an organic compound having a molecular weight of 1000 or less, preferably a molecular weight of 50 to 800, more preferably 100 to 700, and most preferably 200 to 500. In the present invention, a low molecular weight compound receptor (also simply referred to as “receptor” in the present specification) is usually a naturally occurring protein in a living body and has an activity of binding to a naturally occurring ligand. It has a protein. A protein in which a part of the protein is artificially or naturally modified is also a receptor as long as it binds to a naturally occurring ligand. The receptor may be a receptor present in blood or a receptor present in a cell. When present in a cell, a membrane receptor, a nuclear receptor, and an intracytoplasmic receptor are included. The vitamin D3 receptor of the present invention includes so-called vitamin D3 receptor-like compounds.
The naturally occurring ligand (molecule having binding activity with the receptor) may be a protein or a low molecular weight compound, but is preferably naturally present and has physiological activity. Therefore, the low molecular weight compound of the present invention is a compound that exists in nature and exhibits physiological activity by binding to a receptor. For example, glucocorticoid, mineral corticoid, vitamin D3, female hormone, male hormone, thyroid hormone, prostaglandin, leukotriene, vitamin A and the like are included. More specifically, vitamin D3, 1-hydroxyvitamin D3, 1,25-dihydroxyvitamin D3, androgen (testosterone, dihydrotestosterone), estrogen (estradiol, estrone, estriol), adrenaline, noradrenaline, histamine, dopamine, Examples include serotonin, progesterone, cortisol, corticosterone, aldosterone, thyroxine, retinol, retinoic acid, prostaglandin E2, leukotriene B4, and derivatives of these compounds.
In a particularly preferred embodiment of the present invention, vitamin D3 derivatives can be mentioned as low molecular weight compounds. The vitamin D3 derivative refers to a compound having a 9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene structure. A compound having a (5Z, 7E) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene structure is preferable. More preferably (1α, 5Z, 7E) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -trien-1-ol compound, more preferably (1α, 5Z, 7E) -9,10 Secocholesta-5,7,10 (19) -compound having a triene-1,25-diol structure, more preferably (1α, 3β, 5Z, 7E) -9,10-Seccocholesta-5,7,10 (19 ) -Triene-1,3-diol structure, most preferably (1α, 3β, 5Z, 7E) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25- It is a compound having a triol structure. The vitamin D3 derivative of the present invention is not particularly limited as long as it has the above structure, and therefore, compounds having various substituents for the above compound are also included in the vitamin D3 derivative of the present invention. The vitamin D3 derivatives of the present invention also include active analogs and structural analogs to the above compounds. An active analog refers to a compound having the same biological activity as the compound having physiological activity. Regardless of the intensity of the activity of the active analog, compounds having similar biological activity are included in the active analog. Moreover, the structural analog in the present invention refers to a compound in which various modifications are made to the unique structure of the compound. Structural analogs can be synthesized artificially or can be naturally occurring compounds.
The phosphor in the present invention is not particularly limited and can be used as long as it is a molecule that emits fluorescence. For example, florescein, tetramethylrhodamine, and Texas Red can be used preferably. Flow resin is preferred because it is easily available, has a suitable fluorescence lifetime, and can be measured with a commercially available measuring instrument. When using fluorescein as a phosphor, fluorescein isothiocyanate (FITC) may be reacted with an amino group or the like. In order to covalently bond the phosphor and the low molecular weight compound via a linker, for example, it can be carried out according to the method described in the examples described later.
In the present invention, the “linker” refers to a structural part that forms a covalent bond with a low molecular compound and a phosphor, or a compound that is necessary to form the structural part. The linker may have any chemical structure, but it is preferable that the linker does not substantially participate in the binding between the low molecular weight compound and the receptor of the compound, and is chemically stable to various solvents. It is desirable. For example, it may be a carbon chain, a peptide chain, or a sugar chain. In the case of a carbon chain, it may be an optionally substituted alkyl group or an unsubstituted alkyl group. Moreover, you may have an oxygen atom, a nitrogen atom, and a sulfur atom in a carbon chain. For example, an ethyl group or a propyl group may have a repeating structure multiple times through an oxygen atom. The substituent is not particularly limited and includes, for example, an alkyl group, a halogen, a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, and the like, but is preferably an unsubstituted alkyl group in that it does not affect the measurement of fluorescence polarization. is there. The end of the linker preferably has an appropriate substituent so that a covalent bond can be formed with the phosphor and the low molecular weight compound. For example, an amino group, a hydroxyl group, a thiol group, etc. are mentioned. What kind of substituent is used may be determined in combination with a low molecular compound to be bonded and a functional group of the phosphor, and is preferably an amino group or a hydroxyl group. The selection and production of these appropriate linkers are techniques known to those skilled in the art.
The site of the low molecular compound that forms a covalent bond with the linker is not particularly limited as long as the low molecular compound bonded to the linker binds to the receptor of the compound. That is, the site where the low molecular weight compound forms a covalent bond with the linker may be a portion that does not participate in binding to the receptor or the enzyme in the structure of the low molecular weight compound. The selection of the site or functional group to which the linker is bound can be determined, for example, by analyzing the mode of interaction with the receptor or enzyme. What is necessary is just to determine the site | part which does not participate in a coupling | bonding by analyzing the three-dimensional structure of a receptor or an enzyme with a computer, analyzing the binding mode with a desired low molecular weight compound. Specifically, when the low molecular compound is a vitamin D3 derivative, it is preferably a position other than the 1st position and / or the 3rd position. Preferably, it is a carbon atom at the 2nd, 20th, 21st, 22nd, 23rd, 24th, 25th, 26th position of the vitamin D3 skeleton, more preferably at the 2nd, 25th or 26th carbon atom. is there.
The length of the linker does not hinder the binding of the low molecular compound and the receptor of the low molecular compound between the low molecular compound and the phosphor, and the low molecular compound and the receptor of the low molecular compound It is preferable to provide an appropriate distance that can affect the degree of fluorescence polarization of the phosphor by the combination with. The appropriate distance between the low molecular weight compound and the phosphor is 5 to 25, preferably 5 to 20, more preferably 8 to 15, most preferably 8 to 12 in terms of carbon chain. It is. Further, if necessary, the optimal mode of the linker can be determined by analyzing the binding mode with the low molecular weight compound by a computer.
In the present invention, it is preferable that the phosphor and the low molecular weight compound form a covalent bond via a linker having an appropriate length.
In a preferred embodiment of the present invention, the low molecular weight compound of the present invention has a fluorescence polarization degree when bound to the receptor of the low molecular compound and a fluorescence polarization degree when not bound to the receptor. It is a compound that shows a significant difference. A commercially available measuring instrument can be used for the measurement of fluorescence polarization. For example, BEACON (trade name) by Pan Vera may be used.
Preferred examples of the low molecular weight compound of the present invention include fluorescently labeled vitamin D3 derivatives having the following structure.

X represents a linker, and Y represents a phosphor.

X represents a linker, and Y represents a phosphor.
In order to measure the binding activity between the fluorescently labeled low molecular weight compound of the present invention and the receptor, the receptor is preferably purified. Therefore, a recombinant protein is a preferred receptor in the present invention in terms of easy purification. A method for producing a recombinant protein is already known, and can be produced by combining an appropriate vector and a host (Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Basic Methods & Molecular Biology, Lange, 1986). In addition, the separation and purification of the recombinant protein and the naturally occurring protein may be carried out using a separation method and a purification method that are used in normal protein purification, and are not limited in any way.
For example, affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, reverse phase chromatography, filter, salting out, immunoprecipitation, electrophoresis, and the like can be used in combination (Stratesies for Protein) Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996).
The present invention also relates to a method for detecting the binding between a low molecular weight compound and the compound receptor using fluorescence polarization. In a preferred embodiment of the present invention, a method for detecting the binding between the vitamin D3 derivative of the present invention and vitamin D3 receptor using fluorescence polarization is provided.
In the above method of the present invention, first, the fluorescently labeled vitamin D3 derivative of the present invention and the vitamin D3 receptor are contacted (step (a)), and then the fluorescently labeled vitamin D3 derivative and vitamin D3 receptor are contacted. The fluorescence polarization degree of the combined product with the body is measured (step (b)).
In this method, the presence or absence of binding can be measured by measuring the degree of fluorescence polarization in a state where the fluorescently labeled vitamin D3 derivative and the vitamin D3 receptor are in contact with each other. Moreover, you may measure the change of the fluorescence polarization degree before and behind the contact with a vitamin D3 receptor.
A person skilled in the art can measure the degree of fluorescence polarization in the step (b) by using the above-described commercially available measuring instrument.
The type of buffer used for measurement is not particularly limited as long as fluorescence can be measured appropriately, and those skilled in the art can appropriately determine the type depending on the type of phosphor used. For example, when using fluorescein as a phosphor, a buffer solution having a pH of 7.5 or higher is preferable as a buffer solution that stabilizes fluorescence. For example, the pH is preferably 7.5 to 10.0, more preferably pH 7.5 to 9.0, and most preferably pH 7.5 to 8.5. Also, the type and concentration of the salt can be appropriately selected by those skilled in the art. For example, KCl can be used. Although the salt concentration can be appropriately determined according to the measurement, for example, a concentration of 300 to 500 mM can be used. Moreover, it is preferable to use a stabilizer depending on the properties of a protein such as a receptor or an enzyme to be used. In the case of a vitamin D3 receptor, EDTA may be added.
When a poorly water-soluble compound is used as the low molecular weight compound of the present invention, it is preferably used after once dissolved in an organic solvent. For example, DMSO may be used as the organic solvent. For example, DMSO having a final concentration of 5% or less, preferably 2% or less, and most preferably 1% or less can be used.
In the present invention, when a change in the measured fluorescence polarization degree is observed, it is determined that the vitamin D3 derivative and the vitamin D3 receptor bind (interact).
According to the present invention, not only vitamin D3 receptors but also vitamin D3 derivatives contained in the sample can be measured. In the above method of the present invention, a certain amount of vitamin D3 receptor is brought into contact with the fluorescently labeled vitamin D3 derivative of the present invention simultaneously with or after contact with the sample, and the vitamin D3 derivative and vitamin D3 are contacted. The degree of fluorescence polarization generated by binding to the receptor is measured. The order in which the vitamin D3 receptor, the sample, and the fluorescently labeled vitamin D3 derivative are brought into contact with each other is arbitrary, and after the sample and the fluorescently labeled vitamin D3 derivative are brought into contact, the vitamin D3 receptor is added. Good. The “fixed amount” is not particularly limited in the upper limit or lower limit, but is usually 100 pg to 100 ng.
In the above method, the vitamin D3 derivative contained in the sample is measured by competing the vitamin D3 derivative fluorescently labeled with the vitamin D3 derivative present in the sample for a certain amount of vitamin D3 receptor. be able to. To perform a competitive reaction, an amount of vitamin D3 receptor is contacted with a fluorescently labeled vitamin D3 derivative in the presence of the sample, or after contact with the sample, the fluorescently labeled vitamin D3 derivative and Make contact. As a result, the vitamin D3 receptor that binds to the fluorescently labeled vitamin D3 derivative is inversely proportional to the concentration of the vitamin D3 derivative contained in the sample.
In another aspect of the present invention, a method for measuring the binding activity of a test compound to the vitamin D3 receptor is provided. In the method of the present invention, the fluorescently labeled vitamin D3 derivative of the present invention is contacted with a vitamin D3 receptor and a test compound, and then the conjugate of the fluorescently labeled vitamin D3 derivative and the vitamin D3 receptor is contacted. Measure fluorescence polarization.
The present invention also provides a method for screening a vitamin D3 receptor agonist or antagonist using a method for detecting the binding activity of a test compound to the vitamin D3 receptor. In this method, the binding activity of the test compound to the vitamin D3 receptor is measured, and a compound having the binding activity to the vitamin D3 receptor is selected.
The test compound used in the screening method of the present invention is usually a vitamin D3 derivative, but is not particularly limited thereto. The compound that binds to the vitamin D3 receptor selected by the above method of the present invention is useful as an agonist, antagonist or inhibitor, or promoter for the vitamin D3 receptor. A compound that binds to the vitamin D3 receptor is useful as a ligand that enables detection and purification of the vitamin D3 receptor. In the present invention, the vitamin D3 receptor used for searching for a compound that binds to the vitamin D3 receptor may be particularly called a target molecule. That is, the test compound is fluorescently labeled and the target molecule is reacted, and then the formation of a complex caused by the reaction between the target molecule and the fluorescently labeled test compound is measured based on the change in the degree of fluorescence polarization.
Furthermore, in a preferred embodiment of the present invention, the vitamin D3 receptor has a binding activity to the vitamin D3 receptor, which interferes with the binding between the vitamin D3 receptor and a vitamin D3 derivative previously known to bind to the vitamin D3 receptor. The present invention relates to a method for detecting a compound. The above method is a method for detecting the binding activity of a test compound to the vitamin D3 receptor, and includes the following steps.
(I) A step of bringing the fluorescently labeled vitamin D3 derivative of the present invention into contact with a vitamin D3 receptor and a test compound
(Ii) a step of measuring the degree of fluorescence polarization of the conjugate of the fluorescently labeled vitamin D3 derivative and the vitamin D3 receptor
More specifically, the “contact” in the step (i) can be performed as follows, for example.
(A) A vitamin D3 receptor is brought into contact with a fluorescently labeled vitamin D3 derivative that is already known to form a complex with a vitamin D3 receptor in the presence of a test compound.
(B) After contacting the test compound with the vitamin D3 receptor, the test compound is contacted with a fluorescently labeled vitamin D3 derivative that is already known to form a complex with the vitamin D3 receptor.
(C) A fluorescently labeled vitamin D3 derivative already known to form a complex with a vitamin D3 receptor is contacted with a vitamin D3 receptor and then contacted with a candidate compound.
(A) is a competitive activity of a test compound for a binding reaction between a fluorescently labeled vitamin D3 derivative already known to form a complex with a vitamin D3 receptor and the vitamin D3 receptor. It is a method for measuring. When the binding between the vitamin D3 receptor and the fluorescently labeled vitamin D3 derivative is not observed in the presence of the test compound, the test compound has an activity of binding to the vitamin D3 receptor, and the vitamin D3 receptor Can be identified as agonists or promoters, or antagonists or inhibitors.
The above (B) measures the inhibitory activity (inhibition activity) of a test compound against the binding reaction between a vitamin D3 derivative already known to form a complex with a vitamin D3 receptor and the vitamin D3 receptor. It is a method to do. Also in this method, when the test compound has a binding activity to the vitamin D3 receptor, the binding of the vitamin D3 receptor to the vitamin D3 derivative is inhibited.
The above (C) measures the replacement activity of the test compound against the binding reaction between the vitamin D3 derivative already known to form a complex with the vitamin D3 receptor and the vitamin D3 receptor. It is a way for. In this method, when the test compound has binding activity to the vitamin D3 receptor, a part of the vitamin D3 receptor previously bound to the vitamin D3 derivative is replaced by the test compound, The amount of formation decreases.
Also by the above method of the present invention, the binding activity of the test compound to the vitamin D3 receptor can be detected. In addition, by selecting a test compound that has been found to have a binding activity by this method, a compound that binds to the vitamin D3 receptor can be screened. Compounds selected by this method are useful as agonists or promoters, antagonists or inhibitors of vitamin D3 receptors.
After the test compound and vitamin D3 receptor are mixed in advance, the binding to the fluorescently labeled vitamin D3 derivative of the present invention may be measured, or the vitamin D3 receptor and the fluorescently labeled vitamin D3 derivative are once combined. After binding, the test compound is reacted, and the dissociation of the vitamin D3 receptor caused by the binding between the fluorescently labeled vitamin D3 derivative and the vitamin D3 receptor being replaced by the test compound is detected as a change in the degree of fluorescence polarization. May be.
In the method of the present invention, in addition to the vitamin D3 receptor that directly binds to the fluorescently labeled vitamin D3 derivative, a co-binding molecule can be isolated and identified. The co-binding molecule is also called a co-factor, and has an activity of regulating the activity of a bioactive molecule. For example, the co-binding molecule is further bound to a complex of a vitamin D3 derivative and a vitamin D3 receptor, thereby enhancing physiological activity. In this case, the co-bonded molecule is called a cofactor. On the other hand, when the activity is reduced, it is sometimes called a co-repressor. The co-binding molecule may bind to a complex of vitamin D3 receptor and vitamin D3 derivative, may bind only to vitamin D3 receptor, or may bind only to vitamin D3 derivative.
The vitamin D3 receptor recovered (selected) by the method of the present invention can be analyzed and identified by analytical techniques such as mass spectrometry and amino acid analysis (see, for example, US Pat. No. 5,955,729). Using this method, it is possible to identify an unknown vitamin D3 receptor having an activity of binding to a fluorescently labeled vitamin D3 derivative. The new vitamin D3 receptor identified by this method is useful as a drug target molecule.
The newly identified vitamin D3 receptor can be used to screen for compounds having the same activity as the vitamin D3 derivative used for identification. That is, using the newly identified vitamin D3 receptor, the binding to the test compound may be measured, or the competitive reaction with the vitamin D3 derivative used for the identification may be measured. As described above, these screening methods can be performed by measuring a change in the degree of fluorescence polarization.
There are no particular limitations on the test compound or test sample used for screening. For example, peptides, purified or crude proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, microbial fermentation products, marine organism extracts, plant effluents, cell extracts A liquid etc. can be used suitably. These test compounds may be novel compounds or known compounds.
New compounds, such as vitamin D3 receptor agonists or antagonists, that can be found by the above methods of the present invention are useful as pharmaceuticals. In particular, the compound is expected to be a therapeutic agent for bone related diseases. Examples of the bone-related diseases include osteoporosis and bone metastasis of cancer. Vitamin D3 receptor agonists and antagonists obtained by the method of the present invention are also included in the present invention. The compound obtained by using the screening method of the present invention is used as a pharmaceutical for humans and other mammals such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, chickens, cats, dogs, sheep, pigs, cows, monkeys, baboons and chimpanzees In this case, it can be carried out according to commonly used means. A pharmaceutical composition containing a compound obtained by using the screening method of the present invention as an active ingredient can be produced together with pharmaceutically acceptable excipients, stabilizers and the like by methods known to those skilled in the art.
Furthermore, this invention provides the measurement kit for using for the said method of this invention. The kit of the present invention contains at least the fluorescently labeled vitamin D3 derivative of the present invention. The kit includes, for example, fluorescently labeled vitamin D3 derivative, vitamin D3 receptor, specimen diluent, test tube or microplate for measurement, 1α-hydroxyvitamin D3 or 1α, 25-dihydroxyvitamin D3 as a standard product, Can also package instructions that describe how to use the kit.
The present invention also provides the following compounds (i) to (iv) described in Examples described later.
(I) (1α, 3β, 5Z, 7E) -25- (10-hydroxydecanyl) -27-nor-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25- Triol
(Ii) (1α, 3β, 5Z, 7E) -25- (10-aminodecanyl) -27-nor-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol
(Iii) (1α, 2β, 3β, 5Z, 7E) -2- (10-hydroxydecanyl) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol
(Iv) (1α, 2β, 3β, 5Z, 7E) -2- (10-aminodecanyl) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol
These compounds are useful for the production of labeled vitamin D3 derivatives, particularly fluorescently labeled vitamin D3 derivatives.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Aminoalkyl vitamin D3 derivative ((1α, 3β, 5Z, 7E) -25- (10-aminodecanyl) -27-nor-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene- Synthesis of 1,3,25-triol (hereinafter referred to as ED-533) (scheme until synthesis is shown in FIG. 5)
(1) Synthesis of (1α, 3β, 20S) -1,3-bis ((1,1-dimethylethyl) dimethylsilyl) oxy) -20-iodomethyl-pregna-5-ene
(1α, 3β, 20S) -1,3-bis ((1,1-dimethylethyl) dimethylsilyl) oxy) pregna-5-ene-20-methanol (Chem. Pharm. Bull. 39 (12), 3221 ( 1991), 34.14 g), triphenylphosphine (18.62 g), imidazole (5.24 g) and dichloromethane (350 ml) were added with iodine (16.52 g) under ice cooling and stirred at room temperature for 30 minutes. did. The reaction mixture was evaporated under reduced pressure, hexane was added to the resulting residue, and the insoluble material was filtered off. The obtained filtrate was washed with aqueous sodium thiosulfate solution, 0.5N hydrochloric acid, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate and saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was washed with acetonitrile, and (1α, 3β, 20S) -1,3-bis ((1,1-dimethylethyl) dimethylsilyl) oxy) -20-iodomethyl-pregna-5-ene (36. 63 g, 90%) was obtained as a white solid. The physicochemical properties of this compound are as follows.
¹1 H NMR (CDCl₃) Δ: 0.03 (3H, s), 0.04 (3H, s), 0.05 (3H, s), 0.07 (3H, s), 0.72 (3H, s), 0. 88 (9H, s), 0.89 (9H, s), 0.96 (3H, s), 2.13-2.37 (2H, m), 3.11-3.21 (1H, m) , 3.34 (1H, d, J = 8.9 Hz), 3.77 (1H, brs), 3.91-4.06 (1H, m), 5.41-5.49 (1H, m) .
(2) Synthesis of 1α, 3β-1,3-bis ((1,1-dimethylethyl) dimethylsilyl) oxy) -27-nor-5-cholesten-25-one
A mixture of nickel chloride hexahydrate (9 g), zinc dust (12.4 g), methyl vinyl ketone (14.8 g) and pyridine (200 ml) was stirred at 60 ° C. for 30 minutes and then cooled to room temperature. (1α, 3β, 20S) -1,3-bis ((1,1-dimethylethyl) dimethylsilyl) oxy) -20-iodomethyl-pregna-5-ene (20 g), tetrahydrofuran (50 ml) and pyridine (at room temperature) 100 ml) was added and stirred at room temperature for 2 hours. The reaction mixture was diluted with ethyl acetate and filtered through celite. The filtrate was washed with 0.5N hydrochloric acid, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate and saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate = 10: 1), and 1α, 3β-1,3-bis ((1,1-dimethylethyl) dimethylsilyl) oxy) -27-nor. -5-cholesten-25-one (16.8 g, 91%) was obtained as a white solid. The physicochemical properties of this compound are as follows.
¹1 H NMR (CDCl₃) Δ: 0.03 (3H, s), 0.04 (3H, s), 0.05 (3H, s), 0.07 (3H, s), 0.67 (3H, s), 0. 88 (9H, s), 0.88 (9H, s), 2.13 (3H, s), 3.77 (1H, brs), 3.91-4.06 (1H, m), 5.41 -5.49 (1H, m).
(3) 1α, 3β-1,3-bis ((1,1-dimethylethyl) dimethylsilyl) oxy) -27-nor-5,7-cholestadien-25-one 4-phenyl-1,2,4- Synthesis of triazoline-3,5-dione adduct
1α, 3β-1,3-bis ((1,1-dimethylethyl) dimethylsilyl) oxy) -27-nor-5-cholesten-25-one (16.8 g), N-bromosuccinimide (6.14 g) A mixture of 2,2′-azobisisobutyronitrile (1.3 g) and hexane (200 ml) was heated to reflux for 15 minutes. The reaction mixture was cooled to room temperature, insolubles were filtered, and the solvent was evaporated under reduced pressure. Toluene (200 ml) and γ-collidine (13.3 ml) were sequentially added to the obtained residue at room temperature, and the mixture was heated to reflux for 2.5 hours. The reaction mixture was cooled to room temperature, insolubles were filtered, diluted with hexane, washed with 0.5N hydrochloric acid, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate, and saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. Dichloromethane (200 ml) and 4-phenyl-1,2,4-triazole-3,5-dione (4.7 g) were sequentially added to the obtained residue at room temperature, and the mixture was stirred at room temperature for 45 minutes. After the reaction mixture was concentrated under reduced pressure, the resulting residue was purified by silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate: dichloromethane = 10: 1: 1), and 1α, 3β-1,3-bis ((1,1 -Dimethylethyl) dimethylsilyl) oxy) -27-nor-5,7-cholestadien-25-one 4-phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione adduct (7.8 g, 36%) Was obtained as a white amorphous. The physicochemical properties of this compound are as follows.
¹1 H NMR (CDCl₃) Δ: 0.07 (3H, s), 0.08 (3H, s), 0.10 (3H, s), 0.13 (3H, s), 0.80 (3H, s), 0. 88 (9H, s), 0.89 (9H, s), 2.14 (3H, s), 3.18-3.30 (1H, m), 3.84 (1H, brs), 4.69 -4.85 (1H, m), 6.21 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.37 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.34-7.49 (m, 5H).
(4) Synthesis of 1α, 3β-1,3-bis ((1,1-dimethylethyl) dimethylsilyl) oxy) -27-nor-5,7-cholestadien-25-one
1α, 3β-1,3-bis ((1,1-dimethylethyl) dimethylsilyl) oxy) -27-nor-5,7-cholestadien-25-one 4-phenyl-1,2,4-triazoline-3 , 5-dione adduct (5.7 g) and 1,3-dimethyl-2-imidazolidinone (57.1 ml) were stirred at 150 ° C. under an argon atmosphere. The residue obtained by evaporating the solvent under reduced pressure was purified by silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate = 8: 1), and 1α, 3β-1,3-bis ((1,1-dimethylethyl) dimethylsilyl). Oxy) -27-nor-5,7-cholestadien-25-one (3.3 g, 74%) was obtained as a pale yellow amorphous. The physicochemical properties of this compound are as follows.
¹1 H NMR (CDCl₃) Δ: 0.03-0.08 (9H, m), 0.10 (3H, s), 0.61 (3H, s), 0.88 (9H, s), 0.88 (9H, s) ), 2.13 (3H, s), 2.69-2.82 (1H, m), 3.69 (1H, brs), 3.97-4.11 (1H, m), 5.25- 5.34 (1H, m), 5.52-5.61 (1H, m).
(5) 1α, 3β-1,3-bis ((1,1-dimethylethyl) dimethylsilyl) oxy) -25- (10-hydroxydecanyl) -27-nor-5,7-cholestadien-25-ol Synthesis of
A few drops of ethylene bromide were added to a mixture of magnesium powder (3.3 g), 10-((triethylsilyl) oxy) decanyl bromide (4.8 g) and tetrahydrofuran (30 ml) at 50 ° C. under an argon atmosphere and stirred for 30 minutes. did. To the reaction mixture was added 1α, 3β-1,3-bis ((1,1-dimethylethyl) dimethylsilyl) oxy) -27-nor-5,7-cholestadien-25-one (2.2 g) and tetrahydrofuran (10 ml). Was added at 50 ° C. and stirred at the same temperature overnight. The reaction mixture was cooled to room temperature, saturated aqueous ammonium chloride solution was added, and the mixture was extracted with ethyl acetate. The organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate = 10: 1) to obtain a colorless oil (3.97 g). To a mixture of the obtained colorless oil (3.97 g) and tetrahydrofuran (50 ml), tetrabutylammonium fluoride (1M tetrahydrofuran solution, 10 ml) was added at room temperature, and the mixture was stirred at the same temperature for 15 min. The residue obtained by evaporating the solvent under reduced pressure was purified by silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate = 4: 1), and 1α, 3β-1,3-bis ((1,1-dimethylethyl) dimethylsilyl). Oxy) -25- (10-hydroxydecanyl) -27-nor-5,7-cholestadien-25-ol (1.74 g, 63%) was obtained as a white amorphous. The physicochemical properties of this compound are as follows.
¹1 H NMR (CDCl₃) Δ: 0.03-0.08 (9H, m), 0.11 (3H, s), 0.62 (3H, s), 0.88 (9H, s), 0.89 (9H, s) ), 2.28-2.41 (2H, m), 2.71-2.83 (1H, m), 3.57-3.74 (3H, m), 3.96-4.13 (1H) M), 5.26-5.36 (1H, m), 5.54-5.62 (m, 1H).
(6) (1α, 3β, 5Z, 7E) -25- (10-hydroxydecanyl) -27-nor-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25- Synthesis of triol
1α, 3β-1,3-bis ((1,1-dimethylethyl) dimethylsilyl) oxy) -25- (10-hydroxydecanyl) -27-nor-5,7-cholestadien-25-ol (0. 5 g) and tetrahydrofuran (350 ml) were subjected to UV light irradiation (500 W xenon-mercury lamp ultraviolet irradiation device 295 nm interference filter transmission light manufactured by Ushio Electric Co., Ltd.) for 3 hours while stirring with water cooling under an argon stream. Tetrahydrofuran (150 ml) was added to the reaction mixture, and the mixture was heated to reflux for 2 hours under an argon atmosphere. The residue obtained by evaporating the solvent under reduced pressure was purified by silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate = 2: 1) to give (1α, 3β, 5Z, 7E) -1,3-bis ((1,1- 493 mg of a mixture containing dimethylethyl) dimethylsilyl) oxy) -25- (10-hydroxydecanyl) -27-nor-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -trien-25-ol was obtained. . A mixture of the obtained mixture (493 mg), tetrabutylammonium fluoride (1.0 M tetrahydrofuran solution, 16 ml) and tetrahydrofuran (10 ml) was stirred at 45 ° C. for 2 hours under an argon atmosphere. The reaction mixture was diluted with ethyl acetate, washed with 0.5N hydrochloric acid, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate, and saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate: ethanol = 5: 5: 1), and (1α, 3β, 5Z, 7E) -25- (10-hydroxydecanyl) -27-nor -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol (159 mg, 45%) was obtained. The physicochemical properties of this compound are as follows.
IR (neat): 3338, 2927, 2850, 1711, 1466, 1377, 1261, 1057 cm^-1;¹1 H NMR (CDCl₃) Δ: 0.54 (3H, s), 2.54-2.65 (1H, m), 2.76-2.90 (1H, m), 3.63 (2H, t, J = 6. 8 Hz), 4.23 (1H, brs), 4.43 (1H, brs), 5.00 (1H, s), 5.33 (1H, s), 6.01 (1H, d, J = 11) .1 Hz), 6.38 (1H, d, J = 11.1 Hz); MS (EI) m / z 540 (M⁺-H₂O); UV (in EtOH) λ_max212.5, 264.5 nm.
(7) (1α, 3β, 5Z, 7E) -25- (10-aminodecanyl) -27-nor-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol Composition
(1α, 3β, 5Z, 7E) -25- (10-hydroxydecanyl) -27-nor-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol (159 mg ), Phthalimide (63 mg), triphenylphosphine (89 mg) and tetrahydrofuran (2.8 ml) were slowly added with azodicarboxylic acid diethyl ester (0.05 ml) at room temperature under an argon atmosphere and stirred at room temperature for 1.5 hours. . The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, and the resulting residue was subjected to silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate: ethanol = 5: 5: 1) and thin layer silica gel chromatography (hexane: ethyl acetate: ethanol = 5: 5: 1). ), And (1α, 3β, 5Z, 7E) -25- (10-phthalimidodecanyl) -27-nor-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3 A mixture (240 mg) containing 25-triol was obtained. A mixture of the obtained mixture (240 mg) and methylamine (40% methanol solution, 8 ml) was stirred at room temperature for 1 hour under an argon atmosphere. The reaction mixture was purified by thin layer silica gel chromatography (NH TLC plate manufactured by Fuji Silysia Chemical, dichloromethane: ethanol = 10: 1), and (1α, 3β, 5Z, 7E) -25- (10-aminodecanyl) -27-nor. 8.8 mg (5.6%) (ED-533) of -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol was obtained as white amorphous. The physicochemical properties of this compound are as follows. The structure of ED-533 is shown in Chemical Formula 3.
IR (neat): 3356, 2927, 2852, 1647, 1466, 1375, 1057 cm^-1;¹1 H NMR (CDCl₃) Δ: 0.54 (3H, s), 2.66 (1H, t, J = 7.0 Hz), 2.77-2.88 (1H, m), 4.15-4.28 (1H, m), 4.35-4.44 (1H, m), 4.98 (1H, s), 5.32 (1H, s), 6.01 (1H, d, J = 11.1 Hz), 6 .36 (1H, d, J = 11.1 Hz); MS (EI) m / z 539 (M⁺-H₂O); UV (in EtOH) λ_max210.8, 263.3 nm.

Example 2 (1α, 2β, 3β, 5Z, 7E) -2- (10-aminodecanyl) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol ( (Hereinafter referred to as ED-532) (scheme until synthesis is shown in FIG. 6)
(1) Synthesis of (1α, 2β, 3β) -2- (10-((triethylsilyl) oxy) decanyl) -5,7-cholestadien-1,3,25-triol
A few drops of ethylene bromide were added to a mixture of magnesium powder (1.5 g), 10-((triethylsilyl) oxy) decanyl bromide (5.0 g) and tetrahydrofuran (10 ml) at room temperature in an argon atmosphere and stirred for 30 minutes. . (1α, 2α, 3β) -1,2-epoxy-cholesta-5,7-diene-3,25-diol (Chem. Pharm. Bull. 41 (6), 1111 (1993), 625 mg) and A mixture of tetrahydrofuran (15 ml) was added at room temperature and heated to reflux for 1 hour. The reaction mixture was cooled to room temperature, saturated aqueous ammonium chloride solution was added, and the mixture was extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained residue was purified by silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate = 4: 1), and (1α, 2β, 3β) -2- (10-((triethylsilyl) oxy) decanyl) -5,7- Cholestadiene-1,3,25-triol 714 mg (67%) was obtained as a white amorphous. The physicochemical properties of this compound are as follows.
¹1 H NMR (CDCl₃) Δ: 0.5-0.7 (9H, m), 0.9-1.1 (15H, m), 1.91 (1H, m), 2.0-2.2 (2H, m) , 2.30 (1H, dd, J = 14.7, 4.6 Hz), 2.49 (1H, m), 2.69 (1H, m), 3.59 (2H, t, J = 6. 6 Hz), 3.78 (1H, brs), 4.20 (1H, m), 5.37 (1H, m), 5.68 (1H, m).
(2) (1α, 2β, 3β, 5Z, 7E) -2- (10-((triethylsilyl) oxy) decanyl) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3 , 25-triol synthesis
A mixture of (1α, 2β, 3β) -2- (10-((triethylsilyl) oxy) decanyl) -5,7-cholestadien-1,3,25-triol (500 mg) and tetrahydrofuran (350 ml) was added under an argon stream. Then, UV light irradiation (500 W xenon-mercury lamp ultraviolet irradiation device 295 nm interference filter transmission light manufactured by Ushio Electric Co., Ltd.) was performed for 3 hours while stirring with water cooling. Tetrahydrofuran (150 ml) was added to the reaction mixture, and the mixture was heated to reflux for 2 hours under an argon atmosphere. The residue obtained by evaporating the solvent under reduced pressure was purified by silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate = 1: 1), and (1α, 2β, 3β, 5Z, 7E) -2- (10-((triethylsilyl ) Oxy) decanyl) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol 123 mg (25%) was obtained as a pale yellow amorphous. The physicochemical properties of this compound are as follows.
¹1 H NMR (CDCl₃) Δ: 0.5-0.7 (9H, m), 0.8-1.0 (15H, m), 2.45 (2H, m), 2.81 (1H, brd, J = 1.11. 9 Hz), 3.59 (2H, t, J = 6.7 Hz), 3.9-4.2 (2H, m), 5.01 (1H, s), 5.37 (1H, s), 6 .03 (1H, d, J = 11.2 Hz), 6.34 (1H, d, J = 11.2 Hz); MS (ESI) m / z 687 (M⁺+1); UV (in EtOH) λ_max214.1, 264.5 nm.
(3) of (1α, 2β, 3β, 5Z, 7E) -2- (10-hydroxydecanyl) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol Composition
(1α, 2β, 3β, 5Z, 7E) -2- (10-((triethylsilyl) oxy) decanyl) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25- A mixture of triol (123 mg), tetrabutylammonium fluoride (1.0 M tetrahydrofuran solution, 2 ml) and tetrahydrofuran (2 ml) was stirred at room temperature for 15 minutes under an argon atmosphere. The reaction mixture was purified twice by silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate: ethanol = 5: 5: 1), and (1α, 2β, 3β, 5Z, 7E) -2- (10-hydroxydecanyl) -9. , 10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol (89 mg, 87%) was obtained as a white amorphous. The physicochemical properties of this compound are as follows.
¹1 H NMR (CDCl₃) Δ: 0.55 (3H, s), 0.94 (3H, d, J = 6.1 Hz), 2.46 (2H, m), 2.81 (1H, brd, J = 12.0 Hz) 3.64 (2H, t, J = 6.6 Hz), 4.03 (1H, m), 4.14 (1H, m), 5.01 (1H, s), 5.37 (1H, s) ), 6.03 (1H, d, J = 11.2 Hz), 6.34 (1H, d, J = 11.2 Hz); MS (ESI) m / z 573 (M⁺+1); UV (in EtOH) λ_max213.7, 264.1 nm
(4) Synthesis of (1α, 2β, 3β, 5Z, 7E) -2- (10-aminodecanyl) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol
(1α, 2β, 3β, 5Z, 7E) -2- (10-hydroxydecanyl) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol (89 mg), To a mixture of phthalimide (34 mg) triphenylphosphine (49 mg) and tetrahydrofuran (1.5 ml) was slowly added azodicarboxylic acid diethyl ester (0.03 ml) at room temperature under an argon atmosphere, and the mixture was stirred at room temperature for 1.5 hours. The reaction mixture was subjected to silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate: ethanol = 5: 5: 1), silica gel chromatography (hexane: ethyl acetate = 1: 1) and silica gel chromatography (hexane: ethyl acetate = 2: 1). (1α, 2β, 3β, 5Z, 7E) -2- (10-phthalimidodecanyl) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol A containing mixture (70 mg) was obtained. A mixture of the obtained mixture (70 mg) and methylamine (40% methanol solution, 4 ml) was stirred at room temperature for 30 minutes under an argon atmosphere. The reaction mixture was purified by thin layer silica gel chromatography (NH TLC plate manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd., dichloromethane: methanol = 10: 1), and (1α, 2β, 3β, 5Z, 7E) -2- (10-aminodecanyl) -9. , 10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol (ED-532) as 17.8 mg (20%) as white amorphous. The physicochemical properties of this compound are as follows. The structure of ED-532 is shown in Chemical Formula 4.

IR (neat): 3363, 2925, 2852, 1716, 1645, 1585, 1468, 1441, 1377, 1215, 1149, 1059 cm^-1;¹1 H NMR (CDCl₃) Δ: 0.55 (3H, s), 0.94 (3H, d, J = 5.4 Hz), 2.67 (1H, t, J = 7.3 Hz), 2.76-2.87 ( 1H, m), 4.01-4.08 (1H, m), 4.11-4.17 (1H, m), 5.01 (1H, s), 5.37 (1H, s), 6 .03 (1H, d, J = 11.3 Hz), 6.33 (1 H, d, J = 11.3 Hz); MS (EI) m / z 572 (M⁺); UV (in EtOH) λ_max213.3, 264.7 nm.
[Example 3] Production of ED-532 and ED-533 labeled with flowresin (scheme up to synthesis is shown in FIG. 7)
(1) Synthesis of ED-532FL
125 μL of an ethanol solution of ED-532 diluted to 1 mg / mL and 125 μL of 0.1 M borate buffer (pH 11.9) were mixed, and FITC isomer I (100 mg / mL) diluted to 100 mg / mL. 10 μL of a dimethylformamide solution (Molecular Probes) was added and shaken for 90 minutes in the dark at room temperature. After adding 15 μL of ethanolamine in ethanolamine diluted to 10% (v / v) to this solution, the flowresin-labeled product was purified by HPLC under the following conditions.
For the purification, Kanto Chemical Lighttysil RP-180DS (75 mm × 4.6 mm, particle size 3 μm) was used as the HPLC column, and the mobile phase was 10% acetonitrile (0 to 0.5 min), 10 to 100% acetonitrile linear gradient ( 0.5-11.5 minutes), 100% acetonitrile (11.5 minutes-), flow rate of 1 mL / min, injection volume: 20 μL / time, 265 nm UV absorption peak portion observed at retention time of about 12 minutes Of 0.5 mL was obtained.
(2) Synthesis of ED-533FL
By using ED-533 instead of ED-532, ED-533FL in which fluorescein was bonded to the 25th position via a linker was synthesized in the same manner. For purification, a Varian Bond Elute C18 column was used, and after sequential treatment with 2.4 mL of acetonitrile and 4 mL of water as pre-washing, 1 mL of a solution obtained by diluting the reaction product to 10 times volume with water was applied to the column. After sequentially washing under conditions of 2.4 mL of 10% acetonitrile and 2.4 mL of 20% acetonitrile, elution was performed with 2.4 mL of 30% acetonitrile. The eluate obtained by drying with a centrifugal concentrator was dissolved in 500 μL of ethanol and used in the following experiment.
Example 4 1.25 (OH) by ED-532FL₂Dose response curve for vitamin D3
50 mM Tris-HCl buffer solution containing 28 mM of fluorescein-labeled ED-532 (ED-532FL) obtained in Example 3 (1), 300 mM potassium chloride, 2 mM dithiothreitol, and 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid. 7 mL of pH 8.0 was added. From this solution, 198 μL was transferred to a BEACON test tube (P2244, Panvera), and 2 μL of dimethyl sulfoxide was added thereto as a control sample without vitamin D receptor. 1.7 μL of recombinant human vitamin D3 receptor (548-00871, Wako Pure Chemicals) is added to the remaining solution, and 198 μL of this solution is transferred to a BEACON test tube and dissolved in dimethyl sulfoxide to a predetermined concentration. 1,25 (OH)₂2 μL of vitamin D3 was added to prepare a measurement sample. Control samples and measurement samples without vitamin D receptor were allowed to stand for 90 minutes in the dark at room temperature after preparation, and the dose response of these samples was measured by measuring the degree of fluorescence polarization at 25 ° C. using full range BEACON 2000 (Panbella). A curve was obtained.
FIG. 1 shows the measurement results. This result shows the average and standard deviation of three measurements in the same experiment, and the leftmost point (VD (−)) is 1,25 (OH)₂The measured value when vitamin D3 is not added (in the state where only ED-532FL and vitamin D receptor are present), the rightmost point (VDR (−)) indicates the measured value of the control sample without vitamin D receptor. Yes. The degree of polarization of fluorescence increases by about 130 mm by adding vitamin D receptor, and the final concentration is 10^-91.25 (OH) above M₂Addition of vitamin D3 decreased the degree of polarization in a dose-dependent manner. This result shows that ED-532FL has an activity of binding to vitamin D3 receptor, and 1.25 (OH) of vitamin D3 receptor.₂This indicates that it binds to the vitamin D3 binding site, and 1.25 (OH) by this method₂It shows that quantification of various vitamin D3 derivatives including vitamin D3 is possible.
[Example 5] Dose response curves for various vitamin D derivatives
Various vitamin D3 derivatives (ED-71, OCT, ED-130) dissolved in dimethyl sulfoxide so as to have a predetermined concentration were measured in the same manner as in Example 4, and the respective dose-response curves were compared. The structure of ED-71, OCT, or ED-130 is shown in Chemical Formula 5, 6 or 7, respectively.

FIG. 2 shows the measurement results. This result shows the average of three measured values in the same experiment, the leftmost point (VD (-)) is the measured value when various vitamin D3 derivatives are not added, and the rightmost point (VDR (-)) is the vitamin. The measured value of the control sample without D receptor is shown. ED-71, OCT, ED-130 are 1.25 (OH)₂10 as a final concentration slightly higher than vitamin D3^-8The dose-dependent degree of polarization decreased with the addition of M or more. This result shows that the method we invented can be used for the quantification of various vitamin D3 derivatives, and that the receptor-binding ability of various vitamin D derivatives can be compared with each other.
[Example 6] Reaction to various vitamin D derivatives
10 in the same manner as in Example 4.^-71.25 (OH) dissolved in dimethyl sulfoxide to be M₂Vitamin D3 and its derivatives (ED-71, OCT, ED-130) were measured.
FIG. 3 shows the measurement results. This result shows the average and standard deviation of three experimental values with different implementation dates, and each experimental value is obtained as the average of three measured values within the same experiment. The leftmost bar (VD (-)) shows the measured value when various vitamin D3 derivatives are not added, and the second bar (VDR (-)) from the leftmost shows the measured value of the control sample without vitamin D receptor. Yes. 10 as final concentrations of ED-71, OCT, ED-130^-7The degree of polarization when M is added is significantly lower than when no vitamin D3 derivative is added, but the same concentration of 1.25 (OH)₂The degree of decrease was not as significant as when vitamin D3 was added. This result shows that the receptor binding ability of various vitamin D derivatives can be compared with each other based on the degree of polarization at a single dose.
[Example 7] 1.25 (OH) by ED-533FL₂Dose response curve for vitamin D3
50 mM Tris-HCl containing 3.3 mM L-flowresin-labeled ED-533 (ED-533FL) obtained in Example 3 (2) and 300 mM potassium chloride, 2 mM dithiothreitol, and 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid. 10.4 mL of buffer pH 8.0 was added. This solution was transferred to three BEACON test tubes (P2244, Panvera) in increments of 198 μL, and 2 μL of dimethyl sulfoxide was added to each to make a control sample without vitamin D receptor. To the remaining solution, 2.5 μL of vitamin D3 receptor, human and recombinant (548-00871, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) are added, and 198 μL of this solution is transferred to a BEACON test tube, and dimethyl sulfoxide is added thereto to obtain a predetermined concentration. Dissolved 1,25 (OH)₂Vitamin D3 was added to prepare a measurement sample. Control samples and measurement samples without vitamin D receptor were allowed to stand for 90 minutes in the dark at room temperature after preparation, and the dose response of these samples was measured by measuring the degree of fluorescence polarization at 25 ° C. using full range BEACON 2000 (Panbella). A curve was obtained.
FIG. 4 shows the measurement results. This result shows the average and standard deviation of three measurements in the same experiment, and the leftmost point (VD (−)) is 1,25 (OH)₂The measured value when vitamin D3 is not added, the rightmost point (VDR (-)) indicates the measured value of the control sample without vitamin D receptor. The degree of polarization of fluorescence increases by 136 mm with the addition of vitamin D receptor, and the final concentration is 10^-81.25 (OH) above M₂Addition of vitamin D3 decreased the degree of polarization in a dose-dependent manner. This result shows that ED-533FL has an activity of binding to vitamin D3 receptor, and 1.25 (OH) of vitamin D3 receptor.₂This indicates that it binds to the vitamin D3 binding site, and 1.25 (OH) by this method₂It shows that quantification of various vitamin D3 derivatives including vitamin D3 is possible.
Industrial applicability
INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, there has been provided a novel method capable of easily and accurately detecting a binding activity between a low molecular compound using fluorescence polarization and a receptor of the compound. This method can complete the measurement in a short time, and there is less inactivation of the binding activity of the protein used for the test compound compared to the binding activity measurement test using a radioisotope element. Expected to get. Further, by using this method, it has become possible to screen for compounds that bind to vitamin D3 receptors or novel vitamin D3 receptors. The compound obtained by the screening method of the present invention is highly expected to be a therapeutic agent for bone related diseases.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows 1.25 (OH) by ED-532FL.₂It is a figure which shows the dose response curve with respect to vitamin D3. The vertical axis represents the degree of fluorescence polarization, and the horizontal axis represents the concentration of the test compound.
FIG. 2 shows dose-response curves for various vitamin D3 derivatives (ED-71, OCT, ED-130). The vertical axis represents the degree of fluorescence polarization, and the horizontal axis represents the concentration of the test compound.
FIG. 3 shows various vitamin D3 derivatives (ED-71, OCT, ED-130) 1 × 10^-7It is a figure which shows the polarization degree at the time of adding M. The vertical axis represents the degree of fluorescence polarization.
FIG. 4 shows 1.25 (OH) by ED-533FL.₂It is a figure which shows the dose response curve with respect to vitamin D3. The vertical axis represents the degree of fluorescence polarization, and the horizontal axis represents the concentration of the test compound.
FIG. 5 is a diagram showing a scheme up to the synthesis of ED-533.
FIG. 6 is a diagram showing a scheme up to synthesis of ED-532.
FIG. 7 shows a scheme up to the synthesis of ED-532FL and ED-533FL.

Claims (14)

A fluorescent label having a structure represented by the following chemical formula 1.
(Chemical formula 1)

X represents a linker which is an alkyl group, an alkyloxy group or a peptide giving a distance of 8 to 15 in terms of carbon chain, and Y represents a phosphor composed of a group including florescein, tetramethylrhodamine and Texas Red. A fluorescent label having a structure represented by the following chemical formula 2.
(Chemical formula 2)

X represents a linker which is an alkyl group, an alkyloxy group or a peptide giving a distance of 8 to 15 in terms of carbon chain, and Y represents a phosphor composed of a group including florescein, tetramethylrhodamine and Texas Red. A method for detecting binding between a vitamin D3 derivative and a vitamin D3 receptor,
(A) measuring a fluorescent label according to claim 1 or 2, contacting the vitamin D3 receptor, and (b) fluorescence polarization of the coupling product of the fluorescent label and vitamin D3 receptor Including a step. A method for detecting a vitamin D3 receptor contained in a sample, comprising:
(1) A step of bringing a sample into contact with the fluorescent label according to claim 1 or 2,
(2) a method comprising the a fluorescent label, measuring the fluorescence polarization of the coupling product of vitamin D3 receptor, the. A method for detecting a vitamin D3 derivative contained in a sample, comprising:
(1) contacting a certain amount of vitamin D3 receptor with a sample and the fluorescent label according to claim 1 or 2,
(2) a method comprising steps, a measuring fluorescence polarization of the coupling product of the fluorescent label and vitamin D3 receptor. A method for measuring the binding activity of a test compound to vitamin D3 receptor, comprising:
(1) and the fluorescent label as claimed in claim 1 or 2, the fluorescence polarization of the vitamin D3 receptor and the step (2) contacting a test compound the fluorescent label and the coupling product of the vitamin D3 receptor Measuring.   A method for screening a vitamin D3 receptor agonist or antagonist, comprising the step of measuring the binding activity of a test compound to vitamin D3 receptor by the method according to claim 6 and selecting a compound having binding activity to vitamin D3 receptor. . A method for measuring the binding activity of a test compound to a vitamin D3 derivative, comprising:
(1) including a test compound, measuring the fluorescence polarization caused by the binding of claim 1 or 2 in step of contacting a fluorescent label according (2) said test compound and said fluorescent label, a Method. A method for screening a vitamin D3 receptor, comprising the step of measuring the binding activity of a test compound to a vitamin D3 derivative by the method according to claim 8 and selecting a compound having a binding activity to the vitamin D3 derivative. To claim 1 or 2 comprising a fluorescent label according claim 3-7, measurement kit for use in a method according to any one of 8 or 9.   (1α, 3β, 5Z, 7E) -25- (10-hydroxydecanyl) -27-nor-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol.   (1α, 3β, 5Z, 7E) -25- (10-Aminodecanyl) -27-nor-9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol.   (1α, 2β, 3β, 5Z, 7E) -2- (10-hydroxydecanyl) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol.   (1α, 2β, 3β, 5Z, 7E) -2- (10-aminodecanyl) -9,10-secocholesta-5,7,10 (19) -triene-1,3,25-triol.

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