JP4439641B2

JP4439641B2 - Novel mannanase, its production and use

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Publication number: JP4439641B2
Application number: JP33055899A
Authority: JP
Inventors: 得麻佐子决; 藤優加; 前英郎大
Original assignee: Kirin Holdings Co Ltd
Current assignee: Kirin Holdings Co Ltd
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 1999-11-19
Publication date: 2010-03-24
Anticipated expiration: 2019-11-19
Also published as: JP2001145485A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なβ−マンナナーゼ、その製造法および用途、ならびに関連の微生物に関するものであり、さらに詳細には、本発明は、従来のものより低温でも活性を示す新規なβ−マンナナーゼおよびその製造方法、β−マンナナーゼ酵素剤（代表的には、コーヒー飲料での沈殿生成防止剤）、β−マンナナーゼのコーヒー飲料における沈殿生成防止のための使用および沈殿生成防止方法、ならびに上記酵素の産生能を有するβ−マンナナーゼ産生菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、コーヒー飲料は缶入り製品としての流通量が増加している。コーヒー抽出液は保存中に濁りや沈殿を発生しやすく、これらを抑える製法の開発が望まれている。さらに近年では、本格風味を提供するための原料コーヒー豆の使用量増加、販売地域拡大による市場滞留期間の長期化および自動販売機や温缶機による加温などにより、沈殿が生じ、商品価値を著しく低下させるという問題が生じている。コーヒー抽出液の沈殿はコーヒー豆由来のガラクトマンナンに起因し、マンナン分解酵素を利用して沈殿発生を抑える飲料の製造方法が特開平7-184546号公報に、また繊維素分解酵素を用いた沈殿防止方法が特公昭４７−１９７３６号公報に、酵素を用いた混濁防止法が特開平４−４５７４５号公報に開示されている。
【０００３】
また、マンナン分解酵素は、バチルス属由来の酵素が特公昭６３−１８４７４、特公平３−６５７５４号公報に、ペニシリウム・パープロゲナム由来の酵素が特開昭６３−２０９５８６号公報に、クロストリジウム・テルチウム、ラクトバチルス属由来の酵素が特開平５−１７６７６７号公報に、リゾプス・ニーベウスが特公昭４９−１２７１０号公報にそれぞれ開示されている。さらに報告があるものとしてトリコデルマ・レーゼイ（Appl. Microbiol. (1993 39:58-62)、ストレプトマイセス属（Agric. Biol. Chem., 48(9), 2189-2195, 1985）、エンテロコッカス・カゼリフラバス（J. Ferment. Bioeng., vol.76(1), 14-18, 1993）、ビブリオ属（Appl. and Environ. Microbiol. Nov., 1990, 3505-36510）、エアロモナス属（J. Fac. Arg., Kyushu Univ., 27(3. 4), 89-98(1983)由来のマンナナーゼ等がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上述の方法では例えば、市販されているマンナン分解酵素であるアスペルギルス・ニガー由来の酵素セルロシンＧＭ５（阪急共栄物産株式会社）、ガマナーゼ（ノボノルディスクバイオインダストリー株式会社）、また論文にて報告されている酵素であるトリコイデルマ・レーゼイ由来酵素、ペニシリウム・パープロゲナム由来のβ−マンナナーゼ等は、その至適温度は概ね70〜80℃であり、常温における酵素反応性が低い。さらに蛋白重量あたりの比活性が低いため、コーヒー抽出液の沈殿解消を工業的に行うには、処理温度を高くする（４０〜５０℃）ことが必要であった。その結果、工程が複雑化し、またコーヒー本来の香味、品質の劣化の問題を生じていた。２０〜３０℃程度の常温で十分に作用させるためには酵素添加量を上げることも考えられるが、その場合上述の酵素は比活性が低いために多量の酵素を添加せざるをえず、酵素蛋白質由来の異味を生じる問題があり、常温における酵素反応性のより高い酵素、あるいは少量の添加量で効果のある、より高い比活性の酵素の開発が望まれる。
【０００５】
その他に現在報告されている微生物由来のβ−マンナナーゼとしてはバチルス属由来、クロストリジウム・テルチウム、ラクトバチルス属由来、ストレプトマイセス属由来、エンテロコッカス・カゼリフラバス由来、リゾプス・ニーベウス由来、ビブリオ属由来、エアロモナス属由来があるが、バチルス属、ストレプトマイセス属由来酵素は至適ｐＨが中性〜アルカリ性であるため、コーヒーの処理の目的には適さず、クロストリジウム・テルチウム、ラクトバチルス属、エンテロコッカス・カゼリフラバスは微嫌気性細菌のため、培養装置の気相部を窒素で置換する必要があり、培養方法が煩雑化するため工業的に使用するのには困難である。リゾプス・ニーベウス由来酵素については特公昭４９−１２７１０号公報によると、酵素の採取方法として、ＳＥ−セファデックスなどのイオン交換体を低イオン強度に緩衝化し分離する第一工程と、高イオン強度に緩衝化し分離する第二工程が必要であり、実用上は難点を残していた。またビブリオ属には食品汚染菌が数多く見られ、食品工業において使用するには安全性に難点がある。エアロモナス属酵素は温度安定性が低く、工業的に流通して使用するには保存安定性に問題がある。
【０００６】
本発明は、より常温に近い状態でもマンナン分解活性が高く、かつ高い比活性を有する酵素、その製造法および用途（例えば、コーヒー製造において少量の添加量で有効な沈殿防止方法）を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者はかかる実情において、コーヒー沈殿防止に更に適した活性を有するβ−マンナナーゼを産生する微生物を微生物保存機関より取寄せた菌株にて探索した結果、単輪生のペニシリウム属に属する微生物から高いマンナン分解活性を持つ菌株を多数見出した。単輪生とはペニシリウム属の同定を行う際に重要なぺニシリの形態的特徴の一種であり、分生子柄より直接フィアライドを輪生し、メトレ、ラミなどの分岐を持たないぺニシリの状態を表している。一方、分生子柄に分岐を持つ複輪生、多輪生もある。
【０００８】
本発明者は、さらに自然界からも検索した結果、群馬県の土壌から高分解活性株を複数株見出し、分離同定あるいは分離観察したところ、分離された微生物のうち、コーヒー沈殿防止に適した活性を有するものの全てが単輪生のペニシリウム（Penicillium）属に属する微生物であることがわかった。この微生物は（1）マンナンに対し高い分解活性を有するβーマンナナーゼを多量に産生すること、（2）これをコーヒー抽出液に作用させた場合、驚くべきことに常温でも沈殿防止効果がすぐれていること、（3）この酵素を精製したところ、非常に高い比活性を持つため、酵素添加量が少なくてよいこと、(4)また本菌は安全な菌であり、食品工業での利用において安全性に問題がないこと、を見出し、この知見に基づいて本発明を完成させるに至った。
【０００９】
従って、本発明は新規なβ−マンナナーゼ、その製造法および用途、さらに具体的には、β−マンナナーゼ酵素剤（代表的には、例えばガラクトマンナンに作用してコーヒー飲料での沈殿を解消することができる沈殿生成防止剤）、β−マンナナーゼのコーヒー飲料における沈殿生成防止のための使用および沈殿生成防止方法、ならびに上記酵素を産生する能力を有するβ−マンナナーゼ産生菌に関する。
【００１０】
すなわち、本発明によるβ−マンナナーゼは、次の理化学的性質を有することを特徴とするものであり、代表的には単輪生のペニシリウム属または単輪生のユーぺニシリウム属に属する微生物によって生産することができる。
(1)作用
β−マンナンのβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合を非特異的に加水分解して、マンノースおよびマンノオリゴ糖を生成する。
(2)至適ｐＨ
至適ｐＨは約５．０〜６．０である。
(3)作用適温の範囲
作用適温範囲は少なくとも約20〜70℃である。
（ここで、少なくとも約20〜70℃とは、約20〜70℃は明確に適温範囲であるということであり、それ以外の範囲を排除するものではない。）
(4)30℃活性／40℃活性が約８０%以上である。
【００１１】
好ましい態様において、このβ−マンナナーゼは、次の理化学的性質を有することを特徴とするものであり、代表的には前記の微生物、特にペニシリウム・マルチカラーに属する微生物によって生産することができる。
(1)作用
β−マンナンのβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合を非特異的に加水分解して、マンノースおよびマンノオリゴ糖を生成する。
(2)至適ｐＨ
至適ｐＨは約５．０〜６．０である。
(3)作用適温の範囲
作用適温範囲は少なくとも約20〜70℃である。
(4)３０℃活性／４０℃活性が約８０％以上である。
(5)基質特異性
マンナン、ガラクトマンナン、グルコマンナンに特異的に作用し、アラビノキシラン、キシラン、トラガントガム、セルロース、カルボキシメチルセルロースには作用しない。
(6)至適温度
至適温度は約60〜70℃である
(7)安定ｐＨ範囲
安定ｐＨ範囲は約3.0〜10.0である。
(8)温度安定性
温度安定性（pH5.0において）は、30℃で1時間の処理を行ったときの残存活性を100％としたとき、50℃で1時間の処理により約100％の残存活性であり、60℃で1時間の処理により約70％の残存活性である。
(9)分子量
分子量は約42,000〜45,000(SDS-PAGE法)である。
【００１２】
また、本発明によるβ−マンナナーゼの製造方法は、上記β−マンナナーゼの生産菌を培養し、培養物から上記酵素もしくは含有組成物を採取することを特徴とするものである。
【００１３】
さらに、本発明によるβ−マンナナーゼ酵素剤（代表的には、コーヒー飲料の沈殿生成防止剤）は、上記β−マンナナーゼを含んでなるものである。
【００１４】
本発明はまた、上記β−マンナナーゼの、コーヒー飲料における沈殿生成防止のための使用でもある。
【００１５】
本発明による沈殿生成防止法は、コーヒー抽出液に、上記のβ−マンナナーゼ酵素剤を作用させる（好ましくは低温もしくは常温で）ことを特徴とするものである。
【００１６】
本発明による微生物は、上記のβ−マンナナーゼを産生する能力を有する微生物である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明において、β−マンナナーゼとは、本発明による酵素が精製されたもの、粗精製物もしくは非精製物のいずれをも包含することを意味する。すなわち、この酵素は後述のように上記β−マンナナーゼの生産菌を培養し、この培養物（培養液、培養濾液）の活性画分を蛋白質を得るのに通常用いられる手段、例えば硫安を用いた塩析、限外ろ過による濃縮あるいは減圧蒸留による濃縮により粗精製物を得ることができ、またこの生成物を適当なクロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動などを適宜使用してより精製された酵素を得ることができるが、本発明においては、上記の性質のβ−マンナナーゼを含んでいる限り、このいずれの段階のものも包含される。ここでは、培養濾液等の非精製物あるいは粗精製物をβ−マンナナーゼ含有組成物ともいう。
【００１８】
本発明のβ−マンナナーゼは、前記のようなβ−マンナナーゼを産生する能力を有するβ−マンナナーゼ生産菌を適当な栄養源含有培地（後述）で培養し、培養物からβ−マンナナーゼを得ることにより製造することができる。β−マンナナーゼ生産菌は、好ましくは単輪生のペニシリウム属または単輪生のユーペニシリウム属に属する微生物であり、具体的には例えば、ペニシリウム属アスペルギロイデス亜属に属する微生物、代表的にはペニシリウム・マルチカラー（特にぺニシリウム・マルチカラーmch13-2株）があげられる。
【００１９】
単輪生のペニシリウム属および単輪生のユーペニシリウム属に属するβ−マンナナーゼ生産菌としては、例えばペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)、ペニシリウム・スクレロチオラム(Penicillium sclerotiorum)、Penicillium purprescens、Penicillium spinulosum、Penicillium thomii、Penicillium implicatum、Penicillium adametzioides、Penicillium quercetorum、Penicillium montanense、Penicillium chermesinum、Penicillium restrictum、Penicillium roseopurpureum、Penicillium vinaceum、Penicillium capsulatum、Penicillium resedanum、Penicillium citreonigrum、Penicillium sublateritium、Penicillium cyaneum、Penicillium decumbens、Eupenicillium alutaceum、Eupenicillium gracilentum、Eupenicillium stolkiae、Eupenicillium meridianum、Eupenicillium cinnamopurpureum、Eupenicillium erubescens、Eupenicillium parvum、Eupenicillium abidjanum、Eupenicillium hirayamae、Eupenicillium fractum、Eupenicillium inusitatum、Eupenicillium catenatum、Eupenicillium rubidurum、Eupenicillium pinetorum、Eupenicillium katangense、Eupenicillium euglaucum、Eupenicillium senticosum、Eupenicillium javanicum、Eupenicillium brefeldianum、Eupenicillium levitum、Eupenicillium zonatum、Eupenicillium lapidosum等が挙げられる。例えば下記に示すペニシリウム・マルチカラーmch13-2株は本発明者らが見出した新菌株であって、次の菌学的性質を有する。なお、以下の文中で本菌株と表記したものはmch13-2株を表す。
【００２０】
[1]生理的、生態的性質
1）培地における生育状態
(1)CYA培地(CZAPEK YEAST AUTOLYSATE AGAR PITT, 1973)
5℃：生育せず。
25℃：表面--色調はオレンジ色、外周は白いマージン有り。放射状の深いしわが有る。透明な浸出液有り。
裏面--はっきりしたオレンジ色。
37℃:生育せず。
(2)MEA培地(MALT EXTRACT AGAR; AFTER BLAKESLEE, 1915)
25℃:表面--色調は暗いオレンジ色、中央がけば立つように盛り上がっている。色は明るいオレンジ、または白色。外周は白いマージン有り。
裏面--暗いオレンジ色。
2)生育速度
(1)CYA培地(CZAPEK YEAST AUTOLYSATE AGAR PITT, 1973)
5℃:生育せず。
25℃:直径29〜35mm（7日目）
37℃:生育せず。
(2)MEA培地(MALT EXTRACT AGAR; AFTER BLAKESLEE, 1915)
25℃:直径24〜29.5mm（7日目）
[2]顕微鏡的所見
(1)分生子柄: 長さ--滑面、無色、110〜300μm×2〜3μm
(2)ペニシリ: 単輪生
(3)ラミ：形成せず
(4)メトレ：形成せず
(5)フィアライド：アンプル形、11〜14μm×2〜3μm
(6)分生子: 球形〜楕円形〜倒卵形、滑面--無色〜淡緑色、3〜5μm×3〜4μm
(7)菌核: 形成せず。
【００２１】
以上の菌学的性質を「ザ・ジーナス・ペニシリウム・アンド・イッツ・テレオモルフィック・ステイツ・ユーペニシリウム・アンド・タラロマイセス（The Genus PENICILLIUM and its teleomorphic states Eupenicillium and Talaromyces）」（1979）（ジョン・アイ・ピット（John I Pitt））及び「菌類図鑑」（1978）（宇田川俊一、椿啓介他）に照合したところ、本菌株はペニシリウム・スクレオチオラム(Penicillium sclerotiorum)に類似の形態を示すことがわかった。本発明者らは、微生物保存機関より取寄せたペニシリウム・スクレオチオラムからも高いマンナン分解活性を見出している。しかし、本菌株は菌核を形成しない点でペニシリウム・スクレオチオラムとは異なっていた。そこでさらに調べたところ、従来ペニシリウム・スクレオチオラムに分類されていたが、菌核を形成しないことで分類が分かれた菌株であるペニシリウム・マルチカラーであることがわかり、最終的に本発明者は本菌株をペニシリウム・マルチカラー(Penicillium multicolor)mch13-2株と命名し、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に（受託番号）FERM BP-6831として寄託した。
【００２２】
ペニシリウム・マルチカラーがβ−マンナナーゼを生産し、ましてや非常に高活性で生産することは現在までに報告されておらず、新知見である。
【００２３】
ペニシリウム・マルチカラーは、「ファンジャイ・アンド・フード・スポイレ-ジ・セカンド・エディション（FUNGI AND FOOD SPOILAGE Second edition）(1997)(ジェイ・アイ・ピット・アンド・エイ・ディー・ホッキング（J I Pitt and A D Hocking）に「マイコトキシンの生産の報告はない」との記載があり、食品加工においても安全性に問題のないことがわかった。なお、本発明によるβ−マンナナーゼは、マウスを用いた急性毒性試験および亜急性毒性試験において毒性のないことが確認されている。また、後記実施例にも示されるように、単輪生のペニシリウム属あるいは単輪生のユーペニシリウム属に属する他の種々の菌株においても同様に高い酵素活性が確認された。
【００２４】
本発明によるβ−マンナナーゼ産生菌は、その代表例である上記微生物の他に、ぺニシリウム属あるいはユーペニシリウム属に属する菌等に適した適当な栄養源含有培地（後記）で培養して前記のような理化学的性質を有するβ−マンナナーゼ酵素の産生を指標として目的の菌株をスクリーニングすることにより自然界より得ることが可能である。また、自然的変異あるいは通常の人工的変異手段（紫外線、放射線照射、薬品（亜硝酸ナトリウム、エチルメタンスルホネート、ニトロソグアニジンなど））等による変異体であっても、同様の酵素の産生能を有するものであれば本発明のβ−マンナナーゼ産生菌に包含される。
【００２５】
本発明によるβ−マンナナーゼは、上記のようなβ−マンナナーゼ産生菌により産生されるものの他、遺伝子工学的手法により製造されたもの等、前記のような理化学的性質を有する限り、その製造方法の由来は問わず任意の方法により得られる酵素を包含するものである。
【００２６】
本発明のβ−マンナナーゼを得るには、前記のようなβ−マンナナーゼ産生菌（具体的には、単輪生のペニシリウム属に属する菌株）を栄養源含有培地に接種して好気的に培養し、培養物（培養液、培養濾液もしくは培養上清）、特に好ましくは培養ろ液もしくは培養上清を採取する。
【００２７】
培養に使用される栄養源としては、従来知られている各種培養材料を用いることができるが、炭素源としては、例えばローカストビーンガム、グアーガム、コンニャクマンナン、コプラミール等が好ましい。ローカストビーンガムはイナゴ豆より抽出されたガラクトマンナンで、またグアーガムはグアプラントの種子から得られるガラクトマンナンであり、主として食品の増粘、保水、品質改良などの目的で利用されている。また、コンニャクマンナンはコンニャクから抽出したグルコマンナンであり、コプラミールはココナッツヤシよりヤシ油を絞った残渣で、ガラクトマンナンを含有する。窒素源も特に制限はないが、例えば酵母エキス、ペプトン、硫酸アンモニウム、大豆、大豆フレーク、コーンスティープリカー、ピーナッツミール、綿実ミール、カゼイン水解物、魚紛、その他一般的に培地成分として利用される成分が利用できる。さらに培地には、炭素源、窒素源の他に必要に応じて無機塩、ビタミン類、ミネラル類などを添加することができ、例えばマグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、カリウム塩、カルシウム塩などを用いることも可能である。
【００２８】
培養は、好ましくは培養温度15〜35℃、特に好ましくは25〜30℃で振盪培養もしくは通気撹拌培養で行うことができる。かかる条件で培養を行えば、培養開始後通常4日〜7日にてβ-マンナナーゼを含有する培養物を得ることができる。
【００２９】
培養物は遠心または濾過分離等で菌体を除去して培養上清（培養濾液）を採取することによりこれをそのまま本発明によるβ-マンナナーゼとするか、凍結乾燥などにより粉体にして用いることも可能である。また、培養上清液を分離、精製して培養濾液から目的の酵素をさらに粗精製もしくは精製状態で採取することも可能である。具体的には例えば、培養上清（もしくは濾液）を限外濾過膜（例えば分子量カット13000）または減圧蒸留にて濃縮した後、塩析（硫酸アンモニウムなど）して目的の酵素活性を有する画分の沈殿を得て、この沈殿を適当なクロマトグラフィー（疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、クロマトフォーカシングなど）、およびさらなる限外濾過（例えば分子量カット10000）に付し、さらにこれを電気泳動（例えばSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動）などにより粗精製あるいは精製して本発明によるβ-マンナナーゼとすることができる。これらの具体例については後記の実施例を参照されたい。
【００３０】
前述のように、本発明は上記β-マンナナーゼを含んでなる β-マンナナーゼ酵素剤、およびそのコーヒー飲料における沈殿生成防止のための使用にも関する。すなわち、本発明によるβ-マンナナーゼは、β-マンナナーゼ酵素剤として、代表的にはコーヒー飲料における沈殿生成防止剤として使用することができる。
【００３１】
本発明によるβ-マンナナーゼ酵素剤あるいはコーヒー飲料における沈殿生成防止剤は、上記のようなβ-マンナナーゼのみから構成して粉末状、顆粒状、液体状の剤形等種々の形態にすることもできるが、通常は食品用賦形剤、保存料、安定剤など必要に応じて他の添加剤を含んでなるものである。
【００３２】
食用賦形剤としては、一般的な食用賦形剤、例えば乳糖、ソルビトール、マルチトール、デキストリン、グルコース、デンプン類、多糖類、ガム類、ペクチン等が使用できる。保存料としては、例えばエタノールやパラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸ナトリウムなどが単独または併用で使用できる。その他、食品に添加できる通常使用される他の添加剤なども適宜使用できる。
【００３３】
添加剤の使用量は適宜設定できるが、具体的には例えば、液状酵素剤（例えば培養上清）の場合、静菌剤としてエタノールを１０重量％、パラオキシ安息香酸エステルを０．０１重量％添加することができる。また、本発明による-マンナナーゼの酵素剤中での配合比率は特に制限はないが、酵素剤１ｇあたり１〜100,000ユニット、望ましくは10,000〜50,000ユニットになるように配合すれば、工業的利用上から望ましい。
【００３４】
上記のようなβ−マンナナーゼ酵素剤を用いた本発明によるコーヒー飲料の沈殿生成防止法は、コーヒー抽出液に、本発明によるβ−マンナナーゼ酵素剤を作用させることを特徴とするものであり、上記のβ−マンナナーゼ酵素剤がコーヒー抽出液と接触する方法である限り特に限定されるものではないが、具体的には、例えば下記のようにして実施することができる。
【００３５】
通常この方法は、基本的に上記β−マンナナーゼ酵素剤をコーヒー抽出液に添加して適当な時間、酵素反応処理に付すことからなるが、この際、上記酵素剤に加えて他の沈殿防止剤、例えばアルカリ性ナトリウム塩またはアルカリ性カリウム塩などを添加することも可能である。
【００３６】
コーヒー抽出液は、通常焙煎豆から抽出した液、それを濃縮したエキス、あるいは一旦インスタントコーヒーに加工したものを熱水で溶かした液のいずれでも使用可能である。コーヒー飲料としては、コーヒー抽出液をそのままもしくは熱水等で希釈するものの他、乳類（全粉乳、脱脂粉乳、牛乳など）、糖類（砂糖など）等の通常コーヒー飲料に使用される添加剤を加えたものも対象となる。
【００３７】
コーヒー抽出液のβ−マンナナーゼ酵素剤による処理において、この反応温度、時間、ｐＨ、添加量は酵素の活性等により適宜設定すればよいが、本発明の酵素を用いる場合、通常、原料の焙煎豆に対して酵素剤を０．０２％〜４．０％程度になるようにコーヒー抽出液に添加して、約２０〜７０℃、ｐＨ４〜６の条件で３０分以上反応させればよいが、好ましくは、酵素剤を０．２〜２．０％添加して、常温、ｐＨ約５．５の条件で２時間以上反応させることが望ましい。本発明において、常温とは、約２０℃〜４０℃の範囲をいうが、好ましい態様では２５℃〜３５℃である。なお、本明細書で使用する％表示は、特に断りのない限り重量％を意味する。
【００３８】
他の沈殿防止剤としての上記塩（アルカリ性ナトリウム塩およびアルカリ性カリウム塩）としては、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、炭酸カリウム等があげられるが、香味の点からアルカリ性ナトリウム塩が好ましく、特に炭酸水素ナトリウムが最も好ましい。これらの塩は、最終製品（水で希釈して焙煎豆含量を一定濃度に調整したもの）に対して通常０．０３〜０．３０％、好ましくは０．０５〜０．２０％添加する。添加時期は、酵素反応より前またはこれと同時であっても良いが、酵素処理後の方が好ましい。上記酵素処理と塩処理との併用処理による方法では、特に乳類を添加したコーヒー飲料の場合において、より高い沈殿防止効果を発揮することができる。乳類を添加したコーヒー飲料の場合の沈殿防止効果については、特開平７−１８４５４６号公報も参照されたい。
【００３９】
添加した酵素は、反応後において特に除去する必要はなく、また、この酵素反応は、酵素の添加の他に、固定化酵素などによる接触反応によりコーヒー抽出液中に直接酵素が含まれないようにすることも可能である。上述のような本発明の沈殿防止方法により、常温においても多量の酵素を添加しなくても酵素反応を遂行してコーヒー飲料の沈殿防止を可能とし、これにより酵素蛋白由来の異味を生じることのない本来の風味を維持したコーヒー飲料を製造することができる。
【００４０】
【実施例】
以下に、具体的な実施例を示し、本発明をより詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例に制限されないことはいうまでもない。
【００４１】
実施例１本発明のβ−マンナナーゼを産生する微生物
β-マンナナーゼ生産菌、Penicillium multicolor mch13-2株は、群馬県の土壌より単離した。15ｍｌの試験管に分注した１０ｇ／リットルのローカスト・ビーン・ガム、１０ｇ／リットルのバクトペプトン（ディフコ社製）、１ｇ／リットルのイースト・エキストラクト（ディフコ社製）、２ｇ／リットルのリン酸２水素カリウム、及び０．５ｇ／リットルの硫酸マグネシウム・７水和物からなる液体培地に植菌して振とう培養を行い、β-マンナナーゼ活性を測定し、最も活性の高い菌株としてmch13-2株を得た。
なお、本発明のβ-マンナナーゼの活性測定は次の方法により行った。
１０ｇ／リットルのローカストビーンガム溶液3ｍｌと１５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.０）２ｍｌに被験液１ｍｌを加えて４０℃で３０分反応させた。反応液中に生じた還元糖をソモギーネルソン法にて定量した。β-マンナナーゼ活性は被験液１ｍｌが１分間に１μmoleのマンノースに相当する還元力を生じる酵素活性を１Ｕｎｉｔとして示した。
【００４２】
実施例２ Penicillium multicolor mch13-2 由来のβ−マンナナーゼの精製
１０ｇ／リットルのローカスト・ビーン・ガム、１０ｇ／リットルのバクトペプトン（ディフコ社製）、１ｇ／リットルのイースト・エキストラクト（ディフコ社製）、２ｇ／リットルのリン酸２水素カリウム、及び０．５ｇ／リットルの硫酸マグネシウム・７水和物を含む培地１リットルを、５Ｌのバッフル付き三角フラスコに入れ、１２１℃、４０分滅菌した。
Penicillium multicolor mch13-2株を、上記のようにして調製した５L三角フラスコ培地１６本に植菌し、２７℃、１６０ｒｐｍにて、４日間培養した。培養液はヌッチェにて菌体を濾過分離し、培養上清約１４Ｌを得た。なお、以後の操作は全て４℃にて行った。また、β−マンナナーゼ活性測定法は実施例1に記載の方法にて行った。
上記のようにして得られた培養上清を、限外濾過膜（分子量カット１３０００）にて濃縮し、１１８ｍｌの濃縮液を得た。次に、４０％飽和となるよう硫酸アンモニウムを添加し、１００００×ｇ、１５分間遠心分離し、活性画分である上清を１２６ｍｌ得た。これに７５％飽和となるよう硫酸アンモニウムを添加し、１００００×ｇ、１５分間遠心分離し、活性画分である沈殿を得た。
上記のように遠心分離して得られた沈澱を１．５Ｍの硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、３４ｍｌとした。同緩衝液にて平衡化した疎水クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel Phenyl-TOYOPEARL 650S １２０ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、次に３００ｍｌの１．５Ｍ〜０Ｍ硫安の線状勾配でβ−マンナナーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１００００）にて濃縮し、引き続き５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて洗浄、脱塩した。
次いで同緩衝液にて平衡化したイオン交換クロマトグラフィー（カラム：TOSOH TSK-gel DEAE-TOYOPEARL 650S １２０ｍｌ）に通した。カラムを同緩衝液にて洗浄し、引き続き３００ｍｌの０〜０．５Ｍ食塩の線状勾配でβ−マンナナーゼを溶離した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１００００）にて濃縮し、引き続き０．２Ｍの食塩を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗浄、濃縮した。
次に濃縮液をゲル濾過クロマトグラフィー（カラム：Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200pg ）にアプライし、同緩衝液にてβ−マンナナーゼを溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１００００）にて濃縮した。
次に、この濃縮液を２５ｍＭビス・トリス緩衝液（ｐＨ４．８５）にて平衡化したクロマトフォーカシング（カラム：Pharmacia Mono P HR5/20 ）にアプライし、１０％Polybuffer 74 （Pharmacia 製、塩酸にてｐＨ３．５に調製したもの）で目的のβ−マンナナーゼを溶出した。活性画分を限外濾過膜（分子量カット１００００）にて濃縮した。
最終的にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、及び等電点電気泳動にて単一バンドを示す精製酵素を得た。
各精製ステップにおける総酵素活性、総蛋白量、比活性を以下の第１表に示す。
なお、蛋白量は、BSA（牛血清アルブミン）を標準物質として、フォーリン・ローリー法にて測定した。

また、最終的に精製された酵素について、実施例１の活性測定法に従って３０℃での活性を測定し、フォーリン・ローリー法での同サンプルの蛋白質量にて比活性を求めたところ、１８０Ｕ／ｍｇ−proteinであった。
【００４３】
比較例１その他のマンナナ - ゼの蛋白重量当りの比活性の測定
Aspergillus niger由来のマンナナ-ゼの比活性を測定した。活性測定方法は実施例１に従い、蛋白質量の測定は実施例２と同様にフォーリン・ローリー法によるものに加えて、重量法にても行なった。重量法は、精製酵素３００μｌを透析膜（三光純薬社製 10000カット）に入れ、ＭＱ水４００ｍｌ中で6時間２回、さらに１８時間透析を行い、回収後、凍結乾燥し重量を測定した。結果を第２表に示す。

精製酵素の蛋白質重量当りの比活性は４０℃において２４５Ｕ／ｍｇ蛋白（ローリー法）、３４１．１Ｕ／ｍｇ蛋白質（重量法）であり、蛋白質の定量法によって値が異なるが、市販のアスペルギルス・ニガー由来酵素に比べて１．９〜１０.８倍であり、いずれの測定方法においてもペニシリウム・マルチカラーｍｃｈ１３−２株は非常に蛋白質当りの比活性が高いことがわかった。測定方法によって値が異なる原因としては、ローリー法は蛋白質中のチロシン、トリプトファン、システインと反応して青色を示すが、この発色反応は試料中に含まれる上記アミノ酸量の違いにより発色の度合いが異なることが考えられる。
【００４４】
実施例３本発明のβ - マンナナーゼの諸性質の検討
実施例２で得られた精製酵素の酵素学的諸性質を測定した。
なお、酵素活性は上記実施例１に記載の方法にて測定した。
（１）作用
β−１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合しているローカストビーンガム０．２％溶液に、本発明の酵素を２Ｕ／ｍｌの濃度になるように添加し、経時的にサンプルをとり、反応生成物を液体高速クロマトグラフィー（カラムＢｉｏ−ｒａｄ社Ａｍｉｎｅｘ４２Ａ）にて分析した。その結果、反応開始後６０分後には高分子のローカストビーンガムは消失し、主として中〜低分子の酵素分解物が観察されたが、反応開始後５時間後にはそれらがさらに低分子化していた。反応初期に高分子がすみやかに消失し、中〜低分子の酵素分解物が観察されたことで、本酵素がβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合にエンド型で非特異的に作用し、マンノオリゴ糖、マンノースを生成したと考えられる。
（２）基質特異性
ローカストビーンガム（ガラクトマンナン）、グルコマンナン（コンニャク由来）、アラビノキシラン（大麦由来）、キシラン、トラガントガム、セルロース、カルボキシメチルセルロースの各０．２％溶液に本酵素２Ｕ／ｍｌになるように混合し、４５℃にて６６時間反応させた。その後、反応を１００℃にて停止後、反応生成物を液体高速クロマトグラフィー（カラムＢｉｏ−ｒａｄ社Ａｍｉｎｅｘ４２Ａ）にて分析した。その結果、ローカストビーンガム、グルコマンナンでは低分子化が観察されたが、それ以外のアラビノキシラン、キシラン、トラガントガム、セルロース、カルボキシメチルセルロースでは変化は認められなかった。
（３）分子量
分子量の測定はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により行った。マーカータンパク質として200,000、116,300、97,400、66,300、55,400、36,500、31,000、21,500、14,400を用いた。その結果、本酵素は糖鎖がついていると考えられ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のバンドはスメアになった。分子量範囲は42,000〜45,000であり、メインバンドの分子量は43,000であった。
（４）等電点
ファーマライトｐＨ2.5〜5.0（ファルマシア社製）３に対してファーマライトｐＨ4.5〜5.4（ファルマシア社製）を１加えた溶液を作成した。さらに、その溶液１に対して１５の割合で純水を加えた液にて膨潤させたアガロースゲルを用いて、等電点電気泳動を行った。その結果、等電点は3.2であった。
（５）安定性
得られた精製酵素の各温度、各ｐＨにおける安定性をそれぞれ図１、図２に示す。測定は温度の安定性を調べるには50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0を、ｐＨの安定性を調べるにはｐＨ2.2〜8.0の間はマッケルヴァイン緩衝液を、ｐＨ8.0〜10.0の間は50mMトリス塩酸系緩衝液を、ｐＨ10.0〜11.0の間は50mM炭酸水素ナトリウム系緩衝液をそれぞれ用いた。温度安定性は、各温度で１時間処理した後の活性を測定し、３０℃で１時間処理を行った時の残存活性を１００％として比較表記した。
本酵素は50℃で1時間の処理で安定（１００％の残存活性）であり、６０℃１時間の処理で７０％の残存活性であった。またｐＨ3.0〜10.0の20℃で20時間処理で安定であった。
（６）反応性
得られた精製酵素の各温度、各ｐＨにおける反応性をそれぞれ図３、図４に示す。測定は温度の反応性を調べるには50mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0を、ｐＨの反応性を調べるにはマッケルヴァイン緩衝液をそれぞれ用いた。
本酵素は70℃付近に反応最適温度、ｐＨ5.5付近に反応最適ｐＨを有する。
（７）各種活性化剤、阻害剤の影響
実施例１のβ-マンナナーゼ活性測定法において、以下の第3表に示す物質を基質と共に添加し、それぞれの場合の活性測定を行い、活性化または阻害の有無を調べた。その結果、マンガンイオン、N-ブロモコハク酸イミドにより阻害を受けることがわかった。

【００４５】
実施例４単輪生の Penicillium 属微生物由来の低温での活性
１０ｇ／リットルのローカスト・ビーン・ガム、１０ｇ／リットルのバクトペプトン（ディフコ社製）、１ｇ／リットルのイースト・エキストラクト（ディフコ社製）、２ｇ／リットルのリン酸２水素カリウム、及び０．５ｇ／リットルの硫酸マグネシウム・７水和物を含む培地２mlを、１５ｍＬの試験管に入れ、１２１℃、２０分滅菌した。
単輪生のPenicillium属に属する菌株29株を、上記の試験管に植菌し、２７℃、２５０ｒｐｍにて、５日間振盪培養した。培養液は菌体を遠心分離し、培養上清約１mlを得た。その上清を粗酵素液として40℃における酵素活性を、上記実施例１に記載の方法にて測定した。結果を第４表に示す。表中のペニシリウム属の分類は、「ザ・ジーナス・ペニシリウム・アンド・イッツ・テレオモルフィック・ステイツ・ユーペニシリウム・アンド・タラロマイセス（The Genus PENICILLIUNM and its teleomorphic states Eupenicillium and Talaromyces）」(1979)（ジョン・アイ・ビット（John I Pitt）に従った。
【表１】

Pittらによれば、ペニシリウム属とペニシリウム属の完全世代であるユーペニシリウム属、タラロマイセス属のうち、ぺニシリの形状が単輪生を示すのはペニシリウム属アスペルギロイデス亜属とユーペニシリウム属である。第４表に示すように、単輪生のペニシリウム属のうち、ほとんどの菌株にマンナナーゼの生産が認められ、その中でもとりわけペニシリウム属のグラブラシリーズ、ユーペニシリウム属のアルタセアグループ、フラクタシリーズ、ジャパニカシリーズに顕著に反応性の高い菌株が認められた。特に、ペニシリウム・マルチカラーIFO7817、IFO5725、ペニシリウム・スクレオチオラムIFO6105は、高い活性を示した。また、本発明者が天然より分離したカビの一例としてmch33株、mch47株、mch51株は最終的に同定はしていないものの、顕微鏡での形態観察から、ペニシリウム属に属し、それらのぺニシリは単輪生のものばかりであったことを観察した。
単輪生のペニシリウム属のうち、ペニシリウム・マルチカラーIFO7817株、ユーペニシリウムジャパニカムIFO31369株については30℃〜80℃での各温度での活性を調べた。結果を図5、図６に示す。
また単輪生のPenicillium属であるペニシリウム・マルチカラーmch13−2株、IFO7817株、ペニシリウム・スクレオチオラムＩＦＯ6105株、ユーペニシリウムジャパニカムIFO31369株、ユーペニシリウム・ルビドラムIFO9703株が生産するβ-マンナナーゼは、40℃での活性を基準とした時に、３０℃でも活性がそれぞれ８４．７％、７６．８％、９４．２％、８１．１％、７７．２％維持されていた。単輪生のPenicillium属由来酵素は４０℃での活性が高く、また３０℃活性／４０℃活性の比率が高かった。一方で、比較としてアスペルギルス・ニガー由来の酵素であるセルロシンＧＭ５はその製品シートによると、３０℃活性／４０℃活性が５６％と低いものであった。従って、本発明の酵素を用いて常温での酵素処理を行う場合、添加量が少なくてすむという有用性が明確となった。
【００４６】
比較例２複輪生の Penicillium 属微生物由来酵素の低温での活性
実施例４に記載の方法により、複輪生のPenicillium 属２４株の活性を測定した。結果を第５表に示す。
【表２】

複輪生のPenicillium 属に属する微生物が生産する酵素の４０℃での活性は、単輪生のPenicillium 属に属する微生物が生産する酵素の活性に比べて低く、従って、常温でも酵素添加量を少なくできないことがわかった。
【００４７】
実施例５酵素剤の配合例
液状酵素剤：
実施例１で得られた培養上清液に、保存剤としてエタノールを１０重量％、パラオキシ安息香酸エステルを０．０１重量％添加して酵素剤とした。
活性は安定であり、汚染微生物の増加は抑制された。
【００４８】
【発明の効果】
上述してきたように、本発明によれば、より常温に近い状態でもマンナン分解活性が高く、かつ高い比活性を有するβ-マンナナーゼ酵素、その製造法および用途を提供することができる。従って本発明は、例えばコーヒー飲料において、常温下でも多量の酵素を添加しなくても酵素反応を遂行して沈殿生成を防止することを可能とし、これにより酵素蛋白由来の異味を生じることなく、本来のコーヒーの風味を維持したコーヒー飲料の製造を可能とするものである。
従来コーヒー飲料の沈殿防止に用いられていたマンナン分解酵素はアスペルギルス・ニガー由来であり、しかもその酵素の至適温度が７５〜８０℃の高温であって常温における作用は低く、かつ比活性が低いものであったことから、特に、本発明で提供される単輪生ぺニシリウム属菌および単輪生ユーペニシリウム属菌由来のマンナナーゼ酵素が、このように常温においても実用的に高い活性および比活性を有していたことは当業者にとって意外なことであったと解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるβ−マンナナーゼ酵素の温度安定性を示すグラフ。
【図２】本発明によるβ−マンナナーゼ酵素のｐＨ安定性を示すグラフ。
【図３】本発明によるβ−マンナナーゼ酵素の温度反応性を示すグラフ。
【図４】本発明によるβ−マンナナーゼ酵素のｐＨ反応性を示すグラフ。
【図５】ペニシリウム・マルチカラーＩＦＯ７８１７の温度反応性を示すグラフ。
【図６】ユーペニシリウム・ジャパニカムＩＦＯ３１３６９の温度反応性を示すグラフ。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel β-mannanase, its production and use, and related microorganisms. More specifically, the present invention relates to a novel β-mannanase and its activity that are active even at lower temperatures than conventional ones. Production method, β-mannanase enzyme agent (typically, precipitation inhibitor in coffee beverage), use of β-mannanase for preventing precipitation in coffee beverage and method for preventing precipitation, and ability to produce the enzyme The present invention relates to a β-mannanase-producing bacterium having
[0002]
[Prior art]
In recent years, coffee beverages have increased in circulation as canned products. The coffee extract tends to generate turbidity and precipitation during storage, and development of a production method for suppressing these is desired. Furthermore, in recent years, precipitation has occurred due to an increase in the amount of raw coffee beans used to provide full-fledged flavors, a prolonged market residence period due to expansion of sales areas, and heating with vending machines and hot-water cans. There is a problem of significant reduction. The precipitation of the coffee extract is caused by galactomannan derived from coffee beans, and a method for producing a beverage that suppresses the occurrence of precipitation using mannan-degrading enzyme is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-184546 and precipitation using fibrin-degrading enzyme The prevention method is disclosed in Japanese Patent Publication No. 47-19736, and the turbidity prevention method using an enzyme is disclosed in JP-A-4-45745.
[0003]
As for the mannan degrading enzyme, an enzyme derived from the genus Bacillus is disclosed in JP-B-63-18474 and JP-B-3-65754, an enzyme derived from Penicillium perprogenum is disclosed in JP-A-63-209586, Clostridium tertium, lactate An enzyme derived from the genus Bacillus is disclosed in JP-A-5-176767, and Rhizopus nieveus is disclosed in JP-B-49-12710. Further reports include Trichoderma reesei (Appl. Microbiol. (1993 39: 58-62), Streptomyces (Agric. Biol. Chem., 48 (9), 2189-2195, 1985), Enterococcus caseiflavus. (J. Ferment. Bioeng., Vol.76 (1), 14-18, 1993), Vibrio (Appl. And Environ. Microbiol. Nov., 1990, 3505-36510), Aeromonas (J. Fac. Arg) , Kyushu Univ., 27 (3.4), 89-98 (1983).
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the above-mentioned method, for example, the commercially available mannan degrading enzyme Aspergillus niger-derived enzyme cellulosin GM5 (Hankyu Kyoei Bussan Co., Ltd.), Gamanase (Novo Nordisk Bioindustry Co., Ltd.), and reported in papers Enzymes derived from Trichoderma reesei, β-mannanase derived from Penicillium perprogenum, etc., have an optimum temperature of about 70 to 80 ° C. and have low enzyme reactivity at room temperature. Furthermore, since the specific activity per protein weight is low, it was necessary to increase the treatment temperature (40 to 50 ° C.) in order to industrially eliminate the precipitation of the coffee extract. As a result, the process is complicated, and the original flavor and quality of coffee are deteriorated. In order to sufficiently act at a room temperature of about 20-30 ° C., it is conceivable to increase the amount of enzyme added. In that case, however, the above-mentioned enzyme has low specific activity, so a large amount of enzyme must be added. There is a problem of producing an off-flavor derived from protein, and it is desired to develop an enzyme with higher enzyme reactivity at room temperature, or an enzyme with higher specific activity that is effective with a small addition amount.
[0005]
Other currently reported microorganism-derived β-mannanases include the genus Bacillus, Clostridium tertium, Lactobacillus, Streptomyces, Enterococcus caseiflavus, Rhizopus nieveus, Vibrio, Aeromonas Although the enzymes derived from the genus Bacillus and Streptomyces are neutral to alkaline in pH, they are not suitable for the purpose of coffee treatment. Clostridium tertium, Lactobacillus genus, Enterococcus casei flavus are fine. Since it is an anaerobic bacterium, it is necessary to replace the gas phase part of the culture apparatus with nitrogen, and the culture method becomes complicated, making it difficult to use industrially. According to Japanese Patent Publication No. 49-12710, the Rhizopus nieveus-derived enzyme has a first step of buffering and separating an ion exchanger such as SE-Sephadex at a low ionic strength and a high ionic strength as a method for collecting the enzyme. A second step of buffering and separation was necessary, and this left practical difficulties. The Vibrio genus has many food-contaminating bacteria, and it is difficult to use in the food industry. Aeromonas enzymes have low temperature stability and have a problem in storage stability when used industrially.
[0006]
The present invention provides an enzyme having a high mannan decomposing activity and a high specific activity even in a state closer to room temperature, a method for producing the enzyme, and a use thereof (for example, a precipitation prevention method effective in a small amount of addition in coffee production). It is intended.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In this situation, the present inventors searched for a microorganism that produces β-mannanase having an activity more suitable for preventing coffee precipitation in a strain obtained from a microorganism storage organization. As a result, the present inventors found that it was higher from microorganisms belonging to the genus Penicillium. Many strains with mannan degrading activity were found. Monocycle is a kind of morphological characteristic of Penicillium that is important for the identification of Penicillium genus, and the state of Penicillium that produces phialide directly from the conidia and has no branching such as metre and lami. Represents. On the other hand, there are also two-wheelers and multi-wheelers who have branches in the conidia pattern.
[0008]
As a result of further searching from the natural world, the present inventor found a plurality of high-degradation active strains from the soil of Gunma Prefecture and isolated or identified or observed them. Among the separated microorganisms, the present inventors showed activity suitable for preventing coffee precipitation. All of them have been found to be microorganisms belonging to the genus Penicillium. This microorganism (1) produces a large amount of β-mannanase with high degradation activity against mannan. (2) When it is applied to coffee extract, it is surprisingly effective in preventing precipitation even at room temperature. (3) When this enzyme is purified, it has a very high specific activity, so that the amount of enzyme added may be small. (4) This bacteria is also safe and safe for use in the food industry. The present inventors have found that there is no problem in sex, and have completed the present invention based on this finding.
[0009]
Therefore, the present invention relates to a novel β-mannanase, a production method and use thereof, more specifically, a β-mannanase enzyme agent (typically, for example, acting on galactomannan to eliminate precipitation in a coffee beverage. And a method for preventing precipitation in a coffee beverage and a method for preventing precipitation, and a β-mannanase-producing bacterium having the ability to produce the enzyme.
[0010]
That is, the β-mannanase according to the present invention is characterized by having the following physicochemical properties, and is typically produced by a microorganism belonging to the genus Penicillium belonging to the unicycle or the genus Eupenicillium singular. can do.
(1) Action
Non-specific hydrolysis of the β-1,4-D-mannopyranoside bond of β-mannan produces mannose and mannooligosaccharides.
(2) Optimum pH
The optimum pH is about 5.0 to 6.0.
(3) Optimum temperature range
The optimal temperature range of action is at least about 20-70 ° C.
(Here, at least about 20 to 70 ° C. means that about 20 to 70 ° C. is clearly in the proper temperature range, and does not exclude other ranges.)
(4) 30 ° C. activity / 40 ° C. activity is about 80% or more.
[0011]
In a preferred embodiment, this β-mannanase is characterized by having the following physicochemical properties, and can be typically produced by the aforementioned microorganisms, particularly microorganisms belonging to Penicillium multicolor.
(1) Action
Non-specific hydrolysis of the β-1,4-D-mannopyranoside bond of β-mannan produces mannose and mannooligosaccharides.
(2) Optimum pH
The optimum pH is about 5.0 to 6.0.
(3) Optimum temperature range
The optimal temperature range of action is at least about 20-70 ° C.
(4) 30 ° C. activity / 40 ° C. activity is about 80% or more.
(5) Substrate specificity
It specifically acts on mannan, galactomannan and glucomannan, and does not act on arabinoxylan, xylan, tragacanth gum, cellulose and carboxymethylcellulose.
(6) Optimal temperature
The optimum temperature is about 60-70 ° C
(7) Stable pH range
The stable pH range is about 3.0 to 10.0.
(8) Temperature stability
Temperature stability (at pH 5.0) is about 100% residual activity after treatment at 50 ° C for 1 hour, assuming that the residual activity when treated at 30 ° C for 1 hour is 100%. Approximately 70% residual activity after 1 hour treatment at ° C.
(9) Molecular weight
The molecular weight is about 42,000-45,000 (SDS-PAGE method).
[0012]
The method for producing β-mannanase according to the present invention is characterized by culturing the above-mentioned β-mannanase-producing bacterium and collecting the enzyme or the containing composition from the culture.
[0013]
Furthermore, the β-mannanase enzyme agent (typically, an agent for preventing precipitation of coffee beverages) according to the present invention comprises the β-mannanase.
[0014]
The present invention is also the use of the β-mannanase for preventing precipitation in coffee beverages.
[0015]
The precipitation prevention method according to the present invention is characterized in that the above-mentioned β-mannanase enzyme agent is allowed to act on a coffee extract (preferably at a low temperature or a normal temperature).
[0016]
The microorganism according to the present invention is a microorganism having an ability to produce the above-mentioned β-mannanase.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, β-mannanase means that the enzyme according to the present invention includes any purified product, crude product or non-purified product. That is, this enzyme used the means normally used for culturing the above-mentioned β-mannanase producing bacterium and obtaining the protein from the active fraction of the culture (culture solution, culture filtrate), for example, ammonium sulfate as described later. A crude product can be obtained by salting out, concentration by ultrafiltration, or concentration by distillation under reduced pressure, and the product is further purified by appropriate chromatography, ultrafiltration, electrophoresis, etc. However, in the present invention, any of these stages is included as long as it contains β-mannanase having the above-mentioned properties. Here, an unpurified product or a crude product such as a culture filtrate is also referred to as a β-mannanase-containing composition.
[0018]
The β-mannanase of the present invention is obtained by culturing a β-mannanase-producing bacterium having the ability to produce β-mannanase as described above in an appropriate nutrient source-containing medium (described later), and obtaining β-mannanase from the culture. Can be manufactured. The β-mannanase-producing bacterium is preferably a microorganism belonging to the genus Penicillium belonging to the unicycle or the genus Eupenicillium, specifically, for example, a microorganism belonging to the genus Aspergillus subgenus, typically, Penicillium multicolor (especially Penicillium multicolor mch13-2).
[0019]
Examples of β-mannanase-producing bacteria belonging to the genus Penicillium and the genus Eupenicillium include Penicillium multicolor, Penicillium sclerotiorum, Penicillium purprescens, Penicillium spinulosum, Penicillium thomii. , Penicillium implicatum, Penicillium adametzioides, Penicillium quercetorum, Penicillium montanense, Penicillium chermesinum, Penicillium restrictum, Penicillium roseopurpureum, Penicillium vinaceum, Penicillium capsulatum, Penicillium resedanum, Penicillium citreonigrum, Penicillium sublateritium, Penicillium cyaneum, Penicillium decumbens, Eupenicillium alutaceum, Eupenicillium gracilentum, Eupenicillium stolkiae, Eupenicillium meridianum, Eupenicillium cinnamopurpureum, Eupenicillium erubescens, Eupenicillium parvum, Eupenicillium abidjanum, Eupenicillium hirayamae, Eupenicillium fractum, Eupenicillium inu sitatum, Eupenicillium catenatum, Eupenicillium rubidurum, Eupenicillium pinetorum, Eupenicillium katangense, Eupenicillium euglaucum, Eupenicillium senticosum, Eupenicillium javanicum, Eupenicillium brefeldianum, Eupenicillium levitum, Eupenicillium lium, Elapenicilsum atum For example, the following Penicillium multicolor mch13-2 strain is a new strain found by the present inventors and has the following mycological properties. In addition, what was described as this strain in the following text represents the mch13-2 strain.
[0020]
[1] Physiological and ecological properties
1) Growth state in the medium
(1) CYA medium (CZAPEK YEAST AUTOLYSATE AGAR PITT, 1973)
5 ° C .: Not grown.
25 ° C: Surface--color is orange and the outer periphery is white. There are radial deep wrinkles. There is a transparent leachate.
Back side--clear orange.
37 ° C: Not growing.
(2) MEA medium (MALT EXTRACT AGAR; AFTER BLAKESLEE, 1915)
25 ℃: Surface--The color tone is dark orange, and it rises so that the center will stand out. The color is bright orange or white. There is a white margin on the periphery.
Back--dark orange.
2) Growth rate
(1) CYA medium (CZAPEK YEAST AUTOLYSATE AGAR PITT, 1973)
5 ° C: not growing.
25 ° C: Diameter 29-35mm (7th day)
37 ° C: Not growing.
(2) MEA medium (MALT EXTRACT AGAR; AFTER BLAKESLEE, 1915)
25 ℃: Diameter 24 ~ 29.5mm (7th day)
[2] Microscopic findings
(1) Conidial pattern: length--smooth, colorless, 110-300μm × 2-3μm
(2) Penisiri: Monocycle students
(3) Lami: Not formed
(4) Metre: Not formed
(5) Fear ride: Ampoule type, 11-14μm × 2-3μm
(6) Conidia: Spherical to oval to inverted egg shape, smooth surface-colorless to light green, 3 to 5 μm x 3 to 4 μm
(7) Mycorrhiza: Not formed.
[0021]
The bacteriological properties described above are “The Genus PENICILLIUM and its teleomorphic states Eupenicillium and Talaromyces” (1979) (John I.)・ It was found that the strain showed similar morphology to Penicillium sclerotiorum when compared to Pitt (John I Pitt) and “Mycological Encyclopedia” (1978) (Shunichi Udagawa, Keisuke Tsuji et al.). The present inventors have also found high mannan degrading activity from Penicillium scleothiolam obtained from a microorganism preservation organization. However, this strain was different from Penicillium scleothiolam in that it did not form sclerotia. Therefore, further investigation revealed that it was Penicillium multicolor, a strain that was previously classified as Penicillium scleothiolam, but separated by not forming a mycorrhizal nucleus. Was named Penicillium multicolor mch13-2 strain and deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology (METI) as FERM BP-6831.
[0022]
Penicillium multicolor produces β-mannanase, and it is a new finding that has not been reported so far, and is very active.
[0023]
Penicillium Multicolor is "FUNGI AND FOOD SPOILAGE Second edition" (1997) (JI Pitt and ADI Hocking (JI Pitt and AD Hocking states that there is no report of mycotoxin production, and it was found that there is no safety problem in food processing.The β-mannanase according to the present invention is an acute toxicity using mice. In the test and subacute toxicity test, it has been confirmed that there is no toxicity, and as shown in the examples below, various other strains belonging to the genus Penicillium belonging to the unicycle or the genus Eupenicillium unicyclic. Similarly, a high enzyme activity was confirmed.
[0024]
The β-mannanase-producing bacterium according to the present invention is cultured in an appropriate nutrient source-containing medium (described later) suitable for a bacterium belonging to the genus Penicillium or Eupenicillium in addition to the above-mentioned microorganisms which are representative examples thereof. It can be obtained from the natural world by screening a target strain using the production of β-mannanase enzyme having such physicochemical properties as an index. Moreover, even if it is a mutant by natural mutation or normal artificial mutation means (ultraviolet rays, irradiation, chemicals (sodium nitrite, ethylmethanesulfonate, nitrosoguanidine, etc.)), it has the same ability to produce enzymes. Any of these may be included in the β-mannanase producing bacterium of the present invention.
[0025]
As long as the β-mannanase according to the present invention has the physicochemical properties as described above, such as those produced by the above-described β-mannanase-producing bacteria, those produced by genetic engineering techniques, Regardless of origin, it includes enzymes obtained by any method.
[0026]
In order to obtain the β-mannanase of the present invention, a β-mannanase-producing bacterium as described above (specifically, a strain belonging to the genus Penicillium belonging to the unicycle) is inoculated into a nutrient source-containing medium and cultured aerobically. The culture (culture solution, culture filtrate or culture supernatant), particularly preferably the culture filtrate or culture supernatant is collected.
[0027]
Various nutrient materials known in the art can be used as the nutrient source used for the culture, and as the carbon source, for example, locust bean gum, guar gum, konjac mannan, copra meal and the like are preferable. Locust bean gum is a galactomannan extracted from locust beans, and guar gum is a galactomannan obtained from seeds of gua plant, and is mainly used for the purpose of thickening foods, retaining water, improving quality and the like. Konjac mannan is a glucomannan extracted from konjac, and copra meal is a residue obtained by squeezing palm oil from coconut palm and contains galactomannan. Nitrogen source is not particularly limited, but for example, yeast extract, peptone, ammonium sulfate, soybean, soybean flake, corn steep liquor, peanut meal, cottonseed meal, casein hydrolyzate, fish meal, and other generally used as a medium component Ingredients available. Furthermore, in addition to the carbon source and nitrogen source, inorganic salts, vitamins, minerals, and the like can be added to the medium as needed. For example, magnesium salts, sodium salts, phosphate salts, potassium salts, calcium salts, etc. It is also possible to use.
[0028]
The culture can be performed by shaking culture or aeration-agitation culture, preferably at a culture temperature of 15 to 35 ° C, particularly preferably 25 to 30 ° C. By culturing under such conditions, a culture containing β-mannanase can be obtained usually 4 to 7 days after the start of the culture.
[0029]
For the culture, remove the cells by centrifugation or filtration separation and collect the culture supernatant (culture filtrate), and use it as it is as β-mannanase according to the present invention or use it as a powder by freeze-drying etc. Is also possible. It is also possible to separate and purify the culture supernatant and collect the target enzyme from the culture filtrate in a crudely purified or purified state. Specifically, for example, the culture supernatant (or filtrate) is concentrated by ultrafiltration membrane (for example, molecular weight cut 13000) or vacuum distillation, and then salted out (such as ammonium sulfate) to obtain a fraction having the desired enzyme activity. A precipitate is obtained, which is subjected to appropriate chromatography (hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, chromatofocusing, etc.) and further ultrafiltration (eg molecular weight cut 10000), Can be roughly purified or purified by electrophoresis (for example, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing) to obtain the β-mannanase according to the present invention. See the examples below for specific examples.
[0030]
As described above, the present invention also relates to a β-mannanase enzyme agent comprising the above β-mannanase, and its use for preventing precipitation in a coffee beverage. That is, the β-mannanase according to the present invention can be used as a β-mannanase enzyme agent, typically as a precipitation inhibitor for coffee beverages.
[0031]
The β-mannanase enzyme agent according to the present invention or the precipitation-preventing agent in coffee beverages can be composed of only β-mannanase as described above and can be in various forms such as powder, granule, and liquid. However, it usually comprises other additives such as food excipients, preservatives and stabilizers as required.
[0032]
As the edible excipient, general edible excipients such as lactose, sorbitol, maltitol, dextrin, glucose, starches, polysaccharides, gums, pectin and the like can be used. As the preservative, for example, ethanol, paraoxybenzoic acid ester, sodium sulfite and the like can be used alone or in combination. In addition, other commonly used additives that can be added to foods can be used as appropriate.
[0033]
The amount of additive used can be appropriately set. Specifically, for example, in the case of a liquid enzyme agent (eg, culture supernatant), 10% by weight of ethanol and 0.01% by weight of paraoxybenzoate are added as a bacteriostatic agent. can do. The blending ratio of mannanase according to the present invention in the enzyme agent is not particularly limited, but if it is blended so as to be 1 to 100,000 units, preferably 10,000 to 50,000 units per gram of the enzyme agent, it is industrially useful. desirable.
[0034]
The method for preventing precipitation of a coffee beverage according to the present invention using the β-mannanase enzyme agent as described above is characterized in that the β-mannanase enzyme agent according to the present invention is allowed to act on a coffee extract. The β-mannanase enzyme agent is not particularly limited as long as it is a method of contacting with the coffee extract, and specifically, for example, the following can be carried out.
[0035]
Usually, this method basically consists of adding the β-mannanase enzyme agent to the coffee extract and subjecting it to an enzyme reaction treatment for an appropriate time. In this case, in addition to the enzyme agent, another precipitation preventing agent is used. For example, alkaline sodium salt or alkaline potassium salt can be added.
[0036]
As the coffee extract, any one of a liquid extracted from roasted beans, an extract obtained by concentrating it, or a liquid once processed into instant coffee with hot water can be used. As coffee beverages, in addition to those obtained by diluting the coffee extract as it is or with hot water, additives such as milk (whole powdered milk, skimmed milk powder, milk, etc.), sugars (sugar etc.) and the like that are usually used in coffee beverages The added ones are also covered.
[0037]
In the treatment of the coffee extract with the β-mannanase enzyme agent, the reaction temperature, time, pH, and addition amount may be appropriately set depending on the activity of the enzyme. However, when the enzyme of the present invention is used, usually the raw material is roasted. The enzyme agent may be added to the coffee extract so that it becomes about 0.02% to 4.0% with respect to the beans, and the reaction is performed at about 20 to 70 ° C. and pH 4 to 6 for 30 minutes or more. Preferably, the enzyme agent is added in an amount of 0.2 to 2.0%, and the reaction is performed for 2 hours or more under conditions of normal temperature and pH of about 5.5. In the present invention, normal temperature refers to a range of about 20 ° C. to 40 ° C., but in a preferred embodiment it is 25 ° C. to 35 ° C. In addition, the% display used in this specification means weight% unless there is particular notice.
[0038]
Examples of the above-mentioned salts (alkaline sodium salt and alkaline potassium salt) as precipitation inhibitors include sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, disodium hydrogen phosphate, potassium carbonate and the like. Particularly preferred is sodium bicarbonate. These salts are usually added in an amount of 0.03 to 0.30%, preferably 0.05 to 0.20%, based on the final product (diluted with water to adjust the roasted bean content to a certain concentration). . The timing of addition may be before or simultaneously with the enzyme reaction, but is preferably after the enzyme treatment. In the method by the combined treatment of the enzyme treatment and the salt treatment, a higher precipitation preventing effect can be exhibited particularly in the case of a coffee beverage to which milk is added. See also JP-A-7-184546 for the effect of preventing precipitation in the case of a coffee beverage to which milk is added.
[0039]
It is not necessary to remove the added enzyme after the reaction. In addition to the addition of the enzyme, the enzyme reaction is not directly contained in the coffee extract by contact reaction with an immobilized enzyme or the like. It is also possible to do. By the precipitation prevention method of the present invention as described above, it is possible to prevent the precipitation of coffee beverages by performing an enzyme reaction without adding a large amount of enzyme even at room temperature, thereby producing an off-flavor derived from enzyme protein. It is possible to produce a coffee beverage that maintains its original flavor.
[0040]
【Example】
Hereinafter, specific examples will be shown and the present invention will be described in more detail. Needless to say, the present invention is not limited to these examples.
[0041]
Example 1 Microorganism producing the β-mannanase of the present invention
A β-mannanase-producing bacterium, Penicillium multicolor mch13-2 strain, was isolated from soil in Gunma Prefecture. 10 g / liter locust bean gum dispensed into a 15 ml test tube, 10 g / liter bactopeptone (Difco), 1 g / liter yeast extract (Difco), 2 g / liter phosphoric acid Inoculate in a liquid medium consisting of potassium dihydrogen and 0.5 g / liter magnesium sulfate heptahydrate, culture with shaking, measure β-mannanase activity, mch13-2 as the most active strain Got the stock.
The activity of β-mannanase of the present invention was measured by the following method.
1 ml of the test solution was added to 3 ml of 10 g / liter locust bean gum solution and 2 ml of 150 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) and reacted at 40 ° C. for 30 minutes. The reducing sugar produced in the reaction solution was quantified by the Somogy Nelson method. The β-mannanase activity was expressed as 1 Unit, where 1 ml of the test solution produces a reducing power corresponding to 1 μmole of mannose per minute.
[0042]
Example 2 Penicillium multicolor mch13-2 Purification of β-mannanase from
10 g / liter locust bean gum, 10 g / liter bactopeptone (Difco), 1 g / liter yeast extract (Difco), 2 g / liter potassium dihydrogen phosphate, and 0.5 g 1 liter of medium containing / liter of magnesium sulfate heptahydrate was placed in a 5 L baffled Erlenmeyer flask and sterilized at 121 ° C. for 40 minutes.
The Penicillium multicolor mch13-2 strain was inoculated into 16 5 L Erlenmeyer flask media prepared as described above, and cultured at 27 ° C. and 160 rpm for 4 days. The culture broth was separated by filtration with Nutsche to obtain about 14 L of culture supernatant. All subsequent operations were performed at 4 ° C. The β-mannanase activity was measured by the method described in Example 1.
The culture supernatant obtained as described above was concentrated with an ultrafiltration membrane (molecular weight cut 13000) to obtain 118 ml of a concentrated solution. Next, ammonium sulfate was added so as to be 40% saturated, and centrifuged at 10000 × g for 15 minutes to obtain 126 ml of the supernatant as the active fraction. Ammonium sulfate was added thereto so as to be 75% saturated, and centrifuged at 10,000 × g for 15 minutes to obtain a precipitate which was an active fraction.
The precipitate obtained by centrifugation as described above was dissolved in 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 1.5 M ammonium sulfate to make 34 ml. It was passed through hydrophobic chromatography equilibrated with the same buffer (column: TOSOH TSK-gel Phenyl-TOYOPEARL 650S 120 ml). The column was washed with the same buffer and then β-mannanase was eluted with a linear gradient of 300 ml of 1.5 M to 0 M ammonium sulfate. The active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane (molecular weight cut 10,000), then washed with 50 mM Tris / hydrochloric acid buffer (pH 8.0) and desalted.
Subsequently, it was passed through ion exchange chromatography (column: TOSOH TSK-gel DEAE-TOYOPEARL 650S 120 ml) equilibrated with the same buffer. The column was washed with the same buffer followed by elution of β-mannanase with a linear gradient of 300 ml of 0-0.5 M saline. The active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane (molecular weight cut 10,000), then washed and concentrated with a 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.2 M sodium chloride.
Next, the concentrated solution was applied to gel filtration chromatography (column: Pharmacia HiLoad 16/60 Superdex 200 pg), and β-mannanase was eluted with the same buffer. The active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane (molecular weight cut 10,000).
Next, this concentrated solution was applied to chromatofocusing (column: Pharmacia Mono P HR5 / 20) equilibrated with 25 mM Bis-Tris buffer (pH 4.85), and 10% Polybuffer 74 (manufactured by Pharmacia, with hydrochloric acid). The target β-mannanase was eluted at pH 3.5). The active fraction was concentrated with an ultrafiltration membrane (molecular weight cut 10,000).
Finally, a purified enzyme showing a single band was obtained by SDS polyacrylamide gel electrophoresis and isoelectric focusing.
The total enzyme activity, total protein amount, and specific activity in each purification step are shown in Table 1 below.
The amount of protein was measured by the Foreign-Raleigh method using BSA (bovine serum albumin) as a standard substance.

Further, the activity of the finally purified enzyme was measured at 30 ° C. according to the activity measurement method of Example 1, and the specific activity was determined from the protein amount of the same sample by the foreign-Lawley method. It was mg-protein.
[0043]
Comparative Example 1 Other Mannana - Measurement of specific activity per protein weight
The specific activity of mannanase from Aspergillus niger was measured. The activity measurement method was in accordance with Example 1, and the protein mass was measured by the weight method in addition to that by the Foreign-Lorry method as in Example 2. In the gravimetric method, 300 μl of the purified enzyme was put in a dialysis membrane (10000 cut manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.), dialyzed twice in 400 ml of MQ water for 6 hours and further for 18 hours, recovered, lyophilized and weighed. The results are shown in Table 2.

The specific activity of the purified enzyme per weight of protein is 245 U / mg protein (Lowry method) and 341.1 U / mg protein (weight method) at 40 ° C., and the values vary depending on the protein quantification method. However, commercially available Aspergillus niger It was 1.9 to 10.8 times that of the derived enzyme, and Penicillium multicolor mch13-2 strain was found to have a very high specific activity per protein in any measurement method. The reason why the values differ depending on the measurement method is that the Raleigh method reacts with tyrosine, tryptophan, and cysteine in the protein to give a blue color, but the color development reaction differs depending on the amount of the amino acid contained in the sample. It is possible.
[0044]
Example 3 Β of the present invention - Examination of various properties of mannanase
The enzymatic properties of the purified enzyme obtained in Example 2 were measured.
The enzyme activity was measured by the method described in Example 1 above.
(1) Action
The enzyme of the present invention was added to a 0.2% solution of β-1,4-D-mannopyranoside-bound locust bean gum to a concentration of 2 U / ml, a sample was taken over time, and the reaction product Was analyzed by liquid high performance chromatography (column Bio-rad Aminex 42A). As a result, high molecular locust bean gum disappeared 60 minutes after the start of the reaction, and medium to low molecular enzyme degradation products were mainly observed, but they were further reduced in molecular weight 5 hours after the start of the reaction. . In the early stage of the reaction, the polymer disappeared quickly, and an enzyme degradation product of medium to low molecular weight was observed, so that this enzyme acts on the β-1,4-D-mannopyranoside bond non-specifically, It is thought that mannooligosaccharide and mannose were produced.
(2) Substrate specificity
Locust bean gum (galactomannan), glucomannan (derived from konjac), arabinoxylan (derived from barley), xylan, tragacanth gum, cellulose, and carboxymethylcellulose are mixed to a concentration of 2 U / ml of the enzyme, 45 The reaction was carried out at 66 ° C. for 66 hours. Thereafter, the reaction was stopped at 100 ° C., and the reaction product was analyzed by liquid high performance chromatography (column Bio-rad Aminex 42A). As a result, low molecular weight was observed in locust bean gum and glucomannan, but no change was observed in other arabinoxylan, xylan, tragacanth gum, cellulose, and carboxymethylcellulose.
(3) Molecular weight
The molecular weight was measured by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. 200,000, 116,300, 97,400, 66,300, 55,400, 36,500, 31,000, 21,500, 14,400 were used as marker proteins. As a result, this enzyme was considered to have a sugar chain, and the band of SDS polyacrylamide gel electrophoresis was smeared. The molecular weight range was 42,000-45,000, and the molecular weight of the main band was 43,000.
(4) Isoelectric point
A solution was prepared by adding 1 of Pharmalite pH 4.5 to 5.4 (Pharmacia) to Pharmalite pH 2.5 to 5.0 (Pharmacia) 3. Furthermore, isoelectric focusing was performed using an agarose gel swollen with a solution obtained by adding pure water at a ratio of 15 to the solution 1. As a result, the isoelectric point was 3.2.
(5) Stability
The stability of the obtained purified enzyme at each temperature and pH is shown in FIGS. 1 and 2, respectively. To check the stability of temperature, use 50 mM sodium acetate buffer pH 5.0, to check pH stability, use McKelwein buffer between pH 2.2 and 8.0, and between pH 8.0 and 10.0. Used 50 mM Tris-HCl buffer, and between pH 10.0 and 11.0, 50 mM sodium bicarbonate buffer was used. For the temperature stability, the activity after treatment at each temperature for 1 hour was measured, and the remaining activity when treated at 30 ° C. for 1 hour was defined as 100%.
This enzyme was stable (100% residual activity) after treatment at 50 ° C. for 1 hour, and 70% residual activity after treatment at 60 ° C. for 1 hour. Moreover, it was stable by treatment at 20 ° C. at pH 3.0 to 10.0 for 20 hours.
(6) Reactivity
The reactivity of the obtained purified enzyme at each temperature and each pH is shown in FIGS. 3 and 4, respectively. For the measurement, 50 mM sodium acetate buffer pH 5.0 was used for examining temperature reactivity, and McKelwein buffer was used for examining pH reactivity.
This enzyme has an optimum reaction temperature at around 70 ° C. and an optimum reaction pH at around pH 5.5.
(7) Effects of various activators and inhibitors
In the β-mannanase activity measurement method of Example 1, the substances shown in Table 3 below were added together with the substrate, the activity was measured in each case, and the presence or absence of activation or inhibition was examined. As a result, it was found that it was inhibited by manganese ions and N-bromosuccinimide.

[0045]
Example 4 Single-wheeled Penicillium Activity at low temperature from genus microorganisms
10 g / liter locust bean gum, 10 g / liter bactopeptone (Difco), 1 g / liter yeast extract (Difco), 2 g / liter potassium dihydrogen phosphate, and 0.5 g 2 ml of a medium containing 1 liter of magnesium sulfate heptahydrate was placed in a 15 mL test tube and sterilized at 121 ° C. for 20 minutes.
29 strains belonging to the genus Penicillium, which are monocyclic, were inoculated into the above-mentioned test tubes and cultured with shaking at 27 ° C. and 250 rpm for 5 days. The culture broth was centrifuged to obtain about 1 ml of culture supernatant. Using the supernatant as a crude enzyme solution, the enzyme activity at 40 ° C. was measured by the method described in Example 1 above. The results are shown in Table 4. The classification of the genus Penicillium in the table is "The Genus PENICILLIUNM and its teleomorphic states Eupenicillium and Talaromyces" (1979) (John・ I followed I Ibit (John I Pitt).
[Table 1]

According to Pitt et al., The Penicillium and Penicillium genus Eupenicillium and Tallaromyces are Penicillium sp. . As shown in Table 4, the production of mannanase was recognized in most strains among the genus Penicillium genus, among which the Penicillium glabra series, the Eupenicillium altacea group, the Fracta series, Japanica Remarkably highly reactive strains were observed in the series. In particular, Penicillium multicolor IFO7817, IFO5725, and Penicillium scleothiolam IFO6105 showed high activity. In addition, although mch33 strain, mch47 strain, mch51 strain have not been finally identified as an example of mold isolated from nature by the present inventor, from the observation of the morphology with a microscope, they belong to the genus Penicillium, We observed that it was only for single-wheelers.
Among the genus Penicillium, the activity of Penicillium multicolor IFO7817 strain and Eupenicillium Japanicum IFO31369 strain was examined at each temperature of 30 ° C to 80 ° C. The results are shown in FIGS.
Also, the β-mannanase produced by the Penicillium multicolor mch13-2 strain, IFO7817 strain, Penicillium scleothiolam IFO6105 strain, Eupenicillium Japanicum IFO31369 strain, Eupenicillium ruby drum IFO9703 strain, which is a genus Penicillium belonging to the genus Penicillium, is 40 ° C. The activity was maintained at 84.7%, 76.8%, 94.2%, 81.1% and 77.2% even at 30 ° C., respectively. Monocyclic Penicillium-derived enzymes had a high activity at 40 ° C. and a high ratio of 30 ° C. activity / 40 ° C. activity. On the other hand, cellulosin GM5, which is an enzyme derived from Aspergillus niger as a comparison, had a low 30 ° C. activity / 40 ° C. activity of 56% according to the product sheet. Therefore, when performing the enzyme treatment at room temperature using the enzyme of the present invention, the usefulness that the addition amount is small is clarified.
[0046]
Comparative Example 2 Compound Penicillium Activity of genus microorganism-derived enzymes at low temperatures
According to the method described in Example 4, the activity of 24 genus Penicillium strains was measured. The results are shown in Table 5.
[Table 2]

The activity at 40 ° C of the enzyme produced by the microorganism belonging to the genus Penicillium is lower than that of the enzyme produced by the microorganism belonging to the genus Penicillium. I found it impossible.
[0047]
Example 5 Formulation Example of Enzyme Agent
Liquid enzyme agent:
To the culture supernatant obtained in Example 1, 10% by weight of ethanol and 0.01% by weight of p-hydroxybenzoate were added as preservatives to prepare an enzyme agent.
The activity was stable and the increase of contaminating microorganisms was suppressed.
[0048]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, it is possible to provide a β-mannanase enzyme having a high mannan decomposing activity and a high specific activity even in a state closer to room temperature, a method for producing the same, and an application thereof. Accordingly, the present invention, for example, in coffee beverages, allows the enzyme reaction to be carried out and prevent precipitation without adding a large amount of enzyme even at room temperature, thereby producing no off-flavor from the enzyme protein. This makes it possible to produce a coffee beverage that maintains the original coffee flavor.
The mannan-degrading enzyme conventionally used for preventing precipitation of coffee beverages is derived from Aspergillus niger, and the optimum temperature of the enzyme is 75 to 80 ° C., the action at room temperature is low, and the specific activity is low. In particular, the mannanase enzymes derived from the genus Penicillium genus and the genus Eupenicillium genus provided in the present invention have practically high activity and specific activity even at room temperature. It was understood that it was unexpected for those skilled in the art to have
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the temperature stability of a β-mannanase enzyme according to the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the pH stability of the β-mannanase enzyme according to the present invention.
FIG. 3 is a graph showing temperature reactivity of β-mannanase enzyme according to the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the pH reactivity of β-mannanase enzyme according to the present invention.
FIG. 5 is a graph showing the temperature reactivity of Penicillium multicolor IFO7817.
FIG. 6 is a graph showing the temperature reactivity of Iupenicilium Japanica IFO 31369.

Claims

A β-mannanase produced by a microorganism belonging to the genus Penicillium subgenus Aspergilloides, characterized by having the following physicochemical properties:
(1) Action The β-1,4-D-mannopyranoside bond of β-mannan is nonspecifically hydrolyzed to produce mannose and mannooligosaccharides.
(2) Optimum pH
The optimum pH is 5.0 to 6.0.
(3) Range of optimal temperature of action The optimal temperature range of action is at least 20 to 70 ° C.
(4) 30 ° C. activity / 40 ° C. activity is 80% or more.
(5) Substrate specificity It acts specifically on mannan, galactomannan and glucomannan, but does not act on arabinoxylan, xylan, tragacanth gum, cellulose and carboxymethylcellulose.
(6) Optimal temperature The optimal temperature is 60-70 ° C.
(7) Stable pH range The stable pH range is 3.0 to 10.0.
(8) Temperature stability Temperature stability (at pH 5.0) is 100% after treatment at 50 ° C for 1 hour, assuming that the residual activity when treated at 30 ° C for 1 hour is 100%. Active, 70% residual activity after 1 hour treatment at 60 ° C.
(9) Molecular weight The molecular weight is 42,000-45,000 (SDS-PAGE method).

The β-mannanase according to claim 1, which is produced by a microorganism belonging to Penicillium multicolor.

The β-mannanase according to claim 2, which is produced by Penicillium multicolor mch13-2 strain (FERM BP-6831).

Β-mannanase characterized by having the following physicochemical properties:
(1) Action The β-1,4-D-mannopyranoside bond of β-mannan is nonspecifically hydrolyzed to produce mannose and mannooligosaccharides.
(2) Optimum pH
The optimum pH is 5.0 to 6.0.
(3) Range of optimal temperature of action The optimal temperature range of action is at least 20 to 70 ° C.
(4) 30 ° C. activity / 40 ° C. activity is 80% or more.
(5) Substrate specificity It acts specifically on mannan, galactomannan and glucomannan, but does not act on arabinoxylan, xylan, tragacanth gum, cellulose and carboxymethylcellulose.
(6) Optimal temperature The optimal temperature is 60-70 ° C.
(7) Stable pH range The stable pH range is 3.0 to 10.0.
(8) Temperature stability Temperature stability (at pH 5.0) is 100% after treatment at 50 ° C for 1 hour, assuming that the residual activity when treated at 30 ° C for 1 hour is 100%. Active, 70% residual activity after 1 hour treatment at 60 ° C.
(9) Molecular weight The molecular weight is 42,000-45,000 (SDS-PAGE method).

A microorganism which is a Penicillium multicolor mch13-2 strain (FERM BP-6831) belonging to the subgenus Aspergillus subgenus that produces the β-mannanase enzyme according to claim 1 or 4.

A method for producing β-mannanase, wherein the β-mannanase enzyme-producing microorganism according to claim 5 is cultured, and the enzyme is collected from the culture.

A β-mannanase enzyme agent comprising the β-mannanase according to any one of claims 1 to 4 or the β-mannanase produced by the method according to claim 6 .

The β-mannanase enzyme agent according to claim 7 , which is a coffee beverage precipitation inhibitor.

Use of β-mannanase according to claim 1 or β-mannanase produced by the method according to claim 6 for preventing precipitation in coffee beverages.

A method for preventing precipitation in a coffee beverage, comprising causing the β-mannanase enzyme agent according to claim 7 or 8 to act on a coffee extract.

The method according to claim 10 , wherein the β-mannanase enzyme agent is allowed to act at room temperature.