JP4436109B2 - Optical measuring apparatus and optical measuring method for specific binding substance using the same - Google Patents
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Description
本発明は、光学的測定装置及びそれを用いた特異的結合物の光学的測定方法に関し、詳
細には、蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱された蛍光又は散乱光を反射させ
ながら伝播する導波路の表面において、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第2の特異
的結合メンバーと被測定物質を結合させ、更に、被測定物質と第1の特異的結合メンバー
と結合させた後、光線を照射して蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱された蛍
光又は散乱光を導波路に導入し、導波路を反射させながら伝播させ、導波路の出光側縁面
から出光した蛍光又は散乱光を測定して特異的結合物を測定し、ひいては流体試料中の被
測定物質を測定する光学的測定装置及光学的測定方法に関する。
The present invention relates to an optical measuring apparatus and a method for optically measuring a specific binding substance using the same, and in particular, propagates while reflecting fluorescence or scattered light converted or scattered by a fluorescent label or light scattering label. On the surface of the waveguide, the second specific binding member to which the fluorescent label or the light scattering label is bound is bound to the target substance, and further, the target substance is bound to the first specific binding member, Fluorescence or scattered light emitted from the light emitting side edge surface of the waveguide by introducing light into the waveguide that is converted or scattered by the fluorescent label or light scattering label and diffusing the light or propagating the light. The present invention relates to an optical measurement apparatus and an optical measurement method for measuring a specific binding substance by measuring light, and consequently measuring a substance to be measured in a fluid sample.
従来から、光源からの光線を光導波路を通して全反射させながら伝播させ、抗原抗体反
応により光導波路の表面近傍に拘束された蛍光物質をエバネッセント波成分により励起し
、これにより生じる蛍光の強度を測定することにより間接的に免疫反応の程度を測定する
蛍光免疫測定装置の研究が行われている。
Conventionally, the light from the light source is propagated while totally reflecting through the optical waveguide, and the fluorescent substance constrained near the surface of the optical waveguide by the antigen-antibody reaction is excited by the evanescent wave component, and the intensity of the resulting fluorescence is measured. Therefore, studies on fluorescent immunoassay devices that indirectly measure the degree of immune reaction have been conducted.
測定感度、測定精度の優れた蛍光免疫測定装置として、導入された励起光を全反射させ
ながら伝播させる光導波路の表面において抗原抗体反応を行なわせ、さらに蛍光物質で標
識された物質を反応させ、上記励起光のエバネッセント波成分により励起される蛍光物質
が発する蛍光を光導波路に導入し、全反射させながら伝播させ、光導波路から出射される
蛍光に基づいて免疫反応の程度を測定する蛍光免疫測定装置において、650nm近傍に
吸収のピークがある蛍光物質を用い、635nm近傍の波長の光を励起光として採用した
ことを特徴とする蛍光免疫測定装置が提案されている(例えば、特許文献1参照。)。
しかしながら、上記の蛍光免疫測定装置においては、照射する光線は特定波長のレーザ
光線を特定の角度(導波路内で全反射する角度)で照射しなければならず、白熱電球、キ
セノンランプ等の普通の光源を使用することができないので、装置が大型化し、コストが
高く且つ測定が困難であった。
However, in the above-described fluorescence immunoassay apparatus, the light to be irradiated has to be irradiated with a laser beam having a specific wavelength at a specific angle (an angle at which the light is totally reflected in the waveguide), and an ordinary incandescent lamp, xenon lamp, etc. Since the light source cannot be used, the apparatus becomes large, the cost is high, and the measurement is difficult.
又、異なる導波路を用いた特異的結合分析物の測定方法として、流体試料中の1種以上
の特異的結合分析物の存在又は量の検出方法であって、(a)(i)流体試料よりも大き
い屈折率をもつ透明エレメントと、(ii)受光縁部と、(iii)エレメントの表面の
複数の部位に固定された少なくとも1個の同系結合対の第1の特異的結合メンバーを含む
反応表面(該反応表面の他の非部位部分には特異的結合メンバーを固定しない)とを備え
る導波路デバイス(ここで、前記第1の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合
対を介して、少なくとも1種の分析物と特異的に結合することが可能である)を準備する
段階と、(b)前記1種以上の分析物を含む疑いのある試料と第2の同系結合対の特異的
結合メンバーに結合した光散乱ラベルとに反応表面を接触させ(ここで、該第2の同系結
合対の特異的結合メンバーは、所望により中間同系結合対を介して、サンドイッチアッセ
イの場合には前記1種以上の分析物と特異的に結合することが可能であり、競合アッセイ
の場合には前記第1の同系結合対の固定化した第1の特異的結合メンバーに結合すること
が可能である)、試料中の分析物の量に比例して複数の部位に結合した光散乱ラベル複合
体を形成する段階と、(c)導波路の内部で内部全反射を生じるのに有効な光を導波路の
受光縁部に照射し、全反応表面を同時に照射する段階と、(d)散乱光が存在する場合に
は前記表面の各部位及び非部位部分から実質的に同時に散乱光を集光する段階と、(e)
各部位の光散乱度を(i)非部位部分の光散乱度、もしくは(ii)別の部位の光散乱度
、又はその両者と比較し、各部位の光散乱を該部位の固定化特異的結合メンバーに特異的
な分析物の存在又は量と相関させる段階を含む前記方法が提案されている(例えば、特許
文献2参照。)。
The light scattering degree of each part is compared with (i) the light scattering degree of a non-part part, or (ii) the light scattering degree of another part, or both. Such methods have been proposed that involve correlating with the presence or amount of an analyte specific for a binding member (see, for example, Patent Document 2).
上記方法では、光源として、可視、紫外及び近IRスペクトルのエネルギーを含む、ほ
ぼ任意の電磁エネルギー源が可能であり、レーザ、発光ダイオード、フラッシュランプ、
アーク灯、白熱電球、蛍光放電灯等が記載されている。
In the above method, almost any electromagnetic energy source can be used as the light source, including energy in the visible, ultraviolet and near IR spectra, such as lasers, light emitting diodes, flash lamps,
An arc lamp, an incandescent bulb, a fluorescent discharge lamp, etc. are described.
しかし、導波路デバイスの受光縁部から透明エレメント内部に光線を照射するのであり
、透明エレメントの厚みは非常に薄いので、この厚みより幅の狭いスリットを通して光線
を照射しなければならず、反応表面まで届く光線の量が少なくなり、ノイズの影響を受け
易くなるという欠点があった。
However, the light is emitted from the light receiving edge of the waveguide device to the inside of the transparent element. Since the thickness of the transparent element is very thin, the light must be irradiated through a slit narrower than this thickness. The amount of light that reaches the surface decreases, and it is susceptible to noise.
又、導波路デバイスの受光縁部の面精度が低いと、全反射する光線のみならず、全反射
しない光線も反応表面まで届き、この光線が流体試料中に入光し、流体試料中に残存して
いる第2の同系結合対の特異的結合メンバーに結合した光散乱ラベルに到達し、散乱光が
発生するために測定精度が悪くなるという欠点があった。
In addition, if the surface accuracy of the light receiving edge of the waveguide device is low, not only the totally reflected light but also the light that does not totally reflect reaches the reaction surface, and this light enters the fluid sample and remains in the fluid sample. In this case, the light scattering label bound to the specific binding member of the second cognate binding pair is reached, and scattered light is generated, so that the measurement accuracy is deteriorated.
更に、反応表面が広く、流体試料が広く存在すると、散乱光を測定する測定画像が大き
くなり、ノイズの影響が大きくなり、測定感度が低下するという欠点があった。
Furthermore, when the reaction surface is wide and the fluid sample is widely present, the measurement image for measuring the scattered light becomes large, the influence of noise becomes large, and the measurement sensitivity is lowered.
又、従来は、高感度、高精度の分析を行おうとするとB/F分離が必要であったが、B
/F分離の工程は煩雑な処理が必要であるため、高速で短時間で分析を行うことが出来な
かった。
In the past, B / F separation was required to perform high-sensitivity and high-precision analysis.
Since the / F separation process requires complicated processing, analysis could not be performed at high speed in a short time.
本発明の目的は、上記欠点に鑑み、任意の光源を使用して被測定物質に光線を照射し、
蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱された蛍光又は散乱光を導波路内に導入し
、導波路内を反射させながら伝播させると共に、全反射しない蛍光又は散乱光を除去し、
全反射した蛍光又は散乱光のみを、導波路の端縁面で測定することにより、特異的結合物
を、B/F分離を行わず、、高速で感度及び精度よく測定しうる光学的測定装置及びそれ
を用いた特異的結合物の光学的測定方法を提供することにある。
The purpose of the present invention is to irradiate a substance to be measured with a light beam using an arbitrary light source in view of the above drawbacks,
Fluorescence or scattered light converted or scattered by a fluorescent label or light scattering label is introduced into the waveguide and propagated while being reflected in the waveguide, and fluorescence or scattered light that is not totally reflected is removed,
An optical measuring device capable of measuring a specific binding substance at high speed with high sensitivity and accuracy without performing B / F separation by measuring only the totally reflected fluorescence or scattered light at the end face of the waveguide. Another object of the present invention is to provide a method for optically measuring a specific binding substance using the same.
請求項1記載の光学的測定装置は、流体試料中の特異的結合物を光学的に測定する装置
であって、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第2の特異的結合メンバーと結合した被
測定物質と、特異的に結合して前記特異的結合物を構成しうる第1の特異的結合メンバー
が、少なくとも一表面に固定されている反応部と、出光側縁面を有する透明な導波路の一
面に第一の空間層を介して透明基材層が積層され、他面に第二の空間層を介して光吸収層
が積層されており、前記第一の空間層と第二の空間層は連通された、流体試料注入するた
めの層であり、導波路の屈折率が流体試料の屈折率より大きいことを特徴とする。
The optical measurement apparatus according to
上記導波路は、蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱された蛍光又は散乱光が
全反射しながら伝播するのであるから、光学的に透明な材料からなるフィルム、シート状
物又は板状体であり、一側面が出光側縁面となされ、一表面が反応部となされている。
The waveguide is a film, sheet or plate made of an optically transparent material because the fluorescence or scattered light converted or scattered by the fluorescent label or light scattering label propagates while being totally reflected. Yes, one side is a light-emitting side edge surface, and one surface is a reaction part.
上記光学的に透明な材料としては、例えば、ガラス、石英、アクリル系樹脂、フッ素樹
脂、ポリカーボネート樹脂、芳香族ポリエステル樹脂、ポリアリレート樹脂、エポキシ樹
脂、シリコン樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリイミド樹脂及びそのフッ素化物等が挙げら
れ、ガラス、石英、アクリル系樹脂、ポリカーボネート樹脂及びポリスチレン系樹脂が好
ましい。
Examples of the optically transparent material include glass, quartz, acrylic resin, fluorine resin, polycarbonate resin, aromatic polyester resin, polyarylate resin, epoxy resin, silicon resin, polystyrene resin, polyimide resin, and fluorine thereof. In particular, glass, quartz, acrylic resin, polycarbonate resin, and polystyrene resin are preferable.
上記アクリル系樹脂としては、例えば、ポリメチルメタアクリレート(屈折率=1.4
90)、ポリベンジルメタクリレート(屈折率=1.568)、ポリフェニルメタクリレ
ート(屈折率=1.571)、ポリ1−フェニルエチルメタクリレート(屈折率=1.5
49)、ポリシクロヘキシルメタクリレート(屈折率=1.507)、メチルメタアクリ
レート−ベンジルメタクリレート共重合体、メチルメタアクリレート−フェニルメタクリ
レート共重合体、メチルメタアクリレート−1,1,2−トリフルオロエチルメタクリレ
ート共重合体、メチルメタアクリレート−スチレン共重合体等が挙げられる。
Examples of the acrylic resin include polymethyl methacrylate (refractive index = 1.4
90), polybenzyl methacrylate (refractive index = 1.568), polyphenyl methacrylate (refractive index = 1.571), poly 1-phenylethyl methacrylate (refractive index = 1.5).
49), polycyclohexyl methacrylate (refractive index = 1.507), methyl methacrylate-benzyl methacrylate copolymer, methyl methacrylate-phenyl methacrylate copolymer, methyl methacrylate-1,1,2-trifluoroethyl methacrylate Examples thereof include a polymer and a methyl methacrylate-styrene copolymer.
導波路の屈折率は流体試料の屈折率より大きくなければならず、流体試料が水溶液の場
合、水の屈折率は1.33であるから、導波路の屈折率は1.33以上であり、好ましく
は、1.49以上である。
The refractive index of the waveguide must be greater than the refractive index of the fluid sample. If the fluid sample is an aqueous solution, the refractive index of water is 1.33, so the refractive index of the waveguide is 1.33 or more, Preferably, it is 1.49 or more.
導波路の厚みは、蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱された蛍光又は散乱光
の波長の10〜1000倍が好ましく、一般に5〜600μmが好ましく、より好ましく
は15〜100μmである。
The thickness of the waveguide is preferably 10 to 1000 times the wavelength of fluorescence or scattered light converted or scattered by a fluorescent label or light scattering label, generally 5 to 600 μm, more preferably 15 to 100 μm.
上記反応部は、導波路の少なくとも一表面に形成されているが、対向する他表面にも形
成されてもよい。
The reaction portion is formed on at least one surface of the waveguide, but may be formed on the other surface facing the waveguide.
上記反応部には、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第2の特異的結合メンバーと結
合した被測定物質と、特異的に結合して前記特異的結合物を構成しうる第1の特異的結合
メンバーが固定されている。
The reaction part has a first specific substance that can specifically bind to a substance to be measured bound to a second specific binding member to which a fluorescent label or a light scattering label is bound to form the specific bound substance. Static binding member is fixed.
上記第1の特異的結合メンバーは、測定すべき被測定物質により異なるが、例えば、酵
素、微生物、抗原、抗体、抗体断片、レクチン、レセプター、イオノフォア、プロトンポ
ンプ、生体膜、人工生体素子、DNAの分子、RNAの分子、タンパク質、糖鎖、糖タン
パク質、メタロプロティンよりなる群から選ばれた1 種もしくはこれらの混合物等が挙げ
られる。
The first specific binding member varies depending on the substance to be measured. For example, an enzyme, a microorganism, an antigen, an antibody, an antibody fragment, a lectin, a receptor, an ionophore, a proton pump, a biological membrane, an artificial biological element, DNA , One molecule selected from the group consisting of RNA molecules, proteins, sugar chains, glycoproteins, metalloproteins, or a mixture thereof.
上記第1の特異的結合メンバーを反応部に固定する方法は、従来公知の任意の方法が採
用されてよく、例えば、反応部表面に上記第1の特異的結合メンバーと共有結合しうる反
応基を有する合成樹脂の層を被覆し、上記第1の特異的結合メンバーと共有結合させる方
法、タンパク質等の上記第1の特異的結合メンバーが吸着しうる化合物層を反応部表面に
被覆し、上記第1の特異的結合メンバーを吸着させる方法等が挙げられる。
As a method for fixing the first specific binding member to the reaction part, any conventionally known method may be employed. For example, a reactive group capable of covalently binding to the first specific binding member on the reaction part surface. Covering the reaction part surface with a compound layer that can be adsorbed by the first specific binding member such as protein, and the like. Examples include a method of adsorbing the first specific binding member.
上記蛍光標識は、光線の照射を受けた際に光線を変換することにより蛍光を発生する物
質であり、例えば、光線の照射を受けた際に蛍光を発生する化合物、この蛍光を発生する
化合物を含有する合成樹脂粒子等が挙げられる。
The fluorescent label is a substance that generates fluorescence by converting light when irradiated with light. For example, a compound that generates fluorescence when irradiated with light, a compound that generates fluorescence. Examples thereof include synthetic resin particles.
上記蛍光を発生する化合物としては、例えば、フルオレインイソチオシアネート、フル
オレセイン、フルオレセインN−ヒドロキシスクシンイミドエステル、6−(((4−(
4,4−ジフルオロ−5−(2−チエニル)4−4−ボラ−3a,4a−ジアザ−5−イ
ンダセン−3−イル)フェノキシ)アセチル)アミノ)ヘキサン酸、スクシンイミジルエ
ステル、4−アセトアミド−4’−イソシアナトスチルベン−2,2’−ジスルホン酸、
7−アミノ−4−メチルクマリン、7-アミノ-4- トリメチルクマリン、N−(4−アニリ
ノ−1−ナフチル)マレイミド、ダンシルクロライド、4’6−ジアミジノ−2−フェニ
ルインドール、5−(4,6−ジクロトリアジン−2−イル)アミノフルオレセイン、4
,4’−ジイソチオシアナトスチルベン−2,2’−ジスルホン酸、エオシンイソチオシ
アネート、エリトロシンB、フルオレサミン、フルオレセイン−5(6)−カルボキシア
ミドカプロン酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、5−イソチオシアネート(is
othiosyanante)ジアセテート、4−メチルウンベリフェロン、o−フタル
ジアルデヒド、QFITC、ローダミンBイソチオシアネート、硫酸ローダミン101酸
クロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、2’,7’−ジフルオロフル
オレセイン、シアニン系色素、ローダミン、希土類金属錯体等が挙げられ、発光寿命の長
い希土類金属錯体が好適に使用される。
Examples of the compound generating fluorescence include fluorin isothiocyanate, fluorescein, fluorescein N-hydroxysuccinimide ester, 6-(((4- (
4,4-difluoro-5- (2-thienyl) -4--4-bora-3a, 4a-diaza-5-indacene-3-yl) phenoxy) acetyl) amino) hexanoic acid, succinimidyl ester, 4-acetamide -4'-isocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid,
7-amino-4-methylcoumarin, 7-amino-4-trimethylcoumarin, N- (4-anilino-1-naphthyl) maleimide, dansyl chloride, 4′6-diamidino-2-phenylindole, 5- (4 6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein, 4
, 4'-Diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid, eosin isothiocyanate, erythrosin B, fluoresamine, fluorescein-5 (6) -carboxyamidocaproic acid N-hydroxysuccinimide ester, 5-isothiocyanate (is
othioscanante) diacetate, 4-methylumbelliferone, o-phthaldialdehyde, QFITC, rhodamine B isothiocyanate, rhodamine 101 acid chloride, tetramethylrhodamine isothiocyanate, 2 ′, 7′-difluorofluorescein, cyanine dye, Examples thereof include rhodamine and rare earth metal complexes, and rare earth metal complexes having a long emission lifetime are preferably used.
上記希土類金属錯体を構成する希土類金属としては、例えば、スカンジウム、イットリ
ウム、及び、ランタン、セリウム、プラセオジウム、ネオジム、プロメチウム、サマリウ
ム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウ
ム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウム等のランタノイド族金属等が挙げられ、サマ
リウム、ユウロピウム、テルビウム及びジスプロシウムが好適に使用される。
Examples of the rare earth metal constituting the rare earth metal complex include scandium, yttrium, lanthanum, cerium, praseodymium, neodymium, promethium, samarium, europium, gadolinium, terbium, dysprosium, holmium, erbium, thulium, ytterbium, lutetium, and the like. And samarium, europium, terbium and dysprosium are preferably used.
上記希土類金属と共に希土類金属錯体を構成するリガンドとしては、希土類金属と反応
して蛍光を発生する希土類金属錯体を構成しうるものであれば、特に限定されず、例えば
、エチレンジアミン四酢酸類、4,7−ビス−(クロロスルフォフェニル)−1,10−
フェナントロリン−2,9−ジカルボキシリックアシッド、4,4’−ビス−1”,1”
,1”,2”,2”,3”,3”−ヘプタフルオロ−4”,6”−ヘキサンジオン−6”
−イル)−クロロスルホ−o−テルフェニル、ヘキサフルオロアセチルアセトン、トリフ
ェニルホスフィンオキシド、ジフェニルスルホキシド、1,10−フェナントロリン等が
挙げられる。
The ligand constituting the rare earth metal complex together with the rare earth metal is not particularly limited as long as it can constitute a rare earth metal complex that reacts with the rare earth metal to generate fluorescence. For example, ethylenediaminetetraacetic acid, 4, 7-bis- (chlorosulfophenyl) -1,10-
Phenanthroline-2,9-dicarboxylic acid, 4,4′-bis-1 ″, 1 ″
, 1 ", 2", 2 ", 3", 3 "-heptafluoro-4", 6 "-hexanedione-6"
-Yl) -chlorosulfo-o-terphenyl, hexafluoroacetylacetone, triphenylphosphine oxide, diphenyl sulfoxide, 1,10-phenanthroline and the like.
上記蛍光を発生する化合物を含有する合成樹脂粒子は、蛍光を発生する化合物を流体試
料に溶解した場合に比較し、発生する蛍光の強度が流体試料中の共存物質によって低下さ
れることが少ないので好ましい。
Synthetic resin particles containing a compound that generates fluorescence are less likely to be reduced by coexisting substances in the fluid sample compared to when the compound that generates fluorescence is dissolved in the fluid sample. preferable.
上記蛍光を発生する化合物を合成樹脂粒子に含有させる方法は従来公知の任意の方法が
採用されてよく、例えば、蛍光を発生する化合物の存在下で重合性モノマーを乳化重合、
懸濁重合等の重合方法で重合する方法が挙げられる。
Any conventional method may be employed as a method for causing the synthetic resin particles to contain the compound that generates fluorescence. For example, emulsion polymerization of a polymerizable monomer in the presence of a compound that generates fluorescence,
Examples thereof include a polymerization method by a polymerization method such as suspension polymerization.
上記重合性モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、o−ビニルト
ルエン、m−ビニルトルエン、p−ビニルトルエン等の芳香族ビニル化合物;メチル(メ
タ)アクリレート、エチル(メタ)アクリレート、n−プロピル(メタ)アクリレート、
i−プロピル(メタ)アクリレート、n−ブチル(メタ)アクリレート、t−ブチル(メ
タ)アクリレート、n−ヘキシル(メタ)アクリレート、2−エチルヘキシル(メタ)ア
クリレート、シクロヘキシル(メタ)アクリレート等のアクリレート類;(メタ)アクリ
ロニトリル、シアン化ビニリデン等のシアン化ビニル化合物;塩化ビニル、塩化ビニリデ
ン、フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン等のハロゲン化ビニル化
合物;酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステルなどが挙げられる。
Examples of the polymerizable monomer include aromatic vinyl compounds such as styrene, α-methylstyrene, o-vinyltoluene, m-vinyltoluene, and p-vinyltoluene; methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, n -Propyl (meth) acrylate,
acrylates such as i-propyl (meth) acrylate, n-butyl (meth) acrylate, t-butyl (meth) acrylate, n-hexyl (meth) acrylate, 2-ethylhexyl (meth) acrylate, and cyclohexyl (meth) acrylate; Vinyl cyanide compounds such as (meth) acrylonitrile and vinylidene cyanide; vinyl halide compounds such as vinyl chloride, vinylidene chloride, vinyl fluoride, vinylidene fluoride and tetrafluoroethylene; vinyl esters such as vinyl acetate and vinyl propionate Is mentioned.
上記重合性モノマーは、これらの重合性モノマーを重合する際に一般に共重合されてい
る単官能性モノマーや多官能性モノマーが共重合されてよく、単官能性モノマーとしては
、例えば、(メタ)アクリル酸、無水マレイン酸、グリシジルアクリレート等が挙げられ
、多官能性モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン、(ポリ)エチレングリコール
ジ(メタ)アクリレート、(ポリ)プロピレングリコールジ(メタ)アクリレート、トリ
メチロールプロパントリ(メタ)アクリレート等が挙げられる。
The polymerizable monomer may be a copolymer of a monofunctional monomer or a polyfunctional monomer that is generally copolymerized when these polymerizable monomers are polymerized. Examples of the monofunctional monomer include (meth) Acrylic acid, maleic anhydride, glycidyl acrylate and the like can be mentioned. Examples of the polyfunctional monomer include divinylbenzene, (poly) ethylene glycol di (meth) acrylate, (poly) propylene glycol di (meth) acrylate, and trimethylol. Examples thereof include propane tri (meth) acrylate.
上記合成樹脂粒子中の蛍光を発生する化合物の含有量は、少なくなると蛍光の発生量が
少なくなり測定感度が低下し、多くなると蛍光を発生する化合物を溶解しているのと同様
になるので、合成樹脂粒子中5〜80重量%が好ましく、より好ましくは15〜60重量
%である。
Since the content of the compound that generates fluorescence in the synthetic resin particles decreases, the amount of generated fluorescence decreases and the measurement sensitivity decreases. 5-80 weight% is preferable in a synthetic resin particle, More preferably, it is 15-60 weight%.
上記合成樹脂粒子は大きくなるとさはなるべく小さいのが好ましく、10μm以下が好
ましく、より好ましくは20nm〜500nmであり、更に好ましくは30nm〜200
nmである。
The synthetic resin particles are preferably as small as possible, preferably 10 μm or less, more preferably 20 nm to 500 nm, and even more preferably 30 nm to 200 nm.
nm.
このような粒子径の小さい合成樹脂粒子を合成するには、重合性モノマーの微小液滴を
作製し重合すればよく、例えば、重合性モノマーと乳化剤、分散剤、重合開始剤等の必要
成分との混合液をホモジナイザー、マイクロミキサー、マイクロチャンネル等に供給して
微小液滴を作製し常法に従って重合すればよい。
In order to synthesize such synthetic resin particles having a small particle diameter, it is only necessary to prepare and polymerize a fine droplet of a polymerizable monomer. For example, the polymerizable monomer and necessary components such as an emulsifier, a dispersant, and a polymerization initiator The mixed solution may be supplied to a homogenizer, a micromixer, a microchannel or the like to produce fine droplets and polymerized according to a conventional method.
上記光散乱標識は、光線の照射を受けた際に光線を散乱しうる化合物又は微粒子であり
、例えば、金,銀など金属のコロイド微粒子凝集体、CdS、CdSeなどのカルコゲナ
イト微粒子、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリ(メタ)アクリル樹脂など
のポリマー微粒子、シリカゲル、アルミナ、酸化チタンなどの無機酸化物微粒子、これら
の2種以上の組合せによるコアシェル微粒子等が挙げられる。又、上記ポリマー微粒子及
び無機酸化物微粒子は、染色されていてもよいし、蛍光分子や金属ナノ粒子が分散されて
いてもよい。
The light scattering label is a compound or fine particles that can scatter light when irradiated with light, for example, colloidal fine particles of metal such as gold and silver, chalcogenite fine particles such as CdS and CdSe, polystyrene resin, polycarbonate Examples thereof include polymer fine particles such as resin and poly (meth) acrylic resin, inorganic oxide fine particles such as silica gel, alumina and titanium oxide, and core-shell fine particles formed by a combination of two or more of these. The polymer fine particles and inorganic oxide fine particles may be dyed, or fluorescent molecules or metal nanoparticles may be dispersed.
上記光散乱標識粒子の大きさは、特に限定されるものではないが、一般に10nm〜1
0μmであり、好ましくは50nm〜500nmであり、更に好ましくは70〜200n
mである。
The size of the light scattering label particles is not particularly limited, but is generally 10 nm to 1 nm.
0 μm, preferably 50 nm to 500 nm, more preferably 70 to 200 n.
m.
上記第2の特異的結合メンバーは、測定すべき被測定物質に特異的に結合しうるもので
あり、第1の特異的結合メンバーと第2の特異的結合メンバーの間に被測定物質をサンド
ウィッチすることができるものである。
The second specific binding member is capable of specifically binding to the analyte to be measured, and the analyte is sandwiched between the first specific binding member and the second specific binding member. Is something that can be done.
従って、第2の特異的結合メンバーとしては、被測定物質及び第1の特異的結合メンバ
ーに対応して異なるが、例えば、酵素、微生物、抗原、抗体、抗体断片、レクチン、レセ
プター、イオノフォア、プロトンポンプ、生体膜、人工生体素子、DNAの分子、RNA
の分子、タンパク質、糖鎖、糖タンパク質、メタロプロティンよりなる群から選ばれた1
種もしくはこれらの混合物等が挙げられる。
Accordingly, the second specific binding member differs depending on the substance to be measured and the first specific binding member, but for example, an enzyme, a microorganism, an antigen, an antibody, an antibody fragment, a lectin, a receptor, an ionophore, a proton Pumps, biological membranes, artificial biological elements, DNA molecules, RNA
1 selected from the group consisting of molecules, proteins, sugar chains, glycoproteins, and metalloproteins
Seeds or a mixture thereof.
従って、免疫測定方法の場合には、被測定物質が抗体又は抗原であり、第1の特異的結
合メンバーと第2の特異的結合メンバーとしては、それに特異的に反応する抗原又は抗体
が使用される。
Therefore, in the case of an immunoassay method, the substance to be measured is an antibody or an antigen, and an antigen or an antibody that reacts specifically with the first specific binding member and the second specific binding member is used. The
反応部で発生した蛍光又は散乱光が導波路内を反射して導波路の出光側縁面まで伝播す
る間に、導波路内を全反射しない蛍光又は散乱光を除去するのであるから、全反射しない
蛍光又は散乱光が導波路内でなるべく多く反射するのが好ましい。
While the fluorescence or scattered light generated in the reaction part is reflected in the waveguide and propagates to the light output side edge surface, the fluorescence or scattered light that is not totally reflected in the waveguide is removed. It is preferable to reflect as much fluorescence or scattered light as possible in the waveguide.
従って、上記反応部から出光側縁面までの距離は、蛍光又は散乱光が導波路内を全反射
して伝播する1往復の距離の2倍以上であることが好ましく、より好ましくは20倍以上
である。
Therefore, the distance from the reaction part to the light-exiting side edge surface is preferably at least twice the distance of one round trip in which the fluorescence or scattered light propagates by being totally reflected in the waveguide, and more preferably at least 20 times. It is.
上記透明基材層は、導波路の一面に第一の空間層を介して積層されており、特異的結合
物を光学的に測定する際に、光源からの光線はこの層を透過して反応部に照射されるので
あり、光学的に透明な材料で形成される。
The transparent base material layer is laminated on one surface of the waveguide via the first space layer, and when the specific binding substance is optically measured, the light from the light source passes through this layer and reacts. The portion is irradiated with an optically transparent material.
上記光学的に透明な材料としては、前述の導波路を形成するのに使用された光学的に透
明な材料が好適に使用される。
As the optically transparent material, the optically transparent material used for forming the above-described waveguide is preferably used.
上記光吸収層は、導波路の他面に第二の空間層を介して積層されており、導波路から出
射してきた蛍光又は散乱光を吸光する層であり、吸光することにより、導波路内の全反射
しない蛍光又は散乱光をなくすのであるから、着色された、特に、黒色に着色された合成
樹脂層が好ましい。
The light absorption layer is laminated on the other surface of the waveguide through the second space layer, and is a layer that absorbs fluorescence or scattered light emitted from the waveguide. Therefore, the synthetic resin layer colored, particularly black, is preferable.
上記合成樹脂としては、例えば、オレフィン系樹脂、塩化ビニル系樹脂、ポリスチレン
系樹脂、アクリル系樹脂、ABS樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエ
ステル系樹脂、ポリアリレート系樹脂、エポキシ系樹脂、シリコン系樹脂、ポリイミド系
樹脂等の熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂及び光硬化性樹脂が挙げられる。
Examples of the synthetic resin include olefin resin, vinyl chloride resin, polystyrene resin, acrylic resin, ABS resin, fluorine resin, polycarbonate resin, polyester resin, polyarylate resin, epoxy resin, silicon Thermoplastic resins such as epoxy resins and polyimide resins, thermosetting resins, and photocurable resins.
着色は、上記合成樹脂に着色剤を練りこんでもよいし、合成樹脂層の表面に着色剤層を
積層してもよく、該着色剤としては、例えば、アゾ系、フタロシアニン系、スレン系、染
料レーキ系等の有機系着色剤;カーボンブラック、酸化物系、クロム酸モリブデン系、硫
化物・セレン化物系、フェロシアン化物等の無機系着色剤が挙げられ、カーボンブラック
が好ましい。
For coloring, a colorant may be kneaded into the synthetic resin, or a colorant layer may be laminated on the surface of the synthetic resin layer. Examples of the colorant include azo, phthalocyanine, selenium, and dyes. Organic colorants such as lakes; inorganic colorants such as carbon black, oxides, molybdenum chromates, sulfides / selenides, ferrocyanides, etc., and carbon black is preferred.
上記第一の空間層及び第二の空間層は、流体試料を注入するための層であり、両層は流
体試料を一度に注入できるように連通されている。又、両層は、特異的結合物を光学的に
測定する際に、流体試料が注入され、導波路を伝播する蛍光又は散乱光のうち全反射しな
い蛍光又は散乱光が入光する層である。
The first space layer and the second space layer are layers for injecting a fluid sample, and both layers are communicated so that the fluid sample can be injected at a time. In addition, both layers are layers into which a fluid sample is injected when a specific binding substance is optically measured, and fluorescence or scattered light that is not totally reflected out of fluorescence or scattered light propagating through a waveguide enters. .
上記第一の空間層及び第二の空間層の厚みは、特に限定されるものではないが、薄くな
ると水等の流体試料を導入しにくくなり、厚くなると導波路と光吸収層との積層が困難に
なるので、0.6〜2000μmが好ましい。
The thickness of the first space layer and the second space layer is not particularly limited. However, when the thickness is reduced, it becomes difficult to introduce a fluid sample such as water, and when the thickness is increased, the lamination of the waveguide and the light absorption layer is reduced. Since it becomes difficult, 0.6-2000 micrometers is preferable.
空間層の厚みが薄すぎるとエバネッセント波が光吸収層まで到達する恐れがあるため、
10〜1500μmがより好ましく、100〜1000μmが更に好ましい。 又、空間
層の厚みが10μm程度以下の時は、光吸収層を流体試料の屈折率より大きくするのが好
ましい。
If the thickness of the space layer is too thin, evanescent waves may reach the light absorption layer.
10-1500 micrometers is more preferable and 100-1000 micrometers is still more preferable. Further, when the thickness of the space layer is about 10 μm or less, it is preferable to make the light absorption layer larger than the refractive index of the fluid sample.
上記透明基材層は、反応部に対応する位置以外は光線が透過する必要はなく、むしろ導
波路から出射してくる光線を吸収するほうが好ましいので、透明基材層の外表面に、反応
部に対応する位置を除いて遮光層が積層されているのが好ましく、更に、遮光層が光吸収
性を有しているのが好ましい。
The transparent base layer does not need to transmit light except for the position corresponding to the reaction part, but rather absorbs the light emitted from the waveguide, so that the reaction part is formed on the outer surface of the transparent base layer. It is preferable that the light shielding layer is laminated except for the position corresponding to, and further, the light shielding layer preferably has a light absorption property.
上記遮光層としては、遮光性を有していればよく、例えば、アルミニウム箔、アルミニ
ウム蒸着合成樹脂フィルム、着色合成樹脂フィルム、不透明の紙、不透明の布等が挙げら
れる。又、前述の光吸収層も遮光性及び光吸収性を有しているので好適に使用できる。
The light-shielding layer only needs to have a light-shielding property, and examples thereof include aluminum foil, aluminum-deposited synthetic resin film, colored synthetic resin film, opaque paper, and opaque cloth. Moreover, since the above-mentioned light absorption layer also has light-shielding properties and light-absorbing properties, it can be suitably used.
又、透明基材層には、流体試料を第一の空間層に供給するための連通孔が穿設されてい
るのが好ましい。
The transparent base material layer is preferably provided with a communication hole for supplying the fluid sample to the first space layer.
更に、反応部に照射された光線が反射され、再度反応部に照射されて、蛍光標識又は光
散乱標識によって変換又は散乱された蛍光又は散乱光の強度が向上するように、光吸収層
の第二の空間層側であって、反応部に対応する位置に光反射層が積層されているのが好ま
しい。
Further, the light absorption layer is reflected so that the light irradiated to the reaction part is reflected, and the reaction part is irradiated again to improve the intensity of the fluorescence or scattered light converted or scattered by the fluorescent label or the light scattering label. It is preferable that the light reflecting layer is laminated at a position corresponding to the reaction portion on the second space layer side.
上記光反射層としては、光線が反射するものであれば、特に限定されず、例えば、鏡、
アルミニウムシート等が挙げられる。
The light reflecting layer is not particularly limited as long as it reflects light rays. For example, a mirror,
An aluminum sheet etc. are mentioned.
次に、本発明の光学的測定装置を図面を参照して説明する。図1は、本発明の光学的測
定装置の一例を示す模式図であり、図2は、図1におけるA−A断面図である。
Next, the optical measuring apparatus of the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a schematic view showing an example of the optical measuring apparatus of the present invention, and FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG.
図中1は透明な導波路であり、一表面に、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第2の
特異的結合メンバーと結合した被測定物質と、特異的に結合して前記特異的結合物を構成
しうる第1の特異的結合メンバー11が固定されて反応部12が形成され、反応部12か
ら遠い側縁面が出光側縁面13となされている。
In the figure,
導波路1の反応部12側には、導波路1の端部と透明基材層2の端部が両面テープより
なるスペーサー3’、3’により接着され、導波路1と透明基材層2の間に第一の空間層
4が形成されている。
On the
又、21は、流体試料を空間層4に注入するための貫通孔であり、透明基材層2に穿設
されている。尚、出光側縁面13側のスペーサー3’は、導波路1と接触する面積が少な
いほうが、測定に与える影響が少ないため、線接触となるようにするのが好ましい。
又、導波路1の反応部12と反対側は、導波路1の端部と光吸収層6の端部が両面テー
プよりなるスペーサー3’、3’により接着され、導波路1と光吸収層6の間に第二の空
間層5が形成されている。
Further, the end of the
更に、透明基材層2と光吸収層6は第一の空間層4及び第二の空間層5に満たす液体試
料が漏れないようにスペーサー3、3等により容器状となるように封止されている(一部
図示せず。)。
Further, the
又、液漏れ防止として導波路の出光側側縁と透明基材層2と光吸収層6を、光学的な影
響の少ないフィルム等で封止しても良い。
Further, the light output side edge of the waveguide, the transparent
又、第一の空間層4と第二の空間層5は、図2に示したように両側部で連通されており
流体試料が流入する構造となっている。
Further, as shown in FIG. 2, the
光学的測定は、注入口21から液体試料を注入し、第一の空間層4及び第二の空間層5
に液体試料を満たし、光源から反応部12に光線を照射し、導波路1の出光側縁面13か
ら出光した蛍光又は散乱光を出光側縁面13の付近に設置した受光素子で測定することよ
り行われる。
In the optical measurement, a liquid sample is injected from the
The sample is filled with a liquid sample, light is irradiated from the light source to the
上記光学的測定装置において、反応部12に光源から光線を照射する際には、光源と反
応部12の間にスリットを設置し、光線が反応部12のみに照射されるようにするのが好
ましい。
In the optical measurement apparatus, when the
図3は、本発明の光学的測定装置の異なる例を示す模式図であり、図4は図3の平面図
である。図3に示した光学的測定装置は、いわば、図1及び2で示した光学的測定装置の
縦型の光学的測定装置である。
FIG. 3 is a schematic view showing another example of the optical measuring apparatus of the present invention, and FIG. 4 is a plan view of FIG. The optical measuring device shown in FIG. 3 is a vertical optical measuring device of the optical measuring device shown in FIGS.
図中1は透明な導波路であり、一表面の下方に、蛍光標識又は光散乱標識が結合された
第2の特異的結合メンバーと結合した被測定物質と、特異的に結合して前記特異的結合物
を構成しうる第1の特異的結合メンバー11が固定されて反応部12が形成され、反応部
12から遠い上側縁面が出光側縁面13となされている。
In the figure,
透明基材層2と光吸収層6は、端部が両面テープよりなるスペーサー3、3により接着
され、底面が底蓋体31により貼付され容器状に形成されており、その中に導波路1が挿
入され、導波路1と透明基材層2の間に第一の空間層4が形成され、導波路1と光吸収層
6の間に第二の空間層5が形成されている。
The transparent
そして、上端部の導波路1と透明基材層2の間、導波路1と光吸収層6の間及び導波路
1とスペーサー3との間が、液体試料の注入口22となされている。又、第一の空間層4
と第二の空間層5は、図4に示したように両側部で連通されており流体試料が流入する構
造となっている。
A
As shown in FIG. 4, the
光学的測定は、注入口22から液体試料を注入し、第一の空間層4及び第二の空間層5
に液体試料を満たし、光源から反応部12に光線を照射し、導波路1の出光側縁面13か
ら出光した蛍光又は散乱光を出光側縁面13の上部付近に設置した受光素子で測定するこ
とより行われる。
In the optical measurement, a liquid sample is injected from the
The sample is filled with a liquid sample, light is irradiated from the light source to the
図5は、本発明の光学的測定装置の更に異なる例を示す模式図であり、図6は図5の平
面図であり、図7は図5におけるB−B断面図である。
FIG. 5 is a schematic view showing still another example of the optical measuring apparatus of the present invention, FIG. 6 is a plan view of FIG. 5, and FIG. 7 is a cross-sectional view taken along line BB in FIG.
図5に示した光学的測定装置は、透明基材層2の外表面に遮光層7が積層されている以
外は図1に示した光学的測定装置と同一である。遮光層7には、反応部12に対応する位
置に光線入射孔71が形成されると共に貫通孔21に連通する貫通孔72が形成されてい
る。
The optical measuring device shown in FIG. 5 is the same as the optical measuring device shown in FIG. 1 except that the
図8は、本発明の光学的測定装置の更に異なる例を示す模式図であり、図9は図8にお
けるC−C断面図である。
FIG. 8 is a schematic view showing still another example of the optical measuring apparatus of the present invention, and FIG. 9 is a cross-sectional view taken along the line CC in FIG.
図中1は透明な導波路であり、両表面の対応する位置に、蛍光標識又は光散乱標識が結
合された第2の特異的結合メンバーと結合した被測定物質と、特異的に結合して前記特異
的結合物を構成しうる第1の特異的結合メンバー11が固定されて反応部12、12が形
成され、反応部12から遠い側縁面が出光側縁面13となされている。
In the figure,
導波路1の一面には、導波路1の端部と透明基材層2の端部が両面テープよりなるスペ
ーサー3’、3’により接着され、導波路1と透明基材層2の間に第一の空間層4が形成
されている。21は、流体試料を第一の空間層4に注入するための貫通孔であり、透明基
材層2に穿設されている。
On one surface of the
又、透明基材層2の外表面に遮光層7が積層されている。遮光層7には、反応部12に
対応する位置に光線入射孔71が形成されると共に貫通孔21に連通する貫通孔72が形
成されている。
A
又、導波路1の他面には、導波路1の端部と光吸収層6の端部が両面テープからなるス
ペーサー3’、3’により接着され、導波路1と光吸収層6の間に第二の空間層5が形成
されている。又、光吸収層6には、反応部12に対応する位置に反射層61が積層されて
いる。
The other end of the
第一の空間層4と第二の空間層5は、導波路1に穿設された連通孔14で連通されてい
る。連通孔14の形状は、流体試料を通すことが可能であれば良く、例えば、円形、正方
形、長方形等が挙げられ、その数は1本でもよいし、2以上の複数本であってもよい。
The
尚、連通孔14の位置は、反応部12以外の位置であれば任意の位置で可能であるが、
透明基材層2に穿設されている貫通孔21の真下に穿設されるのが好ましい。
The position of the
It is preferable to drill directly under the through
請求項9記載の特異的結合物の光学的測定方法は、蛍光標識又は光散乱標識が結合され
た第2の特異的結合メンバーと、被測定物質を含む流体試料を、請求項1〜8項のいずれ
か1項に記載の光学的測定装置の第一の空間層と第二の空間層に供給し、被測定物質を介
して、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第2の特異的結合メンバーと、反応部に固定
された第1の特異的結合メンバーとを結合させ、特異的結合物を形成した後、該特異的結
合物に光線を照射し、蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱された蛍光又は散乱
光を導波路に導入し、導波路を反射しながら伝播し、出光側縁面から出光した蛍光又は散
乱光を受光素子で測定することを特徴とする。
The method for optically measuring a specific binding substance according to claim 9, wherein a fluid sample containing a second substance to be measured and a second specific binding member to which a fluorescent label or a light scattering label is bound, and a substance to be measured are used. The second specific substance, which is supplied to the first spatial layer and the second spatial layer of the optical measurement device according to any one of the above, and is bound with a fluorescent label or a light scattering label via the substance to be measured The binding member and the first specific binding member immobilized on the reaction part are bound to form a specific binding product, and then the specific binding product is irradiated with light and converted by a fluorescent label or a light scattering label. Alternatively, scattered fluorescence or scattered light is introduced into a waveguide, propagated while reflecting through the waveguide, and the fluorescence or scattered light emitted from the light output side edge surface is measured by a light receiving element.
次に、請求項9記載の特異的結合物の光学的測定方法を図面を参照して説明する。図1
0は、図5〜7に示した光学的測定装置をもちいて特異的結合物の光学的測定方法の1例
を示す模式図であり、図11は、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第2の特異的結合
メンバーと、被測定物質被測定物質と、第1の特異的結合メンバーが結合した特異的結合
物が反応部表面に固定されている状態を示す模式図である。
Next, an optical measurement method for the specific binding substance according to claim 9 will be described with reference to the drawings. FIG.
0 is a schematic diagram showing an example of an optical measurement method for a specific binding substance using the optical measurement apparatus shown in FIGS. 5 to 7, and FIG. 11 is a diagram in which a fluorescent label or a light scattering label is bound. It is a schematic diagram which shows the state by which the specific binding substance which the 2nd specific binding member, the to-be-measured substance to-be-measured substance, and the 1st specific binding member couple | bonded is fixed to the reaction part surface.
図中8は光源であり、遮光層7の光線入射孔71の上方に設置されている。又、9は受
光素子であり、導波路1の出光側縁面13の側方に設置されている。
In the figure, reference numeral 8 denotes a light source, which is installed above the
上記特異的結合物の光学的測定方法において、最初の工程は、蛍光標識又は光散乱標識
が結合された第2の特異的結合メンバーと被測定物質16を混合した流体試料15を、透
明基材層2に穿設されている貫通孔21から第一の空間層4及び第二の空間層5に供給す
る工程である。
In the method for optically measuring a specific binding substance, the first step is to prepare a
第一の空間層4及び第二の空間層5に流体試料15を供給すると、反応部12において
、被測定物質を介して、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第2の特異的結合メンバー
と、反応部12に固定された第1の特異的結合メンバー11とが結合し、特異的結合物1
9が形成される。
When the
9 is formed.
即ち、流体試料15に含まれる被測定物質16よりも多量の、蛍光標識又は光散乱標識
18が結合された第2の特異的結合メンバー17と、被測定物質16を含む流体試料15
を混合すると、被測定物質16は、蛍光標識又は光散乱標識18が結合された第2の特異
的結合メンバー17と特異的に結合し、被測定物質16の結合した第2の特異的結合メン
バー17と被測定物質16の結合していない第2の特異的結合メンバー17とを含む流体
試料15が得られる。
That is, the
, The
この流体試料15を反応部12に供給すると、第2の特異的結合メンバー17と特異的
に結合している被測定物質16は、反応部12に固定された第1の特異的結合メンバー1
1とも特異的に結合し、蛍光標識又は光散乱標識18が結合された第2の特異的結合メン
バー17と被測定物質16と第1の特異的結合メンバー11が結合した特異的結合物19
が形成される。
When the
The second specific binding
Is formed.
そして、第1の特異的結合メンバー11は反応部12に固定されているので、特異的結
合物19は反応部12に固定されている。又、過剰の蛍光標識又は光散乱標識18が結合
された第2の特異的結合メンバー17は流体試料15中に浮遊している。
Since the first specific binding
次に、特異的結合物19に光線を照射し、蛍光標識又は光散乱標識18により変換又は
散乱された蛍光又は散乱光を導波路1に導入し、導波路1を反射しながら伝播し、出光側
縁面13から出光した蛍光又は散乱光を受光素子9で測定する。
Next, the specific
光源8から矢印Dのように光線入射孔71を通って反応部12(流体試料15)に光線
を照射すると、流体試料15中の蛍光標識又は光散乱標識18により変換又は散乱された
蛍光又は散乱光が発生する。
When light is irradiated from the light source 8 to the reaction unit 12 (fluid sample 15) through the
流体試料15中を浮遊している第2の特異的結合メンバー17に結合した蛍光標識又は
光散乱標識18により変換又は散乱された蛍光又は散乱光は、光線Eで示したように深い
入射角を有している光線だけが導波路1内に入射する。
The fluorescent or scattered light converted or scattered by the fluorescent label or
光線Eは導波路の1表面で全反射しない深い角度の光線であるから、光線Eは導波路1
を通り、導波路1の他表面から第二の空間層5内の流体試料15に入射し、光吸収層6で
一部吸収されると共に一部反射される。
Since the ray E is a deep angle ray that is not totally reflected by one surface of the waveguide, the ray E is the
And enters the
反射された光線Eは、再度,導波路1に入射し、導波路1の1表面から第一の空間層4
内の流体試料15に入射し、遮光層7で反射される。反射された光線Eは更に導波路1に
入射する。光線Eは、上記反射及び光吸収が繰り返され、減衰してなくなってしまう。
The reflected light beam E is incident again on the
It enters the
一方、反応部12に固定されている特異的結合物19に含まれる蛍光標識又は光散乱標
識18により変換又は散乱された蛍光又は散乱光も、浅い角度の入射角を有する光線と深
い角度入射角を有する光線があるが、深い角度入射角を有する光線は、上記光線Eと同様
に反射及び光吸収が繰り返され、減衰してなくなってしまう。
On the other hand, the fluorescent or scattered light converted or scattered by the fluorescent label or
浅い角度の入射角を有する光線は、光線Fで示したように、導波路1を全反射しながら
伝播し、出光側縁面13から出光するので、出光した蛍光又は散乱光を受光素子4で受光
し、電気的処理により測定する。又、出光した光線を、蛍光又は散乱光を選択的に透過す
るフィルターを介して受光してもよい。
As shown by the light beam F, the light beam having a shallow incident angle propagates while being totally reflected on the
上記光源としては、公知の任意の光源が使用可能であり、例えば、レーザー、発光ダイ
オード、フラッシュランプ、アーク灯、白熱電球、蛍光灯、キセノンランプ、水銀灯等が
挙げられ、光線も任意の光線が使用可能であり、例えば、可視光線、紫外線、赤外線等が
挙げられる。
As the light source, any known light source can be used, and examples thereof include lasers, light emitting diodes, flash lamps, arc lamps, incandescent lamps, fluorescent lamps, xenon lamps, mercury lamps, and the like. Usable, for example, visible light, ultraviolet light, infrared light, and the like.
上記受光素子としては、光線を感知しうる任意の計測装置が使用可能であるが、一般に
フォトダイオード、CMOSカメラ、CCDカメラ等が好適に使用される。
As the light receiving element, any measuring device capable of sensing light can be used, but in general, a photodiode, a CMOS camera, a CCD camera, or the like is preferably used.
本発明の光学的測定装置及びそれを用いた特異的結合物の光学的測定方法の構成は上述
の通りであるから、任意の光源を使用して容易に照射することができ、導波路に固定され
ていない浮遊した特異的結合物に存在する蛍光標識又は光散乱標識によって変換又は散乱
された蛍光又は散乱光は、導波路を伝播する際に減衰され光学測定装置まで到達しないの
で、B/F分離を行わず、特異的結合物を高速で、感度及び精度よく測定することができ
る。
Since the configuration of the optical measurement apparatus of the present invention and the optical measurement method of a specific binding substance using the same is as described above, it can be easily irradiated using an arbitrary light source and fixed to the waveguide. The fluorescence or scattered light converted or scattered by the fluorescent label or light scattering label present in the unbound floating specific binder is attenuated when propagating through the waveguide and does not reach the optical measurement device. Specific separation can be measured at high speed with high sensitivity and accuracy without separation.
又、導波路表面の反応部に固定された特異的結合物中の蛍光標識又は光散乱標識によっ
て変換又は散乱された蛍光又は分散光の入射角は浅いので、導波路を薄くすることができ
、出光側側縁面からの光線は明るくなり測定感度が優れ、更に、光学的測定装置は薄肉化
が可能となる。従って、流体試料中の被測定物質を高速で感度及び精度よく測定すること
ができる。
In addition, since the incident angle of fluorescence or dispersed light converted or scattered by the fluorescent label or light scattering label in the specific binding substance fixed to the reaction portion on the surface of the waveguide is shallow, the waveguide can be made thin. The light beam from the light-exit side edge surface becomes bright and has excellent measurement sensitivity, and the optical measuring device can be thinned. Therefore, the substance to be measured in the fluid sample can be measured at high speed with high sensitivity and accuracy.
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。 Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to the following examples.
(実施例1)
ヒトヘモグロビンに対するモノクロール抗体とヒトグリコヘモグロビンA1cに対する
モノクロール抗体の作製
ヒトヘモグロビンとヒトグリコヘモグロビンA1cをフロイントコンプリートアジュバ
ントに充分に分散させた溶液(20μg/ml)100μlをBalb/cマウスに2週
間置きに4回免疫した。
Example 1
Monoclonal antibody against human hemoglobin and human glycohemoglobin A1c
Preparation of Monoclonal Antibody Balb / c mice were immunized 4 times every 2 weeks with 100 μl of a solution (20 μg / ml) in which human hemoglobin and human glycohemoglobin A1c were sufficiently dispersed in Freund's complete adjuvant.
免疫終了の2週間後に、免疫されたBalb/cマウスの脾臓を摘出し、106個の脾
細胞を得た。得られた脾細胞をミエローマ細胞とPEG(ポリエチレングリコール)の存
在下で融合させ培養した。増殖した細胞の上澄みを採取しELISA法により各抗体の有
無を調査した。
Two weeks after the end of immunization, the spleen of the immunized Balb / c mouse was excised and 106 splenocytes were obtained. The obtained splenocytes were fused and cultured in the presence of myeloma cells and PEG (polyethylene glycol). The supernatant of the proliferated cells was collected and examined for the presence or absence of each antibody by ELISA.
各抗体が陽性の細胞を限界希釈法により試験し、各抗体を産生している細胞を確認した
。この細胞を大量に培養し、Balb/cマウス腹腔に注射し、2週間後から3日おきに
腹水を採取してヒトヘモグロビンに対するモノクロール抗体とヒトグリコヘモグロビンA
1cに対するモノクロール抗体を得た。
Cells positive for each antibody were tested by the limiting dilution method, and cells producing each antibody were confirmed. These cells are cultured in large quantities, injected into the peritoneal cavity of Balb / c mice, and ascites is collected every 3 days from 2 weeks, and a monoclonal antibody against human hemoglobin and human glycohemoglobin A are collected.
Monoclonal antibody against 1c was obtained.
蛍光合成樹脂粒子の作製
ガラス製重合器に、水80重量部とドデシルスルホン酸ナトリウム1.5重量部を供給
し、攪拌してドデシルスルホン酸ナトリウムを溶解した後、スチレン20重量部、希土類
金属錯体(ユウロピウムに配位したヘキサフルオロアセチルアセトン・ トリオクチルフ
ォスフィンオキシド配位子錯体)4重量部及びアゾビスイソブチロニトリル0,15重量
部を供給し、冷却しながらホモジナイザーで高速分散し、乳化液を得た。
Preparation of fluorescent synthetic resin particles 80 parts by weight of water and 1.5 parts by weight of sodium dodecyl sulfonate are supplied to a glass polymerizer and stirred to dissolve sodium dodecyl sulfonate, and then 20 parts by weight of styrene, rare earth metal complex (Hexafluoroacetylacetone / trioctylphosphine oxide ligand complex coordinated to europium) 4 parts by weight and
得られた乳化液をホモジナイザーで高速分散しながら、窒素置換し、温水で80℃まで
昇温し、80℃で8時間重合して、体積平均粒子径が120nmの蛍光合成樹脂粒子を得
た。
The obtained emulsion was purged with nitrogen while being dispersed at high speed with a homogenizer, heated to 80 ° C. with warm water, and polymerized at 80 ° C. for 8 hours to obtain fluorescent synthetic resin particles having a volume average particle diameter of 120 nm.
抗ヒトグリコヘモグロビンA1c抗体吸着蛍光合成樹脂粒子の作製
0.05Mグリシン緩衝液(pH8.6)に抗ヒトグリコヘモグロビンA1c抗体を溶
解し、濃度が1mg/mlの抗体溶液を得た。
Preparation of anti-human glycohemoglobin A1c antibody-adsorbing fluorescent synthetic resin particles Anti-human glycohemoglobin A1c antibody was dissolved in 0.05 M glycine buffer (pH 8.6) to obtain an antibody solution having a concentration of 1 mg / ml.
上記の得られた蛍光合成樹脂粒子を0.05Mグリシン緩衝液(pH8.6)で3回洗
浄した後、蛍光合成樹脂粒子濃度が1.0重量%になるように0.05Mグリシン緩衝液
(pH8.6)に分散し、得られた分散液1mlに対し、得られた抗体溶液0.5mlを
添加し、35℃で1時間攪拌混合した。
The obtained fluorescent synthetic resin particles were washed three times with 0.05 M glycine buffer (pH 8.6), and then 0.05 M glycine buffer (so that the fluorescent synthetic resin particle concentration was 1.0% by weight ( 0.5 ml of the obtained antibody solution was added to 1 ml of the resulting dispersion, and the mixture was stirred and mixed at 35 ° C. for 1 hour.
次に、牛血清アルブミンの1.0重量%リン酸食塩緩衝液(pH7.2)を1ml添加
し、常温で1時間攪拌混合した後、遠心分離(15000rpm、1時間)し、リン酸食
塩緩衝液(pH7.2)で洗浄した。この遠心分離及び洗浄を3回行った後、得られた抗
ヒトグリコヘモグロビンA1c抗体吸着蛍光合成樹脂粒子に2mlのリン酸食塩緩衝液(
pH7.2)を添加し、超音波ホジナイザーで攪拌し、抗ヒトグリコヘモグロビンA1c
抗体吸着蛍光合成樹脂粒子の分散リン酸食塩緩衝液を得た。
Next, 1 ml of bovine serum albumin 1.0 wt% phosphate buffer solution (pH 7.2) was added, stirred and mixed at room temperature for 1 hour, centrifuged (15000 rpm, 1 hour), and phosphate buffer solution. Washed with liquid (pH 7.2). After performing this centrifugation and washing three times, 2 ml of a phosphate buffer solution (into the obtained anti-human glycohemoglobin A1c antibody-adsorbed fluorescent synthetic resin particles (
pH 7.2) was added, and the mixture was stirred with an ultrasonic homogenizer, and anti-human glycohemoglobin A1c was added.
A dispersed phosphate buffer solution of antibody-adsorbed fluorescent synthetic resin particles was obtained.
反応部の作製
導波路1として、長さ10mm、幅1mm、厚さ100μmの透明ポリメチルメタクリ
レートシートを使用し、ポリメチルメタクリレートシート(導波路1)の反応部12の位
置を蒸留水で洗浄した後、ヒトヘモグロビンに対するモノクロール抗体及びヒトグリコヘ
モグロビンA1cに対するモノクロール抗体を、濃度が1mg/mlになるように0.1
Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)に溶解した緩衝液を、注射針で反応部12表面に供給
し、30℃で1時間静置した。
Production of reaction part As the
A buffer solution dissolved in M Tris-HCl buffer (pH 9.0) was supplied to the surface of the
次に、0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)で洗浄した後、牛血清アルブミンの1
.0重量%リン酸食塩緩衝液(pH7.2)を供給し、30℃で1時間静置することによ
り、上記モノクロール抗体で被覆されていない反応部12表面を被覆した。
Next, after washing with 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0), 1 of bovine serum albumin
. A 0 wt% phosphate buffer solution (pH 7.2) was supplied and allowed to stand at 30 ° C. for 1 hour to coat the surface of the
次いで、再度、0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)で洗浄した後、0.1Mトリ
ス塩酸緩衝液(pH9.0)で被覆してポリメチルメタクリレートシート(導波路(A)
)上に反応部12を形成した。
Next, after washing again with 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0), it was covered with 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) and coated with a polymethyl methacrylate sheet (waveguide (A)
) The
光学的測定装置の作製
導波路1として、上記反応部12が作製された透明ポリメチルメタクリレートシートを
使用し、透明基材層2として、長さ10mm、幅2mm、厚さ100μmの透明ポリメチ
ルメタクリレートシートを使用し、光吸収層6及び遮光層7としてABS樹脂とカーボン
ブラックよりなる、長さ10mm、幅2mm、厚さ100μmの黒色ABS樹脂系シート
を使用した。
Fabrication of optical measuring device The transparent polymethyl methacrylate sheet in which the
図5〜7に示したように、黒色ABS樹脂系シート(光吸収層6)の一面の周囲に、厚
さ0.5mm、幅0.3mmの黒色ABS樹脂系シートよりなるスペーサー3を貼付し、
その上にポリメチルメタクリレートシート(導波路1)を貼付し、第二の空間層5を形成
した。
As shown in FIGS. 5 to 7, a
A polymethyl methacrylate sheet (waveguide 1) was pasted thereon to form a
次に、ポリメチルメタクリレートシート(導波路1)の上面の両端部に厚さ0.5mm
、幅0.3mmの黒色ABS樹脂系シートよりなるスペーサー3を貼付し、その上に直径
1mmの円形の貫通孔21が形成されているポリメチルメタクリレートシート(透明基材
層2)を貼付し第一の空間層4を形成した。
Next, a thickness of 0.5 mm is formed at both ends of the upper surface of the polymethyl methacrylate sheet (waveguide 1).
Then, a
更に、ポリメチルメタクリレートシート(透明基材層2)上に直径1mmの円形の光線
入射孔71及び1辺1mmの正方形の貫通孔72が形成されている黒色ABS樹脂系シー
ト(遮光層7)を貼付し、光学的測定装置を得た。
Further, a black ABS resin sheet (light shielding layer 7) in which a circular
測定用血液試料の作製
被験者の血液を採取後、直ちに全血1ml当りフッ化ナトリウム(血液抗凝固剤)10
mg添加し、次いで、血液3μlを溶血試薬に添加し150倍に希釈して、希釈血液試料
を得た。
Preparation of blood sample for measurement Immediately after collecting the blood of a subject, sodium fluoride (blood anticoagulant) 10 per ml of whole blood
Next, 3 mg of blood was added to the hemolysis reagent and diluted 150 times to obtain a diluted blood sample.
尚、溶血試薬は、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル(Pharm
aceutical Inc社製、商品名「TritonX−100」)を0.1重量%
と除去試薬としてテトラポリリン酸0.1重量%を溶解してなる0.05Mリン酸緩衝液
(pH6.0)を使用した。
The hemolysis reagent was polyoxyethylene (10) octylphenyl ether (Pharm).
0.1% by weight of manufactured by Inc., Inc., trade name "TritonX-100")
A 0.05 M phosphate buffer (pH 6.0) obtained by dissolving 0.1% by weight of tetrapolyphosphate was used as a removal reagent.
得られた血液試料をA1c専用測定装置(液体クロマトグラフィ、京都第一科学社製、
商品名「Hi−AutoA1cHA−8121」に供給し、ヒトグリコヘモグロビンA1
c濃度を測定し、その結果に基づいて、血液試料に、更に、上記溶血試薬を添加しヒトグ
リコヘモグロビンA1c濃度3%、5%、10%及び12%の測定用血液試料を作製した
。
The obtained blood sample was measured using an A1c dedicated measuring device (liquid chromatography, manufactured by Kyoto Daiichi Kagakusha,
Supplied to the trade name “Hi-AutoA1cHA-8121” and human glycohemoglobin A1
c concentration was measured, and based on the result, the hemolysis reagent was further added to the blood sample to prepare blood samples for measurement having human glycohemoglobin A1c concentrations of 3%, 5%, 10% and 12%.
測定
図8に示したように、得られた測定用血液試料に、過剰の抗ヒトグリコヘモグロビンA
1c抗体吸着蛍光合成樹脂粒子の分散リン酸食塩緩衝液を供給、混合した後、5分間静置
し、得られた混合液を光学的測定装置の貫通孔72及び21から第一の空間層4及び第二
の空間層5を満たすように供給し、反応部12に供給した。
Measurement As shown in FIG. 8, the obtained blood sample for measurement was subjected to an excess of anti-human glycohemoglobin A.
After the dispersion phosphate buffer solution of the 1c antibody-adsorbing fluorescent synthetic resin particles is supplied and mixed, the mixture is allowed to stand for 5 minutes. And it supplied so that the
光源8としてキセノンランプを使用して0.1J/Flashの光線を2000回/秒
の間隔で1000回光線入射孔71を通して反応部12に照射し、受光素子4としてフォ
トダイオードを使用し、導波路(A)の出光側縁面13から出光してきた波長650nm
付近の光線の強度を測定した。
Using a xenon lamp as the light source 8 and irradiating the
The intensity of light in the vicinity was measured.
得られた光線強度とヒトグリコヘモグロビンA1c濃度をグラフにプロットしたところ
直線のグラフが得られ、上記光学的測定装置でヒトグリコヘモグロビンA1c濃度を測定
することができることが分かった。
When the obtained light intensity and the human glycohemoglobin A1c concentration were plotted on a graph, a linear graph was obtained, and it was found that the human glycohemoglobin A1c concentration can be measured with the above optical measuring device.
1 導波路
11 第1の特異的結合メンバー
12 反応部
13 出光側縁面
14 連通孔
15 流体試料
16 被測定物質
17 第2の特異的結合メンバー
18 蛍光標識又は光散乱標識
19 特異的結合物
2 透明基材層
21 貫通孔
3、3’ スペーサー
4 第一の空間層
5 第二の空間層
6 光吸収層
61 反射層
7 遮光層
71 光線入射孔
72 貫通孔
8 光源
9 受光素子
DESCRIPTION OF
Claims (12)
とする請求項1記載の光学的測定装置。 The optical measurement apparatus according to claim 1, wherein a communication hole for supplying a fluid sample to the space layer is formed in the transparent base material layer.
徴とする請求項1又は2記載の光学的測定装置。 The optical measurement apparatus according to claim 1, wherein a light shielding layer is laminated on the outer surface of the transparent base layer except for a position corresponding to the reaction part.
ることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の光学的測定装置。 The optical measurement according to any one of claims 1 to 4, wherein a light reflection layer is laminated at a position corresponding to the reaction portion on the second space layer side of the light absorption layer. apparatus.
樹脂よりなる群から選ばれた材料よりなることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項
に記載の光学的測定装置。 The optical measuring device according to any one of claims 1 to 5, wherein the waveguide is made of a material selected from the group consisting of glass, quartz, acrylic resin, polycarbonate resin, and polystyrene resin. .
のいずれか1項に記載の光学的測定装置。 7. The light absorbing layer is a black layer made of a synthetic resin and a colorant.
The optical measuring device according to any one of the above.
伝播する1往復の距離の2倍以上であることを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に
記載の光学的測定装置。 8. The distance from the light output side edge surface of the waveguide to the reaction portion is at least twice as long as one round-trip distance in which fluorescence or scattered light propagates through total reflection in the waveguide. The optical measuring device according to any one of the above.
流体試料を、請求項1〜8項のいずれか1項に記載の光学的測定装置の第一の空間層と第
二の空間層に供給し、被測定物質を介して、蛍光標識又は光散乱標識が結合された第2の
特異的結合メンバーと、反応部に固定された第1の特異的結合メンバーとを結合させ、特
異的結合物を形成した後、該特異的結合物に光線を照射し、蛍光標識又は光散乱標識によ
って変換又は散乱された蛍光又は散乱光を導波路に導入し、導波路を反射しながら伝播し
、出光側縁面から出光した蛍光又は散乱光を受光素子で測定することを特徴とする特異的
結合物の光学的測定方法。 The fluid sample containing the second specific binding member to which the fluorescent label or the light scattering label is bound, and the substance to be measured is used as the first of the optical measuring device according to any one of claims 1 to 8. A second specific binding member that is supplied to the spatial layer and the second spatial layer and has a fluorescent label or a light scattering label bound thereto via a substance to be measured, and a first specific binding immobilized on the reaction part After binding the member and forming a specific binding substance, the specific binding substance is irradiated with light, and fluorescence or scattered light converted or scattered by the fluorescent label or light scattering label is introduced into the waveguide, and guided. A method for optically measuring a specific binding substance, characterized in that fluorescence or scattered light that propagates while reflecting off a waveguide and is emitted from an output side edge surface is measured by a light receiving element.
バーはそれに特異的に結合する抗原又は抗体であることを特徴とする請求項9記載の特異
的結合物の光学的測定方法。 10. The specific binding according to claim 9, wherein the substance to be measured is an antibody or an antigen, and the first specific binding member and the second specific binding member are an antigen or an antibody that specifically binds thereto. Optical measurement method for objects.
合物の光学的測定方法。 The method for optically measuring a specific binding substance according to claim 9 or 10, wherein the fluorescent label is a rare earth metal complex.
求項9、10又は11記載の特異的結合物の光学的測定方法。 12. The method for optically measuring a specific binding product according to claim 9, wherein the fluorescent label is a synthetic resin particle containing a compound that generates fluorescence.
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