JP4424805B2

JP4424805B2 - Opioid peptide and method for producing the same

Info

Publication number: JP4424805B2
Application number: JP2000026387A
Authority: JP
Inventors: 正明吉川; 大行菅沼
Original assignee: Kagome Co Ltd
Current assignee: Kagome Co Ltd
Priority date: 2000-02-03
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2010-03-03
Anticipated expiration: 2020-02-03
Also published as: JP2001213897A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、鎮痛、麻酔等のオピオイド活性を有するペプチド及びその製造方法、並びに当該ペプチド又はその塩を有効成分として含む医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
脳内に存在する神経ペプチドとして、モルヒネと同様の麻酔鎮痛活性（オピオイド活性）を持つ一群のペプチドが知られており、オピオイドペプチドと呼ばれている。このようなオピオイドペプチドとして、エンケファリン、β−エンドルフィン、ネオエンドルフィン、ダイノルフィン、ロイモルフィン等、２０種以上の内因性オピオイドが報告されている。
【０００３】
一方、種々の食品のタンパク質から、オピオイド活性を有するペプチドが見出されている。これらのペプチドは、食品起源の生体調節因子として注目されている。食品由来の外因性オピオイドペプチドとしては、牛乳カゼイン由来のβ−カゾモルフィン（casomorphin）（1-7）（Brantlら、1979年）、β−カゾモルフィン（1-5）（Henschen、1979年）、β−カゾモルフィン（1-3）(Lottspeichら、1980年）、α−カゼインエキソルフィン（caseine xorphin）（Loukasら、1980年）、小麦グルテン由来のペプチド（特開平5-86094号）が知られている。
【０００４】
ところで、光合成を行なう緑色植物の葉緑素には、ルビスコ（RuBisCO：リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ）と呼ばれる酵素が含まれている。本酵素は光合成の暗反応において、リブロース−１，５−二リン酸と二酸化炭素から二分子のグリセリン酸−３−リン酸を生成することにより、二酸化炭素をカルビン回路に取込む働きを持っており、地球上においてもっとも量が多い酵素であるともいわれている。現在までに、ルビスコから派生するオピオイドペプチドを単離し、その構造を決定したという報告は知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なオピオイドペプチドを提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、抹茶の尿素可溶性蛋白質について研究を行ったところ、オピオイド活性を有するペプチドを分離、同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなるオピオイドペプチド。
（２）リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼをペプシン又はペプシン及びパンクレアチンで加水分解して得られる加水分解物から、オピオイドペプチドを採取することを特徴とするオピオイドペプチドの製造方法。
（３）前記ペプチドが（１）のペプチドである（２）のオピオイドペプチドの製造方法。
（４）リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼが茶葉由来である（２）のオピオイドペプチドの製造方法。
（５）茶葉から尿素溶液に可溶性のタンパク質画分を抽出し、同画分をペプシン又はペプシン及びパンクレアチンで加水分解し、得られる加水分解物からオピオイドペプチドを採取することを特徴とするオピオイドペプチドの製造方法。
（６）（１）のオピオイドペプチド又はその生理的に許容可能な塩の１種又は２種以上を有効成分として含む医薬組成物。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
＜１＞本発明のペプチド
本発明のペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなり、オピオイド活性を示す。
【００１０】
本発明のペプチドは、後述する本発明のオピオイドペプチドの製造法によって製造することができる。また、本発明のペプチドは、通常のペプチドの化学合成法によって合成することもできる。
【００１１】
＜２＞オピオイドペプチドの製造法
本発明のオピオイドペプチドの製造法の第一の形態は、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼをペプシン又はペプシン及びパンクレアチンで加水分解して得られる加水分解物から、オピオイドペプチドを採取することを特徴とするオピオイドペプチドの製造方法である。
【００１２】
上記方法において、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼとしては、茶葉由来の酵素が挙げられる。
本発明のオピオイドペプチドの製造法の第二の形態は、茶葉から尿素溶液に可溶性のタンパク質画分を抽出し、同画分をペプシン又はペプシン及びパンクレアチンで加水分解し、得られる加水分解物からオピオイドペプチドを採取することを特徴とするオピオイドペプチドの製造方法である。
【００１３】
上記の各形態において、茶葉としては、茶葉の粉砕物又は磨砕物が挙げられる。具体的には、一般的に抹茶として市販されているものが挙げられる。
以下に、第二の形態に基づいて、抹茶を原料としてオピオイドペプチドを製造する方法について例示するが、第一の形態に基づいて茶葉以外のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ又は同酵素を含む画分を用いる場合も、同様にして、ペプシン又はペプシン及びパンクレアチン処理、並びにオピオイドペプチドの採取を行うことができる。
【００１４】
まず、抹茶粉末を５Ｍ〜飽和尿素液に分散溶解させた後、遠心分離又は濾過等で不溶物を除去し、尿素溶液に可溶性のタンパク質画分を抽出する。次に、こうして抽出された画分中のタンパク質を透析後、ペプシン又はペプシンとパンクレアチンの両方を用いて加水分解する。
【００１５】
ペプシンとしては、ブタの胃粘膜由来が挙げられるが、本発明では特に由来を問わない。パンクレアチンとしては、ブタすい臓由来等が挙げられるが、本発明では、どれを使用しても構わない。本発明において、ペプシンは、単独で使用しても、２種類以上を混合して使用しても構わない。パンクレアチンも同様である。
【００１６】
加水分解は、ペプシンを用いる場合は酸性条件下（ｐＨ１．５〜３．０）で行うことが好ましい。また、ペプシンとパンクレアチンの両方を用いる場合は、第一の酵素に適した条件で同酵素を反応させた後、第二の酵素に適した条件に調整して第二の酵素を反応させるとよい。このとき、パンクレアチンで反応させる場合は中性又は弱アルカリ性条件下（ｐＨ６．５〜９．０）で行うことが好ましい。
例えば、まず抹茶の尿素可溶性タンパク質を希塩酸等の酸性溶液中に分散溶解させた状態でペプシンで加水分解し、次いで中和又は弱アルカリ性にした後にパンクレアチンで加水分解する。
【００１７】
ペプシンおよびパンクレアチンは、いずれも遊離の状態で使用してもよく、担体に固定化したものを使用してもよい。
ペプシンまたはパンクレアチンの使用量は、いずれの場合も、例えば、乾燥した抹茶の尿素可溶性タンパク質又はリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ１００ｇ当たり、約５，０００〜１００，０００ユニットの割合で用いるとよい。活性は、基質として米国メルク社製のハマーステインカゼイン１％溶液を用い、アンソン−萩原変法[赤堀四郎編 "酵素研究法"第２巻、２３７頁（昭和３６年１月１０日、朝倉書店発行）]により測定することができる。反応は３０℃で３０分間行ない、１分間に１μｇのチロシン相当量を遊離するのに要する酵素量を１ユニットとする。
【００１８】
より具体的な条件としては、例えば、２ｇ分の抹茶に相当する７Ｍ尿素抽出物を、透析を行なって尿素を除いたうえで、ｐＨ２．０に調整し、ペプシン５，０００ユニットを加えて、３７℃で５時間インキュベートする条件が挙げられる。また、例えば２ｇ分の抹茶に相当する尿素抽出物を、透析を行なって尿素を除いたうえで、ｐＨ２．０に調整し、ペプシン５，０００ユニットを加えて、３７℃で５時間インキュベートし、その後ｐＨを７．５に調整しパンクレアチン５，０００ユニットを加えて、３７℃で５時間インキュベートする条件が挙げられる。
反応後、ペプシンまたはパンクレアチンは、例えば、９０℃で１０分間加熱することにより、失活させる。反応後、ペプシン又はパンクレアチンは、例えば、９０℃で１０分間加熱することにより、失活させる。
【００１９】
尚、加水分解の条件は、種々の条件で一定量の茶葉の尿素可溶性蛋白質を加水分解し、得られる加水分解物についてオピオイド活性を測定し、最も高い活性の加水分解物が得られる条件を予め設定するとよい。条件としては、ｐＨ、温度、酵素量、処理時間が挙げられる。
【００２０】
次に、上記のようにして得られた加水分解物から、オピオイドペプチドを採取する。ここで採取されるオピオイドペプチドとしては、例えば配列番号１に示すペプチドが挙げられる。
【００２１】
具体的には、各種クロマトグラフィーによって前記加水分解物を分画し、オピオイド活性を示す画分を採集する方法が挙げられる。クロマトグラフィーとしては、逆粗カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる、逆相カラムとしては、オクタデシルシラン（ODS）カラム、ニトロフェネチルカラム、シアノプロピルカラム等が挙げられる。
【００２２】
最終的に得られたペプチドは、例えばアプライドバイオシステム社製のプロテインシーケンサー（４９２型）等を使用して、アミノ酸配列を決定する。配列番号１に示すペプチドは、上記のようにして抹茶から分離、同定されたものである。
【００２３】
また、配列番号１で表されるペプチドは、化学合成によっても取得することができる。ペプチドの合成法は特に制限されないが、市販の自動ペプチド合成装置を使用して、同装置に添付されている標準プロトコールに従って合成を行なうことができる。目的とするペプチドは、合成反応物から、ＯＤＳカラムによる高速液体クロマトグラフィー等によって精製することができる。
【００２４】
＜３＞本発明の医薬組成物
本発明の医薬組成物は、前記本発明のペプチド又は生理学的に許容可能なその塩を有効成分として含む。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。
【００２５】
本発明のペプチドは、極めて少量でオピオイド活性を示すので、鎮痛又は麻酔作用；情動、呼吸、脈動、体温、消化管機能、摂食、免疫等の整調；インシュリンやソマトスタチン等のホルモンの分泌調節、電解質の吸収促進、心筋の収縮調節等の作用を示すことが期待される。したがって、鎮痛麻酔剤、催眠剤、消化管ホルモン分泌促進剤、電解質の吸収促進剤、腸管ぜん動抑制又は胃腸輸送筋収縮による下痢改善剤としての利用が期待できる。
【００２６】
また、本発明のペプチドは、食品や飼料に添加して、またそれらと一緒に投与することもできる。本発明のペプチドは、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、食品に含まれるタンパク質に由来するものであり、安全性が高いと考えられる。
【００２７】
さらに、本発明のペプチドは、オピオイド作用を阻害するオピオイド・アンタゴニストのスクリーニングに使用することができる。
本発明の医薬組成物において、含有させるペプチド又はその塩としては、単独でもよく、２種類以上の混合物であってもよい。
【００２８】
本発明の医薬組成物の好適な投与量は、投与される人間又は動物の年齢、体重、性別、症状、動物の種類等の条件によって適宜設定する。本発明の医薬組成物は、経口および非経口のいずれによっても投与可能であり、更に単独で投与しても、また製薬工業において通常使用されている固体担体や液体担体と一緒に投与してもよく、或いは他の薬剤と混合または組合せて使用するしてもよい。
【００２９】
また投与形態は、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル、散剤、水溶液、注射剤等の任意の形態が可能である。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３１】
【実施例１】
抹茶の尿素可溶性タンパク質のペプシン加水分解物からのオピオイドペプチドの調製
（１）抹茶粉末２ｇを７Ｍ尿素液２００ｍｌに分散溶解させた後、３，５００Ｇで２０分間遠心分離して不溶物を除き、透析を行なって尿素を除いたうえで、１Ｎ塩酸を加えてｐＨを２．０に調整した。
【００３２】
この溶液に、ペプシン（米国シグマ社製）５０００ユニットを加えて３７℃で５時間インキュベートした。反応終了後、９０℃で１０分間加熱してペプシンを失活させ、３，５００Ｇで２０分間遠心分離して不溶物を除き、得られた上澄液を凍結乾燥して、ペプシンによる、抹茶の尿素可溶性蛋白質の加水分解物約０．２ｇを得た。
【００３３】
（２）上記（１）で得た抹茶の尿素可溶性蛋白質の加水分解物１ｍｇを、オクタデシルシラン（ODS）逆相カラム（ナカライテスク社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ₁₈−ＡＲII、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）に注入した。次いで０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）及び０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）を使用して、Ｂ液の濃度を０％から５０％まで５０分かけて直線的に増加する濃度勾配にて、１ｍｌ／分の流速で溶出させた。その時の波長２３０ｎｍにおける吸光度測定によるクロマトグラムを図１に示す。溶出液を経時的に採取し、各画分のオピオイド活性を測定したところ、図１に示したクロマトグラムにおいて矢印で表した、アセトニトリル濃度が約３７．５〜３８．５％の範囲で溶出してくる画分において、オピオイド活性が認められた。尚、本実施例において、オピオイド活性は実施例３に示す方法によって測定した。
【００３４】
（３）上記（１）で得た抹茶の尿素可溶性蛋白質の加水分解物５０ｍｇを使用して、上記（２）と同じ工程を繰り返して活性画分を得た。次に、これらの画分を、ニトロフェネチル逆相カラム（ナカライテスク社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５ＮＰＥ、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）に注入し、上記（２）におけるのと同じ条件で溶出させた。溶出してくる各画分のオピオイド活性を測定したところ、アセトニトリル濃度が約３９〜４０％の範囲で溶出してくる画分にオピオイド活性が認められた。
【００３５】
（４）次に、上記（３）で得たオピオイド活性画分を、シアノプロピル逆粗カラム（ナカライテスク社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５ＣＮ、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）を使用した逆相クロマトグラフィーカラムに供して、上記（２）、（３）におけるのと同様の条件で溶出させた。溶出してくる各画分を分取して、そのオピオイド活性を測定したところ、アセトニトリル濃度が約２６〜２７％の範囲のピーク画分にオピオイド活性が認められた。
【００３６】
（５）上記（４）で得たオピオイド活性画分を回収し、濃縮乾燥した。この乾燥物のアミノ酸配列を、アプライドバイオシステム社製のプロテインシーケンサー４９２型を使用して調べたところ、Ｎ末端から順次Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−ＬｅｕおよびＬ−Ｐｈｅが遊離してきた。このことから、その構成アミノ酸のすべてがＬ−アミノ酸である配列番号１で表されるペプチドであることが確認された。
【００３７】
配列番号１で表されるペプチドの原料抹茶粉末からの収率（％）を、その分子量と２８０ｎｍにおける分子吸光係数から求めたところ、約０．０１％であることが確認された。
【００３８】
配列番号１に示すペプチドは、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼの大サブユニットの第１０３〜１０８残基と構造が一致することから、同酵素に由来することが明らかとなった。
【００３９】
【実施例２】
合成による本発明ペプチドの製造
配列番号１で表されるペプチドの合成は以下の方法で行なった。市販のＦｍｏｃ（Ｎ−α−９−フルオレニルメトキシカルボニル）―Ｐｈｅ−Ｗａｎｇ樹脂（置換率０．５ｍｅｑ／ｇ）０．６ｇ、２０％ピペリジンを含むジメチルフォルムアミドをペプチド合成装置（プロテインテクノロジー社ＰＳ−３）の反応槽中で、室温で反応させてＦｍｏｃ基を除去した。
【００４０】
次にＦｍｏｃ基の除去されたＰｈｅ−樹脂をジメチルフォルムアミドで洗浄し、この樹脂に１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｌｅｕと１ｍｍｏｌのＨＢＴＵ（2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate O-Benzotriazole-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate）を含む０．４ＭＮ−メチルモルフォリンのジメチルフォルムアミド溶液５ｍｌを混合して反応槽に入れて室温で２０分間攪拌下に反応させた。
【００４１】
上記で得られた樹脂を、ジメチルフォルムアミドで洗浄して、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−樹脂を得た。引き続き、上記と同様にして、Ｆｍｏｃ基の除去、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ及びＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）のカップリングを繰り返して、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ―樹脂からなる生成物を得た。
【００４２】
この樹脂を、５％アニソール及び５％水を含有するトリフルオロ酢酸中、室温で１時間反応させ、ペプチドを樹脂から遊離させた。その後、ジエチルエーテルを添加することによりペプチドを沈殿させ、粗ペプチド１５０ｍｇを得た。これをオクタデシルシラン（ＯＤＳ）逆相カラム（ナカライテスク株式会社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＡＲII）を用いた逆相クロマトグラフィーにより精製し、最終生成物４０ｍｇを得た。そのアミノ酸組成（モル比）は、Ｔｙｒ：Ｐｒｏ：Ｌｅｕ：Ａｓｐ：Ｌｅｕ：Ｐｈｅ＝1：1：１：１：１：１であった。
【００４３】
この生成物について、更に、実施例１で使用したのと同じプロテインシーケンサーにより分析したところ、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであることが判明した。
【００４４】
【実施例３】
本発明のペプチドの生理活性
（１）オピオイド活性の測定上記の実施例１における各画分のオピオイド活性、及び実施例２で合成した配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、ならびに既知のオピオイドペプチドのオピオイド活性は、いずれも次のようにして測定した。
【００４５】
ＩＣＲ系雄性マウス（体重３０〜３５ｇ）から輸精管を摘出した。アイソトニックトランスデューサー（日本光電工業株式会社製：ＴＢ６１２−Ｔ）に摘出した２本の輸精管を接続して、０．４ｇの張力をかけた。
【００４６】
２ｍｌ容量のマグヌス管に、Ｋｒｅｂｓ等張液（ＮａＣｌ１１８ｍＭ、ＫＣｌ４．７５ｍＭ、ＣａＣｌ₂２．５４ｍＭ、ＮａＨＣｏ₃２５ｍＭ、ＫＨ₂ＰＯ₄１．１９ｍＭ、グルコース１１ｍＭ）を満たし、３６℃で保温しておいた。この液中に前記輸精管を浸し、ボンベから通気（Ｏ₂９５％：ＣＯ₂５％）を行なった。通気を約２時間行って安定化させた後、３０Ｖで１ｍｓｅｃの電気刺激を与え、マウス輸精管を電気収縮させた。
【００４７】
電気収縮が安定した後、ペプチダーゼによるペプチドの分解を避けるためにL−Ｌｅｗ−L−Ｌｅｗ（２ｍＭ）、ベスタチン（３０μＭ）、チオファン（０．３μＭ）、カプトプリル（１０μＭ）共存下で試料を添加し、マウス輸精管の電気収縮の変化をレコーダーで記録した。オピオイド活性は、試料添加後の電気収縮の抑制と、１０^-4Ｍナロキソン２０μｌ添加による抑制の解除によって判定した。そしてマウス輸精管の電気収縮を５０％抑制する濃度（ＩＣ₅₀）を測定した。
【００４８】
その結果、実施例１で得られた活性画分、及び実施例２で得られたペプチドのＩＣ₅₀は３０μＭであることが判明した。対照として、既知のオピオイド活性を有するペプチド、グルテンエキソルフィン（gluten exorphin ）A（小麦グルテン由来、配列番号２）、α−カゼインエキソルフィン（α-casein exorphin（牛乳α−カゼイン由来、配列番号３）、グリアドルフィン（小麦α−グリアジン由来、配列番号４）のオピオイド活性を、上記と同様にして測定した時のＩＣ₅₀を合せて表１に示した。
【００４９】
【表１】

【００５０】
表１の結果から、本発明のオピオイドペプチドは、低濃度でオピオイド活性を有することがわかる。
【００５１】
（２）鎮痛作用
体重２５ｇ前後のｄｄＹ系マウスを、痛覚が正常であることを確認した後、実験に供した。マウスの痛覚の確認は、尾の付け根を、挟み強度を２５０ｇに調節した長さ３ｃｍの動脈クリップで挟んだ際に、２秒以内にそのクリップに対して、噛む等の反応を示すか否かで判定した。あらかじめ痛覚が正常であることを確認したマウス２４匹を6匹ずつ４群に分け、１群には生理的濃度の食塩水を１０μｌ、他の３群には、実施例１又は実施例２で得られたペプチドをそれぞれ、１０、３０、１００ｎｍｏｌずつ、１０μｌの生理食塩水に溶解させ、脳室内に投与した。そして、投与前および投与より５、１０、１５、２０、２５、３０分後に上記クリップでマウスの尾を挟み、クリップに対して反応を示すまでの時間を記録した。なお、６秒以上反応を示さなかった個体の記録は、一律６秒とした。
【００５２】
マウスが反応を示すまでの時間（秒）を縦軸に、投与からの経過時間（分）を横軸にとり、各測定時間の結果を試験群ごとに線で結び、それぞれの群について、その線の下側の面積（作用曲線下面積）を算出して図２に示した。生理食塩水を投与した対照と比較して、実施例１又は実施例２で得られたペプチドを投与した群においては曲線下面積が顕著に大きく、本発明のペプチドは、実際に脳内において鎮痛作用を示すことが判明した。
【００５３】
【実施例４】
抹茶の尿素可溶性タンパク質のペプシン及びパンクレアチン加水分解物からのオピオイドペプチドの調製
（１）抹茶粉末２ｇを７Ｍ尿素液２００ｍｌに分散溶解させた後、３，５００Ｇで２０分間遠心分離して不溶物を除き、透析を行なって尿素を除いたうえで、１Ｎ塩酸を加えてｐＨ２．０に調整した。
【００５４】
この溶液に、ペプシン（米国シグマ社製）５，０００ユニットを加えて３７℃で５時間インキュベートした。反応終了後、１Ｎ水酸化ナトリウムを加えてｐＨを７．５に調整した。この溶液に、パンクレアチン（米国シグマ社製）５，０００ユニットを加えて３７℃で５時間インキュベートした。反応終了後、９０℃で１０分間加熱してペプシン及びパンクレアチンを失活させ、３，５００Ｇで２０分間遠心分離して不溶物を除き、得られた上澄液を凍結乾燥して、ペプシン及びパンクレアチンによる、抹茶の尿素可溶性タンパク質の加水分解物約０．２ｇを得た。
【００５５】
（２）上記（１）で得た抹茶の尿素可溶性タンパク質の加水分解物１ｍｇをオクタデシルシラン（ＯＤＳ）逆相カラム（ナカライテスク社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＡＲII、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）に注入した。次いで０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）及び０．１％トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）を使用して、Ｂ液の濃度を０％から５０％まで５０分間かけて直線的に増加する濃度勾配にて、１ｍｌ／分の流速で溶出させた。溶出液を経時的に採取し、各画分のオピオイド活性を測定したところ、アセトニトリル濃度が約３７．５〜３８．５％の範囲で溶出してくる画分において、オピオイド活性が認められた。尚、本実施例において、オピオイド活性は実施例３に示す方法によって測定した。
【００５６】
【発明の効果】
本発明のペプチド又はその塩は、オピオイド活性を有しているので、該ペプチド又はその塩を有効成分とする医薬組成物は、極めて少量の投与で、鎮痛又は麻酔作用；情動、呼吸、脈動、体温、消化管機能、摂食、免疫等の整調；インシュリンやソマトスタチン等のホルモンの分泌調節、電解質の吸収促進、心筋の収縮調節等の作用を示す可能性があり、鎮痛麻酔剤、催眠剤、消化管ホルモン分泌促進剤、電解質の吸収促進剤、胃腸輸送筋収縮による下痢改善剤としての利用が期待できる。
【００５７】
その場合に、本発明のペプチドおよびその塩は、水溶性の白色粉末であるため、そのままで、または水等に溶解させて経口および非経口のいずれかの方法によっても極めて簡単に投与する事ができる。
【００５８】
さらに、本発明のペプチドおよびその塩は、６個のアミノ酸が配列しただけの極めて簡単な構造を有する低分子量化合物であるため、化学合成によっても簡単に製造することができる。また、本発明のペプチドは、茶葉中のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼの酵素による加水分解物として得られるために安全性が高い。
【００５９】
上記ペプチドは、本発明の方法に基づいて、茶葉から抽出、精製することにより、又は、化学合成することにより、製造することができる。
【００６０】
【配列表】

【００６１】

【００６２】

【００６３】

【００６４】

【００６５】

【図面の簡単な説明】
【図１】抹茶の尿素可溶性蛋白質をペプシンで加水分解して得られたペプチド混合物のＯＤＳ逆相カラムクロマトグラフィーおける、２３０ｎｍの吸収によるクロマトグラム。左側縦軸は溶出液の２３０ｎｍにおける吸光度を、右側縦軸は溶離液中のアセトニトリル濃度を示す。
【図２】本発明のペプチドをマウス脳室内に投与した際の作用曲線下面積の平均値と標準偏差を示す。作用曲線下面積（秒×分）は、投与時から投与３０分後まで、５分間隔で痛覚に対する反応時間（秒）を測定し、各試験群の反応時間の平均値を投与後の時間経過に沿って３０分まで積分することにより算出したものであり、鎮痛作用の強弱を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a peptide having opioid activity such as analgesia and anesthesia, a method for producing the same, and a pharmaceutical composition containing the peptide or a salt thereof as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
A group of peptides having anesthesia and analgesic activity (opioid activity) similar to morphine are known as neuropeptides present in the brain, and are called opioid peptides. As such opioid peptides, 20 or more endogenous opioids such as enkephalin, β-endorphin, neoendorphin, dynorphin, leumorphin and the like have been reported.
[0003]
On the other hand, peptides having opioid activity have been found from proteins of various foods. These peptides are attracting attention as bioregulators of food origin. Exogenous opioid peptides derived from food include β-casomorphin derived from milk casein (1-7) (Brantl et al., 1979), β-casomorphin (1-5) (Henschen, 1979), β- Casomorphin (1-3) (Lottspeich et al., 1980), α-caseine xorphin (Loukas et al., 1980), and a peptide derived from wheat gluten (Japanese Patent Laid-Open No. 5-86094) are known.
[0004]
By the way, the chlorophyll of a green plant that performs photosynthesis contains an enzyme called rubisco (RuBisCO: ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase). This enzyme has the function of incorporating carbon dioxide into the Calvin circuit by producing two molecules of glyceric acid-3-phosphate from ribulose-1,5-diphosphate and carbon dioxide in the dark reaction of photosynthesis. It is said to be the most abundant enzyme on earth. To date, there is no known report that an opioid peptide derived from Rubisco has been isolated and its structure determined.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel opioid peptide.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have studied the urea-soluble protein of Matcha, and as a result, succeeded in isolating and identifying a peptide having opioid activity, thereby completing the present invention.
[0007]
That is, the present invention is as follows.
(1) An opioid peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(2) A method for producing an opioid peptide, comprising collecting an opioid peptide from a hydrolyzate obtained by hydrolyzing ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase with pepsin or pepsin and pancreatin.
(3) The method for producing an opioid peptide of (2), wherein the peptide is the peptide of (1).
(4) The method for producing an opioid peptide according to (2), wherein ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase is derived from tea leaves.
(5) Extracting a protein fraction soluble in a urea solution from tea leaves, hydrolyzing the fraction with pepsin or pepsin and pancreatin, and collecting an opioid peptide from the resulting hydrolyzate Manufacturing method.
(6) A pharmaceutical composition comprising one or more of the opioid peptides of (1) or physiologically acceptable salts thereof as an active ingredient.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0009]
<1> peptide of the peptide of the Invention The present invention consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, shows the opioid activity.
[0010]
The peptide of this invention can be manufactured with the manufacturing method of the opioid peptide of this invention mentioned later. In addition, the peptide of the present invention can also be synthesized by a general peptide chemical synthesis method.
[0011]
<2> Method for Producing Opioid Peptide A first form of the method for producing an opioid peptide of the present invention is a hydrolysis obtained by hydrolyzing ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase with pepsin or pepsin and pancreatin. A method for producing an opioid peptide, comprising collecting an opioid peptide from a product.
[0012]
In the above method, examples of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase include tea leaf-derived enzymes.
The second form of the method for producing the opioid peptide of the present invention is to extract a protein fraction soluble in urea solution from tea leaves, hydrolyze the same fraction with pepsin or pepsin and pancreatin, and use the resulting hydrolyzate. A method for producing an opioid peptide, comprising collecting an opioid peptide.
[0013]
In each of the above forms, examples of tea leaves include ground or ground tea leaves. Specifically, what is generally marketed as matcha is mentioned.
Below, based on the second form, it illustrates about the method of manufacturing an opioid peptide from green tea as a raw material, but ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase other than tea leaves or the same enzyme based on the first form Similarly, pepsin or pepsin and pancreatin treatment, and collection of opioid peptides can be performed.
[0014]
First, powdered green tea powder is dispersed and dissolved in 5M to saturated urea solution, then insoluble materials are removed by centrifugation or filtration, and a protein fraction soluble in the urea solution is extracted. Next, the protein in the fraction thus extracted is dialyzed and then hydrolyzed using pepsin or both pepsin and pancreatin.
[0015]
Examples of pepsin include those derived from porcine gastric mucosa, but the origin is not particularly limited in the present invention. Examples of pancreatin include those derived from porcine pancreas, and any pancreatin may be used in the present invention. In the present invention, pepsin may be used alone or in combination of two or more. The same applies to pancreatin.
[0016]
Hydrolysis is preferably performed under acidic conditions (pH 1.5 to 3.0) when pepsin is used. Also, when using both pepsin and pancreatin, react the enzyme under conditions suitable for the first enzyme, then adjust the conditions suitable for the second enzyme and react with the second enzyme. Good. At this time, when making it react with pancreatin, it is preferable to carry out on neutral or weakly alkaline conditions (pH 6.5-9.0).
For example, the urea-soluble protein of matcha is first hydrolyzed with pepsin in a state of being dispersed and dissolved in an acidic solution such as dilute hydrochloric acid, then neutralized or weakly alkaline, and then hydrolyzed with pancreatin.
[0017]
Pepsin and pancreatin may both be used in a free state, or those immobilized on a carrier may be used.
The amount of pepsin or pancreatin used in each case is, for example, about 5,000 to 100,000 units per 100 g of dried green tea urea soluble protein or ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase. Use it. As the activity, a 1% solution of Hammerstein casein manufactured by Merck & Co., USA was used as a substrate, and Anson-Kashihara modified method [edited by Shiro Akahori, “Enzyme Research Method”, Volume 2, page 237 (January 10, 1960, Asakura Shoten) Issue)]. The reaction is performed at 30 ° C. for 30 minutes, and the amount of enzyme required to release 1 μg of tyrosine equivalent per minute is defined as 1 unit.
[0018]
As more specific conditions, for example, a 7M urea extract corresponding to 2 g of green tea is dialyzed to remove urea, adjusted to pH 2.0, pepsin 5,000 units added, A condition of incubating at 37 ° C. for 5 hours can be mentioned. In addition, for example, a urea extract corresponding to 2 g of Matcha is dialyzed to remove urea, adjusted to pH 2.0, added with 5,000 units of pepsin, and incubated at 37 ° C. for 5 hours, Thereafter, the pH is adjusted to 7.5, 5,000 units of pancreatin are added, and the mixture is incubated at 37 ° C. for 5 hours.
After the reaction, pepsin or pancreatin is inactivated by heating at 90 ° C. for 10 minutes, for example. After the reaction, pepsin or pancreatin is inactivated by heating at 90 ° C. for 10 minutes, for example.
[0019]
The hydrolysis conditions were determined by hydrolyzing a certain amount of urea-soluble protein in tea leaves under various conditions, measuring the opioid activity of the obtained hydrolyzate, and determining the conditions under which the highest active hydrolyzate was obtained in advance. It is good to set. Conditions include pH, temperature, enzyme amount, and treatment time.
[0020]
Next, an opioid peptide is collected from the hydrolyzate obtained as described above. As an opioid peptide extract | collected here, the peptide shown to sequence number 1 is mentioned, for example.
[0021]
Specifically, a method of fractionating the hydrolyzate by various chromatography and collecting a fraction showing opioid activity can be mentioned. Examples of the chromatography include high performance liquid chromatography (HPLC) using a reverse crude column. Examples of the reverse phase column include an octadecylsilane (ODS) column, a nitrophenethyl column, a cyanopropyl column, and the like.
[0022]
The amino acid sequence of the finally obtained peptide is determined using, for example, a protein sequencer (type 492) manufactured by Applied Biosystems. The peptide shown in SEQ ID NO: 1 was isolated and identified from matcha as described above.
[0023]
Moreover, the peptide represented by SEQ ID NO: 1 can also be obtained by chemical synthesis. Although the peptide synthesis method is not particularly limited, the synthesis can be performed using a commercially available automatic peptide synthesizer according to a standard protocol attached to the apparatus. The target peptide can be purified from the synthesis reaction product by high performance liquid chromatography using an ODS column.
[0024]
<3> Pharmaceutical composition of the present invention The pharmaceutical composition of the present invention comprises the peptide of the present invention or a physiologically acceptable salt thereof as an active ingredient. Examples of the salt include sodium salt and potassium salt.
[0025]
Since the peptide of the present invention exhibits opioid activity in an extremely small amount, analgesia or anesthetic action; emotion, breathing, pulsation, body temperature, gastrointestinal function, feeding, immunity, etc .; secretion regulation of hormones such as insulin and somatostatin, It is expected to show actions such as promotion of electrolyte absorption and regulation of myocardial contraction. Therefore, it can be expected to be used as an analgesic anesthetic, hypnotic, gastrointestinal hormone secretagogue, electrolyte absorption promoter, intestinal peristalsis suppression or gastrointestinal transport muscle contraction ameliorating agent.
[0026]
Moreover, the peptide of this invention can also be added to food and feed, and can also be administered with them. The peptide of the present invention is derived from ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase, a protein contained in food, and is considered to be highly safe.
[0027]
Furthermore, the peptides of the present invention can be used for screening opioid antagonists that inhibit opioid action.
In the pharmaceutical composition of the present invention, the peptide or salt thereof to be contained may be a single peptide or a mixture of two or more.
[0028]
A suitable dose of the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately set depending on conditions such as age, weight, sex, symptom, animal type, etc. of the human or animal to be administered. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered either orally or parenterally, and can be administered alone or together with a solid carrier or liquid carrier usually used in the pharmaceutical industry. Or may be used in combination or in combination with other drugs.
[0029]
The administration form can be any form such as tablet, pill, granule, capsule, powder, aqueous solution, injection and the like.
[0030]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0031]
[Example 1]
Preparation of opioid peptide from pepsin hydrolyzate of matcha urea-soluble protein (1) Disperse and dissolve 2 g of matcha powder in 200 ml of 7M urea solution, then centrifuge at 3,500 G for 20 minutes to remove insoluble matter, and dialyze After removing urea, 1N hydrochloric acid was added to adjust the pH to 2.0.
[0032]
To this solution, 5000 units of pepsin (manufactured by Sigma, USA) was added and incubated at 37 ° C. for 5 hours. After completion of the reaction, heating at 90 ° C. for 10 minutes to inactivate pepsin, centrifuging at 3,500 G for 20 minutes to remove insoluble matter, freeze-drying the resulting supernatant, About 0.2 g of a hydrolyzate of urea-soluble protein was obtained.
[0033]
(2) 1 mg of the green tea urea-soluble protein hydrolyzate obtained in (1) above was added to an octadecylsilane (ODS) reversed-phase column (Nacalai Tesque, Cosmosil 5C ₁₈ -ARII, inner diameter 4.6 mm, length 150 mm). Injected into. Next, using a 0.1% aqueous trifluoroacetic acid solution (liquid A) and an acetonitrile solution containing 0.1% trifluoroacetic acid (liquid B), the concentration of liquid B was changed from 0% to 50% over 50 minutes. Elution was performed at a flow rate of 1 ml / min with a linearly increasing concentration gradient. A chromatogram obtained by measuring absorbance at a wavelength of 230 nm is shown in FIG. The eluate was collected over time and the opioid activity of each fraction was measured. As a result, the acetonitrile concentration indicated by the arrow in the chromatogram shown in FIG. 1 was eluted in the range of about 37.5 to 38.5%. Opioid activity was observed in the coming fraction. In this example, opioid activity was measured by the method shown in Example 3.
[0034]
(3) Using 50 mg of the green tea urea-soluble protein hydrolyzate obtained in (1) above, the same steps as in (2) above were repeated to obtain an active fraction. Next, these fractions were injected into a nitrophenethyl reverse phase column (Nacalai Tesque, Cosmosil 5NPE, inner diameter 4.6 mm, length 150 mm) and eluted under the same conditions as in (2) above. When the opioid activity of each eluted fraction was measured, opioid activity was observed in the fraction eluted with an acetonitrile concentration in the range of about 39 to 40%.
[0035]
(4) Next, the opioid active fraction obtained in (3) above was applied to a reverse phase chromatography column using a cyanopropyl reverse crude column (Nacalai Tesque, Cosmosil 5CN, inner diameter 4.6 mm, length 150 mm). And eluted under the same conditions as in (2) and (3) above. Each eluted fraction was collected and its opioid activity was measured. As a result, opioid activity was observed in the peak fraction having an acetonitrile concentration in the range of about 26 to 27%.
[0036]
(5) The opioid active fraction obtained in (4) above was collected and concentrated to dryness. When the amino acid sequence of this dried product was examined using a protein sequencer type 492 manufactured by Applied Biosystems, L-Tyr, L-Pro, L-Leu, L-Asp, L-Leu and L-Phe has been liberated. From this, it was confirmed that all of the constituent amino acids are peptides represented by SEQ ID NO: 1 which are L-amino acids.
[0037]
When the yield (%) of the peptide represented by SEQ ID NO: 1 from the powdered green tea powder was determined from its molecular weight and the molecular extinction coefficient at 280 nm, it was confirmed to be about 0.01%.
[0038]
The peptide shown in SEQ ID NO: 1 was found to be derived from the enzyme because the structure matched with residues 103 to 108 of the large subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase.
[0039]
[Example 2]
Production of the peptide of the present invention by synthesis The peptide represented by SEQ ID NO: 1 was synthesized by the following method. Commercially available Fmoc (N-α-9-fluorenylmethoxycarbonyl) -Phe-Wang resin (substitution rate 0.5 meq / g) 0.6 g, dimethylformamide containing 20% piperidine as a peptide synthesizer (Protein Technology) In the reactor of PS-3), the reaction was carried out at room temperature to remove the Fmoc group.
[0040]
Next, the Phe-resin from which the Fmoc group was removed was washed with dimethylformamide, and 1 mmol of Fmoc-Leu and 1 mmol of HBTU (2- (1H-Benzotriazole-1-yl) -1,1,3, 3-tetramethyluronium hexafluorophosphate O-Benzotriazole-1-yl-N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate) containing 0.4 ml of 0.4 MN-methylmorpholine in dimethylformamide and mixed in a reaction vessel at room temperature For 20 minutes with stirring.
[0041]
The resin obtained above was washed with dimethylformamide to obtain Fmoc-Leu-Phe-resin. Subsequently, in the same manner as described above, the removal of the Fmoc group and the coupling of Fmoc-Asp (O-tBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Pro, and Fmoc-Tyr (tBu) were repeated, and Fmoc-Tyr (tBu)- A product consisting of Pro-Leu-Asp (OtBu) -Leu-Phe-resin was obtained.
[0042]
The resin was reacted in trifluoroacetic acid containing 5% anisole and 5% water for 1 hour at room temperature to release the peptide from the resin. Thereafter, the peptide was precipitated by adding diethyl ether to obtain 150 mg of a crude peptide. This was purified by reverse phase chromatography using an octadecylsilane (ODS) reverse phase column (Cosmosil 5C18-ARII, manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) to obtain 40 mg of the final product. The amino acid composition (molar ratio) was Tyr: Pro: Leu: Asp: Leu: Phe = 1: 1: 1: 1: 1: 1: 1.
[0043]
This product was further analyzed by the same protein sequencer used in Example 1, and was found to be a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[0044]
[Example 3]
Peptides consisting of the peptides bioactive (1) Opioid activity of each fraction in the measurement above Example 1 opioid activity, and Example 2 with synthesized SEQ ID NO: 1 amino acid sequence of the present invention as well as the known opioid peptides, All of the opioid activities were measured as follows.
[0045]
The vas deferens was excised from an ICR male mouse (body weight 30-35 g). Two extracted vas deferens were connected to an isotonic transducer (Nihon Koden Kogyo Co., Ltd .: TB612-T), and a tension of 0.4 g was applied.
[0046]
A 2 ml Magnus tube was filled with Krebs isotonic solution (NaCl 118 mM, KCl 4.75 mM, CaCl ₂ 2.54 mM, NaHCo ₃ 25 mM, KH ₂ PO ₄ 1.19 mM, glucose 11 mM) and kept warm at 36 ° C. . The vas deferens was immersed in this solution, and aeration (O ₂ 95%: CO ₂ 5%) was performed from the cylinder. After stabilizing by performing aeration for about 2 hours, the mouse vas deferens was electrically contracted by applying an electrical stimulus of 1 msec at 30V.
[0047]
After the electrical contraction is stabilized, the sample is added in the presence of L-Lew-L-Lew (2 mM), bestatin (30 μM), thiophane (0.3 μM), and captopril (10 μM) to avoid degradation of the peptide by peptidase. Changes in the electroconstriction of mouse vas deferens were recorded with a recorder. The opioid activity was determined by suppression of electrical contraction after addition of the sample and cancellation of suppression by addition of 20 μl of 10 ⁻⁴ M naloxone. And an electrical contraction of the mouse vas deferens was measured 50% inhibition concentration (IC _50).
[0048]
As a result, the IC ₅₀ of the active fraction obtained in Example 1 and the peptide obtained in Example 2 was found to be 30 μM. As controls, peptides with known opioid activity, gluten exorphin A (derived from wheat gluten, SEQ ID NO: 2), α-casein exorphin (derived from milk α-casein, SEQ ID NO: 3) Table 1 shows the IC ₅₀ when the opioid activity of gliadolphin (derived from wheat α-gliadin, SEQ ID NO: 4) was measured in the same manner as described above.
[0049]
[Table 1]

[0050]
From the results in Table 1, it can be seen that the opioid peptide of the present invention has opioid activity at a low concentration.
[0051]
(2) Analgesic action A ddY mouse having a body weight of about 25 g was subjected to an experiment after confirming that pain sensation was normal. Confirmation of mouse pain sensation is whether or not there is a reaction such as biting to the clip within 2 seconds when the base of the tail is pinched with a 3 cm long arterial clip with pinching strength adjusted to 250 g Judged by. Twenty-four mice that had been confirmed to have normal pain sensation in advance were divided into 4 groups of 6 mice, one group containing 10 μl of physiological saline, and the other 3 groups used in Example 1 or Example 2. Each of the obtained peptides was dissolved in 10 μl of physiological saline in an amount of 10, 30, 100 nmol and administered into the ventricle. Then, before the administration and 5, 10, 15, 20, 25, and 30 minutes after the administration, the mouse's tail was pinched with the clip, and the time until the reaction was shown with respect to the clip was recorded. The records of individuals that did not respond for 6 seconds or longer were uniformly 6 seconds.
[0052]
The time until the mouse responds (seconds) is plotted on the vertical axis, the elapsed time (min) after administration is plotted on the horizontal axis, and the results of each measurement time are connected by a line for each test group. The lower area (area under the action curve) was calculated and shown in FIG. The area under the curve was significantly larger in the group administered with the peptide obtained in Example 1 or Example 2 compared to the control administered with physiological saline, and the peptide of the present invention was actually analgesic in the brain. It was found to show an effect.
[0053]
[Example 4]
Preparation of opioid peptide from pepsin and pancreatin hydrolyzate of matcha urea soluble protein (1) Disperse and dissolve 2 g of matcha powder in 200 ml of 7M urea solution, and then centrifuge at 3,500 G for 20 minutes to remove insoluble matter. After removing the urea by dialysis, 1N hydrochloric acid was added to adjust the pH to 2.0.
[0054]
To this solution, 5,000 units of pepsin (Sigma, USA) were added and incubated at 37 ° C. for 5 hours. After completion of the reaction, 1N sodium hydroxide was added to adjust the pH to 7.5. To this solution, 5,000 units of pancreatin (Sigma, USA) were added and incubated at 37 ° C. for 5 hours. After completion of the reaction, the reaction mixture was heated at 90 ° C. for 10 minutes to inactivate pepsin and pancreatin, centrifuged at 3,500 G for 20 minutes to remove insoluble matters, and the resulting supernatant was lyophilized to obtain pepsin and About 0.2 g of a urea-soluble protein hydrolyzate of green tea was obtained with pancreatin.
[0055]
(2) 1 mg of the green tea urea-soluble protein hydrolyzate obtained in (1) above was injected into an octadecylsilane (ODS) reversed-phase column (Nacalai Tesque, Cosmosil 5C18-ARII, inner diameter 4.6 mm, length 150 mm). did. Next, using 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution (liquid A) and acetonitrile solution (liquid B) containing 0.1% trifluoroacetic acid, the concentration of liquid B was changed from 0% to 50% over 50 minutes. Elution was performed at a flow rate of 1 ml / min with a linearly increasing concentration gradient. The eluate was collected over time, and the opioid activity of each fraction was measured. As a result, opioid activity was observed in the fraction eluted with an acetonitrile concentration in the range of about 37.5 to 38.5%. In this example, opioid activity was measured by the method shown in Example 3.
[0056]
【The invention's effect】
Since the peptide of the present invention or a salt thereof has opioid activity, a pharmaceutical composition containing the peptide or a salt thereof as an active ingredient can be used for analgesia or anesthetic action; Body temperature, gastrointestinal tract function, feeding, immunity, etc .; may regulate hormone secretion such as insulin and somatostatin, promote absorption of electrolytes, regulate myocardial contraction, analgesic anesthetics, hypnotics, It can be expected to be used as a gastrointestinal hormone secretion promoter, electrolyte absorption promoter, and diarrhea ameliorating agent by gastrointestinal transport muscle contraction.
[0057]
In this case, since the peptide of the present invention and its salt are water-soluble white powder, it can be administered very easily as it is or by dissolving it in water or the like by either oral or parenteral methods. it can.
[0058]
Furthermore, since the peptides and salts thereof of the present invention are low molecular weight compounds having a very simple structure in which only 6 amino acids are arranged, they can be easily produced by chemical synthesis. The peptide of the present invention is highly safe because it is obtained as a hydrolyzate of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase in tea leaves.
[0059]
The peptide can be produced by extraction and purification from tea leaves or chemical synthesis based on the method of the present invention.
[0060]
[Sequence Listing]

[0061]

[0062]

[0063]

[0064]

[0065]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a chromatogram by absorption at 230 nm in ODS reverse phase column chromatography of a peptide mixture obtained by hydrolyzing matcha urea-soluble protein with pepsin. The left vertical axis represents the absorbance of the eluate at 230 nm, and the right vertical axis represents the acetonitrile concentration in the eluent.
FIG. 2 shows the mean value and standard deviation of the area under the action curve when the peptide of the present invention is administered into the mouse ventricle. The area under the action curve (seconds x minutes) was measured from the time of administration to 30 minutes after the administration, by measuring the reaction time (seconds) for pain sensation at 5-minute intervals, and the average value of the reaction time of each test group after the administration Calculated by integrating up to 30 minutes along the line and shows the strength of the analgesic action.

Claims

An opioid peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

A method for producing an opioid peptide, comprising collecting an opioid peptide from a hydrolyzate obtained by hydrolyzing ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase with pepsin or pepsin and pancreatin.

The method for producing an opioid peptide according to claim 2, wherein the peptide is the peptide according to claim 1.

The method for producing an opioid peptide according to claim 2, wherein the ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase is derived from tea leaves.

Extracting a protein fraction soluble in a urea solution from tea leaves, hydrolyzing the fraction with pepsin or pepsin and pancreatin, and collecting the opioid peptide from the resulting hydrolyzate, a method for producing an opioid peptide .

A pharmaceutical composition comprising one or more of the opioid peptides according to claim 1 or physiologically acceptable salts thereof as an active ingredient.