JP4413523B2 - Cell death inhibitor - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞死抑制剤、細胞死抑制剤のスクリーニングなどに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞死は死に至る過程の特徴からネクローシスとアポトーシスの二種類に分けられる。ネクローシスは、物理的・化学的要因などで不慮に起こる細胞死である。それに対してアポトーシスは、発生過程での形態、組織の形成、ホメオスタシスの維持、生体の防御などに深く関わり、個体の生命維持に重要な役割を持つ細胞の死で、その過程は遺伝子によって制御されている。これら細胞死の過程が先天的または後天的に障害されると、細胞死が過剰に誘発または抑制され、様々な臓器の機能障害を引き起こして病気に至る（最新医学 第54巻、825頁、1999年）。
近年、種々の疾患の発症または進展に、これら細胞死が深く関わっていることが明らかとなってきた（R.Sanders Williams, The New England Journal of Medicine 第341巻、759頁、1999年）。例えば、細胞死の増加に起因する疾患としては、神経変性疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性など）、虚血性疾患（例、心筋梗塞、心不全、脳卒中、脳梗塞、虚血性急性腎不全など）、骨・関節疾患（例、骨粗鬆症、変形性関節症、リウマチなど）、骨髄異形成疾患（例、再生不良性貧血など）、肝疾患（例、アルコール性肝炎、ウイルス性肝炎など）、糖尿病、エイズなどが挙げられる〔日本臨床、第54巻、1996年；別冊・医学のあゆみ、8頁、1997年など〕。マクロファージ遊走阻止因子（MIF）は、免疫担当細胞や脳下垂体などから生体侵襲に即応して産生される炎症性サイトカインであり、炎症性サイトカインカスケードの上流に位置して炎症反応を制御することが知られている（Annual Reports in Medicinal Chemistry、第33巻、24頁、1998年；Advances in Immunology、第66巻、197頁、1997年）。さらにMIFは脂肪細胞、癌細胞などの増殖、分化に関与し、免疫応答だけでなく様々な生体反応に重要な役割を果たしていることが明らかになりつつある（International Journal of Molecular Medicine、第2巻、17頁、1998年）。MIFを発現する細胞・組織としては、T細胞、単球・マクロファージ、メサンギウム細胞、尿細管上皮細胞、角膜上皮細胞、肝細胞、卵細胞、セルトリ細胞、ケラチノサイト、骨芽細胞、滑膜細胞、脂肪細胞、アストロサイト、癌細胞、粘膜、脳下垂体などが知られている。MIFがヒトの疾患に関与する例として、リウマチ患者の滑膜液や血清、急性呼吸促迫症候群患者の肺胞洗浄液、腎臓移植を受けた患者の拒絶反応時における尿、および急性心筋梗塞、糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、アトピー性皮膚炎患者で血清中のMIF濃度が健常人と比べて顕著に上昇していることを示した報告などが挙げられ、また、MIFの機能を抑制することが症状の改善につながることを示した例として、抗MIF中和抗体を用いた実験例を挙げることができる。即ち、腎炎、肝炎、肺炎、関節炎、エンドドキシンショックなどの動物病態モデルでは、抗MIF中和抗体の投与群で明らかな改善効果が認められているInternational Journal of Molecular Medicine、第2巻、17頁、1998年）。
このMIFと細胞死の関係に関しては、マウスB細胞株で抗IgM抗体によって引き起こされるアポトーシスが、MIFの産生低下によって抑制されることが報告されている（非特許文献１ Microbiology and Immunology、第43巻、61頁、1999年）。しかしながら、マウスB細胞株以外には、MIFと細胞死の関係は知られておらず、さらにMIFが関与する細胞死のメカニズムについての報告はない。
【非特許文献１】
Microbiology and Immunology、第43巻、61頁、1999年
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
最近、細胞死の研究、特にアポトーシス研究の発展につれてその誘導を制御する因子が次々と明らかにされてきている。その結果、それら制御因子を標的として探索した低分子化合物などを用いて、直接アポトーシスを抑制する試みが数多く行われるようなってきた。中でもアポトーシスの最終段階で働くカスパーゼを標的にしたカスパーゼ阻害剤の研究が盛んに行われているが、臨床応用されたものはない〔実験医学、第19巻、1726頁、2001年〕。またネクローシスに関してもHSP70などのシャペロンを対象にした研究が行われているが、やはり臨床応用されたものはない（Essays in Biochemistry、第32巻、17頁、1997年）。そのため安全で強力な細胞死抑制剤、およびこの細胞死抑制剤を探索するためのスクリーニング系の開発が切望されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
以上のような状況を鑑み、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、マクロファージ遊走阻止因子（MIF）に対するモノクローナル抗体およびMIFに結合する低分子化合物などが、血清除去によるラット初代心筋細胞の細胞死を抑制することを見出した。さらにこのMIFに結合する低分子化合物が、ドキソルビシンやHMG-CoA還元酵素阻害薬による心筋細胞死、NOによる軟骨細胞死などをも抑制することを、およびAntioxidant response element（ARE）制御下にある遺伝子の発現を上昇させることも見出した。 これらの知見に基づいてさらに検討を重ね、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
（１） マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質を含有してなる細胞死抑制剤、
（２） マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、マクロファージ遊走阻止因子に対する抗体である上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（３） 抗体がモノクローナル抗体である上記（２）記載の細胞死抑制剤、
（３ａ） モノクローナル抗体が、ＢＷＳ４８−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９９１）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得るＢＷＳ４８−１ａで標示されるモノクローナル抗体である上記（３）記載の細胞死抑制剤、
（４） マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、式
【化２】
〔式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族複素環基または置換基を有していてもよいアミノを示す。〕で表される化合物またはその塩である上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（５） マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、メタロポルフィリン類である上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（５ａ） メタロポルフィリン類が、ヘミンまたはヘマチンである上記（５）記載の細胞死抑制剤、
（６） マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、Antioxidant response element制御下にある遺伝子の発現を促進する物質である上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（６ａ）Antioxidant response element制御下にある遺伝子が、ヘムオキシゲナーゼ−１、Liver glutathione S-transferase Ya subunit、Liver glutathione S-transferase Yc subunit、Glutathione S-transferase Yb subunit、Glutathione S-transferase Yc1 subunit、Gammma-glutamylcysteine synthetase、NAD(P)H:quinone reductase、UDP-glucuronosyltransferase, exon 1、Bilirunin-specific UDP-glucuronosyltransferase、またはNAD(P)H-menadione oxidereductaseである上記（６）記載の細胞死抑制剤、
（６ｂ）Antioxidant response element制御下にある遺伝子が、ヘムオキシゲナーゼ−１である上記（６）記載の細胞死抑制剤、
（７） マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、Antioxidant response element制御下にある遺伝子タンパク質の産生を亢進する物質である上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（７ａ）Antioxidant response element制御下にある遺伝子が、ヘムオキシゲナーゼ−１（Heme oxygenase-1）、Liver glutathione S-transferase Ya subunit、Liver glutathione S-transferase Yc subunit、Glutathione S-transferase Yb subunit、Glutathione S-transferase Yc1 subunit、Gammma-glutamylcysteine synthetase、NAD(P)H:quinone reductase、UDP-glucuronosyltransferase, exon 1、Bilirunin-specific UDP-glucuronosyltransferase、またはNAD(P)H-menadione oxidereductaseである上記（７）記載の細胞死抑制剤、
（７ｂ）Antioxidant response element制御下にある遺伝子が、ヘムオキシゲナーゼ−１である上記（７）記載の細胞死抑制剤、
（８） マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質が、Antioxidant response element制御下にある遺伝子タンパク質の活性を促進する物質である上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（８ａ）Antioxidant response element制御下にある遺伝子が、ヘムオキシゲナーゼ−１（Heme oxygenase-1）、Liver glutathione S-transferase Ya subunit、Liver glutathione S-transferase Yc subunit、Glutathione S-transferase Yb subunit、Glutathione S-transferase Yc1 subunit、Gammma-glutamylcysteine synthetase、NAD(P)H:quinone reductase、UDP-glucuronosyltransferase, exon 1、Bilirunin-specific UDP-glucuronosyltransferase、またはNAD(P)H-menadione oxidereductaseである上記（８）記載の細胞死抑制剤、
（８ｂ）Antioxidant response element制御下にある遺伝子が、ヘムオキシゲナーゼ−１である上記（８）記載の細胞死抑制剤、
（９） マクロファージ遊走阻止因子を用いることを特徴とする細胞死抑制剤のスクリーニング方法、
（１０） 細胞死抑制剤が、Antioxidant response element制御下にある遺伝子の発現を促進する物質である上記（９）記載のスクリーニング方法、
（１１） (i) マクロファージ遊走阻止因子および標識されたマクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する化合物を混合した場合、および（ii）試験化合物、マクロファージ遊走阻止因子および標識されたマクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する化合物を混合した場合における、マクロファージ遊走阻止因子に結合した標識化合物の結合量をそれぞれ測定し、比較することを特徴とする上記（９）記載のスクリーニング方法、
（１２） マクロファージ遊走阻止因子を含有することを特徴とする細胞死抑制剤のスクリーニング用キット、
（１３） マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質を用いることを特徴とするマクロファージ遊走阻止因子の定量方法、
（１４） 上記（１３）記載の定量方法を用いるマクロファージ遊走阻止因子が関与する疾患の診断方法、
（１４ａ） 疾患が、心疾患、神経変性疾患、脳血管疾患、中枢神経感染症、外傷性疾患、脱髄疾患、骨・関節疾患、腎疾患、肝疾患、骨髄異形成疾患、動脈硬化症、糖尿病、肺高血圧症、敗血症、炎症性腸疾患、自己免疫性疾患、エイズまたは癌である上記（１４）記載の診断方法、
（１５） 心疾患、神経変性疾患、脳血管疾患、中枢神経感染症、外傷性疾患、脱髄疾患、骨・関節疾患、腎疾患、肝疾患、骨髄異形成疾患、動脈硬化症、糖尿病、肺高血圧症、敗血症、炎症性腸疾患、自己免疫性疾患、移植臓器の拒絶時の障害、エイズもしくは癌の予防・治療剤または移植用臓器の保護剤である上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（１６） 炎症性腸疾患の予防・治療剤である上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（１７） さらにＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、フィブラート系高脂血症薬および（または）抗癌剤を組み合わせてなる上記（１）記載の細胞死抑制剤、
（１８） 哺乳動物に対して、マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質の有効量を投与することを特徴とする細胞死抑制方法、
（１８ａ） 哺乳動物に対して、マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質の有効量を投与することを特徴とする炎症性腸疾患の予防・治療方法、
（１９） 細胞死抑制剤を製造するための、マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質の使用、
（１９ａ） 炎症性腸疾患の予防・治療剤を製造するための、マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質の使用などに関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
マクロファージ遊走阻止因子（MIF）に結合する能力を有する物質としては、MIFに結合する能力を有する物質であればいずれでもよい。MIFの機能を調節する物質であってもよい。
MIFに結合する能力を有する物質としては、例えば、（a）MIFに対する抗体、（b）式
【化３】
〔式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族複素環基または置換基を有していてもよいアミノを示す。〕で表される化合物またはその塩、（c）メタロポルフィリン類、（d）WO 03/020719号公報に記載されている化合物またはその塩、（e）WO 02/094203号公報に記載されている化合物またはその塩などが挙げられる。
上記（a）のMIFに対する抗体としては、MIFに特異的に反応するものであればよく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。好ましい具体例としては、BWS48-1（FERM BP-7991）で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得る、BWS48-1aで標示されるモノクローナル抗体などが挙げられる。
【０００６】
該抗体は、ＭＩＦを抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（i）モノクローナル抗体産生細胞の作製
温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にＭＩＦ自体、またはＭＩＦおよび担体または希釈剤などとともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられる。マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、標識化ＭＩＦと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Nature、256巻、495頁 (1975年)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
【０００７】
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ii）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【０００８】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
ポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいは免疫抗原（タンパク質抗原）とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から目的とする抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【０００９】
上記（b）の式（I）中、Ｒで示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「炭化水素基」としては、例えばアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキルなどが挙げられる。
該「アルキル」としては、例えばＣ１−６アルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなど）などが挙げられる。
該「シクロアルキル」としては、例えばＣ３−６シクロアルキル（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなど）などが挙げられる。
該「シクロアルキルアルキル」としては、例えばＣ４−７シクロアルキルアルキル基（例、シクロプロピルメチル、シクロイブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチルなど）などが挙げられる。
該「アルケニル」としては、例えばＣ２−６アルケニル（例えば、ビニル、アリル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−２−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニルなど）などが挙げられる。
該「アルキニル」としては、例えばＣ２−６アルキニル（例えば、エチニル、プロパルギル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ヘキシニルなど）などが挙げられる。
該「アリール」としては、例えばＣ６−１４アリール（例、フェニル、ナフチル、ビフェニル、インダニル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチルなど）などが挙げられる。
該「アラルキル」としては、例えばＣ７−１６アラルキル（例、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、ナフチルメチル、インダニルメチルなど）などが挙げられる。
【００１０】
Ｒで示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「置換基」としては、例えば、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）、芳香族複素環基、オキソ、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシなど）、カルボキシ、Ｃ１−４アルキル−カルボニル（例、アセチル、プロピオニルなど）、Ｃ６−１４アリール−カルボニル（例、ベンゾイルなど）、Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル（例、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニルなど）、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル（例、フェノキシカルボニルなど）、Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル（例、ベンジルオキシカルボニルなど）、カルバモイル、モノ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイルなど）、ジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル（例、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイルなど）、ハロゲン化されていてもよいＣ６−１４アリール−カルバモイル、５ないし６員複素環カルバモイル（例、２−ピリジルカルバモイル、３−ピリジルカルバモイル、４−ピリジルカルバモイル、２−チエニルカルバモイル、３−チエニルカルバモイルなど）、置換基を有していてもよい５ないし７員飽和環状アミノ−カルボニルなどが挙げられる。このうち、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ１−４アルコキシ−カルボニル、５ないし６員複素環カルバモイル、５ないし７員飽和環状アミノ−カルボニルなどが好ましい。
【００１１】
該「芳香族複素環基」としては、例えば、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１または２種、１ないし４個のヘテロ原子を含む５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）芳香族複素環から任意の１個の水素原子を除いてできる１価基などが挙げられる。該「５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）の芳香族複素環」としては、例えば、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、ベンゾ［ｂ］フラン、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンズイソチアゾール、ナフト［２，３−ｂ］チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドール、イソインドール、１Ｈ−インダゾール、プリン、４Ｈ−キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルバゾール、β−カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナジン、チアゾール、イソチアゾール、フェノチアジン、イソオキサゾール、フラザン、フェノキサジンなどの芳香族複素環、またはこれらの環（好ましくは単環）が１ないし複数個（好ましくは１または２個）の芳香環（例、ベンゼン環等）と縮合して形成された環などが挙げられる。
該「芳香族複素環基」としては、例えばチエニル（例、２−チエニル、３−チエニル）、フリル（例、２−フリル、３−フリル）、ピリジル（例、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、キノリル（例、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、８−キノリル）、イソキノリル（例、１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル）、ピラジニル、ピリミジニル（例、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル）、ピロリル（例、３−ピロリル）、イミダゾリル（例、２−イミダゾリル）、ピリダジニル（例、３−ピリダジニル）、イソチアゾリル（例、３−イソチアゾリル）、イソオキサゾリル（例、３−イソオキサゾリル）、インドリル（例、１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル）、ベンゾチアゾリル（例、２−ベンゾチアゾリル）、ベンゾチエニル（例、２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンゾフラニル（例、２−ベンゾ［ｂ］フラニル、３−ベンゾ［ｂ］フラニル）などが挙げられる。このうち、例えば炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし３個のヘテロ原子を含む５ないし６員の複素環基（例、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジルなどのピリジル）が好ましい。
【００１２】
該「ハロゲン化されていてもよいＣ６−１４アリール−カルバモイル」としては、例えば、１ないし３個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素など）を有していてもよいＣ６−１４アリール−カルバモイル（例、フェニルカルバモイル、１−ナフチルカルバモイル、２−ナフチルカルバモイルなど）などが挙げられる。
該「置換基を有していてもよい５ないし７員飽和環状アミノ−カルボニル」の「５ないし７員飽和環状アミノ−カルボニル」としては、例えば、ピロリジン−１−イルカルボニル、ピペリジノカルボニル、ピペラジン−１−イルカルボニル、モルホリノカルボニルなどが挙げられる。該「置換基を有していてもよい５ないし７員飽和環状アミノ−カルボニル」の「置換基」としては、Ｃ１−３アルキル（例、メチルなど）、フェニル、ベンジルなどが１ないし２個挙げられる。
該「炭化水素基」は、例えば上記置換基を、置換可能な位置に１ないし５個、好ましくは１ないし３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一または異なっていてもよい。
【００１３】
Ｒで示される「置換基を有していてもよい芳香族複素環基」の「芳香族複素環基」としては、例えば、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１または２種、１ないし４個のヘテロ原子を含む５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）芳香族複素環から任意の１個の水素原子を除いてできる１価基などが挙げられる。該「５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）の芳香族複素環」としては、例えば、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、ベンゾ［ｂ］フラン、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンズイソチアゾール、ナフト［２，３−ｂ］チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドール、イソインドール、１Ｈ−インダゾール、プリン、４Ｈ−キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルバゾール、β−カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナジン、チアゾール、イソチアゾール、フェノチアジン、イソオキサゾール、フラザン、フェノキサジンなどの芳香族複素環、またはこれらの環（好ましくは単環）が１ないし複数個（好ましくは１または２個）の芳香環（例、ベンゼン環等）と縮合して形成された環などが挙げられる。
該「芳香族複素環基」としては、例えばチエニル（例、２−チエニル、３−チエニル）、フリル（例、２−フリル、３−フリル）、ピリジル（例、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、キノリル（例、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、８−キノリル）、イソキノリル（例、１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル）、ピラジニル、ピリミジニル（例、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル）、ピロリル（例、３−ピロリル）、イミダゾリル（例、２−イミダゾリル）、ピリダジニル（例、３−ピリダジニル）、イソチアゾリル（例、３−イソチアゾリル）、イソオキサゾリル（例、３−イソオキサゾリル）、インドリル（例、１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル）、ベンゾチアゾリル（例、２−ベンゾチアゾリル）、ベンゾチエニル（例、２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンゾフラニル（例、２−ベンゾ［ｂ］フラニル、３−ベンゾ［ｂ］フラニル）などが挙げられる。このうち、例えば炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし３個のヘテロ原子を含む５ないし６員の複素環基（例、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジルなどのピリジル）が好ましい。
【００１４】
Ｒで示される「置換基を有していてもよい芳香族複素環基」の「置換基」としては、例えば、前記「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「置換基」と同様のものが同個数挙げられる。このうち、ヒドロキシなどが好ましい。
【００１５】
Ｒで示される「置換基を有していてもよいアミノ」としては、例えばアミノ、グアニジノ、置換基を有しているアミノ、置換基を有しているグアニジノなどが挙げられる。
該「置換基を有しているアミノ」および「置換基を有しているグアニジノ」の「置換基」としては、例えば、前記Ｒで示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」などが挙げられる。
Ｒの好ましい例としては、ベンジル、ベンゾイルメチル、３−ピリジルアミノカルボニルメチル、４−クロロフェニルアミノカルボニルメチル、エトキシカルボニルメチル、ピペリジノカルボニルメチル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、３−ヒドロキシ−２−ベンゾ［ｂ］フラニル、グアニジノなどが挙げられる。
【００１６】
また、式（I）で表される化合物には、式
【化４】
〔式中、ＸはＣＨまたは窒素原子、Ｒ’はＲからＸ−Ｈを除いた基を示す。〕で表される互変異性体およびその塩が存在しうる。式（I）で表される化合物またはその塩〔以下、化合物（I）と略記することもある〕は、該互変異性体ならびにその塩、およびこれらと化合物（I）との混合物も含む。
【００１７】
式（I）で表される化合物および互変異性体の「塩」としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ,Ｎ'-ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
化合物（I）として具体的には、後述の参考例１〜５の化合物などが挙げられる。
化合物（I）は、市販品を購入してもよく、あるいは自体公知の方法またはそれに準じた方法により製造できる。
【００１８】
上記（c）のメタロポルフィリン類としては、例えば、ヘミン、ヘマチン、Sn(IV) protoporphyrin IX、Zn(II) protoporphyrin IX、Co(III) protoporphyrin IXなどがあげられる。
【００１９】
ＭＩＦに結合する能力を有する物質は、優れた細胞死抑制作用を有する。例えば、酸化ストレスによる細胞死、血清除去による細胞死、増殖因子の欠乏による細胞死、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬による細胞死、抗癌剤による細胞死、ＮＯによる細胞死、アミロイドβタンパク質による細胞死などを抑制する。
さらに、ＭＩＦに結合する能力を有する物質は、Antioxidant response element（ＡＲＥ）制御下にある遺伝子（例、種々のストレスから細胞を防御する因子の遺伝子等）発現促進作用、ＡＲＥ制御下にある遺伝子タンパク質（遺伝子産物）の産生亢進（促進）作用または活性促進用などを有する。
ＡＲＥ制御下にある遺伝子としては、ヘムオキシゲナーゼ−１（Heme oxygenase-1）、Liver glutathione S-transferase Ya subunit、Liver glutathione S-transferase Yc subunit、Glutathione S-transferase Yb subunit、Glutathione S-transferase Yc1 subunit、Gammma-glutamylcysteine synthetase、NAD(P)H:quinone reductase、UDP-glucuronosyltransferase, exon 1、Bilirunin-specific UDP-glucuronosyltransferase、NAD(P)H-menadione oxidereductaseなどが挙げられる。
このようにＭＩＦに結合する能力を有する化合物は、ストレスから細胞を防御する因子を増加させることによって様々な原因による細胞死を強力に抑制する。
ＭＩＦに結合する能力を有する物質は低毒性であり、細胞死抑制剤として、例えば、心疾患（例、心筋症、心不全、狭心症、心筋梗塞など）、神経変性疾患（例、パーキンソン病、アルツハイマー病、トリプレットリピート病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、小脳変性、色素性網膜炎など）、脳血管疾患（例、脳梗塞など）、中枢神経感染症（例、ＨＩＶ脳炎、細菌性髄膜炎など）、外傷性疾患（例、脊髄損傷、脳損傷など）、脱髄疾患（例、多発性硬化症など）、骨・関節疾患（例、骨粗鬆症、変形性関節症、リウマチなど）、腎疾患（例、虚血性急性腎不全、溶血性尿毒症症候群、急性尿細管壊死、水腎症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症など）、肝疾患（例、ウィルス性肝炎、アルコール性肝炎など）、骨髄異形成疾患（例、再生不良性貧血など）、動脈硬化症、糖尿病、肺高血圧症、敗血症、炎症性腸疾患、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、アトピー性皮膚炎など）、移植臓器の拒絶時の障害、エイズ、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、移植用臓器の保護剤などとして有用である。
ＭＩＦに結合する能力を有する物質は、自体公知の方法に従って医薬組成物とし、種々の剤形で哺乳動物（例、ヒト、サル等）に経口的または非経口的に安全に投与しうる。
具体的には、ＭＩＦに結合する能力を有する物質を、薬学的に許容される担体と混合し、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などとして経口投与、または、注射剤、坐剤または舌下錠などとして、静脈内、皮下および筋肉内などに非経口投与する。また、舌下錠、マイクロカプセル等の徐放製剤として、舌下、皮下および筋肉内などに投与してもよい。
【００２０】
上記薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
上記賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。上記滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。上記結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。上記崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。上記溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。上記溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。上記懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。上記等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。上記緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。上記防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。上記抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００２１】
ＭＩＦに結合する能力を有する物質の投与量は、症状の程度；投与対象の年齢、性別、体重；投与の時期、間隔、医薬製剤の性質、調剤、種類；有効成分の種類などによって異なり、特に限定されないが、心疾患の治療に用いる場合は、通常、成人に対して一日につき、約10μg〜100mg/kg体重、好ましくは100μg〜50mg/kg体重である。通常1日1〜4回に分けて投与する。
ＭＩＦに結合する能力を有する物質の、細胞死抑制剤中の含有量は、剤全体の約0.01ないし100重量％である。
【００２２】
本発明の細胞死抑制剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬（例、 シンバスタチン（Simvastatin）、アトロバスタチン（Atorvastatin）など）、フィブラート系高脂血症薬（例、ゲムフィブロジル（Gemfibrozil）など）、抗癌剤（例、イホスファミド（Ifosfamide）、ＵＦＴ、アドリアマイシン（Adriamycin）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、ペプロマイシン（Peplomycin）、シスプラチン（Cisplatin）、シクロフォスファミド（Cyclophosphamide）、５−ＦＵ、メトレキセート（Methotrexate）、マイトマイシンＣ（Mitomycin C）、マイトキサントロン（Mitoxantrone）など）などと併用して用いると、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、フィブラート系高脂血症薬、抗癌剤などの、正常細胞に障害を及ぼす副作用が軽減される。
【００２３】
ＭＩＦを用いて細胞死抑制剤をスクリーニングすることができる。
ＭＩＦに結合する化合物が種々の細胞の細胞死を抑制することから、ＭＩＦに結合する物質を選択することにより、細胞死抑制作用を有する物質を得ることができる。細胞死抑制作用を有する物質として、好ましくはＡＲＥ制御下にある遺伝子の発現を促進する物質などである。
本発明のスクリーニング方法の具体例としては、表面プラズモンセンサー技術を利用し、ＭＩＦに結合する物質をスクリーニングする方法などが挙げられる。
具体的には、ビアコア3000のセンサーチップ表面にＭＩＦを固定化後、チップ表面にリン酸緩衝液（PBS）などに溶解した試験物質を流したときの表面プラズモンの変化を測定することにより、ＭＩＦに結合する物質をスクリーニングする。例えば、表面プラズモンの変化の測定値が５レゾナンスユニット以上与える試験物質を、細胞死抑制剤として選択する。
試験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、醗酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００２４】
本発明のスクリーニング方法の具体例として、（i）ＭＩＦおよび標識されたＭＩＦに結合する能力を有する化合物（標識化合物）を混合した場合、および（ii）試験化合物、ＭＩＦおよび標識されたＭＩＦに結合する能力を有する化合物（標識化合物）を混合した場合における、ＭＩＦに結合した標識化合物の結合量をそれぞれ測定、比較することにより、ＭＩＦに結合する物質をスクリーニングする方法も挙げられる。
標識化合物の化合物としては、化合物（I）、メタロポルフィリン類、WO 03/020719号公報に記載されている化合物またはその塩、WO 02/094203号公報に記載されている化合物またはその塩などが用いられる。
標識に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ランタニド元素、スピン試薬などが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕、〔32P〕、〔33P〕、〔35S〕、〔59Fe〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、シアニン蛍光色素（例、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。
例えば、上記（ii）において、上記（i）の場合におけるＭＩＦに結合した標識化合物の結合量を、約20％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは約50％以上阻害する試験化合物を、ＭＩＦに結合する物質（細胞死抑制剤）として選択する。
試験物質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、醗酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００２５】
本発明のスクリーニング用キットは、ＭＩＦ、必要に応じて上記標識化合物を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、細胞死抑制作用を有する化合物またはその塩であり、上記と同様な細胞死抑制剤として用いられる。
【００２６】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００２７】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
【００２８】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
実施例１で使用した5’末端側にNdeI切断部位を含むラットMIFのN末端と一致するセンス鎖の塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
実施例１で使用した5’末端側にSapI切断部位を含むラットMIFのC末端と一致する抗−センス鎖の塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
実施例１で使用した5’末端側にNdeI切断部位を含むマウスMIFのN末端と一致するセンス鎖の塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
実施例１で使用した5’末端側にSapI切断部位を含むマウスMIFのC末端と一致する抗−センス鎖の塩基配列を示す。
【００２９】
後述の参考例７で得られたハイブリドーマ細胞BWS48-1は、平成14（2002）年3月28日から、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号305-8566）、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、受託番号FERM BP-7991として寄託されている。
【００３０】
以下に、参考例、実験例および実施例を示し、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
以下の参考例中の「％」は特記しない限り重量パーセントを意味する。
1H-NMRスペクトルは内部基準としてテトラメチルシランを用いてバリアンGEMINI 200（200MHz）型スペクトルメーターで測定した。全δ値をppmで示す。
その他の本文中で用いられている略号は下記の意味を示す。
s ：シングレット（singlet）
d ：ダブレット（doublet）
dd ：ダブルダブレット（double doublet）
t ：トリプレット（triplet）
q ：クァルテット（quartet）
m ：マルチプレット（multiplet）
J ：カップリング定数（coupling constant）
Hz ：ヘルツ（Hertz）
CDCl3 ：重クロロホルム
1H-NMR ：プロトン核磁気共鳴
IR ：赤外吸収スペクトル
【実施例】
【００３１】
参考例１
２−（２−ピリジル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン（化合物１）
【化５】
チオサリチル酸メチル（1.6g, 9.51mM）と２−シアノピリジン（1.0g，9.60mM）とをトルエン（2ml）に溶解し、これにトリエチルアミン（2ml，14.4mM）を加え、8時間加熱還流後、トルエンを留去した。残留物にエタノールを加え、析出物を濾取して粗結晶（1.7g）を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：クロロホルム＝5：1→クロロホルム）で精製し、表題化合物を結晶として得た（1.0g，43.4％）。
元素分析値 C13H8N2OSとして
計算値（％） C:64.98, H:3.36, N:11.66
実測値（％） C:64.93, H:3.31, N:11.59
1H-NMR（CDCl3）δ：7.50-7.75(m,4H)，7.85-8.00(m,1H)，8.50-8.60(m,2H)，8.70-8.80(m,1H)．
IR（KBr）：1660cm-1
【００３２】
参考例２
２−（３−ピリジル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン
【化６】
チオサリチル酸メチル（1.8g，10.7mM）と３−シアノピリジン（1.1g，10.56mM）とをトルエン（5ml）に溶解し、これにトリエチルアミン（2ml，14.4mM）を加え、48時間加熱還流後、参考例１と同様の操作を行い、表題化合物を結晶として得た（1.1g，43.4％）。
元素分析値 C13H8N2OSとして
計算値（％） C:64.98, H:3.36, N:11.66
実測値（％） C:64.97, H:3.33, N:11.63
【００３３】
参考例３
２−（４−ピリジル）−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン
【化７】
チオサリチル酸メチル（2.0g，11.9mM）と４−シアノピリジン（1.2g，11.5mM）とをトルエン（5ml）に溶解し、これにトリエチルアミン（2ml）を加え、22時間加熱還流後、参考例１と同様の操作を行い、表題化合物を結晶として得た（850mg，30.7％）。
元素分析値 C13H8N2OSとして
計算値（％） C:64.98, H:3.36, N:11.66
実測値（％） C:65.07,H:3.15, N:11.62
【００３４】
参考例４
２−（４−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−２−イリデン）酢酸エチル
【化８】
チオサリチル酸メチル（6g，35.7mM）とシアノ酢酸エチル（4g，35.4mM）とをトルエン（10ml）に溶解し、これにトリエチルアミン（5ml，35.8mM）を加えて、7時間加熱還流した。反応液を濃縮し、残留物にエタノールを加えて放置し、析出した結晶を濾取して粗結晶を得た。これをエタノールから再結晶し、表題化合物を針状晶として得た（5.4g，60.7％）。
元素分析値 C12H11NO3Sとして
計算値（％） C:57.82,H:4.45, N:5.62
実測値（％） C:57.86,H:4.36, N:5.51
1H-NMR（CDCl3）δ：1.31(t,3H,J=7.0Hz)，4.22(q,2H,J=7.0Hz)，5.57(s,1H)，7.35(t,2H,J=7.4Hz)，7.50-7.60(m,1H)，8.28(d,1H,J=7.4Hz)，9.73(s,1H).
IR（KBr）cm-1：1660, 1590, 1580, 1560, 1440, 1295, 1165, 730．
【００３５】
参考例５
２−［２−オキソ−２−（１−ピペリジニル）エチリデン］−２，３−ジヒドロ−４Ｈ−１，３−ベンゾチアジン−４−オン
【化９】
チオサリチル酸メチル（1.7g，10.1mM）と１−シアノアセチルピペリジン（2.0g，13.1mM）とをトルエン（5ml）に溶解し、これにトリエチルアミン（2ml，14.4mM）を加えて、30時間加熱還流し、反応液を濃縮して粗結晶を得た。これをエタノールから再結晶し、表題化合物を針状晶として得た（730mg，25％）。
元素分析値 C15H16N2O2Sとして
計算値（％） C:62.48,H:5.59, N:9.71
実測値（％） C:62.22,H:5.58, N:9.65
NMR（CDCl3）δ：1.30-1.80(m,6H)，3.30-3.70(m,4H)，5.30(s,1H)，6.90-7.60(m,3H)，8.27(dd,1H,J=8Hz,J=2Hz).
IR（KBr）cm-1：1660, 1595, 1560.
【００３６】
参考例６
ラットＭＩＦタンパク質およびマウスＭＩＦタンパク質の調製
（１）ＭＩＦ発現ベクターの構築
T7プロモータ発現プラスミドpET32b(+)(Novagen 社)をSapIとTthIIIで切断後、切断面を平滑末端化して再び環状化することで、pET32b(+)よりSapI切断部位を除去したpET32b-1を得た。次に、pCYB1（IMPACT I: One-Srep Protein Purification System、New England BioLabs社）をNdeIとBglIで切断して、マルチクローニング部位とインテイン−キチンバインディングドメイン融合タンパク質をコードする領域のDNA断片を回収し、このBglI切断部位を平滑末端化した後、pET32b-1のNdeIとEcoRV部位の間に挿入してpET32b-Int-CBDを得た。
次にラットおよびマウスの脳の相補的DNA(cDNA)ライブラリー（GIBCO BRL社）よりMIFをコードする領域をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法により増幅した。ラットMIFのcDNA増幅には、5’末端側にNdeI切断部位を含むラットMIFのN末端と一致するセンス鎖（配列番号：１）と5’末端側にSapI切断部位を含むラットMIFのC末端と一致する抗−センス鎖（配列番号：２）を使用した。マウスMIFのcDNA増幅には、5’末端側にNdeI切断部位を含むマウスMIFのN末端と一致するセンス鎖（配列番号：３)と5’末端側にSapI切断部位を含むマウスMIFのC末端と一致する抗−センス鎖（配列番号：４）を使用した。増幅したMIFcDNAはNdeIとSapIで切断後、pET32b-Int-CBDのNdeI切断部位とSapI切断部位の間に挿入して、それぞれMIF−インテイン−キチンバインディングドメイン融合タンパク質発現プラスミドpET32b-rMIF-Int-CBDとpET32b-mMIF-Int-CBDを得た。得られた発現プラスミド内のMIFcDNA配列は、DNAシーケンス・システム（アプライド・バイオシステム社）を用いて確認した。
【００３７】
（２）ラットＭＩＦタンパク質の調製
pET32b-rMIF-Int-CBDを大腸菌BL21(DE3)(Novagen)に形質転換した後、アンピシリンを添加したLB培地（1 ％トリプトン、0.5 ％イーストイクストラクト、0.5 ％ NaCl）(LBamp培地)に植菌し、37℃で一晩振とう培養した。これをLBamp培地に1 ％となるように移し、37℃で約2時間振とう培養した後22℃で約1時間培養し、0.4 mMのイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド（IPTG）を添加して15 ℃でさらに24 時間培養してラットMIF−インテイン−キチンバインディングドメイン融合タンパク質の発現を誘導した。培養終了後、大腸菌を回収し1/10量の0.1 %トライトンX-100を含むカラムバッファー（20 mM Tris-HCl; pH8.0, 500 mM NaCl, 0.1 mM EDTA）に懸濁して超音波破砕した。この菌体破砕液を4 ℃、12000rpmで30分間遠心分離してその上清を回収した。回収した上清は0.1 ％トライトンX-100を含むカラムバッファーで平衡化したキチンビーズカラム（New England BioLabs社）を通過させて、MIF−インテイン−キチンバインディングドメイン融合タンパク質をカラムに結合させた後、カラムサイズの10倍容量の0.1 ％トライトンX-100を含むカラムバッファーとカラムサイズの10倍容量のカラムバッファーで洗浄して非特異的に結合したタンパク質および随伴する物質を除去した。次にカラム内のバッファーを50 mMのジチオスレイトールを含むカラムバッファーと置換して4 ℃で16 時間以上放置することで、インテインのタンパク質スプライシング活性を利用して融合タンパク質よりMIFタンパク質を切り出した。切り出したMIFタンパク質はカラムバッファーで溶出した後、20 mMの燐酸ナトリウム緩衝液で透析した。
（３）マウスＭＩＦタンパク質の調製
マウスMIFタンパク質を、ラットMIFタンパク質とほぼ同様の方法で取得した。ただし、タンパク質を発現させた大腸菌を破砕する際に懸濁するカラムバッファー（20 mM Tris-HCl; pH8.0, 500 mM NaCl, 0.1 mM EDTA）には0.1 ％トライトンX-100を加えなかった。
【００３８】
参考例７
モノクローナル抗マウスＭＩＦ抗体の作製
（１）抗マウスＭＩＦを産生するハイブリドーマ細胞の調製
（i）免疫
6〜8週令のBALB/C雌マウスに、参考例６で得られたマウスMIFを、それぞれ約50μg/匹となるよう、完全フロイントアジュバントとともに皮下免疫した。以後2週間おきに同量の免疫原を不完全フロイントアジュバントとともに2〜3回追加免疫した。
（ii）マウスＭＩＦを免疫したマウスの抗血清中の抗体価測定
マウスMIFを2週間間隔で2回免疫し、その1週間後に眼底採血を行い血液を採取した。さらに血液を4℃で12,000 rpmで15分遠心した後、上清を回収し抗血清を得た。抗血清中の抗体価を下記の方法により測定した。マウスMIF結合マイクロプレートを作製するため、まず、マウスMIFを2μg/ml含むリン酸緩衝生理食塩水溶液（PBS、pH7.4）を96ウェルマイクロプレートに100μlずつ分注し、4℃で24時間放置した。次に、プレートを0.5％Tween-20を含むPBSで洗浄したのち、ウェルの余剰の結合部位をふさぐため2％ BSA（シグマ社製）を含むPBSを200μlずつ分注し、37℃で1時間処理した。
得られた抗マウスMIF結合マイクロプレートの各ウェルにPBSで希釈した抗血清100μlを加え、室温で2時間反応させた。次に、該プレートを0.5％Tween-20を含むPBSで洗浄したのち、HRP標識化抗マウスIgG−gamma（PBSで5,000倍希釈）100μlを加え、室温で1時間反応させた。次に、該プレートを0.5％Tween-20を含むPBSで洗浄したのち、固相上の酵素活性をTMBマイクロウェルパーオキシダーゼ基質システム（KIRKEGAARD&PERRY LAB, INC、フナコシ薬品取り扱い）100μlを加え室温で10分間放置した。反応を1Mリン酸100μlを加えて停止させたのち、450nmの吸収をプレートリーダー（BICHROMATIC、大日本製薬社製）で測定した。
（iii）モノクローナル抗マウスMIF抗体の作製
比較的高い抗体価を示したマウスに対して10〜100μgの免疫原を生理食塩水0.2mlに溶解させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を行なった。最終免疫4日後のマウスから脾臓を摘出し、スライドグラスで脾細胞を遊出させメッシュでろ過した。この細胞をイーグルズ・ミニマム・エッセンシャルメデイウム（MEM）に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞として、BALB/Cマウス由来ミエローマ細胞P3-X63.Ag8.U1（P3U1）を用いた（Current Topics in Microbiology and Imnology、81巻、１頁、1978年）。
細胞融合は、原法（Nature、256巻、495頁、1975年）に準じて行なった。すなわち、脾臓細胞およびP3U1をそれぞれ、血清を含有しないMEMで3度洗浄し、脾臓細胞とP3U1数の比率を5:1になるよう混合して、800回転で15分間遠心を行ない細胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽くほぐし、45％ポリエチレングリコール（PEG）1500（Sigma社製）を0.3ml加え、37℃温水槽中で7分間静置して融合を行なった。融合後、細胞に毎分2mlの割合でMEMを添加し、合計15mlのMEMを加えた後600回転15分間遠心して上清を除去した。この細胞沈殿物をCM-Bメデイウム（三光純薬）に、P3U1が1ml当り2ｘ105個になるように浮遊し、24穴マルチディッシュ（コースター社製）に1ウェル1mlずつ192ウェルに播種した。播種後、細胞を37℃で5％炭酸ガスインキュベーター中で培養した。24時間後、HAT（ヒポキサンチン 1x10-4M、アミノプテリン 4x10-7M、チミジン 1.6x10-3M）を含んだCM-B培地（HAT培地）を1ウェル当り1mlずつ添加することにより、HAT選択培養を開始した。HAT選択培養は、培養開始3、5、7および9日後に旧液を1ml捨てた後、1mlのHAT培地を添加することにより継続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後9〜14日で認められ、培養液が黄変したとき（約1x106セル/ml）、上清を採取し、（ii）に記載の方法に従って抗体価を測定後、細胞のクローニングを行い、ハイブリドーマ細胞BWS48-1を取得した。
このハイブリドーマを、あらかじめミネラルオイル0.5mlを腹腔内投与されたマウス（BALB/C）に1x106セル/匹を腹腔内投与したのち、6〜20日後に抗体含有腹水を採取した。
BWS48-1aで標示されるモノクローナル抗体は、得られた腹水よりプロテイン-Gカラムにより精製した。即ち、腹水6〜20mlを2倍量の結合緩衝液〔20mM リン酸緩衝液（pH7.0）〕で希釈したのち、あらかじめ結合緩衝液で平衡化したリコンビナントプロテイン-G-セファロース（ファルマシア社製）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衝液〔0.1Mグリシン緩衝液（pH2.7）〕で溶出した。溶出液をPBSに対して4℃、2日間透析したのち、0.22μmのフィルター（ミリポア社製）により除菌濾過し、4℃あるいは-80℃で保存した。
【００３９】
実験例１
ＭＩＦと化合物１との結合
参考例６で得られたラットMIFと参考例１で得られた化合物１の結合をBIACORE3000（ビアコア株式会社製）を用いて解析した。
ラットMIFをセンサーチップCM5（ビアコア株式会社製）に固定化後、10μMの化合物１を含むリン酸緩衝液（PBS）をチップ上に流し、表面プラズモン共鳴シグナルの変化をラットMIFに対する化合物の結合として測定した。
結果を図１に示す。
これより化合物１がMIFに結合することがわかる。
【００４０】
実験例２
（１）モノクローナル抗体ＢＷＳ４８−１ａおよび化合物１の心筋細胞死抑制作用
日本チャールスリバー社より購入した妊娠ウイスター・ラットより新生仔（生後1日以内のもの）を得、これをエーテル麻酔し、70％エタノールで消毒後、ピンセットで心臓を摘出した。摘出した心臓を、リン酸緩衝生理食塩水（タカラ社製、T900）で洗浄後、手術用のハサミで細片化した。この組織片を、リン酸緩衝生理食塩水で4〜5回洗浄し、大部分の血液由来の非心筋細胞を除去した。この新生仔10匹分の組織片に対し、5mlの酵素液〔リン酸緩衝液（1ml）に、トリプシン（1.25mg）（ディフコ社製）およびコラゲナーゼ（0.25mg）（シグマ社製）を溶解したもの〕を加え、37℃に保ちながらスターラーで15分間攪拌した。これに、2.5mlの酵素液を追加し、さらに15分間攪拌し、この操作を2回繰り返した。続いて、10％牛胎仔血清（バイオウィカー社製）を含むMedium 199（ギブコ社製）を、酵素液の1/2量添加して酵素反応を停止させ、これをセルストレイナー（ファルコン社製）で濾過後、400xgで5分間遠心分離して細胞を集めた。
このように集めた新生仔10匹分の細胞を、50mlの10％牛胎仔血清を含むMedium 199に懸濁し、100mmシャーレ（イワキ社製）に10mlずつ播種し、5％ CO2、37℃に設定したCO2インキュベーター中で１時間培養した。その後、細胞を回収してセルストレイナーで濾過後、400xgで５分間遠心分離し、ラット新生仔由来の初代心筋細胞を集めた。
次に、ラット新生仔（10匹分）由来の初代心筋細胞を、2mlの低張液〔水（1L）に、NH4Cl（8.29g）、KHCO3（1.0g）およびEDTA/2Na（ethylenediaminetetraacetic acid disodium；同仁化学研究所製）（37mg）を溶かしたもの〕に懸濁し、3分間放置して赤血球を破砕した。これに10mlの10％牛胎仔血清を含むMedium 199を加え、400xgで5分間遠心分離し、ラット新生仔由来初代心筋細胞を集めた。これを10％牛胎仔血清を含むMedium 199に懸濁してセルストレイナーで濾過した。得られた心筋細胞懸濁液の一部を取り、これに0.3％のトリパンブルーを添加し、軽く混合して心筋細胞数を血球計算板を用いて計数した。
このようにして調製したラット新生仔由来初代心筋細胞を3×105個/mlとなるように、10％牛胎仔血清を含むMedium 199に懸濁し、96穴プレートに0.1ml/wellずつ播種し、5％ CO2、37℃に設定したCO2インキュベーター中で1日培養した。これをマイクロミキサー（大洋化学工業社製）で攪拌後、血清を含まないMedium 199と3回交換して血清を除去し、被検検体を加え、さらに4日間培養して細胞死を誘導した。被検検体としては、参考例７で得られたモノクローナル抗体BWS48-1aまたは参考例１で得られた化合物１を使用した。
その後、これに牛胎仔血清を10％となるように添加し、5％ CO2、37℃に設定したCO2インキュベーター中でさらに約17時間培養した後、WST-8〔2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt〕を発色基質とする細胞数計測キット（同仁化学研究所社製）を用いて生細胞数を測定することにより、心筋細胞死抑制作用を調べた。
上記実験を独立して3回行った。
抗体無添加群の生細胞数を１としたときの対照抗体（マウスIgG）およびモノクローナル抗体BWS48-1aの各濃度添加群の生細胞数の平均値（±SD）を図２に示す。
化合物１の細胞死抑制に必要な最小有効濃度の平均値（±SD）は、0.015 ± 0.011μMであった。これは、化合物１を添加しなかったときの平均細胞数に比べて30％増加させるために要求される化合物１の濃度を最小有効濃度とした。
以上の結果より、モノクローナル抗体BWS48-1aおよび化合物１は、心筋細胞死抑制活性を有することがわかる。
（２）ヘミンおよびヘマチンの心筋細胞死抑制作用
上記（１）と同様に調製したラット新生仔由来初代心筋細胞を3×105個/mlとなるように、10％牛胎仔血清を含むMedium 199に懸濁し、96穴プレートに0.1ml/wellずつ播種し、5％ CO2、37℃に設定したCO2インキュベーター中で1日培養した。これをマイクロミキサー（大洋化学工業社製）で攪拌後、血清を含まないMedium 199と3回交換して血清を除去し、被検検体を加え、さらに4日間培養して細胞死を誘導した。被検検体としては、ヘミンまたはヘマチンを使用した。
その後、これに牛胎仔血清を10％となるように添加し、5％ CO2、37℃に設定したCO2インキュベーター中でさらに約17時間培養した後、WST-8を発色基質とする細胞数計測キット（同仁化学研究所社製）を用いて生細胞数を測定することにより、心筋細胞死抑制作用を調べた。
上記実験を独立して3回行った。
被検体無添加群の生細胞数を１としたときのヘミンおよびヘマチンの各濃度添加群の生細胞数の平均値（±SD）を図７に示す。
以上の結果より、ヘミンおよびヘマチンは、心筋細胞死抑制活性を有することがわかる。
【００４１】
実験例３
ドキソルビシンで誘導した心筋細胞死に対する抑制作用
実験例２で得られたラット新生仔由来初代心筋細胞を6×105個/mlとなるように、10％牛胎仔血清を含むMedium 199に懸濁し、96穴プレートに0.1ml/wellずつ播種し、5％ CO2、37℃に設定したCO2インキュベーター中で1日培養した。これをマイクロミキサー（大洋化学工業社製）で攪拌後、血清を含まないMedium 199で3回洗浄して血清を除去し、Medium 199と被検検体を加え、3時間培養した。 培養後、ドキソルビシン（DOX：終濃度200μM）を添加し、さらに18時間培養して細胞死を誘導した。その後、牛胎仔血清を10％となるように添加し、5％ CO2、37℃に設定したCO2インキュベーター中でさらに約17時間培養した後、WST-8を発色基質とする細胞数計測キット（同仁化学研究所社製）を用いて生細胞数を測定することにより、心筋細胞死抑制作用を調べた。上記実験は独立して3回行った。なお各実験群の生細胞数は、ドキソルビシン無添加群の生細胞数を1としたときの各実験群の生細胞数の平均値（±SD）で示した。
結果を図３に示す。
これより、化合物１がドキソルビシンで誘導した心筋細胞死に対する抑制活性を有することがわかる。
【００４２】
実験例４
スタチンで誘導した心筋細胞死に対する抑制作用
実験例２で得られたラット新生仔由来初代心筋細胞を6×105個/mlとなるように、10％牛胎仔血清を含むMedium 199に懸濁し、96穴プレートに0.1ml/wellずつ播種し、5％ CO2、37℃に設定したCO2インキュベーター中で1日培養した。これをマイクロミキサー（大洋化学工業社製）で攪拌後、血清を含まないMedium 199と3回交換して血清を除去し、シンバスタチン（0.3μM）またはアトロバスタチン（1μM）と化合物１とを加え、さらに3日間培養した。その後、これに牛胎仔血清を10％となるように添加し、5％ CO2、37℃に設定したCO2インキュベーター中でさらに約17時間培養した後、WST-8を発色基質とする細胞数計測キット（同仁化学研究所社製）を用いて生細胞数を測定することにより、スタチンで誘導した心筋細胞死に対する抑制作用を調べた。上記実験は独立して3回行った。なお各実験群の生細胞数は、スタチン無添加群の生細胞数を１としたときの各実験群の生細胞数の平均値（±SD）で示した。
結果を図４および図５に示す。
これより、シンバスタチン（0.3μM）およびアトロバスタチン（1μM）は心筋細胞死を誘導すること、さらに化合物１は、HMG-CoA還元酵素阻害薬で誘導した心筋細胞死に対する抑制活性を有することがわかる。
【００４３】
実験例５
血清除去で誘導した血管平滑筋細胞死に対する抑制作用
正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（大日本製薬社）を4×104個/mlとなるように、10％牛胎仔血清を含むMCDB131培地（大日本製薬社）に懸濁後、96穴プレートに0.1ml/wellずつ播種し、5％ CO2、37℃に設定したCO2インキュベーター中で1日培養した。これをマイクロミキサー（大洋化学工業社製）で攪拌後、培地を除去し、血清を含まないMCDB131培地および参考例１で得られた化合物１を加え、3日間培養した。培養後、WST-8を発色基質とする細胞数計測キット（同仁化学研究所社製）を用いて生細胞数を測定することにより、心筋細胞死抑制作用を調べた。上記実験は独立して3回行った。なお生細胞数は、化合物１無添加群の生細胞数を1としたときの、各濃度添加群の生細胞数の平均値（±SD）で示した。
結果を図６に示す。
これより化合物１は、血清除去で誘導した血管平滑筋細胞死に対する抑制活性を有することがわかる。
【００４４】
実験例６
ＮＯで誘導したヒト関節軟骨細胞死に対する抑制作用
ヒト正常関節軟骨細胞（Clonetics社）を関節軟骨細胞用増殖培地（CGM、Clonetics社）中で単層培養により増殖させた後に、1.2％ アルギン酸を含む 155 mM NaCl溶液に 2.0×106個/mlの密度で細胞を懸濁し、22ゲージの注射針を付けた注射筒を用いて直径 2 mmのビーズを作製した。このビーズを関節軟骨細胞用分化培地（CDM、Clonetics社）を添加した 96穴丸底プレート（1 ビーズ／ウェル、ファルコン社製）中でさらに７日間培養後、化合物１（0.1μMまたは1μM）および 10％ 牛胎仔血清を含むα-modified minimum essential mediumに換えて48時間培養し、さらに1.5 mMのニトロプルシッドナトリウム（NO発生剤、シグマ社製）を共存させて5時間培養した。対照薬としてカスパーゼ3インヒビター（Z-DEVD-FMK、100 μM、R&Dシステムズ社製）およびカスパーゼ9インヒビター（Z-LEHD-FMK、100 μM、R&Dシステムズ社製）の作用についても同様に調べた。実験終了後に、アルギン酸を除去し、3-(4,5-dimethyl-thiazole-2-yl)- 2,5-diphenyl tetrazolium bromide を用いた MTT法により細胞生存率を測定した。結果を表１に示す。
【表１】
表中の数値は、MTT 法測定値から換算した細胞死抑制率の平均値（±SD）を示す。なお、1.5 mM のニトロプルシッドナトリウム添加後の細胞生存率（化合物１または対照薬なし）は 31.9％であった。
化合物１は、NOで誘導したヒト関節軟骨細胞死に対する抑制活性を有することがわかる。
【００４５】
実験例７
ＤＮＡチップによる遺伝子発現解析
実験例２で得られたラット新生仔由来初代心筋細胞を1.5x105個/mlとなるように10％牛胎仔血清を含むMedium 199に懸濁し、12穴プレート (旭テクノグラス社製)に2ml/wellずつ播種して5 ％ CO2、37℃で1日培養した。これを軽く攪拌後、Medium199培地で3回洗浄して血清を除去し、Medium199培地と化合物１を添加して5％ CO2、37℃で21時間培養した。次に培養液を除去し、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を用いてtotal RNAを回収し、これを用いてGeneChip発現解析用アレイ（Rat Genome U34A アレイ：AFFYMETRIX社製）で網羅的な遺伝子の発現解析を行った。各遺伝子の発現上昇率は、化合物無添加時の発現量を１としたときの化合物添加時の発現量で表した。
結果を表２に示す。
【表２】
これより化合物１は、Antioxidant response element（ARE）制御下にある遺伝子の発現を増強することがわかる。
【００４６】
実験例８
化合物１のヘムオキシゲナーゼ−１産生増加作用
実験例２で得られたラット新生仔由来初代心筋細胞を1.5×105個/mlとなるように10％牛胎仔血清を含むMedium199に懸濁し、12穴プレート（旭テクノグラス社製）に2ml/wellずつ播種し、5％ CO2、37℃で1日培養した。これをMedium199培地で3回洗浄して血清を除去し、化合物１を添加して、5％ CO2、37℃で24時間培養した。培養終了後、心筋細胞をPBS（-）で1回洗浄し、100μlの細胞溶解用緩衝液〔10 mM Tris（hydroxymethyl）aminomethane, pH7.4, 150 mM NaCl，1 mM EDTA・2Na，1 mM ethyleneglycol-bis-(β-aminoethylether〕N,N,N',N'-tetraacetic acid、0.5 mM (p-aminophenyl)methanesulfonyl fluoride hydrochloride，200μM sodiumβ-Glycerophosphate n-hydrate, 20 mM NaF, 2 mM sodium diphosphate decahydrate, 10 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml leupeptin，1 ％ Triton X-100, 0.5 ％ Nonidet P40，0.1 ％ sodium dodesyl sulfate〕を添加した後、セルスクレーパーを用いて細胞残渣をプレートより乖離させてから、細胞溶解用緩衝液を回収した。回収した細胞溶解用緩衝液はサンプル用緩衝液（Tris-SDS-ME Sample Buffer；第一化学薬品製）と等量ずつ混合して、95℃で5分間熱処理した後、マルチゲル（第一化学薬品社製）を用いて、SDSポリアクリルアミド電気泳動を行った。次に、ブロッティング緩衝液〔0.1 M Tris（hydroxymethyl）aminomethane, 0.192 Mグリシン, 20％ エタノール〕に10分以上浸しておいたニトロセルロース膜（Hybond-ECL；アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）、ブロッティング用ろ紙、透析膜およびゲルをホライズブロット（ATTO社製）にセットし、100 mA/ゲル（64 cm2）で１時間処理してゲル内のタンパク質をニトロセルロース膜に吸着させた。その後、ニトロセルロース膜をブロッキング緩衝液〔5 ％ スキムミルク粉末を含有するTTBS緩衝液（20 mM Tris-HCl, pH7.6, 0.137 M NaCl, 0.1 ％ Tween-20）〕に浸し、室温で1時間攪拌してブロッキングを行った。次に、ブロッキング緩衝液で1000〜2000倍希釈した抗HO-1抗体溶液（StressGen社製）に上記のニトロセルロース膜を浸し、4℃で12〜18時間反応させた。反応終了後、このニトロセルロース膜をTTBS緩衝液で3回洗浄し、さらにブロッキング緩衝液で2000倍に希釈したhorseradish peroxidase標識抗ウサギIgG抗体溶液（NEW ENGLAND BioLabs社製）に浸し、室温で1時間反応させた。反応終了後、TTBS緩衝液を用いて3回洗浄し、ウェスタンブロッティング検出試薬（ECL＋Plus；アマシャム社製）と、Hyperfilm ECL（アマシャム社製）を用いてタンパク質量を測定した。ヘムオキシゲナーゼ-1タンパク質の産生増加率は、化合物無添加時の産生量を1としたときの化合物添加時の産生量で表した。
結果を表３に示す。
【表３】
これより化合物１はAntioxidant response element （ARE）制御下にある遺伝子の産物の１つであるヘムオキシゲナーゼ−１の産生量を増加させることがわかる。
【００４７】
実施例１
化合物１（100mg）、ラクトース（165mg）、コーンスターチ（25mg）、ポリビニールアルコール（4mg）およびステアリン酸マグネシウム（1mg）を用いて、常法により錠剤を製造する。
実施例２
MIFに結合する化合物のスクリーニング
参考例６で得られたラットMIFをセンサーチップCM5（ビアコア株式会社製）に固定化後、10μMの3-[2-(4-オキソ-4H-1,3-ベンゾチアジン-2-イル)-4-ピリジル]プロピオン酸（WO 03/020719記載の実施例308の化合物）を含むリン酸緩衝液（PBS）をチップ上に流し、表面プラズモン共鳴シグナルの変化をラットMIFに対する化合物の結合として測定した。
結果を図８に示す。
これより、MIFに結合する物質として、3-[2-(4-オキソ-4H-1,3-ベンゾチアジン-2-イル)-4-ピリジル]プロピオン酸が選択できた。
【００４８】
【発明の効果】
マクロファージ遊走阻止因子に結合する能力を有する物質は、低毒性であり、優れた細胞死抑制作用を有する。例えば、酸化ストレスによる細胞死、血清除去による細胞死、増殖因子の欠乏による細胞死、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬による細胞死、抗癌剤による細胞死、ＮＯによる細胞死、アミロイドβタンパク質による細胞死などを抑制する。さらに、ＡＲＥ制御下にある遺伝子（例、種々のストレスから細胞を防御する因子の遺伝子等）発現を促進、ＡＲＥ制御下にある遺伝子タンパク質（遺伝子産物）の産生を亢進または活性を促進する。よって、本発明の細胞死抑制剤は、例えば、心疾患（例、心筋症、心不全、狭心症、心筋梗塞など）、神経変性疾患（例、パーキンソン病、アルツハイマー病、トリプレットリピート病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、小脳変性、色素性網膜炎など）、脳血管疾患（例、脳梗塞など）、中枢神経感染症（例、ＨＩＶ脳炎、細菌性髄膜炎など）、外傷性疾患（例、脊髄損傷、脳損傷など）、脱髄疾患（例、多発性硬化症など）、骨・関節疾患（例、骨粗鬆症、変形性関節症、リウマチなど）、腎疾患（例、虚血性急性腎不全、溶血性尿毒症症候群、急性尿細管壊死、水腎症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症など）、肝疾患（例、ウィルス性肝炎、アルコール性肝炎など）、骨髄異形成疾患（例、再生不良性貧血など）、動脈硬化症、糖尿病、肺高血圧症、敗血症、炎症性腸疾患、自己免疫性疾患（例、全身性エリテマトーデス、アトピー性皮膚炎など）、移植臓器の拒絶時の障害、エイズ、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）などの予防・治療剤、移植用臓器の保護剤などとして有用である。
さらに、本発明の細胞死抑制剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、フィブラート系高脂血症薬、抗癌剤などと併用して用いると、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、フィブラート系高脂血症薬、抗癌剤などの、正常細胞に障害を及ぼす副作用が軽減される。
また、本発明のスクリーニングにより、効率よくＭＩＦに結合する物質を選択することができ、低毒性で優れた細胞死抑制剤を提供することができる。
【００４９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 MIFと化合物１の結合結果を示す。図中、縦軸は表面プラズモン共鳴シグナル（レゾナンスユニット）を、横軸は時間（秒）を示す。
【図２】 モノクローナル抗体BWS48-1aの心筋細胞死抑制作用結果を示す。図中、□はBWS48-1aを、■は対照抗体を示す。
【図３】 ドキソルビシン（DOX）で誘導した心筋細胞死に対する化合物１の抑制作用の結果を示す。
【図４】 シンバスタチンで誘導した心筋細胞死に対する化合物１の抑制作用の結果を示す。
【図５】 アトロバスタチンで誘導した心筋細胞死に対する化合物１の抑制作用の結果を示す。
【図６】 血清除去で誘導した血管平滑筋細胞死に対する化合物１の抑制作用の結果を示す。
【図７】 ヘミンおよびヘマチンの心筋細胞死抑制作用結果を示す。図中、□はヘミンを、■はヘマチンを示す。
【図８】 MIFに結合する化合物のスクリーニング結果を示す。 図中、縦軸は表面プラズモン共鳴シグナル（レゾナンスユニット）を、横軸は時間（秒）を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to cell death inhibitors, screening for cell death inhibitors, and the like.
[0002]
[Prior art]
Cell death is divided into two types, necrosis and apoptosis, based on the characteristics of the process leading to death. Necrosis is cell death that occurs unexpectedly due to physical or chemical factors. Apoptosis, on the other hand, is the death of a cell that plays an important role in maintaining the life of an individual, and is closely related to morphology, tissue formation, maintenance of homeostasis, defense of the living body, and the process is controlled by genes. ing. When these cell death processes are congenitally or acquiredly impaired, cell death is excessively induced or suppressed, causing dysfunction of various organs and leading to diseases (Latest Medicine Vol. 54, 825, 1999). Year).
In recent years, it has become clear that these cell deaths are deeply involved in the onset or development of various diseases (R. Sanders Williams, The New England Journal of Medicine, Vol. 341, 759, 1999). For example, diseases caused by increased cell death include neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, retinitis pigmentosa, cerebellar degeneration, etc.), ischemic diseases (eg, myocardium) Infarction, heart failure, stroke, cerebral infarction, ischemic acute renal failure, etc., bone / joint diseases (eg, osteoporosis, osteoarthritis, rheumatism, etc.), myelodysplastic diseases (eg, aplastic anemia, etc.), liver Diseases (eg, alcoholic hepatitis, viral hepatitis, etc.), diabetes, AIDS, etc. [Japanese clinical, volume 54, 1996; separate volume, history of medicine, page 8, 1997, etc.] Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is an inflammatory cytokine produced in response to biological invasion from immunocompetent cells and pituitary gland, and can be located upstream of the inflammatory cytokine cascade to control the inflammatory response. Known (Annual Reports in Medicinal Chemistry, 33, 24, 1998; Advances in Immunology, 66, 197, 1997). Furthermore, it is becoming clear that MIF plays an important role not only in immune responses but also in various biological reactions, as it is involved in the proliferation and differentiation of adipocytes and cancer cells (International Journal of Molecular Medicine, Volume 2). 17, p. 1998). Cells and tissues that express MIF include T cells, monocytes / macrophages, mesangial cells, tubular epithelial cells, corneal epithelial cells, hepatocytes, egg cells, Sertoli cells, keratinocytes, osteoblasts, synoviocytes, adipocytes Astrocytes, cancer cells, mucous membranes, pituitary gland, etc. are known. Examples of how MIF is involved in human disease include synovial fluid and serum from rheumatic patients, alveolar lavage fluid from patients with acute respiratory distress syndrome, urine at the time of rejection in patients receiving kidney transplants, and acute myocardial infarction, diabetes, Reports have shown that serum MIF levels are significantly elevated in patients with systemic lupus erythematosus, Crohn's disease, and atopic dermatitis, as well as suppressing MIF function. As an example showing that it leads to improvement of symptoms, an experimental example using an anti-MIF neutralizing antibody can be mentioned. That is, in animal pathological models such as nephritis, hepatitis, pneumonia, arthritis, and endotoxin shock, the International Journal of Molecular Medicine, Vol. 2, 17 Page, 1998).
Regarding the relationship between MIF and cell death, it has been reported that apoptosis induced by anti-IgM antibodies in a mouse B cell line is suppressed by a decrease in MIF production (Non-Patent Document 1, Microbiology and Immunology, Vol. 43). 61, 1999). However, other than the mouse B cell line, the relationship between MIF and cell death is not known, and there is no report on the mechanism of cell death involving MIF.
[Non-Patent Document 1]
Microbiology and Immunology, 43, 61, 1999
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Recently, factors that control its induction have been revealed one after another as cell death research, especially apoptosis research progresses. As a result, many attempts have been made to directly inhibit apoptosis using low molecular weight compounds that have been searched for targeting these regulatory factors. In particular, caspase inhibitors that target caspases that act at the final stage of apoptosis are actively studied, but none have been clinically applied [Experimental Medicine, Vol. 19, p. 1726, 2001]. Research on chaperones such as HSP70 has also been conducted for necrosis, but none has been clinically applied (Essays in Biochemistry, Vol. 32, p. 17, 1997). Therefore, development of a safe and powerful cell death inhibitor and a screening system for searching for this cell death inhibitor is eagerly desired.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
In view of the situation as described above, the present inventors have conducted extensive research. As a result, monoclonal antibodies against macrophage migration inhibitory factor (MIF), low molecular weight compounds that bind to MIF, and the like have been found in cells of rat primary cardiomyocytes by removal of serum. Found to suppress death. Furthermore, this low molecular weight compound that binds to MIF also suppresses cardiomyocyte death by doxorubicin and HMG-CoA reductase inhibitors, chondrocyte death by NO, etc., and a gene under the control of Antioxidant response element (ARE) It has also been found to increase the expression of. Based on these findings, further studies have been made and the present invention has been completed.
That is, the present invention
(1) a cell death inhibitor comprising a substance capable of binding to macrophage migration inhibitory factor,
(2) The cell death inhibitor according to the above (1), wherein the substance having the ability to bind to a macrophage migration inhibitory factor is an antibody against the macrophage migration inhibitory factor,
(3) The cell death inhibitor according to the above (2), wherein the antibody is a monoclonal antibody,
(3a) The cell death inhibitor according to (3), wherein the monoclonal antibody is a monoclonal antibody labeled with BWS48-1a that can be produced from a hybridoma cell labeled with BWS48-1 (FERM BP-7991),
(4) A substance having the ability to bind to macrophage migration inhibitory factor is represented by the formula
[Chemical 2]
[Wherein, R represents a hydrocarbon group which may have a substituent, an aromatic heterocyclic group which may have a substituent, or amino which may have a substituent. A cell death inhibitor according to the above (1), which is a compound represented by the formula:
(5) The cell death inhibitor according to (1), wherein the substance having the ability to bind to a macrophage migration inhibitory factor is a metalloporphyrin,
(5a) The cell death inhibitor according to the above (5), wherein the metalloporphyrin is hemin or hematin,
(6) The cell death inhibitor according to (1) above, wherein the substance capable of binding to a macrophage migration inhibitory factor is a substance that promotes the expression of a gene under the control of an antioxidant response element,
(6a) Genes under the control of the antioxidant response element include heme oxygenase-1, Liver glutathione S-transferase Ya subunit, Liver glutathione S-transferase Yc subunit, Glutathione S-transferase Yb subunit, Glutathione S-transferase Yc1 subunit, Gammma- Cell death inhibitor according to (6) above, which is glutamylcysteine synthetase, NAD (P) H: quinone reductase, UDP-glucuronosyltransferase, exon 1, Bilirunin-specific UDP-glucuronosyltransferase, or NAD (P) H-menadione oxidereductase,
(6b) The cell death inhibitor according to (6) above, wherein the gene under the control of an antioxidant response element is heme oxygenase-1.
(7) The cell death inhibitor according to (1) above, wherein the substance capable of binding to a macrophage migration inhibitory factor is a substance that enhances the production of a gene protein under the control of an antioxidant response element,
(7a) Genes under the control of the Antioxidant response element are heme oxygenase-1, Liver glutathione S-transferase Ya subunit, Liver glutathione S-transferase Yc subunit, Glutathione S-transferase Yb subunit, Glutathione S- The cell described in (7) above, which is transferase Yc1 subunit, Gammma-glutamylcysteine synthetase, NAD (P) H: quinone reductase, UDP-glucuronosyltransferase, exon 1, Bilirunin-specific UDP-glucuronosyltransferase, or NAD (P) H-menadione oxidereductase Death inhibitor,
(7b) The cell death inhibitor according to (7) above, wherein the gene under the control of an antioxidant response element is heme oxygenase-1.
(8) The cell death inhibitor according to (1) above, wherein the substance capable of binding to a macrophage migration inhibitory factor is a substance that promotes the activity of a gene protein under the control of an antioxidant response element,
(8a) Genes under the control of the antioxidant response element are heme oxygenase-1, Liver glutathione S-transferase Ya subunit, Liver glutathione S-transferase Yc subunit, Glutathione S-transferase Yb subunit, Glutathione S- The cell according to (8) above, which is transferase Yc1 subunit, Gammma-glutamylcysteine synthetase, NAD (P) H: quinone reductase, UDP-glucuronosyltransferase, exon 1, Bilirunin-specific UDP-glucuronosyltransferase, or NAD (P) H-menadione oxidereductase Death inhibitor,
(8b) The cell death inhibitor according to (8) above, wherein the gene under the control of an antioxidant response element is heme oxygenase-1.
(9) A screening method for a cell death inhibitor comprising using a macrophage migration inhibitory factor,
(10) The screening method according to (9) above, wherein the cell death inhibitor is a substance that promotes the expression of a gene under the control of an antioxidant response element,
(11) When (i) a macrophage migration inhibitory factor and a compound capable of binding to a labeled macrophage migration inhibitory factor are mixed, and (ii) a test compound, a macrophage migration inhibitory factor and a labeled macrophage migration inhibitory factor The screening method according to (9) above, wherein the amount of the labeled compound bound to the macrophage migration inhibitory factor when each compound having the ability to bind is mixed is measured and compared,
(12) A kit for screening a cell death inhibitor, comprising a macrophage migration inhibitory factor,
(13) A method for quantifying macrophage migration inhibitory factor, comprising using a substance having an ability to bind to macrophage migration inhibitory factor,
(14) A method for diagnosing a disease involving macrophage migration inhibitory factor using the quantification method according to (13) above,
(14a) The disease is heart disease, neurodegenerative disease, cerebrovascular disease, central nervous system infection, traumatic disease, demyelinating disease, bone / joint disease, kidney disease, liver disease, myelodysplastic disease, arteriosclerosis, The diagnostic method according to the above (14), which is diabetes, pulmonary hypertension, sepsis, inflammatory bowel disease, autoimmune disease, AIDS or cancer,
(15) Heart disease, neurodegenerative disease, cerebrovascular disease, central nervous system infection, traumatic disease, demyelinating disease, bone / joint disease, kidney disease, liver disease, myelodysplastic disease, arteriosclerosis, diabetes, lung The cell death inhibitor according to the above (1), which is a prophylactic / therapeutic agent for hypertension, sepsis, inflammatory bowel disease, autoimmune disease, transplant organ rejection, AIDS or cancer, or organ for transplantation ,
(16) The cell death inhibitor according to the above (1), which is a prophylactic / therapeutic agent for inflammatory bowel disease,
(17) The cell death inhibitor according to (1) above, further comprising a combination of an HMG-CoA reductase inhibitor, a fibrate hyperlipidemia agent and / or an anticancer agent,
(18) A method for inhibiting cell death, comprising administering an effective amount of a substance capable of binding to a macrophage migration inhibitory factor to a mammal,
(18a) A method for preventing / treating inflammatory bowel disease, comprising administering an effective amount of a substance capable of binding to a macrophage migration inhibitory factor to a mammal,
(19) Use of a substance capable of binding to a macrophage migration inhibitory factor for producing a cell death inhibitor,
(19a) The present invention relates to the use of a substance having an ability to bind to a macrophage migration inhibitory factor for producing a prophylactic / therapeutic agent for inflammatory bowel disease.
[0005]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Any substance capable of binding to macrophage migration inhibitory factor (MIF) may be used as long as it is capable of binding to MIF. It may be a substance that regulates the function of MIF.
Examples of substances having the ability to bind to MIF include (a) antibodies against MIF, (b) formula
[Chemical Formula 3]
[Wherein, R represents a hydrocarbon group which may have a substituent, an aromatic heterocyclic group which may have a substituent, or amino which may have a substituent. Or a salt thereof, (c) a metalloporphyrin, (d) a compound or salt thereof described in WO 03/020719, (e) described in WO 02/094203 Examples thereof include a compound or a salt thereof.
The antibody against MIF of (a) above may be any antibody that specifically reacts with MIF, and includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and preferably monoclonal antibodies. Preferable specific examples include a monoclonal antibody labeled with BWS48-1a that can be produced from a hybridoma cell labeled with BWS48-1 (FERM BP-7991).
[0006]
The antibody can be produced according to a known antibody or antiserum production method using MIF as an antigen.
[Production of monoclonal antibodies]
(I) Preparation of monoclonal antibody-producing cells
It is administered to a warm-blooded animal together with MIF itself or MIF and a carrier or diluent at a site where antibody production is possible by administration. In order to enhance antibody production ability upon administration, complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of the warm-blooded animal used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats and chickens. Mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, select a warm-blooded animal immunized with an antigen, for example, an individual with a confirmed antibody titer from a mouse, and collect spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization. Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared by fusing the antibody-producing cells to be fused with allogeneic or xenogeneic myeloma cells. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting labeled MIF and antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus. Preferably, PEG is used.
[0007]
Examples of myeloma cells include warm-blooded animal myeloma cells such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, and P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG 6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. Cell fusion can be efficiently carried out by incubating at 20 to 40 ° C., preferably 30 to 37 ° C. for 1 to 10 minutes.
Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which a protein antigen is adsorbed directly or together with a carrier, and then a radioactive substance or An anti-immunoglobulin antibody labeled with an enzyme or the like (when the cell used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A, and a method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase; Examples include a method in which a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase on which a globulin antibody or protein A is adsorbed, a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme is added, and a monoclonal antibody bound to the solid phase is detected.
The selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a similar method. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a selection and breeding medium, any medium may be used as long as the hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal calf serum, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 1-10% fetal calf serum, or serum-free for hybridoma culture A culture medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) etc. can be used. The culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks. Culturing can usually be performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the above antiserum.
(Ii) Purification of monoclonal antibodies
Monoclonal antibodies can be separated and purified by known methods such as immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)). Desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or a specific purification method for obtaining an antibody by dissociating the binding using an active adsorbent such as protein A or protein G. it can.
[0008]
[Preparation of polyclonal antibody]
Polyclonal antibodies can be produced according to known methods or similar methods. For example, an immune antigen (protein antigen) itself or a complex of an immune antigen (protein antigen) and a carrier protein is prepared, and a warm-blooded animal is immunized in the same manner as the above monoclonal antibody production method. Can be produced by collecting the antibody-containing product and separating and purifying the antibody.
Regarding the complex of immunizing antigen and carrier protein used to immunize warm-blooded animals, the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are effective for antibodies against hapten immunized by cross-linking to carrier. As long as it can, what kind of thing may be bridge | crosslinked by what ratio, For example, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, hemocyanin etc. are about 0.1-20 by weight ratio with respect to hapten 1, Preferably it is about 1 A method of coupling at a rate of ˜5 is used.
In addition, various condensing agents can be used for coupling of the hapten and the carrier, and active ester reagents containing glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, and dithiobilidyl group are used.
The condensation product is administered to warm-blooded animals at the site where antibody production is possible, or with a carrier and a diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood of warm-blooded animals immunized by the above method.
The polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the antibody titer in the antiserum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described monoclonal antibody separation and purification.
[0009]
In the formula (I) of the above (b), as the “hydrocarbon group” of the “hydrocarbon group optionally having substituent (s)” represented by R, for example, alkyl, cycloalkyl, cycloalkylalkyl, alkenyl, Alkynyl, aryl, aralkyl and the like can be mentioned.
Examples of the “alkyl” include C1-6Alkyl (eg, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, etc.) and the like can be mentioned.
Examples of the “cycloalkyl” include C3-6And cycloalkyl (eg, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, etc.) and the like.
Examples of the “cycloalkylalkyl” include C4-7And cycloalkylalkyl groups (eg, cyclopropylmethyl, cyclobutylmethyl, cyclopentylmethyl, cyclohexylmethyl, etc.).
Examples of the “alkenyl” include C2-6Alkenyl (eg, vinyl, allyl, isopropenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 2-methyl-2-propenyl, 1-methyl-2-propenyl, 2-methyl-1-propenyl, etc.) Can be mentioned.
Examples of the “alkynyl” include C2-6Alkynyl (for example, ethynyl, propargyl, 1-butynyl, 2-butynyl, 3-butynyl, 1-hexynyl and the like) and the like can be mentioned.
Examples of the “aryl” include C6-14Aryl (eg, phenyl, naphthyl, biphenyl, indanyl, 1,2,3,4-tetrahydronaphthyl, etc.) and the like can be mentioned.
Examples of the “aralkyl” include C7-16Aralkyl (eg, benzyl, phenethyl, phenylpropyl, naphthylmethyl, indanylmethyl, etc.) and the like.
[0010]
As the “substituent” of the “hydrocarbon group optionally having substituent (s)” represented by R, for example, a halogen atom (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.), an aromatic heterocyclic group, oxo , Hydroxy, C1-4Alkoxy (eg, methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, etc.), carboxy, C1-4Alkyl-carbonyl (eg, acetyl, propionyl, etc.), C6-14Aryl-carbonyl (eg, benzoyl, etc.), C1-4Alkoxy-carbonyl (eg, methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, propoxycarbonyl, butoxycarbonyl, etc.), C6-14Aryloxy-carbonyl (eg, phenoxycarbonyl, etc.), C7-16Aralkyloxy-carbonyl (eg, benzyloxycarbonyl, etc.), carbamoyl, mono-C1-6Alkyl-carbamoyl (eg, methylcarbamoyl, ethylcarbamoyl, etc.), di-C1-6Alkyl-carbamoyl (eg, dimethylcarbamoyl, diethylcarbamoyl, ethylmethylcarbamoyl, etc.), optionally halogenated C6-14Aryl-carbamoyl, 5- to 6-membered heterocyclic carbamoyl (eg, 2-pyridylcarbamoyl, 3-pyridylcarbamoyl, 4-pyridylcarbamoyl, 2-thienylcarbamoyl, 3-thienylcarbamoyl, etc.), optionally substituted Examples include 5- to 7-membered saturated cyclic amino-carbonyl. Of these, C6-14Aryl-carbonyl, C1-4Alkoxy-carbonyl, 5- to 6-membered heterocyclic carbamoyl, 5- to 7-membered saturated cyclic amino-carbonyl and the like are preferable.
[0011]
Examples of the “aromatic heterocyclic group” include, for example, 5 to 14 members (preferably 5 or 5) containing 1 or 2 kinds and 1 to 4 heteroatoms selected from a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom in addition to a carbon atom. Or a monovalent group formed by removing any one hydrogen atom from an aromatic heterocyclic ring. Examples of the “5- to 14-membered (preferably 5- to 10-membered aromatic heterocycle)” include, for example, thiophene, benzo [b] thiophene, benzo [b] furan, benzimidazole, benzoxazole, benzothiazole, benziso Thiazole, naphtho [2,3-b] thiophene, furan, pyrrole, imidazole, pyrazole, pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, indole, isoindole, 1H-indazole, purine, 4H-quinolidine, isoquinoline, quinoline, phthalazine, naphthyridine , Quinoxaline, quinazoline, cinnoline, carbazole, β-carboline, phenanthridine, acridine, phenazine, thiazole, isothiazole, phenothiazine, isoxazole, furazane, phenoxazine, etc. Heterocyclic or aromatic ring (eg, benzene ring, etc.) of these rings (preferably monocycle) with one or more (preferably 1 or 2), such as fused formed ring are exemplified with.
Examples of the “aromatic heterocyclic group” include thienyl (eg, 2-thienyl, 3-thienyl), furyl (eg, 2-furyl, 3-furyl), pyridyl (eg, 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl), quinolyl (eg, 2-quinolyl, 3-quinolyl, 4-quinolyl, 5-quinolyl, 8-quinolyl), isoquinolyl (eg, 1-isoquinolyl, 3-isoquinolyl, 4-isoquinolyl, 5-isoquinolyl) , Pyrazinyl, pyrimidinyl (eg, 2-pyrimidinyl, 4-pyrimidinyl), pyrrolyl (eg, 3-pyrrolyl), imidazolyl (eg, 2-imidazolyl), pyridazinyl (eg, 3-pyridazinyl), isothiazolyl (eg, 3-isothiazolyl) ), Isoxazolyl (eg, 3-isoxazolyl), indolyl (eg, 1-indolyl, 2-indolyl, 3 Indolyl), benzothiazolyl (eg, 2-benzothiazolyl), benzothienyl (eg, 2-benzo [b] thienyl, 3-benzo [b] thienyl), benzofuranyl (eg, 2-benzo [b] furanyl, 3-benzo [ b] furanyl) and the like. Of these, for example, a 5- to 6-membered heterocyclic group containing 1 to 3 heteroatoms selected from a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom in addition to a carbon atom (eg, 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl) Pyridyl) is preferred.
[0012]
The “optionally halogenated C6-14“Aryl-carbamoyl” is, for example, C optionally having 1 to 3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, etc.).6-14Aryl-carbamoyl (eg, phenylcarbamoyl, 1-naphthylcarbamoyl, 2-naphthylcarbamoyl, etc.) and the like.
Examples of the “5- to 7-membered saturated cyclic amino-carbonyl” of the “optionally substituted 5- to 7-membered saturated cyclic amino-carbonyl” include pyrrolidin-1-ylcarbonyl, piperidinocarbonyl, And piperazin-1-ylcarbonyl, morpholinocarbonyl and the like. The “substituent” of the “optionally substituted 5- to 7-membered saturated cyclic amino-carbonyl” includes C1-3One or two alkyl (eg, methyl, etc.), phenyl, benzyl, etc. may be mentioned.
The “hydrocarbon group” may have, for example, the above-mentioned substituents at 1 to 5, preferably 1 to 3, substituents. When the number of substituents is 2 or more, each substituent is They may be the same or different.
[0013]
The “aromatic heterocyclic group” of the “optionally substituted aromatic heterocyclic group” represented by R is, for example, 1 or a carbon atom other than a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom. Examples thereof include monovalent groups formed by removing any one hydrogen atom from a 5- to 14-membered (preferably 5- to 10-membered) aromatic heterocycle containing 2 or 1 to 4 heteroatoms. Examples of the “5- to 14-membered (preferably 5- to 10-membered aromatic heterocycle)” include, for example, thiophene, benzo [b] thiophene, benzo [b] furan, benzimidazole, benzoxazole, benzothiazole, benziso Thiazole, naphtho [2,3-b] thiophene, furan, pyrrole, imidazole, pyrazole, pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, indole, isoindole, 1H-indazole, purine, 4H-quinolidine, isoquinoline, quinoline, phthalazine, naphthyridine , Quinoxaline, quinazoline, cinnoline, carbazole, β-carboline, phenanthridine, acridine, phenazine, thiazole, isothiazole, phenothiazine, isoxazole, furazane, phenoxazine, etc. Heterocyclic or aromatic ring (eg, benzene ring, etc.) of these rings (preferably monocycle) with one or more (preferably 1 or 2), such as fused formed ring are exemplified with.
Examples of the “aromatic heterocyclic group” include thienyl (eg, 2-thienyl, 3-thienyl), furyl (eg, 2-furyl, 3-furyl), pyridyl (eg, 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl), quinolyl (eg, 2-quinolyl, 3-quinolyl, 4-quinolyl, 5-quinolyl, 8-quinolyl), isoquinolyl (eg, 1-isoquinolyl, 3-isoquinolyl, 4-isoquinolyl, 5-isoquinolyl) , Pyrazinyl, pyrimidinyl (eg, 2-pyrimidinyl, 4-pyrimidinyl), pyrrolyl (eg, 3-pyrrolyl), imidazolyl (eg, 2-imidazolyl), pyridazinyl (eg, 3-pyridazinyl), isothiazolyl (eg, 3-isothiazolyl) ), Isoxazolyl (eg, 3-isoxazolyl), indolyl (eg, 1-indolyl, 2-indolyl, 3 Indolyl), benzothiazolyl (eg, 2-benzothiazolyl), benzothienyl (eg, 2-benzo [b] thienyl, 3-benzo [b] thienyl), benzofuranyl (eg, 2-benzo [b] furanyl, 3-benzo [ b] furanyl) and the like. Of these, for example, a 5- to 6-membered heterocyclic group containing 1 to 3 heteroatoms selected from a nitrogen atom, sulfur atom and oxygen atom in addition to carbon atoms (eg, 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl) Pyridyl) is preferred.
[0014]
Examples of the “substituent” of the “optionally substituted aromatic heterocyclic group” represented by R include, for example, the “substituent” of the “hydrocarbon group optionally having substituent”. The same number can be listed. Of these, hydroxy and the like are preferable.
[0015]
Examples of the “optionally substituted amino” represented by R include amino, guanidino, amino having a substituent, guanidino having a substituent, and the like.
Examples of the “substituent” of the “amino having a substituent” and “guanidino having a substituent” include, for example, the “hydrocarbon group optionally having substituent (s)” represented by R. Or the like.
Preferable examples of R include benzyl, benzoylmethyl, 3-pyridylaminocarbonylmethyl, 4-chlorophenylaminocarbonylmethyl, ethoxycarbonylmethyl, piperidinocarbonylmethyl, 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl, 3-hydroxy -2-Benzo [b] furanyl, guanidino and the like.
[0016]
In addition, the compound represented by the formula (I) includes the formula
[Formula 4]
[Wherein, X represents CH or a nitrogen atom, and R ′ represents a group obtained by removing X—H from R. ] Tautomers and salts thereof represented by the formula: The compound represented by the formula (I) or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the compound (I)) also includes the tautomer, a salt thereof, and a mixture thereof with the compound (I).
[0017]
As the “salt” of the compound represented by the formula (I) and the tautomer, a pharmaceutically acceptable salt is preferable, for example, a salt with an inorganic base, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, Examples include salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like. Preferable examples of the salt with inorganic base include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt; aluminum salt; ammonium salt and the like. Preferable examples of the salt with an organic base include salts with trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, N, N′-dibenzylethylenediamine and the like. Preferable examples of the salt with inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like. Preferable examples of the salt with organic acid include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p -Salts with toluenesulfonic acid and the like. Preferable examples of salts with basic amino acids include salts with arginine, lysine, ornithine and the like, and preferable examples of salts with acidic amino acids include salts with aspartic acid and glutamic acid, for example. It is done.
Specific examples of compound (I) include the compounds of Reference Examples 1 to 5 described later.
Compound (I) may be commercially available, or can be produced by a method known per se or a method analogous thereto.
[0018]
Examples of the metalloporphyrins of (c) include hemin, hematin, Sn (IV) protoporphyrin IX, Zn (II) protoporphyrin IX, Co (III) protoporphyrin IX, and the like.
[0019]
A substance having the ability to bind to MIF has an excellent cell death inhibiting action. For example, cell death due to oxidative stress, cell death due to serum removal, cell death due to lack of growth factor, cell death due to HMG-CoA reductase inhibitor, cell death due to anticancer agent, cell death due to NO, cell death due to amyloid β protein, etc. Suppress.
Furthermore, substances having the ability to bind to MIF include genes that are under the control of antioxidant response element (ARE) (eg, genes for factors that protect cells from various stresses) expression promoting action, gene proteins that are under the control of ARE (Genetic product) production enhancement (promotion) action or activity promotion.
The genes under ARE control include heme oxygenase-1, Liver glutathione S-transferase Ya subunit, Liver glutathione S-transferase Yc subunit, Glutathione S-transferase Yb subunit, Glutathione S-transferase Yc1 subunit, Examples include Gammma-glutamylcysteine synthetase, NAD (P) H: quinone reductase, UDP-glucuronosyltransferase, exon 1, Bilirunin-specific UDP-glucuronosyltransferase, NAD (P) H-menadione oxidereductase, and the like.
Thus, the compound which has the capability to couple | bond with MIF strongly suppresses the cell death by various causes by increasing the factor which protects a cell from stress.
Substances having the ability to bind to MIF have low toxicity, and as cell death inhibitors, for example, heart diseases (eg, cardiomyopathy, heart failure, angina pectoris, myocardial infarction, etc.), neurodegenerative diseases (eg, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, triplet repeat disease, prion disease, amyotrophic lateral sclerosis, cerebellar degeneration, retinitis pigmentosa, etc., cerebrovascular disease (eg, cerebral infarction, etc.), central nervous system infection (eg, HIV encephalitis, bacteria) Meningitis, etc.), traumatic diseases (eg, spinal cord injury, brain injury, etc.), demyelinating diseases (eg, multiple sclerosis, etc.), bone / joint diseases (eg, osteoporosis, osteoarthritis, rheumatism, etc.) ), Renal disease (eg, ischemic acute renal failure, hemolytic uremic syndrome, acute tubular necrosis, hydronephrosis, glomerulonephritis, diabetic nephropathy), liver disease (eg, viral hepatitis, alcoholic) Hepatitis, etc.), myelodysplastic diseases (eg, poor regeneration) Anemia, etc.), arteriosclerosis, diabetes, pulmonary hypertension, sepsis, inflammatory bowel disease, autoimmune diseases (eg, systemic lupus erythematosus, atopic dermatitis, etc.), transplant organ rejection, AIDS, cancer (Eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent) and a protective agent for organs for transplantation.
A substance having the ability to bind to MIF is made into a pharmaceutical composition according to a method known per se, and can be safely administered orally or parenterally to mammals (eg, humans, monkeys, etc.) in various dosage forms.
Specifically, a substance capable of binding to MIF is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier and orally administered as a tablet, pill, granule, capsule, syrup, emulsion, suspension, etc. Alternatively, it is administered parenterally, such as intravenously, subcutaneously and intramuscularly as an injection, suppository or sublingual tablet. Further, it may be administered sublingually, subcutaneously or intramuscularly as a sustained release preparation such as a sublingual tablet or a microcapsule.
[0020]
As the pharmaceutically acceptable carrier, various organic or inorganic carrier substances commonly used as pharmaceutical materials are used, and excipients, lubricants, binders, disintegrants, solvents, solubilizers, suspending agents. , Tonicity agents, buffering agents, soothing agents and the like. Further, if necessary, preparation additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners and the like can be used.
Preferable examples of the excipient include lactose, sucrose, D-mannitol, starch, crystalline cellulose, light anhydrous silicic acid and the like. Preferable examples of the lubricant include magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica and the like. Preferable examples of the binder include crystalline cellulose, sucrose, D-mannitol, dextrin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone and the like. Preferable examples of the disintegrant include starch, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium and the like. Preferable examples of the solvent include water for injection, alcohol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, corn oil and the like. Preferable examples of the solubilizer include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate and the like. Suitable examples of the suspending agent include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate; And hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and hydroxypropylcellulose. Preferable examples of the isotonic agent include sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like. Preferable examples of the buffer include buffers such as phosphate, acetate, carbonate and citrate. Preferable examples of the soothing agent include benzyl alcohol. Preferable examples of the preservative include paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like. Preferable examples of the antioxidant include sulfite and ascorbic acid.
[0021]
The dose of the substance having the ability to bind to MIF varies depending on the degree of symptoms; age, sex, body weight of administration subject; timing of administration, interval, nature of pharmaceutical preparation, preparation, type; type of active ingredient, etc. Although it is not limited, when used for the treatment of heart disease, it is usually about 10 μg to 100 mg / kg body weight, preferably 100 μg to 50 mg / kg body weight per day for an adult. The dose is usually divided into 1 to 4 times a day.
The content of the substance having the ability to bind to MIF in the cell death inhibitor is about 0.01 to 100% by weight of the whole agent.
[0022]
The cell death inhibitor of the present invention includes an HMG-CoA reductase inhibitor (eg, simvastatin, atorvastatin, etc.), a fibrate hyperlipidemia (eg, gemfibrozil), an anticancer agent, etc. (Eg, Ifosfamide, UFT, Adriamycin, Doxorubicin, Peplomycin, Cisplatin, Cyclophosphamide, 5-FU, Methotrexate, Mitomycin C When used in combination with Mitomycin C), Mitoxantrone, etc.) side effects such as HMG-CoA reductase inhibitors, fibrate hyperlipidemias, anticancer agents, etc., that are harmful to normal cells are reduced. The
[0023]
A cell death inhibitor can be screened using MIF.
Since a compound that binds to MIF suppresses cell death of various cells, a substance having a cell death inhibitory action can be obtained by selecting a substance that binds to MIF. The substance having a cell death inhibitory action is preferably a substance that promotes the expression of a gene under ARE control.
Specific examples of the screening method of the present invention include a method of screening a substance that binds to MIF using surface plasmon sensor technology.
Specifically, by measuring the change in surface plasmon when immobilizing MIF on the sensor chip surface of Biacore 3000 and then flowing a test substance dissolved in phosphate buffer (PBS) or the like on the chip surface, Screen for substances that bind to. For example, a test substance that gives a measured value of change in surface plasmon of 5 resonance units or more is selected as a cell death inhibitor.
Examples of test substances include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts and the like, and these compounds may be novel compounds. It may be a known compound.
[0024]
As specific examples of the screening method of the present invention, (i) when MIF and a compound capable of binding to labeled MIF (labeled compound) are mixed, and (ii) binding to test compound, MIF and labeled MIF A method of screening a substance that binds to MIF by measuring and comparing the binding amount of the labeled compound bound to MIF in the case of mixing compounds having the ability to label (labeled compound) is also included.
As the compound of the labeling compound, compound (I), metalloporphyrin, compound described in WO 03/020719 or a salt thereof, compound described in WO 02/094203 or a salt thereof, and the like are used. It is done.
Examples of the labeling agent used for labeling include radioisotopes, enzymes, fluorescent materials, luminescent materials, lanthanide elements, and spin reagents. Examples of radioisotopes include [125I], [131I], [ThreeH], [14C], [32P], [33P], [35S], [59Fe] or the like is used. As the enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. Examples of the fluorescent substance include cyanine fluorescent dyes (eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Bioscience)), fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, and the like. As the luminescent substance, for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used.
For example, in the above (ii), a test compound that inhibits the binding amount of the labeled compound bound to MIF in the case of (i) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more, It selects as a substance (cell death inhibitor) couple | bonded with MIF.
Examples of test substances include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts and the like, and these compounds may be novel compounds. It may be a known compound.
[0025]
The screening kit of the present invention contains MIF and, if necessary, the labeled compound.
The compound or salt thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention is a compound having a cell death inhibitory effect or a salt thereof, and is used as a cell death inhibitor similar to the above.
[0026]
In the present specification and drawings, bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on abbreviations by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or common abbreviations in the field, examples of which are described below. In addition, when there is an optical isomer with respect to an amino acid, the L form is shown unless otherwise specified.
[0027]
In addition, substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols.
[0028]
The sequence number in the sequence listing in the present specification indicates the following sequence.
[SEQ ID NO: 1]
The base sequence of the sense strand that matches the N-terminus of rat MIF containing the NdeI cleavage site on the 5'-end side used in Example 1 is shown.
[SEQ ID NO: 2]
The base sequence of the anti-sense strand corresponding to the C-terminus of rat MIF containing a SapI cleavage site on the 5'-end side used in Example 1 is shown.
[SEQ ID NO: 3]
The base sequence of the sense strand that matches the N-terminus of mouse MIF containing the NdeI cleavage site on the 5'-end side used in Example 1 is shown.
[SEQ ID NO: 4]
The base sequence of the anti-sense strand corresponding to the C terminus of mouse MIF containing a SapI cleavage site on the 5 'end side used in Example 1 is shown.
[0029]
The hybridoma cell BWS48-1 obtained in Reference Example 7 to be described later, from March 28, 2002, 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki, Japan, 1st 6th (zip code 305-8566), Deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as deposit number FERM BP-7991.
[0030]
In the following, reference examples, experimental examples and examples will be shown to explain the present invention in more detail, but these do not limit the scope of the present invention.
In the following reference examples, “%” means percent by weight unless otherwise specified.
1The H-NMR spectrum was measured with a Varian GEMINI 200 (200 MHz) spectrometer using tetramethylsilane as an internal standard. All δ values are given in ppm.
Other abbreviations used in the text have the following meanings.
s: singlet
d: Doublet
dd: double doublet
t: triplet
q: quartet
m: multiplet
J: coupling constant
Hz: Hertz
CDClThree : Deuterated chloroform
1H-NMR: Proton nuclear magnetic resonance
IR: Infrared absorption spectrum
【Example】
[0031]
Reference example 1
2- (2-Pyridyl) -4H-1,3-benzothiazin-4-one (Compound 1)
[Chemical formula 5]
Methyl thiosalicylate (1.6 g, 9.51 mM) and 2-cyanopyridine (1.0 g, 9.60 mM) were dissolved in toluene (2 ml), triethylamine (2 ml, 14.4 mM) was added thereto, and the mixture was heated under reflux for 8 hours. Toluene was distilled off. Ethanol was added to the residue, and the precipitate was collected by filtration to obtain crude crystals (1.7 g). This was purified by silica gel column chromatography (hexane: chloroform = 5: 1 → chloroform) to obtain the title compound as crystals (1.0 g, 43.4%).
Elemental analysis value C13H8N2As an OS
Calculated value (%) C: 64.98, H: 3.36, N: 11.66
Actual value (%) C: 64.93, H: 3.31, N: 11.59
1H-NMR (CDClThree) Δ: 7.50-7.75 (m, 4H), 7.85-8.00 (m, 1H), 8.50-8.60 (m, 2H), 8.70-8.80 (m, 1H).
IR (KBr): 1660cm-1
[0032]
Reference example 2
2- (3-Pyridyl) -4H-1,3-benzothiazin-4-one
[Chemical 6]
Methyl thiosalicylate (1.8 g, 10.7 mM) and 3-cyanopyridine (1.1 g, 10.56 mM) were dissolved in toluene (5 ml), triethylamine (2 ml, 14.4 mM) was added thereto, and the mixture was heated under reflux for 48 hours. The same operation as in Reference Example 1 was performed to obtain the title compound as crystals (1.1 g, 43.4%).
Elemental analysis value C13H8N2As an OS
Calculated value (%) C: 64.98, H: 3.36, N: 11.66
Actual value (%) C: 64.97, H: 3.33, N: 11.63
[0033]
Reference example 3
2- (4-Pyridyl) -4H-1,3-benzothiazin-4-one
[Chemical 7]
Methyl thiosalicylate (2.0 g, 11.9 mM) and 4-cyanopyridine (1.2 g, 11.5 mM) were dissolved in toluene (5 ml), triethylamine (2 ml) was added thereto, and the mixture was heated under reflux for 22 hours. The title compound was obtained as crystals (850 mg, 30.7%).
Elemental analysis value C13H8N2As an OS
Calculated value (%) C: 64.98, H: 3.36, N: 11.66
Actual value (%) C: 65.07, H: 3.15, N: 11.62
[0034]
Reference example 4
2- (4-Oxo-3,4-dihydro-2H-1,3-benzothiazin-2-ylidene) ethyl acetate
[Chemical 8]
Methyl thiosalicylate (6 g, 35.7 mM) and ethyl cyanoacetate (4 g, 35.4 mM) were dissolved in toluene (10 ml), triethylamine (5 ml, 35.8 mM) was added thereto, and the mixture was heated to reflux for 7 hours. The reaction mixture was concentrated, ethanol was added to the residue and the mixture was allowed to stand, and the precipitated crystals were collected by filtration to obtain crude crystals. This was recrystallized from ethanol to give the title compound as needles (5.4 g, 60.7%).
Elemental analysis value C12H11NOThreeAs S
Calculated Value (%) C: 57.82, H: 4.45, N: 5.62
Actual value (%) C: 57.86, H: 4.36, N: 5.51
1H-NMR (CDClThree) Δ: 1.31 (t, 3H, J = 7.0Hz), 4.22 (q, 2H, J = 7.0Hz), 5.57 (s, 1H), 7.35 (t, 2H, J = 7.4Hz), 7.50-7.60 ( m, 1H), 8.28 (d, 1H, J = 7.4Hz), 9.73 (s, 1H).
IR (KBr) cm-1: 1660, 1590, 1580, 1560, 1440, 1295, 1165, 730.
[0035]
Reference Example 5
2- [2-oxo-2- (1-piperidinyl) ethylidene] -2,3-dihydro-4H-1,3-benzothiazin-4-one
[Chemical 9]
Dissolve methyl thiosalicylate (1.7 g, 10.1 mM) and 1-cyanoacetylpiperidine (2.0 g, 13.1 mM) in toluene (5 ml), add triethylamine (2 ml, 14.4 mM) to this, and heat to reflux for 30 hours The reaction solution was concentrated to obtain crude crystals. This was recrystallized from ethanol to give the title compound as needles (730 mg, 25%).
Elemental analysis value C15H16N2O2As S
Calculated value (%) C: 62.48, H: 5.59, N: 9.71
Actual value (%) C: 62.22, H: 5.58, N: 9.65
NMR (CDClThree) Δ: 1.30-1.80 (m, 6H), 3.30-3.70 (m, 4H), 5.30 (s, 1H), 6.90-7.60 (m, 3H), 8.27 (dd, 1H, J = 8Hz, J = 2Hz ).
IR (KBr) cm-1: 1660, 1595, 1560.
[0036]
Reference Example 6
Preparation of rat MIF protein and mouse MIF protein
(1) Construction of MIF expression vector
After cutting the T7 promoter expression plasmid pET32b (+) (Novagen) with SapI and TthIII, the cut surface is blunted and circularized again to obtain pET32b-1 with the SapI cleavage site removed from pET32b (+). It was. Next, pCYB1 (IMPACT I: One-Srep Protein Purification System, New England BioLabs) was cleaved with NdeI and BglI to recover the DNA fragment of the region that encodes the multiple cloning site and the intein-chitin binding domain fusion protein. The BglI cleavage site was blunt-ended and then inserted between the NdeI and EcoRV sites of pET32b-1 to obtain pET32b-Int-CBD.
Next, a region encoding MIF was amplified by polymerase chain reaction (PCR) from a rat and mouse brain complementary DNA (cDNA) library (GIBCO BRL). For rat MIF cDNA amplification, the sense strand (SEQ ID NO: 1) coincides with the N-terminus of rat MIF containing the NdeI cleavage site at the 5 ′ end and the C-terminus of rat MIF containing the SapI cleavage site at the 5 ′ end. An anti-sense strand (SEQ ID NO: 2) consistent with was used. For mouse MIF cDNA amplification, the sense strand (SEQ ID NO: 3) coincides with the N-terminus of mouse MIF containing the NdeI cleavage site at the 5 ′ end and the C-terminus of mouse MIF containing the SapI cleavage site at the 5 ′ end. An anti-sense strand (SEQ ID NO: 4) consistent with was used. The amplified MIF cDNA is cleaved with NdeI and SapI, and then inserted between the NdeI and SapI cleavage sites of pET32b-Int-CBD, respectively, and the MIF-intein-chitin binding domain fusion protein expression plasmid pET32b-rMIF-Int-CBD And pET32b-mMIF-Int-CBD were obtained. The MIF cDNA sequence in the obtained expression plasmid was confirmed using a DNA sequencing system (Applied Biosystems).
[0037]
(2) Preparation of rat MIF protein
After transforming pET32b-rMIF-Int-CBD into E. coli BL21 (DE3) (Novagen), inoculate ampicillin-added LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) (LBamp medium) And cultured overnight at 37 ° C. with shaking. This was transferred to LBamp medium to 1%, cultured at 37 ° C for about 2 hours with shaking, then cultured at 22 ° C for about 1 hour, and 0.4 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) was added and further cultured at 15 ° C. for 24 hours to induce expression of rat MIF-intein-chitin binding domain fusion protein. After completion of the culture, E. coli was recovered, suspended in a column buffer (20 mM Tris-HCl; pH 8.0, 500 mM NaCl, 0.1 mM EDTA) containing 1/10 volume of 0.1% Triton X-100 and sonicated. . The cell disruption solution was centrifuged at 12000 rpm for 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant was recovered. The collected supernatant was passed through a chitin bead column (New England BioLabs) equilibrated with a column buffer containing 0.1% Triton X-100 to bind the MIF-intein-chitin binding domain fusion protein to the column. Non-specifically bound proteins and accompanying substances were removed by washing with a column buffer containing 0.1% Triton X-100 of 10 times the column size and a column buffer of 10 times the column size. Next, the buffer in the column was replaced with a column buffer containing 50 mM dithiothreitol and allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours or longer, so that the MIF protein was excised from the fusion protein using the protein splicing activity of intein. The excised MIF protein was eluted with column buffer and dialyzed against 20 mM sodium phosphate buffer.
(3) Preparation of mouse MIF protein
Mouse MIF protein was obtained in much the same way as rat MIF protein. However, 0.1% Triton X-100 was not added to the column buffer (20 mM Tris-HCl; pH 8.0, 500 mM NaCl, 0.1 mM EDTA) suspended when the E. coli expressing the protein was disrupted.
[0038]
Reference Example 7
Production of monoclonal anti-mouse MIF antibody
(1) Preparation of hybridoma cells producing anti-mouse MIF
(I) Immunity
6-8 week old BALB / C female mice were immunized subcutaneously with complete Freund's adjuvant so that each mouse MIF obtained in Reference Example 6 was about 50 μg / mouse. Thereafter, every two weeks, the same amount of immunogen was boosted 2-3 times with incomplete Freund's adjuvant.
(Ii) Measurement of antibody titer in antiserum of mice immunized with mouse MIF
Mouse MIF was immunized twice at 2-week intervals, and one week later, blood was collected by collecting the fundus. Further, the blood was centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C., and the supernatant was recovered to obtain antiserum. The antibody titer in the antiserum was measured by the following method. To prepare a mouse MIF-coupled microplate, first, 100 μl of phosphate buffered saline solution (PBS, pH 7.4) containing 2 μg / ml of mouse MIF was dispensed into a 96-well microplate and allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours. did. Next, after washing the plate with PBS containing 0.5% Tween-20, 200 μl of PBS containing 2% BSA (manufactured by Sigma) was dispensed in order to block excess binding sites in the well, and the plate was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Processed.
100 μl of antiserum diluted with PBS was added to each well of the obtained anti-mouse MIF-coupled microplate and allowed to react at room temperature for 2 hours. Next, after the plate was washed with PBS containing 0.5% Tween-20, 100 μl of HRP-labeled anti-mouse IgG-gamma (diluted 5,000 times with PBS) was added and reacted at room temperature for 1 hour. Next, after washing the plate with PBS containing 0.5% Tween-20, 100 μl of TMB microwell peroxidase substrate system (KIRKEGAARD & PERRY LAB, INC, handled by Funakoshi Chemical) was added to the enzyme activity on the solid phase for 10 minutes at room temperature. I left it alone. After stopping the reaction by adding 100 μl of 1M phosphoric acid, the absorbance at 450 nm was measured with a plate reader (BICHROMATIC, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.).
(Iii) Production of monoclonal anti-mouse MIF antibody
Final immunization was performed by intravenously inoculating mice showing a relatively high antibody titer with 10 to 100 μg of immunogen dissolved in 0.2 ml of physiological saline. The spleen was removed from the mouse 4 days after the final immunization, and the spleen cells were migrated with a slide glass and filtered with a mesh. The cells were suspended in Eagles Minimum Essential Medium (MEM) to obtain a spleen cell suspension. As cells used for cell fusion, BALB / C mouse-derived myeloma cells P3-X63.Ag8.U1 (P3U1) were used (Current Topics in Microbiology and Imnology, vol. 81, page 1, 1978).
Cell fusion was performed according to the original method (Nature, 256, 495, 1975). That is, each spleen cell and P3U1 were washed 3 times with MEM without serum, mixed so that the ratio of the number of spleen cells to P3U1 was 5: 1, and centrifuged at 800 rpm for 15 minutes to precipitate the cells. It was. After sufficiently removing the supernatant, the precipitate was lightly loosened, 0.3 ml of 45% polyethylene glycol (PEG) 1500 (manufactured by Sigma) was added, and the mixture was allowed to stand in a 37 ° C. hot water bath for 7 minutes for fusion. After the fusion, MEM was added to the cells at a rate of 2 ml / min, and a total of 15 ml of MEM was added, followed by centrifugation at 600 rpm for 15 minutes to remove the supernatant. This cell precipitate is added to CM-B medium (Sanko Junyaku) and P3U1 is 2 x 10 per ml.FiveThe cells were floated so that they became individual, and 1 ml of 1 well was seeded in 192 wells in a 24-well multi-dish (manufactured by Coaster). After seeding, the cells were cultured in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. 24 hours later, HAT (hypoxanthine 1x10-FourM, aminopterin 4x10-7M, thymidine 1.6x10-3The HAT selective culture was started by adding 1 ml of CM-B medium (HAT medium) containing M) per well. The HAT selective culture was continued by discarding 1 ml of the old solution 3, 5, 7 and 9 days after the start of the culture, and then adding 1 ml of HAT medium. Hybridoma growth was observed 9-14 days after cell fusion, and when the culture broth turned yellow (about 1 × 106Cell / ml), the supernatant was collected, and the antibody titer was measured according to the method described in (ii), followed by cell cloning to obtain hybridoma cell BWS48-1.
This hybridoma was administered to mice (BALB / C) that received 0.5 ml of mineral oil by intraperitoneal injection.6After the cells / animal were intraperitoneally administered, antibody-containing ascites was collected 6 to 20 days later.
The monoclonal antibody labeled with BWS48-1a was purified from the obtained ascites using a protein-G column. That is, recombinant protein-G-Sepharose (manufactured by Pharmacia) was prepared by diluting 6-20 ml of ascites with a double volume of binding buffer [20 mM phosphate buffer (pH 7.0)] and equilibrating in advance with a binding buffer. The column was applied to a column and the specific antibody was eluted with an elution buffer [0.1 M glycine buffer (pH 2.7)]. The eluate was dialyzed against PBS at 4 ° C. for 2 days, sterilized by filtration through a 0.22 μm filter (Millipore), and stored at 4 ° C. or -80 ° C.
[0039]
Experimental example 1
Binding of MIF to Compound 1
The binding between rat MIF obtained in Reference Example 6 and compound 1 obtained in Reference Example 1 was analyzed using BIACORE3000 (manufactured by Biacore).
After immobilization of rat MIF on sensor chip CM5 (manufactured by Biacore), a phosphate buffer solution (PBS) containing 10 μM of compound 1 was passed over the chip, and the change in surface plasmon resonance signal was taken as the binding of the compound to rat MIF. It was measured.
The results are shown in FIG.
This shows that Compound 1 binds to MIF.
[0040]
Experimental example 2
(1) Cardiomyocyte death inhibitory action of monoclonal antibody BWS48-1a and compound 1
Newborn pups (those within 1 day after birth) were obtained from pregnant Wistar rats purchased from Charles River, Japan. They were anesthetized with ether, disinfected with 70% ethanol, and the heart was removed with tweezers. The excised heart was washed with phosphate buffered saline (manufactured by TAKARA, T900), and then cut into pieces with surgical scissors. The tissue pieces were washed 4-5 times with phosphate buffered saline to remove most blood-derived non-cardiomyocytes. 5 ml enzyme solution [trypsin (1.25 mg) (manufactured by Difco) and collagenase (0.25 mg) (manufactured by Sigma) were dissolved in 5 ml of enzyme solution (phosphate buffer (1 ml)] And stirred with a stirrer for 15 minutes while maintaining the temperature at 37 ° C. To this, 2.5 ml of enzyme solution was added, and the mixture was further stirred for 15 minutes, and this operation was repeated twice. Subsequently, Medium 199 (Gibco) containing 10% fetal bovine serum (BioWicker) was added to stop the enzyme reaction by adding 1/2 volume of the enzyme solution, and this was treated with Cell Strainer (Falcon). The cells were collected by centrifugation at 400 × g for 5 minutes.
The cells of 10 newborns collected in this way are suspended in Medium 199 containing 50 ml of 10% fetal calf serum, seeded 10 ml each in a 100 mm petri dish (Iwaki), and 5% CO.2CO set at 37 ° C2The cells were cultured for 1 hour in an incubator. Thereafter, the cells were collected, filtered through a cell strainer, and centrifuged at 400 × g for 5 minutes to collect primary cardiomyocytes derived from rat neonates.
Next, primary cardiomyocytes derived from newborn rats (for 10 animals) were added to 2 ml of hypotonic solution [water (1 L), NHFourCl (8.29g), KHCOThree(1.0 g) and EDTA / 2Na (ethylenediaminetetraacetic acid disodium; dissolved in Dojindo Laboratories) (37 mg)] and suspended for 3 minutes to disrupt erythrocytes. Medium 199 containing 10 ml of 10% fetal calf serum was added thereto, and centrifuged at 400 × g for 5 minutes to collect primary cardiomyocytes derived from rat neonates. This was suspended in Medium 199 containing 10% fetal calf serum and filtered with a cell strainer. A part of the obtained cardiomyocyte suspension was taken, 0.3% trypan blue was added thereto, mixed gently, and the number of cardiomyocytes was counted using a hemocytometer.
The neonatal rat primary cardiomyocytes prepared in this way were 3 × 10FiveSuspended in Medium 199 containing 10% fetal bovine serum so that the number of cells per ml is 0.1 ml / well in 96-well plates, 5% CO2CO set at 37 ° C2The cells were cultured for 1 day in an incubator. This was stirred with a micromixer (manufactured by Taiyo Chemical Co., Ltd.), then exchanged with Medium 199 containing no serum three times to remove serum, added with a test sample, and further cultured for 4 days to induce cell death. As a test sample, the monoclonal antibody BWS48-1a obtained in Reference Example 7 or Compound 1 obtained in Reference Example 1 was used.
Then add fetal bovine serum to 10% and add 5% CO2.2CO set at 37 ° C2After further incubation for about 17 hours in an incubator, WST-8 [2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium, monosodium The cardiomyocyte death inhibitory effect was examined by measuring the number of living cells using a cell count kit (produced by Dojindo Laboratories) using salt] as a chromogenic substrate.
The above experiment was performed three times independently.
FIG. 2 shows the mean number (± SD) of the number of viable cells in the control antibody (mouse IgG) and monoclonal antibody BWS48-1a added groups when the number of viable cells in the antibody-free group is 1.
The average value (± SD) of the minimum effective concentration necessary for the suppression of cell death of Compound 1 was 0.015 ± 0.011 μM. The minimum effective concentration was the concentration of Compound 1 required to increase by 30% compared to the average cell number when Compound 1 was not added.
From the above results, it can be seen that monoclonal antibody BWS48-1a and compound 1 have cardiomyocyte death inhibitory activity.
(2) Inhibition of cardiomyocyte death by hemin and hematin
3x10 primary neonatal rat cardiomyocytes prepared in the same manner as (1) aboveFiveSuspended in Medium 199 containing 10% fetal bovine serum so that the number of cells per ml is 0.1 ml / well in 96-well plates, 5% CO2CO set at 37 ° C2The cells were cultured for 1 day in an incubator. This was stirred with a micromixer (manufactured by Taiyo Chemical Co., Ltd.), then exchanged with Medium 199 containing no serum three times to remove serum, added with a test sample, and further cultured for 4 days to induce cell death. As a test sample, hemin or hematin was used.
Then add fetal bovine serum to 10% and add 5% CO2.2CO set at 37 ° C2After further incubation for about 17 hours in an incubator, the cardiomyocyte death inhibitory effect was examined by measuring the number of living cells using a cell count kit (made by Dojindo Laboratories) using WST-8 as a chromogenic substrate. It was.
The above experiment was performed three times independently.
FIG. 7 shows the average number (± SD) of the number of viable cells in the groups added with hemin and hematin when the number of viable cells in the subject-free group is 1.
From the above results, it can be seen that hemin and hematin have cardiomyocyte death inhibitory activity.
[0041]
Experimental example 3
Inhibitory effect on doxorubicin-induced cardiomyocyte death
6 x 10 primary cardiomyocytes derived from rat neonates obtained in Experimental Example 2FiveSuspended in Medium 199 containing 10% fetal bovine serum so that the number of cells per ml is 0.1 ml / well in 96-well plates, 5% CO2CO set at 37 ° C2The cells were cultured for 1 day in an incubator. This was stirred with a micromixer (manufactured by Taiyo Chemical Co., Ltd.), then washed three times with Medium 199 without serum to remove the serum, Medium 199 and a test sample were added, and the mixture was cultured for 3 hours. After culture, doxorubicin (DOX: final concentration 200 μM) was added, and further cultured for 18 hours to induce cell death. Then add fetal calf serum to 10% and add 5% CO2.2CO set at 37 ° C2After further incubation for about 17 hours in an incubator, the cardiomyocyte death inhibitory effect was examined by measuring the number of living cells using a cell count kit (made by Dojindo Laboratories) using WST-8 as a chromogenic substrate. It was. The above experiment was performed three times independently. The number of living cells in each experimental group was shown as an average value (± SD) of the number of living cells in each experimental group when the number of living cells in the doxorubicin-free group was 1.
The results are shown in FIG.
From this, it can be seen that Compound 1 has an inhibitory activity against cardiomyocyte death induced by doxorubicin.
[0042]
Experimental Example 4
Inhibitory effect on statin-induced cardiomyocyte death
6 x 10 primary cardiomyocytes derived from rat neonates obtained in Experimental Example 2FiveSuspended in Medium 199 containing 10% fetal bovine serum so that the number of cells per ml is 0.1 ml / well in 96-well plates, 5% CO2CO set at 37 ° C2The cells were cultured for 1 day in an incubator. After stirring this with a micromixer (manufactured by Taiyo Chemical Co., Ltd.), the serum was removed by exchanging with Medium 199 without serum three times, and simvastatin (0.3 μM) or atorvastatin (1 μM) and Compound 1 were added. The culture was further continued for 3 days. Then add fetal bovine serum to 10% and add 5% CO2.2CO set at 37 ° C2After further culturing for about 17 hours in an incubator, cardiomyocyte death induced by statin by measuring the number of living cells using a cell count kit (made by Dojindo Laboratories) using WST-8 as a chromogenic substrate The inhibitory effect on selenium was investigated. The above experiment was performed three times independently. The number of living cells in each experimental group was shown as an average value (± SD) of the number of living cells in each experimental group when the number of living cells in the statin-free group was 1.
The results are shown in FIG. 4 and FIG.
This shows that simvastatin (0.3 μM) and atorvastatin (1 μM) induce cardiomyocyte death, and that compound 1 has an inhibitory activity against cardiomyocyte death induced by an HMG-CoA reductase inhibitor.
[0043]
Experimental Example 5
Inhibitory effect on vascular smooth muscle cell death induced by serum removal
4 × 10 normal human umbilical vein endothelial cells (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.)FourAfter suspension in MCDB131 medium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 10% fetal calf serum to inoculate 0.1 ml / well in a 96-well plate, 5% CO2CO set at 37 ° C2Cultured for 1 day in an incubator. This was stirred with a micromixer (manufactured by Taiyo Kagaku Kogyo Co., Ltd.), the medium was removed, the MCDB131 medium without serum and the compound 1 obtained in Reference Example 1 were added, and the mixture was cultured for 3 days. After culturing, the cardiomyocyte death inhibitory action was examined by measuring the number of living cells using a cell count kit (manufactured by Dojindo Laboratories) using WST-8 as a chromogenic substrate. The above experiment was performed three times independently. The number of viable cells was shown as an average value (± SD) of the number of viable cells in each concentration-added group when the number of viable cells in the group without compound 1 was 1.
The results are shown in FIG.
This shows that Compound 1 has an inhibitory activity against vascular smooth muscle cell death induced by serum removal.
[0044]
Experimental Example 6
Inhibitory action on human articular chondrocyte death induced by NO
Human normal articular chondrocytes (Clonetics) were grown in monolayer culture in a growth medium for articular chondrocytes (CGM, Clonetics) and then 2.0 × 10 in a 155 mM NaCl solution containing 1.2% alginate.6Cells were suspended at a density of 1 cell / ml, and beads having a diameter of 2 mm were prepared using a syringe equipped with a 22 gauge needle. The beads were cultured in a 96-well round bottom plate (1 bead / well, manufactured by Falcon) supplemented with differentiation medium for articular chondrocytes (CDM, Clonetics) for 7 days, and then compound 1 (0.1 μM or 1 μM) and The cells were cultured for 48 hours in place of α-modified minimum essential medium containing 10% fetal calf serum, and further cultured for 5 hours in the presence of 1.5 mM sodium nitroprusside (NO generator, Sigma). As controls, caspase 3 inhibitor (Z-DEVD-FMK, 100 μM, manufactured by R & D Systems) and caspase 9 inhibitor (Z-LEHD-FMK, 100 μM, manufactured by R & D Systems) were also examined in the same manner. After the experiment was completed, alginic acid was removed, and cell viability was measured by MTT method using 3- (4,5-dimethyl-thiazole-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide. The results are shown in Table 1.
[Table 1]
The numerical values in the table represent the average value (± SD) of the cell death inhibition rate converted from the MTT method measurement value. The cell viability after addition of 1.5 mM sodium nitroprusside (no compound 1 or control drug) was 31.9%.
It can be seen that Compound 1 has an inhibitory activity against human articular chondrocyte death induced by NO.
[0045]
Experimental Example 7
Gene expression analysis with DNA chip
1.5x10 primary neonatal rat cardiomyocytes obtained in Experimental Example 2FiveSuspend in Medium 199 containing 10% fetal calf serum so that there are 2ml / well in a 12-well plate (Asahi Techno Glass Co., Ltd.).2And cultured at 37 ° C. for 1 day. After stirring gently, this was washed 3 times with Medium 199 medium to remove serum, and Medium 199 medium and Compound 1 were added to add 5% CO.2The cells were cultured at 37 ° C. for 21 hours. Next, the culture solution is removed, and total RNA is recovered using the RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Using this gene, an exhaustive gene analysis is performed using the GeneChip expression analysis array (Rat Genome U34A array: AFFYMETRIX). Expression analysis was performed. The expression increase rate of each gene was expressed as the expression level when the compound was added when the expression level when no compound was added was 1.
The results are shown in Table 2.
[Table 2]
This shows that Compound 1 enhances the expression of genes under the control of Antioxidant response element (ARE).
[0046]
Experimental Example 8
Compound 1 increases heme oxygenase-1 production
The neonatal rat primary cardiomyocytes obtained in Experimental Example 2 were 1.5 × 10FiveSuspended in Medium 199 containing 10% fetal calf serum to give 1 ml / ml, seeded at 2 ml / well in a 12-well plate (Asahi Techno Glass), 5% CO2And cultured at 37 ° C. for 1 day. This is washed 3 times with Medium 199 medium to remove serum, compound 1 is added, and 5% CO2The cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours. After completion of the culture, the cardiomyocytes were washed once with PBS (−), and 100 μl of cell lysis buffer [10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA · 2Na, 1 mM ethyleneglycol -bis- (β-aminoethylether) N, N, N ', N'-tetraacetic acid, 0.5 mM (p-aminophenyl) methanesulfonyl fluoride hydrochloride, 200 μM sodium β-Glycerophosphate n-hydrate, 20 mM NaF, 2 mM sodium diphosphate decahydrate, After adding 10 μg / ml aprotinin, 10 μg / ml leupeptin, 1% Triton X-100, 0.5% Nonidet P40, 0.1% sodium dodesyl sulfate], the cell debris was separated from the plate using a cell scraper, The cell lysis buffer was collected, and the collected cell lysis buffer was mixed with an equal volume of sample buffer (Tris-SDS-ME Sample Buffer; manufactured by Daiichi Chemical) and heat treated at 95 ° C for 5 minutes. After that, SDS polyacrylamide electrophoresis was performed using Multigel (Daiichi Chemical Co., Ltd.). Nitrocellulose membrane (Hybond-ECL; manufactured by Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.) soaked for 10 minutes or more in a cutting buffer (0.1 M Tris (hydroxymethyl) aminomethane, 0.192 M glycine, 20% ethanol), blotting filter paper, Place dialysis membrane and gel on horizon blot (ATTO), 100 mA / gel (64 cm)2) For 1 hour to adsorb the protein in the gel to the nitrocellulose membrane. Then immerse the nitrocellulose membrane in blocking buffer [TTBS buffer containing 20% skim milk powder (20 mM Tris-HCl, pH7.6, 0.137 M NaCl, 0.1% Tween-20)] and stir at room temperature for 1 hour And blocking. Next, the above-mentioned nitrocellulose membrane was immersed in an anti-HO-1 antibody solution (manufactured by StressGen) diluted 1000 to 2000 times with a blocking buffer, and reacted at 4 ° C. for 12 to 18 hours. After completion of the reaction, this nitrocellulose membrane was washed 3 times with TTBS buffer, and then immersed in horseradish peroxidase-labeled anti-rabbit IgG antibody solution (NEW ENGLAND BioLabs) diluted 2000 times with blocking buffer for 1 hour at room temperature. Reacted. After completion of the reaction, the membrane was washed 3 times with TTBS buffer, and the amount of protein was measured using Western blotting detection reagent (ECL + Plus; manufactured by Amersham) and Hyperfilm ECL (produced by Amersham). The production increase rate of heme oxygenase-1 protein was expressed as the production amount when the compound was added when the production amount when no compound was added was 1.
The results are shown in Table 3.
[Table 3]
This shows that Compound 1 increases the production amount of heme oxygenase-1, which is one of the products of genes under the control of Antioxidant response element (ARE).
[0047]
Example 1
Tablets are prepared in a conventional manner using Compound 1 (100 mg), lactose (165 mg), corn starch (25 mg), polyvinyl alcohol (4 mg) and magnesium stearate (1 mg).
Example 2
Screening for compounds that bind to MIF
After immobilizing the rat MIF obtained in Reference Example 6 on a sensor chip CM5 (manufactured by Biacore), 10 μM 3- [2- (4-oxo-4H-1,3-benzothiazin-2-yl) -4 A phosphate buffer (PBS) containing -pyridyl] propionic acid (the compound of Example 308 described in WO 03/020719) was run over the chip, and the change in surface plasmon resonance signal was measured as the binding of the compound to rat MIF.
The results are shown in FIG.
Thus, 3- [2- (4-oxo-4H-1,3-benzothiazin-2-yl) -4-pyridyl] propionic acid could be selected as a substance that binds to MIF.
[0048]
【The invention's effect】
A substance having an ability to bind to a macrophage migration inhibitory factor has low toxicity and an excellent cell death inhibitory action. For example, cell death due to oxidative stress, cell death due to serum removal, cell death due to lack of growth factor, cell death due to HMG-CoA reductase inhibitor, cell death due to anticancer agent, cell death due to NO, cell death due to amyloid β protein, etc. Suppress. Furthermore, expression of genes under ARE control (eg, genes of factors that protect cells from various stresses) is promoted, production of gene proteins (gene products) under ARE control is enhanced, or activity is promoted. Therefore, the cell death inhibitor of the present invention includes, for example, heart diseases (eg, cardiomyopathy, heart failure, angina pectoris, myocardial infarction, etc.), neurodegenerative diseases (eg, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, triplet repeat disease, prion disease). , Amyotrophic lateral sclerosis, cerebellar degeneration, retinitis pigmentosa, etc., cerebrovascular disease (eg, cerebral infarction, etc.), central nervous system infection (eg, HIV encephalitis, bacterial meningitis, etc.), traumatic Disease (eg, spinal cord injury, brain injury, etc.), demyelinating disease (eg, multiple sclerosis, etc.), bone / joint disease (eg, osteoporosis, osteoarthritis, rheumatism, etc.), renal disease (eg, ischemic) Acute renal failure, hemolytic uremic syndrome, acute tubular necrosis, hydronephrosis, glomerulonephritis, diabetic nephropathy, etc.), liver disease (eg, viral hepatitis, alcoholic hepatitis, etc.), myelodysplastic disease ( Eg aplastic anemia), arteriosclerosis, diabetes, lung Blood pressure, sepsis, inflammatory bowel disease, autoimmune disease (eg, systemic lupus erythematosus, atopic dermatitis, etc.), transplant organ rejection, AIDS, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate) Cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) It is useful as a protective agent.
Furthermore, when the cell death inhibitor of the present invention is used in combination with an HMG-CoA reductase inhibitor, a fibrate hyperlipidemia agent, an anticancer agent, etc., the HMG-CoA reductase inhibitor, fibrate hyperlipidemia Side effects such as drugs and anticancer drugs that damage normal cells are reduced.
Moreover, the screening of the present invention can efficiently select a substance that binds to MIF, and can provide an excellent cell death inhibitor with low toxicity.
[0049]
[Sequence Listing]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the binding results of MIF and Compound 1. In the figure, the vertical axis represents a surface plasmon resonance signal (resonance unit), and the horizontal axis represents time (seconds).
FIG. 2 shows the results of a myocardial cell death inhibitory effect of monoclonal antibody BWS48-1a. In the figure, □ indicates BWS48-1a, and ■ indicates a control antibody.
FIG. 3 shows the results of the inhibitory action of Compound 1 on cardiomyocyte death induced by doxorubicin (DOX).
FIG. 4 shows the results of the inhibitory action of Compound 1 on cardiomyocyte death induced by simvastatin.
FIG. 5 shows the results of the inhibitory action of Compound 1 on cardiomyocyte death induced by atorvastatin.
FIG. 6 shows the results of the inhibitory action of Compound 1 on vascular smooth muscle cell death induced by serum removal.
FIG. 7 shows the results of cardiomyocyte death inhibitory action of hemin and hematin. In the figure, □ indicates hemin and ■ indicates hematin.
FIG. 8 shows the results of screening for compounds that bind to MIF. In the figure, the vertical axis represents a surface plasmon resonance signal (resonance unit), and the horizontal axis represents time (seconds).
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