JP4412530B2 - Hairless mice or hairless rats with mutations in the TRPV3 gene - Google Patents
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Description
本発明は、ＴＲＰＶ３遺伝子に優性遺伝する無毛を引き起こす変異を持つ無毛マウスまたは無毛ラットに関する。 The present invention relates to a hairless mouse or hairless rat having a hairless mutation that is inherited dominantly in the TRPV3 gene.
一般に、病気の発症メカニズムの解明や治療薬・治療方法の開発には疾患モデル動物の開発が重要であり、様々な病態モデル動物が作出されている。皮膚炎を自然発症する動物も見出されており、例えば、アトピー性皮膚炎を発症するＮＣ／Ｎｇａマウス（例えば、非特許文献１参照）、湿潤性および乾燥性の皮膚病変を発症する無毛マウス（ＮＯＡマウス）(例えば、特許文献１および非特許文献２参照)、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａ ｃｐｄｍ／ｃｐｄｍ（例えば、非特許文献３参照）などが報告されている。従来、皮膚炎治療薬等の研究に利用されてきた動物としては、マウス、ラット、ウサギ等が挙げられるが、これらの動物は通常有毛であり、研究に用いるためには、皮膚炎症状の目視や薬剤塗布の必要性から剃毛等の作業をする必要があった。これらの作業は煩雑な上に皮膚への無用な刺激を与える等、炎症の均一性、再現性に問題があった。そのため、これらの作業を行なわずとも、皮膚炎治療薬等の研究に使用できる無毛の病態モデル動物の開発が要望されていた。
また、突然変異により無毛のマウスまたはラットが存在することはあったが、それらの無毛形質は劣性遺伝するため、無毛系統の作出が困難であった。さらに、DS-Nhマウス（例えば、非特許文献４および５参照参照）やＫＳＤＲ（例えば、特許文献２参照参照）という無毛形質を優性遺伝するマウスまたはラットが知られているが、遺伝子は特定されておらず、おおよその位置が推測されているに過ぎない（例えば、非特許文献６参照）。そのため、他の系統の動物で無毛を優性遺伝することを特徴とする動物を作出するには戻し交配をする必要があり、時間と手間がかかるという不利があった。これらのことから、遺伝子工学を利用した方法等で容易に無毛系統の動物を作出するために、優性の無毛形質を決定している遺伝子の特定が望まれている。
In general, development of disease model animals is important for elucidating the onset mechanism of diseases and developing therapeutic drugs and treatment methods, and various disease state model animals have been created. Animals that spontaneously develop dermatitis have also been found, such as NC / Nga mice that develop atopic dermatitis (see, for example, Non-Patent Document 1), hairlessness that develops wet and dry skin lesions. Mice (NOA mice) (for example, see
In addition, hairless mice or rats may exist due to the mutation, but since the hairless traits were inherited recessively, it was difficult to produce a hairless strain. Furthermore, mice or rats that are dominantly inherited hairless traits such as DS-Nh mice (see, for example, Non-patent Documents 4 and 5) and KSDR (see, for example, Patent Document 2) are known. It is not done and only an approximate position is estimated (for example, see Non-Patent Document 6). Therefore, in order to produce animals characterized by dominant inheritance of hairlessness in other strains of animals, it is necessary to backcross, which is disadvantageous in that it takes time and effort. From these facts, in order to easily produce a hairless animal by a method using genetic engineering, etc., it is desired to identify a gene that determines a dominant hairless trait.
皮膚炎モデル動物として現在広く使用されているマウスまたはラットは有毛であり、薬剤塗布のための剃毛処理による手間やマウスまたはラットへの刺激を避けることができず、また、見た目の評価が重要となる皮膚炎の病状を目視することが難しい。しかし、本来無毛であるヒトに近い状態での評価ができる無毛マウスまたは無毛ラットは優性遺伝する遺伝子が特定されておらず、無毛系統の作出には面倒と困難を伴った。
上記のような技術背景の中、容易に無毛系統の動物を作出するために、無毛形質を優性遺伝する遺伝子の特定が求められていた。
The mouse or rat currently widely used as a model animal for dermatitis is hairy, and it is difficult to avoid the labor and irritation of the mouse or rat due to the shaving treatment for applying the drug. It is difficult to see the important dermatitis pathology. However, the hairless mouse or hairless rat, which can be evaluated in a state close to that of a human who is essentially hairless, has not been identified with a dominantly inherited gene, and the production of a hairless line was troublesome and difficult.
In view of the technical background as described above, in order to easily produce an animal of a hairless lineage, identification of a gene that dominantly inherits a hairless trait has been demanded.
本発明者らは、無毛形質を優性遺伝するＤＳ‐Ｎｈマウスから無毛の原因遺伝子領域を特定し、塩基配列を調べ、ＴＲＰＶ３をコードする遺伝子の１７１７番目のグアニンがアデニンに変異しており、そのためにＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがセリンに置換する点変異を見出した。また、Ｈｔ遺伝子を持つ皮膚炎発症無毛ラットの遺伝子のシークエンスからＴＲＰＶ３をコードする遺伝子の１７１７番目のグアニンがチミンに変異しており、そのためにＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがシステインに置換する点変異を見出した。これらの知見から、本発明者は以下の発明を完成した。
また、これらの無毛形質を優性遺伝する変異遺伝子を用いて新規の無毛マウスを作出した。特に、本発明は、様々な系統の無毛マウスまたは無毛ラットの作出において有用である。
すなわち、本発明は、
（１）ＴＲＰＶ３が、1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加しているものであることを特徴とするマウスまたはラット（但し、ＤＳ‐ＮｈマウスとＫＳＤＲは除く）。
The present inventors have identified a hairless causative gene region from a DS-Nh mouse that inherits a hairless character dominantly, examined the nucleotide sequence, and the 1717th guanine of the gene encoding TRPV3 has been mutated to adenine. Therefore, a point mutation was found in which the 573rd glycine of TRPV3 was substituted with serine. In addition, a point mutation in which the 1717th guanine of the gene encoding TRPV3 is mutated to thymine from the gene sequence of the dermatitis-onset hairless rat having the Ht gene, so that the 573rd glycine of TRPV3 is replaced with cysteine. I found. From these findings, the present inventor completed the following invention.
In addition, a new hairless mouse was created using a mutant gene that dominantly inherits these hairless traits. In particular, the present invention is useful in the production of various strains of hairless mice or hairless rats.
That is, the present invention
(1) A mouse or rat (except for DS-Nh mouse and KSDR), wherein TRPV3 has one, several amino acid residues deleted, substituted or added.
さらには、以下の（２）〜（２１）に関する。
（２）ＴＲＰＶ３が、５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換しているものであることを特徴とするマウスまたはラット（但し、DS-NhマウスとＫＳＤＲは除く）に関する。
（３）ＴＲＰＶ３が、５７３番目のグリシンがセリンに置換しているものであることを特徴とする（２）記載のマウス。
（４）ＴＲＰＶ３が、５７３番目のグリシンがシステインに置換しているものであることを特徴とする（２）記載のラット。
（５）ＴＲＰＶ３をコードする遺伝子が、１７１７番目のグアニンがグアニン以外の他の塩基に変異しているものであることを特徴とする（２）記載のマウスまたはラット。
（６）ＴＲＰＶ３をコードする遺伝子が、１７１７番目のグアニンがアデニンに変異しているものであることを特徴とする（５）記載のマウス。
（７）ＴＲＰＶ３をコードする遺伝子が、１７１７番目のグアニンがチミンに変異しているものであることを特徴とする（５）記載のラット。
（８）ＴＲＰＶ３が、配列番号１記載のアミノ酸配列の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換した配列からなるタンパク質である（２）記載のマウス、またはＴＲＰＶ３が、配列番号２記載のアミノ酸配列の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換した配列からなるタンパク質である（２）記載のラット。
（９）ＴＲＰＶ３をコードする遺伝子が、配列番号３記載の核酸配列の１７１７番目のグアニンがグアニン以外の他の塩基に変異した配列からなるものである（５）記載のマウス、またはＴＲＰＶ３をコードする遺伝子が、配列番号４記載の塩基配列の１７１７番目のグアニンがグアニン以外の他の塩基に変異した配列からなるものである（５）記載のラット。
（１０）マウスがＢＡＬＢ／ｃ、ＮＣ／ＮｇａおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊからなる群から選択される系統のものである（１）および（２）記載のマウス。
（１１）無毛を示す、（１）〜（１０）のいずれかに記載のマウスまたはラット。
（１２）該変異遺伝子をヘテロ、ホモまたはトランスに有するものである、（１）および（５）記載のマウスまたはラット。
（１３）ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したマウスまたはラットを交配することにより得られる、（１）および（２）記載のマウスまたはラット。
（１４）（１）〜（１３）のいずれかに記載のマウスまたはラットを用いることを特徴とする皮膚炎治療薬のスクリーニング方法。
（１５）皮膚炎治療薬をスクリーニングするための、（１）〜（１３）のいずれかに記載のマウスまたはラットの使用。
（１６）ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したマウスを交配することを特徴とする、（１）〜（１３）のいずれかに記載のマウスまたはラットの作出方法。
（１７）ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したタンパク質を発現できる形でコードしたＤＮＡをインジェクトしたマウスまたはラットの受精卵を、マウスまたはラットの胎内に戻す工程を含む、（１）〜（１３）のいずれかに記載のマウスまたはラットの作出方法。
（１８）ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したタンパク質を発現する遺伝子を有するES細胞を作成する工程を含む、（１）〜（１３）のいずれかに記載のマウスまたはラットの作出方法。
（１９）ａ）ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したＴＲＰＶ３をコードする変異遺伝子のゲノムＤＮＡ領域をクローニングする工程、
ｂ）相同的組換えによりES細胞に該変異遺伝子を導入する工程、
ｃ）偽妊娠マウスまたはラットの子宮角にES細胞を移植してキメラマウスまたはキメララットを作出する工程、
ｄ）該キメラマウスまたはキメララットを交配し、無毛マウスまたは無毛ラットを作出する工程を含む、（１）〜（１３）のいずれかに記載のマウスまたはラットの作出方法。
（２０）配列番号１または２記載のアミノ酸配列のうち、５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したタンパク質をコードする遺伝子。
（２１）アトピー性皮膚炎を発症するものである（２０）記載の遺伝子。
Furthermore, it relates to the following (2) to (21).
(2) The present invention relates to a mouse or rat (except for DS-Nh mouse and KSDR), wherein TRPV3 is obtained by substituting the 573rd glycine with an amino acid other than glycine.
(3) The mouse according to (2), wherein TRPV3 has 573th glycine substituted with serine.
(4) The rat according to (2), wherein TRPV3 is one in which 573rd glycine is substituted with cysteine.
(5) The mouse or rat according to (2), wherein the gene encoding TRPV3 is such that the 1717th guanine is mutated to a base other than guanine.
(6) The mouse according to (5), wherein the gene encoding TRPV3 is such that the 1717th guanine is mutated to adenine.
(7) The rat according to (5), wherein the gene encoding TRPV3 is such that the 1717th guanine is mutated to thymine.
(8) The mouse according to (2), wherein TRPV3 is a protein comprising a sequence in which the 573rd glycine of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid other than glycine, or TRPV3 is described in SEQ ID NO: 2 The rat according to (2), which is a protein having a sequence in which the 573rd glycine in the amino acid sequence is substituted with another amino acid other than glycine.
(9) The gene encoding TRPV3 consists of a sequence in which the 1717th guanine of the nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 3 is mutated to a base other than guanine, or encodes TRPV3 The rat according to (5), wherein the gene consists of a sequence in which the 1717th guanine of the base sequence described in SEQ ID NO: 4 is mutated to a base other than guanine.
(10) The mouse according to (1) and (2), wherein the mouse is of a strain selected from the group consisting of BALB / c, NC / Nga and C57BL / 6J.
(11) The mouse or rat according to any one of (1) to (10), which shows no hair.
(12) The mouse or rat according to (1) and (5), wherein the mutant gene has hetero, homo or trans.
(13) The mouse or rat according to (1) and (2), which is obtained by mating a mouse or rat in which the 573rd glycine of TRPV3 is substituted with another amino acid other than glycine.
(14) A screening method for a dermatitis therapeutic agent, wherein the mouse or rat according to any one of (1) to (13) is used.
(15) Use of the mouse or rat according to any one of (1) to (13) for screening for a therapeutic drug for dermatitis.
(16) The mouse or rat production method according to any one of (1) to (13), wherein a mouse in which the 573rd glycine of TRPV3 is substituted with an amino acid other than glycine is mated.
(17) A step of returning a fertilized egg of a mouse or rat into which the DNA encoded in a form capable of expressing a protein in which the 573rd glycine of TRPV3 is substituted with another amino acid other than glycine into the womb of the mouse or rat is included. A method for producing a mouse or rat according to any one of (1) to (13).
(18) The mouse according to any one of (1) to (13), comprising a step of producing an ES cell having a gene that expresses a protein in which the 573rd glycine of TRPV3 is substituted with another amino acid other than glycine How to make rats.
(19) a) cloning a genomic DNA region of a mutant gene encoding TRPV3 in which the 573rd glycine of TRPV3 is substituted with an amino acid other than glycine;
b) introducing the mutant gene into ES cells by homologous recombination;
c) Transplanting ES cells into the uterine horn of pseudopregnant mice or rats to produce chimeric mice or chimeric rats,
d) The method for producing a mouse or rat according to any one of (1) to (13), comprising the step of mating the chimeric mouse or chimeric rat to produce a hairless mouse or hairless rat.
(20) A gene encoding a protein in which the 573rd glycine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 is substituted with another amino acid other than glycine.
(21) The gene according to (20), which develops atopic dermatitis.
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。
ＴＲＰＶ３はＶＲファミリーに属するタンパク質であり、国際公開第０２／１０１０４５号パンフレットにマウスおよびヒトのアミノ酸配列およびその遺伝子配列が記載されている。また、ＴＲＰＶは、温度感受性イオンチャンネルとして知られているタンパク質であり、痛み、炎症、皮膚障害に関わると考えられている。マウスとラットのＴＲＰＶ３のアミノ酸の相同性は約９８％である。
また、ＴＲＰＶ３をコードする遺伝子を含むゲノム領域が２００ｋｂにわたり先天的に欠損しているトレモロラットには、パーマしているものの発毛が認められる（参考文献：J. Neurochem. 2000 74(6) : 2512-2519）。
本発明者は、ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換することにより、マウスまたはラットが無毛形質を示すことを見出した。本知見と上記参考文献の知見から、本発明者は、本発明の無毛形質は、ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換することによって生じるＴＲＰＶ３の機能欠損ではなく、該置換により引き起こされるＴＲＰＶ３の機能異常によるものと考え、ＴＲＰＶ３中のアミノ酸配列のうち、1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加することにより、ＴＲＰＶ３に機能異常が引き起こされ、マウスまたはラットが無毛形質を示すことを見出した。
すなわち、本発明には、（１）ＴＲＰＶ３が、1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加しているものであることを特徴とするマウスまたはラット（但し、ＤＳ‐ＮｈマウスとＫＳＤＲは除く）が包含される。
１若しくは数個のアミノ酸とは、部位特異的変異誘発法などにより欠失、置換または付加することができる程度の数のアミノ酸であり、５０個以下、好ましくは３０個以下、より好ましくは２０個以下、さらに好ましくは１０個以下のアミノ酸残基を意味している。さらに、本発明のＴＲＰＶ３は、欠失、置換または付加によっても生物学的活性を有しており、無毛形質を発現する機能異常を有するタンパク質であり、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリペプチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリペプチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリペプチドを挙げることができる。
また、本発明には、（２）ＴＲＰＶ３が、５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換しているものであることを特徴とするマウスまたはラット（但し、DS-NhマウスとＫＳＤＲは除く）が包含される。
グリシン以外の他のアミノ酸とは、グリシン以外の天然型アミノ酸を意味する。特に、ＴＲＰＶ３の５７３番目がセリン、システインに置換しているもの等が具体例として挙げられる。例えば、マウスにおいては、５７３番目のグリシンがセリンに置換しているものが見つかっており、ラットにおいては、５７３番目のグリシンがシステインに置換しているものが見つかった。従って、ＴＲＰＶ３がこれらの置換タンパク質であるマウスおよびラットも本発明に包含される。
本発明において、ＴＲＰＶ３は、1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加したもの、特に、ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したものを意味する。本発明において、ＴＲＰＶ３は、配列番号１または２記載のアミノ酸配列の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換した配列からなるタンパク質と実質的に同様の性質を有するタンパク質であれば何れのものでもよい。具体的には、（１）ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したもの、（２）ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがセリンまたはシステインに置換したもの、（３）配列番号１または２記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１または２記載のアミノ酸配列の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換した配列からなるタンパク質と実質的に同様の性質を有するもの、（４）配列番号１または２記載のアミノ酸配列の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したもの、（５）配列番号１または２記載のアミノ酸配列の５７３番目のグリシンがセリンまたはシステインに置換したもの、（６）配列番号１または２記載のアミノ酸配列の５７３番目のグリシン以外の部分において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したものであり、配列番号１または２記載のアミノ酸配列の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換した配列からなるタンパク質と実質的に同様の性質を有するものも含まれる。
本発明において使用される「遺伝子」は、一般にはＤＮＡの形で、発現可能なものを意味する。例えば、該遺伝子は遺伝子の発現と遺伝子にコードされている産物の分泌に必要な遺伝子調節エレメントと共に、プラスミドや転移性遺伝因子などの発現ベクターに組み込まれていてもよい。
ＴＲＰＶ３をコードする遺伝子の１７１７番目のグアニンがグアニン以外の他の塩基に変異することにより、ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換しているものが見つかった。従って、上記変異遺伝子を有するマウスおよびラットも本発明に包含される。グアニン以外の他の塩基とは、アデニン、チミン、シトシンを意味する。特に、ＴＲＰＶ３をコードする遺伝子の１７１７番目がアデニン、チミンに変異しているもの等が具体例として挙げられる。例えば、マウスにおいては、１７１７番目のグアニンがアデニンに変異しているものが見つかっており、ラットにおいては、１７１７番目のグアニンがチミンに変異しているものが見つかった。従って、ＴＲＰＶ３をコードする遺伝子がこれらの変異遺伝子であるマウスおよびラットも本発明に包含される。
上記の変異遺伝子の中には、（１）ＴＲＰＶ３をコードする遺伝子が、１７１７番目のグアニンがグアニン以外の他の塩基に変異しているもの、（２）ＴＲＰＶ３をコードする遺伝子が、１７１７番目のグアニンがアデニンまたはチミンに変異しているもの、（３）配列番号３または４記載の塩基配列の１７１７番目のグアニンがグアニン以外の他の塩基に変異した配列からなるもの、（４）配列番号３または４記載の塩基配列の１７１７番目のグアニンがアデニンまたはチミンに変異した配列からなるもの等が含まれる。
The terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified.
TRPV3 is a protein belonging to the VR family, and mouse and human amino acid sequences and gene sequences thereof are described in WO 02/101045. TRPV is a protein known as a temperature sensitive ion channel and is considered to be involved in pain, inflammation, and skin damage. The amino acid homology between mouse and rat TRPV3 is about 98%.
In addition, tremolo rats in which the genomic region containing the gene encoding TRPV3 is inherently deficient over 200 kb have permanent hair growth (reference: J. Neurochem. 2000 74 (6): 2512-2519).
The present inventor has found that the mouse or rat exhibits a hairless character by substituting the 573rd glycine of TRPV3 with an amino acid other than glycine. From this knowledge and the knowledge of the above-mentioned references, the present inventor has shown that the hairless character of the present invention is not a functional defect of TRPV3 caused by substitution of 573th glycine of TRPV3 with an amino acid other than glycine, It is considered that this is due to TRPV3 dysfunction caused by substitution, and deletion or substitution or addition of one or several amino acid residues in the amino acid sequence in TRPV3 causes dysfunction in TRPV3. It was found that rats show hairless traits.
That is, according to the present invention, (1) TRPV3 is a mouse or rat (however, a DS-Nh mouse, wherein one or several amino acid residues are deleted, substituted or added). KSDR is excluded).
One or several amino acids are amino acids that can be deleted, substituted or added by site-directed mutagenesis or the like, and are 50 or less, preferably 30 or less, more preferably 20 Hereinafter, more preferably, it means 10 or less amino acid residues. Furthermore, TRPV3 of the present invention is a protein having a biological activity also by deletion, substitution or addition, and having a functional abnormality expressing a hairless character, and is represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. And a polypeptide having at least 60% homology with the amino acid sequence, preferably a polypeptide having 80% or more homology, and more preferably a polypeptide having 95% or more homology.
In the present invention, (2) TRPV3 is a mouse or rat characterized in that the 573rd glycine is substituted with an amino acid other than glycine (however, DS-Nh mouse and KSDR are Except).
An amino acid other than glycine means a natural amino acid other than glycine. In particular, specific examples include TRPV3 in which the 573rd is substituted with serine or cysteine. For example, a mouse in which the 573th glycine was replaced with serine was found in mice, and a rat in which the 573th glycine was replaced with cysteine was found. Therefore, mice and rats in which TRPV3 is these replacement proteins are also encompassed by the present invention.
In the present invention, TRPV3 means one in which one or several amino acid residues are deleted, substituted or added, and in particular, one obtained by substituting the 573rd glycine of TRPV3 with an amino acid other than glycine. In the present invention, TRPV3 is any protein as long as it has substantially the same properties as a protein consisting of a sequence in which the 573rd glycine of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 is substituted with another amino acid other than glycine. It may be a thing. Specifically, (1) TRPV3 573th glycine is substituted with another amino acid other than glycine, (2) TRPV3 573rd glycine is substituted with serine or cysteine, (3) SEQ ID NO: 1 Alternatively, the amino acid sequence described in 2 has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and the 573rd glycine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 is other than glycine A protein having substantially the same properties as a protein comprising a sequence substituted with an amino acid, (4) a protein in which the 573rd glycine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 is substituted with an amino acid other than glycine, (5 ) The 573th glycine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 is substituted with serine or cysteine, ) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in a portion other than the 573th glycine, and the 573rd glycine is other than glycine Also included are those substituted with other amino acids and having substantially the same properties as a protein consisting of a sequence in which the 573rd glycine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 is substituted with another amino acid other than glycine It is.
The “gene” used in the present invention generally means a gene that can be expressed in the form of DNA. For example, the gene may be incorporated into an expression vector such as a plasmid or transposable genetic factor together with gene regulatory elements necessary for gene expression and secretion of the product encoded by the gene.
By mutating the 1717th guanine of the gene encoding TRPV3 to a base other than guanine, the 573th glycine of TRPV3 was replaced with an amino acid other than glycine. Therefore, mice and rats having the above mutant gene are also included in the present invention. Bases other than guanine mean adenine, thymine, and cytosine. Specific examples include those in which the 1717th gene encoding TRPV3 is mutated to adenine or thymine. For example, 1717th guanine was found to be mutated to adenine in mice, and 1717th guanine was found to be mutated to thymine in rats. Therefore, mice and rats in which the gene encoding TRPV3 is these mutant genes are also included in the present invention.
Among the above mutant genes, (1) a gene encoding TRPV3 has a 1717th guanine mutated to another base other than guanine, and (2) a gene encoding TRPV3 has a 1717th Guanine is mutated to adenine or thymine, (3) a sequence comprising a sequence in which the 1717th guanine of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 3 or 4 is mutated to a base other than guanine, (4) SEQ ID NO: 3 Alternatively, those comprising a sequence in which the 1717th guanine of the base sequence described in 4 is mutated to adenine or thymine are included.
ＢＡＬＢ／ｃ、ＮＣ／Ｎｇａ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊはマウスの系統名である。ＮＣ／Ｎｇａは、アトピー性皮膚炎のモデルマウスとして広く知られている有毛のマウスであり、 空気中の微生物制御（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ、ＳＰＦ）環境下でダニ抗原を外から加えることにより発症する。ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊは、一般的に用いられている実験用マウスである。アレルギー疾患や自己免疫疾患の発症と関わるとされているヘルパーＴ細胞の型が、ＢＡＬＢ／ｃはＴｈ２優位、Ｃ５７ＢＬ／６ＪはＴｈ１優位であるマウスとして知られている。
このようなマウスに本発明の遺伝子を導入して無毛マウスを作出することによって、通常の系統よりも有用な無毛のモデル動物を入手することができる。その他、病状を目視する必要、または薬剤塗布に剃毛が必要である場合に使用するマウスまたはラットの系統に遺伝子を導入することにより利用が可能である。
また、本発明において無毛形質を示すＴＲＰＶ３をコードする変異遺伝子は優性遺伝することから、本発明には、該変異遺伝子をヘテロ、ホモまたはトランスに有する無毛マウスおよび無毛ラットも含有される。
本発明の無毛マウスまたは無毛ラットは様々な皮膚炎に対する治療薬のスクリーニングにおいて使用することができる。本スクリーニングは、当業者であれば、従来から行われている方法で行うことができる。その結果得られる、皮膚炎治療薬も本発明に含まれる。
「皮膚炎」としては、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎などの内因性のものおよび、刺激物、アレルゲンなどが接触して起こる接触皮膚炎などが例示される。また、炎症ではないが乾癬などの皮膚の異常も含まれる。
BALB / c, NC / Nga, and C57BL / 6J are mouse strain names. NC / Nga is a hairy mouse that is widely known as a model mouse for atopic dermatitis. By adding a tick antigen from the outside in the environment of microbial control in the air (Specific-pathogen-free, SPF) Develops. BALB / c and C57BL / 6J are generally used experimental mice. The types of helper T cells that are believed to be involved in the development of allergic diseases and autoimmune diseases are known as mice in which BALB / c is predominantly Th2 and C57BL / 6J is predominantly Th1.
By introducing the gene of the present invention into such a mouse to produce a hairless mouse, a hairless model animal that is more useful than a normal strain can be obtained. In addition, it can be used by introducing a gene into a mouse or rat strain to be used when it is necessary to visually check the medical condition or when shaving is required for applying a drug.
In addition, since the mutant gene encoding TRPV3 exhibiting a hairless trait in the present invention is dominantly inherited, the present invention also includes hairless mice and hairless rats having the mutant gene in hetero, homo or trans. .
The hairless mouse or hairless rat of the present invention can be used in screening for therapeutic agents for various dermatitis. This screening can be performed by a person skilled in the art by a conventional method. The resulting dermatitis therapeutic agent is also included in the present invention.
Examples of “dermatitis” include endogenous ones such as atopic dermatitis and seborrheic dermatitis, and contact dermatitis caused by contact with irritants and allergens. It also includes skin abnormalities such as psoriasis but not inflammation.
本発明の無毛マウスを作出するためには、無毛形質を持ったマウス（ＴＲＰＶ３が、５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換しているものであることを特徴とするマウス）と作出を希望する系統のマウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ、ＮＣ／Ｎｇａ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ等の系統のマウス等）を掛け合わせ、無毛形質を持った仔マウスに、戻し交配を行う方法がある。すなわち、ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したマウスを交配することにより、本発明のマウスを作出することができる。なお、無毛ラットも、上記のマウスの作出方法と同様の作業を行うことによって得ることができる。
また、本発明で明らかになった遺伝子変異を利用し、公知の遺伝子工学技術を用いたトランスジェニック動物作出方法により無毛マウスまたは無毛ラットを作出することができる。例えば、ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したタンパク質を発現できる形でコードしたＤＮＡをインジェクトしたマウスまたはラットの受精卵を、マウスまたはラットの胎内に戻す工程を含む、本発明のマウスまたはラットの作出する方法等が挙げられる。また、ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したタンパク質を発現する遺伝子を有するES細胞を作成する工程を含む本発明のマウスまたはラットの作出方法も、本発明に包含される。
より具体的には、
ａ）ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したＴＲＰＶ３をコードする変異遺伝子のゲノムＤＮＡ領域をクローニングする工程、
ｂ）相同的組換えによりＥＳ細胞に該変異遺伝子を導入する工程、
ｃ）偽妊娠マウスまたはラットの子宮角にＥＳ細胞を移植してキメラマウスまたはキメララットを作出する工程、
ｄ）該キメラマウスまたはキメララットを交配し、無毛マウスまたは無毛ラットを作出する工程を含む、本発明のマウスまたはラットの作出方法が挙げられる。
例えば、ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したタンパク質を発現できる形でコードしたＤＮＡは、以下の様にして得ることができる。マウスやラットの血液等から採取したＴＲＰＶ３をコードするＤＮＡを用い、部位指定突然変異導入法により５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したＴＲＰＶ３をコードするＤＮＡを作製する。部位指定突然変異導入法には、野生型の塩基配列に相補的であるが１７１７番目のグアニンがグアニン以外の他の塩基に変異した化学合成オリゴヌクレオチド（７〜４０ヌクレオチドの長さ）を作り、それをプライマーとしてＰＣＲでＤＮＡ合成を行う方法などが含まれる。
上記の方法などで得られたＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したタンパク質を発現できる形でコードしたＤＮＡをプラスミドベクターなどのベクターに挿入し、そのベクターをＥＳ細胞に導入する。ＥＳ細胞内で相同的組換えが起った細胞を選択マーカーにより選択する。選択マーカーとしてはネオマイシン耐性遺伝子などが使用できる。
上記に従って作出される無毛マウスは、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ、ＮＣ／ＮｇａおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊ等の系統のマウスであり、そのＴＲＰＶ３は、５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換しているものである。これらの無毛マウスは、ＤＳ‐Ｎｈマウスと異なり、既にその性質がよく知られたマウスの系統であり、実験動物として極めて有用である。
特に、該変異遺伝子をヘテロ、ホモまたはトランスに有するマウスまたはラットが好ましい。
本発明のＴＲＰＶ３遺伝子の変異は、ＤＳ‐Ｎｈマウスにおいてアトピー性皮膚炎を発症させることも見出した。また、ＴＲＰＶ３遺伝子の変異を他の系統（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ等の系統のマウス）に導入すると、皮膚炎の発症が弱くなったり、無くなったりすることも確認した。これらの知見から、ＤＳ−Ｎｈマウスにおいてアトピー性皮膚炎を発症させる形質には多因子が関わっていると考えられた。
In order to produce the hairless mouse of the present invention, a mouse having a hairless character (TRPV3 is characterized in that the 573rd glycine is substituted with an amino acid other than glycine) There is a method of cross-breeding a mouse with a hairless character and backcrossing a mouse with a strain desired to be produced (for example, a mouse with a strain such as BALB / c, NC / Nga, C57BL / 6J) . That is, the mouse of the present invention can be produced by mating mice in which the 573rd glycine of TRPV3 is substituted with another amino acid other than glycine. Hairless rats can also be obtained by performing the same operation as in the above mouse production method.
In addition, hairless mice or hairless rats can be produced by a transgenic animal production method using a known genetic engineering technique using the gene mutation revealed in the present invention. For example, a step of returning a fertilized egg of a mouse or rat injected with DNA encoded in a form capable of expressing a protein in which the 573rd glycine of TRPV3 is substituted with another amino acid other than glycine into the womb of the mouse or rat, Examples thereof include a method for producing the mouse or rat of the present invention. In addition, the present invention also includes a method for producing a mouse or rat of the present invention comprising the step of producing an ES cell having a gene expressing a protein in which the 573rd glycine of TRPV3 is substituted with another amino acid other than glycine. .
More specifically,
a) a step of cloning a genomic DNA region of a mutant gene encoding TRPV3 in which the 573rd glycine of TRPV3 is substituted with another amino acid other than glycine,
b) introducing the mutant gene into ES cells by homologous recombination;
c) transplanting ES cells into the uterine horn of pseudopregnant mice or rats to produce chimeric mice or chimeric rats,
d) A method for producing a mouse or rat of the present invention, comprising the step of mating the chimeric mouse or chimeric rat to produce a hairless mouse or hairless rat.
For example, DNA encoded in a form capable of expressing a protein in which the 573rd glycine of TRPV3 is substituted with another amino acid other than glycine can be obtained as follows. Using DNA encoding TRPV3 collected from mouse or rat blood or the like, DNA encoding TRPV3 in which the 573rd glycine is substituted with an amino acid other than glycine by site-directed mutagenesis is prepared. In the site-directed mutagenesis method, a chemically synthesized oligonucleotide (7 to 40 nucleotides in length) that is complementary to the wild-type base sequence but in which the 1717th guanine is mutated to another base other than guanine, A method of performing DNA synthesis by PCR using it as a primer is included.
DNA encoded in a form capable of expressing a protein in which the 573rd glycine of TRPV3 obtained by the above method is substituted with other amino acids other than glycine is inserted into a vector such as a plasmid vector, and the vector is introduced into an ES cell. To do. Cells in which homologous recombination has occurred in the ES cells are selected using a selection marker. As a selection marker, a neomycin resistance gene can be used.
Hairless mice produced according to the above are, for example, mice of strains such as BALB / c, NC / Nga and C57BL / 6J, and TRPV3 has a 573th glycine substituted with an amino acid other than glycine. It is what. Unlike the DS-Nh mice, these hairless mice are already well-known mouse strains and are extremely useful as experimental animals.
In particular, mice or rats having the mutant gene in hetero, homo or trans are preferred.
It was also found that the mutation of the TRPV3 gene of the present invention causes atopic dermatitis in DS-Nh mice. It was also confirmed that when a mutation in the TRPV3 gene was introduced into other strains (for example, mice of strains such as BALB / c), the onset of dermatitis was weakened or eliminated. From these findings, it was considered that multifactors are involved in the traits that cause atopic dermatitis in DS-Nh mice.
本発明には、（１）配列番号１または２記載のアミノ酸配列のうち、５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したタンパク質をコードする遺伝子、（２）配列番号１または２記載のアミノ酸配列の５７３番目のグリシンがセリンまたはシステインに置換した遺伝子、（３）配列番号１または２記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号１または２記載のアミノ酸配列の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換した配列からなるタンパク質と実質的に同様の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子、（３）配列番号１または２記載のアミノ酸配列の５７３番目のグリシン以外の部分において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換したものであり、配列番号１または２記載のアミノ酸配列の５７３番目のグリシンがグリシン以外の他のアミノ酸に置換した配列からなるタンパク質と実質的に同様の性質を有するタンパク質をコードする遺伝子も包含される。
また、アトピー性皮膚炎を発症するものである上記の遺伝子も本発明に包含される。
The present invention includes (1) a gene encoding a protein in which the 573rd glycine is replaced with another amino acid other than glycine among the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 1 or 2, (2) described in SEQ ID NO: 1 or 2 A gene in which the 573rd glycine in the amino acid sequence is substituted with serine or cysteine, and (3) an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added And a gene encoding a protein having substantially the same properties as a protein comprising a sequence in which the 573rd glycine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 is substituted with another amino acid other than glycine, (3) SEQ ID NO: 1 or several amino acids other than 573rd glycine in the amino acid sequence described in 1 or 2 Has a deleted, substituted or added amino acid sequence, and the 573rd glycine is substituted with an amino acid other than glycine, and the 573rd glycine of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2 is glycine A gene encoding a protein having substantially the same properties as a protein consisting of a sequence substituted with other amino acids other than the above is also included.
Moreover, said gene which develops atopic dermatitis is also included by this invention.
本発明は、皮膚炎に対する治療薬のスクリーニングにおいて使用することができる無毛のマウスまたは無毛ラット、それらの作出方法、無毛マウスまたは無毛ラットを用いた皮膚炎治療薬のスクリーニング方法、および無毛の形質を有する変異遺伝子を提供する。
The present invention relates to a hairless mouse or hairless rat that can be used in screening for a therapeutic agent for dermatitis, a method for producing the same, a method for screening a dermatitis therapeutic agent using a hairless mouse or hairless rat, and A mutant gene having a hairless character is provided.
以下に本発明に関わるＴＲＰＶ３遺伝子の変異、変異を持つ無毛マウスまたは無毛ラットの作出方法について詳細に説明する。本明細書において、特に指示のない限り、当該分野で公知であるマウスまたはラットの交配方法、トランスジェニックマウスまたはラットの作出方法が採用される。
無毛マウスの作出方法としては以下の方法を用いることができる。
(１) ＴＲＰＶ３遺伝子をヘテロで持つマウスの雄（Ｎｈ／＋）と新しい系統Ｘ（ＸはＢＡＬＢ／ｃ、ＮＣ／Ｎｇａ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊなどが考えられる。）のマウスの雌（＋／＋）を自然交配し、得られたｆ１個体の内、無毛の雄を選別する。無毛と有毛の比はほぼ１対１になる。この個体をさらに系統Ｘの雌と交配して無毛のｆ２個体を選別する。これを繰り返すことにより無毛の表現型（Ｎｈが支配する）を持ちつつ、遺伝的バックグランドが系統Ｘのものであるマウスを得ることができる。ＴＲＰＶ３遺伝子を持つマウスが雌であってもよく、その場合はｆ１固体の内、無毛の雌を選別し、系統Ｘの雄を交配する。最初の交配に用いるＴＲＰＶ３遺伝子を持つマウスは、Ｎｈ／Ｎｈでもよく、その場合はｆ１個体はすべて無毛である。
（２）ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンが他のアミノ酸に置換したＴＲＰＶ３をコード
する変異遺伝子のゲノムＤＮＡ領域をクローニングする。雌マウスにホルモン注射をして強制的に過剰排卵させ、受精を行い、交尾後1日目の卵管から受精卵を摘出する。核が融合する前の時期の受精卵へ、顕微鏡下に該変異遺伝子を雄性前核中にマイクロインジェクションにより注入する。こうした操作を施した受精卵を偽妊娠雌マウスの子宮あるいは卵管内に移植する。この雌マウスを通常どおり飼育しつづけ仔マウスを出産させる。遺伝子の導入の成否は見た目の形質および仔マウスから抽出したＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーション法によって確認することができる。（参考文献：緒方宣邦・野島博著「遺伝子工学キーワードブック改訂第２版」 羊土社、２００２年１月１日、ｐ.２８４）
（３）ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンが他のアミノ酸に置換したＴＲＰＶ３をコー
ドする変異遺伝子のゲノムＤＮＡ領域をクローニングする。相同的組換えによりＥＳ細胞に該変異遺伝子を導入する。このＥＳ細胞を偽妊娠マウスの子宮角に移植してキメラマウスを作出する。遺伝子の導入の成否は見た目の形質および仔マウスから抽出したＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーション法によって確認することができる。
無毛ラットも上記の無毛マウスの作出方法と同様の方法を用いて作出することができる。
The TRPV3 gene mutation related to the present invention and a method for producing a hairless mouse or hairless rat having the mutation will be described in detail below. In the present specification, unless otherwise indicated, a mouse or rat mating method and a transgenic mouse or rat production method known in the art are employed.
The following methods can be used as methods for producing hairless mice.
(1) Male mouse (Nh / +) heterozygous with TRPV3 gene and female mouse (+ / +) of new strain X (X may be BALB / c, NC / Nga, C57BL / 6J, etc.) Are naturally mated, and among the obtained fl individuals, a hairless male is selected. The ratio between hairless and hairy is almost 1: 1. This individual is further mated with a female of line X to select a hairless f2 individual. By repeating this, a mouse having a hairless phenotype (Nh-dominated) and a genetic background of strain X can be obtained. The mouse having the TRPV3 gene may be a female. In this case, a hairless female is selected from the fl solid, and a male of line X is mated. The mouse having the TRPV3 gene used for the first mating may be Nh / Nh, in which case all fl individuals are hairless.
(2) The genomic DNA region of the mutant gene encoding TRPV3 in which the 573rd glycine of TRPV3 is substituted with another amino acid is cloned. A female mouse is hormonally injected and forced to ovulate, fertilize, and the fertilized egg is removed from the oviduct on the first day after mating. The mutant gene is injected into the male pronucleus by microinjection under a microscope into a fertilized egg at a time before the nucleus is fused. A fertilized egg subjected to such an operation is transplanted into the uterus or fallopian tube of a pseudopregnant female mouse. This female mouse is bred as usual and a pup mouse is born. The success or failure of gene introduction can be confirmed by the appearance traits and Southern blot hybridization of DNA extracted from offspring mice. (Reference: Nobuhiko Ogata / Hiroshi Nojima "Genetic Engineering Keyword Book Revision 2nd Edition" Yodosha, January 1, 2002, p.284)
(3) The genomic DNA region of the mutant gene encoding TRPV3 in which the 573rd glycine of TRPV3 is substituted with another amino acid is cloned. The mutant gene is introduced into ES cells by homologous recombination. This ES cell is transplanted into the uterine horn of a pseudopregnant mouse to produce a chimeric mouse. The success or failure of gene introduction can be confirmed by the appearance traits and Southern blot hybridization of DNA extracted from offspring mice.
Hairless rats can also be created using a method similar to the method for creating hairless mice described above.
マウスをアトピー性皮膚炎治療薬の評価に用いる方法としては、以下のような方法がある。すなわち、マウスは生後５から７週齢のものを用いる。皮膚炎の誘発は、ダニ抗原を皮下注射することにより起こす。また、水やエーテルの塗布によっても誘発することができる。ＤＳ‐Ｎｈマウスの場合は、コンベンショナル環境（空気中の微生物制御がなされていない環境）下で飼育することにより自発的に皮膚炎を惹起する。数日おきにダニ抗原を注射し、数週間後の、皮膚炎を誘発したマウスに治療薬を投与する。投与方法は塗布（塗り薬）のほか、経口、経血管（尾静脈への注射）などの方法がある。薬効の評価方法としては、耳介部（耳たぶ）の厚さを測る方法、見た目の皮膚炎の様子をスコアリングする方法、アトピー性皮膚炎により上昇する血中ＩｇＥの量を測る方法、解剖して皮膚の病理解析をする方法などがある。
いずれの場合も、皮膚炎の強度を目視する場合には剃毛が必要であるが、ＴＲＰＶ３の変異を導入したマウスではその必要がない。
As a method for using a mouse for evaluation of a drug for treating atopic dermatitis, there are the following methods. That is, use a mouse 5 to 7 weeks old. Induction of dermatitis occurs by subcutaneous injection of mite antigen. It can also be induced by application of water or ether. In the case of DS-Nh mice, dermatitis is spontaneously induced by rearing in a conventional environment (an environment in which airborne microorganisms are not controlled). Mite antigens are injected every few days, and therapeutic agents are administered to mice that have induced dermatitis several weeks later. In addition to application (coating), administration methods include oral and transvascular (injection into the tail vein). As a method for evaluating drug efficacy, a method of measuring the thickness of the auricle (earlobe), a method of scoring the appearance of apparent dermatitis, a method of measuring the amount of blood IgE rising due to atopic dermatitis, and dissection For example, there is a method for analyzing the pathology of the skin.
In any case, shaving is necessary for visualizing the intensity of dermatitis, but it is not necessary for mice introduced with a mutation in TRPV3.
優性遺伝の確認
DS-Nh（Nh/Nh、無毛）とC57BL/6Shi（有毛）の掛け合わせで得られたＦ１個体を、さらにC57BL/6Shiと戻し交配し、有毛、無毛の分離比を調べたところ、Ｆ１ではすべて無毛、戻し交配では常染色体単一優性遺伝の分離比１：１が支持されたため、単一遺伝部位の優性遺伝と確認できた（表１）。以後、この遺伝部位をNh locusと称する。
F1 individuals obtained by crossing DS-Nh (Nh / Nh, hairless) and C57BL / 6Shi (hairy) were further backcrossed to C57BL / 6Shi, and the separation ratio between hair and hairless was examined. However, since F1 supported hairlessness and backcrossing supported a 1: 1 autosomal single dominant inheritance ratio, it was confirmed that the inheritance was dominant at a single inherited site (Table 1). Hereinafter, this genetic site is referred to as Nh locus.
Nh locus の位置
Nh locusの存在する染色体を決定するために、10染色体に属する13遺伝子座について、C57BL/6Shi × (C57BL/6Shi × DS-Nh/Nh)バッククロス個体の、無毛形質との連鎖試験を行った（表2）。
C57BL/6Shi × (C57BL/6Shi × DS-Nh/Nh)BC1世代の、既知の遺伝子型を調べた。調べた表現型は、毛色遺伝子のagouti (a、2番染色体)、生化学的マーカー遺伝子のisocitrate dehydrogenase-1 (Idh-1、1番染色体)、 peptidase-3 (Pep-3、1番染色体)、 alkaline phosphatase-1 (Akp-1、1番染色体)、 alcohol dehydrogenase-3 (Adh-3、3番染色体)、 major urinary protein-1 (Mup-1、4番染色体)、 aldehyde dehydrogenase-1 (Ahd-1、4番染色体)、 glucose phospyate isomerase-1 (Gpi-1、7番染色体)、 esterase-1 (Es-1、8番染色体)、 malic enzyme-1 (Mod-1、9番染色体)、 esterase-3 (Es-3、11番染色体)、 esterse-10 (Es-10、14番染色体)、 免疫学的マーカー遺伝子のhistocompatibility-2D (H-2D、17番染色体)である。
その結果、+ / + (Nh)、 Es-3 a / aが31例、Nh / +、 Es-3 a / cが25例、+ / + (Nh)、 Es-3 a / cが18例、Nh / +、 Es-3 a / aが7例であり、連鎖に対するχ二乗値は11.864 (p<0.01)で連鎖を支持するものであった。両遺伝子座間の遺伝子距離は30.9±5.1cMであった。なお、その他のマーカーとの連鎖は認められなかった。
In order to determine the chromosome where the Nh locus is present, a linkage test of the C57BL / 6Shi × (C57BL / 6Shi × DS-Nh / Nh) backcross individuals with hairless traits was performed at 13 loci belonging to 10 chromosomes. (Table 2).
C57BL / 6Shi × (C57BL / 6Shi × DS-Nh / Nh) BC1 generation known genotypes were examined. The phenotypes examined were agouti (a, chromosome 2) of the coat color gene, isocitrate dehydrogenase-1 (Idh-1, chromosome 1) and peptidase-3 (Pep-3, chromosome 1) of the biochemical marker genes , Alkaline phosphatase-1 (Akp-1, chromosome 1), alcohol dehydrogenase-3 (Adh-3, chromosome 3), major urinary protein-1 (Mup-1, chromosome 4), aldehyde dehydrogenase-1 (Ahd -1, Chromosome 4), glucose phospyate isomerase-1 (Gpi-1, Chromosome 7), esterase-1 (Es-1, Chromosome 8), malic enzyme-1 (Mod-1, Chromosome 9), These are esterase-3 (Es-3, chromosome 11), esterse-10 (Es-10, chromosome 14), histocompatibility-2D (H-2D, chromosome 17) of the immunological marker gene.
As a result, + / + (Nh), Es-3 a / a were 31 cases, Nh / +, Es-3 a / c were 25 cases, + / + (Nh), Es-3 a / c were 18 cases Nh / +, Es-3 a / a were 7 cases, and the chi-square value for the chain was 11.864 (p <0.01), which supported the chain. The gene distance between both loci was 30.9 ± 5.1 cM. No linkage with other markers was observed.
１１番染色体上の位置の決定
Nh遺伝子の１１番染色体上の位置を詳細に決定するために、１１番染色体上のマーカー遺伝子Es-3、 Hbaを用いて3点交雑試験により１１番染色体上のおおよその位置を求めたところ、Es-3から23.0cM、Hbaから24.6cMに位置することが明らかとなった(data not shown)。この位置は同じ無毛遺伝子として知られているnude遺伝子座の近傍であるため、その同座性を確認するため、DS-Nh (Nh/+Nh、+nu/+nu)と、BALB/cShi-nu/nu (+Nh/+Nh、 nu/nu)とのF1無毛個体(Nh/+Nh、nu/+nu)をBALB/cShi-nu/nuに戻し交雑した個体の表現型を調べた結果、4例で有毛個体(+Nh/+Nh、 +nu/+nu)を得た。これによりNhとnude遺伝子の同座性は否定されたが、ごく近傍に位置することがわかった。
Determination of position on chromosome 11
In order to determine the position of the Nh gene on chromosome 11 in detail, when the approximate position on chromosome 11 was determined by a three-point hybridization test using marker genes Es-3 and Hba on chromosome 11, It was found to be located at 23.0 cM from Es-3 and 24.6 cM from Hba (data not shown). Since this position is near the nude locus known as the same hairless gene, DS-Nh (Nh / + Nh, + nu / + nu) and BALB / cShi Investigate the phenotype of individuals that crossed F1 hairless individuals (Nh / + Nh, nu / + nu) with -nu / nu (+ Nh / + Nh, nu / nu) back to BALB / cShi-nu / nu As a result, hairy individuals (+ Nh / + Nh, + nu / + nu) were obtained in 4 cases. As a result, the homozygosity of Nh and nude genes was denied, but it was found to be very close.
さらにNh遺伝子の11番染色体上の位置を詳細に決定するために戻し交雑による系統解析を行った。交雑する系統は、11番染色体上nude遺伝子付近の多型マーカーを調べてDSとの多型頻度が最も高かったＮＣ／Ｎｇａを用いた。
DS-NhとＮＣ／Ｎｇａを掛け合わせて作製したF1個体から無毛個体を選別し、さらにDS若しくはＮＣ／Ｎｇａに戻し交雑をして、無毛、有毛の表現型と多型マーカーの遺伝子型を調べた。遺伝子型は、マイクロサテライトマーカーについてはPCR後にPAGE、若しくはアガロースゲル電気泳動、SNPについてはSSCP若しくはRFLP、およびシークエンスにより解析した。
Furthermore, phylogenetic analysis by backcrossing was performed to determine the position of Nh gene on chromosome 11 in detail. As a crossing line, NC / Nga having the highest polymorphism frequency with DS by using a polymorphic marker near the nude gene on chromosome 11 was used.
Hairless, hairy phenotypes and polymorphic marker genes are selected by selecting hairless individuals from F1 individuals produced by crossing DS-Nh and NC / Nga, and then backcrossing to DS or NC / Nga. Examine the type. The genotype was analyzed by PAGE after PCR for microsatellite markers, or by SSCP or RFLP and sequence for SNP.
さらに、近傍のマイクロサテライトマーカーを指標にしてNh領域のYAC、BACによる物理的地図（コンティグ）を作製した。YAC、BACによるマウスゲノムライブラリはリサーチ ジェネティックス社のCITB Mouse YAC Library およびCITB BAC Libraryを用いた。クローンの単離はマイクロサテライトマーカー検出用のPCRプライマーによるPCRによって行った。単離したBACクローンは、近隣のマーカーをプライマーとしてPCRを行い、その位置を決めた。また精製したBAC DNAは、インビトロゲン社のTOPO Shotgun subcloningキットにより断片化、ショットガンクローニングを行い、T7、M13Ｒプライマーでシークエンスを行ない、シークエンスデータのアセンブルによりドラフトシークエンスを決定した。さらにその配列より適当なPCRプライマーを設定し、クローンの単離からの作業を繰り返すことで、コンティグを完成させた。
その過程でマイクロサテライトマーカーとして利用できる配列はマーカーとして用いた。
Furthermore, a physical map (contig) of the Nh region by YAC and BAC was prepared using a nearby microsatellite marker as an index. YAC and BAC mouse genomic libraries were CITB Mouse YAC Library and CITB BAC Library from Research Genetics. The clone was isolated by PCR using PCR primers for detecting microsatellite markers. The isolated BAC clone was subjected to PCR using a nearby marker as a primer, and its position was determined. The purified BAC DNA was fragmented and shotgun cloned with TOPO Shotgun subcloning kit of Invitrogen, sequenced with T7 and M13R primers, and draft sequence was determined by assembling sequence data. Furthermore, an appropriate PCR primer was set from the sequence, and the work from the isolation of the clone was repeated to complete the contig.
In the process, a sequence that can be used as a microsatellite marker was used as a marker.
戻し交雑により得られた2777匹について組換えの有無を調べたところ、X84896とU12236の間で2匹、263CAと311H11の間で2匹の組換え個体が見出された。U12236、 D11Mit194、 263CAの3マーカーとNhの間では組換え個体が存在しなかった。
これにより、X84896、 332H11間にNh locus が存在し、その遺伝的距離は4 / 2777 = 0.144 cMであった。また、この間のBACコンティグが完成し、その物理的距離は約1Mbと見積もられた（図1）。また、この領域には、セントロメア側より、CAMKK (calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase 1、 alpha)、ELG、Itgae (integrin、 alpha E、epithelial-associated)、P2X5 (purinergic receptor P2X、ligand-gated ion channel,5)、TIP-1、CARKL (carbohydrate kinase-like)、CTNS (cystinosis、 nephropathic)、TRPV1 (transient receptor potential cation channel、subfamily V、member 1)、ASPA (aspartoacylase 2)そして、olfactory receptor superclusterの遺伝子が存在していた。
When 2777 animals obtained by backcrossing were examined for the presence or absence of recombination, 2 recombinant individuals were found between X84896 and U12236, and 2 between 263CA and 311H11. There were no recombinant individuals between the three markers of U12236, D11Mit194, and 263CA and Nh.
As a result, there was a Nh locus between X84896 and 332H11, and the genetic distance was 4/2777 = 0.144 cM. In addition, the BAC contig was completed during this period, and the physical distance was estimated to be about 1Mb (Figure 1). Also, in this region, from the centromere side, CAMKK (calcium / calmodulin-dependent
Nh Locusにおける変異の決定
Nh locusの範囲が決定されたので、DS、DS-NhのゲノムDNAのシークエンスの比較により、Nhの変異を見出すために、DS、DS-NhそれぞれのゲノムDNAのコスミドライブラリを作製した。
DS、DS-Nh両マウスのゲノムDNAを肝臓より抽出し、Sau3AIで部分消化した後、BamHI消化したSuperCos1ベクター(STRATAGENE)とライゲーションし、STRATAGENE社のGigapack III XL packaging extract を用いて大腸菌にコスミドを導入した。大腸菌はタイトレーションの後、1プレートに500個のコロニーができるようにプレーティングして一晩培養した後、コロニーをPBSで回収して終濃度40%のグリセロール溶液として-80度で保存した。ライブラリからのクローンの単離、ショットガンクローニングとシークエンスはBACでの方法に準じた。
Mutation determination in Nh Locus
Since the range of the Nh locus has been determined, DS and DS-Nh genomic DNA cosmid libraries have been created to find Nh mutations by comparing the DS and DS-Nh genomic DNA sequences.
Genomic DNA from both DS and DS-Nh mice was extracted from the liver, partially digested with Sau3AI, ligated with BamHI-digested SuperCos1 vector (STRATAGENE), and cosmid was transformed into E. coli using Gigapack III XL packaging extract from STRATAGENE. Introduced. After titration, E. coli was plated to form 500 colonies on one plate and cultured overnight, and then the colonies were collected with PBS and stored at −80 ° C. as a glycerol solution with a final concentration of 40%. Isolation of clones from the library, shotgun cloning and sequencing were in accordance with the BAC method.
コスミドのシークエンスデータよりDSとDS-Nhのゲノム配列を比較して、1塩基置換を見出した。この部位は当時遺伝子の存在が知られていなかったが、ゲノム配列をエクソン配列予測プログラム(genscan http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)で解析するとVR-OAC（TRPV4）とホモロジーを持つORFが予測された（現在のTRPV3）。DS-Nhでの変異は、このORFの1717番目の塩基が、GからＡに変化していた。これは、TRPV3蛋白質の573番目のアミノ酸をグリシンからセリンに変化させる変異であった。TRPV3は、N末側に三回のアンキリンリピート配列、そしてC末側に6回の膜貫通部位を持ったイオンチャネル様配列を持つが、この変異は、4回目と5回目の膜貫通部位の間の細胞な領域にあり、既知のTRPVファミリーすべてについて、種を超えて保存されているアミノ酸であった。高度に保存されているアミノ酸が変化していることで、酵素活性に変化が生じていることが推測された。
ゲノム配列の比較はNh領域内の少なくとも既知の遺伝子のエクソン部分すべてについて行ったが、変異はこの部分にしか存在していなかった。
From the cosmid sequence data, we compared the genomic sequences of DS and DS-Nh and found one base substitution. The existence of the gene was not known at this time, but when the genome sequence was analyzed with the exon sequence prediction program (genscan http://genes.mit.edu/GENSCAN.html), homology with VR-OAC (TRPV4) The ORF is predicted (current TRPV3). In the mutation in DS-Nh, the 1717th base of this ORF was changed from G to A. This was a mutation that changed the 573rd amino acid of TRPV3 protein from glycine to serine. TRPV3 has an ion channel-like sequence with three ankyrin repeats at the N-terminus and six transmembrane sites at the C-terminus, but this mutation is associated with the fourth and fifth transmembrane sites. Amino acids that are conserved across species for all known TRPV families, in the intercellular area. It was speculated that changes in the enzyme activity were caused by changes in highly conserved amino acids.
Genomic sequence comparisons were made for at least all exon parts of the known gene within the Nh region, but the mutation was present only in this part.
Htラットの変異
また、DS-Nhと同様に無毛で皮膚炎を自然発症する形質を優性遺伝するラット（WBN/Ila-Ht Rat）が知られている。文献上（Exp Anim. 2000 Apr;49(2):137-40）このラットの無毛．皮膚炎原因遺伝子は、ラット10番染色体のAsgr1 と Nos2 の間にマッピングされているが、この部分はマウス11番染色体のNh領域の相同領域（シンテニー）であることが分かっている。そこで、このラットのTRPV3遺伝子に変異があるかどうかを確かめた。
Clontech社のRat Genomic DNA を用いてラットのコスミドライブラリを構築した。方法はマウスコスミドライブラリの方法に準じた。ラットのゲノム配列についての情報がないので、マウス用TRPV3領域のゲノム配列のプライマーを用いてラットゲノムを増幅したところ、13-106Ｈ-5-3 (5'-GTCAGCATCAGCTACCATGG-3')、13-106H-5-4 (5'-CTCAGGGTCAGAACATTTCC-3')のプライマー対でラットゲノムから増幅することができた。このプライマーを用いてコスミドの単離を行った。
得られたコスミドクローンをショットガンシークエンスして、ラットTRPV3領域のゲノム配列を調べた。マウスTRPV3領域のゲノム配列、ORFと比較してラットのORFを予測し、ORFすべてを数個の断片にわけて増幅できる様PCRプライマーを設定した。
WBN/Ila-Ht Ratとその親株のWBNラットの肝臓からDNAを抽出し、設定したプライマーを用いてゲノムDNAを増幅してシークエンスを決定したところ、WBN/Ila-Ht Ratにおいても、DS-Nhと同じ部分の塩基に変異が起こっていた。すなわち、TRPV3のORFの、1717番目の塩基がGからTに変化していた。これは、マウスと同じ573番目のアミノ酸を、グリシンからシステインに置換する変異である。もう一つ、1727番目の塩基にも変異が認められたが、これはアミノ酸置換を起こさないサイレント変異であった。TRPV3ORFの、他のエクソンには変異は認められなかった。
また、文献的に、先天的にTRPV3遺伝子を欠損しているトレモロラットには、パーマしているものの発毛が認められる(参考文献： J. Neurochem. 2000 74(6) : 2512-2519)ことも、DS-Nhマウス、HtラットでのTRPV3の変異は、機能欠損ではなく機能に異常を来していることが示唆された。
Mutation of Ht rat Also known is a rat (WBN / Ila-Ht Rat) that inherits a trait that causes hairlessness and spontaneous dermatitis as well as DS-Nh. In literature (Exp Anim. 2000 Apr; 49 (2): 137-40) Hairlessness of this rat. The dermatitis-causing gene is mapped between Asgr1 and Nos2 of rat chromosome 10, but this part is known to be a homologous region (synteny) of the Nh region of mouse chromosome 11. Therefore, it was confirmed whether or not there was a mutation in the TRPV3 gene of this rat.
A rat cosmid library was constructed using Rat Genomic DNA of Clontech. The method was the same as that of the mouse cosmid library. Since there is no information about the genomic sequence of the rat, the rat genome was amplified using primers for the genomic sequence of the TRPV3 region for mice. 13-106H-5-3 (5'-GTCAGCATCAGCTACCATGG-3 '), 13-106H -5-4 (5'-CTCAGGGTCAGAACATTTCC-3 ') primer pair could be amplified from the rat genome. Using this primer, cosmids were isolated.
The obtained cosmid clone was shotgun sequenced to examine the genomic sequence of the rat TRPV3 region. Compared with the ORF of the mouse TRPV3 region genome sequence, the ORF of the rat was predicted, and PCR primers were set so that the entire ORF could be divided into several fragments and amplified.
DNA was extracted from the liver of WBN / Ila-Ht Rat and its parent WBN rat, and the sequence was determined by amplifying the genomic DNA using the set primers. In WBN / Ila-Ht Rat, DS-Nh A mutation occurred in the same base. That is, the 1717th base of TRPV3 ORF was changed from G to T. This is a mutation that substitutes glycine for cysteine for the same amino acid at 573 as in mouse. Another mutation was observed at the 1727th base, which was a silent mutation that did not cause an amino acid substitution. No mutations were found in other exons of TRPV3ORF.
In addition, in literature, tremolo rats that are deficient in the TRPV3 gene have permanent hair growth (reference: J. Neurochem. 2000 74 (6): 2512-2519). It was also suggested that mutations in TRPV3 in DS-Nh mice and Ht rats are abnormal, not functional.
さらに、DS-Nhと Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、 ＮＣ／Ｎｇａなどの他系統のマウスを掛け合わせることにより、1対1で無毛のf1個体を得た。この無毛マウスをそれぞれの親系統に戻し交配をしてＣ５７ＢＬ／６Ｊ-Nh、NC-Nhなどの無毛系統を作成した。これらのマウスはTRPV３の変異をヘテロに持つことが期待されるが、調べたところいずれも期待通りにTRPV3の変異をヘテロに持っていた。
BALB/c、 C57BL/6J、 NC/Ngaは、マウスの系統名である。NC/Ngaは、アトピー性皮膚炎のモデルマウスとして広く知られている有毛のマウスであり、SPF環境下でダニ抗原を外から加えることにより発症する。BALB/c、C57BL/6Jは、一般的に用いられている実験用マウスである。BALB/cはTh2優位、C57BL/6JはTh1優位のマウスとして知られている。このようなマウスに本発明の遺伝子を導入して無毛マウスを作出することによって、通常の系統よりも有用な無毛のモデル動物を入手することができる。
Furthermore, DS-Nh and other strains of mice such as C57BL / 6J and NC / Nga were crossed to obtain one-to-one hairless f1 individuals. The hairless mice were backcrossed to their parent strains to create hairless strains such as C57BL / 6J-Nh and NC-Nh. Although these mice are expected to have heterozygous TRPV3 mutations, when examined, all have heterozygous TRPV3 mutations as expected.
BALB / c, C57BL / 6J, and NC / Nga are strain names of mice. NC / Nga is a hairy mouse that is widely known as a model mouse for atopic dermatitis, and develops by adding mite antigen from the outside in an SPF environment. BALB / c and C57BL / 6J are generally used experimental mice. BALB / c is known as Th2-dominant, and C57BL / 6J is known as Th1-dominant mouse. By introducing the gene of the present invention into such a mouse to produce a hairless mouse, a hairless model animal that is more useful than a normal strain can be obtained.
BALB/c-Nhの特徴
DS-Nhの持つTRPV3の変異を戻し交配によりBALB/cに導入して作製した無毛マウス、BALB/c-Nhの特徴を調べた。SPF環境下からコンベンショナル環境下に移して6、17、35週目のDS-Nhマウスと、35週目のBALB/c-Nhマウスの血清中のIgE濃度をELISAによって測定した。このとき、DS-Nh35週の群だけに皮膚炎が見られ、BALB/c-Nhの群には皮膚炎は見られなかった。
IgE濃度は、皮膚炎が起こっていた35週目のマウス以外に、17週目のDS-Nh、35週目のBALB/cでも上昇していた(表3)。このことは、TRPV3の変異が、無毛形質だけでなく、アトピー性皮膚炎を引き起こすファクターの一つであることを示唆している。
The characteristics of the hairless mouse, BALB / c-Nh, produced by introducing the TRPV3 mutation of DS-Nh into BALB / c by backcrossing, were examined. The concentration of IgE in the serum of DS-Nh mice at 6, 17 and 35 weeks and BALB / c-Nh mice at 35 weeks after moving from SPF environment to conventional environment was measured by ELISA. At this time, dermatitis was observed only in the DS-Nh 35 week group, and no dermatitis was observed in the BALB / c-Nh group.
In addition to the 35-week mice in which dermatitis occurred, the IgE concentration also increased with DS-Nh at 17 weeks and BALB / c at 35 weeks (Table 3). This suggests that TRPV3 mutation is one of the factors causing atopic dermatitis as well as hairless traits.
NC-Nhの特徴
DS-Nhの持つTRPV3の変異を戻し交配によりＮＣ／Ｎｇａに導入して作製した無毛マウス、NC-Nhの特徴を調べることができる。ＮＣ／Ｎｇａマウスは、ダニによるアトピー様皮膚炎を誘発できるマウスとして認知、流通しているが、体毛があるので薬剤の塗布、皮膚炎の観察などのために剃毛を行わねばならず、薬効評価のためのタスクがかかり、剃毛の影響も除外できないと言える。また、ダニによる皮膚炎の誘発も個体差が大きく、薬効評価系としては改善されるべき点があると言える。
NC-Nhマウスは無毛であるので、ＮＣ／Ｎｇａよりも評価系として優れていると言え、さらにダニによる皮膚炎の誘発効率が向上している可能性もある。
ダニによる皮膚炎の誘発は、SPF環境下で飼育しているマウスの背中に、週一回、ダニ抗原を皮下注射して、皮膚炎を観察することにより行うことができる。ＮＣ／Ｎｇａは背中を剃毛する。ＮＣ／Ｎｇａは、NC-Nhと比べて発症に時間がかかり、また個体差も大きい。その点、NC-Nhは、全身の様子の観察も容易であると言える。
よって、アトピー性皮膚炎モデルとしては、ＮＣ／ＮｇａよりもNC-Nhが利便性に富んでいるといえる。
Features of NC-Nh
The characteristics of the hairless mouse NC-Nh produced by introducing the TRPV3 mutation of DS-Nh into NC / Nga by backcrossing can be examined. NC / Nga mice are recognized and distributed as mice that can induce atopic dermatitis due to ticks, but since there is body hair, they must be shaved for drug application, dermatitis observation, etc. It takes a task for evaluation, and it can be said that the influence of shaving cannot be excluded. In addition, the induction of dermatitis due to ticks varies greatly among individuals, and it can be said that there is a point that should be improved as a medicinal effect evaluation system.
Since NC-Nh mice are hairless, it can be said that the NC-Nh mice are superior to NC / Nga as an evaluation system, and there is a possibility that the efficiency of inducing dermatitis due to mites is improved.
Induction of dermatitis by mites can be carried out by observing dermatitis by subcutaneously injecting mite antigen once a week on the back of a mouse reared in an SPF environment. NC / Nga shaves his back. NC / Nga takes more time to develop than NC-Nh, and individual differences are large. In this respect, NC-Nh can be easily observed.
Therefore, it can be said that NC-Nh is more convenient than NC / Nga as an atopic dermatitis model.
Claims (4)
ｂ）相同的組換えによりES細胞に該変異遺伝子を導入する工程、
ｃ）偽妊娠マウスの子宮角にES細胞を移植してキメラマウスを作出する工程、
ｄ）該キメラマウスを交配し、無毛マウスを作出する工程を含む、ＴＲＰＶ３の５７３番目のグリシンがセリンに置換していることを特徴とするマウスの作出方法。 a) cloning a genomic DNA region of a mutant gene encoding TRPV3 in which the 573rd glycine of TRPV3 is replaced with serine;
b) introducing the mutant gene into ES cells by homologous recombination;
c) A step of producing a chimeric mouse by transplanting ES cells into the uterine horn of a pseudopregnant mouse,
d) A method for producing a mouse, comprising the step of mating the chimeric mouse to produce a hairless mouse, wherein the 573rd glycine of TRPV3 is substituted with serine .
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