JP4406305B2

JP4406305B2 - スチレン系重合体の生物分解処理法およびこの方法に用いる微生物

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Publication number: JP4406305B2
Application number: JP2004056697A
Authority: JP
Inventors: 栄作及川; 良信石橋; 胤昭及川
Original assignee: 胤昭及川
Priority date: 2003-11-13
Filing date: 2004-03-01
Publication date: 2010-01-27
Anticipated expiration: 2024-03-01
Also published as: JP2005163004A

Description

本発明はスチレン系樹脂を微生物を用いて分解する方法に関する。本発明は、例えば廃棄された発泡スチロールの処理に用いることができる。

発泡スチロールは、ポリスチレンをブタン等の発泡剤で膨張させたものである。製法と用途により、ビーズ法発泡スチロール（Expanded Polystyrene； EPS）、ポリスチレンペーパー（Polystyrene Paper; PSP）、押出ボード（Extruded Polystyrene; XPS）に分類され、EPSは主に農水産容器や緩衝包装材として、PSPは主に食品トレー、XPSは主に断熱建材に使用されている。発泡スチロールは断熱性や衝撃吸収性等に優れ、加工も容易であることから、今後もその消費が続くと考えられるが、使命を終えた後の発泡スチロールは産業および家庭で廃棄物として排出されている。このような状況において、他のプラスチック同様、発泡スチロールの廃棄物処理問題の解決は重要性を増しており、廃棄物ゼロのいわゆる“ゼロエミッション”を目指し、発泡スチロールリサイクル処理への取り組みが求められている。

発泡スチロールのリサイクルの手法には、マテリアルリサイクルとサーマルリサイクルがある。発泡スチロールのマテリアルリサイクルとは、発泡スチロールを減容剤・溶解剤によって減容し、減容剤を分離した後、精製したポリスチレン樹脂を再利用するリサイクル法である。また、サーマルリサイクルとは、発泡スチロールを焼却処理した際に生じる燃焼熱を熱資源として利用するリサイクル法である。2002年度の我が国における発泡スチロールリサイクル率は、マテリアルリサイクルが39.1％、サーマルリサイクルが25.6％で、両方を合わせても約65%に過ぎず、残りは埋め立てや単純焼却によって処理されている。

埋め立て処理は、将来に渡って土地を確保し続けることが困難であるばかりでなく、発泡スチロールを直接分解する微生物が知られていないことから、発泡スチロールが半永久的に土中に留まるという問題を有する。土壌中の発泡スチロールからは、熱や有機溶剤によって、いわゆる環境ホルモン性が疑われているスチレンダイマーやスチレントリマーといった内分泌攪乱物質が溶出したり、発ガン性が指摘されているスチレンモノマーが溶出したりする可能性があり、埋め立て処理は二次的な環境汚染を招く危険性を否定できない。また、サーマルリサイクルを含む焼却処理は、発泡スチロール自体によるダイオキシンの発生はないものの、塩化ビニル等との同時燃焼によるダイオキシン発生増強の懸念の問題が残る。さらに、ダイオキシン発生回避のための高温処理による焼却炉の消耗、発熱、さらに二酸化炭素の排出問題を伴う。こうした処理法は、結果的に人類の健康を損ね、地球温暖化を促進するばかりでなく、エネルギー浪費にもつながっている。それにもかかわらず発泡スチロールが埋め立てや焼却処理される理由の一つは、汚れ・臭い・色が付いたために従来のマテリアルリサイクル処理を施せないことである。

ところで、廃棄物処理方法の一つとして、微生物を用いた生物分解による方法が既に実用化されている。例えば、一次産業、食品加工業等からの有機性廃棄物を微生物により堆肥化する技術が知られている。一方、発泡スチロールのリサイクル率や処理技術は年々進んでいるが、発泡スチロールを生物分解する方法は知られていない。これは、発泡スチロールや発泡スチロールを溶解した後に生じるポリスチレンを直接的に分解できる微生物が知られていないためである。発泡スチロールを減容剤で処理するとスチレンモノマー、スチレンダイマー、スチレントリマー、ポリスチレンが生ずるが、スチレンモノマーを分解する微生物としてはPseudomonas属（非特許文献1,2,3）やXanthobacter属（非特許文献4）が知られているものの、スチレンダイマーやスチレントリマーおよびポリスチレンに対して、耐性や分解を示す微生物の報告は知られていない。

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本発明はこのような状況を鑑みてなされたものであり、その目的は発泡スチロール等のスチレン系重合体を生物分解により処理する方法を提供することである。また、発泡スチロール等の生物分解を可能とする微生物を提供する。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、発泡スチロールを溶解した際に大半を占めるポリスチレンを分解できる微生物を発見できれば、発泡スチロールを微生物分解し、最終的には堆肥化等のリサイクル処理が可能になると考えた。そこで本発明者らは、固形ポリスチレンビーズ（モノマー重合度3000）を溶解剤であるジクロロメタンで溶解し、発泡スチロールをジクロロメタンで溶解したものと同じ状態にした後、環境中から単離したスチレン酸化微生物やスチレントリマー耐性微生物の培養液に添加し、ポリスチレン分解能を高速液体クロマトグラフィーによって分析した。その結果、スチレン酸化微生物やスチレントリマー耐性微生物の中にポリスチレン分解能を有するものがあることを実験的に確認し、該微生物を用いて発泡スチロール分解処理ができることを見出し、本発明を完成した。

したがって本発明は、発泡スチロールをスチレン分解微生物やポリスチレン分解微生物を含む微生物を用いて分解処理する方法およびその微生物を提供するものであり、より具体的には、
（１）ポリスチレン分解能を有する微生物をスチレン系重合体と接触させる工程を含む、スチレン系重合体の分解方法であって、前記ポリスチレン分解能を有する微生物が、受託番号FERM P-19584で示されるXanthomonas sp. PSD-2株、受託番号FERM P-19583で示されるSphingobacterium-Like sp. PSD-6株、受託番号FERM P-19582で示されるBacillus thuringiensis STR-Y-O 株のいずれかに属する微生物を含む、スチレン系重合体の分解方法、
（２）受託番号FERM P-19584で示されるXanthomonas sp. PSD-2株、受託番号FERM P-19583で示されるSphingobacterium-Like sp. PSD-6株、受託番号FERM P-19582で示されるBacillus thuringiensis STR-Y-O 株のいずれかに属するポリスチレン分解能を有する微生物、
（３）Bacillus属に属するスチレン分解能を有する微生物とスチレンを接触させる工程を含む、スチレンの分解方法であって、前記スチレン分解能を有する微生物が受託番号FERM P-19582で示されるBacillus thuringiensis STR-Y-O株である、スチレンの分解方法、
（４）Bacillus属に属するスチレン分解能を有する微生物であって、受託番号FERM P-19582で示されるBacillus thuringiensis STR-Y-O株である、スチレン分解能を有する微生物、
（５）（２）または（４）に記載の微生物を含む、ポリスチレンまたはスチレン分解に用いる微生物製剤、
（６）スチレン系重合体を減容剤によって溶かして得られた溶解物をポリスチレン分解能を有する微生物と接触させる、スチレン系重合体の分解方法であって、前記ポリスチレン分解能を有する微生物が、受託番号FERM P-19582で示されるBacillus thuringiensis STR-Y-O株である、スチレン系重合体の分解方法、
（７）スチレン系重合体を減容剤によって溶かして得られた溶解物と、ポリスチレン分解能を有する微生物の培養液を混合し、スチレン系重合物を分解する方法であって、前記微生物が、前記溶解物と前記培養液を混合した際に、表面に浮遊する前記減容剤の浮遊状態を解除する能力を有する、受託番号FERM P-19584で示されるXanthomonas sp. PSD-2株、受託番号FERM P-19583で示されるSphingobacterium-Like sp. PSD-6株、受託番号FERM P-19582で示されるBacillus thuringiensis STR-Y-O 株のいずれかに属する微生物である、スチレン系重合体の分解方法、
（８）前記減容剤はリモネンである、（７）に記載のスチレン系重合体の分解方法、
（９）前記減容剤は、有機溶媒である、（６）に記載のスチレン系重合体の分解方法、
（１０）前記有機溶媒はジクロロメタンである、（９）に記載のスチレン系重合体の分解方法、
（１１）（６）〜（１０）のいずれか１つに記載のスチレン系重合体の分解方法に使用されるポリスチレン分解能を有する微生物、
（１２）（１１）に記載の微生物を含む、微生物製剤、
を提供するものである。

本発明により、発泡スチロールを始めとするスチレン系重合体を生物分解処理する方法が提供された。本発明の方法による発泡スチロール廃棄物処理は、これまでマテリアルリサイクルに不適であったEPSをも、焼却処理や埋め立て処理に頼ることなく処理可能となる。そのため、資源の有効利用、CO2削減による地球温暖化防止、燃焼工程がなく発熱が少ないため、焼却炉の寿命延長など地球環境に役立つ効果を与えることができる。将来的には、市販の処理機を用いた生ゴミ処理のように、個人や事業体レベルでEPSのリモネン溶解とコンポスト化を独自に行うことができるようなシステムが構築されれば、家庭や事業体から出る発泡スチロール廃棄物の減量を行うことができると考えられる。さらに、EPSの微生物分解物を堆肥として植物の肥料に使うことができれば、窒素や炭素の循環に役立ち、まさに“ゼロエミッション処理”の達成を可能とするものとなる。

本発明は、ポリスチレン分解能を有する微生物をスチレン系重合体と接触させる工程を含む、発泡スチロール、ポリスチレン等のスチレン系重合体の分解方法を提供する。ポリスチレン分解能を有する微生物を、本発明者らが具体的に見出したことによるものである。

本発明においてスチレン系重合体とは、スチレンが２以上重合または他の化合物と共重合しているものをいい、例えば、スチレンダイマー、スチレントリマー、ポリスチレンは本発明に含まれる。また、本発明におけるスチレン系重合体は、ビーズ、ペレット、インゴット、ゲル、成形体、粉砕品、発泡スチロール、再生発泡スチレン系樹脂、これらの溶解物などの形態をとることができる。例えば発泡スチロール溶解物は本発明におけるスチレン系重合体に含まれるが、発泡スチロールを有機溶剤で溶解したものをいい、一般にはスチレンモノマー、スチレンダイマー、スチレントリマー、ポリスチレン等の混合物である。本発明におけるスチレン系重合体には、他の物質が混在していてもよく、例えば、発泡スチロールの塗装剤や食品等の付着物があってもよい。

本発明に使用する微生物は、ポリスチレン分解能を有する微生物であれば、他の物質の分解能を有していてもよい。例えば、後述するBacillus thuringiensis STR-Y-O 株のようにポリスチレンとスチレンの両方の分解能を有する微生物は、スチレンモノマー、スチレンダイマー、スチレントリマー、ポリスチレン等の混合物である発泡スチロール溶解物の分解処理を目的とする場合に、より好ましい選択肢となる。ポリスチレン分解能を有する微生物であることは、例えば、後述する実施例のように、ポリスチレン溶液を添加した液体培地で微生物を数日間培養し、培養液中のポリスチレン濃度を高速液体クロマトグラフ等を用いて定量し、ポリスチレン量の変化を観察することによって確認することができる。

ポリスチレン分解能を有する微生物の代表的なものとして、具体的には、Arthrobacter属、Xanthomonas属、Sphingobacterium-Like、Bacillus属のいずれかに属する微生物を挙げることができる。より具体的には、Arthrobacter woluwensis PSD-1株、Xanthomonas sp. PSD-2株、Sphingobacterium-Like sp. PSD-6株、Bacillus thuringiensis STR-Y-O 株を挙げることができる。これらの菌株は、ポリスチレン分解能が確認された最初の微生物であり、本発明者らによって単離され、16s-rDNAの解析から新規の株として分類されたものである。

本発明者らは、これら菌株を、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
（イ）寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
（所在地：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６郵便番号305-8566）
（ロ）寄託日：平成15年11月12日
（ハ）受託番号：
Xanthomonas sp. PSD-2株（受託番号FERM P-19584）
Sphingobacterium-Like sp. PSD-6株（受託番号FERM P-19583）
Bacillus thuringiensis STR-Y-O 株（受託番号FERM P-19582）

ポリスチレン分解微生物を単離するには、本発明者らが、ポリスチレン分解微生物を初めて具体的に単離した方法によることができる。すなわち、本発明者らによって完成された、スチレントリマー耐性能を指標として微生物をスクリーニングする方法である。従来は、ポリスチレン分解微生物の単離報告例がなかったことから、ポリスチレン分解微生物単離方法についても公知のものはなかった。ポリスチレンは常温で固体であるが、一般的な溶媒には溶けにくく特殊な溶媒を用いないと溶解しにくい。微生物の分解能をしらべるためにポリスチレンを特殊な溶媒に溶解して培地に添加したとすると、微生物への溶媒による影響が大きくなってポリスチレン分解能を評価できない可能性が高い。そこで、本発明者らはポリスチレンよりも取り扱いやすいスチレントリマーに注目し、単離方法を構築した。実施例のように、スチレントリマー耐性能を指標として微生物をスクリーニングする工程の後に、さらにポリスチレン分解能を確認する工程を行うことにより、より確実に単離することが可能となる。

なお、単離した微生物が上記Arthrobacter属、Xanthomonas属、Sphingobacterium-Like、Bacillus属に属するか否かについては、微生物の分類同定のための16Sリボソーマル(r)DNAの塩基配列決定の操作(非特許文献6)を行って判断することができる。さらに微生物の分類のための相同性検索は、ウエッブ上のNational Center for Biotechnology Information (NCBI) 、http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/BLAST/で行うことができる。

ポリスチレン分解能を有する微生物は、土壌から単離することができる。土壌の種類は問わないが、EPS、プラスチック、ゴム等の工業製品からの溶出等によりスチレンやポリスチレンを含有する可能性がある土壌であれば、本発明の微生物を単離できる可能性が高い。たとえば道路沿いの土壌は、自動車のタイヤにスチレンゴムを使用しているものがあることから、本発明に使用する微生物を採取するのに好適である。また、本発明に使用する微生物は、ポリスチレン分解能を有する限り、天然から単離した微生物を形質転換したものでもよい。

ポリスチレン分解能を有する微生物とスチレン系重合体とを接触させる工程は、例えば、上記微生物が投入された微生物培養槽に分解対象のスチレン系重合体を投入することによって実施することができる。微生物培養槽はスチレン系重合体を効果的に分解できる環境を備えたものであれば特に限定されるものではないが、機械的な温度コントロール機能や攪拌機能等を備えていることが好ましい。また、微生物が固定化されている装置にスチレン系重合体を投入または通過等させる方法であってもよい。

ポリスチレン分解能を有する微生物とスチレン系重合体とを接触させる工程の前に、前処理が施されてもよい。例えば、成形体であるスチレン系重合体を直接本発明の微生物と接触させて分解処理することも可能であるが、成形体の直接分解は効率が悪いことがある。その場合に効率分解を効率化するための粉砕処理や有機溶剤による溶解処理を行うことは可能である。また、発泡スチロールについて、本発明の分解方法実施の前に、リモネンやエステル系のコハク酸ジメチル、グルタル酸ジメチル、アジピン酸ジメチルなどの二塩基酸エステル混合液、あるいは石油系のn-パラフィンとキシレンの混合溶液で減容処理を行ってもよい。

さらに、本工程とポリスチレン以外の化合物の分解工程が並行して進行していてもよい。例えば、タイヤやゴムを分解する場合やポリスチレン、スチレンモノマー等の混合物を分解する場合、ポリスチレン分解能を有する微生物に他の化合物分解能を有する微生物を混合して使用することにより、ポリスチレン分解工程と他の化合物の分解工程が並行して進行していてもよい。

ポリスチレン分解能を有する微生物は、一種類で使用してもよく、またはポリスチレン分解能を有する微生物が分解能を発揮しながら生息できる限り、他のポリスチレン分解能を有する微生物や他の化合物分解微生物と共存した状態で使用してもよい。例えば、既存のスチレン分解能を有する微生物が混合されていてもよい。

また本発明は、Bacillus属に属するスチレン分解能を有する微生物および該微生物を用いたスチレンの分解方法を提供する。従来知られているスチレン分解菌はPseudomonas属とXanthobacter属等であったが、本発明者らによって、新たにBacillus属のスチレン分解微生物が同定されたことに基づくものである。

既知のスチレンモノマー分解微生物のうち、Pseudomonas属の微生物はその分解初期段階の経路も明らかにされている（非特許文献1）。これらの微生物によるスチレンモノマーの分解経路の初期段階では、スチレンモノマーがスチレンオペロンのstyA (large subunit)およびstyB (small subunit)遺伝子のコードするスチレンモノオキシゲナーゼ(SMO)酵素によって酸化されて、エポキシスチレンに転換される。その後、styC遺伝子のコードするエポキシスチレンイソメラーゼによってフェニルアセトアルデヒドに異性化され、さらにstyDのコードするフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素によってフェニル酢酸に転換される。この後は別の遺伝子が関与し、フェニルアセチル-CoAに至る分解経路を経て、最終的にH2OやCO2まで分解資化されると考えられている。

O'connorらの報告（非特許文献5）より、スチレン分解における初期段階で働くスチレンモノオキシゲナーゼ(SMO)によってインドール（無色）をインディーゴーブルー（青色）に酸化させる反応も触媒できることが明らかになっている。スチレン分解微生物の選別は、上記知見を利用して、インドールを塗沫したスチレン添加寒天培地上に青色のコロニーとして容易に識別する方法をとることができる。

Bacillus属に属するスチレン分解能を有する微生物であれば、本発明のスチレン分解方法に用いることができるが、より具体的には、Bacillus thuringiensis STR-Y-O 株を挙げることができる。Bacillus thuringiensis STR-Y-O 株は、本発明者らによりポリスチレン分解能及びスチレン分解能を持つ微生物として見出され、寄託された。寄託を特定する情報は、上述のとおりである。Bacillus thuringiensis STR-Y-O 株のほか、本発明者らは、実施例において後述するとおり、Arthrobacter woluwensis PSD-1株、Xanthomonas sp. PSD-2株、Sphingobacterium-Like sp. PSD-6株等がSMO活性を有していることを明らかにしており、これらの菌株もまたスチレン分解方法に使用可能と考えられる。

本発明は、上述の微生物を含む、スチレン系重合体またはスチレン分解用微生物製剤を提供する。上述微生物は、単独または他の微生物と混合して、そのままあるいは加工して微生物製剤とすることができる。微生物をゼオライトや樹脂等の担体に固定化して用いてもよい。微生物製剤の形態は、培養液、粉末、凍結乾燥菌体などを例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の微生物製剤は、微生物培養槽などに投入してスチレン系重合体分解処理に用いることができるほか、土壌中のスチレン系重合体分解を目的として、土壌に散布する利用方法も考えられる。

また、本発明では、発泡スチロールをリモネンなどの減容剤や、ジクロロメタンなどの有機溶剤によって溶かし、得られた溶解物を微生物と接触させて発泡スチロールを分解する。

この場合の微生物は、上述したスチレン重合体や、スチレンの分解能力を持つ微生物が利用される。

なお、減容剤はリモネンに限定されたものでなく、発泡スチロールのリサイクル等の処理のために用いられているものや、発泡スチロールを溶かすことができるのであれば良い。また、有機溶媒はジクロロメタンに限定されたものでなく、発泡スチロールを溶かすことができるものであれば良い。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］スチレン酸化微生物の単離
仙台市内の国道4号線の路肩または山形市大字八森の畑から土壌を採取し、スチレン酸化菌の単離用の試料として用いた。20gの土壌試料を生理食塩水で懸濁し、室温30℃で10分間遠心した。遠心後の上清500μlを各種の濃度添加したスチレンモノマーを炭素源とする50mlの0.001%(w/v) 酵母エキスを含む基礎無機塩培地（非特許文献７）に植え継いだ。スチレンは原液をそれぞれ10μl(1.74mM), 30μl(5.24mM), 50μl(8.72mM), 100μl(17.4mM), 300μl(52.4mM), 500μl(87.2mM)を添加した（カッコ内は終濃度）。スチレンを添加した培養液を100ml容の共栓付三角フラスコに移し、30℃、130rpm、7日間振とう培養した。増殖を示すにごりが確認された後、スチレンを10μl添加した試料の培養液100μLを基礎無機塩寒天培地に塗沫し、室温の暗所で静置培養した。寒天培地には予め100mMのインドール（N,N-ジメチルホルムアミドに溶解）を100μl塗沫した。7日間程度培養して、青く発色したコロニーを同様の寒天培地に白金耳で画線し、さらに室温で7日間程度静置培養した。寒天培地に形成された単一の青色コロニーを10mlのLB培地（非特許文献８）に植え、30℃で1〜2日間振とう培養した。この培養液に等量の60%グリセロールを加え、-85℃で凍結保存した。

［実施例２］スチレントリマー耐性微生物の単離およびSMO活性試験
ポリスチレン分解菌はSMO活性を保有することが明らかでなく、SMO活性を指標として単離することができないため、ポリスチレン耐性菌として単離を試みた。仙台市若林区六丁ノ目産業道路わきの街路樹根元から土壌を採取し、ポリスチレン分解菌単離用の試料とした。20gの土壌試料を生理食塩水で懸濁し、室温、3,000rpmで5分遠心した。遠心後の上清500μlを、炭素源として各種の濃度のスチレントリマーを添加した酵母エキス0.001%(w/v) 50mlを含む基礎無機塩培地に植え継いだ。スチレントリマー（10μg／mlトルエン溶液, 関東化学）は、原液をそれぞれ10μl(1.56μM), 30μl(4.68μM), 50μl(7.8μM), 100μl(15.6μM), 300μl(46.8μM), 500μl(78μM)を添加した（カッコ内は終濃度）。スチレントリマーを添加した培養液を100ml容の共栓付三角フラスコに移し、30℃、130rpm、7日間振とう培養した。濁りが確認された後、スチレントリマーを10μl、30μl、または50μl添加した試料の培養液500μlを、新しい同じ組成の培地に植え継ぎ、さらに7日間培養した。同様の操作をもう一度行った。この集積培養液100μlを基礎無機塩寒天培地に塗沫し、室温の暗所で7日間静置培養した。寒天培地には予めスチレントリマーをそれぞれ10μl、30μl、50μl塗沫した。出現したコロニーを同様の寒天培地に白金耳で画線し、さらに室温の暗所で3日間培養した。それぞれのプレートから単一のコロニーを10mlのLB培地に植え、30℃で1〜2日間振とう培養した。この培養液に等量の60%グリセロールを加え、-85℃で凍結保存した。

ポリスチレン耐性菌のSMO活性試験は、スチレン酸化細菌の単離実験と同様に、インドールを塗沫した基礎無機塩寒天培地にグリセロールストックしておいたポリスチレン耐性菌を植え、形成されたコロニーの色が青く発色するのを観察する方法によって行った。

［実施例３］抗生物質耐性試験
スチレン酸化細菌およびポリスチレン耐性細菌の抗生物質耐性能を、4種類の抗生物質について検討した。-85℃でグリセロールストックしておいた細菌を、終濃度50μg／mlの各種抗生物質入り1×LB寒天培地に画線して植え、30℃で2〜7日間培養した。抗生物質はアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリンを用いた。耐性はコロニー形成能力から判定した。

［実施例４］16SリボソーマルDNA塩基配列の決定
スチレン酸化細菌およびポリスチレン耐性細菌からのトータルDNAの調製は常法であるSDSとproteinase Kを用いた方法により調製した。トータルDNAからのPCRによる16SリボソーマルDNA(16S-rDNA)のクローニングは、既知のユニバーサルプライマーを用いて行った。PCRプライマーは既知の520Fプライマー5'-GCCACG（AC）GCCGCGGT-3'（配列番号１）および、1400Rプライマー5'- ACGGGCGGTGTGT(GA)C-3'（配列番号２）を用いることで、分類に適した遺伝子情報を得ることができる。特に本開発で単離したBacillus thuringiensis STR-Y-O株の分類には以下のプライマーを用いた。Basillus属の種を分類するために有効であることが（非特許文献８）によって示されている、16S-rDNAと23S-rDNAスペーサー領域を増幅するためのプライマーITS-A-f 5'-CCTTGTACACACCGCCCGT-3'（配列番号３）およびITS-A-r 5'-AAAATAGCTTTTTGGTGGAG-3'（配列番号４）と、さらに（非特許文献９）によってBacillus sereusとBacillus thuringiensisとを分類することに有効であることが示されているBacillus sereusのDNAジャイレース遺伝子gyrBに対するプライマーBC1 5'-ATTGGTGACACCGATCAAACA-3'（配列番号５）およびBC2r 5'-TCATACGTATGGATGTTATTC-3'（配列番号６）、さらにBacillus thuringiensisのDNAジャイレース遺伝子gyrBに対するプライマーBT1 5'-ATCGGTGATACAGATAAGACT-3'（配列番号７）およびRT2r 5'-CCTTCATACGTATGAATATTATTT-3'（配列番号８）を用いた。

DNA塩基配列は310 Genetic Analyzer(ABI)を用いて決定し、DNA相同性解析は遺伝情報解析ソフトウエアGenetyx-MAC ver.9を用いて行った。

［実施例５］スチレン分解能測定
スチレン分解実験は単離した6株のスチレン酸化細菌の内のSD-10株とSTR-Y-O株について試みた。-85℃でグリセロール溶液に保存しておいたスチレン酸化細菌を、LB寒天培地に画線し、30℃で一晩静置培養した。翌日、単一のコロニーを白金耳でかき取り、50mlのM9最小培地（非特許文献６）に植え継ぎ、100ml容の共栓付き三角フラスコを用いて、30℃で一晩振とう培養した。500μlの培養液を新しい50mlのM9最小培地に植え継ぎ培養を続けた。コントロールとしてM9最小培地のみを用いた。吸光度OD600nmが0.2に達したところで、ヘキサンで希釈した0.1μl/mlの濃度のスチレンモノマー溶液を200μl (18μg)添加した。その後、30℃で8日間振とう培養を続けた。培養液を24時間おきに4ml分取し、2mlのヘキサンと混合した。混合した溶液を遠心分離し、ヘキサン層を回収した。回収したヘキサン溶液はふた付きのバイアルビンに移し、ガスクロマトグラフ分析を行う直前まで4℃で保存した。この内の5μlをガスクロマトグラフ(GC)分析に用いて、スチレン濃度を測定した。GC装置は島津のGC-9Aを用いた。カラムはFFAP(島津)を用いた。GC分析の条件はキャリアーガスをHe、カラム温度を130℃、検出器温度を250℃で行った。

［実施例６］ポリスチレン分解能測定
ポリスチレン分解実験は、16S-rDNAの塩基配列より分類された微生物のうちPSD-3株と同種と同定されたPSD-4株およびPSD-5株を除く、PSD-1株、PSD-2株、PSD-3株、PSD-6株、およびスチレン酸化細菌STR-Y-O株について実施した。-85℃でグリセロール溶液に保存しておいた菌株をLB寒天培地に画線して、30℃で1〜2日間静置培養した。単一のコロニーを白金耳でかき取り、15mlのLB培地に植え継ぎ、50ml容の三角フラスコを用いて、30℃で一晩振とう培養した。250μlの培養液を25mlのM9培地それぞれの耐性菌につき4本ずつに植え継ぎ、100ml容の共栓付き三角フラスコを用いて、30℃で培養した。コントロールとしてM9培地のみを用いた。吸光度OD600nmが0.2に達したところで、ジクロロメタンで溶解した0.3mg/mlのポリスチレンビーズ（重合度n≒3,000）溶液を200μl(60μg)添加した。その後、30℃で8日間振とう培養を続けた。0、2、5、8日目の培養液25mlを、50ml容のガラス製の遠心菅に移した。2.5gのNaClを加え良く混合して溶解した。続いて2mlのジクロロメタンを加え良く混合した。混合した溶液を室温、3,000rpm、5分遠心分離し、ジクロロメタン層を2ml容のマイクロチューブに移した。0.1gの無水Na2SO4を加えて充分に混合し、室温下で10分間静置した。フラッシュ遠心し、上清をふた付きのバイアルビンに移し、分析まで4℃で保存した。この内の10μlを高速液体クロマトグラフ分析(LC)に用いてポリスチレン濃度を測定した。LC装置は島津のLC-10ADを用いた。カラムはShim-pack GPC-803(島津)を用いた。LC分析の条件は移動相をテトラヒドロフラン、流速を1ml/min、カラム温度を30℃、検出波長254nmで行った。

［実施例７］スチレン酸化細菌の分類結果例
環境中から10株以上のインドール（無色）をインディーゴーブルー（青色）に酸化させる能力を有する細菌を単離することができた。SD-1〜SD-10株は仙台市の国道沿いから単離された細菌であり、STR-Y-O株は山形市の畑から単離した細菌である。単離した細菌のうち、6 株の16S-rDNA塩基配列に基づく分類を試みた結果を表1に示す。SD-1、SD-4およびSD-9株はいずれもAureobacterium resistensおよびMicrobacterium nematophilumと99.3 %の相同性が示され、これらの株は2つの属名が重なっていることから未同定株とした。SD-2株はArthrobacter woluwensisと99.8%示され、SD-10株はPseudomonas sp.と99.9%の相同性が示された。これらの結果より、SD-2株およびSD-9株はそれぞれ、Arthrobacter woluwensis SD-2株、Pseudomonas sp. SD-10株と命名した。STR-Y-O株はBacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensisと99.9%の相同性が示された。ここで、Bacillus anthracisは炭疽菌として知られる病原菌であるので、Ameurらの方法(非特許文献8)に従って、16S-rDNAと23S-rDNAの塩基配列の間のスペーサー領域の塩基配列を決定して炭疽菌か否か確認した。その結果、約400塩基の3塩基に炭疽菌に存在せず、B. cereusと B. thuringiensisのみに存在する塩基が確認されたことから、炭疽菌でないことを確認できた。続いて、Yamadaらの方法（非特許文献9）に従ってgyrB遺伝子に対するPCRの結果、B. thuringiensisのみを増幅することができるプライマーを用いた場合にアガロースゲル電気泳動の結果にDNAバンドが検出され、B. cereusのみを増幅することができるPCRプライマーを用いた場合には検出されなかった。この結果より、STR-Y-O株はB. thuringiensisであると同定し、B. thuringiensis STR-Y-O株と命名した。

［実施例８］ポリスチレン耐性細菌の分類結果例
10株のスチレントリマーに対して耐性を示す細菌を単離することができた。16S-rDNA塩基配列に基づく分類の結果、PSD-1、PSD-3およびPSD-4株はArthrobacter woluwensisと99.8%の相同性が示された（表1）。これらの株は同じ仙台市内の道路沿いで単離されたスチレン酸化細菌のSD-2株と同株でないかと考えている。この結果より、それぞれPSD-1、PSD-3およびPSD-4株はArthrobacter woluwensis PSD-1株、PSD-3およびPSD-4と命名した。また、PSD-2株はXanthomonas cynarae, Xanthomonas gardneaeおよびXanthomonas campestrisといずれも99.1%の相同性が示された。この結果より、PSD-2株は種までの同定には至らず、Xanthomonas sp. PSD-2株と命名した。PSD-6株はSphingobacterium-Like sp. およびSphingobacterium comitansとそれぞれ94.3%および94.2%と種レベルまで同定できたとはいいにくい相同性が示された。この結果より、PSD-6株は未同定株とてSphingobacterium-Like sp PSD-6株と命名した。

［実施例９］抗生物質耐性およびSMO活性観察例
3種類の抗生物質に対する耐性を調べた結果とスチレンモノオキシゲナーゼ(SMO)活性の有無を調べた結果を表2に示す。スチレン酸化細菌とポリスチレン耐性菌はSTR-Y-O株以外はカナマイシン耐性があり、スチレン酸化細菌はすべてアンピシリン耐性であり、またポリスチレン酸化細菌はPSD-2株を除いてテトラサイクリン耐性であることが特徴である。これまで遺伝子まで特定されている3株（非特許文献1,2,3）のいずれもPseudomonas属のスチレン分解菌はすべてSMOをコードするstyAおよびstyB遺伝子を含むstyオペロン有することが明らかになっている。これら3株のstyA遺伝子間の相同性は92%ありPCRによりクローン化がなされている（非特許文献1）。単離したポリスチレン耐性菌においてもすべての株にSMO活性が示された（表2）。既存のstyA遺伝子に対するPCRプライマーを合成して、単離した7株のスチレンおよびポリスチレン分解菌からのトータルDNAを鋳型としてPCRを行い、styA遺伝子の所在の確認を試みた。その結果、データは示してないがstyA遺伝子と相同性のあるクローンは得られなかった。

［実施例１０］ポリスチレンおよびスチレン分解能実験結果例
ポリスチレン耐性菌3株とスチレン分解が明らかになったSTR-Y-O株を用いて、ポリスチレン分解能実験を試みた。その結果、4株すべてがポリスチレン分解を示し、PSD-1株、PSD-2株、PSD-6株およびSTR-Y-O株は培養8日目でそれぞれ47%、24%、43%および56% (34μg)の分解を示した(図1)。発砲スチロールはポリスチレンピーズに空気を吹き込んで50倍の体積に膨らませて作製される。STR-Y-O株はスチレン分解能を有すると伴に単離した細菌の中で最も高いポリスチレン分解能を有していた。また、2株のスチレン酸化細菌を用いてスチレン分解能実験を試みた結果を図2に示す。SD-10株は培養8日目で初期濃度の50% (9μg)の分解を示し、STR-Y-O株は初期濃度の40 % (7.2μg)の分解を示した。

これまで、ポリスチレンを分解する細菌の報告はなく、単離した細菌のポリスチレン分解メカニズム解明が今後の課題である。しかしながら、ポリスチレン分解菌すべてにSMO活性が認められたことから、既存のstyオペロン（非特許文献1）と同様にスチレンを酸化させてスチレンオキシドを生成し、その後フェニルアセトアルデヒドを経由してフェニルアセチル-CoAに至る分解経路を有する可能性がある。一方前述の実験ではDNA相同性に基づくPCRによって、styAをクローン化ができなかった事実もあり、新規のSMOの可能性やポリスチレンの側鎖に反応して低分低分子化するメカニズムが不明であることなどからstyオペロン全体の構造解析を行って、既存のデータと比較して見る必要がある。

これまで知られているスチレン分解菌はPseudomonas属とXanthobacter属などであったが、新たにBacillus属の微生物を同定することができた。また、ポリスチレンを分解するArthrobacter woluwensis, Xanthomonas属、Sphingobacterium属に近縁の細菌などを分類することができたことから、ポリスチレン分解細菌の多様性が示された。同時に自動車タイヤの磨耗による、スチレンやポリスチレンが多く含まれると考えられる道路沿いの土壌は、多種の分解細菌生息場所の一つであることを示すことができた。

［実施例１１］リモネンおよびジクロロメタンで減容したEPSの微生物分解
(1)分解微生物の培養
-85℃でグリセロール溶液に保存していたPSD-1株、PSD-2株、PSD-6株、STR-Y-O株をLB寒天培地(非特許文献6)に白金耳で画線し、30℃で一晩静置培養した。翌日、単一のシングルコロニーを爪楊枝でかき取り、10mlのLB液体培地に植え継ぎ、37℃で一晩振とう培養した。予め、100 ml容の共栓付三角フラスコを1株あたり4本ずつ用意し、このフラスコにM9液体培地(非特許文献6)を25 mlずつ加えておいた。培養液250μlを予め用意したM9液体培地に植え継ぎ、30℃で振とう培養した。増殖度を示す吸光度OD₆₀₀ nmが0.2に達したところで、0.3 mg/mlの発泡スチロール溶液(リモネンまたはジクロロメタンで減容したEPS)を200μl（60μg）添加し、30℃で振とう培養した。培養時間の0、2、5、8日目に、1本のフラスコ全量25mLを試料に以下のジクロロメタン抽出法によって、発泡スチロール溶解物を抽出した。この内の10μlを高速液体クロマトグラフ分析(LC)に用いて、発泡スチロール溶解物濃度を測定した。溶解物の定量はリテンションタイムが5.4分に検出される最も高いピークの溶解物を指標に行った。LC装置は島津のLC-10ADを用いた。カラムはShim-pack GPC-803(島津)を用いた。LC分析の条件は移動相をテトラヒドロフラン、流速を1 ml/min、カラム温度を35℃、検出波長254 nmで行った。コントロールはM9液体培地のみを用いた。

(2)EPS溶解物のジクロロメタン抽出法
50 ml容共栓付ガラス製遠心管に0.4gのNaClを加え、次ぎに培養液25mlを移し、ボルテックスミックスチャーを用いて良く混合した。ジクロロメタン3mlを加え、2分間ボルテックスミックスチャーを用いて良く混合した。その後、室温3,000rpm、5分間遠心を行った。ジクロロメタン層(下層)をパスツールピペット用いて取り、予め無水硫酸ナトリウム0.1gを加えた2ml容マイクロチューブに移した。ボルテックスミックスチャーでよく混合し、室温10分間放置した。フラッシュ遠心し、上清をふた付のガラス製バイアルビンに移し、HPLC分析まで4℃で保存した。

(3)実験結果および考察
リモネンで減容した発泡スチロールのPSD-1株、PSD-2、PSD-6株、STR-Y-O株による分解実験を試みた。この結果を図３に示す。このように、STR-Y-O株を用いた場合は8日目までに、約67%（40μg）の分解が示された。データは示してないが、他の株による分解は認められなかった。

一方で、ジクロロメタンで減容した発泡スチロールの分解結果はすべての株で発泡スチロール溶解物の分解が示された。特にPSD-6株とSTR-Y-O株の分解結果を図４に示す。STR-Y-O株は8日目までに初期濃度の約61%(37μg)の分解が示された。

リモネンで減容した際にSTR-Y-O株にのみ分解が認められ、他の株に分解が認められなかった理由の一つとして以下のことが推察された。まず、すべてのリモネン発泡スチロール溶解液を添加した微生物に増殖が認められた。しかし、添加したリモネンについて培養中に変化が認められた。リモネンは植物の精油成分として知られることもあり、培養液に添加すると浮遊し、界面（表面）一面を被うまでになっている様子が観察できる。STR-Y-O株では培養日数が進むにつれて、界面（表面）を浮遊していたリモネンが消失し、8日目までにはほとんど目で観察できないほどまでになった。この結果、リモネンは微生物の増殖は阻害しないが、発泡スチロール溶解物分解を阻害することを示唆している。また、STR-Y-O株はリモネンを分解して、発泡スチロール溶解物の分解も可能にしたことが推測された。STR-Y-O株のリモネン分解実験は試みてないが、もしリモネン分解を確認することができれば、リモネンで溶解したEPSの微生物分解処理に特に有用な微生物である。

さらに、今後、STR-Y-O株以外のポリスチレン分解微生物をEPSの微生物分解処理に用いる場合にはリモネンの分解阻害を解く方法を考慮する必要がある。

リモネン分解阻害を解く方法として、リモネン分解能力を持った微生物を同時に添加する方法が考えられる。

本発明で単離した微生物Arthrobacter woluwensis PSD-1株とXanthomonas sp. PSD-2株とSphingobacterium-Like sp PSD-6株およびBacillus thuringiensis STR-Y-O株を用いて、重合度3000のポリスチレン分解実験を行った結果を示す図である。本発明で単離した微生物Pseudomonas sp. SD-10株とBacillus thuringiensis STR-Y-O株を用いて、スチレンモノマー分解実験を行った結果を示す図である。リモネンで減容したEPSの分解経日変化を示す図である。ジクロロメタンで減容したEPSの分解経日変化を示す図である。

Claims

ポリスチレン分解能を有する微生物をスチレン系重合体と接触させる工程を含む、スチレン系重合体の分解方法であって、
前記ポリスチレン分解能を有する微生物が、受託番号FERM P-19584で示されるXanthomonas sp. PSD-2株、受託番号FERM P-19583で示されるSphingobacterium-Like sp. PSD-6株、受託番号FERM P-19582で示されるBacillus thuringiensis STR-Y-O 株のいずれかに属する微生物を含む、スチレン系重合体の分解方法。
受託番号FERM P-19584で示されるXanthomonas sp. PSD-2株、受託番号FERM P-19583で示されるSphingobacterium-Like sp. PSD-6株、受託番号FERM P-19582で示されるBacillus thuringiensis STR-Y-O 株のいずれかに属するポリスチレン分解能を有する微生物。
Bacillus属に属するスチレン分解能を有する微生物とスチレンを接触させる工程を含む、スチレンの分解方法であって、
前記スチレン分解能を有する微生物が受託番号FERM P-19582で示されるBacillus thuringiensis STR-Y-O株である、スチレンの分解方法。
Bacillus属に属するスチレン分解能を有する微生物であって、
受託番号FERM P-19582で示されるBacillus thuringiensis STR-Y-O株である、スチレン分解能を有する微生物。
請求項２または請求項４に記載の微生物を含む、ポリスチレンまたはスチレン分解に用いる微生物製剤。
スチレン系重合体を減容剤によって溶かして得られた溶解物をポリスチレン分解能を有する微生物と接触させる、スチレン系重合体の分解方法であって、
前記ポリスチレン分解能を有する微生物が、受託番号FERM P-19582で示されるBacillus thuringiensis STR-Y-O株である、スチレン系重合体の分解方法。
スチレン系重合体を減容剤によって溶かして得られた溶解物と、ポリスチレン分解能を有する微生物の培養液を混合し、スチレン系重合物を分解する方法であって、
前記微生物が、前記溶解物と前記培養液を混合した際に、表面に浮遊する前記減容剤の浮遊状態を解除する能力を有する、受託番号FERM P-19584で示されるXanthomonas sp. PSD-2株、受託番号FERM P-19583で示されるSphingobacterium-Like sp. PSD-6株、受託番号FERM P-19582で示されるBacillus thuringiensis STR-Y-O 株のいずれかに属する微生物である、スチレン系重合体の分解方法。
前記減容剤はリモネンである、請求項７に記載のスチレン系重合体の分解方法。
前記減容剤は、有機溶媒である、請求項６に記載のスチレン系重合体の分解方法。
前記有機溶媒はジクロロメタンである、請求項９に記載のスチレン系重合体の分解方法。
請求項６〜１０のいずれか１つに記載のスチレン系重合体の分解方法に使用されるポリスチレン分解能を有する微生物。
請求項１１に記載の微生物を含む、微生物製剤。