JP4405264B2 - 穀粒の品質的特性が改良されたトーモロコシ植物 - Google Patents

Description

本出願は、2001年12月28日に出願された米国特許仮出願一連番号60/345,965号の優先権を有する。この開示全体は引用によりとくに本明細書に導入される。

本発明は一般的に、トーモロコシの品種改良の分野に関する。とくに、本発明はREN100と命名されたトーモロコシaccessionの使用方法に関する。

野外における穀類の品質改良における最終目的は、単一変種／雑種における様々な望ましい性質を組み合わせることである。このような望ましい特性には、高収率、良好な茎梗、良好な根、殺虫剤、除草剤、有害生物殺滅剤および疾病に対する抵抗性、熱および乾燥に対する耐性、穀類の成熟時間の短縮、農業経営学的に良好な品質、高い栄養値、発芽時期、標準の確立、成長速度、成熟および果実の大きさにおける均一性が包含される。

品質改良技術には植物の受粉方法が利用される。受粉には2つの一般的な方法がある。一つは、一つの花からの花粉を同じ植物の同じ花または他の花に輸送する植物自家受粉である。花粉が異なる植物上の花に由来する場合は、植物の交配受粉である。トーモロコシ植物（Zea mays L.）は、自家受粉および交配受粉の両者により品質改良することができる。両タイプの受粉にはトーモロコシ植物の花が関与する。トーモロコシは同一植物上に分離された雄花および雌花を有し、それぞれ房および穂上に存在する。トーモロコシでは、房から、穂の若枝の頂部に突出する若芽に、花粉が風で吹かれてきたときに自然受粉が起こる。

自家受粉され、多くの世代にわたりタイプが選択された植物は、ほぼすべての遺伝子座でホモ接合体となり、真の品質改良子孫の均一な集団、すなわち、ホモ接合植物を生じる。このようなホモ接合植物2種の間の交配は多くの遺伝子座においてホモ接合である雑種植物の均一な集団を生じる。逆に、多くの遺伝子座におけるそれぞれ2種のヘテロ接合植物の交配では、遺伝学的に異なり、均一ではない雑種植物の集団を生じる。得られる非均一性は予測できない挙動を招来する。

均一なトーモロコシ植物の雑種の発生にはホモ接合同系植物の発生、これらの同系植物の交配および交配の評価が要求される。系統繁殖および反復選択は品種改良集団から同系の植物を発生させるために用いられる品種改良方法の例である。それらの品種改良法では、2種またはそれ以上の同系植物または他の広範な起源に基づく遺伝的背景を繁殖プールに組み合わせ、これらから自家受粉および所望の表現型の選択によって新しい同系植物を開発する。新しい同系植物を他の同系植物と交配させ、これらの交配からの雑種を評価して商業的価値の可能性を決定する。

系統繁殖方法には2種のゲノタイプの交配が含まれる。それぞれのゲノタイプは1または2以上の他にない所望の特徴を有するか、またはそれぞれのゲノタイプは他方により相補することができる。2つの元の親ゲノタイプが所望の特徴すべてを提供しない場合は、他のゲノタイプを繁殖集団に包含させることができる。これらの交配の産物である上方植物は自家受粉および選択により継代する。それぞれの継代世代は自家受粉および選択の結果さらに相同になる。この品質改良法は通常5またはそれ以上の世代の自家受粉および選択を包含する：S₁→S₂；S₂→S₃；S₃→S₄；S₄→S₅等。少なくとも5世代の継代後に、同系植物は遺伝的純粋とみなされる。

同系植物の改良にはまた、戻し交配を用いることもできる。戻し交配では特定の望ましい特性が、1つの同系または非同系起源からその特性を欠く同系に移送される。これは、たとえば最初に上方同系植物（A）（反復親植物）をドナー同系（非反復親植物）と交配することにより達成できる。これは、たとえば、問題の特性のための適当な遺伝子座（または複数）を有する。この交配の子孫をついで上方の反復親植物（A）と戻し交配し、ついで得られる子孫について、非反復親植物から移送される所望の特性を選択する。5またはそれ以上の世代の戻し交配および所望特性についての選択後に得られる子孫は移送される特徴をコントロールする遺伝子座についてヘテロ接合体であるが、他の遺伝子座の大部分、またはほぼすべては上方親植物と同様である。最後の戻し交配世代が自家受粉されると、移送される特性について純粋な子孫が育成される。

単一交配雑種のトーモロコシ品種は互いに他のゲノタイプを補足するゲノタイプを有する2つの同系植物の交配によるものである。最初の世代の雑種子孫はF₁と命名される。通常、F₁雑種は同系のそれらの親植物よりも生命力が旺盛である。この雑種の生命力の旺盛さもしくはヘテローシスは多くの多遺伝子性の特性として表現され、これらには著しく改善された収率、良好な茎梗、良好な根、良好な均一性、および良好な昆虫および疾病抵抗性が包含される。雑種の発生では通常F₁雑種植物のみが求められる。F₁単一交配雑種は2種の同系植物を交配する場合に生じる。二重交配雑種は4種の同系植物を対で交配させ（A×BおよびC×D）、ついで2つのF₁雑種を再び交配させて（A×B）（C×D）産生させる。

雑種トーモロコシ品種の発生は通常、次の3工程で行われる。すなわち（1）様々な生殖細胞のプールからの植物の選択、（2）選択された植物の数世代にわたる自家受粉と選択による一連の同系植物の産生（互いに他と相違するがそれぞれ真に繁殖し、高度に均一である）および（3）選択された同系植物の、無関係な同系植物との交配による雑種子孫（F₁）の産生である。トーモロコシの品質改良過程では植物の生命力は低下する。2種の無関係な同系植物を交配して雑種子孫（F₁）を産生する場合には、生命力は保存される。同系植物の重要な結果であるホモ接合性および均質性は、2種の同系植物間の雑種であり、常に同一である。上方雑種を与える同系が同定されると、同系の親の均質性が維持されている限り、雑種の種子は無限に再生することができる。逆に、次の世代（F₂）ではF₁雑種により示される多くの雑種生命力は失われる。したがって雑種変種からの種子は育種のための株としては使用されない。一般にF₁雑種の種子を保存するのは栽培者に有利ではない。むしろ、育種のため、栽培者は毎年F₁雑種の種子を購入する。

北米の農業経営者は現時点で1,000エーカーのトーモロコシを栽培し、大規模な国内および国外向けトーモロコシの品種改良計画がある。これらの品種改良計画における絶えざる目的は、安定な雑種植物に基づく、1または2以上の望ましい特徴を有するトーモロコシ雑種の開発である。この目的を達成するため、品種改良者は上方雑種親植物の選択および開発を続けなければならない。

一態様においては、本発明は、少なくとも第一の改良された品質の穀粒特性を有するトーモロコシ植物の製造方法であり、これは（a）トーモロコシaccession REN001のトーモロコシ植物の、第二のトーモロコシ植物もしくはそれ自身との交配および（b）上記交配によって得られ、少なくとも1つの品質で改良された品質の穀粒特性を有するトーモロコシ植物の子孫を選択する工程からなる。本発明のある実施態様では、交配に使用される植物の一方は交配前に雄性不稔化に付され、これには雄性不稔を付与する核もしくは細胞質遺伝子を包含させてもよい。交配は任意の方法により、手作業での受粉または自然の受粉が起こるように行われる。

本発明の一実施態様においては、本発明の方法により製造されるトーモロコシ植物は、種子乾燥物の約6％以上の油脂含量、種子乾燥乾燥物の約10％以上の蛋白質含量、改良された油脂品質、向上した油脂の酸化安定性、油脂中の多価不飽和脂肪酸量の低下、油脂総脂肪酸の約35％以上のオレイン酸含量、種子乾燥物の約0.32％以上のリジン含量、および種子乾燥物の約0.08％以上のトリプトファン含量からなる群より選択される品質が改良された穀粒特性からなる。また、トーモロコシ植物は油脂総脂肪酸の約28％以上、約30％以上、約32%以上および約35％以上のオレイン酸含量；種子乾燥物の約0.25%以上、約0.28％以上、約0.30％以上または約0.32％以上のリジン含量；ならびに種子乾燥物の約0.05%以上、約0.06％以上、約0.07％以上または約0.08％以上のトリプトファン含量からなる群より選択される1または2以上の特性を有していてもよい。

本発明の更なる実施態様では、第二のトーモロコシ植物は同系または合成雑種植物を含む雑種であり、遺伝的に不均一であってもよい。トーモロコシaccession REN 001トーモロコシ植物を第二のトーモロコシ植物またはそれ自身と交配して産生させたトーモロコシ植物は、花粉ドナーとして、第二のトーモロコシ植物は花粉レセプターとして使用してもよく、また花粉レセプターとしておよび第二のトーモロコシ植物を花粉ドナーとして使用してもよい。

本発明の方法においては、交配は（a）トーモロコシaccession REN001の種子集団を取得し、（b）その集団における種子に比べて大きな胚を有する種子を選択し、（c）その種子を育種してトーモロコシaccession REN001のトーモロコシ植物を産生させることからなる。ここで用いられる「大きい」の語はその胚が集団内の平均の胚サイズよりも大きいか、または集団における種子より約20％、約40％、約60％、約80％、約90％および約95％大きいことを意味する。

本発明の方法はさらに、（c）トーモロコシ植物の子孫をそれ自身または第三の植物と交配し次の世代の子孫植物を産生させる工程；なおさらに（d）次の世代の子孫植物をそれ自身または第二の植物と交配する工程からなり；（e）工程（c）および（d）をさらに3〜10世代反復してトーモロコシaccession REN001に由来する同系トーモロコシ植物を産生させる工程からなる。この方法では次世代の植物子孫の交配を少なくとも最初に品質を上昇させた穀粒の特性の存在に基づいて選択し、さらに少なくとも最初に品質を向上させた穀粒の特性の存在に基づく一部またはすべての世代について選択する。向上させた穀粒の特性は、本発明の一実施態様では種子乾燥物の約6％以上の油脂含量、種子乾燥物の約10％以上の蛋白質含量、向上した油脂酸化安定性、油脂中の多価不飽和脂肪酸量の低下、油脂総脂肪酸の約35％以上のオレイン酸含量、種子乾燥物の約0.32％以上のリジン含量、および種子乾燥物の約0.08％以上のトリプトファン含量からなる群より選択される。

他の態様においては、本発明は少なくとも2種の以下のトーモロコシaccession REN001の特性すなわち種子乾燥物の約6％以上の油脂含量、種子乾燥物約10％以上の蛋白質含量、改良された油脂品質、向上した油脂の酸化安定性、油脂中の多価不飽和脂肪酸量の低下、油脂総脂肪酸の約35％以上のオレイン酸含量、種子乾燥物の約0.32％以上のリジン含量、および種子乾燥物の約0.08％以上のトリプトファン含量からなる本発明の方法により製造される。本発明の更なる実施態様においては、トーモロコシ植物は、トーモロコシ植物REN001の上述の全特性より少ない特性からなり、本発明のある種の実施態様においては、それは約、約3、約4、約5、約6、約7、約8または約9種のみの前記REN001の特性からなる。

なおさらに他の態様においては、本発明は、トーモロコシaccession REN001の種子またはトーモロコシaccession REN001のトーモロコシ植物を第二のトーモロコシ植物もしくはそれ自身と交配させて産生させたトーモロコシ植物からなる組成物を提供する。種子組成物はまたこのような種子を農業経営学的に優れた雑種トーモロコシ品種とランダムに混合し、この場合、雑種トーモロコシ品種は遺伝的に雄性不稔であり、トーモロコシaccession REN001は約1未満〜約3の比で存在させる。本発明の更なるある実施態様においては、accession REN001のトーモロコシ種子の集団が提供される。種子組成物は実質的に他の種子を包含せず、たとえば少なくとも約70％、80％、90％、95％、98％、99％または100％のREN種子からなると定義することができる。本発明の他の実施態様においては実質的にREN001種子からなるREN001種子の集団が提供される。本発明の一実施態様においては、REN001種子のコレクションにおける大きな胚のサイズに基づいて、このような集団は他の種子集団から識別できる。

なおさらに他の態様においては、本発明はトーモロコシ穀粒の製造方法において、（a）受粉可能な近位置で、第一および第二のトーモロコシ植物の種子を栽培し、この場合、第一の植物は農業経営学的に優れた品種であって、第二の植物はaccession REN001のトーモロコシ植物またはトーモロコシaccession REN001のトーモロコシ植物を第二のトーモロコシ植物もしくはそれ自身と交配して産生させ、（b）第一および第二の植物を成熟させ、（c）第二の植物からの花粉により第一の植物を受粉させ、（d）少なくとも第一の植物上に形成される穀粒を収集することからなる穀粒の製造方法を提供する。育成は第一および第二のトーモロコシ植物の種子からなる種子集団の育成であってもよい。収集は第一のトーモロコシ植物および第二のトーモロコシ植物上に形成される穀粒の収穫からなる。本発明の特定の実施態様においては、第一のトーモロコシ植物は遺伝的に雄性不稔である。

本発明のなおさらに他の態様においては、本発明で使用される植物または本発明の方法で製造される植物は、雄性不稔を付与できる細胞質もしくは核因子を有するか、または自家受粉を防止できる他の方法、たとえば自己不適合性からなる。細胞質により承継される特性は特定の交配の場合、雌性の親によって子孫に受け継がれる。細胞質によって承継される特性の例は雄性不稔特性である。細胞質性雄性不稔（CMS）は細胞質および核における遺伝子間の相互反応によって決定される花粉不妊現象である。ミトコンドリアゲノムの変化と核における復元遺伝子（単数または複数）の欠損が花粉不妊を招くことになる。正常な細胞質または核における復元遺伝子の存在のいずれかにより、植物は花粉を正常に産生する。CNS植物は同じ品種の維持変種による受粉が可能であり、細胞質が正常であれば核に復元遺伝子（単数または複数）を欠いても、次の世代に雄性不稔が継続される。CMS植物は同じ品種の維持変種によって受粉される。これは正常な細胞質を有するが、核に復元遺伝子を欠き、次の世代は雄性不稔であり続ける。CMS植物の雄性不稔は同じ品種の復元遺伝子によって回復され、これは核に復元遺伝子をもたねばならない。核における復元遺伝子により、雄性不稔植物の子孫は正常な花粉穀粒を産生し、繁殖することができる。細胞質により承継される特性は自然に起こるトーモロコシの特性または遺伝子トランスフォーメーション技術により導入される特性である。

（発明の詳細な説明）
I．植物特性の定義
不妊植物：不妊性の植物、すなわち穀粒を有する穂を欠くかまたはわずかな不規則な穀粒のみの穂を有する。
Cg：Collectotrichum graminicola評点。評点×10は全植物の感染率にほぼ等しい。

CLN：トーモロコシの致死的壊死（Maize Chlorotic MottleおよびMaize Dwarf Mosaicウイルス）評点：評点数は重症度スケール（1＝最も抵抗性〜9＝易感染性）に基づく。
Cn：Corynebacterium nebraskense評点。評点×10は全植物の感染率にほぼ等しい。
Cz：Cercospora zeae−mayis評点。評点×10は全植物の感染率にほぼ等しい。

Dgg：Diatraea grandiosellaガードリング評点（値はガードルされた植物対落下した茎の百分率）。
落下した穂：植物から地面に落下した穂。
Dsp：Diavrotica種根の評点（1＝わずかな影響〜9＝重度の剪定）。

穂の姿勢：収穫時における穂の姿勢もしくは位置。直立、水平または懸垂として評価。
穂軸の色：穂軸の色を白、ピンク、赤または褐色として評価。
穂軸の直径：中点で測定した穂軸の平均直径。
穂軸の強度：破損に対する穂軸の機械的強度。強いまたは弱いで評価。
穂の直径：中点における穂の平均直径。
乾燥した穂の皮の色：収穫時の皮の色を黄赤、赤または紫色として評価。
穂の新鮮な皮の色：受粉から1〜2週後に穂の皮の色を緑、赤または紫色として評価。
穂の皮の包葉：皮の葉の平均長を短い、中程度または長いと評価。
穂の皮の被覆：穂の尖端から皮の先端までの平均距離。最低値０より大。
穂の皮の開口：収穫時における皮の強固さ。強固、中間、開口として評価。
穂の長さ：穂の平均長。
茎あたりの穂の数：植物あたりの穂の平均数。
穂の節間収縮：縮んだ穂上の節の平均数。
収縮した穂の平均長：収縮した穂の平均の長さ。
穂と殻の百分率：殻を剥いた穀粒の平均重量を、殻を剥いた穀粒重量と1個の穂軸重量の和で除した値。
穂の若芽の色：若芽の発生後2〜3日に観察される若芽の色を緑黄色、黄色、ピンク、赤または紫として評価。
穂−テイパー（形状）：テイパーまたは穂の形状を円錐状、半円錐状または円筒状として評価。
穂の重量：穂の平均重量。
早期の直立：地面から出現した植物の百分率を春の早期に測定。
ER：腐朽した穂の評点（腐朽した穂の凡その百分率）。

最終的な直立数：収穫直前の植物数。

GDU：成長度単位はここではBarger法によって測定され、24時間の熱単位をGDU [（最高1日温度＋最低1日温度）／2]−50として計算される。使用される最高1日温度は86°F、使用される最低１日温度は50°Fである。
落下に対するGDU：同系または雑種において、栽培時から測定して50％の植物で花粉が落下するまでに要する成長度単位数（GDU）または熱単位数。落下に対するGDUは栽培日から50％の花粉が落下する日までの個々の1日GDU値を合計して決定する。
若芽に対するGDU：同系または雑種が、栽培時から測定して50％の植物で若芽が発生するまでに要する成長度単位数。若芽に対するGDUは栽培日から50％の若芽の発生までの個々の1日GDU値を合計して決定する。

Hc2：Helminthosporium carbonum種2評点。評点×10は全植物の感染率にほぼ等しい。
Hc2：Helminthosporium carbonum種2評点。評点×10は全植物の感染率にほぼ等しい。
Hm：Helminthosporium maydis種0評点。評点×10は全植物の感染率にほぼ等しい。
Ht1：Helminthosporium turcium種1評点。評点×10は全植物の感染率にほぼ等しい。
Ht2：Helminthosporium turcium種2評点。評点×10は全植物の感染率にほぼ等しい。
HtG：萎黄病−病型抵抗性。＋＝Ht萎黄病−病型抵抗性の存在を指示。−＝Ht萎黄病−病型抵抗性の不存在を指示。±＝Ht萎黄病−病型抵抗性の分離を指示。評点×10は全植物の感染率にほぼ等しい。

穀粒−糊粉の色：糊粉の色は白色、ピンク色、黄褐色、褐色、青銅色、赤色、紫色、淡紫色、無色または斑入りとして評価される。
穀粒−カップの色：乾燥段階に観察される穀粒−カップの色は白色、レモン黄色、黄色または橙色として評価される。
穀粒−胚乳の色：胚乳の色は白色、淡黄色または黄色として評価される。
穀粒−胚乳の型：−胚乳の型は正常、蝋状または不透明として評価した。
穀粒の等級：丸状として分類される百分率。
穀粒の長さ：穀粒のキャップから小花梗までの平均距離。
一列あたりの穀粒数：単一列中の穀粒の平均数。
穀粒−果皮の色：果皮の色は無色、赤−白クラウン、黄褐色、青銅色、淡赤色、桃赤色または斑入りとして評価される。
穀粒−列の方向：穂上の穀粒列の方向は直線状、わずかに曲線上、螺旋状または明確でない（散在する）として評価した。
穀粒列の数：単一の穂における穀粒列の平均数。
穀粒列の横側の色：乾燥段階で観察される穀粒列の横側の色を白色、淡黄色、黄色、橙色、赤色または褐色として評価した。
穀粒の厚さ：穀粒の狭い側を横切る距離。
穀粒の型：穀粒の型を窪みがある、粒が硬い、中間として評価した。
穀粒の重量：予め数えた穀粒の平均重量。
穀粒の幅：穀粒の平たい側を横切る距離。
Kz：Kabatiella zeae評点：評点×10は全植物の感染率にほぼ等しい。

葉の角度：上葉の茎に対する角度を直立（0〜30度）、中間（30〜60度）または散開（60〜90度）として評価する。
葉の色：受粉後1〜2週の葉の色を明緑色、中間の緑色、暗緑色またはきわめて暗緑色として評価する。
葉の長さ：初生葉の平均長。
葉の縦皺：受粉後1〜2週の葉表面における縦皺の数の評点。皺はなし、わずかまたは多いとして評価する。
葉の縁の波：受粉1〜2週後における葉の縁の波状評点。なし、わずかまたは多いとして評価する。
葉の数：成熟植物の葉の平均数。子葉から始めてフラッグ葉まで続ける。
葉の鞘のアントシアニン：受粉1〜2週後、葉の鞘におけるアントシアニンのレベルの評点を、なし、基底小体に弱い、基底小体に強い、弱いまたは強いとして評価する。
葉の鞘における軟毛：葉の鞘における軟毛の評価。受粉後1〜2週に評点をつけ、軽度、中等度または重度に評価する。
葉の幅：初子葉の平均幅をその最も広い点で測定。
LSS：後期季節における直立能（値×10は疾病評価プロット中で倒れた植物の百分率にほぼ相当する）。

湿度：収穫時における穀粒の湿度。
On1：Ostrinia nubilalis第一品種の評点（1＝抵抗性〜9＝易感染性）。
On2：Ostrinia nubilalis第二品種の評点（1＝抵抗性〜9＝易感染性）。
相対成熟度：回帰分析に基づく成熟度の評価。回帰分析はチェック雑種およびそれらの以前に確立された1日評点対実際の収穫時湿度を用いることにより展開する。問題の雑種における収穫時湿度を測定し、湿度値を回帰式に挿入すると、相対成熟度が得られる。
根の倒立：根の倒立は根が倒れた植物の百分率である。垂直軸から30度以上もたれた植物部分があれば根の倒立として計数する。

実生の色：葉6〜8枚の段階における葉の色。
実生の高さ：葉6〜8枚の段階における植物の高さ。
実生の成長力：肉眼で評価した活力ある成長度を、1を最善とし1〜9のスケールで評価。スコアは平均第5葉段階試験に組み入れた場合に採点する。
選択係数：選択係数は多くの特性からの情報に基づく雑種価値の単一な測定値を与える。ほとんど常に包含される特性の一つは収率である。特性はそれらに割り振られた重要性のレベルに応じて重みを加える。
Sr：Spcelotheca reiliana評点は実際の感染百分率である。
茎−アントシアニン：茎におけるアントシアニン色素量の評点。茎は受粉1〜2週後になし、基底小体に弱い、基底小体に強い、弱いまたは強いとして評価する。
茎−支柱根の色：受粉1〜2後に観察される支柱根の色を緑色、赤色または紫色として評価する。
茎の直径：茎の最も下部に観察される節間の平均直径。
茎−穂の高さ：茎の頂部に発生した穂が軸から腐って落下した付着点までの地面からの測定される穂の平均の高さ。
茎−節間部の方向：受粉後に観察される茎節間部の方向は直線またはジグザグとして評価される。
茎−節間部の長さ：初生葉上における節間部の平均長。
茎の倒立：茎がもたれた植物の百分率。植物が穂上にまたは穂の倒れた場合、倒れた茎として計数する。
支柱根を有する茎−節部：植物あたりの支柱根を有する節部の平均数。
茎−植物高：土壌から房の頂部までの測定した平均高。
茎−若木：若木を有する植物の百分率。若木は花粉をこぼすことができる房として発生した二次発芽として定義される。
ステイグリーン：ステイグリーンは黒色層形成時間に近い植物の一般的健康の目安である。それは通常、試験内の大部分の実体について穂の包皮が成熟色に変わった時点で記録される。1を最善として1〜9のベースで採点される。
STR：茎の腐敗の評点（値は重症度を表す。1＝接種した節間の25％が腐敗から9＝茎全体の腐敗による崩壊）。
SVC：Southeastウイルス複合体（Maize Chlorotic DwarfウイルスとMaize Dwarf Mosaicウイルス）評点；評点は重症度に基づき1最高の抵抗性〜9易感染性で評価する（1988反応は大部分Maize Mosaicウイルスの反応）。

房−葯の色：50％の花粉が落ちた時点での葯の色を緑黄色、黄色、ピンク色、赤色または紫色として評価する。
房の状態：受粉後の房の状態を開口またはまたはまとまっているとして評価。
房の分枝角：主たる茎に対する房の分枝の平均角を直立（30度未満）、中間（30〜45度）または散開（45度より大）と評価する。
房−分枝の数：一次的な房の平均分枝数。
房−頴バンド：頴の基部における閉じたアントシアニンバンドをありまたはなしで評価する。
房−頴の色：50％落下した時点で、頴の色を緑色、赤色または紫色に評価する。
房−花柄の長さ：フラッグ葉の基部から底部房分枝の基部までの房−花柄の平均距離の測定値。
房−落下する花粉：房をタッピングし、実体あたり約5つの垂れた花粉を観察して測定し、落下した花粉を肉眼により評価する。
房−穂状花序の長さ：房分枝の頂部基部から房のチップまでの穂状花序の長さ。
試験重量：湿度15.5％に調整した、与えられた容量（ブッセル）のポンドでの重量。

収率：湿度15.5％に調整した収穫時における穀粒の収率。

II．他の定義
対立遺伝子：1または2以上の互いに異なる型の遺伝子座であり、その対立遺伝子は1つの特性または特徴に関連する。二倍体細胞または生物においては、与えられた遺伝子の2つの対立遺伝子が1対のホモ接合染色体上の相当する遺伝子座を占める。

戻し交配：一つの親たとえば第一の世代の雑種（F₁）を一つの親のゲノタイプF₁雑種に戻す雑種子孫の交配を反復する品種改良方法。

クロマトグラフィー：溶解した物質の混合物を固体支持体に結合させ、ついで、固体支持体および液体の様々な組成物を液体カラムに通過させる。混合物の成分を選択的溶出によって分離する。
交配：トーモロコシ植物の雌花を、同じ植物または同種もしくは異種ゲノタイプの他の植物からの花粉で受粉させると、花から種子が生成する。
交配受粉：異なる植物からの2つの配偶子の結合による受粉。

二倍体：2セットの染色体を有する細胞または生物体。

電気泳動：液体またはゲルマトリックス中の懸濁粒子を電場の作用下に移動させ、それらの電荷および分子量に応じて分離する方法。この分離方法は本技術分野の熟練者には周知であり、通常、様々な型の酵素および制限エンドヌクレアーゼによって生成するDNAフラグメントの分離に適用される。
去勢：植物の雄性性器官の除去、または雄性不稔を付与する化学物質もしくは細胞質あるいは核遺伝因子によるその器官の不活性化。
酵素：生物学的反応を触媒できる分子。

F₁雑種：2つの植物の交配による第一世代の子孫。

遺伝子の構成要素：一群のヌクレオチド配列であり、その配列の発現はトーモロコシ植物の表現型を決定するか、または細胞もしくは組織を含む植物の成分。
ゲノタイプ：細胞または生物体の遺伝的構成。

ハプロイド：二倍体中に2セットの染色体1セットを有する細胞または生物体。

アイソザイム：酵素の検知可能な変種であり、同一の反応（単数または複数）を触媒するが、たとえば一次構造および／または電気泳動移動性において互いに異なる変種。アイソザイム間の相違は単一遺伝子相互優性コントロールである。したがって、バンドパターンを生成させるための電気泳動分離ではDNAレベルにおける異なる対立遺伝子は同一視される。電荷を変えない構造的な差異はこの方法では検出することができない。
アイソザイム型プロフィル：電気泳動により分離されるアイソザイムのバンドパターンのプロフィルはDNAレベルにおける異なる対立遺伝子を同一視できる。

連結：同じ染色体上にある対立遺伝子が、それらの移動が独立していたならば偶然期待される以上にしばしば、一緒に分離されがちである現象。

マーカー：容易に検出可能な表現型、好ましくは環境的変動成分なく相互優性様式（二倍体ヘテロ接合体における遺伝子座の両対立遺伝子は容易に検出可能である）により受け継がれる。すなわち、遺伝率＝1である。
メタキセニア：花粉が寄与するゲノタイプにより、胚および種子の関連二倍体組織の表現型に発生する作用。

REN001：ATCC Accession No. PIA−3822を有する種子が得られるトーモロコシ植物accessionならびにそれらの種子から生育した植物。

表現型：細胞または生物体の検出可能な特徴であり、その特徴は遺伝子の発現により表出される。

定量的特性遺伝子座（QTL）：通常連続的に分布される数の上で代表的な特性で、少なくとも一部が寄与する遺伝子座。

再生：組織培養からの植物の発生。

SSRプロフィル：遺伝子マーカーとして使用され、隣接オリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCR（登録商標）に続くゲル電気泳動により評価した単一配列反復のプロフィル。
自家受粉:：同じ植物の葯から柱頭への花粉の移動。
単一遺伝子座が変換された（変換）植物：品種の望ましい形態学的および生理学的特徴の実質的にすべてが、戻し交配の技術を介して品種に移された単一遺伝子座により付与される特徴に加えて回復される、戻し交配と呼ばれる植物の品種改良技術によって植物が発生する。単一の遺伝子座は1個の遺伝子、またはトランスジェニック植物の場合、単一部位（遺伝子座）における宿主ゲノムにインテグレートされた1または2以上の導入遺伝子からなる。
実質的に均等：修飾に際し、第一の数的価値に関して、たとえば定量的特性に関して使用される「実質的に均等」の語は、第一の数的価値と比較した場合、それらの各平均から統計的な有意差を示さない数的価値を包含して使用される。

組織培養体：同一もしくは異なるタイプの単離細胞または植物の部分に有機化されたこのような細胞の集団からなる組成物。
導入遺伝子：トーモロコシ植物の核または葉緑体ゲノムに、遺伝子のトランスフォーメーションにより導入された遺伝子配列。

キセニア：花粉が寄与するゲノタイプにより種子の胚乳の表現型に現れる作用。

III．トーモロコシaccession REN001
本発明の一態様によれば、REN001と命名されたトーモロコシ植物を使用する方法が、自家受粉またはaccession REN001トーモロコシ植物の異系統交配植物により産生される系統を含め提供される。本発明のある態様では、accession REN001との新しい植物品種の創製方法が提供される。たとえば、同系トーモロコシ植物は、トーモロコシ植物accession REN001の種子を播き、植物を自家受粉または異系交配し、得られたトーモロコシ植物を自家受粉または同系受粉し、農業技術の熟練者には周知の標準技術を用いる適当な単離により製造できる。種子はこのような植物から既知の標準操作を用いて収穫できる。

A．表現型の記述
本発明の他の態様によれば、トーモロコシ植物accession REN001の生理学的および形態学的特徴を有するトーモロコシ植物が提供される。トーモロコシ植物accession REN001の生理学的および形態学的特徴の説明は表1に示す。
表1：REN001の生理学的および形態学的特徴
表現型
成熟度：
日 熱単位
発生から若芽中植物50％まで 78 1471
発生から花粉中植物50％まで 77 1451
熱単位＝[最高温度（≦86°F）+最低温度（≧50°F）−50]／2
植物：
植物の高さ（房の頂部まで） 222.0 cm
穂の高さ（最上部の穂の基部まで）119.0 cm
若木の平均数：0
茎あたりの穂の平均数：1
支柱根のアントシアニン：なし

葉：
穂の節における葉の幅：9.0 cm
穂の節における葉の長さ：74.0 cm
最上部の穂より上の葉：5
葉の角度（開花時における穂の上部第二の葉から葉上部の茎まで）：28度
葉の色：中間の緑−Munsell Color Code 5GY 4/4
葉鞘の軟毛（1＝なしから9＝桃のような毛羽立ちで評価）：2
縁の波状態（1＝なしから9＝多いまでのスケールで評価）：8
縦皺：1＝なしから9＝多いまでのスケールで評価）：4

房
側部の分枝数：6
中央の穂状花序からの分枝の角度：15度
穂の長さ（葉のカラー頂部から房の頂部まで）38.0 cm
落下した花粉（0＝雄性不稔から9＝ひどい落下までのスケールで評価）：6
葯の色を緑黄色−Munsell Color Code 2.5GY 7/6
頴の色：緑−Munsell Color Code 5 GY 5/8
バー頴：なし

穂：（包葉のないデータ）
若芽の色（発生3日後）：明緑−Munsell Color Code 2.5 GY 8/6
新鮮な皮の色（25日後50％若芽）：明緑−Munsell Color Code 2.5 GY 7/6
乾燥した皮の色（65日後50％若芽）：淡黄色−Munsell Color Code 7.5 YR 7/4
皮の伸長：短い（穂露出）

穂（包葉のあるデータ）
穂の長さ：10.0 cm
中点における穂の直径：41.0 cm
穂の重量：45.0 gm
穀粒の列数：16
穀粒の列：明瞭
茎柄の長さ：12.0 cm
穂のテイパー：平均

穀粒：（乾燥）
穀粒の長さ：10.0 mm
穀粒の幅：7.0 mm
穀粒の厚さ：6.0 mm
糊粉の色パターン：ホモ接合

穂軸：
中点における軸穂の直径：3.0
これらは典型的な値である。この値は環境によって変動する。実質的に等しい他の値も本発明の範囲に包含される。

Accession REN001の穀粒について品質の分析を実施した。以下の表2〜5に示すように、分析では、REN001は比較品種に比べ、穀粒特性の品質に著しい上昇を示す。

Ｂ． 寄託情報
REN001と命名されたaccessionトーモロコシの種子2500の代表的寄託は、2002年1月10日にAmerican Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd, Manassas, VAに寄託された。これらの寄託された種子は、ATCC Accession No. PTA−3822に帰属された。寄託は微生物の寄託に関するBudapest協定の期間および条項に従って少なくとも30年の期間行われ、寄託サンプルの供給のための最も新しい要求後少なくとも5年もしくはその特許の有効期間のどちらか長い期間、寄託所により受け付けられ、その期間にそれが生命力を失った場合には置換される。

IV．トーモロコシ植物の産生方法およびこのような交配により産生されるトーモロコシ植物
この発明の一態様は穀粒特性の質が向上した新規なトーモロコシ植物を創成するための方法を提供する。たとえば、本発明の一態様においては、accession REN001のトーモロコシ植物をそれ自身または第二の植物と交配させ、ついで得られた植物を更なる品種改良に使用する。たとえば、植物をそれぞれ約2〜10世代にわたって自家受粉すると明らかに純粋に品種改良された雑種系列が提供される。各世代において、所望のように1または2種以上の選択を行う。このように本技術分野の熟練者に理解される標準的な品質改良技術を用いて、トーモロコシaccession REN001の特性のすべてがトーモロコシaccession REN001の交配または異系交配によって産生された種子集団から選択することができる。たとえばaccession REN001を第二の系列と自家受粉条件で交配して産生させた種子の集団を数世代にわたって生育させ、accession RE001の特性について選択すると、本質的にすべてのaccession REN001の特性は回復させることができる。

本発明により産生された新しい系列は従来の慣用の雑種変種に比較して品質的に著しく改良された穀粒特性を有する。さらにこれらの系列は、品質的に優れた穀粒特性をもつ植物に生育させることができる雑種種子の商業的製造のために交配への使用が可能である。このような穀粒の品質的特性には、たとえば、種子乾燥物の6％以上の油脂含量、種子乾燥物の10％以上の蛋白質含量、改良された油脂の品質、油脂の酸化的安定性の上昇、油脂中の多不飽和脂肪酸の低下、油脂における総脂肪酸の35％以上のオレイン酸含量、種子乾燥物の0.32％以上のリジン含量、および種子乾燥物の0.08％以上のトリプトファン含量が含まれる。

REN001と交配される第二の植物または新規な雑種系列を発生させる目的でそれらから誘導される系列の選択においては、通常それ自体1または2以上の選択された特徴、または雑種の組み合わせの場合、所望の特徴（複数）を示す植物を選択することが望ましい。望ましい可能性の高い特徴の例には穀粒特性の品質的向上、高い収率、良好な茎、良好な根、殺虫剤、除草剤、有害生物、および疾病に対する抵抗性、熱および乾燥に対する耐性、穀物の成熟までの時間の短縮、農業経営学的品質の向上、高い栄養価、ならびに発芽時間、標準の確立、成長速度、成熟度および果実なサイズにおける均一性がある。またトーモロコシaccession REN001植物またはそれらから誘導される品種は、商業的生産農場で栽培するため、農業経営者に販売される雑種種子の産生の目的で、第二の異種植物と交配してもよい。この場合第二の品種は最初の系列との雑種組み合わせにより、所望の特徴が付与されるように選択される。

トーモロコシ植物（Zea mays L.）は自然にまたは機械的方法のいずれかによって交配させることができる。自然の受粉は受け皿の穂の頂部から突出した若芽に、房から風が花粉を吹き付けたときトーモロコシに起こる。機械的受粉は、若芽上に吹き付ける花粉のタイプをコントロールするか、または手作業で受粉させることにより実施される。

一実施態様においては、交配は以下の工程で行われる。すなわち、
（a）第一および第二の親トーモロコシ植物の種子を、受粉可能な近位置で栽培し、
（b）第一および第二の親トーモロコシ植物の種子を栽培して花を持つ植物に成長させ、
（c）第一または第二の親トーモロコシ植物のいずれかを除雄、すなわち花粉の産生を防止するように処理するか、または雌性の親として不妊雄性植物を使用して除雄された親の植物を提供し、
（d）第一および第二の親トーモロコシ植物の間で自然交配受粉を起こさせ、
（e）除雄した親トーモロコシ植物上に産生する種子を収穫し、所望により、
（f）種子をトーモロコシ植物、好ましくは雑種トーモロコシ植物に生育させて収穫することからなる。

親植物は通常、受粉可能な近位置で植物を互いに交互の列、ブロックまたは他の慣用の栽培パターンで栽培する。親植物が性的成熟の時期で異なる場合には、成熟の遅い植物を最初に植えることが望ましく、この場合、雌性親上の若芽が雄性親からの花粉を利用できる時期であることが保証される。親両親植物を栽培し、花の時期まで成長させる。この成長段階においては、一般に植物を肥料および／または他の栽培者により適当と思われる農業用薬品によって処置するのが有利である。

開花の時期に、accession REN001またはそれから誘導される植物が雄性の親として採用される場合には、他の親植物の房は、雌性の親として採用されるすべての植物から自家受粉を避けるため除去される。房の除去は手作業で達成することができるが、所望により機械で行うこともできる。また、雌性親トーモロコシ植物が、雄性不稔を付与する細胞質または核遺伝子からなる場合には房の除去は必要ない。さらに、雌性植物の雄性花を不妊化するためには化学的な生殖体撲滅薬を用いることができる。この場合、雄性の親として用いられる親植物は、化学剤で処置せず、また化学剤の除雄作用に抵抗を生じる遺伝因子からなる。生殖体撲滅薬は発生、成熟または花粉の放出に関与する過程または細胞に影響する。このような生殖体撲滅薬で処理した植物は雄性不稔になるが、通常、雌性の繁殖能力は残っている。化学的な生殖体撲滅薬の使用はたとえばUS特許4,936,904に記載されている。この開示は、引用によってその全体が本明細書に導入される。

除雄に続き、植物はついで通常成長を続けさせ、自然の交配を起こさせると、トーモロコシを含めて草本の正常な受粉が風の作用の結果として起こる。雌性親植物の除雄の結果として雄性親植物からのすべての花粉が受粉に利用できる。房、およびその場合、花の部分をもつ花粉が以前に雑種形成雌植物として使用されるすべての植物から除去されたからである。この雑種形成の間にもちろん、親品種が他のトーモロコシ農場から単離され、異種起源からの偶発的な夾雑は最小限に抑制もしくは防止するように生育される。これらの単離技術は本技術分野における熟練者の技術範囲内で周知である。

両方の親トーモロコシ植物は成熟するまで、または開花完了後に雄性植物の列が破壊されるまで、生育を続ける。雌性親植物からの穂のみを収穫して新規なF₁雑種の種子を得る。産生されたこの新規なF₁雑種の種子をついで、次の生育季節に商業的農場に栽培するか、または新規な雑種系統を発生させる目的での品種改良を進める。

また、本発明の他の実施態様においては、第一および第二の親トーモロコシ植物の両者は同じトーモロコシ植物、すなわちaccession REN001と命名された植物もしくはそれから誘導される植物とすることができる。すなわち本発明の方法を用いて産生された任意のトーモロコシ植物およびaccession REN001またはそれから生育された植物は、本発明の部分を形成する。本明細書で使用される交配の語は自家受粉、異種交配、他のもしくは同一品種との交配、集団との交配等を意味する。故に、トーモロコシ植物REN001とそれから誘導される系列を用いて産生されたすべてのトーモロコシは本発明の範囲に包含される。

A．核の質が向上した穀粒のための受粉植物としてのREN001の利用
トーモロコシaccession REN001の一つの利点は、典型的な従来の変種に比較して、品質の著しく向上した穀粒特性を有することである。これらの特性は核を産生させるのための交配ついでそれから育成される品質の向上した特性を有する植物によって付与される。このような向上した特性には、たとえば上昇した油脂含量、上昇した蛋白質含量、油脂の品質の改良、油脂の酸化的安定性の上昇、油脂中の多不飽和脂肪酸の低下、オレイン酸含量の上昇、および蛋白質の改良された栄養価ならびに他の特性が含まれる。本発明の特定の実施態様においては、得られる植物は、種子乾燥物の6％以上の油脂含量、種子乾燥物の10％以上の蛋白質含量、油脂における総脂肪酸の35％以上のオレイン酸含量、種子乾燥物の0.32％以上のリジン含量、および種子乾燥物の0.08％以上のトリプトファン含量が包含される。本明細書で証明されるように、このような向上された品質特性は雑種の組み合わせによって付与される。

Accession REN001はまた、花粉の品質特性が受粉から得られる穀粒に影響するキセニアおよび／またはメタキセニアの作用による穀粒の品質特性向上に使用することができる。その作用を活用する一方法には、accession REN001のトーモロコシ種子を受粉可能な近位置において植物またはそれから誘導される植物、および農業経営学的に優れたトーモロコシ種子を農場で栽培する方法が包含される。これらの植物を共に成長させることによりaccession REN001の花粉は農業経営学的に優れた品種の雌性の花を受粉するのに利用可能になる。この受粉は受粉によって産生される穀粒に品質の向上した穀粒特性を付与するが、穀粒の収率はその逆に農業経営学的に優れた「雌性」の親を用いて正常に得られる値に近づくことになる。このような技術を使用して、トーモロコシaccession REN001はREN001を受粉植物として用いた場合には、品質の改良された穀粒特性を付与することが示された（表6および7）。

好ましくは、穀粒の産生に使用する農業経営学的に優れた植物は自家受粉を防止するために雄性不稔とする。これは、本明細書に記載したように遺伝的に、手作業で、または化学的に達成される。農業経営学的に優れた親はaccession REN001またはそれから誘導される品種と類似の成熟日を有し、花粉の利用性およびそれに対する個別性への一致を保証することが好ましい。得られた穀粒子を植物から収穫することができる。

Ｂ．REN001 誘導同系列の、穀粒特性品質が向上した植物による品質改良
本明細書に上述したようにトーモロコシaccession REN001は、穀粒特性品質が向上した新規な同系トーモロコシ変種の製造に使用することができる。REN 001から誘導され、HOI001と命名されたこのような代表的植物の品種改良歴を以下に掲げる。これから明らかなように、この植物は穀粒の品質が著しく改善された特性を示す。HOI001の品種改良歴は次の通りである。
1997年3月：種子はMaize Genetics Cooperative in Urbana ILから得られ、胚の大きな種子が選択された。
1997年夏：選択された種子はREN001と命名し、Rows 32861および32862に栽培した。選択を行い、植物の成長をバルクベースで進めると穂の表現型は既に部分的に品種改良を指示し、多分S3またはS4に均等であると思われた。
97冬−98：選択された植物をHawaii Nursery Rows 7556−7565で栽培した。すべての植物を自家受粉させ、評価のために試験交配した。選択された穂の栽培をバルクベースで進めた。増加した穂を選択し、Hawaii Row 33724で栽培した。
1998年夏：選択された植物をIowa Nursery Rows 66619および66620で成長させた。列あたり5つの穂を自家受粉し、評価のため試験交配した。穂は均一にみえた。
98冬−99：増加した植物をHawaii rows 34091−34140で栽培した。
1999年春：増加植物からの種子をHOI001と命名した。

HOI001の生理学的記録をとり、以下の表8に掲げる。

REN001誘導品種HOI001はまた、穀粒特性としての品質、とくに穀粒中の油脂含量についても評価した。また、HOI001は、同系としても、選択された同系と雑種の組み合わせの場合にも評価された。以下の表9〜14から明らかなように、同系HOI001は品質が向上した穀粒特性を有し、これらの特性は一つの同系親植物としてHOI001を有する雑種トーモロコシ植物に付与される。

HOI002と命名された品種もまた、本発明によりREN001を用いて産生された。トーモロコシ植物HOI002の生理学的および形態学的特徴を表15に示す。

表15. HOI002の生理学的および形態学的特性
成熟度：
日 熱単位
発生から若芽中植物50％まで 80 1524
発生から花粉中植物50％まで 79 1496
熱単位＝[最高温度（≦86°F）+最低温度（≧50°F）−50]／2
植物：
植物の高さ（房の頂部まで） 206.0 cm
穂の高さ（最上部の穂の基部まで）129.0 cm
若木の平均数：0
茎あたりの穂の平均数：1
支柱根のアントシアニン：なし

葉：
穂の節における葉の幅：9.0 cm
穂の節における葉の長さ：72.0 cm
最上部の穂より上の葉：5
葉の角度（開花時における穂の上部第二の葉から葉上部の茎まで）：27度
葉の色：中間の緑−Munsell Color Code 5GY 4/4
葉鞘の軟毛（1＝なしから9＝桃のような毛羽立ちで評価）：2
縁の波状態（1＝なしから9＝多いまでのスケールで評価）：4
縦皺：1＝なしから9＝多いまでのスケールで評価）：5

房
側部の分枝数：4
中央の穂状花序からの分枝の角度：15度
穂の長さ（葉のカラー頂部から房の頂部まで）39.0 cm
落下した花粉（0＝雄性不稔から9＝ひどい落下までのスケールで評価）：6
葯の色を緑黄色−Munsell Color Code 2.5GY 8/10
頴の色：緑−Munsell Color Code 5 GY 5/8
バー頴：なし

穂：（包葉のないデータ）
若芽の色（発生3日後）：明緑−Munsell Color Code 2.5 GY 8/6
新鮮な皮の色（25日後50％若芽）：明緑−Munsell Color Code 2.5 GY 7/8
乾燥した皮の色（65日後50％若芽）：淡黄色−Munsell Color Code 7.5 YR 7/4
皮の伸長：短い（穂の露出）

穂（包葉のあるデータ）
穂の長さ：12.0 cm
中点における穂の直径：42.0 cm
穂の重量：66.0 gm
穀粒の列数：18
穀粒の列：明瞭
茎柄の長さ：10.0 cm
穂のテイパー：平均

穀粒：（乾燥）
穀粒の長さ：10.0 mm
穀粒の幅：7.0 mm
穀粒の厚さ：4.0 mm
丸い穀粒（形状等級）：
糊粉の色パターン：ホモ接合

穂軸：
中点における軸穂の直径：3.1
＊これらは典型的な値である。この値は環境によって変動する。実質的に等しい他の値も本発明の範囲に包含される。

REN001誘導品種HOI002についても、穀粒および他の特性とくに穀粒の油脂含量を評価した。以下の表16〜18から明らかなように、雑種HOI002は親植物として、HOI002を有する雑種トーモロコシ植物に、穀粒特性が向上した品質を付与する。

Ｃ．雑種トーモロコシ植物および種子の製造
Accession REN001またはそれから誘導される品種を、他のトーモロコシ植物と交配させると、常に第一世代（F₁）の雑種植物が産生される。このようにF₁トーモロコシは、accession REN001もしくはそれから誘導される品種を任意の第二のトーモロコシ植物と交配させることによって産生される。F₁雑種を産生させる方法の目的は、トーモロコシの遺伝的補体を操作して新しいまたは改良された特性（特徴）を生じるように作用する遺伝子の新しい組み合わせを発生させることである。新しいF₁雑種の産生方法は通常1または2以上の雑種植物を産生させることに始まる。それらの植物は起源的に関連するトーモロコシ植物を反復交配し、ある種の遺伝子を雑種植物内に組み込むことを試みることにより産生される。

トーモロコシは二倍体相を有する。これは2つの遺伝子条件（対立遺伝子）が各遺伝子座（染色体上の位置）を占拠することを意味する。対立遺伝子が同一の遺伝子座にある場合にはホモ接合と呼ばれる。それらが異なる場合には、ヘテロ接合と呼ばれる。完全に同系植物である場合にはすべての遺伝子座はホモ接合である。同系繁殖には栽培者による洗練された操作が要求される。自然のトーモロコシで異系繁殖よりもむしろ同系繁殖が起こる全く見込みがない事象であっても、完全な同系繁殖の達成は、周知のホモ接合による有害作用により、自然には期待することができない。植物は多くの世代を単離されて栽培されなければならない。栽培者が同系植物を創成する理由は、配偶子移送が期待できる遺伝子の貯蔵部を得るためである。同系植物の発生には、一般に約5〜7世代の自家受粉が要求される。改良されたF₁雑種の発生を試み、同系植物をついで異種繁殖する。雑種植物を小規模な野外試験でスクリーニングして、評価する。通常、それらの商業的価値の可能性については、約10〜15種の表現型を選択し、測定する。

Accession REN001植物またはそれから誘導される変種を他の植物と交配させて雑種を産生させる場合、その植物は雌性または親植物のいずれかとして働く。多くの交配で、親植物の帰属された性とは無関係に、結果は同一である。しかしながら、種子収率の向上および生産特性のためには、一方の親植物として多くの場合、雌性植物が好ましい。一部の植物は穂の堅い包葉を生じ、たとえば腐敗による損失が大きい。若芽の形成が遅延し、親植物一対の再生サイクルのタイミングに有害な作用を招くことがある。種子の被覆の特徴が一方の植物では好ましい。花粉は一方の植物では良好に落ちる。他の変数も、特定の交配の好ましい性帰属によって影響される。本発明の場合には、雄性親植物としてREN001およびそれから誘導される系列の使用が好ましい。

IV．単一遺伝子座の変換
本発明に関連してトーモロコシ植物の語が使用される場合、これにはそのトーモロコシ植物の単一遺伝子座変換が包含される。本明細書で用いられる単一遺伝子座変換植物の語は、戻し交配と呼ばれる植物栽培技術によって発生させたトーモロコシ植物を意味する。この場合、戻し交配を介し、その品種への単一遺伝子座の移送に加えて本質的にすべての所望の、その品種の形態学的および生理学的特徴が回復される。戻し交配法は、その品種の特徴を改良するため、またはその品種にその特徴を導入するために、本発明で使用される。本明細書で用いられる戻し交配の語は、雑種子孫を、その変種の親トーモロコシ植物の一方に繰り返し戻し交配することを意味する。所望の特徴を付与するその親トーモロコシ植物は非反復またはドナー親植物と呼ばれる。この用語は、非反復親植物が戻し交配のプロトコール中に1回使用され、したがって反復されないという事実を意味する。

非反復親植物からの遺伝子座（単数または複数）が移送される親トーモロコシ植物は、戻し交配プロトコールにおいて数ラウンド使用されるので、反復親植物として知られている（Poehlmanら, 1995；Fehr, 1987；Sprague & Dudley, 1988）。典型的な戻し交配プロトコールでは、興味ある元の品種（反復親植物）は、移送される興味ある単一遺伝子座を有する第二の品種（非反復親植物）に交配する。この交配から得られる子孫をついで再び反復親植物と交配し、この過程を非反復親植物から移送される単一遺伝子座に加えて、本質的にすべての望ましい形態学的および生理学的特徴が変換植物に回復されるトーモロコシ植物が得られるまで反復する。戻し交配過程は、遺伝子マーカーたとえばSSR, RFLP, SNPまたはAFLPの使用によって加速し、反復親植物からの最大の遺伝的補体を有する植物を同定する。

適当な反復親植物の選択は有効な戻し交配操作の重要な工程である。戻し交配プロトコールの最終目的は、元の品種における単一の特性または特徴を変化または置換させることである。これを達成するためには、反復品種の単一遺伝子座を非反復親植物からの所望の遺伝子座で修飾または置換し、一方、残り所望の遺伝子の本質的にすべて、すなわち元の品種の所望の生理学的および形態学的構成は維持させる。特定の非反復親植物の選択は戻し交配の目的に依存することになる。主要な目的の一つは、ある種の商業的に望ましい、農業経営学的に重要な特性を植物に付加することである。正確な戻し交配プロトコールは変化させる特徴または特性に依存し、適当な試験プロトコールが決定される。移送される特徴が優性対立遺伝子である場合には、戻し交配法は単純であるが、劣性対立遺伝子も移送することができる。本例では、所望の特徴が有効に移送されたか否かを決定するために、子孫の試験を導入する必要がある。

新規な同系の開発のためには通常選択されないが、戻し交配技術により改良できる多くの単一遺伝子座も同定された。単一遺伝子座特性はトランスジェニックでも、そうでなくてもよい。これらの特性の例は、それらに限定されるものではないが、雄性不稔、蝋状デンプン、除草剤抵抗性、細菌、カビもしくはウイルス疾患に対する抵抗性、昆虫抵抗性、雄性不稔、栄養品質の向上、工業的利用性、収率の安定性ならびに収率の向上が包含される。これらの遺伝子は、一般に核によって承継されるが、細胞質によっても承継される。これに対する周知の例外は雄性不稔の遺伝子であり、一部は細胞質により承継されるが、なお単一遺伝子座特性としても作用する。単一遺伝子座特性は多くの例が、たとえばPCT出願WO 95/06128に記載されている。この開示は引用により本明細書にとくに導入される。

雄性不稔を付与する遺伝子の例は、US特許3,861,709, US特許3,710,511, US特許4,654,465, US特許5,625,132およびUS特許4,727,219の開示に包含される。これらの開示のそれぞれは、引用によりその全体がとくに本明細書に導入される。本発明によりトーモロコシ植物において、雄性不稔システムの使用を所望の場合には、1または2以上の雄性稔性修復遺伝子の利用も有利である。たとえば、細胞質雄性稔性（CMS）を使用する場合には、雑種種子の産生は3種の同系統を要求する。すなわち（1）CMS細胞質をもつ細胞質雄性不稔系統、（2）核遺伝子に対するCMS系列と同系（「維持系列」）の正常な細胞質をもつ稔の系統、および（3）稔性修復遺伝子（「修復系列」）を有する、正常な細胞質をもつ明瞭な稔性系統である。CMS細胞質は雌性親植物から誘導されるので、CMS系統を、すべての子孫が雄性不稔である維持系統と受粉させて繁殖させる。これらの雄性不稔植物は、雌性親植物の雄性再生部分を物理的に除雄することなく、修復系統との雑種交配において雌性親植物として有効に使用することができる。

雄性稔性修復遺伝子の存在は、完全に稔性のF₁雑種子孫の産生を生じる。雄性親植物中に修復遺伝子が存在しないと雄性不稔雑種が得られる。このような雑種はトーモロコシ植物の成長期組織が使用される場合、たとえば保存に有用であるが、大抵の場合、種子は穀粒の最も価値ある部分としてみなされ、したがって、これらの穀粒における雑種の稔性は修復されねばならない。本発明で使用できる雄性不稔遺伝子ならびに相当する修復遺伝子の例は、植物栽培技術の熟練者には周知であり、たとえばUS特許5,530,191；US特許5,689,041；US特許5,741,684およびUS特許5,684,242に開示されている。これらの開示はそれぞれ、引用により、とくにそれらの全体が本明細書に導入される。

単一の遺伝子座が優性の特性として働く場合には直接選択が適用される。優性の特性の例には除草剤抵抗性特性がある。この選択過程においては、最初の交配が行われる子孫に、戻し交配の前に除草剤のスプレーが行われる。このスプレーにより、所望の除草剤抵抗性の特徴をもたない植物は消失し、除草剤抵抗性遺伝子をもつそれらの植物のみが次の戻し交配に使用される。この過程はついですべての付加的戻し交配世代に反復される。

多くの有用な遺伝子座特性は、遺伝子トランスフォーメーション技術によって導入される。トーモロコシの遺伝子トランスフォーメーションの方法は、本技術分野の熟練者には周知である。たとえば、トーモロコシの遺伝子トランスフォーメーションについて記載されている方法としては、エレクトロポレーション（US特許5,384,253）、エレクトロトランスフォーメーション（US特許5,371,003）、マイクロプロジェクタイルボンバードメント（US特許5,550,318；US特許5,736,369；US特許5,538,880；およびPCT公開WO 96/06128）、Agrobacterium−仲介トランスフォーメーション（US特許5,591,616；EP公開特許EP672752）、プロトプラストの直接DNA取り込みトランスフォーメーション（Omirullehら, 1963）ならびにシリコンカーバイド繊維仲介トランスフォーメーション（US特許5,302,532およびUS特許5,464,765）がある。

遺伝子トランスフォーメーション（US特許5,554,798）によって導入することが可能で、とくに有用な単一遺伝子座特性のタイプは、除草剤グリフォセートに対する抵抗性を付与する遺伝子である。グリフォセートは、芳香族アミノ酸の生合成経路で活性な酵素EPSPSの作用を阻害する。この酵素の阻害は、アミノ酸のフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンならびにそれらから誘導される二次代謝物の枯渇を招来する。グリフォセートに対して抵抗性の、この酵素の突然変異体が利用できる。たとえばUS特許4,535,060には、EPSPSに対するSalmonella typhimurium遺伝子aroAを有する生物体にグリフォセート抵抗性を付与するEPSPS突然変異体の単離が記載されている。類似の突然変異をもつ突然変異EPSPS遺伝子もZea maysからクローン化されている。突然変異遺伝子は、残基102および106にアミノ酸変化を有する蛋白質をコードする（PCT公開WO 97/01034）。植物がこのような遺伝子からなる場合には、除草剤抵抗性の表現型を生じる。

突然変異EPSPS遺伝子からなる導入遺伝子を承継する植物は、したがって、植物に有意な損害を生じることなく、除草剤グリフォセートで直接処理することができる。この表現型は、広範囲のスペクトルを有する除草剤グリフォセートの適用は、除草剤抵抗性特性をもつ植物の農場における雑草の成長抑制において、栽培者に利益を提供する。たとえば、グリフォセート抵抗性のトーモロコシ植物が栽培される農場の表面上に、Monsanto Companyによって製造され、販売されている除草剤Roundup（登録商標）を適用することができる。除草剤の適用率は通常、1エーカーあたりRoundup（登録商標）4〜256オンスである。さらに好ましくは、1エーカーあたり約16〜約64オンスのRoundup（登録商標）が農場に適用される。しかしながら適用率は処置すべき雑草の多さおよび／または種類により、必要に応じて増加または低減させることができる。さらに、雑草の生長および蔓延する雑草のタイプに影響する農場の位置および天候の状態に応じて、さらにグリフォオセート処置を実施することが望ましい。第二のグリフォセートの適用も通常、処置するエーカーあたりRoundup（登録商標）約16オンス〜約64オンスの適用率からなる。この場合も処置率は農場の条件に基づいて調整される。農業用穀物に対する除草剤のこのような適用方法は本技術分野において周知であり、一般的にAnderson（1983）に要約されている。

また、2以上の単一遺伝子座特性を戻し交配変換の方法により品種に浸透遺伝させることもできる。選択可能なマーカー遺伝子および興味ある特性を付与する蛋白質をコードする遺伝子は遺伝子トランスフォーメーションの結果としてトーモロコシ植物に同時に導入される。通常1または2以上の導入遺伝子が宿主細胞のゲノムにおける単一染色体部位にインテグレートされることになる。たとえば、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（PPT）をコードし、グルタミンシンターゼの阻害によって一部の除草剤の活性成分に対する抵抗性を付与する選択可能マーカー遺伝子（たとえばバー遺伝子）ならびにBacillus thuringiensis（Bt）からのエンドトキシンをコードし、特定のクラスの昆虫たとえば鱗翅目の昆虫、とくにEuropean Corn Borerが同時に、宿主ゲノムに導入される。さらに戻し交配変換の方法により2以上のトランスジェニック特性が優れた同系植物に移送される。

蝋状の特徴は劣性特性の例である。本例では、最初の戻し交配世代から生じた子孫（BC1）を生育させ、自家受粉させなければならない。ついで、BC1植物からの自家受粉種子を試験して、どのBC1植物が蝋状特性の劣性遺伝子を有するかを決定する。他の劣性遺伝子では、付加的な子孫試験たとえばBC1S1のような付加的世代の成長の試験が、どの植物が劣性遺伝子を有するかを決定するために要求される。

Ｖ．単一遺伝子座変換植物の例の起源および栽培歴
単一遺伝子変換植物の製造方法は本技術分野の熟練者には周知である。このような単一遺伝子変換植物の例は、トーモロコシ系列を細胞質雄性不稔の単一遺伝子座に変換した85DGD1 MLmsである。こ系統を変換するために使用する方法はUS特許6,175,063に記載されている。その開示はその全体を本明細書に導入され、本明細書の以下に掲げる。US特許6,175,063に記載されているように、85DGD1 MLmsは戻し交配方法を用いて誘導された。とくに、85DGD1と命名された系統は反復親植物として使用され、ML細胞質性不妊を有する生殖質起源を非反復親植物として使用された。変換された単一遺伝子座の同系85DGD1の栽培歴は次のように要約できる。
Hawaii苗床への播種日 04−02−1992 S−Oの作成：雌性列585雄性列500
Hawaii苗床への播種日 07−15−1992 S−Oを生育させ、植物を85DGD1 times戻し交配（列444’ 443）
Hawaii苗床への播種日 11−18−1992 混合したBC1種子を生育させ、85 DGD1 times戻し交配（列V 3−27’ V3−26）
Hawaii苗床への播種日 04−02−1993 混合したBC2種子を生育させ、85 DGD1 times戻し交配（列V 37’ 36）
Hawaii苗床への播種日 07−14−1993 混合したBC3種子を生育させ、85 DGD1 times戻し交配（列99’ 98）
Hawaii苗床への播種日 10−28−1993 混合したBC4種子を生育させ、85 DGD1 times戻し交配（列KS−63’ KS−62）
1994年夏：BC5の単一の穂を生育させ、85 DGD1 times戻し交配（MC94−822’ MC94−822−7）
1994年冬：混合したBC6種子を生育させ、85 DGD1 times戻し交配（3Q− 1’3Q−2）
1995年夏：BC7種子を混合し、85 DGD1 MLmsと命名する。

本明細書に開示され、請求されるすべての組成物および方法は、本開示を参照すれば不必要な実験を行うことなく作成および実行することができる。本発明の組成物および方法は前述の例示的実施態様により説明してきたが、本技術分野の熟練者には、本発明の真の概念、精神、および範囲から逸脱することなく本明細書に記載の組成物、方法および工程または工程の順序に変動、改変、修飾および変化を適用できることは自明の通りである。さらに特定すれば、本明細書に記載の物質は化学的および生理学的の両者で類似する物質に置換しても同様な結果が得られることは自明の通りである。このような本技術分野の熟練者に自明の類似の置換および修飾は添付の特許請求の範囲により定義された本発明の精神、範囲および概念に含むものとみなされる。

引用文献
以下の引用文献は、本明細書に掲げた引用文献の例示的操作または他の詳細な補足を提供する限りにおいて、引用によりとくに本明細書に導入される。

Claims (18)

1. 種子乾燥物の6％以上の油脂含量、種子乾燥乾燥物の10％以上の蛋白質含量、油脂総脂肪酸の35％以上のオレイン酸含量、種子乾燥物の0.32％以上のリジン含量、および種子乾燥物の0.08％以上のトリプトファン含量からなる群より選択される改良された品質の穀粒特性を少なくとも一つ有するトーモロコシ植物の製造方法において、（a）トーモロコシaccession REN001のトーモロコシ植物を第二のトーモロコシ植物もしくはそれ自身との交配させ、この場合、トーモロコシaccession REN001の種子サンプルはATCC Accession No. PTA-3822として寄託され、（b）上記交配によって得られ、少なくとも1つの品質で改良された穀粒特性を有するトーモロコシ植物の子孫を選択する工程からなる方法。
2. 交配は、上記交配に先立ってトーモロコシ植物accession REN001または第二のトーモロコシ植物を雄性不稔にすることからなる「請求項１」記載の方法。
3. 交配に先立ってaccession REN001のトーモロコシ植物または第二のトーモロコシ植物を雄性不稔にするには、雄性不稔を付与する細胞質もしくは核遺伝子を導入するか、または雄穂を除去する「請求項２」記載の方法。
4. 交配は手作業受粉を行うことまたは自然の受粉を起こさせることからなる「請求項１」記載の方法。
5. 第二のトーモロコシ植物はトーモロコシaccession REN001の植物である「請求項１」記載の方法。
6. 第二のトーモロコシ植物は同系、雑種または合成雑種である「請求項１」記載の方法。
7. 第二のトーモロコシ植物は遺伝的にヘテロ接合である「請求項１」記載の方法。
8. トーモロコシaccession REN001のトーモロコシ植物は花粉ドナーとして使用され第二のトーモロコシ植物は花粉レセプターであるか、またはトーモロコシaccession REN001のトーモロコシ植物は花粉レセプターとして使用され第二のトーモロコシ植物は花粉ドナーである「請求項１」記載の方法。
9. さらに、（c）トーモロコシ植物の子孫をそれ自身または第三の植物と交配し次の世代の子孫植物を産生させる工程からなる「請求項１」記載の方法。
10. さらに（d）次の世代の子孫植物をそれ自身または第二の植物と交配する工程および（e）工程（c）および（d）をさらに3〜10世代反復してトーモロコシaccession REN001に由来する同系トーモロコシ植物を産生させる工程からなる「請求項９」記載の方法。
11. 上記次世代の植物子孫は少なくとも最初に品質を上昇させた穀粒の特性の存在に基づく交配について選択する「請求項１０」記載の方法。
12. 上記次世代の植物子孫は少なくとも最初に品質を上昇させた穀粒の特性の存在に基づく交配について、それぞれの世代で選択する「請求項１１」記載の方法。
13. 次世代の植物子孫は少なくとも2種の向上させた穀粒特性の品質存在に基づく交配について、それぞれの世代で選択し、向上された穀粒特性の品質は種子乾燥物の6％以上の油脂含量、種子乾燥乾燥物の10％以上の蛋白質含量、油脂総脂肪酸の35％以上のオレイン酸含量、種子乾燥物の0.32％以上のリジン含量、および種子乾燥物の0.08％以上のトリプトファン含量からなる群より選択される「請求項１２」記載の方法。
14. トーモロコシの穀粒を製造する方法において、（a）第一および第二のトーモロコシ植物を受粉可能な近位置において栽培し、第一の植物は農業経営学的に優れた品種であり、第二の植物はトーモロコシ植物accession REN001であり、この場合、トーモロコシaccession REN001の種子サンプルはATCC Accession No. PTA-3822として寄託され、（b）第一および第二の植物は性的成熟に至るまで生育させ、(c)第二の植物からの花粉を第一の植物に受粉させ、そして、(d)少なくとも第一の植物上に形成される穀粒を収集することからなる方法。
15. さらに、上記第一の植物および第二の植物の種子集団を栽培することからなると定義される「請求項１４」記載の方法。
16. 収集は第一のトーモロコシ植物および第二のトーモロコシ植物上に形成される穀粒を収穫することからなる「請求項１４」記載の方法。
17. 第一のトーモロコシ植物は遺伝的、化学的または機械的手段によって雄性不稔にする「請求項１４」記載の方法。
18. 第一のトーモロコシ植物は遺伝的に雄性不稔にする「請求項１４」記載の方法。