JP4402511B2 - Method for measuring enzyme activity of crosoprotein and its use - Google Patents
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本発明は、クロソ（Klotho）蛋白質の酵素活性の測定法及びその利用方法、特には、クロソ蛋白質のβ−グルクロニダーゼ活性に基づく特異酵素活性を測定することによりクロソ蛋白質の酵素活性を測定する方法、及び、該方法を用いてクロソ遺伝子の発現の低下により発症する疾病の診断を行う方法、生体中のクロソ蛋白質作用物質のスクリーニングを行う方法、クロソ蛋白質機能活性化物質のスクリーニングを行う方法、及び、早期老化症状を呈する疾病の予防又は治療薬のスクリーニングを行う方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring the enzyme activity of Klotho protein and a method for using the same, in particular, a method for measuring the enzyme activity of Kuroso protein by measuring the specific enzyme activity based on the β-glucuronidase activity of Kuroso protein, And a method for diagnosing a disease caused by a decrease in the expression of a croso gene using the method, a method for screening a crosoprotein active substance in a living body, a method for screening a crosoprotein function activator, and The present invention relates to a method for screening a preventive or therapeutic agent for a disease that exhibits premature aging symptoms.
個体の老化機序の解明は、医学・生物学に残された最大の課題の一つである。老化は成熟期以後、加齢とともに各臓器の機能、あるいは統合する機能の低下が起こり、個体の恒常性を維持することができなくなり、最終的に死に至る過程を指す。このように老化は、広範囲に及ぶ多面的な現象であり、しかも、個体差が大きく、さらに環境や生活習慣の影響を受けることから、その実体を捉え、機序を説明することが困難であった。このような状況の中で、老化の実体を明らかにするために多くの独自の切り口を持った研究が進められてきた。例えば、（１）生物体を構成する細胞に着目したアプローチ、（２）生物個体の生理機能、免疫機能、内分泌系に着目したアプローチ、（３）実験動物の生存寿命に着目したアプローチ、また、（４）ヒトの早老症や老年性疾患を解析することで、老化の実体に迫ろうとするアプローチなどである。これらのアプローチは、それぞれ老化のある側面を捉えることを可能にしており、多くの老化に関する知識をもたらしたが、未だ老化の機序を一元的に説明するまでは至っていない。 Elucidation of the aging mechanism of an individual is one of the biggest challenges left in medicine and biology. Aging refers to a process in which the function of each organ or the function of integration occurs with aging after the maturity period, and the individual's homeostasis cannot be maintained, resulting in death. As described above, aging is a wide-ranging and multifaceted phenomenon, and it is difficult to grasp the substance and explain the mechanism because there are large individual differences and the influence of the environment and lifestyle. It was. In this situation, research with many unique aspects has been carried out to clarify the substance of aging. For example, (1) an approach that focuses on the cells that make up the organism, (2) an approach that focuses on the physiological function, immune function, and endocrine system of the individual organism, (3) an approach that focuses on the survival life of experimental animals, (4) An approach to approach the substance of aging by analyzing human progeria and senile diseases. Each of these approaches has made it possible to capture certain aspects of aging, and has provided a lot of knowledge about aging, but it has not yet been able to explain the mechanism of aging centrally.
その中にあって、黒尾らによって確立されたクロソ（Klotho）マウスは個体老化の実体、さらには機序の解析に一石を投じた。このマウスは、クロソ遺伝子の欠損によって、性成熟期に動脈効果、中膜や軟部組織の石灰化、肺気腫などヒト型老化様を呈し、短時間で死亡する。さらにクロソ遺伝子及び蛋白質は、主に腎臓遠位尿細管と脳脈絡叢に発現しているが、老化様表現型は発現部位を越え全身に及んでいる。これは、クロソの作用が組織−組織間を越えて作用しており、動物個体の恒常性を保ち、老化様表現型の発現を抑えていることを示している。このようにクロソの解析は、個体の恒常性の維持機構という立場で、老化の実体を理解するためのアプローチの一つと考え、研究が進められてきた。 Among them, the Klotho mouse established by Kuroo et al. Invested in analyzing the aging entity and the mechanism. Due to the deficiency of the croso gene, this mouse exhibits human-type aging such as arterial effects, calcification of the media and soft tissues, and emphysema during sexual maturation, and dies in a short time. Furthermore, the Kuroso gene and protein are mainly expressed in the distal renal tubule and the choroid plexus, but the aging-like phenotype extends to the whole body beyond the expression site. This indicates that the action of Kuroso acts across tissues, maintaining the homeostasis of individual animals and suppressing the expression of the aging-like phenotype. In this way, Kuroso's analysis is considered as one of the approaches to understand the substance of aging from the standpoint of maintaining the homeostasis of individuals, and research has been advanced.
クロソ遺伝子は、寿命の短縮、各種臓器の石灰化、動脈硬化、生殖臓器の萎縮など、顕著かつ多彩な早期老化症状を呈するトランスジェニックマウス(クロソマウス)の外来遺伝子挿入部に存在し、その発現が低下するとマウスに前記老化症状を引き起こす原因遺伝子として同定された遺伝子である。クロソマウスは生後３週目までは野生型のマウスと同様に生育するが、その後は成長が止まり様々な老化の兆候を示す。６週齢になると、クロソマウスの活動性は野生型の５０％程度に低下し、パーキンソン病様の歩行がみられる。性腺は萎縮しており不妊である。骨粗鬆症が顕著となるほか、大動脈弁、気管支、脳の脈絡叢に異所性の石灰化が生じる。動脈系では、血管内膜の肥厚や中膜の石灰化といった加齢に特徴的なメンケベルグ型の動脈硬化所見を示す。その他皮膚の萎縮や、肺気腫も観察されるようになる（ＷＯ９８／２９５４４、Nature, 390, 45, 1997)。クロソ遺伝子のｃＤＮＡの解析から、クロソ遺伝子はスプライシングの違いにより２種類のｍＲＮＡが転写され、該ｍＲＮＡより２種類の蛋白質が翻訳される（以下、これら蛋白質を含め、クロソ遺伝子にコードされる蛋白質を「クロソ蛋白質」と呼ぶ）。 The Kuroso gene is present in the foreign gene insertion site of transgenic mice (closo mice) that exhibit prominent and diverse early aging symptoms such as shortening of life span, calcification of various organs, arteriosclerosis, atrophy of reproductive organs, etc. It is a gene identified as a causative gene that causes the aging symptoms in mice when lowered. The black mouse grows up to the third week after birth in the same manner as the wild-type mouse, but then stops growing and shows various signs of aging. At 6 weeks of age, the activity of Kuroso mice decreases to about 50% of the wild type, and Parkinson's disease-like gait is observed. The gonadal is atrophied and infertile. In addition to prominent osteoporosis, ectopic calcification occurs in the aortic valve, bronchi, and choroid plexus of the brain. In the arterial system, it shows Menkeberg-type arteriosclerosis findings characteristic of aging such as thickening of the intima and calcification of the media. Other skin atrophy and pulmonary emphysema are also observed (WO 98/29544, Nature, 390, 45, 1997). From the analysis of the cDNA of the Kuroso gene, the mRNA of the Kuroso gene is transcribed into two kinds of mRNAs due to splicing differences, and the two kinds of proteins are translated from the mRNA (hereinafter referred to as the proteins encoded by the Kuroso gene). Called "crosoprotein").
クロソ遺伝子変異が様々な老化症状を引き起こす機作や、クロソ蛋白質の分子機能はまだ明らかにされていない。クロソ遺伝子の発現は腎臓で高いが、激しい老化症状は、肺、骨、胃壁、皮膚等を含む全身臓器に及んでいる。このことから、その分子機能には何らかの分泌性の因子が存在し、作用を発揮していることが推定された（Nature, 390, 45, 1997)。クロソマウスとクロソ遺伝子発現トランスジェニックマウスとの交配実験および、膜結合型クロソ遺伝子のｃＤＮＡを組み込んだアデノウイルスベクターを用いてクロソマウス体内でクロソ蛋白質を発現させる実験等により、クロソマウスの老化症状発症の予防が達成されたことから、クロソ蛋白質の機能不全に由来する疾患の治療は、何らかの手段を用いてクロソ遺伝子を増強することにより達成されることが示唆されている（Nature, 390, 45, 1997、ＷＯ９８／２９５４４）。血管内皮細胞は、内皮依存性血管弛緩因子や内皮依存性血管収縮因子を放出して血管緊張を調節しているばかりでなく、血管内膜の透過性や血小板凝集にも深く関与しており、血栓性動静脈疾患の発症進展に重要な役割を演じている。 The mechanism by which Kuroso gene mutations cause various aging symptoms and the molecular function of Kuroso protein have not yet been clarified. Although the expression of Kuroso gene is high in the kidney, severe aging symptoms have spread to systemic organs including lung, bone, stomach wall, skin and the like. From this, it was presumed that some secretory factors exist in the molecular function and exert their actions (Nature, 390, 45, 1997). Crossing experiments between Kuroso mice and Kuroso gene-expressing transgenic mice, and experiments to express Kuroso proteins in Kuroso mice using adenovirus vectors incorporating the cDNA of membrane-bound Kuroso genes can prevent the development of aging symptoms in Kuroso mice. It has been suggested that treatment of diseases resulting from dysfunction of crosoprotein is achieved by enhancing the crosogene using some means (Nature, 390, 45, 1997, WO98). / 29544). Vascular endothelial cells not only regulate endothelium by releasing endothelium-dependent vasorelaxing factors and endothelium-dependent vasoconstrictors, but are also deeply involved in intima permeability and platelet aggregation, It plays an important role in the development of thrombotic arteriovenous disease.
前記２種類のｍＲＮＡにコードされるクロソ蛋白質の内、一方の蛋白質はＮ末端のシグナル配列領域、細胞外ドメイン領域及びＣ末端の膜貫通ドメイン領域を有する構造を持つ１型膜蛋白（以下、「膜結合型クロソ蛋白質」と呼ぶ）であり、細胞外ドメインは細菌或いは植物のβ−グルコシダーゼに相同性を持つ２つのドメイン（ＫＬ１、ＫＬ２）より構成されている。これに対して、もう一方の蛋白は、Ｎ末端のシグナル配列領域とＫＬ１ドメイン領域を有する分泌蛋白（以下、分泌型クロソ蛋白と呼ぶ）であることが明らかにされた（Biochem. Biophys. Res. Commun., 242, 626, 1998)。 One of the crosoproteins encoded by the two types of mRNAs is a type 1 membrane protein (hereinafter referred to as “a”) having a structure having an N-terminal signal sequence region, an extracellular domain region and a C-terminal transmembrane domain region. The extracellular domain is composed of two domains (KL1, KL2) having homology to bacterial or plant β-glucosidase. On the other hand, the other protein was revealed to be a secreted protein having an N-terminal signal sequence region and a KL1 domain region (hereinafter referred to as secreted Kuroso protein) (Biochem. Biophys. Res. Commun., 242, 626, 1998).
クロソ蛋白質は、約１２０ｋＤａの１型膜蛋白質である。Ｎ末端側よりシグナル配列、β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）に相同性のある２つの繰り返し領域を持つ細胞外領域（ＫＬ１、ＫＬ２）、１回膜貫通領域、短い細胞内領域を持つ。β−グルコシダーゼとは、高度に保存された酵素群であり、単糖−単糖間、単糖−オリゴ糖間及び単糖−非炭水化物間のグリコシド結合を加水分解するものであり、生体内において糖鎖の合成・分解、配糖体の合成・分解、細胞内シグナルの調節、解毒など生体維持に不可欠な機能を担っている。例として、ファミリー１グリコシダーゼ（glycosidase）には、リソソームβ−グルコシダーゼ（lysosomal beta-glucosidase）、細胞質β−グルコシダーゼ（cytosolic beta-glucosidase）、ラクターゼピロリジンヒドラーゼ（lactase philorizine hydrolase：ＬＰＨ）、ミロシナーゼ（myrosinase）などがある。またファミリー２には、β−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）、β−ガラクトシダーゼ（beta-galactosidase：ＬａｃＺ）、β−マンノシダーゼ（beta-mannosidase）などがある。多くのグリコシダーゼは２つの活性中心（求核基、酸塩基触媒基）を担うグルタミン酸残基を持ち、これらの働きによって酵素反応が２段階にわたって進む。 Kuroso protein is a type 1 membrane protein of about 120 kDa. From the N-terminal side, it has an extracellular region (KL1, KL2) having two repeat regions having homology to the signal sequence, β-glucosidase, a single transmembrane region, and a short intracellular region. β-glucosidase is a highly conserved enzyme group that hydrolyzes glycosidic bonds between monosaccharides—monosaccharides, monosaccharides—oligosaccharides, and monosaccharides—non-carbohydrates. It plays essential functions for the maintenance of living organisms such as sugar chain synthesis / degradation, glycoside synthesis / degradation, intracellular signal regulation, detoxification. For example, family 1 glycosidases include lysosomal beta-glucosidase, cytosolic beta-glucosidase, lactase philorizine hydrolase (LPH), myrosinase and so on. Family 2 includes β-glucuronidase, β-galactosidase (LacZ), β-mannosidase and the like. Many glycosidases have glutamic acid residues that bear two active centers (nucleophilic groups and acid-base catalytic groups), and the enzymatic reaction proceeds in two stages by these functions.
第一段階として、求核基が基質のアノマー炭素を攻撃し、酸塩基触媒基のカルボキシル基が糖−酵素（α−グリコピラノシル−酵素：alpha-glycopyranosyl-enzyme）中間体の形成を助ける。第二段階として、水分子による一般塩基触媒作用によりアノマー中心が攻撃を受ける。最終的に、グリコシド結合は切断される。興味深いことに、クロソ蛋白質は、活性に必要な２つのグルタミン酸残基の一方が、それぞれの領域で置換されている。ＫＬ１領域において、酸塩基触媒を担うグルタミン酸残基がアスパラギン酸に、ＫＬ２領域において求核基を担うグルタミン酸残基がアラニンまたはセリンに置換されている。このため、クロソ蛋白質が一次構造上に相同性を持つからといって、β−グルコシダーゼとして働くかは不明であった。しかし、植物が持つミロシナーゼは、酸塩基触媒を担うグルタミン酸がグルタミンに置換されているのにもかかわらず、Ｓ−グリコシド（S-glycoside）結合を持つグルコシノレート（glucosinolate）に対して、酵素活性が見られている。よってクロソ蛋白質も酵素として機能する可能性が考えられていた。 As a first step, the nucleophilic group attacks the anomeric carbon of the substrate, and the carboxyl group of the acid-base catalytic group helps to form a sugar-enzyme (α-glycopyranosyl-enzyme) intermediate. As a second step, the anomeric center is attacked by general base catalysis by water molecules. Eventually, the glycosidic bond is cleaved. Interestingly, Kurosoprotein has one of the two glutamic acid residues required for activity substituted in each region. In the KL1 region, the glutamic acid residue responsible for the acid-base catalyst is replaced with aspartic acid, and the glutamic acid residue responsible for the nucleophilic group in the KL2 region is replaced with alanine or serine. For this reason, it was unclear whether the Kuroso protein functions as β-glucosidase just because of its homology on the primary structure. However, myrosinase possessed by plants has an enzyme activity against glucosinolate having an S-glycoside bond, although glutamic acid serving as an acid-base catalyst is replaced with glutamine. Is seen. Therefore, it was considered that the black protein may function as an enzyme.
前記のとおり、クロソ遺伝子や該遺伝子がコードするクロソ蛋白質の欠失により、多彩な老化関連疾患が発症する機構や、クロソ蛋白質の機能については明らかにされていない点が多いが、その医薬等への利用については、特許公報上でいくつかの開示がなされている。再公表特許公報ＷＯ９８／２９５４４には、クロソ蛋白質のポリペプチド、該ポリペプチドを認識する抗体等を、早期老化症治療薬、成人病治療薬及び老化抑制薬等に用いること及びクロソ遺伝子を組み込んだベクター等を該老化抑制のための遺伝子治療に用いることが開示されている。ＷＯ００／２７８８５には、血中での安定性を保持するために、クロソ蛋白質と免疫グロブリンとを結合させたキメラポリペプチドを老化症の予防・治療薬、或いは腎疾患、悪液質及び変形性関節炎等の予防・治療薬として用いることが開示されている。 As described above, there are many unclear points about the mechanism of the development of various aging-related diseases due to the deletion of the Kuroso gene and the Kuroso protein encoded by the gene, and the function of Kuroso protein. There are some disclosures in the patent gazette regarding the use of. The republished patent publication WO 98/29544 uses a polypeptide of croso protein, an antibody recognizing the polypeptide, etc. as a therapeutic agent for premature aging diseases, a therapeutic agent for adult diseases, an anti-aging agent, etc., and has incorporated a croso gene. It is disclosed that a vector or the like is used for gene therapy for suppressing aging. In WO00 / 27885, in order to maintain stability in blood, a chimeric polypeptide in which a crosoprotein and an immunoglobulin are combined is used as a prophylactic / therapeutic agent for aging, or kidney disease, cachexia and deformability. It is disclosed to be used as a prophylactic / therapeutic agent for arthritis.
また、特開２００１−７２６０７号公報には、クロソ遺伝子ｃＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを投与することにより、哺乳動物の血管内皮機能低下を伴う高血圧や動脈硬化等の疾患の予防・改善を図ることについて開示されている。 JP-A-2001-72607 discloses the prevention and improvement of diseases such as hypertension and arteriosclerosis accompanied by a decrease in vascular endothelial function in mammals by administering a recombinant vector incorporating a croso gene cDNA. Is disclosed.
更に、関連する開示としては、ＷＯ０１／００５２４４には、二価の陽イオン金属を含有する化合物及び／又はリンを含有する化合物を食品や動物飼料に含有させて、摂取させることにより、ヒトや動物のクロソ蛋白質発現量増加又は減少に伴う疾患の予防又は治療を行うことについて開示されている。また、特表２００３−５１４５１３号公報には、骨粗鬆症、皮膚障害、老化関連疾患、肺機能不全及び代謝症候群を含むさまざまな慢性疾患に対する素因と関連して、クロソ遺伝子中のリスク多型に関連する疾患の診断方法等について、開示されている。 Further, as a related disclosure, WO01 / 005244 includes a compound containing a divalent cation metal and / or a compound containing phosphorus in a food or animal feed, and ingesting it to humans or animals. It is disclosed that prevention or treatment of a disease associated with an increase or decrease in the expression level of crosoproteins is described. In addition, JP 2003-514513 A relates to risk polymorphisms in the Kuroso gene in relation to predisposition to various chronic diseases including osteoporosis, skin disorders, aging-related diseases, pulmonary dysfunction and metabolic syndrome. A disease diagnosis method and the like are disclosed.
上記のように、クロソ蛋白質やその遺伝子、及びその用途については、種々の開示がなされており、また、該クロソ蛋白質や遺伝子の検出方法やそれを用いたクロソ遺伝子の発現を増強させる化合物のスクリーニング方法等についての開示もなされているが（ＷＯ９８／２９５４４）、クロソ蛋白質の欠失が多彩な老化関連疾患をもたらす機構は、唯一、クロソ蛋白質の細胞外ドメインがβ−グルコシダーゼと相同性を持つこと以外は明らかになっていない。したがって、クロソ蛋白質の機能を明らかにすることが、生体においてクロソ蛋白質の機能に関与する物質を特定し、老化関連疾患に対するクロソ蛋白質の作用機構の解明を可能にし，更には、クロソ蛋白質の機能を増加させる物質の効果的な開発が可能になる。したがって、それらの解明が強く望まれていた。
本発明の課題は、クロソ蛋白質の機能を明らかにし、クロソ蛋白質の測定法及びその利用方法を提供すること、特には、クロソ蛋白質が酵素活性を持つことを明らかにし、該特異酵素活性を測定することによりクロソ蛋白質の酵素活性を測定する方法、更には、該方法を用いてクロソ遺伝子の発現の低下により発症する疾病の診断を行う方法、動物個体における特異的な基質を推定し、真の基質の同定とその情報に基づく生理活性物質の解析を行うために、生体中のクロソ蛋白質作用物質のスクリーニングを行う方法、真の基質に作用する新規薬剤の開発へと発展させるために、クロソ蛋白質機能活性化物質のスクリーニング、及び、早期老化症状を呈する疾病の予防又は治療薬のスクリーニングを行う方法を提供することにある。 An object of the present invention is to elucidate the function of closoprotein, to provide a method for measuring and use of crosoprotein, and in particular to clarify that crosoprotein has enzyme activity and to measure the specific enzyme activity. A method for measuring the enzyme activity of a croso protein, a method for diagnosing a disease caused by a decrease in the expression of a croso gene using the method, a specific substrate in an animal individual is estimated, and a true substrate In order to develop the development of new drugs that act on true substrates, the screening method of the active substance of crosoprotein in the living body in order to identify the bioactive substance based on the identification and the information, the function of crosoprotein It is an object of the present invention to provide a method for screening an activator and screening for a preventive or therapeutic agent for a disease that exhibits premature aging symptoms.
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究する中で、クロソ蛋白質の機能を明らかにすることで、クロソ蛋白質が関わっている個体老化制御機構を解明できる可能性があると考えた。クロソ蛋白質の一次構造に着目した時、クロソ蛋白質はβ−グルコシダーゼとして酵素活性を持つ可能性、或いは酵素活性は持たず、受容体などと結合することで機能する可能性が考えられた。しかし、クロソ蛋白質の直接の作用分子はわかっていないため、この２つの可能性について直接検証することは難しい。そこで、生体内作用分子の代わりに人工的に合成された類似物を用いることでin vitroにおいて傍証をとることは可能であることから、本発明においては、組換え型クロソ蛋白質を作製し、β−グルコシダーゼ活性測定に用いられている人工基質と反応させることで、クロソ蛋白質が酵素活性を持つ可能性を検証した。 The present inventor thought that there was a possibility of elucidating the control mechanism of the individual aging involved in the closoprotein by clarifying the function of the crosoprotein during intensive studies to solve the above problems. When focusing on the primary structure of the Kuroso protein, the Kuroso protein may have the enzyme activity as β-glucosidase, or may have the enzyme activity and function by binding to the receptor. However, since the direct acting molecule of Kuroso protein is not known, it is difficult to directly verify these two possibilities. Therefore, since it is possible to take evidence in vitro by using an artificially synthesized analog instead of the in vivo acting molecule, in the present invention, a recombinant crosoprotein is prepared, and β -The possibility that crosoprotein has enzyme activity was verified by reacting with an artificial substrate used for measuring glucosidase activity.
この検証の中で、本発明者は、今回、その酵素活性の解析により、クロソ蛋白質が、４メチルウンベリフェル−グルクロニド（4Methylumberifel-Glucuronide：4-Methylumberifelyl-beta-D-glucuronide：4Mu-glucuronide）と反応し、β−グルクロニダーゼ活性（β‐glucuronidase）を持つことを解明し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明においては、該知見に基づいて、その特異酵素活性を測定することによりクロソ蛋白質の酵素活性を測定する方法を開発した。また、該クロソ蛋白質の酵素活性を測定する方法により、生体中のクロソ遺伝子の発現の状況を検知・測定し、クロソ遺伝子の発現の低下により発症する疾病の診断を行う方法を開発した。更に、クロソ蛋白質がβ−グルクロニダーゼ活性を持つことを解明したことによって、クロソ蛋白質が末端にグルクロン酸をもつ分子を切断し、活性化することが示唆され、そのことにより、動物個体における酵素特異的な基質を推定し、真の基質の同定とその情報に基づく生理活性物質の解析を行うことが可能となり、この知見により、生体中のクロソ蛋白質作用物質のスクリーニングを行う方法を開発した。このスクリーニング方法により、数多くの天然β−グルクルニドをスクリーニングした結果、β−エストラジオール３−β−Ｄグルクロニド（b-estradiol 3-b-D-glucuronide）、エストロン３βＤグルクロニド（estrone 3-b-D-glucuronide）、及びエルトリオール３βＤグルクロニド（estriol 3-b-D-glucuronide）などのステロイドβ−グルクロニドが、クロソ蛋白質によって加水分解されたことを見い出した。 In this verification, the present inventor, by analyzing the enzyme activity, this time, the Kuroso protein is 4 Methylumberifel-Glucuronide (4-Methylumberifelyl-beta-D-glucuronide) and 4 Mu-glucuronide The reaction revealed that it had β-glucuronidase activity (β-glucuronidase), and the present invention was completed. That is, in the present invention, based on this finding, a method for measuring the enzyme activity of crosoprotein by measuring the specific enzyme activity was developed. In addition, we have developed a method for diagnosing diseases that develop due to a decrease in the expression of the Kuroso gene by detecting and measuring the expression status of the Kuroso gene in the living body by measuring the enzyme activity of the Kuroso protein. Furthermore, elucidating that crosoprotein has β-glucuronidase activity suggests that crosoprotein cleaves and activates molecules with glucuronic acid at the end, which enables enzyme-specific activity in animal individuals. It was possible to estimate the true substrate, to identify the true substrate and to analyze the physiologically active substance based on the information, and based on this finding, we developed a method for screening for the active substance of closoprotein in vivo. As a result of screening many natural β-glucuronides by this screening method, β-estradiol 3-β-D glucuronide, estrone 3-bD-glucuronide, and L It has been found that steroidal β-glucuronides, such as triol 3βD glucuronide, have been hydrolyzed by crosoproteins.
従来、クロソ蛋白質の細胞外ドメインがβ−グルコシダーゼと相同性を持つという構造から生体分子末端のグルコースやガラクトースを切断する可能性が示唆されてきたが、これらは一般的な糖蛋白、糖鎖分子に含まれているものであり、酵素活性から特異的な基質を推定することは困難であると考えられてきた。しかし、本発明の知見により、アルカロイドやステロイドのような低分子量分子を含む特殊な分子がその生体内基質である可能性が示唆されたことから、クロソ蛋白質の酵素活性を指標にして生体内基質を同定することが可能であることが明らかとなった。また、本発明においては、真の基質に作用する新規薬剤の開発へと発展させるために、本発明のクロソ蛋白質の酵素活性を測定する方法を用いて、被検物質を投与した生体でのクロソ蛋白質の酵素活性の増減の状況を把握し、このことによってクロソ蛋白質機能活性化物質のスクリーニング、及び、早期老化症状を呈する疾病の予防又は治療薬のスクリーニングを行う方法を開発した。 Previously, the structure that the extracellular domain of crosoprotein has homology with β-glucosidase has been suggested to cleave glucose and galactose at the end of biomolecules. It has been considered that it is difficult to estimate a specific substrate from the enzyme activity. However, the knowledge of the present invention suggests that special molecules including low molecular weight molecules such as alkaloids and steroids may be in vivo substrates. Therefore, in vivo substrates using the enzyme activity of crosoprotein as an index. It became clear that it was possible to identify. Further, in the present invention, in order to develop into the development of a new drug that acts on a true substrate, the method for measuring the enzyme activity of the Kuroprotein of the present invention is used to measure the activity of the living body administered the test substance. We have developed a method of screening for a substance that activates crosoprotein function and screening for a prophylactic or therapeutic drug for a disease presenting with premature aging.
すなわち具体的には本発明は、クロソ蛋白質のβ−グルクロニダーゼ活性に基づく特異酵素活性を測定することを特徴とするクロソ蛋白質酵素活性の測定法（請求項１）や、クロソ蛋白質のβ−グルクロニダーゼ活性に基づく特異酵素活性の測定が、β−グルクロニド結合を有する酵素基質を用いる特異酵素活性の測定であることを特徴とする請求項１記載のクロソ蛋白質酵素活性の測定法（請求項２）や、β−グルクロニド結合を有する酵素基質が、β−グルクロニド結合を有するフラボノイド又はアルカロイドであることを特徴とする請求項１又は２記載のクロソ蛋白質酵素活性の測定法（請求項３）や、β−グルクロニド結合を有する酵素基質が、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドであることを特徴とする請求項１又は２記載のクロソ蛋白質酵素活性の測定法（請求項４）や、β−グルクロニド結合を有する酵素基質が、天然基質のステロイドβ−グルクロニドであることを特徴とする請求項１又は２記載のクロソ蛋白質酵素活性の測定法（請求項５）からなる。 Specifically, the present invention specifically relates to a method for measuring the activity of a crosoprotein enzyme characterized by measuring the specific enzyme activity based on the β-glucuronidase activity of the crosoprotein (claim 1), and the β-glucuronidase activity of the crosoprotein. The specific enzyme activity measurement based on the above is a specific enzyme activity measurement using an enzyme substrate having a β-glucuronide bond. The method for measuring the activity of crosoprotein enzyme according to claim 1 or 2, wherein the enzyme substrate having a β-glucuronide bond is a flavonoid or alkaloid having a β-glucuronide bond, or β-glucuronide. The enzyme substrate having a bond is 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide, or 3. The method for measuring the activity of crosoprotein enzyme according to claim 4 (claim 4) or the enzyme substrate having a β-glucuronide bond is a natural substrate steroid β-glucuronide. It comprises a method for measuring activity (claim 5).
また本発明は、天然基質のステロイドβ−グルクロニドが、β−エストラジオール３−β−Ｄグルクロニド、エストロン３−β−Ｄグルクロニド、又はエルトリオール３−β−Ｄグルクロニドであることを特徴とする請求項５記載のクロソ蛋白質酵素活性の測定法（請求項６）や、クロソ蛋白質のβ−グルクロニダーゼ活性に基づく特異酵素活性の測定が、生体または生体細胞中のクロソ遺伝子の発現に基づくクロソ蛋白質生成の測定であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のクロソ蛋白質酵素活性の測定法（請求項７）や、生体または生体細胞中のクロソ遺伝子の発現に基づくクロソ蛋白質生成の測定が、クロソ遺伝子の発現の低下により発症する疾病の診断のための測定であることを特徴とする請求項７記載のクロソ蛋白質酵素活性の測定法（請求項８）や、クロソ遺伝子の発現の低下により発症する疾病の診断が、早期老化症状を呈する疾病の診断であることを特徴とする請求項８記載のクロソ蛋白質酵素活性の測定法（請求項９）や、早期老化症状を呈する疾病の診断が、寿命の短縮、各種臓器の石灰化、動脈硬化又は生殖臓器の萎縮に係わる疾病の診断であることを特徴とする請求項９記載のクロソ蛋白質酵素活性の測定法（請求項１０）からなる。 Further, in the present invention, the natural substrate steroid β-glucuronide is β-estradiol 3-β-D glucuronide, estrone 3-β-D glucuronide, or ertriol 3-β-D glucuronide. 5. The method for measuring the activity of the crosoprotein enzyme according to claim 5 (claim 6) or the measurement of the specific enzyme activity based on the β-glucuronidase activity of the crosoprotein, The method for measuring the activity of the crosoprotein enzyme according to any one of claims 1 to 6 (claim 7) or the measurement of the production of crosoprotein based on the expression of a croso gene in a living body or a living cell, 8. The Kuroso protein enzyme according to claim 7, which is a measurement for diagnosing a disease caused by a decrease in the expression of Kuroso gene. The method of measuring sex (Claim 8) or diagnosing a disease that develops due to a decrease in the expression of a croso gene is a diagnosis of a disease that exhibits premature aging symptoms. The measurement method (Claim 9) or the diagnosis of a disease exhibiting premature aging symptoms is a diagnosis of a disease related to shortening of life span, calcification of various organs, arteriosclerosis or atrophy of reproductive organs. 9. The method for measuring the activity of a crosoprotein enzyme according to claim 9 (claim 10).
更に本発明は、早期老化症状を呈する疾病の診断が、血管内皮機能劣化に起因する疾病の診断であることを特徴とする請求項９記載のクロソ蛋白質酵素活性の測定法（請求項１１）や、血管内皮機能劣化に起因する疾病の診断が、高血圧、動脈硬化、高コレステロール血症、糖尿病、心筋梗塞又は脳梗塞の診断であることを特徴とする請求項１１記載のクロソ蛋白質酵素活性の測定法（請求項１２）や、配列表の配列番号２又は配列番号４に示されるポリペプチド、又は該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルクロニダーゼ活性を有する変異ポリペプチドを用い、生体又は生体細胞中から分離した物質とのβ−グルクロニダーゼ酵素反応を利用して生体又は生体細胞中の酵素基質を検出することを特徴とする生体中のクロソ蛋白質作用物質のスクリーニング方法（請求項１３）や、請求項１３記載のポリペプチド又は変異ポリペプチドを、イムノグロブリンを結合させたキメラポリペプチドとして用いることを特徴とする請求項１３記載の生体中のクロソ蛋白質作用物質のスクリーニング方法（請求項１４）や、イムノグロブリンとしてイムノグロブリンＦｃ領域を用いることを特徴とする請求項１４記載の生体中のクロソ蛋白質作用物質のスクリーニング方法（請求項１５）からなる。 Furthermore, the present invention provides a method for measuring the activity of a crosoprotein enzyme according to claim 9 (claim 11), wherein the diagnosis of a disease exhibiting premature aging symptoms is a diagnosis of a disease caused by vascular endothelial function deterioration. 12. The measurement of a crosoprotein enzyme activity according to claim 11, wherein the diagnosis of a disease caused by vascular endothelial function deterioration is diagnosis of hypertension, arteriosclerosis, hypercholesterolemia, diabetes, myocardial infarction or cerebral infarction. Amino acids in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the method (Claim 12), the polypeptide shown in SEQ ID NO: 2 or 4 in the sequence listing, or the amino acid sequence of the polypeptide Β-glucuronidase enzyme reaction with a substance separated from living organisms or living cells using a mutant polypeptide comprising a sequence and having β-glucuronidase activity A method for screening an active substance of a crosoprotein acting in a living body, wherein an enzyme substrate in a living body or a living cell is detected using the method (claim 13), or the polypeptide or mutant polypeptide according to claim 13, 14. A method for screening an active substance of a crosoprotein in vivo (Claim 14), wherein the immunoglobulin is used as a chimeric polypeptide to which immunoglobulin is bound, or an immunoglobulin Fc region is used as the immunoglobulin. A screening method for a substance acting in the living body according to claim 14 (claim 15).
また本発明は、生体又は生体細胞中の物質とのβ−グルクロニダーゼ酵素反応を利用した生体または生体細胞中の酵素基質の検出が、β−グルクロニダーゼ酵素反応によって生成されるβ−グルクロニドの検出であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか記載の生体中のクロソ蛋白質作用物質のスクリーニング方法（請求項１６）や、生体又は生体細胞中の酵素基質の検出が、天然基質としてのステロイドβ−グルクロニドの検出であることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか記載の生体中のクロソ蛋白質作用物質のスクリーニング方法（請求項１７）や、天然基質としてのステロイドβ−グルクロニドの検出が、天然基質としてのβ−エストラジオール３−β−Ｄグルクロニド、エストロン３−β−Ｄグルクロニド、又はエルトリオール３−β−Ｄグルクロニドの検出であることを特徴とする請求項１７記載の生体中のクロソ蛋白質作用物質のスクリーニング方法（請求項１８）からなる。 Further, in the present invention, detection of an enzyme substrate in a living body or living cell using a β-glucuronidase enzymatic reaction with a substance in the living body or living cell is detection of β-glucuronide generated by the β-glucuronidase enzymatic reaction. A screening method for a substance acting in the body of a crosoprotein according to any one of claims 13 to 15 (claim 16), or detection of an enzyme substrate in a living body or a living cell is a steroid β as a natural substrate. The method for screening an active substance of a crosoprotein acting substance in a living body according to any one of claims 13 to 16, wherein the detection of steroid β-glucuronide as a natural substrate is characterized by detecting glucuronide. Β-estradiol 3-β-D glucuronide, estrone 3-β-D glucuronide or ertri as natural substrate 18. The screening method for an active substance of a crosoprotein in vivo according to claim 17, characterized in that it is detection of all 3-β-D glucuronide (claim 18 ) .
本発明においては、クロソ蛋白質がβ−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）活性を持つことを解明し、該クロソ蛋白質の酵素活性を測定する方法を開発した。また、本発明は、該クロソ蛋白質の酵素活性を測定する方法により、生体中のクロソ遺伝子の発現の状況を検知・測定し、クロソ遺伝子の発現の低下により発症する疾病の診断を行う方法を提供する。更に、本発明は、クロソ蛋白質がβ−グルクロニダーゼ活性を持つことを解明したことによって、クロソ蛋白質が末端にグルクロン酸をもつ分子を切断し、活性化することが示唆されたことにより、動物個体における酵素特異的な基質を推定し、真の基質の同定とその情報に基づく生理活性物質の解析を行うことが可能となり、この知見により、生体中のクロソ蛋白質作用物質のスクリーニングを行う方法を提供する。 In the present invention, it was elucidated that the crosoprotein has β-glucuronidase activity, and a method for measuring the enzyme activity of the crosoprotein was developed. In addition, the present invention provides a method for diagnosing a disease caused by a decrease in the expression of Kuroso gene by detecting and measuring the expression status of Kuroso gene in the living body by a method for measuring the enzyme activity of said Kuroso protein. To do. Furthermore, the present invention revealed that crosoprotein has β-glucuronidase activity, and it was suggested that crosoprotein cleaves a molecule having glucuronic acid at its terminal and activates it. It is possible to estimate an enzyme-specific substrate, identify a true substrate, and analyze a physiologically active substance based on the information, and this knowledge provides a method for screening an active substance of a crosoprotein in vivo. .
本発明においては、本発明のスクリーニング方法を用いて、数多くの天然β−グルクルニドをスクリーニングし、β−エストラジオール３−β−Ｄグルクロニド（b-estradiol 3-b-D-glucuronide）、エストロン３βＤグルクロニド（estrone 3-b-D-glucuronide）、及びエルトリオール３βＤグルクロニド（estriol 3-b-D-glucuronide）などのステロイドβ−グルクロニドが、クロソ蛋白質によって加水分解されることを見い出した。
また、本発明においては、本発明のクロソ蛋白質の酵素活性を測定する方法を用いて、被検物質を投与した生体でのクロソ蛋白質の酵素活性の増減の状況を把握し、このことによってクロソ蛋白質機能活性化物質のスクリーニング、更には、早期老化症状を呈する疾病の予防又は治療薬のスクリーニングを行う方法を提供する。
In the present invention, a number of natural β-glucuronides are screened using the screening method of the present invention, and β-estradiol 3-bD-glucuronide, estrone 3βD glucuronide (estrone 3 It has been found that steroidal β-glucuronides such as -bD-glucuronide) and ertriol 3-bD-glucuronide are hydrolyzed by crosoproteins.
Further, in the present invention, the method for measuring the enzyme activity of the crosoprotein of the present invention is used to grasp the increase / decrease state of the enzyme activity of the crosoprotein in the living body to which the test substance is administered. Provided is a method for screening for a function activator, and further for screening for a prophylactic or therapeutic drug for a disease presenting premature aging symptoms.
本発明は、クロソ蛋白質のβ−グルクロニダーゼ活性に基づく特異酵素活性を測定してクロソ蛋白質酵素活性を測定することよりなる。該クロソ蛋白質のβ−グルクロニダーゼ活性に基づく特異酵素活性の測定は、β−グルクロニド結合を有する酵素基質を用いて、行うことができる。該酵素基質を用いたβ−グルクロニダーゼ活性の測定は、それ自体公知の方法を用いることができる。
β−グルクロニダーゼ活性の公知の測定方法としては、発色基質を用いて、β−グルクロニダーゼの酵素反応の結果、遊離する発色物質を比色測定する方法を挙げることができる。例えば、発色基質としてｐ−ニトロフェニルグルクロニドを用いた比色測定法（赤堀四郎、沖中重雄監修「臨床酵素学」朝倉書店、３９７−３９８）を挙げることができる。発色基質としては、その他に、フェノールフタレイン、フェニル、ｐ−ヒドロキシフェニル、ｐ−クロロフェニル、８−ヒドロキシキノリン、１−Ｏ−ヒドロキシフェニル−アゾナフトール、６−ブロム−２−ナフチルなどの発色基を有するグルクロニド等を用いることができる。
The present invention comprises measuring the specific enzyme activity based on the β-glucuronidase activity of the croso protein to measure the croso protein enzyme activity. The specific enzyme activity based on the β-glucuronidase activity of the croso protein can be measured using an enzyme substrate having a β-glucuronide bond. For the measurement of β-glucuronidase activity using the enzyme substrate, a method known per se can be used.
As a known method for measuring β-glucuronidase activity, there can be mentioned a method for colorimetrically measuring a chromogenic substance released as a result of an enzymatic reaction of β-glucuronidase using a chromogenic substrate. For example, a colorimetric measurement method using p-nitrophenyl glucuronide as a chromogenic substrate (Shiro Akahori, Shigeo Okinanaka “Clinical Enzymology” Asakura Shoten, 397-398) can be mentioned. Other chromogenic substrates such as phenolphthalein, phenyl, p-hydroxyphenyl, p-chlorophenyl, 8-hydroxyquinoline, 1-O-hydroxyphenyl-azonaphthol, 6-bromo-2-naphthyl, etc. The glucuronide etc. which it has can be used.
望ましいβ−グルクロニダーゼ活性の測定方法として、蛍光基質を用いて測定する方法が挙げられる。蛍光測定方法として、４−メチルウンべリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを蛍光基質に用いる方法を挙げることができる（J. Biol. Chem., 254, 14, 6588-6597, 1979）。また、生体内基質である可能性が示唆されるβ−グルクロニド結合を有するフラボノイド又はアルカロイドのような低分子量分子を、望ましい酵素基質として用いることができる。更に、近年、迅速かつ高感度な測定方法として開発されたルシフェリン−ルシフエラーゼ発光反応を利用する測定方法を用いることができる。例えば、Ｄ−ルシフェリン−Ｏ−β−Ｄ−グルクロニドのような発光基質を用いた測定方法を用いて測定することができる（特開２０００−２７０８９４号公報）。該β−グルクロニダーゼ活性の測定方法を用いて、クロソ蛋白質の酵素活性の測定を行うには、それ自体既に公知の手法及び装置を使用して、実施することができる。 A desirable method for measuring β-glucuronidase activity is a method using a fluorescent substrate. An example of the fluorescence measurement method is a method using 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide as a fluorescent substrate (J. Biol. Chem., 254, 14, 6588-6597, 1979). In addition, a low molecular weight molecule such as a flavonoid or alkaloid having a β-glucuronide bond suggested to be an in vivo substrate can be used as a desired enzyme substrate. Furthermore, in recent years, a measurement method using a luciferin-luciferase luminescence reaction developed as a rapid and highly sensitive measurement method can be used. For example, it can be measured using a measuring method using a luminescent substrate such as D-luciferin-O-β-D-glucuronide (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-270894). In order to measure the enzyme activity of the crosoprotein using the method for measuring β-glucuronidase activity, it can be carried out using a technique and apparatus which are already known per se.
本発明においては、クロソ蛋白質のβ−グルクロニダーゼ活性に基づく特異酵素活性を測定して、生体又は生体細胞中のクロソ遺伝子の発現に基づくクロソ蛋白質の生成を測定することができる。クロソ遺伝子の発現の低下により、寿命の短縮、各種臓器の石灰化、動脈硬化又は生殖臓器の萎縮に係わる疾病のような早期老化症状を呈する疾病を発症することが知られており、また、クロソ遺伝子の発現の低下により、高血圧、動脈硬化、高コレステロール血症、糖尿病、心筋梗塞又は脳梗塞のような血管内皮機能劣化に起因する疾病を発症することが知られている。したがって、本発明のクロソ蛋白質酵素活性の測定法を用いて、クロソ蛋白質生成の検知・測定を行うことにより、生体又は生体細胞中のクロソ遺伝子の発現の状況を検知・測定し、これらの疾病の診断を行うことができる。生体又は生体細胞中のクロソ蛋白質生成の測定を行うには、生体中より、適宜の方法により試料を採取し、該試料及び採取した生体細胞に、本発明のクロソ蛋白質酵素活性の測定法を適用して、クロソ蛋白質の生成を測定することができる。 In the present invention, the specific enzyme activity based on the β-glucuronidase activity of the croso protein can be measured, and the production of the croso protein based on the expression of the croso gene in the living body or living cells can be measured. Decreased expression of the Kuroso gene is known to cause diseases that exhibit premature aging symptoms such as diseases related to shortening of life span, calcification of various organs, arteriosclerosis or atrophy of reproductive organs. It is known that a decrease in gene expression causes diseases caused by vascular endothelial function deterioration such as hypertension, arteriosclerosis, hypercholesterolemia, diabetes, myocardial infarction or cerebral infarction. Therefore, by using the method for measuring the activity of the crosoprotein enzyme of the present invention, by detecting / measuring the production of crosoprotein, the state of expression of the croso gene in living organisms or living cells can be detected / measured, and these diseases can be detected. Diagnosis can be made. In order to measure the production of crosoprotein in a living body or a living cell, a sample is collected from the living body by an appropriate method, and the method for measuring the activity of crosoprotein enzyme of the present invention is applied to the sample and the collected living cell. Thus, the production of Kuroso protein can be measured.
また、本発明においては、クロソ蛋白質のポリペプチドを用い、該ポリペプチドと、生体又は生体細胞中の物質とのβ−グルクロニダーゼ酵素反応を利用して、生体又は生体細胞中の酵素基質を検出することにより生体中のクロソ蛋白質作用物質のスクリーニングを行うことができる。本発明で用いられるクロソ蛋白質のポリペプチド及びその遺伝子は既に取得され、その構造が明らかにされている（Nature 390, 6655, 45-51, 1997、Biochem. Biophys. Res. Commun. 242, 3, 626-630, 1998）。マウスのクロソ蛋白質及び該クロソ蛋白質をコードする遺伝子のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩのデーターベースに、アクセッション番号 ＳＥＧ＿ＡＢ０１００８９Ｓとして登録されており、該アクセッション番号により検索することができる。また、ヒトのクロソ蛋白質及び該クロソ蛋白質をコードする遺伝子のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩのデーターベースに、アクセッション番号 ＡＢ００９６６６及びＡＢ００９６６７として登録されており、該アクセッション番号により検索することができる。 In the present invention, a polypeptide of crosoprotein is used, and an enzyme substrate in a living body or a living cell is detected using a β-glucuronidase enzyme reaction between the polypeptide and a substance in the living body or living cell. By doing so, screening of the active substance of crosoprotein in the living body can be performed. The polypeptide of the croso protein used in the present invention and the gene thereof have already been obtained and the structure thereof has been elucidated (Nature 390, 6655, 45-51, 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 242, 3, 626-630, 1998). The amino acid sequence and DNA sequence of the mouse crosoprotein and the gene encoding the crosoprotein are registered in the NCBI database as accession number SEG_AB010089S, and can be searched by the accession number. In addition, the amino acid sequence and DNA sequence of human black protein and the gene encoding the black protein are registered as accession numbers AB009666 and AB009667 in the NCBI database, and can be searched by the accession number. .
これらのクロソ蛋白質をコードする遺伝子は、エクソン１〜５の５つのエクソン部を有し、該エクソン部によってコードされるクロソ蛋白質のポリペプチドのうち、β−グルコシダーゼと構造的に相同性を有する細胞外ドメイン部分は、ヒトの遺伝子については、ＮＣＢＩのデータベースに登録されているアクセッション番号：ＡＢ００９６６６ エクソン１の２０８１〜２８９９番目、ＡＢ００９６６７ エクソン２の１２４１８〜１２９２８番目、エクソン３の１３６９８〜１３９６６番目、及びエクソン４の１９３２２〜１９４１７番目によってコードされる部分である（配列表の配列番号１、そのアミノ酸配列を配列番号２に示した。）。また、マウスの遺伝子については、ＮＣＢＩのデータベースに登録されているアクセッション番号：ＳＥＧ＿ＡＢ０１００８９Ｓ１ エクソン１の６８７〜１５１１番目、ＳＥＧ＿ＡＢ０１００８９Ｓ２ エクソン２の１４１〜６５１番目、エクソン３の２０３４〜２３０２番目、及びエクソン４の７９０６〜８００１番目によってコードされる部分である（配列表の配列番号３、そのアミノ酸配列を配列番号４に示した。）。
本発明においては、該クロソ蛋白質のポリペプチドを調製し、該ポリペプチドと、生体又は生体細胞中の物質とのβ−グルクロニダーゼ酵素反応を利用し、生体又は生体細胞中の酵素基質の検出を行うことができる。本発明において用いられるクロソ蛋白質のポリペプチドの調製は、この分野で通常用いられている遺伝子工学的手法を用いて行うことができる（ＷＯ９８／２９５４４）。
The gene encoding these crosoproteins has five exon parts of exons 1 to 5, and among the polypeptides of the crosoprotein encoded by the exon parts, cells having structural homology with β-glucosidase The outer domain part includes the accession numbers registered in the NCBI database for human genes: AB009666, exon 1, 2081-2899, AB009667 exon 2, 12418-12929, exon 3, 13698-13966, and It is a portion encoded by the 19322th to 19417th positions of exon 4 (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2). As for mouse genes, accession numbers registered in the NCBI database: SEG_AB010089S1 Exon 1 687-1511, SEG_AB010089S2 Exon 2 141-651, Exon 3 2034-2302, Exon 4 This is a portion encoded by 7906 to 8001 (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4).
In the present invention, a polypeptide of the crosoprotein is prepared, and an enzyme substrate in the living body or living cell is detected using a β-glucuronidase enzyme reaction between the polypeptide and a substance in the living body or living cell. be able to. Preparation of the polypeptide of crosoprotein used in the present invention can be carried out using genetic engineering techniques usually used in this field (WO 98/29544).
また、本発明における、クロソ蛋白質酵素の生体又は生体細胞中の酵素基質の検出には、クロソ蛋白質の変異ポリペプチドを用いることができる。該変異ポリペプチドとしては、該配列表の配列番号２又は配列番号４に示されるポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−グルクロニダーゼ活性を有する変異ポリペプチドが挙げられる。該変異ポリペプチドの調製は、この分野で通常用いられている遺伝子工学的手法を用いて行うことができる（ＷＯ９８／２９５４４）。該変異ポリペプチドを用い、該変異ポリペプチドと生体または生体細胞中の物質とのβ−グルクロニダーゼ酵素反応を利用して、該酵素の酵素基質を検出し、生体中のクロソ蛋白質作用物質のスクリーニングを行う。 In the present invention, a mutant polypeptide of a crosoprotein can be used for the detection of an enzyme substrate in a living organism or a living cell of a crosoprotein enzyme. The mutant polypeptide includes an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the polypeptide shown in SEQ ID NO: 2 or 4 in the sequence listing, and β -Mutant polypeptides having glucuronidase activity. The mutant polypeptide can be prepared using a genetic engineering technique usually used in this field (WO 98/29544). Using the mutant polypeptide, utilizing the β-glucuronidase enzyme reaction between the mutant polypeptide and a substance in a living body or a living cell, the enzyme substrate of the enzyme is detected, and screening of a substance acting on a crosoprotein in the living body is performed. Do.
該生体中のクロソ蛋白質作用物質をスクリーニングするに際して、クロソ蛋白質のポリペプチド或いはその変異ポリペプチドの生体又は生体細胞中での安定性を保持するために、イムノグロブリンＦｃ領域のようなイムノグロブリンを結合させたキメラポリペプチドとして用いることができる。また、クロソ蛋白質のポリペプチドやその変異ポリペプチド或いはキメラポリペプチドを生体又は生体細胞中に導入するには、該ポリペプチドをコードする遺伝子の形で、生体又は生体細胞中へ導入することができる（ＷＯ００／２７８８５）。生体または生体細胞中の物質とクロソ蛋白質のβ−グルクロニダーゼ活性との酵素反応を利用した酵素基質の検出は、β−グルクロニダーゼ酵素反応によって生成されるβ−グルクロニドの検出によって行うことができる。 When screening for a crosoprotein active substance in the living body, an immunoglobulin such as an immunoglobulin Fc region is bound in order to maintain the stability of the polypeptide of the crosoprotein or its mutant polypeptide in the living body or living cells. It can be used as a chimeric polypeptide. In addition, in order to introduce a polypeptide of crosoprotein, a mutant polypeptide thereof or a chimeric polypeptide into a living body or a living cell, it can be introduced into the living body or living cell in the form of a gene encoding the polypeptide. (WO00 / 27885). Detection of an enzyme substrate using an enzyme reaction between a substance in a living body or a living cell and β-glucuronidase activity of a croso protein can be performed by detecting β-glucuronide produced by the β-glucuronidase enzyme reaction.
本発明は、本発明のクロソ蛋白質酵素活性の測定法を用いてクロソ蛋白質機能活性化物質のスクリーニングを行うことができる。すなわち、本発明のクロソ蛋白質酵素活性の測定法を、真の基質に作用する新規薬剤の開発へと発展させるために、本発明のクロソ蛋白質の酵素活性測定法を用いて、被検物質を投与した生体でのクロソ蛋白質の酵素活性の増減の状況を把握し、このことによってクロソ蛋白質機能活性化物質のスクリーニング、更には、早期老化症状を呈する疾病の予防又は治療薬のスクリーニングを行うことができる。該スクリーニング方法を行うには、クロソ遺伝子欠損モデル動物又は該動物由来の細胞に、被検物質を投与し、本発明のクロソ蛋白質酵素活性の測定法により、クロソ蛋白質酵素活性を測定し、生体又は生体細胞中でのクロソ遺伝子の発現の状況を検知・測定することにより行うことができる。クロソ遺伝子欠損モデル動物は、公知の方法により、モデル動物のクロソ遺伝子をノックアウトすることによって作製することができるが、既に公知のクロソマウスのような動物を用いることができる。該クロソ蛋白質機能活性化物質のスクリーニングにより、クロソ遺伝子の発現の低下により発症する疾病である早期老化症状を呈する疾病の予防又は治療薬のスクリーニングを行うことができる。 The present invention can be used to screen for a substance that activates the function of crosoprotein using the method for measuring the activity of the crosoprotein enzyme of the present invention. That is, in order to develop the method for measuring the enzyme activity of the crosoprotein of the present invention into the development of a novel drug that acts on a true substrate, the test substance is administered using the method for measuring the enzyme activity of the enzyme of the present invention. It is possible to grasp the state of increase / decrease of the enzyme activity of crosoprotein in the living body, and to screen for a substance that activates crosoprotein function, and further, to screen for a preventive or therapeutic agent for a disease exhibiting premature aging symptoms. . In order to perform the screening method, a test substance is administered to a model animal deficient in croso gene or a cell derived from the animal, and the activity of crosoprotein enzyme is measured by the method for measuring the activity of crosoprotein enzyme of the present invention. This can be done by detecting and measuring the status of the expression of the Kuroso gene in living cells. Although the Kuroso gene-deficient model animal can be prepared by knocking out the Kuroso gene of the model animal by a known method, an animal such as the already-known Kuroso mouse can be used. By screening for the substance that activates the function of the crosoprotein, it is possible to screen for preventive or therapeutic agents for diseases that exhibit premature aging symptoms, which are diseases caused by a decrease in the expression of the croso gene.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
＜クロソ蛋白質の機能の解明＞
本実施例においては、クロソ蛋白質の機能を明らかにするために、組換え型クロソ蛋白質を作製し、該蛋白質をβ−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）活性測定等に用いられている人工基質と反応させることで、クロソ蛋白質の酵素活性を検証した。
<Elucidation of the function of Kuroso protein>
In this example, in order to clarify the function of the Kuroso protein, a recombinant Kuroso protein is prepared, and this protein is reacted with an artificial substrate used for measuring β-glucosidase activity or the like. Thus, the enzyme activity of the croso protein was verified.
［材料及び方法］
（発現ベクターの構築）
マウスクロソ蛋白質及び、該蛋白質がコードされているＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩのデータベースに登録されている（アクセッション番号：ＳＥＧ＿ＡＢ０１００８９Ｓ）。また、マウスクロソ蛋白質の膜貫通領域は、クロソＤＮＡエクソン部分であるエクソン１〜５のうちのエクソン５に存在しており、ＮＣＢＩに登録されているＤＮＡ配列（アクセッション番号：ＳＥＧ＿ＡＢ０１００８９Ｓ３）の第８９５番目〜９６４番目（７０ｂｐ）である。
[Materials and methods]
(Construction of expression vector)
The mouse croso protein and the DNA sequence encoding the protein are registered in the NCBI database (accession number: SEG_AB010089S). In addition, the transmembrane region of mouse croso protein is present in exon 5 of exons 1 to 5 which is a croso DNA exon part, and the 895th position of the DNA sequence (accession number: SEG_AB010089S3) registered in NCBI. It is -964th (70 bp).
組換え型蛋白質を得るために、クロソ（Klotho）膜貫通型領域よりＣ端側（マウスクロソＤＮＡエクソン５部位の第８２０番目以降）を削除し、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域を結合させたクロソ−Ｆｃ領域融合キメラ蛋白を発現するベクターを作製した。また、コントロールとしてラットLactose-Philorizin hydrolase（ＬＰＨ：ＮＣＢＩアクセッション番号：Ｘ５６７４７）の膜貫通領域（ラットＬＰＨ ＤＮＡの第５６３２番目〜５６９５番目：６４ｂｐ）よりＣ端側（ラットＬＰＨ ＤＮＡの第５６３２番目以降）を削除し、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域を結合させたＬＰＨ−Ｆｃ領域融合キメラ蛋白を発現するベクターを作製した。なお、ラットＬＰＨは前駆体領域を含み、融合キメラ蛋白質の作製には、ラットＬＰＨ ＤＮＡの第２５４８番目〜５６３２番目（３０８５ｂｐ）の配列を用いた。 In order to obtain a recombinant protein, the C-terminal side of the Klotho transmembrane region (the 820th and subsequent positions of the mouse croso DNA exon 5 site) is deleted, and a croso-Fc region fusion chimera in which a human IgG1 Fc region is bound. A vector expressing the protein was prepared. In addition, as a control, the transmembrane region of rat Lactose-Philorizin hydrolase (LPH: NCBI accession number: X56747) (the 5632th to 5695th of the rat LPH DNA: 64 bp) from the C-terminal side (the 5632th and later of the rat LPH DNA) ) Was deleted, and a vector expressing an LPH-Fc region fusion chimeric protein to which a human IgG1 Fc region was bound was prepared. Rat LPH contains a precursor region, and the sequence from the 2548th to 5632th (3085 bp) of rat LPH DNA was used for the production of a fusion chimeric protein.
次に、それぞれのｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅し、これをベクター構築に用いた。なお、ＰＣＲに用いたオリゴプライマー（国際試薬株式会社に合成を依頼）を、以下の表１に示した。 Next, DNA fragments were amplified by PCR using each cDNA as a template, and this was used for vector construction. The oligo primers used for PCR (commissioned from International Reagent Co., Ltd.) are shown in Table 1 below.
（ＫＬ−Ｆｃベクター（ＫＬＦｃ／ｐＹＴ）の構築）
全長型マウスクロソｃＤＮＡから制限酵素を用いてEco RI-Xba I断片を切り出し、これをＰＳＰ７２ベクターに挿入し、ＰＳＰ７２−ＫＬ fullを作製した。ＰＳＰ７２−ＫＬ−ＥＰ（ｍＫＬ−Ｓ１、ｍＫＬ−ＡＳ１由来のＰＣＲ断片）より制限酵素を用いてEco RI-Pst I断片を切り出し、ＰＳＰ７２−ＫＬのEco RI-Pst Iサイト間へ挿入し、ＰＳＰ７２−ＫＬ full2を作製した。Fsp I-Bam HI断片（ｍＫＬ−Ｓ２、ｍＫＬ−ＡＳ２由来ＰＣＲ断片）をＰＳＰ７２−ＫＬ full2の同サイトへ挿入し、ＰＳＰ７２−ＫＬ（−ＴＭ）を得た。Ｆｃ断片（Bam HI-Xba I）をＰＳＰ７２−ＫＬ（−ＴＭ）の同サイトへ挿入し、ＰＳＰ７２−ＫＬＦｃを得た。ＰＳＰ７２−ＫＬＦｃをXho Iで消化し、T4 DNA polymerase（TAKARA社より入手）で平滑化した後、Eco RVで消化しＫＬＦｃ断片を切り出した。これを、Eco RVで消化し、アルカリホスファターゼ(TAKARA社より入手）で脱リン酸化処理した部位へ挿入し、順方向のものを選び、ＫＬＦｃ／pYTとした。
(Construction of KL-Fc vector (KLFc / pYT))
An Eco RI-Xba I fragment was excised from the full-length mouse croso cDNA using a restriction enzyme and inserted into a PSP72 vector to prepare PSP72-KL full. An Eco RI-Pst I fragment was excised from PSP72-KL-EP (a PCR fragment derived from mKL-S1, mKL-AS1) using a restriction enzyme, inserted between the Eco RI-Pst I sites of PSP72-KL, and PSP72- KL full2 was produced. The Fsp I-Bam HI fragment (mKL-S2, mKL-AS2-derived PCR fragment) was inserted into the same site of PSP72-KL full2 to obtain PSP72-KL (-TM). The Fc fragment (Bam HI-Xba I) was inserted into the same site of PSP72-KL (-TM) to obtain PSP72-KLFc. PSP72-KLFc was digested with Xho I, blunted with T4 DNA polymerase (obtained from TAKARA), and then digested with Eco RV to cut out the KLFc fragment. This was digested with Eco RV and inserted into a site dephosphorylated with alkaline phosphatase (obtained from TAKARA), and the forward one was selected to obtain KLFc / pYT.
（ＬＰＨ−Ｆｃベクター（ＬＰＨ−Ｆｃ／pcDNA3）の構築）
pS34Tベクター（ＬＰＨβ領域に相当；Jean-Noel Frenud氏より入手）より、Kpn I-Acc IIIを切り出した。予めＰＣＲ断片（ＬＰＨ−Ｓ１〜ＬＰＨ−ＡＳ１由来）が挿入されているpBlueScript KS+（stratagene社より購入）のKpn I-Acc IIIサイトへ挿入し、pBSII／ＬＰＨ（−ＴＭ）を得た。Ｆｃ断片（Bam HI-Xba I）をpcDNA3（Invitrogen社より入手）のBam HI-Xba Iサイトへ導入した。このベクターに、pBSII／ＬＰＨ（−ＴＭ）より切り出したKpn I-Acc III断片をKpn I- Bam HIサイトへ挿入し、ＬＰＨ−Ｆｃ／pcDNA3を得た。
(Construction of LPH-Fc vector (LPH-Fc / pcDNA3))
Kpn I-Acc III was excised from pS34T vector (corresponding to LPHβ region; obtained from Jean-Noel Frenud). The DNA fragment was inserted into the Kpn I-Acc III site of pBlueScript KS + (purchased from Stratagene) into which the PCR fragment (LPH-S1 to LPH-AS1 was previously inserted) to obtain pBSII / LPH (-TM). The Fc fragment (Bam HI-Xba I) was introduced into the Bam HI-Xba I site of pcDNA3 (obtained from Invitrogen). A Kpn I-Acc III fragment excised from pBSII / LPH (-TM) was inserted into this vector into the Kpn I-Bam HI site to obtain LPH-Fc / pcDNA3.
（細胞への遺伝子導入）
ＣＨＯ細胞を次のような条件で培養した。ＭＥＭα（Sigma社より購入）、１％ＦＣＳ（BioWest社より購入）、１％ penicillin/streptmycin（Sigma社より購入）、２ｍＭ L-glutamine（Sigma）。ＣＨＯ細胞にＫＬＦｃまたはＬＰＨＦｃを安定発現させるためにLipofectAMINE plus（Invitrogen社より購入）を使って、４０μｇのＤＮＡを１×１０8個／１０ｃｍ plateの細胞に、導入した。２日間培養後、ＫＬＦｃに関しては２５０μｇ／ｍｌ Hygromicin（Sigma社より購入）で選択した後、１〜１０ｍＭ mthotrexate（Sigma社より購入）で引き続き選択を行った。ＬＰＨＦｃに関しては、１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Invitrogen社より購入）で選択を行った。
(Gene transfer into cells)
CHO cells were cultured under the following conditions. MEMα (purchased from Sigma), 1% FCS (purchased from BioWest), 1% penicillin / streptmycin (purchased from Sigma), 2 mM L-glutamine (Sigma). Using LipofectAMINE plus (Invitrogen Corporation purchased from) to stabilize express KLFc or LPHFc in CHO cells, the 40μg of DNA into cells of 1 × 10 8 cells / 10 cm plate, was introduced. After culturing for 2 days, KLFc was selected with 250 μg / ml Hygromicin (purchased from Sigma), and subsequently selected with 1 to 10 mM mthotrexate (purchased from Sigma). LPHFc was selected with 1 mg / ml G418 (purchased from Invitrogen).
（組換え型蛋白質の精製）
ＫＬＦｃ及びＬＰＨＦｃを安定発現するＣＨＯ細胞をＭＥＭα培地（０．５％ultra low IgG fetal bovain serum、１％ penicillin/streptmycin、２ｍＭ L-glutamineを含む）中で３日間培養した。その後、培養液を回収し、遠心（１５，０００ｇ、６０分、４℃）及びろ過フィルター（Sterivac-GP10，０．２２μｍ；Millipore社より購入）によって死細胞等の不要物を取り除いた。その後、二段階にわたって限外ろ過（viva flow 50及びviva spin 20, poresize 100kDa；sartorius）を行った。得られた濃縮培養上清中のＫＬＦｃ及びＬＰＨＦｃは、ＥＬＩＳＡで検定した。ＥＬＩＳＡは、次のように行った。ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（American Qualex社より購入）を結合させた９６well plate（Falcon社より購入）を作製した。これらに、段階希釈した濃縮上清を入れて、室温にて反応させた。一次抗体としてＨＲＰの結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（BIOSOUCE社より購入）、発色試薬o-phenylendoamine dihydrochloride（ＯＰＤ；Sigma社より購入）、発色反応停止試薬 ４Ｎ Ｈ2ＳＯ4を順に加え、最後にmicroplate reader（Bio Rad社より購入）で検出した。標準物質には、精製ヒトＩｇＧ（ATENS RESEARCH AND TECHNOLOGY社より購入した）を用いた。
(Purification of recombinant protein)
CHO cells stably expressing KLFc and LPHFc were cultured in MEMα medium (containing 0.5% ultra low IgG fetal bovain serum, 1% penicillin / streptmycin, 2 mM L-glutamine) for 3 days. Thereafter, the culture solution was collected, and unnecessary substances such as dead cells were removed by centrifugation (15,000 g, 60 minutes, 4 ° C.) and a filtration filter (Sterivac-GP10, 0.22 μm; purchased from Millipore). Thereafter, ultrafiltration (viva flow 50 and viva spin 20, poresize 100 kDa; sartorius) was performed in two stages. KLFc and LPHFc in the obtained concentrated culture supernatant were assayed by ELISA. The ELISA was performed as follows. A 96-well plate (purchased from Falcon) to which a goat anti-human IgG antibody (purchased from American Qualex) was bound was prepared. A serially diluted concentrated supernatant was added to these and reacted at room temperature. HRP-conjugated goat anti-human IgG antibody (purchased from BIOSOUCE), coloring reagent o-phenylendoamine dihydrochloride (OPD; purchased from Sigma), coloring reaction stopping reagent 4N H 2 SO 4 were added in this order as the primary antibody, and finally microplate It was detected with a reader (purchased from Bio Rad). As a standard substance, purified human IgG (purchased from ATENS RESEARCH AND TECHNOLOGY) was used.
濃縮培養上清は、Sepharose beads（Amersham Pharmacia Biotech社より購入）を用いて２回前処理（非特異的なバックグラウンドを除く）を行った。濃縮培養上清を新チューブに移した後、rProteinA fast flow beads（Amersham Pharmacia Biotech社より購入）を加えた。４℃で２時間以上結合反応を行った後、ビーズを０．１Ｍ クエン酸ナトリウムバッファー〔０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％Tween20及びプロテアーゼ阻害剤（complete, BOERINGER MANNHEIM社より購入）を含む〕で５回洗った。その後、０．１Ｍ クエン酸ナトリウムバッファーで２回洗い、これを酵素活性測定実験で使用した。 The concentrated culture supernatant was pretreated twice (excluding non-specific background) using Sepharose beads (purchased from Amersham Pharmacia Biotech). After the concentrated culture supernatant was transferred to a new tube, rProteinA fast flow beads (purchased from Amersham Pharmacia Biotech) were added. After performing the binding reaction at 4 ° C. for 2 hours or more, the beads were added with 0.1 M sodium citrate buffer (0.2 M NaCl, 0.01% Tween 20 and protease inhibitor (complete, purchased from BOERINGER MANNHEIM)). Washed 5 times. Then, it was washed twice with 0.1 M sodium citrate buffer and used in the enzyme activity measurement experiment.
（ウエスタンブロット）
濃縮培養上清は、Sepharose beads（Amersham Pharmacia Biotech社より購入）を用いて２回前処理（非特異的なバックグラウンドを除く）を行った。濃縮培養上清を新チューブに移した後、rProteinA fast flow beads（Amersham Pharmacia Biotech社より購入）を加えた。４℃で２時間以上結合反応を行った後、ビーズを０．１Ｍ クエン酸ナトリウムバッファー〔０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Tween20及びプロテアーゼ阻害剤（complete, BOERINGER MANNHEIM社より購入）を含む〕で５回洗った。その後、０．１Ｍ クエン酸ナトリウムバッファーで２回洗い、これを酵素活性測定実験で使用した。
(Western blot)
The concentrated culture supernatant was pretreated twice (excluding non-specific background) using Sepharose beads (purchased from Amersham Pharmacia Biotech). After the concentrated culture supernatant was transferred to a new tube, rProteinA fast flow beads (purchased from Amersham Pharmacia Biotech) were added. After the binding reaction at 4 ° C. for 2 hours or more, the beads were added with 0.1 M sodium citrate buffer (0.2 M NaCl, 0.01% Tween 20 and protease inhibitor (complete, purchased from BOERINGER MANNHEIM)). Washed 5 times. Then, it was washed twice with 0.1 M sodium citrate buffer and used in the enzyme activity measurement experiment.
（ゲル染色）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、０．０５％ SYPRO Orange（Bio Rad社より購入）を含む７．５％酢酸中で１６時間染色した。染色したゲルは、７．５％酢酸及び滅菌した脱イオン水で洗った後、ＳＴＯＲＭ（blue filter使用；molecular dynamics）にて解析した。
(Gel staining)
After SDS-PAGE, staining was performed in 7.5% acetic acid containing 0.05% SYPRO Orange (purchased from Bio Rad) for 16 hours. The stained gel was washed with 7.5% acetic acid and sterilized deionized water, and then analyzed by STORM (using blue filter; molecular dynamics).
（酵素アッセイ）
基本条件を以下に示す。
基質として０．５ｍＭ 4-methylumberifel-glycosides（グルクロニド、グルコシド、ガラクトシド、Ｎ−アセチル−グルコサミニド、Ｎ−アセチル−ガラクトサミニド、Ｄ−フコシド、マンノシド）（４Ｍｕ−glucuronide）を用いた。バッファーは、０．１Ｍ クエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Tween20を用い、クロソとして１０μｇ ＫＬＦｃを、ネガティブコントロールとして、１０μｇのヒトＩｇＧ１をＣＨＯ由来の培養上清と混ぜて用いた。また、コントロールとしてラットＬＰＨＦｃを用いた。β−グルコシダーゼ（beta-glucosidase）は、アーモンド由来β−グルコシダーゼ（Sigma社より購入）、及びウシ肝臓由来β−グルコシダーゼ（Sigma社より購入）を用いた。反応温度は３７℃、反応時間は０〜３時間の条件下で実験を行った。これらの実験は、１００μｇの反応系で、９６well plateを用いて酵素反応を行った。反応のモニターは、Multilabel counter（ARVO sx；PerkinElmer社より購入）を用い、蛍光強度（emission；４７０ｎｍ、excitation ３６０ｎｍ）を測定することで行った。酵素活性は、得られた蛍光強度を反応生成物濃度に換算して表した。これは、既知濃度の4-Methylumbelliferoneから検量線を作成し換算した。
(Enzyme assay)
The basic conditions are shown below.
As a substrate, 0.5 mM 4-methylumberifel-glycosides (glucuronide, glucoside, galactoside, N-acetyl-glucosaminide, N-acetyl-galactosaminide, D-fucoside, mannoside) (4Mu-glucuronide) was used. As a buffer, 0.1 M sodium citrate (pH 5.5), 0.05 M NaCl, 0.01% Tween 20 was used, 10 μg KLFc as a closo, 10 μg human IgG1 as a negative control, and a culture supernatant derived from CHO. Used by mixing. Rat LPHFc was used as a control. As β-glucosidase, almond-derived β-glucosidase (purchased from Sigma) and bovine liver-derived β-glucosidase (purchased from Sigma) were used. The experiment was conducted under the conditions of a reaction temperature of 37 ° C. and a reaction time of 0 to 3 hours. In these experiments, an enzyme reaction was performed using a 96-well plate in a 100 μg reaction system. The reaction was monitored by measuring fluorescence intensity (emission: 470 nm, excitation 360 nm) using a Multilabel counter (ARVO sx; purchased from PerkinElmer). The enzyme activity was expressed by converting the obtained fluorescence intensity into a reaction product concentration. This was converted by creating a calibration curve from 4-Methylumbelliferone at a known concentration.
（速度定数の計算）
基質は、０．０１２５ｍＭから３．２ｍＭの範囲で系列希釈を行った。ＫＬＦｃは、２０μｇ用いた。３０分ごとに、一部サンプリングを行い、０．２５Ｍ Ｎａ2ＣＯ3を加えることで反応を停止した。これらのサンプルを、Multilabel counterを用いて、蛍光強度（emission：４７０ｎｍ、excitation：３６０ｎｍ）を測定した。酵素活性は、既知濃度の4-Methylumbelliferoneを基にして、得られた蛍光強度を反応生成物に換算して表示した。得られた結果をLineweaver-Burkプロットに従い、Ｋｍ値及びＶｍａｘ値を計算した。
(Calculation of speed constant)
The substrate was serially diluted in the range of 0.0125 mM to 3.2 mM. 20 μg of KLFc was used. A partial sampling was performed every 30 minutes and the reaction was stopped by adding 0.25M Na 2 CO 3 . These samples were measured for fluorescence intensity (emission: 470 nm, excitation: 360 nm) using a Multilabel counter. The enzyme activity was displayed by converting the obtained fluorescence intensity into a reaction product based on a known concentration of 4-Methylumbelliferone. Based on the obtained results, Km value and Vmax value were calculated according to the Lineweaver-Burk plot.
（ｐＨの影響）
基本条件に基づき、ｐＨ４．５〜６．０までは、０．１Ｍ クエン酸ナトリウムバッファーを、ｐＨ６．０〜８．０までは、０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファーを用いて、クロソ蛋白質のｐＨによる影響を調べた。
(Effect of pH)
Based on basic conditions, 0.1M sodium citrate buffer is used for pH 4.5 to 6.0, and 0.1M sodium phosphate buffer is used for pH 6.0 to 8.0, depending on the pH of the croso protein. The effect was investigated.
（阻害剤の影響）
市販されているβ−グルコシダーゼ及びβ−グルクロニダーゼ（beta-glucuronidase）の阻害剤の影響を調べた。β−グルコシダーゼに対する阻害剤として、Conduritol B epoxide, 1-deoxynojirimycinを、β−グルクロニダーゼに対する阻害剤として、D-Saccharic acid 1,4-lactone and Taurocholic acidを用いた。基本条件にこれらの阻害剤を０．１μＭ〜１ｍＭの範囲で添加した。
(Influence of inhibitors)
The effects of commercially available inhibitors of β-glucosidase and β-glucuronidase were examined. Conduritol Bepoxide, 1-deoxynojirimycin was used as an inhibitor for β-glucosidase, and D-Saccharic acid 1,4-lactone and Taurocholic acid was used as an inhibitor for β-glucuronidase. These inhibitors were added to the basic conditions in the range of 0.1 μM to 1 mM.
（金属イオンの影響）
基本条件下で、二価の金属イオン（Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｃｏ2+、Ｚｎ2+）を０．１ｍＭ〜１ｍＭの範囲で添加した。
(Influence of metal ions)
Under basic conditions, divalent metal ions (Ca 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ , Co 2+ , Zn 2+ ) were added in the range of 0.1 mM to 1 mM.
（反応温度の影響）
３０℃〜８０℃の範囲で、基本条件に基づいて反応させた。
(Influence of reaction temperature)
The reaction was performed in the range of 30 ° C to 80 ° C based on the basic conditions.
［試験の結果］
（組換え型クロソ蛋白質の作製及び精製）
組換え型クロソ蛋白質を作製するために、マウスクロソ蛋白質の膜貫通領域、細胞内領域を削除し、そこにヒトイムノグロブリン（ＩｇＧ）Ｆｃ領域を結合させた組換え型プラスミドを作製した。また、コントロール用酵素としてクロソ同様に１型膜蛋白質で、２回繰り返し構造を持つグルコシダーゼであるＬＰＨを、クロソと同様に加工した。これらのプラスミドをＣＨＯ細胞に導入し、安定発現株を得た。図１にこれらの細胞から回収した培養上清をウエスタンブロットで解析した結果を示した。
図１において、培養後のＣＨＯ細胞から培養上清を回収後、レーン１に非ベクター、レーン２にＫＬＦｃ、レーン３にＬＰＨＦｃをそれぞれ泳動し、実施例に基づいてイムノブロッットにより解析した。なお、図中のＡは、クロソ蛋白質に対するイムノブロッット解析を、Ｂは、Ｆｃタグに対するイムノブロッット解析をそれぞれ示した。分子量マーカーを左側に表示した。
[Test results]
(Production and purification of recombinant Kuroso protein)
In order to prepare a recombinant crosoprotein, a transmembrane region and an intracellular region of the mouse crosoprotein were deleted, and a recombinant plasmid in which a human immunoglobulin (IgG) Fc region was bound thereto was prepared. As a control enzyme, LPH, which is a glucosidase having a twice-repeat structure, was processed in the same manner as Kuroso. These plasmids were introduced into CHO cells to obtain stable expression strains. FIG. 1 shows the results of analyzing the culture supernatant collected from these cells by Western blotting.
In FIG. 1, after collecting the culture supernatant from the cultured CHO cells, non-vector was run in lane 1, KLFc was run in lane 2, and LPHFc was run in lane 3, and analyzed by immunoblotting based on the examples. In the figure, A represents immunoblotting analysis for Kuroso protein, and B represents immunoblotting analysis for Fc tag. Molecular weight markers are displayed on the left side.
約１５０ｋＤａ（ＫＬＦｃ）及び１６０ｋＤａ（ＬＰＨＦｃ）にそれぞれバンドが認められたことから、目的の蛋白質が作られていることが確認された。そこで、この蛋白質を用いて、取扱説明書に従い、組換え型蛋白質を回収した。これら濃縮培養上清中の組換え蛋白質の濃度は、抗ヒトＩｇＧ１抗体によるサンドイッチＥＬＩＳＡによって求めた。精製したＫＬＦｃ、ＬＰＨ Ｆｃ又はヒトＩｇＧを含むＣＨＯ細胞培養上清を実施例に基づいて還元条件下で変性させたのちＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルはSYPRO Orangeで染色した。なお、レーン２にＫＬＦｃ ０．２μｇ、レーン３にＬＰＦｃ ０．２μｇ、レーン４にコントロールとしてヒトＩｇＧ１ ０．２μｇを含むＣＨＯ上清培地、レーン５〜８には、段階的にＢＳＡ（０．０６２５〜０．５μｇ）を除いた条件下で培養したレーン１〜４と同様の蛋白質を表示した。図２に、回収したＫＬＦｃ、ＬＰＨＦｃを約２００μｇずつＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、その後SYPRO Orangeによりゲルの染色をした結果を示す。図１と同様な位置にバンドが確認された。レーン４〜７は系列希釈したＢＳＡである。これらをもとにアプライされている組換え型蛋白質の量を計算すると、１レーンあたり約２００ｎｇとなる。これは、ＥＬＩＳＡによって求めた濃度を支持している。 Since bands were observed at about 150 kDa (KLFc) and 160 kDa (LPHFc), it was confirmed that the target protein was produced. Therefore, using this protein, the recombinant protein was recovered according to the instruction manual. The concentration of the recombinant protein in these concentrated culture supernatants was determined by sandwich ELISA with anti-human IgG1 antibody. The CHO cell culture supernatant containing purified KLFc, LPH Fc or human IgG was denatured under reducing conditions based on the Examples, and then SDS-PAGE was performed. The gel was stained with SYPRO Orange. In lane 2, KLFc 0.2 μg, lane 3 LPFc 0.2 μg, lane 4 control CHO supernatant medium containing human IgG1 0.2 μg, lanes 5-8 are gradually added to BSA (0.0625 Proteins similar to those in lanes 1 to 4 cultured under the conditions excluding ˜0.5 μg) were displayed. FIG. 2 shows the results of developing about 200 μg of the recovered KLFc and LPHFc by SDS-PAGE and then staining the gel with SYPRO Orange. A band was confirmed at the same position as in FIG. Lanes 4-7 are serially diluted BSA. Based on these, the amount of recombinant protein applied is calculated to be about 200 ng per lane. This supports the concentration determined by ELISA.
（クロソ蛋白質の酵素活性の有無）
クロソ蛋白質が酵素活性をもつ可能性を検討するために、作製したＫＬＦｃと様々な蛍光性人工基質４Ｍｕ−glycosidesと反応させた。すなわち、実施例に記載のとおり、組換え蛋白質を３時間インキュベートした。なお、パネルＡはＫＬＦｃ、ＢはＬＰＦｃ、Ｃはβ−グルコシダーゼ、Ｄはβ−グルクロニダーゼを示した（図３）。白四角は、Ｇｌｃ、白ひし形はＧａｌ、白丸はＧｌｃＮＡｃ、白三角はＧａｌＡｃ、黒四角はＧｌｃＡ、黒ひし形はＤ−Ｆｌｃ、黒丸はＭａｎ、黒三角はＸｌｙをそれぞれ示す。標準誤差をエラーバーで表示し、実験はｎ＝３で行った。ＫＬＦｃは４−Ｍｕ−ｇｌｃＡと反応し、他の基質に関しては、ほとんど活性を示さないことが明らかになった（図３Ａ、表２）。別個に作製したＫＬＦｃ安定発現細胞株から回収した様々な濃度のＫＬＦｃを用いて、同様の結果が得られるか調べた。その結果、ＫＬＦｃ量依存的に４−Ｍｕ−ｇｌｃＡと反応したことから、ＫＬＦｃ依存的に酵素活性を示すことが明らかになった。
(Presence or absence of enzyme activity of Kuroso protein)
In order to examine the possibility that the Kuroso protein has enzyme activity, the prepared KLFCc was reacted with various fluorescent artificial substrates 4Mu-glycosides. That is, as described in the Examples, the recombinant protein was incubated for 3 hours. Panel A shows KLFc, B shows LPFc, C shows β-glucosidase, and D shows β-glucuronidase (FIG. 3). A white square indicates Glc, a white diamond indicates Gal, a white circle indicates GlcNAc, a white triangle indicates GalAc, a black square indicates GlcA, a black diamond indicates D-Flc, a black circle indicates Man, and a black triangle indicates Xly. The standard error was displayed with an error bar, and the experiment was performed with n = 3. KLFc reacted with 4-Mu-glcA and was found to show little activity with respect to other substrates (FIG. 3A, Table 2). It was examined whether similar results could be obtained using various concentrations of KLFc collected from separately produced KLFc stably expressing cell lines. As a result, since it reacted with 4-Mu-glcA depending on the amount of KLFCc, it was revealed that the enzyme activity was dependent on KLFCc.
図４に示すように、反応生成物濃度［Ｐ］と時間をプロットした。なお、この実施例においては、組換え蛋白質を、０．０１２５〜３．２ｍＭの一連の濃度勾配の４−Ｍｕ−ＧｌｃＡでインキュベートした。パネルＡはＫＬＦｃ、ＢはＬＰＦｃ、Ｃはβ−グルコシダーゼ、Ｄはβ−グルクロニダーゼを示した。白四角は、３．２ｍＭ、白ひし形は１．６ｍＭ、白丸は０．８ｍＭ、白三角は０．４ｍＭ、黒四角は０．２ｍＭ、黒ひし形は０．１ｍＭ、黒丸は０．０５ｍＭ、黒三角は０．０２５ｍＭをそれぞれ示す。
As shown in FIG. 4, the reaction product concentration [P] and time were plotted. In this example, the recombinant protein was incubated with 4-Mu-GlcA in a series of concentration gradients from 0.0125 to 3.2 mM. Panel A shows KLFc, B shows LPFc, C shows β-glucosidase, and D shows β-glucuronidase. White square is 3.2 mM, white diamond is 1.6 mM, white circle is 0.8 mM, white triangle is 0.4 mM, black square is 0.2 mM, black diamond is 0.1 mM, black circle is 0.05 mM, black triangle Indicates 0.025 mM, respectively.
それぞれの基質濃度における反応初速度Ｖ0を傾きより求めた。初期基質濃度［Ｓ］0、反応初速度Ｖ0を図６に示すようにLineweaver-Burkプロットによりプロットし、得られた直線からＫｍ、Ｖｍａｘを求めた（この図では、ｐＨ５．５下で２００倍超の濃度の４−Ｍｕ−ＧｌｃＡを用いてＫＬＦｃの酵素活性を測定し、Ｘ軸に基質の初期濃度の逆数（１／［Ｓ］0；μＭ-1）を、Ｙ軸に初速度の逆数（１／Ｖ0；ｈ×μＭ-1）を表示した。標準誤差をエラーバーで表示し、実験はｎ＝３で行った）。この結果を表３に示した。一般にＫｍは基質濃度と反応初速度に相当するので、ここで得られた値は、Michaelis-Mentenの式に一致した（図５）。図５において、基質の初速度及び初期濃度をグラフ化し、Ｘ軸に基質の初期濃度（［Ｓ］0；μＭ）を、Ｙ軸に初速度（Ｖ0；μＭ／ｈ）を表示した。標準誤差をエラーバーで表示し、実験はｎ＝３で行った。 The initial reaction velocity V 0 at each substrate concentration was determined from the slope. The initial substrate concentration [S] 0 and the initial reaction rate V 0 were plotted by Lineweaver-Burk plot as shown in FIG. 6, and Km and Vmax were obtained from the obtained straight line (in this figure, 200 at pH 5.5). The enzyme activity of KLFc was measured using 4-Mu-GlcA at a concentration more than twice, and the reciprocal of the initial concentration of the substrate (1 / [S] 0 ; μM −1 ) on the X axis and the initial velocity on the Y axis. The reciprocal (1 / V 0 ; h × μM −1 ) was displayed. The standard error was displayed with an error bar, and the experiment was performed with n = 3). The results are shown in Table 3. Since Km generally corresponds to the substrate concentration and the initial reaction rate, the values obtained here agreed with the Michaelis-Menten equation (FIG. 5). In FIG. 5, the initial velocity and initial concentration of the substrate were graphed, and the initial concentration ([S] 0 ; μM) of the substrate was displayed on the X axis, and the initial velocity (V 0 ; μM / h) was displayed on the Y axis. The standard error was displayed with an error bar, and the experiment was performed with n = 3.
クロソ蛋白質の最適ｐＨを求めるために、ｐＨ４．５〜６．０までの低ｐＨ域では、クエン酸ナトリウムバッファーを、ｐＨ６．０〜８．０では、リン酸ナトリウムバッファーを用いて、実験を行った。ｐＨ５．５下で４−Ｍｕ−ＧｌｃＡを用いてＫＬＦｃの酵素活性を測定した。ｐＨ４．５〜６．０までは、０．１Ｍ クエン酸ナトリウムバッファーを、ｐＨ６．０〜８．０までは、０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファーを用いた。標準誤差をエラーバーで表示し、実験はｎ＝３で行った。その結果、クロソはｐＨ５．５付近で最も高い酵素活性を示すことが明らかになった（図７）。
In order to determine the optimum pH of the croso protein, an experiment was conducted using a sodium citrate buffer at a low pH range from 4.5 to 6.0 and a sodium phosphate buffer at a pH of 6.0 to 8.0. It was. The enzymatic activity of KLFCc was measured using 4-Mu-GlcA at pH 5.5. A 0.1 M sodium citrate buffer was used up to pH 4.5 to 6.0, and a 0.1 M sodium phosphate buffer was used up to pH 6.0 to 8.0. The standard error was displayed with an error bar, and the experiment was performed with n = 3. As a result, it was revealed that Kuroso showed the highest enzyme activity around pH 5.5 (FIG. 7).
（金属イオンの影響）
β−グルコシダーゼの中には、二価の金属イオンにより活性が増強する酵素が知られている。数種類の金属イオンを用いることにより、クロソ蛋白質の、二価の金属イオンに対する反応性を検討した。Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｚｎ2+を０から１ｍＭの範囲で用いたところ、酵素活性は金属イオンによる影響を受けないことが明らかになった。
(Influence of metal ions)
Among β-glucosidases, enzymes whose activities are enhanced by divalent metal ions are known. By using several kinds of metal ions, we investigated the reactivity of Kurosoprotein to divalent metal ions. When Ca 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ and Zn 2+ were used in the range of 0 to 1 mM, it was revealed that the enzyme activity was not affected by metal ions.
（温度の影響）
実施例に基づいて、種々の温度条件下でＫＬＦｃの酵素活性を解析した。定常状態の間、０．１Ｍ クエン酸バッファー（ｐＨ５．５）中のＫＬＦｃを種々の温度条件下で３０分間培養し、酵素活性を解析した。白四角は、３０℃、白ひし形は４０℃、白丸は５０℃、白三角は６０℃、黒四角は７０℃、黒ひし形は８０℃をそれぞれ示す。標準誤差をエラーバーで表示し、実験はｎ＝３で行った。酵素反応の最適温度を調べたところ、６０℃までは温度依存的に反応が起こる（図８）。７０℃以上になると最初の３０分は反応が見られるが、３０分を越えると急激に反応が遅くなることから、最適温度が、６０℃前後にあることが示唆された。
(Effect of temperature)
Based on the examples, the enzyme activity of KLFc was analyzed under various temperature conditions. During steady state, KLFc in 0.1 M citrate buffer (pH 5.5) was incubated for 30 minutes under various temperature conditions and analyzed for enzyme activity. The white square represents 30 ° C., the white diamond represents 40 ° C., the white circle represents 50 ° C., the white triangle represents 60 ° C., the black square represents 70 ° C., and the black diamond represents 80 ° C. The standard error was displayed with an error bar, and the experiment was performed with n = 3. When the optimum temperature of the enzyme reaction was examined, the reaction occurred in a temperature-dependent manner up to 60 ° C. (FIG. 8). When the temperature exceeds 70 ° C., the reaction is observed for the first 30 minutes, but when the temperature exceeds 30 minutes, the reaction is abruptly delayed, suggesting that the optimum temperature is around 60 ° C.
（阻害剤の影響）
人工的に合成された阻害剤の影響を調べた。実施例に基づいてＫＬＦｃの酵素活性をβ−グルコシダーゼ及びβ−グルクロニダーゼに対する阻害剤の種々の濃度下で解析した。パネルＡはD-saccharic acid、ＢはTaurocholic acid、Ｃは1-deoxynojirimycin、ＤはConduritol B epoxideを示した。四角は、ＫＬＦｃ、ひし形はβ−グルコシダーゼ、丸はβ−グルクロニダーゼをそれぞれ示し、阻害剤を含まないものをコントロールとした。この結果を図９に示す。まず、ウシ肝臓由来β−グルクロニダーゼに対して競合的阻害を示すD-Saccharic acid 1,4-lactoneやTaurocholic acidを用いた。ウシ肝臓由来β−グルクロニダーゼと同様に酵素活性が阻害された。また、アーモンド由来β−グルコシダーゼに対して阻害活性を示す競合的阻害剤1-deoxynojirimycinやcatalytic site-directed covalent type阻害剤Conduritol B epoxideを用いて、同様の実験を行った。1-deoxynojirimycinは最大１０ｍＭまで用いたが、ほとんど阻害されなかった。Conduritol B epoxideは、弱いながらも、阻害を受けた。
(Influence of inhibitors)
The effects of artificially synthesized inhibitors were investigated. Based on the examples, the enzymatic activity of KLFc was analyzed under various concentrations of inhibitors against β-glucosidase and β-glucuronidase. Panel A shows D-saccharic acid, B shows Taurocholic acid, C shows 1-deoxynojirimycin, and D shows Conduritol Bepoxide. Squares indicate KLFc, rhombuses indicate β-glucosidase, and circles indicate β-glucuronidase, respectively, and those containing no inhibitor were used as controls. The result is shown in FIG. First, D-Saccharic acid 1,4-lactone and Taurocholic acid which show competitive inhibition with bovine liver-derived β-glucuronidase were used. The enzyme activity was inhibited similarly to β-glucuronidase derived from bovine liver. Moreover, the same experiment was performed using competitive inhibitor 1-deoxynojirimycin which shows inhibitory activity with respect to almond origin beta-glucosidase, and catalytic site-directed covalent type inhibitor Conduritol Bepoxide. Although 1-deoxynojirimycin was used up to 10 mM, it was hardly inhibited. Conduritol B epoxide was weakly affected.
［試験結果の解析］
（酵素活性について）
本実施例により、クロソ蛋白質は酵素活性を持つことが示された。クロソ蛋白質の基質特異性は非常に高く、４−Ｍｕ−グルクロニドのみと反応した。従って、クロソ蛋白質は、β−グルクロニダーゼであると推定された。クロソ蛋白質はB. Henrissaらの一次構造に基づく分類では、ファミリー１−グリコシダーゼに分類される。このファミリーの中には、β−グルクロニダーゼ活性を示すものは今まで知られておらず、この結果は、１−グリコシダーゼの分類法の概念を見直す必要があることを示唆している。クロソ蛋白質の酵素活性は、β−グルクロニダーゼに対する阻害剤で抑制される。このことからも、クロソ蛋白質の酵素活性が、β−グルクロニダーゼであることが支持される。古典的にはβ−グルクロニダーゼ活性を持つβ−グルコシダーゼとして、ファミリー２−グリコシダーゼに分類されるβ−グルクロニダーゼが知られている。
[Analysis of test results]
(About enzyme activity)
According to this example, it was shown that the croso protein has enzyme activity. The substrate specificity of crosoprotein was very high and reacted only with 4-Mu-glucuronide. Therefore, it was estimated that the Kuroso protein is β-glucuronidase. Crosoproteins are classified as family 1-glycosidases according to the primary structure of B. Henrissa et al. None of this family has ever been known to exhibit β-glucuronidase activity, and this result suggests that the concept of 1-glycosidase taxonomy needs to be reviewed. The enzyme activity of crosoprotein is suppressed by an inhibitor against β-glucuronidase. This also supports that the enzyme activity of the croso protein is β-glucuronidase. Classically, β-glucuronidases classified into family 2-glycosidases are known as β-glucosidases having β-glucuronidase activity.
クロソ蛋白質は、この酵素と全く一次構造上は相同性がないにもかかわらず、このような活性をもつのはクロソ蛋白質の立体構造がβ−グルクロニダーゼとしての活性を持ちうる構造をとっている可能性がある。また、クロソ蛋白質は酵素ではなく、何らかのターゲット分子と結合することによって機能している可能性があった。そこで、３Ｈ−グルクロニドを用いて、結合が見られるかどうかを検討したが、全く結合が見られなかった。このことからも、クロソ蛋白質は酵素活性に基づいて機能を発揮する分子であることが確認された。 Despite the fact that Kurosoprotein has no primary structure homology with this enzyme, it is possible that the three-dimensional structure of Kurosoprotein has a structure capable of having activity as β-glucuronidase. There is sex. In addition, Kuroso protein may function by binding to some target molecule, not an enzyme. Therefore, using 3H-glucuronide, it was examined whether or not binding was observed, but binding was not observed at all. This also confirmed that the Kuroso protein is a molecule that exhibits a function based on enzyme activity.
（クロソ蛋白質の生化学的所見）
４−Ｍｕ−ＧｌｃＡを用いてクロソ蛋白質の酵素パラメーターを求めた。先行研究で知られているヒト胎盤由来、血清由来β−グルクロニダーゼのＫｍ値は、それぞれ０．０４５ｍＭ、０．０６ｍＭであり、これらと比べるとクロソ蛋白質のＫｍ値は大きい。よって、既知のβ−グルクロニダーゼに比べ、基質に対する親和性は低い。また、クロソ蛋白質の比活性は、ウシ肝臓由来β−グルクロニダーゼの約１／３０、ＬＰＨの１／３である（ＬＰＨについては本実験の結果よりβ−グルクロニダーゼ活性を持つことを初めて確認した）。クロソ蛋白質は、活性の弱い酵素であると考えられる。
(Biochemical findings of Kuroso protein)
Enzyme parameters of crosoprotein were determined using 4-Mu-GlcA. The Km values of human placenta-derived and serum-derived β-glucuronidase known in previous studies are 0.045 mM and 0.06 mM, respectively. Compared with these, the Km value of crosoprotein is large. Therefore, the affinity for the substrate is lower than that of known β-glucuronidase. Further, the specific activity of the croso protein is about 1/30 of β-glucuronidase derived from bovine liver and 1/3 of LPH (LPH was confirmed for the first time as having β-glucuronidase activity from the results of this experiment). Kurosoprotein is considered to be a weakly active enzyme.
更に、クロソ蛋白質の酵素活性は、ｐＨ５．５で活性が最大になる。β−グルクロニダーゼの酵素活性はクエン酸バッファーにより抑制的に影響を受けるが、クロソ蛋白質の活性はクエン酸バッファーにより影響を受けない。調べた限りにおいて、クロソ蛋白質の酵素活性は金属イオンの影響を全く受けない。クロソ蛋白質は、胆汁酸β−グルコシダーゼやα−マンノシダーゼとは異なり、金属イオン非要求性のグリコシダーゼであると考えられる。クロソ蛋白質の酵素活性は、β−グルクロニダーゼの阻害剤だけではなく、一部ではあるがβ−グルコシダーゼの阻害剤の影響を受ける。これは、従来知られているβ−グルクロニダーゼとは異なる点であり、クロソ蛋白質の生化学的性質の特徴を示す。 Furthermore, the enzyme activity of crosoprotein is maximized at pH 5.5. The enzyme activity of β-glucuronidase is repressively influenced by the citrate buffer, but the activity of crosoprotein is not affected by the citrate buffer. As far as investigated, the enzyme activity of crosoprotein is not affected by metal ions at all. Unlike bile acid β-glucosidase and α-mannosidase, croso protein is considered to be a glycosidase that does not require metal ions. The enzyme activity of the crosoprotein is influenced not only by the inhibitor of β-glucuronidase but also by the inhibitor of β-glucosidase to some extent. This is different from the conventionally known β-glucuronidase, and shows the characteristics of the biochemical properties of the croso protein.
（クロソ蛋白質の生理活性について）
クロソ蛋白質は、酵素領域を細胞外に持つため、細胞自律或いは細胞非自律的に標的前駆体分子を活性化していると推定され、活性化された分子がクロソマウスの変異表現型を抑えることに作用していると推定される。該クロソ蛋白質の標的分子としては、β−グルクロニドを持つ分子が想定される。生体内でβ−グルクロニドを持つものとしては、プロテオグリカンが考えられる。プロテオグリカンは、アミノ糖とウロン酸との二糖の繰り返し構造を持つ。このウロン酸としてβ−グルクロニドが使われている。また、解毒作用の一種であるグルクロン酸抱合により修飾を受けたグルクロン酸抱合体がある。これは脂溶性の高い物質を水溶性に変え排出しやすくするものである。他に、ステロイドホルモンや糖脂質などにも、β−グルクロニドが結合したものが見られる。植物性のフラボノイドやアルカノイドにもβ−グルクロニドが結合している。幾つかの既知の分子について例を挙げた。今回得られた知見から、β−グルクロニドを持つ生体活性因子を探すことでクロソタンパク質の直接の作用点を、明らかにすることができる。
(About the physiological activity of Kuroso protein)
Kurosoprotein has an enzyme domain outside the cell, so it is presumed that the target precursor molecule is activated autonomously or non-autonomously, and the activated molecule suppresses the mutant phenotype of Kuroso mouse. It is estimated that A molecule having β-glucuronide is assumed as a target molecule of the crosoprotein. Proteoglycan is considered as one having β-glucuronide in vivo. Proteoglycan has a repeating structure of disaccharides of amino sugar and uronic acid. Β-glucuronide is used as the uronic acid. There is also a glucuronide conjugate modified by glucuronidation, which is a kind of detoxification action. This makes it easy to discharge a highly liposoluble substance by changing it to water-soluble. In addition, β-glucuronide bound to steroid hormones and glycolipids can also be seen. Β-glucuronide is also bound to plant flavonoids and alkanoids. Examples were given for some known molecules. From the findings obtained this time, the direct action point of crosoprotein can be clarified by searching for a bioactive factor having β-glucuronide.
＜クロソタンパク質の天然基質のスクリーニング＞
クロソタンパク質の天然基質のスクリーニングのために、以下のグルクロニドについて試験を行った：すなわち、天然基質のスクリーニングに、ステロイドグルクロニド（β−エストラジオール３−β―グルクロニド（estradiol-3GlcU）、β−エストラジオール１７−βグルクロニド（estradiol-17GlcU）、アンドロステロングルクロニド（androsterone-GlcU）、エチオコラン−３α-ol-１７−oneグルクロニド（etiocholan-3a-ol-17-one-GlcU）、テストステロンβ−グルクロニド（testosterone-GlcU）、エステロン３−β−グルクロニド（estrone-3GlcU）、５β-プレグナン３α，２０α−ディオールグルクロニド(5b-pregnane-3a, 20a-diol-GlcU)、デヒドロイソアンドロステロン３−グルクロニド（dehyddroisoandrosterone-3GlcU）、５αアンドロスタン−３α，１７β−ディオール １７β―Ｄ−グルクロニド（5a-androstane-3a,17b-diol 17GlucU）、エストリオール１７β−β−Ｄ−グルクロニド（estriol-17GlucU）、エストリオール１６α−β−Ｄ−グルクロニド（estriol-16GlucU）、エストリオール３β−Ｄ−グルクロニド（estriol-3GlucU）（シグマ社製）、プロテオグリカンの二糖（コンドロイシン（Chondorosine）、IdoUA-2S-GlcNS-6S, IdoUA-GlcNS-6S, IdoUA-GlcNS, IdoUA-GlcNac-6S, IdoUA-GalNAc, IdoUA-GalNAc-4S, IdoUA-GalNAc-6S, IdoUA-GalNAc-4S, 6S, IdoUA-GlcNAc, GlcA-GalNAc-4S, GlcA-GalNAc-6S）（生化学工業、Dextra Laboratories社製）及びインタクトなプロテオグリカン（コンドロイオチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸及びヘパラン硫酸）（生化学工業社製）を、競合阻害アッセイ（Inhibition assay）により試験した。
<Screening of natural substrate of Kuroso protein>
The following glucuronides were tested for screening of the natural substrate of crosoprotein: steroid glucuronide (β-estradiol 3-β-glucuronide (estradiol-3GlcU), β-estradiol 17- β-glucuronide (estradiol-17GlcU), androsterone glucuronide (androsterone-GlcU), etiocholan-3α-ol-17-one glucuronide (etiocholan-3a-ol-17-one-GlcU), testosterone β-glucuronide (testosterone-GlcU) , Esterone 3-β-glucuronide (estrone-3GlcU), 5β-pregnane 3α, 20α-diol glucuronide (5b-pregnane-3a, 20a-diol-GlcU), dehydroisoandrosterone 3-glucuronide (dehyddroisoandrosterone-3GlcU), 5α Androstan-3α, 17β-diol 17β-D-gluc Nido (5a-androstane-3a, 17b-diol 17GlucU), estriol 17β-β-D-glucuronide (estriol-17GlucU), estriol 16α-β-D-glucuronide (estriol-16GlucU), estriol 3β-D- Glucuronide (estriol-3GlucU) (Sigma), proteoglycan disaccharide (Chondorosine, IdoUA-2S-GlcNS-6S, IdoUA-GlcNS-6S, IdoUA-GlcNS, IdoUA-GlcNac-6S, IdoUA-GalNAc , IdoUA-GalNAc-4S, IdoUA-GalNAc-6S, IdoUA-GalNAc-4S, 6S, IdoUA-GlcNAc, GlcA-GalNAc-4S, GlcA-GalNAc-6S) (Seikagaku Corporation, manufactured by Dextra Laboratories) and intact Proteoglycans (chondroiotin, chondroitin sulfate, keratan sulfate and heparan sulfate) (manufactured by Seikagaku Corporation) were tested by competitive inhibition assay.
阻害アッセイ用に、各試薬（５ｍＭ）をＫＬＦｃ、０．１ｍＭの４Ｍｕ−ＧｌｃＵを含む標準反応液に添加した。試薬の加水分解を調べるために、各基質（１ｍＭ）を、ＫＬＦｃ融合タンパク質と、標準的な条件下で、３０時間インキュベーションした。Estradiol-3GlcU 及びestrone-3GlcUを水に溶解し、etiocholan-3a-ol-17-one-GlucU、testosterone-b-D-GlucU、5b-pregnane-3a、20-a-diol-GlcU をエタノールに溶解し、5a-androstane-3a、17 b-diol-17-GlucU及びestriol-3-GlucUをジメチルスルホキシドに溶解し、estradiol-17GlcU、dehydroisoandrostenone-3GlucU、estriol-17GlucU、estriol-16GlucUを、N,N-dimethylformamideに溶解した。ステロイドGlcUsの加水分解を分析するために、サンプルをＨＰＬＣ（Waters Alliance HPLC system 2695 EX separation module）システムにかけ、Waters二重λ紫外可視検知機（Waters dualλUV-visible detector）にかけた。 For inhibition assays, each reagent (5 mM) was added to a standard reaction containing KLFc, 0.1 mM 4Mu-GlcU. To examine reagent hydrolysis, each substrate (1 mM) was incubated with KLFc fusion protein for 30 hours under standard conditions. Estradiol-3GlcU and estrone-3GlcU are dissolved in water, etiocholan-3a-ol-17-one-GlucU, testosterone-bD-GlucU, 5b-pregnane-3a, 20-a-diol-GlcU are dissolved in ethanol, Dissolve 5a-androstane-3a, 17 b-diol-17-GlucU, and estriol-3-GlucU in dimethyl sulfoxide. Dissolved. In order to analyze the hydrolysis of the steroid GlcUs, the sample was subjected to a HPLC (Waters Alliance HPLC system 2695 EX separation module) system and a Waters dual λ UV-visible detector.
シメトリ−Ｃ１８カラム（４．６×１５０ｍｍ；Waters 社製）を逆の局面で、フローレート１．０ｍｌ／分で、４０℃で使用した。サンプル１０μｌを、分析用のカラムに注入した。移動相１の勾配プログラムは以下の通りであった：水中の０．０２％トリフルオロ酢酸及び１０％アセトニトリルを０分間、その後０．０２％トリフルオロ酢酸及び８０％アセトニトリルで１０分間、さらにその後０．０２％トリフルオロ酢酸及び１０％アセトニトリルで１０．１分間、定組成的に溶離した。２１０又は２６０ｎｍの吸光度を監視した。最後に、エストランＧｌｕＣの触媒パラメーターを算出した。エストランＧｌｕＣをＫＬＦｃで触媒した加水分解反応を、さまざまな基質濃度で行った。触媒定数は、エストランＧｌｕＣｓを用いた、Lineweaver-Burk plotによる３度の実験で決定した。コンドロイシン（chondrosine）の加水分解を分析するために、アミノ酸分析を、ニンヒドリン試薬の自動オンライン混合が可能な、Hitachi L-8500を用いて行った。 A Symmetry-C18 column (4.6 × 150 mm; Waters) was used in the reverse phase at 40 ° C. with a flow rate of 1.0 ml / min. 10 μl of sample was injected into the analytical column. The mobile phase 1 gradient program was as follows: 0.02% trifluoroacetic acid and 10% acetonitrile in water for 0 minutes, then 0.02% trifluoroacetic acid and 80% acetonitrile for 10 minutes, then 0. Elute isotopically with 10.2% trifluoroacetic acid and 10% acetonitrile for 10.1 minutes. Absorbance at 210 or 260 nm was monitored. Finally, the catalyst parameters of estrane GluC were calculated. Hydrolysis reaction of estrane GluC catalyzed with KLFc was performed at various substrate concentrations. The catalyst constant was determined by three experiments using Lineweaver-Burk plot using Estrane GluCs. To analyze the hydrolysis of chondrosine, amino acid analysis was performed using a Hitachi L-8500 capable of automatic on-line mixing of ninhydrin reagents.
［実験方法及び結果］
実施例１の実験方法を用いて、クロソタンパク質の天然基質についてのスクリーニングを行った。
[Experimental method and results]
The experimental method of Example 1 was used to screen for the natural substrate of crosoprotein.
（組換え型クロソの発現及び精製）
組換え型クロソを発現するために、マウスクロソｃＤＮＡ及びヒト免疫グロブリン遺伝子を用いて、発現ベクターを作製した。クロソの細胞外領域をコードする領域は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域をコードするＤＮＡに融合していた。コントロール実験に、ファミリー１β−グルコシダーゼに相同な２個の内部リピートを有する１型膜タンパク質である、マウスＬＰＨを用いた。ＬＰＨＦｃの発現ベクターを、ＫＬＦｃと同様に作製した。これらの発現構築物をＣＨＯ細胞に導入し、ステーブルなトランスフェクタントを得た。これらのクローンからの培養上澄を濃縮し、ウェスタンブロット分析を行った。融合タンパク質が、１５０ｋＤａ（ＫＬＦｃ）及び１６０ｋＤａ（ＬＰＨＦｃ）の相対分子量でそれぞれ検出した（図１）。
(Expression and purification of recombinant Kuroso)
In order to express recombinant Kuroso, an expression vector was prepared using mouse croso cDNA and human immunoglobulin gene. The region encoding the extracellular region of Kuroso was fused to DNA encoding the human immunoglobulin Fc region. Mouse LPH, a type 1 membrane protein with two internal repeats homologous to family 1β-glucosidase, was used for control experiments. An LPHFc expression vector was prepared in the same manner as KLFc. These expression constructs were introduced into CHO cells to obtain stable transfectants. Culture supernatants from these clones were concentrated and subjected to Western blot analysis. Fusion proteins were detected with relative molecular weights of 150 kDa (KLFc) and 160 kDa (LPHFc), respectively (FIG. 1).
組換え型タンパク質の濃度は、ＥＬＩＳＡで、抗ヒトＩｇＧ抗体とで推定した。推定の信頼性を確認し、精製した融合タンパク質の質を調べるために、ＫＬＦｃ及びＬＰＨＦｃ（ＥＬＩＳＡによる推定による各２００ｎｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより単離し、ゲルをSYPRO Orangeで染色し、タンパク質を視覚化した（図２）。ＫＬＦｃタンパク質は、単一バンドとして検出し、この融合タンパク質がタンパク質分解なしで精製できることを示唆した（図２、レーン１）。ＬＰＨＦｃタンパク質も精製することを可能である（レーン２）。７０ｋＤａで検出した弱いバンドは、ウシ胎児血清由来ウシ血清アルブミンのコンタミネーションのようである。ウシ血清アルブミンの段階希釈を、定量化の標準物質として用いた（図２、レーン４〜７）。シグナル強度を、標準物質と比較し、ＫＬＦｃ及びＬＰＨＦの量を計算した。結果は、ＥＬＩＳＡで得たものと関連している。精製した融合タンパク質を、以下の実験に用いた。 The concentration of the recombinant protein was estimated with an anti-human IgG antibody by ELISA. To confirm the reliability of the estimation and to examine the quality of the purified fusion protein, KLFc and LPHFc (200 ng each estimated by ELISA) were isolated by SDS-PAGE, the gel was stained with SYPRO Orange, and the protein visualized (FIG. 2). The KLFc protein was detected as a single band, suggesting that the fusion protein can be purified without proteolysis (Figure 2, lane 1). LPHFc protein can also be purified (lane 2). The weak band detected at 70 kDa appears to be contamination of fetal bovine serum-derived bovine serum albumin. Serial dilutions of bovine serum albumin were used as quantification standards (Figure 2, lanes 4-7). The signal intensity was compared with the standard and the amount of KLFc and LPHF was calculated. The results are related to those obtained by ELISA. The purified fusion protein was used for the following experiments.
（クロソタンパク質の酵素活性）
ＫＬＦｃタンパク質の酵素活性を検討するために、４Ｍｕ−グルコシドのパネルを調べた。これらの基質は、蛍光性でないが、加水分解された基質の量を推定するために、時間の関数として蛍光光度計を用いて測定した、蛍光４−methylumbelliferoneを遊離する。８種類のグルコシドを調べた。ＫＬＦｃは４Ｍｕ−ＧｌｕＣと特異的に反応し、この基質を加水分解した。他の潜在的な基質の蛍光強度の変化は、ＩｇＧ１で観察したバックグラウンドレベルと同様であり（実施例１、表２）、ＫＬＦｃがこれらの分子を加水分解しないことを示唆した。一方で、ＬＰＨＦｃ、β−グルコシダーゼ及びβ−グルクロニダーゼは、表２に示す基質に対し、活性を示した。
(Enzyme activity of Kuroso protein)
To examine the enzymatic activity of the KLFc protein, a panel of 4Mu-glucosides was examined. These substrates are not fluorescent, but liberate fluorescent 4-methylumbelliferone, measured using a fluorimeter as a function of time, to estimate the amount of hydrolyzed substrate. Eight types of glucosides were examined. KLFc specifically reacted with 4Mu-GluC and hydrolyzed this substrate. Changes in the fluorescence intensity of other potential substrates were similar to the background levels observed with IgG1 (Example 1, Table 2), suggesting that KLFc does not hydrolyze these molecules. On the other hand, LPHFc, β-glucosidase and β-glucuronidase showed activity against the substrates shown in Table 2.
表２は、クロソの特異的活性が、ウシ肝臓由来β−グルクロニダーゼの約１／３０、ラットＬＰＨ由来β−グルクロニダーゼの１／３であることを示す。クローンの変動を除外するために、別個に構築された３個の他のトランスフェクタントを調べ、これらのクローンから得た融合タンパク質、用量依存的方式と同様の結果を示すことを確認した。更に、０．５ｍＭのＦＤ−ＧｌｃＵ及びＥＬＦ９７−ＧｌｃＵ、他の蛍光基質共役β−グルクロン酸を調べたところ、同様の条件下で加水分解され、ＫＬＦｃタンパク質のβ−グルクロニダーゼ活性を確認した。 Table 2 shows that the specific activity of Kuroso is about 1/30 that of bovine liver-derived β-glucuronidase and 1/3 that of rat LPH-derived β-glucuronidase. To rule out clonal variation, three other transfectants constructed separately were examined and confirmed to show similar results to the fusion proteins obtained from these clones, a dose-dependent manner. Furthermore, when 0.5 mM FD-GlcU and ELF97-GlcU and other fluorescent substrate-conjugated β-glucuronic acid were examined, they were hydrolyzed under the same conditions, and the β-glucuronidase activity of the KLFc protein was confirmed.
（速度パラメーターの算出）
ＫＬＦｃ融合タンパク質の基質飽和を、一連の４Ｍｕ−ＧｌｃＵ濃度で調べた。生成物の濃度（［Ｐ］）及び反応時間（ｔ）は、実施例１の図４に示すようにプロットした。３．２及び１．６ｍＭの基質が、同じレベルの生成物を結果として示し、基質飽和がＫＬＦｃタンパク質２０μｇに対し、１．６ｍＭに達したことを示唆した。これらのラインの傾斜に基づき、基質の各初期濃度（［Ｓ］0）の初期速度（ｖ0）を計算した。［Ｓ］0及びｖ0を図５にプロットした。相互のLineweaver-Burk plotを、図６に示す。ミカエリス定数（Ｋm）及び最大速度（Ｖmax）をこのプロットから計算し、実施例１の表３に示した。図５及び表３は、ＫＬＦｃ融合タンパク質４Ｍｕ−ＧｌｃＵに対する反応が、ミカエル−メンテン動力学（Michaelis-Menten kinetics）と合致することを示した。
(Calculation of speed parameter)
The substrate saturation of the KLFc fusion protein was examined at a series of 4Mu-GlcU concentrations. The product concentration ([P]) and reaction time (t) were plotted as shown in FIG. 3.2 and 1.6 mM substrate showed the same level of product as a result, suggesting that substrate saturation reached 1.6 mM for 20 μg of KLFc protein. Based on the slope of these lines were calculated initial velocity of the initial concentration of substrate ([S] 0) (v 0). [S] 0 and v 0 are plotted in FIG. A mutual Lineweaver-Burk plot is shown in FIG. The Michaelis constant (K m ) and maximum velocity (V max ) were calculated from this plot and are shown in Table 3 of Example 1. FIG. 5 and Table 3 showed that the response to the KLFc fusion protein 4Mu-GlcU is consistent with Michaelis-Menten kinetics.
（最適ｐH及びニ価金属イオン）
ＫＬＦｃの酵素活性に対するｐＨ効果を調べた（実施例１の図７）。クエン酸ナトリウム緩衝液をｐＨ４．５〜６．０で使用し、リン酸ナトリウム緩衝液をｐＨ６．０〜８．０で使用し、０．５増加ごとにｐＨ４．５〜８．０までの最適な条件を決定した。４Ｍｕ−ＧｌｃＵの処理に対するKLFｃの最も高い活性を、ｐＨ５．５で観測し、それがＫＬＦｃに対する最適ｐＨであることを示唆した。数種類のグルコシダーゼの活性の、金属イオンへの依存性が報告されている（３０、３１）ので、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+及びＺｎ2+のクロソの酵素活性に対する効果を調べた。しかし、これらの金属イオンは、ＫＬＦｃの酵素活性を有さないようであった。
(Optimal pH and divalent metal ions)
The pH effect on the enzyme activity of KLFc was examined (FIG. 7 of Example 1). Sodium citrate buffer is used at pH 4.5-6.0, sodium phosphate buffer is used at pH 6.0-8.0, optimal for pH 4.5-8.0 every 0.5 increments Was determined. The highest activity of KLFc for treatment of 4Mu-GlcU was observed at pH 5.5, suggesting that it was the optimum pH for KLFc. Since the dependence of several glucosidase activities on metal ions has been reported (30, 31), the effect of Ca 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ and Zn 2+ on the enzyme activity of Kuroso was investigated. . However, these metal ions did not appear to have the enzyme activity of KLFCc.
（阻害剤に対する影響）
ＫＬＦｃ融合タンパク質をさらに特徴づけるため、β−グルクロニダーゼに対する既知の阻害剤の、酵素活性に対する効果を調べた（実施例１、図９）。ウシ肝臓由来β−グルクロニダーゼは、既知の酵素間の相違を測定するための標準物質をして用いた。ウシ肝臓由来βグルクトニダーゼに対する競合阻害剤であることが知られているＤ−糖酸１，４ラクトン(D-Saccharic acid 1,4-lactone)及タウロコール酸(Taurocholic acid)を、４Ｍｕ−ＧｌｃＵ加水分解反応液に添加した。図９Ａ及びＢに示すように、ＫＬＦｃの酵素活性は、これらの阻害剤によって減少した。この阻害効果は、β―グルクロニダーゼでも観察されたが、ＫＬＦｃに対して要求よりも低い用量であった。この結果は、ＫＬＦｃの酵素活性が、β−グルクロニダーゼの既知の阻害剤によって阻害されていることを示唆した。
(Influence on inhibitors)
To further characterize the KLFc fusion protein, the effect of known inhibitors on β-glucuronidase on enzyme activity was examined (Example 1, FIG. 9). Bovine liver-derived β-glucuronidase was used as a standard substance for measuring differences between known enzymes. 4Mu-GlcU hydrolysis of D-saccharic acid 1,4-lactone and taurocholic acid, which are known to be competitive inhibitors for bovine liver-derived β-gluconidase Added to the reaction. As shown in FIGS. 9A and B, the enzymatic activity of KLFCc was decreased by these inhibitors. This inhibitory effect was also observed with β-glucuronidase, but at a lower dose than required for KLFCc. This result suggested that the enzymatic activity of KLFc was inhibited by known inhibitors of β-glucuronidase.
（クロソタンパク質の基質の候補）
クロソの潜在的な未変性の基質を探索するために、プロテオグリカン（Int. J. Biochem.Cell Biol. 32,269-288,2000）、ステロイドホルモン（Chem. Biol. Interact. 129,171-193,2000;Steroids 64, 715-725,1999）、糖脂質（Biochem. J. 320-93-99,1996）、アルカロイド（Clin. Pharmacokinet, 40,485-499,2001）及びフラボノイド（FEBS Lett.,503,103-106）を含む、天然のグルクロニド接合体のスクリーニングを行った。まず、これらの化合物が、ＫＬＦｃ融合タンパク質によって加水分解作用を競合的に阻害できるかどうかを調べた。各化合物（５ｍＭ）を、１０μｇＫＬＦｃ及び０．１ｍＭの４Ｍｕ−Ｇｌｕｃを含む反応液に添加した。プロテオグリカンの部分溶解やインタクトなプロテオグリカン（コンドロイオチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸及びヘパラン硫酸）由来のニ糖には、効果がなかった。
(Candidate for substrate of Kuroso protein)
Proteoglycan (Int. J. Biochem. Cell Biol. 32,269-288,2000), steroid hormone (Chem. Biol. Interact. 129,171-193,2000; Steroids 64 , 715-725, 1999), glycolipids (Biochem. J. 320-93-99, 1996), alkaloids (Clin. Pharmacokinet, 40,485-499, 2001) and flavonoids (FEBS Lett., 503, 103-106), The natural glucuronide conjugate was screened. First, it was investigated whether these compounds can competitively inhibit the hydrolysis action by the KLFc fusion protein. Each compound (5 mM) was added to a reaction solution containing 10 μg KLFc and 0.1 mM 4Mu-Gluc. Disaccharides derived from partial dissolution of proteoglycans and intact proteoglycans (chondroiotin, chondroitin sulfate, keratan sulfate and heparan sulfate) had no effect.
検査した１１のステロイドＧｌｃＵの内、８個（androsterone-GlcU、 etiocholan-3a-ol-17-one GlcU、 estrone-3GlcU、estradiol-3GlcU、5b-pregnane-3a、20a-diol-GlcU, dehydroisoandrosterone-3GlcU、testosterone-GlcU及び estriol-3GlcU）が、ＫＬＦｃによる４Ｍｕ−ＧｌｃＵの加水分解の阻害効果を示した（図１０）。どのプロテオグリカンも４Ｍｕ−ＧｌｃＵの加水分解も阻害しなかった。ステロイドＧｌｃＵｓ（estradiol-3GlcU、 estrone-3GlcU、estriol-3GlcU、testosterone-GlcU、 androsterone-GlcU）が、ＫＬＦｃと加水分解できるかどうか、さらに調べた。各グルクロニドを、ＫＬＦｃ融合タンパク質とインキューベーションした。反応生成物を、ＨＰＬＣ勾配クロマトグラムにかけ、２１０又は２６０ｎｍの吸光度で検出した。その結果、ＫＬＦｃは、estradiol-3GlcU, estrone-3GlcU, estriol-3GlcUを、４Ｍｕ−Ｇｌｕｃで得たものと同様の触媒パラメーター（kcat及び kcat／Km）（実施例１表３、及び表４）と共に加水分解した。Testosterone-GlcUは、わずかにＫＬＦｃによって加水分解されたが、androsterone-GlcU及びコンドロイチンは、全くされなかった。 Of the 11 steroids GlcU tested, 8 (androsterone-GlcU, etiocholan-3a-ol-17-one GlcU, estrone-3GlcU, estradiol-3GlcU, 5b-pregnane-3a, 20a-diol-GlcU, dehydroisoandrosterone-3GlcU , Testosterone-GlcU and estriol-3GlcU) showed an inhibitory effect on the hydrolysis of 4Mu-GlcU by KLFc (FIG. 10). None of the proteoglycans inhibited the hydrolysis of 4Mu-GlcU. It was further investigated whether steroids GlcUs (estradiol-3GlcU, estrone-3GlcU, estriol-3GlcU, testosterone-GlcU, androsterone-GlcU) can be hydrolyzed with KLFc. Each glucuronide was incubated with a KLFc fusion protein. The reaction product was applied to an HPLC gradient chromatogram and detected by absorbance at 210 or 260 nm. As a result, KLFc was obtained by using estradiol-3GlcU, estrone-3GlcU, and estriol-3GlcU with the same catalyst parameters (k cat and k cat / K m ) obtained with 4Mu-Gluc (Example 1 Table 3 and Table 3). Hydrolyzed together with 4). Testosterone-GlcU was slightly hydrolyzed by KLFc, but not androsterone-GlcU and chondroitin.
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