JP4397088B2 - Gene encoding reductase - Google Patents

Description

（式中、X1、X2は、同一かまたは異なっていてもよい、H、NH₄、金属原子、n=1-4）
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明は、還元酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそのホモログに関する。本発明の還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば配列番号：１に示す塩基配列を含む。配列番号：１に示す塩基配列は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明による還元酵素の好ましい態様を構成する。ところでアミノ酸をコードするコドンは単一ではなく、縮重によって複数のコドンが対応することは周知の事項である。したがって、配列番号：２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列には、配列番号：１に示す塩基配列のみならず、異なるコドンに基づくあらゆる塩基配列が含まれる。
【０００８】
本発明の還元酵素をコードするポリヌクレオチドのホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ次の理化学的性質ｉ）およびｉｉ）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
ｉ）作用：２−オキソカルボン酸に作用して、Ｒ−ヒドロキシカルボン酸を生じる。
ｉｉ）基質特異性：２−オキソ−４−フェニル酪酸に作用してＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を生じる。
当業者であれば、配列番号：１記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487(1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448(1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991)などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。あるいは、配列番号：１の塩基配列がLeuconostoc oenos ATCC 27310株に由来するものであるのに対して、この他の種から本発明の開示に基づいて得ることができる機能的に同等な酵素活性を持つタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明におけるホモログを構成する。これらのホモログは、天然に存在するホモログと言うことができる。
本発明のポリヌクレオチドは、DNA、あるいはRNAであることができ、その構造は１本鎖であっても良いし相補鎖との２本鎖を構成したものであることもできる。本発明のポリヌクレオチドの長さは制限されない。更に本発明のポリヌクレオチドは、天然の、あるいは人工的なヌクレオチド誘導体で構成されたものであっても良い。また各種の標識やタグによって修飾されたものであることもできる。加えて、本発明のポリヌクレオチドには、ゲノムやcDNAに由来するもの、また人工的に合成されたポリヌクレオチド等が含まれる。
【０００９】
本発明のポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズでき、かつ、2-オキソカルボン酸に作用し、 R-2-ヒドロキシカルボン酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：１に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つ、または複数選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとし、たとえば ECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：42℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer)において、ハイブリダイズするＤＮＡを指す。
【００１０】
さらに、本発明のポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%または９０%、より好ましくは９５%以上のホモロジーを有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む。タンパク質のホモロジー検索は、たとえば DNA Databank of JAPAN(DDBJ)を対象に、FASTA programや BLAST programなどを用いて行うことができる。
【００１１】
本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含み、かつ、2-オキソカルボン酸に作用し、 R-2-ヒドロキシカルボン酸を生成する活性を有する還元酵素、及びそのホモログを含む。配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明による還元酵素の好ましい態様を構成する。
【００１２】
本発明の還元酵素のホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含む。当業者であれば、配列番号：１記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487(1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448(1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより本発明による還元酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。得られたポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：２に記載の還元酵素のホモログを得ることが可能である。
【００１３】
本発明の還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば、以下のような方法によって単離することができる。すなわち、還元酵素産生能を有する乳酸菌のゲノムライブラリーを、配列番号：１に示す塩基配列から選択された塩基配列を含むＤＮＡをプローブとしてスクリーニングすることにより、本発明のポリヌクレオチドを単離することができる。配列番号：１に示す塩基配列がLeuconostoc oenos ATCC 27310株に由来するものなので、この菌株から調製したライブラリーを用いて本発明のポリヌクレオチドを単離することができる。また近縁の乳酸菌や、あるいは他種の乳酸菌に由来するライブラリーを利用することによって、本発明におけるホモログを単離することもできる。
【００１４】
乳酸菌のゲノムライブラリーは、公知の方法によって得ることができる。すなわち、まず乳酸菌の培養物を集めて、これを物理的に、あるいは酵素的に破壊する。具体的には、たとえば菌体の凍結等により細胞壁を破壊することができる。更に核分画を集めて、フェノール／クロロホルム等で核酸を抽出し、制限酵素等でランダムに切断する。ランダムに切断されたゲノムの断片を、適当なクローニングベクターに挿入すればゲノムライブラリーを得ることができる。
【００１５】
これらのライブラリーに対して、好ましくは先に述べたようなストリンジェントな条件下でプローブをハイブリダイズさせる。ポジティブクローンを集めてその塩基配列を決定し、本発明によるポリヌクレオチドであることが確認される。単離されたポリヌクレオチドがタンパク質翻訳領域の全長を含まない場合には、得られた塩基配列情報に基づいて全長塩基配列を得ることができる。未知の領域をPCRによって増幅する方法として、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化させたＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲを行う方法（Genetics 120, 621-623(1988)）が公知である。あるいは、DNA断片の末端にリンカーをライゲーションしてPCRを行うＲＡＣＥ法（Rapid Amplification of cDNA End、「ＰＣＲ実験マニュアル」p25-33,ＨＢＪ出版局）も公知である。
【００１６】
更に、配列番号：１または配列番号：２５に示す塩基配列に基づいて設定されたプライマーを用い、ＰＣＲ法を利用して本発明のポリヌクレオチドを得ることもできる。すなわち、先に述べたゲノムライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を行い、目的とする長さの断片を回収する。これを適当なクローニングベクターに挿入してクローニングすることにより、本発明のポリヌクレオチドを単離することができる。プライマーとしてディジェネレーティブ・プライマーを用いることによって、配列番号：１のみならず、この塩基配列と相同性の高いホモログを合成することもできる。与えられた塩基配列に基づいて、その配列を増幅することができるプライマーやホモログを増幅しうるディジェネレーティブ・プライマーを設計することは、当業者が日常的に行っていることである。なお本発明のポリヌクレオチドは、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、合成によって得ることもできる。
【００１７】
このようにして単離された、本発明による還元酵素をコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、還元酵素発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明の還元酵素を組み換え体から得ることができる。
本発明において還元酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、還元酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターにより形質転換され、還元酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示すことができる。
【００１８】
エシェリヒア(Escherichia)属
バチルス(Bacillus)属
シュードモナス(Pseudomonas)属
セラチア(Serratia)属
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属
ストレプトコッカス(Streptococcus)属
ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス(Rhodococcus)属
ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス(Saccharomyces)属
クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
ヤロウイア(Yarrowia)属
トリコスポロン(Trichosporon)属
ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
ハンゼヌラ(Hansenula)属
ピキア(Pichia)属
キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ(Neurospora)属
アスペルギルス(Aspergillus)属
セファロスポリウム(Cephalosporium)属
トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
【００１９】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories)。微生物中などにおいて、本発明のD-アミノアシラーゼ遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102(1990)、Yeast 8, 423-488(1992)、などに詳細に記述されている。
【００２０】
例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、trc(lac、trpの融合)、λファージPＬ、PＲなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどを用いることができる。
【００２１】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリプロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミラーゼ)などが利用できる。
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子などが利用できる。
【００２２】
ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281(1985))などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175(1984)などのプラスミドベクターが利用可能である。
ストレプトコッカス(Streptococcus)属においては、pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239(1985)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94(1985)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００２３】
ラクトバチルス(Lactobacillus)属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614(1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
ロドコッカス(Rhodococcus)属においては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能である(J. Gen. Microbiol. 138,1003(1992))。
【００２４】
ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories(1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99(1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150(1995) )が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53(1997))
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae) においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラーゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００２５】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390(1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS (自律複製に関与する遺伝子)及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80(1986)）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729(1987)）。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００２６】
チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zygosaccharomyces rouxii)由来のpSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267(1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来PHO5プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri.Biol. Chem. 54, 2521(1990)）などが利用可能である。
ハンゼヌラ(Hansenula)属においては、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ハンゼヌラ・ポリモルファ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443(1991)）。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ)、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモーターなどが利用可能である。
【００２７】
ピキア(Pichia)属においては、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子(PARS1、PARS2)などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376(1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能な AOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859(1987)）。
キャンディダ(Candida)属においては、キャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・ウチルス(Candida utilis)などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587(1987)）、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平08-173170）。
【００２８】
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリジー(Aspergillus oryzae)などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287(1989)）。
トリコデルマ(Trichoderma)属においては、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603(1989)）。
【００２９】
本発明はまた、配列番号：３に記載の塩基配列からなるターミネーターと、これを用いた本発明による前記還元酵素の組み換え体の製造方法に関する。本発明のポリヌクレオチドとして配列番号：１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを用い、大腸菌を宿主として発現させるとき、配列番号：３に示すターミネーターを組み合わせることによって、より高度な発現が期待できる。配列番号：３の塩基配列からなるターミネーターは、もともと本発明の還元酵素が単離されたLeuconostoc oenosのゲノムに由来する新規な遺伝子である。この新規なターミネーターを本発明のポリヌクレオチドの下流に配置するとき、公知のエンハンサーやターミネーターでは期待できないほどの高度な発現が見られる。したがって、本発明のポリヌクレオチドの発現に当たり、配列番号：３に記載のターミネーターを用いるのは、望ましい態様である。
【００３０】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594(1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
【００３１】
本発明の還元酵素をコードするポリヌクレオチドで形質転換された宿主微生物は、公知の情報に従って培養され、その培養物から本発明による還元酵素を回収することができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地または天然培地のいずれでも使用可能であり、液体培地または固体培地を使用することができる。
具体的には、炭素源として、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類、麦、とうもろこしなどの天然炭水化物、グリセロール、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸、グルコン酸、ピルビン酸、クエン酸などの脂肪酸類、ノルマルパラフィンなどの炭化水素類、グリシン、グルタミン、アスパラギンなどのアミノ酸類等の一般的な炭素源より使用するかびの資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合物、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素などの無機窒素化合物より使用かびの資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
さらに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、カリウム、カルシウム、ナトリウム、銅、亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩等より適宜一種または二種以上を選択して使用することができる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加してもよい。
培養は前記培地成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。
培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、該菌株が増殖し、還元酵素を産生できる条件であれば特に制限はない。通常は、培養開始時のpHを4から10、好ましくは6から8に調節し、15から50℃、好ましくは25から35℃の温度条件下で培養することが望ましい。
【００３２】
十分に菌体が増殖した後に、あるいは増殖過程において、形質転換体の外来遺伝子の発現を誘導する条件を与える。たとえばlacプロモーターに対しては、IPTGを与えることにより、その下流に連結されている外来遺伝子の発現が誘導される。あるいは温度感受性プロモーターであれば、発現に必要な温度条件で培養を行う。
【００３３】
培養時間は、十分量の還元酵素活性を有する菌体が得られれば特に制限はなく、通常は1日から14日、このましくは1日から3日培養する。遺伝子発現に伴ってに生産蓄積された本発明の還元酵素は、次のような方法で採取、分取することができる。
【００３４】
還元酵素が菌体内に蓄積される場合には、培養終了後、菌体をろ過、遠心分離等の方法で集め、緩衝液、生理食塩水等で菌体を洗浄後、例えば、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理などの物理手段、もしくはリゾチームなどの細胞壁溶解酵素処理のような生化学的処理もしくは界面活性剤との接触処理などの化学的処理を単独または組み合わせて行うことにより菌体を破砕し、還元酵素を抽出することができる。こうして得られた粗還元酵素は、塩析、有機溶媒などによる分別沈殿、塩析クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、色素クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーをオープンカラム、中圧クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって行う分離および等電点電気泳動、native-電気泳動などの電気泳動法による分離等の手段を単独もしくは組み合わせて用いることにより精製することができる。
【００３５】
具体的には、例えば、ろ過や遠心分離で集めた菌体を凍結、粉砕処理後緩衝液に懸濁し、Dyno Millを用いて磨砕処理し、還元酵素抽出液を得て、その後、硫安を用いた塩析処理、DEAE-Sepharose FF イオン交換クロマトグラフィー、Phenyl-Sepharose FF 疎水クロマトグラフィー、Superdex200 ゲルろ過クロマトグラフィー、Mono Q イオン交換クロマトグラフィーを行い、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に単一のバンドに精製することができる。
【００３６】
このようにして精製された配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる本発明による還元酵素は、下記の(a)から(f)の理化学的性質を有する。
(a)作用： ２−オキソカルボン酸を還元してR-2-ヒドロキシカルボン酸を生成する。
(b)分子量：SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約33000Daである。
(c)基質特異性：
(d)温度安定性：pH9.5で30分間熱処理した場合、45℃では安定であり、60℃以上では失活する。
(e)至適温度：pH7.5で反応させる場合、温度約45℃において作用が至適である。
(f)安定化剤：還元剤によって、その活性が安定に保持され、さらにICH₃CONH₂で活性化される。
【００３７】
本発明による還元酵素の基質特異性は、次のようにして確認することができる。例えば、酵素活性測定法として、10 mMの基質(2-オキソ-4-フェニル酪酸)、0.1 mMのNADPH、100 μMのリン酸緩衝液(pH 6.0)及び酵素液を含む全容2 mlの反応液を調製した。この反応液の37℃,340 nmにおけるNADPHの吸光度の減少を分光光度計(MILTON ROY SPECTRONIC 3000 ARRAY)で測定した。以上の反応系で基質を含まないものをブランクとして使用した。この条件において１分間に1 μMのNADPHが酸化される酵素量を１単位(U)とし、比活性はタンパク質1 mgあたりの単位数として算出した。タンパク質の測定は牛血清アルブミン(BSA)を標準物質としてLowry法により測定した。
このような解析結果によれば、配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる本発明の還元酵素は、2-オキソ-4-フェニル酪酸の他に特に次の基質に対して特に良く作用することが確認された。各基質に対する2-オキソ-4-フェニル酪酸との反応性を１００としたときの相対活性を以下に示す。
2-オキソヘプタン酸（１３２）
2-オキソオクタン酸（１１２）
2-オキソヘキサン酸（１００）
本発明の還元酵素は、種々の2-オキソカルボン酸に作用して、Ｒ−ヒドロキシカルボン酸を生じる性質を有するため、本発明の還元酵素を用いてＲ−ヒドロキシカルボン酸を工業的に有利に製造することが可能である。
【００３８】
適用可能な2-オキソカルボン酸酸としては特に制限されず、広い範囲の化合物から選択できる。代表的な2-オキソカルボン酸は、式（１）で表される2-オキソカルボン酸である。中でも2-オキソ-4-フェニル酪酸は、医薬品などの中間体として用いられるR-2-ヒドロキシ-4-フェニル酪酸を生じる有用な基質である。
【化３】
式（１）

（式中、X1、X2は、同一かまたは異なっていてもよい、H、NH₄、金属原子、n=1-4）
【００３９】
本発明においてＲ−ヒドロキシカルボン酸の製造に用いられる還元酵素としては、精製酵素の他、部分精製酵素も含まれる。また、本発明においては、これら酵素タンパク質を用いるだけでなく、還元酵素産生能を有する形質転換体自体を用いることも可能である。すなわち、還元酵素産生能を有する形質転換体を直接2-オキソカルボン酸に作用させて、Ｒ−２−ヒドロキシカルボン酸を製造することも可能である。
【００４０】
還元酵素、または還元酵素産生能を有する形質転換体を2-オキソカルボン酸に作用させる際には、還元酵素の活性や安定性、還元酵素産生能を有する乳酸菌の反応性にとって好ましい条件を選択する。本発明による還元酵素が金属イオンによる活性阻害を防ぐために、反応液にEDTAなどのキレート剤を添加することができる。
反応の基質である2-オキソカルボン酸の濃度に特に制限はないが、通常0.1〜30%程度の濃度が用いられる。反応収率は５０−１００％である場合が多い。使用する還元酵素の量は大量に使用すれば反応が速く進む場合が多いが、通常は1U〜1000U/ml程度用いられる。反応温度は還元酵素がその活性を発現できる温度に維持することが好ましく、特に30から50℃に維持することが好ましい。また反応pHも、還元酵素がその活性を発現できるpHに維持することが好ましくpH4〜10で行われる。また、攪拌下、あるいは静置下で行うことができる。
【００４１】
一般に酵素や微生物は、固定化することによって安定化される。固定化する方法としては、ポリアクリルアミドゲル法、含硫多糖ゲル法（カラギーナンゲル法）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法などの公知の方法を用いることができる。固定化した酵素や微生物による反応時間は、D-アミノアシラーゼの量と基質量に左右される。当業者は、経験的にこれらの条件を最も理想的な条件に最適化することができる。通常は10〜100時間の反応により、目的とする反応生成物を効率良く得ることができる。
【００４２】
反応液から反応により生じたＲ−２−ヒドロキシカルボン酸は、例えば、濃縮、等電点沈殿などによる直接結晶法やイオン交換樹脂処理、膜分離などの公知の方法により回収することができる。例えば２−オキソ−４−フェニル酪酸としてＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を生成した場合、酸性下で酢酸エチル等の有機溶媒で抽出することによって、反応液からＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を採取する。
【００４３】
【実施例】
以下に、本発明を実施例をあげて説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
［実施例１］還元酵素の精製
Leuconostoc oenos ATCC 27310株の培養方法
保存stab培地で、30℃、18時間培養を行い、500 mlの前培養培地［Glucose 8 %(w/v), Yeast extract 2 %(w/v), MnSO₄・6H₂O, CaCO₃ 2 %(w/v); pH 7.0］に二白金線分接種し、30℃で30時間、静置培養した。この後、本培養として培地7 lの10 l容ジャーファーメンター(丸菱、MDL 1000)に前培養培地500 mlを接種し、37℃で200 rpm、通気量1 vvmで18時間培養を行った。この培養液から6000 rpm、10分間の遠心分離により菌体の回収を行い、生理食塩水に懸濁し、洗浄を行った。この懸濁液を再度、遠心分離して菌体回収を行い、湿菌体を得た。
保存stab培地：
Glucose 20 g/l
Yeast extract 10 g/l
Polypepton 10 g/l
CH₃COONa・3H₂O 10 g/l
MgSO₄・5H₂O 0.01 g/l
FeSO₄・7H₂O 0.01 g/l
NaCl 0.01 g/l
Agar 15 g/l
CaCO₃ 10 g/l; pH 6.8
【００４４】
粗酵素液の調製
得られた湿菌体に0.02 %(w/v) の2-メルカプトエタノールを含む10 mMリン酸緩衝液(pH 7.2)を50 %(w/v)となるように加え懸濁した。この菌体を氷冷下で、超音波破砕機(BRANSON SONIFIER)を用いて破砕した。これを、15,000 rpm, 10分間遠心分離機により上清を回収し、粗酵素液とした。
【００４５】
酵素活性測定法
酵素活性測定法として、10 mMの基質(2-オキソ-4-フェニル酪酸)、0.1 mMのNADPH、100 μMのリン酸緩衝液(pH 6.0)及び酵素液を含む全容2 mlの反応液を調製した。この反応液の37℃,340 nmにおけるNADPHの吸光度の減少を分光光度計(MILTON ROY SPECTRONIC 3000 ARRAY)で測定した。以上の反応系で基質を含まないものをブランクとして使用した。この条件において１分間に1 μMのNADPHが酸化される酵素量を１単位(U)とし、比活性はタンパク質1 mgあたりの単位数として算出した。タンパク質の測定は牛血清アルブミン(BSA)を標準物質としてLowry法により測定した。
【００４６】
結果と考察
１回のジャー培養7 lの培地あたり、約40 gの湿菌体を得ることができた。この菌体を破砕して得られた粗酵素液中のタンパク質量は、本酵素精製のために十分量であると考えられたため、これを用いて2-オキソ-4-フェニル酪酸還元酵素の精製を行っていくことにした。
【００４７】
2-オキソ-4-フェニル酪酸還元酵素の精製
精製方法の検討の結果、以下に示したような方法により0〜4℃のもとでOPBRaseの精製を行った。なお、以下で述べるリン酸緩衝液はすべて0.02 %(w/v)の2-メルカプトエタノールを含む10 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.2)を用いた。
【００４８】
硫酸アンモニウムによる塩析
L. oenos ATCC 27310株の菌体を破砕して得られた粗酵素液に60 %飽和となるように氷冷下、撹拌しながらゆっくりと硫酸アンモニウムを加えて、4℃で一晩放置し、15,000 rpm、4℃、15分間遠心分離し上清を回収した。これをリン酸緩衝液に対して透析膜(三光純薬)を用いて透析を行い、酵素液を限外濾過膜(Amicon, centriplus)により濃縮した。
【００４９】
疎水クロマトグラフィー
硫安分画後の濃縮液の硫酸アンモニウム濃度を疎水クロマトグラフィーにおける初濃度2 Mの(NH₄)₂SO₄に合わせた。Butyl-Toyopearl 650M(Tosoh Co., Ltd., Tokyo)を充填したガラスカラム(1.1 cm×25 cm)を2 M(NH₄)₂SO₄のリン酸緩衝液300 mlを用いて平衡化した後、酵素液をアプライし、同じ緩衝液200 mlで洗浄した。これをそれぞれ150 mlの2.0 M, 1.5 M, 1.25 M, 1.0 M, 0.75 M, 0.5 M, 0 Mの(NH₄)₂SO₄を用いて硫安濃度を段階的に順次下げていくステップワイズ法により40 ml/hrの流速で溶出を行った。6 mlずつをフラクションとして分画した。この活性画分を集めて限外濾過膜(Amicon, centriplus)により濃縮した。
【００５０】
陰イオン交換クロマトグラフィー
Butyl-Toyopearl 650Mで分画し、集めた活性画分を濃縮した酵素液の硫安を除去した後、リン酸緩衝液200 mlで平衡化したDEAE-Toyopearl 650M(Tosoh Co., Ltd., Tokyo)を充填したガラスカラム(1.1 cm×26.5 cm)にアプライした。同じ緩衝液200 mlで洗浄した後、それぞれ800 mlを用いて0〜0.3 MのKCl濃度を順次上げるグラジエント法によりKClの濃度勾配を直線的に形成させ、60 ml/hrの流速で溶出を行った。16 mlずつをフラクションとして分画した。この活性画分を集めて同様に限外濾過膜(Amicon, centriplus)により濃縮した。
【００５１】
タンパク質の純度検定
Laemmliの緩衝系を用い、ゲル濃度10 %のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により検定した。また、染色は銀染色(シルベストステイン、ナカライ)により、分子量マーカーとしてCombitheck, Calibration protein(Boehringer Mannheim)を用い、fructose-6-phosphate kinase(MW 85,200), glutamate dehydrogenase(MW 55,600), aldolase(MW 39,200), triosephosphateisomerase(MW 26,600)を使用した。
【００５２】
結果と考察
菌体から抽出した粗酵素液を用い、硫安塩析、透析を行った後、Butyl-Toyopearl650Mによる疎水クロマトグラフィーに供した。ステップワイッズ法により溶出を行ったところ硫安濃度1.25 Mで目的の酵素を溶出した。溶出した活性画分を集め濃縮した後、DEAE-Toyopearl 650Mによる陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。本酵素は塩化カリウム濃度約1.5 Mで溶出され、SDS-PAGEにおいて単一なバンドとして確認されたため、これらを回収し、精製酵素標品とした。精製過程と各精製過程における回収率を表１に示す。
【００５３】
【表１】

得られた精製酵素標品は13 %の収率で31.0 U/mgの比活性で得ることができ、粗酵素に比較して約155倍となった。精製酵素標品は電気泳動的に単一なバンドとして検出され、その結果から本酵素の分子量は約33,000であると推定された。
【００５４】
［実施例２］還元酵素をコードする遺伝子のクローニング
・OPBRaseの部分アミノ酸配列の決定
N末端アミノ酸配列の決定
精製酵素標品1 nmol相当分をSpin blot法によりPVDF膜に吸着させ、膜を洗浄後、プロテインシークエンサー(Model 477A-120A, Perkin-Elmer Applied BiosystemsDivision, Foster City, calif., U.S.A.)に供し、解析した。
【００５５】
リジルエンドペプチダーゼ処理による精製酵素の切断、ペプチド断片の調製
精製酵素標品10nmolを乾固し、8 Mとなるように尿素を加えた200 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)で溶解した。これに2 μlの2-メルカプトエタノール(Nacalai Tesque,Inc., Kyoto)を加え、窒素置換を行った後、室温で16時間放置した。3 μlの4-ビニルピリジン(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka)を加え、室温で6時間暗所で振とうし、ピリジルエチル化を行った。反応は、2 μlのギ酸を加えることにより停止させた。
ピリジルエチル化の後、100 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)で2日間透析を行い、再び乾固した。これに8 Mの尿素を含む300 μlの100 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)で溶解し、100 pmolのリジルエンドペプチダーゼ(Wako Pure Chemical Industries)を加え、30℃で24、48、72時間反応させた。
この断片を0.1 ％のトリフルオロ酢酸を溶媒とした逆相C8カラム(Shodex C8P-50 4D, 4.6 mm×150 mm)で流速0.8 ml/min、アセトニトリルの濃度勾配をアプライ5分後から1 ％/minの条件でHPLC展開し、溶出したペプチドをUVモニターの吸光度216 nmと280 nmで検出し、分離回収した。
【００５６】
内部アミノ酸配列の決定
得られたペプチド断片を乾固し、あらかじめポリブレン処理をしたメンブレンにアプライした。同じプロテインシークエンサーを用いた。
結果と考察
これらのアミノ酸配列のホモロジー検索の結果、N末端アミノ酸配列及びOPBR-1とOPBR-4がdehydrogenaseと相同性が見られた。これは酸化還元酵素に属する酵素であり、他のものよりOPBRaseの一部である可能性が高いと思われた。これらの結果からも本酵素は酸化還元酵素であると考えられた。（OPBR-1とOPBR-4は精製酵素より決定した内部部分アミノ酸配列）
【００５７】
・OPBRaseの部分アミノ酸配列からのPCRプライマーの作成、及びプローブの作製PCRプライマーの作製
本酵素のアミノ酸配列より推定される塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを用いた、短いプローブでの目的遺伝子のスクリーニングを行うよりも、L.oenos ATCC 27310株のゲノムDNAへの特異性を高めるため、長いプローブを用いる方がよいと思われた。そのため、プローブのゲノムDNAへの特異性をより高いものへとするために、Polymerase chain reaction法(PCR)による長いプローブの作製を試みた。精製酵素より決定した本酵素のN末端アミノ酸配列、及び内部部分アミノ酸配列をもとに、それぞれ順方向、逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、ダテコンセプト(Co., Ltd., Sapporo)にて依頼合成した。
【００５８】
PCR反応によるプローブの作製
L. oenos ATCC 27310株のゲノムDNAの抽出
菌体培養法
L. oenos ATCC 27310株をstab保存培地に接種し、30℃で一晩培養した後、液体培地［Glucose 8 %(w/v),Yeast extract 2 %(w/v), MnSO₄・6H₂O 10 ppm, CaCO₃ 2 %(w/v) ; pH 7.0］に接種し、30℃、30時間静置培養して得られた菌体を使用した。
【００５９】
ゲノムDNAの抽出
培養後、培地を遠心分離(6,000 rpm, 4℃, 10min)によって菌体を回収し、TEN緩衝液［10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 M NaCl, pH 8.0］で２回洗浄した。これに、終濃度10 mg/mlとなるようにTEN緩衝液で溶解したリゾチーム(卵白由来、Wako PureChemical Industries)溶液を10 ml加えて懸濁し、37℃で一晩、インキュベートした。反応後、終濃度3.3 ％(w/v)となるように10 ％SDSを6 ml加えて37℃で3時間インキュベートし、細胞を破砕した。次に、フェノール処理、エタノール沈澱を行った後、TE緩衝液［10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0］に再溶解し、終濃度100 μg/mlとなるようにRNaseを加えて37℃,1時間消化した。この後、フェノール処理、フェノール‐クロロホルム処理、エタノール沈澱を行い、ゲノムDNAとした。
【００６０】
ゲノムPCR
DNAサーマルサイクラー(Perkin Elmer Cetus Co., Ltd.)を用いてPCRを行った。プライマーsOPBRn+aOPBR1, sOPBRn+aOPBR2, sOPBR1+aOPBR2, sOPBR2+aOPBR1の組み合わせで、４組の反応系を行った。
【００６１】
PCR産物の確認
ライゲーション
ゲノムPCRのそれぞれのプライマーの組み合わせによりPCR産物が１種類と認められたものについて、増幅されたDNA断片の解析を行った。前述の反応系を５チューブずつ作成し、それらを合わせて2％アガロースゲル電気泳動で分離し、Sephaglas BandPrep Kit(Pharmacia Biotech)を用いてゲルから回収した。このDNA断片をTAクロ−ニング法によりT4 DNA ligase(Nippon gene Co., Ltd., Tokyo)を用いてTベクター(pUC19をSma Iで処理し、Taq Polymeraseで3'末端にT塩基を付加したもの)に16℃、4時間インキュベートしてライゲーションを行った。PCR産物は一般にTaq Polymeraseの作用で3'末端にA塩基が１塩基突出した構造を取っており、3'末端にT塩基が１塩基突出したベクターを故意に用いれば、容易にベクターにライゲーションできるというのが、TAクローニング法の原理である。
ライゲ−ション後、ヒ−トショック法でE. coli JM109株を形質転換させ、SOC培地［Trypton(Difco) 20 g/l, Yeast extract(Difco) 5 g/l, NaCl 0.585 g/l, KCl 0.186 g/l, MgCl2 1.9 g/l, Glucose 3.6 g/l］で37℃、1時間振とう培養した後、100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート［Polypepton 10 g/l, Yeast extract 5 g/l, NaCl 10 g/l, Agar 20 g/l; pH 7.0］に塗沫し、37℃で培養した。
【００６２】
PCR産物のDNAシークエンシング、解析
プラスミドの調製
終濃度100 μl/mlのアンピシリンを含むLB培地［Polypepton 10 g/l, Yeast extract 5g/l, NaCl 10 g/l; pH 7.0］に、滅菌した楊枝の先でプレートからコロニーを接種し、37℃、一晩振とう培養した。この培養液からFlexiPrep Kit(Pharmacia Biotech)を用いてプラスミドを抽出した。
【００６３】
シークエンシング、解析
ALFexpress DNA Sequencer(Pharmacia Biotech)を用いて、泳動条件Voltage:1,500V, Current: 55 mA, Power: 25-30 W, Water Preheat: 55℃, Sampling Interval: 2sec, Running Time: 700 minで行った。伸長反応はvistra systems ThermoSequenasecore sequencing kit with 7-deaza-dGTP(Amersham International plc, UK)で行った。アミノ酸配列のホモロジー検索などの情報は、The National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)のインターネットサービスを利用した。
【００６４】
結果と考察
精製されたOPBRaseより決定された部分アミノ酸配列をもとに推定される塩基配列をもつPCRプライマーを作製し、それを用いてL. oenos ATCC 27310株のゲノムDNAについてゲノムPCRを行い、後のハイブリダイゼーションに用いるプローブの作製を試みた。
精製OPBRaseから決定された部分アミノ酸配列のホモロジ−解析の結果、OPBR-1とOPBR-4が酸化還元酵素であるデヒドロゲナーゼと相同性を有していたことから、N末端アミノ酸配列から順方向に１つと、OPBR-1とOPBR-4から順方向と逆方向に２つずつオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、合成した。 このように合成したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてゲノムPCRを行った。電気泳動において単一のバンドとしてPCR産物の増幅が確認されたのは、反応系４組の内、sOPBRn+aOPBR1(680 bp), sOPBRn+aOPBR2(700 bp)の２組だった。このうち680bpのPCR産物の方が上手くライゲーションできた。
よって、このPCR産物のシークエンシングを行い、それより推定されるアミノ酸配列のホモロジーを調べたところ、主に種々の菌株由来のglycerate dehydrogenase、D-3-phosphoglycerate dehydrogenase、2-hydroxyacid dehydrogenaseなどと、プローブのアミノ酸配列中30 %前後の相同性が見られた。これらの酵素も本酵素も酸化還元酵素に分類される酵素群の一部である。PCR増幅断片のアミノ酸配列のホモロジ−解析の結果、このPCR産物はOPBRase遺伝子の一部である可能性があると思われるため、今後のハイブリダイゼーションのためのプローブとして用いることにした。
【００６５】
2-オキソ-4-フェニル酪酸還元酵素遺伝子をもつDNA断片が、L. oenos ATCC 27310株のゲノムライブラリーよりスクリーニングされ、クローニングされた。その結果、得られたプラスミドpOPBRはそのインサ−トDNA中にOPBRase遺伝子と思われるORFを所有していた。OPBRase遺伝子の転写方向はlacプロモーターの遺伝子誘導方向と同じ配置に位置していたが、形質転換体の無細胞抽出液におけるOPBRase活性測定を行ったところ、コントロール(E. coli JM109/pBluescript KS+)と差はなく、SDS-PAGEにおける生成タンパク質の確認においても違いは見られなかった。これは、lacプロモーターと本酵素遺伝子の開始コドンの間の距離に関係するものと思われ、OPBRase遺伝子の活性増大、大量発現を目的とした発現プラスミドの構築を試みることにした。
ベクターpUC18のlacプロモーターと、インサートのOPBRase遺伝子の開始コドンとの距離を短くすることとアミノ酸フレームを合わせることにより、OPBRase遺伝子の活性の増大を試みた。プラスミドpOPBRをもとに、OPBRaseのORFの両端にEcoR I、SalIそれぞれの制限酵素認識部位を導入したDNA断片の作成を行った。OPBRaseのORFの開始コドンの上流にEcoR I認識サイトを導入したプライマーを作製し、終止コドンの下流域のOPBRase遺伝子自身のターミネーターの上流部位と下流部位それぞれにSal I認識サイトを導入したプライマーを作製した。これらのプライマーを用いてプラスミドpOPBRを鋳型としてPCRによりprimer A+B, A+Cの組み合わせでOPBRase遺伝子を含む断片を増幅した。
【００６６】
・合成したプライマー
primer A（配列番号：４）
5'- ACGAA GAATTC(EcoRI site) AACA ATG(開始コドン)AAAAAAGTT -3'
primer B（配列番号：５）
5'- ACCA GTCGAC(Sal I site) GTATGTGGTTTT -3'
primer C（配列番号：６）
5'- TTGGT GTCGAC(Sal I site) CTTGTCTCACA -3'
【００６７】
・結果
プライマーA+B、A+Cの組み合わせで生じた断片をEcoRI、SalIで処理し、同様に処理したpUC18に連結し、OPBRase遺伝子のターミネーターを保持するもの、及び保持しないプラスミドを構築した。それぞれpOPBR-LS、pOPBR-LLと名付けた。pOPBR-LS、pOPBR-LLのベクターDNAとインサートDNAとの繋ぎ目の塩基配列、及びアミノ酸フレームが期待された通りになっていることをシークエンシングにより確認した。SDS-PAGEによる生成タンパク質の確認ではOPBRaseと特定できるバンドは検出できなかった。SDS-PAGEでは菌体の無細胞抽出液を供したため、他のタンパク質と重なっているか、バンドとして確認できる量のタンパク質が生成されなかったためであると思われる。
プラスミドを有するE. coliの酵素活性測定のコントロールとして、ベクターpUC18のみをもつE. coli JM109を使用した。活性測定の結果、pOPBR-LLにおいてpOPBRと比べて活性の上昇が確認された。このことから、lacプロモーターとOPBRase遺伝子のアミノ酸フレームを合わせて新規作製したプラスミドは目的遺伝子の発現が行われたと思われる。以上の結果から、本酵素遺伝子の下流域（ターミネーター）の重要性が示唆された。しかし、IPTGによる酵素遺伝子の発現誘導調節ができていなかった。E. coli JM109/pUC18ではlacプロモーターの発現調節をホスト大腸菌のF'因子上のlac Iqのみに依存しているために、pUC18のコピー数に追いつかずに転写が起こり、IPTGによる誘導調節の効果がなかったと考えられる。IPTGによる発現誘導を可能にするため、あるいは更にOPBRase活性を高めるためにベクター、プロモーターの交換を行い、発現試験を行うことにした。
【００６８】
・プロモーターの交換によるOPBRase遺伝子発現への効果
・lacプロモーターからtrcプロモーターへの交換
pUC18のlacプロモーターとOPBRase遺伝子の開始コドンとのフレームを合わせることにより、活性の増大を試みたが、その活性をさらに増大することと、OPBRase遺伝子の上流に存在するアミノ酸をできるだけ少なくすること、また、誘導物質IPTGによる発現誘導を可能にするためにベクターとしてpTrc99Aを使用し、そのベクターの有するtrcプロモーターを利用してOPBRase遺伝子を発現させることを試みた。ベクターpTrc99Aは、それ自身lacIq遺伝子ももち、ベクターのコピー数に見合うlacIqの発現も行われ、それによりIPTGによる発現誘導が厳密に行えると思われる。また、pTrc99Aはマルチクローニングサイトの上流に強力なプロモーターtrc、下流に強力な転写終了シグナルrrnBをもっている。これらのことから、pTrc99Aを使用した。
【００６９】
方法
pOPBR-LS、pOPBR-LLをそれぞれEcoR I+Sal Iで処理し、電気泳動によりインサートを分離し、その部分をゲルよりDNA CELLを用いて回収した。OPBRase遺伝子のアミノ酸フレームとベクターpTrc99A上の開始コドンのフレームを合わせるために、Klenow Fragmentで断片の平滑末端化を行い、Nco Iで処理したpTrc99Aを同様の方法により平滑末端化を行った。これらを連結し、trcプロモーター制御下の新しい発現プラスミドの構築を行った。
この手法で、pTrc99Aのtrcプロモーターと本酵素遺伝子のアミノ酸フレームが一致させることができた。
【００７０】
・lacプロモーターからT7プロモーターへの交換
trcプロモーターを用いる手法とは別に、OPBRase遺伝子の発現をさらに増大させるために強力なプロモーターであるT7プロモーターをもつベクターpET21b(+)を利用してOPBRase遺伝子の発現を行った。pET21b(+)は強力なプロモーターT7をもっているベクターで、この下流にアミノ酸フレームが合うように目的遺伝子を挿入することにより遺伝子の発現を試みた。このベクターの宿主として用いるE. coli BL21(DE3)は、ゲノム上にT7 RNAポリメラーゼ発現系をもつ。このBL21(DE3)に構築した発現プラスミドを導入すると、IPTGの誘導により、まずBL21(DE3)のゲノム上のT7RNAポリメラーゼが発現し、それにより続いて目的遺伝子の強力な転写が始まる。
【００７１】
方法
pUC18を用いて発現プラスミドを構築したときと同様の方法で新しい発現プラスミドの構築を行った。前に作成したOPBRase遺伝子のORFのN末端側、C末端側にそれぞれEcoR I, Sal Iの制限酵素認識部位を導入したプライマー（先にお送りしましたプライマーです）を使用し、PCRによりOPBRase遺伝子のターミネーターを保持するものと欠けているもの２種類の断片を作成した。これらの断片をEcoR I+Sal Iで処理し、同様に処理したpET21b(+)とライゲーションを行った。ヒートショック法によりE. coliJM109に形質転換した。それぞれの形質転換体からプラスミドを抽出し、適当な制限酵素で処理した後、アガロ−スゲル電気泳動によりインサートの有無を確認した。期待されたインサートDNAをもつプラスミドで再度、E. coli BL21(DE3)を形質転換し、OPBRase遺伝子の発現系を構築した。
【００７２】
・結果
OPBRase遺伝子の発現をさらに増大させるためにベクターpTrc99Aのtrcプロモーター、pET21b(+)のT7プロモーターを利用することとし、pTrc99Aで構築したものをpOPBR-TS, pOPBR-TL, pET21b(+)で構築したものをpOPBR-7S,pOPBR-7Lと名付けた。pOPBRの末尾に-T(7)Sが付いているものはOPBRase遺伝子自身のターミネーターを保持しないもので、-T(7)Lが付いているものはターミネーターを保持するものである。また、-TS(L)が付いているものはpTrc99Aで構築したもので-7S(L)が付いているものはpET21b(+)で構築したものである。
【００７３】
pTrc99Aを用いて構築したプラスミドにおいては、pOPBR-TS, pOPBR-TLの両方において誘導物質IPTGを加えた方がU/mg protein, U/ml brothの値が高く、IPTGにより酵素遺伝子の発現誘導が行われていると思われた。また、自身のターミネーターを保持するpOPBR-TLの方が高い活性が得られた。これは自身のターミネーターの方がOPBRase構造遺伝子と良い位置関係にあり、より厳密に転写が行われ、そのためmRNAが安定になっているためであると思われる。一方、pET21b(+)を用いて構築したプラスミドにおいては、これもpTrc99Aのときと同様に自身のターミネーターを保持するpOPBR-7Lの方が高い活性を示した。
しかし、誘導物質IPTGと活性との関係においては、pTrc99Aのときとは逆にIPTGを加えない方が高い活性を示した。pETシステムにおいて、IPTGを加えることによって目的遺伝子の強制的な生産が行われ、そのため生成タンパク質のインクルージョンボディーが形成される可能性を含んでいる。よって、IPTGを培地中に加えないものよりも酵素活性が低かったと思われる。SDS-PAGEによる生成タンパク質の確認では、いずれの場合もOPBRaseと特定できるバンドは検出できなかった。全形質転換体E.coliで比較した結果、菌体内タンパク質1 mgあたりの活性が最も高いE. coli JM109/pOPBR-TLが目的酵素生産菌として適していると考えられる。
【００７４】
結果として、いずれのベクターを使用した場合においても、本酵素遺伝子自身のターミネーターをもつプラスミドにおいて高い活性が確認された。本発明による酵素の発現における、この遺伝子の下流域（ターミネーター）の重要性が示唆された。また、pTrc99Aを使用した場合は、IPTGによる発現誘導が確認された。
【００７５】
・それぞれの形質転換体の無細胞抽出液の調製と活性測定
それぞれ形質転換体E. coli JM109株のコロニーを100 μl/mlのアンピシリンを含むLB培地5 mlに楊枝で接種し、37 ℃で15時間振とう培養した。誘導物質IPTGは培養直後に終濃度1 mMとなるように培養液に加えた。培養液を3,000 rpm、10 min、4 ℃で遠心して菌体を回収し、少量の10 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.2)で菌体を洗浄し、同様に遠心を行った。菌体回収時の生育は、分光光度計(HITACHI U-1000)でOD660を測定した。1 mlの10 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.2)に懸濁し、超音波破砕機(Sonifier Model 250; Branson)を用いて、氷冷下、１分間×２回行い、細胞を破砕した。これを15,000 rpm、15 min、4 ℃で遠心してその上清を回収し、無細胞抽出液を得た。アッセイ法は公知の方法(Biosci.Biotech.Biochem.,57(1),160-161, 1993)を参考にして行った。終濃度10 mMの2-オキソ-4-フェニル酪酸、0.1 mMのNADPH、100 μMのリン酸カリウム緩衝液(pH 6.0)、及び酵素液を含む全量2 mlの反応液を調製し、37 ℃、340 nmにおけるNADPHの吸光度の減少を分光光度計(MILTON ROY SPECTRONIC 3000ARRAY)で測定した。１分間に1 μMのNADPHが酸化される酵素量を1 Uとした。酵素反応測定のブランクとして、基質を含まない反応系を用意した。粗酵素液としては、約2 mg/mlのタンパク濃度のものが得られ、酵素反応において、これを100 μMのリン酸カリウム緩衝液(pH 6.0)で５倍希釈したものをアッセイ系に200 μl加えた場合、NADPHの良好な減少直線が得られた。形質転換体における細胞内タンパク質量は、Lowry法により測定した。結果を表２にまとめた。
【００７６】
・活性測定結果
【表２】

【００７７】
［実施例８］（形質転換株での遺伝子発現）
実施例７で得られた形質転換株をアンピシリン（50μg/mL）を含む液体 LB培地上で終夜 26℃で振盪培養し、0.1mM IPTGを加えた後、さらに 4時間、30℃で振盪培養を行なった。培養後に菌体を遠心分離により集菌し、生理食塩水で培地成分を洗浄し、1% 2-オキソ-4-フェニル酪酸、0.01% 2-メルカプトエタノールを含む、50mMトリス 塩酸緩衝液（pH 7.0）に懸濁し、全量 1mLの反応液として 30℃、6hr振盪反応を行なった。なお、コントロールとしては大腸菌 JM109株を使用した。
反応終了後、遠心分離により除菌を行ない、反応上清に対し、生成したＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の量を、キラルカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（カラム：CHIRALPAK WH （4.6x250mm）（ダイセル化学工業株式会社製）、溶離液： CH₃CN / 0.5mM CuSO₄=8:2、検出 A220nm、流速 1.5mL/min、カラム温度 50℃）によって、定量し、光学純度も測定した。
形質転換株では反応液上清中に 0.99g/L(>99%ee)のＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸が認められたが、コントロールではＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の蓄積は認められなかった。
【００７８】
【発明の効果】
本発明により、Leuconostoc oenosに由来する還元酵素と、それをコードする遺伝子の構造が明らかにされた。決定された遺伝子の塩基配列を用いて、本発明による還元酵素を遺伝子組み換え体として大量に、そして安価に製造することができる。
本発明の還元酵素は、２−オキソ−４−フェニル酪酸に対する活性が高く、 Ｒ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を効率良く生成することができる。 本発明の還元酵素によって合成することができるＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸は、医薬品原料などとして有用な化合物である。
【００７９】
【配列表】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing R-2-hydroxycarboxylic acid using a gene encoding a reductase and a transformant.
[0002]
[Prior art]
The enzyme not only has a high catalytic function, but also exhibits stereospecificity as well as substrate specificity and reaction specificity. The stereospecificity of an enzyme is almost absolute, with some exceptions.
Now, with the refinement of research in recent years, the importance of handling optically active substances in fields such as pharmaceuticals, agricultural chemicals, feeds and fragrances has increased. Since optical isomers may have completely different physiological activities, techniques for obtaining them specifically are important. For example, thalidomide does not have teratogenicity in D (R) body, but has strong teratogenicity in L (S) body. The use of the racemate for practical use caused a case of phytotoxicity caused by thalidomide. Furthermore, when only one of the enantiomers shows effective physiological activity, the coexistence of both causes not only the problem that the other isomer does not have activity, but also competitive inhibition against the effective enantiomer. . As a result, the biological activity of the racemate may be drastically reduced to 1/2 or less of the effective enantiomer. Therefore, how to obtain (synthesize or split) an optically pure enantiomer is an important industrial issue.
[0003]
Until now, the enzyme of the genus Leuconostoc of the genus Leuconostoc is known as an enzyme which acts on 2-oxocarboxylic acid to produce R-hydroxycarboxylic acid. (Biosci. Biotech. Biochem., 57 (1), 160-161 (1993)) A method for producing R-hydroxycarboxylic acid using a lactic acid bacterium belonging to the genus Leuconostoc is also known. (Biosci. Biotech. Biochem., 56 (12), 2066-2067 (1992), etc.) However, the amount of enzyme produced by the wild strain is small, and a large amount of cells are required to produce R-hydroxycarboxylic acid. is there. Therefore, a method capable of producing this kind of enzyme at low cost and in large quantities has been desired.
For such a demand, isolation of a gene encoding a necessary enzyme and mass production of an enzyme using a transformant by the obtained gene are effective. However, isolation and cloning of the target gene is difficult, and at present there are no reports of successful cloning.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a gene encoding a reductase capable of producing R-hydroxycarboxylic acid using 2-oxocarboxylic acid as a substrate. Another object of the present invention is to provide a recombinant obtained by expression of this gene and its use.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the present inventors have attempted to elucidate the base sequence of a gene by purifying an enzyme from a lactic acid bacterium of the genus Leuconostoc and cloning the gene from the partial amino acid sequence. At this time, since there were no appropriate restriction enzyme recognition sites at both ends of the ORF of the present enzyme gene, a primer having introduced a restriction enzyme recognition site that was easy to use was prepared. Furthermore, the enzyme gene sequence was the same as the enzyme gene sequence except for the 6-base recognition sequence so that the primer could be easily annealed. The present inventors have succeeded for the first time in cloning the gene of the target reductase by such a cloning technique.
In addition, in the construction of the plasmid, EcoRI was used as a restriction enzyme in order to match the lac promoter of pUC18 with the amino acid frame and to reduce the number of peptides upstream of the ORF as much as possible. Furthermore, the expression control region was optimized in order to efficiently express the gene of the present invention. In addition, it has been found that expression of the target enzyme can be further enhanced by combination with a novel terminator. The polynucleotide of the present invention, the protein encoded by this polynucleotide, and variants thereof, and transformants expressing these proteins have been completed based on these findings.
Subsequently, the present inventors succeeded in producing R-hydroxycarboxylic acid using 2-oxocarboxylic acid as a substrate using this transformant. That is, the present invention relates to the following polynucleotides, proteins encoded thereby, methods for producing the same, and methods for synthesizing R-hydroxycarboxylic acid using the proteins.
[0006]
[1] The polynucleotide according to (a) or (b) below.
(A) A polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(B) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
[2] The polynucleotide according to (c) or (d) below.
(C) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and having a reductase activity having the actions described in i) and ii) below: Encoding polynucleotide.
(D) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, and has the physicochemical properties described in i) and ii) below: A polynucleotide encoding a protein having reductase activity.
i) Action: Acts on 2-oxocarboxylic acid to produce R-hydroxycarboxylic acid.
ii) Substrate specificity: acts on 2-oxo-4-phenylbutyric acid to yield R-2-hydroxy-4-phenylbutyric acid.
[3] A recombinant protein encoded by any one of the polynucleotides according to [1] or [2].
[4] A vector into which the polynucleotide according to [1] or [2] is inserted.
[5] The vector according to [4], wherein a terminator comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 3 is operably linked to the polynucleotide described in [1] or [2].
[6] A terminator comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
[7] A transformant that retains the polynucleotide of any one of [1] or [2] and / or the vector of [4] or [5] in an expressible manner.
[8] A method for producing the protein according to [3], comprising a step of culturing the transformant according to [7] and recovering the expression product.
[9] A polynucleotide having the chain length of at least 15 nucleotides, which is a polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or a polynucleotide that hybridizes with its complementary strand.
[10] The polynucleotide synthesis primer according to [1] or [2], which comprises the polynucleotide according to [9].
[11] The polynucleotide detection probe according to [1] or [2], comprising the polynucleotide according to [9].
[12] The protein according to [3] and / or the transformant according to [7] is allowed to act on a 2-oxocarboxylic acid represented by the following formula (1) or a salt thereof: A process for producing R-2-hydroxycarboxylic acid.
[Chemical formula 2]
Formula (1)

Wherein X1 and X2 may be the same or different, H, NH _Four , Metal atoms, n = 1-4)
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention relates to a polynucleotide encoding a reductase and a homologue thereof. The polynucleotide encoding the reductase of the present invention includes the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, for example. The base sequence shown in SEQ ID NO: 1 encodes a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the protein containing this amino acid sequence constitutes a preferred embodiment of the reductase according to the present invention. By the way, the codon which codes an amino acid is not single, and it is a known matter that a plurality of codons correspond by degeneracy. Therefore, the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 includes not only the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, but also any base sequence based on different codons.
[0008]
The homologue of the polynucleotide encoding the reductase of the present invention is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, wherein one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and And / or a polynucleotide encoding a protein comprising an added amino acid sequence and having the following physicochemical properties i) and ii):
i) Action: Acts on 2-oxocarboxylic acid to produce R-hydroxycarboxylic acid.
ii) Substrate specificity: acts on 2-oxo-4-phenylbutyric acid to yield R-2-hydroxy-4-phenylbutyric acid.
Those skilled in the art will be able to introduce site-directed mutagenesis into DNA described in SEQ ID NO: 1 (Nucleic Acid Res. 10, pp. 6487 (1982), Methods in Enzymol. 100, pp. 448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt. ., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991), etc., to introduce homologs of polynucleotides by introducing substitutions, deletions, insertions, and / or addition mutations as appropriate. Alternatively, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is derived from Leuconostoc oenos ATCC 27310 strain, whereas it can be obtained from this other species based on the disclosure of the present invention. A polynucleotide encoding a protein having a functionally equivalent enzyme activity constitutes a homolog in the present invention, and these homologs can be referred to as naturally occurring homologs.
The polynucleotide of the present invention can be DNA or RNA, and the structure thereof may be a single strand or a double strand with a complementary strand. The length of the polynucleotide of the present invention is not limited. Furthermore, the polynucleotide of the present invention may be composed of natural or artificial nucleotide derivatives. It can also be modified with various labels and tags. In addition, the polynucleotide of the present invention includes those derived from genomes and cDNAs, artificially synthesized polynucleotides, and the like.
[0009]
The homologue of the polynucleotide of the present invention can hybridize with a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, and acts on 2-oxocarboxylic acid, and R-2-hydroxycarboxylic acid Also included are polynucleotides that encode proteins having the activity of producing The polynucleotide capable of hybridizing under stringent conditions is one or a plurality of any at least 20, preferably at least 30, for example, 40, 60 or 100 consecutive sequences in SEQ ID NO: 1. Using the selected DNA as a probe DNA, for example, using ECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech), under the conditions described in the manual (wash: 42 ° C, primary wash buffer containing 0.5x SSC), Refers to hybridizing DNA.
[0010]
Further, the homologue of the polynucleotide of the present invention is a DNA encoding a protein having a homology of at least 70%, preferably at least 80% or 90%, more preferably 95% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Including. Protein homology search can be performed using, for example, the FASTA program or BLAST program for DNA Databank of JAPAN (DDBJ).
[0011]
The present invention includes a reductase comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and having an activity of acting on 2-oxocarboxylic acid to produce R-2-hydroxycarboxylic acid, and homologs thereof. The protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 constitutes a preferred embodiment of the reductase according to the present invention.
[0012]
The homologue of the reductase of the present invention includes an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Those skilled in the art will be able to introduce site-directed mutagenesis into DNA described in SEQ ID NO: 1 (Nucleic Acid Res. 10, pp. 6487 (1982), Methods in Enzymol. 100, pp. 448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991)), etc., according to the present invention by appropriately introducing substitutions, deletions, insertions, and / or addition mutations. A polynucleotide encoding a reductase homolog can be obtained. By introducing the resulting polynucleotide into a host and expressing it, it is possible to obtain the homologue of the reductase described in SEQ ID NO: 2.
[0013]
The polynucleotide encoding the reductase of the present invention can be isolated by, for example, the following method. That is, the polynucleotide of the present invention is isolated by screening a genomic library of lactic acid bacteria capable of producing reductase using a DNA containing a base sequence selected from the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a probe. Can do. Since the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is derived from the Leuconostoc oenos ATCC 27310 strain, the polynucleotide of the present invention can be isolated using a library prepared from this strain. Moreover, the homolog in this invention can also be isolated by utilizing the library derived from a related lactic acid bacterium or another kind of lactic acid bacterium.
[0014]
A genomic library of lactic acid bacteria can be obtained by a known method. That is, first, a culture of lactic acid bacteria is collected and destroyed physically or enzymatically. Specifically, the cell wall can be destroyed by freezing the cells, for example. Furthermore, the nuclear fraction is collected, nucleic acid is extracted with phenol / chloroform or the like, and cleaved at random with a restriction enzyme or the like. A genomic library can be obtained by inserting randomly cut genomic fragments into an appropriate cloning vector.
[0015]
Probes are hybridized to these libraries, preferably under stringent conditions as described above. Positive clones are collected and their nucleotide sequences are determined to confirm that they are polynucleotides according to the present invention. When the isolated polynucleotide does not include the full length of the protein translation region, the full length base sequence can be obtained based on the obtained base sequence information. As a method for amplifying an unknown region by PCR, a method (Genetics 120, 621-623 (1988)) in which chromosomal DNA is digested with an appropriate restriction enzyme and then self-cyclized DNA is used as a template is known. is there. Alternatively, the RACE method (Rapid Amplification of cDNA End, “PCR Experiment Manual” p25-33, HBJ Publishing), which performs PCR by ligating a linker to the end of a DNA fragment, is also known.
[0016]
Furthermore, the polynucleotide of the present invention can also be obtained using a PCR method using primers set based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 25. That is, a PCR method is performed using the genomic library described above as a template, and a fragment having a target length is recovered. By inserting this into an appropriate cloning vector and cloning, the polynucleotide of the present invention can be isolated. By using a degenerative primer as a primer, not only SEQ ID NO: 1, but also a homolog having high homology with this base sequence can be synthesized. Based on a given base sequence, designing a degenerative primer capable of amplifying the sequence or a homologue is routinely performed by those skilled in the art. The polynucleotide of the present invention can also be obtained by synthesis in addition to genomic DNA or cDNA cloned by the above method.
[0017]
A reductase expression vector is provided by inserting the isolated polynucleotide encoding the reductase according to the present invention into a known expression vector. In addition, the reductase of the present invention can be obtained from a recombinant by culturing a transformant transformed with this expression vector.
In order to express a reductase in the present invention, a microorganism to be transformed can be transformed with a recombinant vector containing a polynucleotide encoding a polypeptide having a reductase activity to express the reductase activity. If it is a living thing, there will be no restriction in particular. Examples of the microorganisms that can be used include the following microorganisms.
[0018]
Escherichia
Genus Bacillus
Pseudomonas genus
Serratia genus
Brevibacterium genus
Corynebacterium genus
Streptococcus genus
Bacteria for which host vector systems such as Lactobacillus are developed
Rhodococcus genus
Streptomyces genus Streptomyces and other host vector systems being developed
The genus Saccharomyces
Kluyveromyces genus
The genus Schizosaccharomyces
Genus Zygosaccharomyces
The genus Yarrowia
Genus Trichosporon
Rhodosporidium genus
Hansenula genus
Pichia genus
Yeasts for which host vector systems such as Candida are being developed
Genus Neurospora
Aspergillus genus
Cephalosporium genus
Molds for which host vector systems such as Trichoderma are developed
[0019]
The procedure for producing a transformant and the construction of a recombinant vector suitable for the host can be performed according to techniques commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering (for example, Sambrook et al., Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratories). In order to express the D-aminoacylase gene of the present invention in microorganisms or the like, it is first necessary to introduce this DNA into a plasmid vector or phage vector that is stably present in the microorganism, and to transcribe and translate the genetic information. There is. For that purpose, a promoter corresponding to a unit that controls transcription / translation may be incorporated upstream of the 5′-side of the DNA strand of the present invention, and more preferably a terminator is incorporated downstream of the 3′-side. As the promoter and terminator, it is necessary to use a promoter and terminator known to function in a microorganism used as a host. “Microbiology Basic Course 8 Genetic Engineering / Kyoritsu Shuppan” regarding vectors, promoters, terminators, etc. that can be used in these various microorganisms, especially regarding yeast, Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990), Yeast 8 423-488 (1992), and the like.
[0020]
For example, in the genus Escherichia, particularly Escherichia coli, pBR and pUC plasmids can be used as plasmid vectors, and lac (β-galactosidase), trp (tryptophan operon), tac, trc (lac, trp). Fusion), promoters derived from λ phage PL, PR, etc. can be used. Moreover, as the terminator, a terminator derived from trpA, phage, or rrnB ribosomal RNA can be used.
[0021]
In the genus Bacillus, pUB110 series plasmids, pC194 series plasmids and the like can be used as vectors, and can be integrated into chromosomes. Further, apr (alkaline protease), npr (neutral protease), amy (α-amylase) and the like can be used as promoters and terminators.
In the genus Pseudomonas, host vector systems have been developed for Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia, and the like. A broad host range vector (including genes necessary for autonomous replication derived from RSF1010) pKT240 based on the plasmid TOL plasmid, which is involved in the degradation of toluene compounds, can be used, and a lipase (specialized as a promoter and terminator) can be used. Kaihei 5-284973) Genes can be used.
[0022]
In the genus Brevibacterium, particularly in Brevibacterium lactofermentum, plasmid vectors such as pAJ43 (Gene 39, 281 (1985)) can be used. As the promoter and terminator, promoters and terminators used in Escherichia coli can be used as they are.
In the genus Corynebacterium, especially Corynebacterium glutamicum, plasmid vectors such as pCS11 (Japanese Patent Laid-Open No. 57-183799) and pCB101 (Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984) are available. is there.
In the genus Streptococcus, pHV1301 (FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985), pGK1 (Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)), etc. can be used as a plasmid vector.
[0023]
In the genus Lactobacillus, pAMβ1 (J. Bacteriol. 137, 614 (1979)) developed for Streptococcus can be used, and those used in Escherichia coli as promoters can be used. .
In the genus Rhodococcus, a plasmid vector isolated from Rhodococcus rhodochrous can be used (J. Gen. Microbiol. 138, 1003 (1992)).
[0024]
In the genus Streptomyces, plasmids can be constructed according to the method described in Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985). In particular, in Streptomyces lividans, pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986), pKC1064 (Gene 103,97-99 (1991)), pUWL-KS (Gene 165,149 -150 (1995)) can be used. In addition, a similar plasmid can be used in Streptomyces virginiae (Actinomycetol. 11, 46-53 (1997)).
In the genus Saccharomyces (especially Saccharomyces cerevisiae), YRp, YEp, YCp, and YIp plasmids can be used, using homologous recombination with ribosomal DNA present in multiple copies in the chromosome. Such integration vectors (EP 537456, etc.) are extremely useful because they can introduce genes in multiple copies and can stably hold genes. ADH (alcohol dehydrogenase), GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), PHO (acid phosphatase), GAL (β-galactosidase), PGK (phosphoglycerate kinase), ENO (enolase) Promoters and terminators such as are available.
[0025]
In Kluyveromyces genus, especially Kluyveromyces lactis, 2 μm plasmid derived from Saccharomyces cerevisiae, pKD1 plasmid (J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)), involved in killer activity A plasmid derived from pGKl1, an autonomously proliferating gene KARS plasmid in the genus Kleberomyces, a vector plasmid (EP 537456, etc.) that can be integrated into the chromosome by homologous recombination with ribosomal DNA and the like can be used. In addition, promoters and terminators derived from ADH, PGK and the like can be used.
In the genus Schizosaccharomyces, plasmid vectors containing ARS (genes involved in autonomous replication) derived from Schizosaccharomyces pombe and selectable markers that complement the auxotrophy derived from Saccharomyces cerevisiae are available ( Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)). Moreover, the ADH promoter derived from Schizosaccharomyces pombe can be used (EMBO J. 6, 729 (1987)). In particular, pAUR224 is commercially available from Takara Shuzo and can be easily used.
[0026]
In the genus Zygosaccharomyces, plasmid vectors derived from pSB3 (Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)) derived from Zygosaccharomyces rouxii can be used, and the PHO5 promoter derived from Saccharomyces cerevisiae In addition, a promoter of GAP-Zr (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) derived from Tigosaccharomyces rouxi (Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)) can be used.
In the genus Hansenula, host vector systems have been developed in Hansenula polymorpha. As a vector, genes involved in autonomous replication derived from Hansenula polymorpha (HARS1, HARS2) can be used, but since they are relatively unstable, multicopy integration into the chromosome is effective (Yeast 7, 431- 443 (1991)). In addition, AOX (alcohol oxidase), FDH (formate dehydrogenase) promoters induced by methanol, etc. can be used.
[0027]
In the genus Pichia (Pichia), host vector systems using Pichia pastoris and other genes involved in Pichia-derived autonomous replication (PARS1, PRS2) have been developed (Mol. Cell. Biol. 5 , 3376 (1985)), strong promoters such as AOX that can be induced by high concentration culture and methanol (Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)).
In the genus Candida, the host vector system in Candida maltosa, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida utilis, etc. Has been developed. In Candida maltosa, ARS derived from Candida maltosa has been cloned (Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)), and vectors using this have been developed. In Candida utilis, a strong promoter has been developed for the chromosome integration type vector (Japanese Patent Laid-Open No. 08-173170).
[0028]
In the genus Aspergillus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, etc. are the most studied among molds, and integration into plasmids and chromosomes is available. Promoters derived from external protease or amylase are available (Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)).
In the genus Trichoderma, a host vector system using Trichoderma reesei has been developed, and an extracellular cellulase gene-derived promoter or the like can be used (Biotechnology 7, 596-603 (1989)).
[0029]
The present invention also relates to a terminator comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and a method for producing a recombinant of the reductase according to the present invention using the terminator. When a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is used as the polynucleotide of the present invention and expressed in E. coli as a host, a higher level of expression can be expected by combining the terminator shown in SEQ ID NO: 3. The terminator consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3 is a novel gene derived from the Leuconostoc oenos genome from which the reductase of the present invention was originally isolated. When this novel terminator is arranged downstream of the polynucleotide of the present invention, high expression that cannot be expected with known enhancers and terminators is observed. Therefore, in expressing the polynucleotide of the present invention, it is desirable to use the terminator shown in SEQ ID NO: 3.
[0030]
In addition to microorganisms, various host and vector systems have been developed in plants and animals, especially in plants using moths (Nature 315, 592-594 (1985)), rapeseed, corn, potatoes and other plants. A system for expressing a large amount of heterologous protein has been developed and can be suitably used.
[0031]
The host microorganism transformed with the polynucleotide encoding the reductase of the present invention is cultured according to known information, and the reductase according to the present invention can be recovered from the culture. As a medium, any medium can be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and other nutrients, and a synthetic medium or a natural medium can be used, and a liquid medium or a solid medium can be used.
Specifically, as a carbon source, glucose, fructose, maltose, galactose, starch, starch hydrolysate, molasses, sugars such as molasses, natural carbohydrates such as wheat, corn, alcohols such as glycerol, methanol, ethanol, Considering the assimilation of molds used from common carbon sources such as fatty acids such as acetic acid, gluconic acid, pyruvic acid and citric acid, hydrocarbons such as normal paraffin, and amino acids such as glycine, glutamine and asparagine Thus, one or more kinds are appropriately selected and used. Nitrogen sources include meat extract, peptone, yeast extract, soy hydrolyzate, milk casein, casamino acid, various amino acids, corn steep liquor, other animal, plant, microbial hydrolyzate, nitrogen compounds, ammonia, In consideration of the assimilation of fungi, ammonium salt such as ammonium nitrate, ammonium sulfate and sodium chloride, nitrates such as sodium nitrate, and inorganic nitrogen compounds such as urea are used by appropriately selecting one or more kinds.
Furthermore, as an inorganic salt, one or two or more kinds can be appropriately selected and used from a trace amount of magnesium, manganese, potassium, calcium, sodium, copper, zinc and other phosphates, hydrochlorides, nitrates, acetates and the like. . Moreover, you may add antifoamers, such as vegetable oil, surfactant, and silicone, as needed.
Culturing can be performed in a liquid medium containing the above-mentioned medium components by using a normal culture method such as shaking culture, aeration and agitation culture, continuous culture, or fed-batch culture.
The culture conditions may be appropriately selected depending on the type of culture and the culture method, and are not particularly limited as long as the strain can grow and produce reductase. Usually, it is desirable to adjust the pH at the start of the culture to 4 to 10, preferably 6 to 8, and to culture at a temperature of 15 to 50 ° C., preferably 25 to 35 ° C.
[0032]
Conditions for inducing the expression of foreign genes in the transformant are given after the cells have sufficiently grown or during the growth process. For example, with respect to the lac promoter, expression of a foreign gene linked downstream thereof is induced by providing IPTG. Or if it is a temperature sensitive promoter, it will culture | cultivate on the temperature conditions required for expression.
[0033]
The culture time is not particularly limited as long as cells having a sufficient amount of reductase activity can be obtained. Usually, the culture is performed for 1 to 14 days, preferably 1 to 3 days. The reductase of the present invention produced and accumulated along with gene expression can be collected and collected by the following method.
[0034]
When the reductase is accumulated in the microbial cells, after culturing, the microbial cells are collected by a method such as filtration and centrifugation, and the microbial cells are washed with a buffer solution, physiological saline, etc. Single physical treatment such as ultrasonic treatment, pressure treatment, osmotic pressure difference treatment, grinding treatment, or biochemical treatment such as cell wall lytic enzyme treatment such as lysozyme or contact treatment with a surfactant. Alternatively, by carrying out in combination, the cells can be disrupted and the reductase extracted. The crude reductase thus obtained is subjected to salting out, fractional precipitation with organic solvents, salting out chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography, dye chromatography, hydroxyapatite chromatography, affinity chromatography. Separation by various methods such as open column, medium pressure chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC) and separation by electrophoretic methods such as isoelectric focusing and native-electrophoresis, alone or in combination It can be purified by use.
[0035]
Specifically, for example, the cells collected by filtration or centrifugation are frozen, suspended in a buffer after pulverization, and ground using Dyno Mill to obtain a reductase extract, and then ammonium sulfate is used. Performed salting-out treatment, DEAE-Sepharose FF ion exchange chromatography, Phenyl-Sepharose FF hydrophobic chromatography, Superdex200 gel filtration chromatography, Mono Q ion exchange chromatography, single SDS-polyacrylamide gel electrophoresis The band can be purified.
[0036]
The reductase according to the present invention consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 thus purified has the following physicochemical properties (a) to (f).
(a) Action: 2-oxocarboxylic acid is reduced to produce R-2-hydroxycarboxylic acid.
(b) Molecular weight: The molecular weight in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis is about 33000 Da.
(c) Substrate specificity:
(d) Temperature stability: When heat-treated at pH 9.5 for 30 minutes, it is stable at 45 ° C and deactivated at 60 ° C or higher.
(e) Optimum temperature: When the reaction is carried out at pH 7.5, the action is optimum at a temperature of about 45 ° C.
(f) Stabilizer: The activity is stably maintained by the reducing agent, and ICH _Three CONH ₂ It is activated by.
[0037]
The substrate specificity of the reductase according to the present invention can be confirmed as follows. For example, as a method for measuring enzyme activity, a total volume of 2 ml reaction solution containing 10 mM substrate (2-oxo-4-phenylbutyric acid), 0.1 mM NADPH, 100 μM phosphate buffer (pH 6.0), and enzyme solution Was prepared. The decrease in the absorbance of NADPH at 37 ° C. and 340 nm of this reaction solution was measured with a spectrophotometer (MILTON ROY SPECTRONIC 3000 ARRAY). A blank containing no substrate in the above reaction system was used. Under this condition, the amount of enzyme capable of oxidizing 1 μM NADPH per minute was defined as 1 unit (U), and the specific activity was calculated as the number of units per 1 mg of protein. Protein was measured by the Lowry method using bovine serum albumin (BSA) as a standard substance.
According to such analysis results, the reductase of the present invention consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 can act particularly well on the following substrate in addition to 2-oxo-4-phenylbutyric acid. confirmed. The relative activity when the reactivity with 2-oxo-4-phenylbutyric acid for each substrate is taken as 100 is shown below.
2-Oxoheptanoic acid (132)
2-Oxooctanoic acid (112)
2-Oxohexanoic acid (100)
Since the reductase of the present invention has the property of acting on various 2-oxocarboxylic acids to generate R-hydroxycarboxylic acids, the R-hydroxycarboxylic acids are industrially advantageous by using the reductase of the present invention. It is possible to manufacture.
[0038]
The applicable 2-oxocarboxylic acid is not particularly limited and can be selected from a wide range of compounds. A typical 2-oxocarboxylic acid is a 2-oxocarboxylic acid represented by the formula (1). Among them, 2-oxo-4-phenylbutyric acid is a useful substrate that produces R-2-hydroxy-4-phenylbutyric acid used as an intermediate for pharmaceuticals and the like.
[Chemical 3]
Formula (1)

Wherein X1 and X2 may be the same or different, H, NH _Four , Metal atoms, n = 1-4)
[0039]
In the present invention, the reductase used for the production of R-hydroxycarboxylic acid includes a partially purified enzyme in addition to a purified enzyme. In the present invention, not only these enzyme proteins but also transformants having reductase production ability can be used. That is, it is possible to produce R-2-hydroxycarboxylic acid by directly reacting a transformant having reductase producing ability with 2-oxocarboxylic acid.
[0040]
When a reductase or a transformant capable of producing a reductase is allowed to act on 2-oxocarboxylic acid, conditions that are favorable for the activity and stability of the reductase and the reactivity of lactic acid bacteria having the ability to produce a reductase are selected. . In order to prevent the reductase according to the present invention from inhibiting the activity due to metal ions, a chelating agent such as EDTA can be added to the reaction solution.
The concentration of 2-oxocarboxylic acid which is a substrate for the reaction is not particularly limited, but a concentration of about 0.1 to 30% is usually used. The reaction yield is often 50-100%. If the amount of the reductase used is large, the reaction proceeds frequently in many cases. Usually, about 1 U to 1000 U / ml is used. The reaction temperature is preferably maintained at a temperature at which the reductase can exhibit its activity, and is particularly preferably maintained at 30 to 50 ° C. The reaction pH is also preferably maintained at a pH of 4 to 10 so that the reductase can maintain its activity. Moreover, it can carry out under stirring or standing still.
[0041]
In general, enzymes and microorganisms are stabilized by immobilization. As a method for immobilization, known methods such as polyacrylamide gel method, sulfur-containing polysaccharide gel method (carrageenan gel method), alginic acid gel method, and agar gel method can be used. The reaction time of the immobilized enzyme or microorganism depends on the amount and base mass of D-aminoacylase. One skilled in the art can empirically optimize these conditions to the most ideal conditions. Usually, the target reaction product can be efficiently obtained by the reaction for 10 to 100 hours.
[0042]
The R-2-hydroxycarboxylic acid produced by the reaction from the reaction solution can be recovered by a known method such as a direct crystallization method by concentration, isoelectric precipitation, ion exchange resin treatment, membrane separation, or the like. For example, when R-2-hydroxy-4-phenylbutyric acid is produced as 2-oxo-4-phenylbutyric acid, it is extracted with R-2-hydroxy-4 from the reaction solution by extraction with an organic solvent such as ethyl acetate under acidic conditions. -Collect phenylbutyric acid.
[0043]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[Example 1] Purification of reductase
Culture method of Leuconostoc oenos ATCC 27310 strain
Cultivate in storage stab medium for 18 hours at 30 ° C. 500 ml of preculture medium [Glucose 8% (w / v), Yeast extract 2% (w / v), MnSO _Four ・ 6H ₂ O, CaCO _Three 2% (w / v); pH 7.0] was inoculated with a biplatinum wire and statically cultured at 30 ° C. for 30 hours. After that, as a main culture, a 10 l jar fermenter (Maruhishi, MDL 1000) of 7 l medium was inoculated with 500 ml of the preculture medium, and cultured at 37 ° C., 200 rpm, aeration volume 1 vvm for 18 hours . Bacteria were collected from this culture by centrifugation at 6000 rpm for 10 minutes, suspended in physiological saline and washed. This suspension was centrifuged again to collect microbial cells to obtain wet microbial cells.
Preserved stab medium:
Glucose 20 g / l
Yeast extract 10 g / l
Polypepton 10 g / l
CH _Three COONa ・ 3H ₂ O 10 g / l
MgSO _Four ・ 5H ₂ O 0.01 g / l
FeSO _Four ・ 7H ₂ O 0.01 g / l
NaCl 0.01 g / l
Agar 15 g / l
CaCO _Three 10 g / l; pH 6.8
[0044]
Preparation of crude enzyme solution
To the obtained wet cells, 10 mM phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.02% (w / v) 2-mercaptoethanol was added and suspended at 50% (w / v). The cells were crushed using an ultrasonic crusher (BRANSON SONIFIER) under ice cooling. The supernatant was collected by a centrifuge at 15,000 rpm for 10 minutes to obtain a crude enzyme solution.
[0045]
Enzyme activity measurement method
As a method for measuring enzyme activity, prepare a total volume of 2 ml reaction solution containing 10 mM substrate (2-oxo-4-phenylbutyric acid), 0.1 mM NADPH, 100 μM phosphate buffer (pH 6.0), and enzyme solution. did. The decrease in the absorbance of NADPH at 37 ° C. and 340 nm of this reaction solution was measured with a spectrophotometer (MILTON ROY SPECTRONIC 3000 ARRAY). A blank containing no substrate in the above reaction system was used. Under this condition, the amount of enzyme capable of oxidizing 1 μM NADPH per minute was defined as 1 unit (U), and the specific activity was calculated as the number of units per 1 mg of protein. Protein was measured by the Lowry method using bovine serum albumin (BSA) as a standard substance.
[0046]
Results and discussion
Approximately 40 g of wet cells could be obtained per 7 l of medium per jar culture. The amount of protein in the crude enzyme solution obtained by crushing the cells was considered to be sufficient for the purification of the enzyme, and this was used to purify 2-oxo-4-phenylbutyrate reductase. I decided to go.
[0047]
Purification of 2-oxo-4-phenylbutyrate reductase
As a result of examination of the purification method, OPBRase was purified at 0 to 4 ° C. by the method as shown below. The phosphate buffer described below was a 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2) containing 0.02% (w / v) 2-mercaptoethanol.
[0048]
Salting out with ammonium sulfate
To the crude enzyme solution obtained by disrupting the cells of L. oenos ATCC 27310 strain, slowly add ammonium sulfate with stirring to 60% saturation under ice-cooling, and let stand at 4 ° C overnight. Centrifugation was performed at 4 ° C. for 15 minutes, and the supernatant was collected. This was dialyzed against a phosphate buffer using a dialysis membrane (Sanko Junyaku), and the enzyme solution was concentrated using an ultrafiltration membrane (Amicon, centriplus).
[0049]
Hydrophobic chromatography
The concentration of ammonium sulfate in the concentrated solution after ammonium sulfate fractionation was measured with the initial concentration of 2 M (NH _Four ) ₂ SO _Four To match. A glass column (1.1 cm x 25 cm) packed with Butyl-Toyopearl 650M (Tosoh Co., Ltd., Tokyo) is 2 M (NH _Four ) ₂ SO _Four After equilibrating with 300 ml of the phosphate buffer, the enzyme solution was applied and washed with 200 ml of the same buffer. 150 ml of 2.0 M, 1.5 M, 1.25 M, 1.0 M, 0.75 M, 0.5 M, 0 M (NH _Four ) ₂ SO _Four The elution was carried out at a flow rate of 40 ml / hr by the stepwise method of gradually reducing the ammonium sulfate concentration step by step. Each 6 ml fraction was fractionated. This active fraction was collected and concentrated with an ultrafiltration membrane (Amicon, centriplus).
[0050]
Anion exchange chromatography
DEAE-Toyopearl 650M (Tosoh Co., Ltd., Tokyo) equilibrated with 200 ml of phosphate buffer solution after removing ammonium sulfate from the concentrated enzyme solution after fractionation with Butyl-Toyopearl 650M Was applied to a glass column (1.1 cm × 26.5 cm) packed with. After washing with 200 ml of the same buffer, form a KCl concentration gradient linearly by elevating the KCl concentration from 0 to 0.3 M using 800 ml each and elution at a flow rate of 60 ml / hr. It was. Each 16 ml fraction was fractionated. The active fractions were collected and similarly concentrated using an ultrafiltration membrane (Amicon, centriplus).
[0051]
Protein purity test
Using a Laemmli buffer system, the assay was performed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) at a gel concentration of 10%. In addition, the staining is silver staining (Sylveste stain, Nacalai), using Combitheck, Calibration protein (Boehringer Mannheim) as molecular weight markers, fructose-6-phosphate kinase (MW 85,200), glutamate dehydrogenase (MW 55,600), aldolase (MW 39,200 ), triosephosphateisomerase (MW 26,600) was used.
[0052]
Results and discussion
The crude enzyme solution extracted from the cells was subjected to ammonium sulfate salting out and dialysis, and then subjected to hydrophobic chromatography using Butyl-Toyopearl650M. When the elution was performed by the stepwise method, the target enzyme was eluted at an ammonium sulfate concentration of 1.25 M. The eluted active fractions were collected and concentrated, and then subjected to anion exchange chromatography using DEAE-Toyopearl 650M. Since this enzyme was eluted at a potassium chloride concentration of about 1.5 M and confirmed as a single band on SDS-PAGE, these were collected and used as purified enzyme preparations. Table 1 shows the purification process and the recovery rate in each purification process.
[0053]
[Table 1]

The obtained purified enzyme preparation was obtained with a specific activity of 31.0 U / mg with a yield of 13%, which was about 155 times that of the crude enzyme. The purified enzyme preparation was electrophoretically detected as a single band. From the results, the molecular weight of the enzyme was estimated to be about 33,000.
[0054]
[Example 2] Cloning of gene encoding reductase
・ Determining the partial amino acid sequence of OPBRase
Determination of N-terminal amino acid sequence
The purified enzyme preparation equivalent to 1 nmol is adsorbed on a PVDF membrane by the spin blot method, washed, and then subjected to protein sequencer (Model 477A-120A, Perkin-Elmer Applied Biosystems Division, Foster City, calif., USA) for analysis did.
[0055]
Cleavage of purified enzyme by lysyl endopeptidase treatment, preparation of peptide fragments
10 nmol of the purified enzyme preparation was dried and dissolved in a 200 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) to which urea was added to 8 M. 2 μl of 2-mercaptoethanol (Nacalai Tesque, Inc., Kyoto) was added thereto, and after nitrogen substitution, the mixture was allowed to stand at room temperature for 16 hours. 3 μl of 4-vinylpyridine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka) was added, and the mixture was shaken at room temperature for 6 hours in the dark to perform pyridylethylation. The reaction was stopped by adding 2 μl formic acid.
After pyridylethylation, dialysis was performed with 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) for 2 days, and the mixture was again dried. This was dissolved in 300 μl of 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 8 M urea, 100 pmol of lysyl endopeptidase (Wako Pure Chemical Industries) was added, and then at 30 ° C for 24, 48, 72 hours. Reacted.
Using a 0.18% trifluoroacetic acid as a solvent for this fragment on a reverse phase C8 column (Shodex C8P-50 4D, 4.6 mm × 150 mm), the flow rate was 0.8 ml / min, and the acetonitrile concentration gradient was 1% / min after 5 minutes of application. HPLC development was performed under the condition of min, and the eluted peptides were detected by UV monitor absorbance 216 nm and 280 nm and separated and recovered.
[0056]
Determination of internal amino acid sequence
The obtained peptide fragment was dried and applied to a membrane previously treated with polybrene. The same protein sequencer was used.
Results and discussion
As a result of homology search of these amino acid sequences, N-terminal amino acid sequences and OPBR-1 and OPBR-4 were found to be homologous with dehydrogenase. This is an enzyme belonging to oxidoreductase, and seems to be more likely to be part of OPBRase than others. From these results, this enzyme was considered to be an oxidoreductase. (OPBR-1 and OPBR-4 are internal partial amino acid sequences determined from purified enzymes)
[0057]
・ Preparation of PCR primer from partial amino acid sequence of OPBRase and preparation of probe Preparation of PCR primer
R. oenos ATCC 27310 strain is longer than that used to screen the target gene with a short probe using an oligonucleotide having a base sequence deduced from the amino acid sequence of this enzyme. It seemed better to use a probe. Therefore, in order to increase the specificity of the probe to genomic DNA, an attempt was made to create a long probe by the polymerase chain reaction method (PCR). Based on the N-terminal amino acid sequence of the enzyme determined from the purified enzyme and the internal partial amino acid sequence, oligonucleotide primers in the forward and reverse directions were designed respectively, and at Date Concept (Co., Ltd., Sapporo) The request was synthesized.
[0058]
Probe preparation by PCR reaction
Extraction of genomic DNA of L. oenos ATCC 27310 strain
Cell culture method
L. oenos ATCC 27310 strain was inoculated into stab storage medium and cultured at 30 ° C overnight, then liquid medium [Glucose 8% (w / v), Yeast extract 2% (w / v), MnSO _Four ・ 6H ₂ O 10 ppm, CaCO _Three 2% (w / v); pH 7.0], and the cells obtained by static culture at 30 ° C. for 30 hours were used.
[0059]
Extraction of genomic DNA
After culturing, the cells were collected by centrifugation (6,000 rpm, 4 ° C., 10 min), and washed twice with TEN buffer [10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0.1 M NaCl, pH 8.0]. To this, 10 ml of a lysozyme solution (derived from egg white, Wako Pure Chemical Industries) dissolved in TEN buffer so as to have a final concentration of 10 mg / ml was added and suspended, and incubated at 37 ° C. overnight. After the reaction, 6 ml of 10% SDS was added to a final concentration of 3.3% (w / v) and incubated at 37 ° C. for 3 hours to disrupt the cells. Next, after phenol treatment and ethanol precipitation, redissolved in TE buffer [10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0] and added with RNase to a final concentration of 100 μg / ml. Digested at ℃ for 1 hour. Thereafter, phenol treatment, phenol-chloroform treatment, and ethanol precipitation were performed to obtain genomic DNA.
[0060]
Genomic PCR
PCR was performed using a DNA thermal cycler (Perkin Elmer Cetus Co., Ltd.). Four sets of reaction systems were performed using combinations of primers sOPBRn + aOPBR1, sOPBRn + aOPBR2, sOPBR1 + aOPBR2, and sOPBR2 + aOPBR1.
[0061]
Confirmation of PCR products
Ligation
The amplified DNA fragment was analyzed for a PCR product that was recognized as one kind by the combination of each primer of genomic PCR. The above reaction systems were prepared in 5 tubes each, combined, separated by 2% agarose gel electrophoresis, and recovered from the gel using Sephaglas BandPrep Kit (Pharmacia Biotech). This DNA fragment was treated with T vector (pUC19 was treated with Sma I using T4 DNA ligase (Nippon gene Co., Ltd., Tokyo) by TA cloning method, and T base was added to the 3 'end with Taq Polymerase. The product was incubated at 16 ° C. for 4 hours for ligation. PCR products generally have a structure in which one base A protrudes from the 3 'end due to the action of Taq Polymerase, and can be easily ligated to a vector by deliberately using a vector with one base protruding from the 3' end. This is the principle of the TA cloning method.
After ligation, E. coli strain JM109 was transformed by the heat shock method, and SOC medium [Trypton (Difco) 20 g / l, Yeast extract (Difco) 5 g / l, NaCl 0.585 g / l, KCl After shaking culture at 0.186 g / l, MgCl2 1.9 g / l, Glucose 3.6 g / l] at 37 ° C. for 1 hour, LB plate containing 100 μg / ml ampicillin [Polypepton 10 g / l, Yeast extract 5 g / l, NaCl 10 g / l, Agar 20 g / l; pH 7.0], and cultured at 37 ° C.
[0062]
DNA sequencing and analysis of PCR products
Preparation of plasmid
Inoculate a colony from the plate with the tip of a sterile toothpick into LB medium [Polypepton 10 g / l, Yeast extract 5 g / l, NaCl 10 g / l; pH 7.0] containing ampicillin at a final concentration of 100 μl / ml. Cultured with shaking overnight at ° C. The plasmid was extracted from this culture solution using FlexiPrep Kit (Pharmacia Biotech).
[0063]
Sequencing and analysis
Using ALFexpress DNA Sequencer (Pharmacia Biotech), electrophoresis conditions were as follows: Voltage: 1,500 V, Current: 55 mA, Power: 25-30 W, Water Preheat: 55 ° C., Sampling Interval: 2 sec, Running Time: 700 min. The extension reaction was carried out with a Vista systems ThermoSequenasecore sequencing kit with 7-deaza-dGTP (Amersham International plc, UK). For information such as homology search of amino acid sequences, the Internet service of The National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) was used.
[0064]
Results and discussion
A PCR primer having a base sequence deduced based on the partial amino acid sequence determined from the purified OPBRase was prepared, and genomic PCR of L. oenos ATCC 27310 strain was performed using the PCR primer. An attempt was made to prepare a probe for use in hybridization.
As a result of homology analysis of the partial amino acid sequence determined from the purified OPBRase, OPBR-1 and OPBR-4 were homologous to the dehydrogenase, which is an oxidoreductase. First, two oligonucleotide primers were designed and synthesized from OPBR-1 and OPBR-4 in the forward and reverse directions. Genomic PCR was performed using the oligonucleotide primers thus synthesized. Amplification of the PCR product as a single band in electrophoresis was confirmed in 2 sets of sOPBRn + aOPBR1 (680 bp) and sOPBRn + aOPBR2 (700 bp) among the 4 sets of reaction systems. Of these, the 680 bp PCR product ligated better.
Therefore, when sequencing this PCR product and examining the homology of the amino acid sequence deduced from it, glycerate dehydrogenase, D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, 2-hydroxyacid dehydrogenase, etc. A homology of about 30% was observed in the amino acid sequence of. Both these enzymes and this enzyme are part of the group of enzymes classified as oxidoreductases. As a result of homology analysis of the amino acid sequence of the PCR-amplified fragment, this PCR product seems to be a part of the OPBRase gene, so it was decided to use it as a probe for future hybridization.
[0065]
A DNA fragment carrying the 2-oxo-4-phenylbutyrate reductase gene was screened from the genomic library of L. oenos ATCC 27310 strain and cloned. As a result, the obtained plasmid pOPBR possessed an ORF which seems to be an OPBRase gene in its insert DNA. The transcription direction of the OPBRase gene was located in the same arrangement as the gene induction direction of the lac promoter, but when OPBRase activity was measured in the cell-free extract of the transformant, the control (E. coli JM109 / pBluescript KS +) and There was no difference, and no difference was found in the confirmation of the produced protein on SDS-PAGE. This seems to be related to the distance between the lac promoter and the start codon of this enzyme gene, and we decided to try to construct an expression plasmid for the purpose of increasing the activity of OPBRase gene and mass expression.
An attempt was made to increase the activity of the OPBRase gene by shortening the distance between the lac promoter of the vector pUC18 and the start codon of the OPBRase gene in the insert and combining the amino acid frame. Based on the plasmid pOPBR, a DNA fragment was constructed in which restriction enzyme recognition sites for EcoRI and SalI were introduced at both ends of the ORF of OPBRase. Create a primer with an EcoR I recognition site upstream of the OPBRase ORF start codon, and a primer with a Sal I recognition site in the upstream and downstream sites of the OPBRase gene's own terminator downstream of the stop codon. did. Using these primers, a fragment containing the OPBRase gene was amplified by a combination of primer A + B and A + C by PCR using plasmid pOPBR as a template.
[0066]
・ Synthetic primers
primer A (SEQ ID NO: 4)
5'- ACGAA GAATTC (EcoRI site) AACA ATG (start codon) AAAAAAGTT -3 '
primer B (SEQ ID NO: 5)
5'- ACCA GTCGAC (Sal I site) GTATGTGGTTTT -3 '
primer C (SEQ ID NO: 6)
5'- TTGGT GTCGAC (Sal I site) CTTGTCTCACA -3 '
[0067]
·result
Fragments generated by the combination of primers A + B and A + C were treated with EcoRI and SalI, ligated to the similarly treated pUC18, and plasmids retaining and not retaining the OPBRase gene terminator were constructed. They were named pOPBR-LS and pOPBR-LL, respectively. It was confirmed by sequencing that the base sequence of the joint between the vector DNA of pOPBR-LS and pOPBR-LL and the insert DNA and the amino acid frame were as expected. A band that could be identified as OPBRase was not detected by confirmation of the produced protein by SDS-PAGE. This is probably because SDS-PAGE provided a cell-free extract of bacterial cells, so that it did not produce a protein that could overlap with other proteins or could be confirmed as a band.
As a control for measuring enzyme activity of E. coli having a plasmid, E. coli JM109 having only vector pUC18 was used. As a result of the activity measurement, an increase in activity was confirmed in pOPBR-LL compared to pOPBR. From this, it is considered that the target gene was expressed in the newly prepared plasmid by combining the amino acid frames of the lac promoter and the OPBRase gene. The above results suggested the importance of the downstream region (terminator) of this enzyme gene. However, enzyme gene expression induction regulation by IPTG has not been achieved. In E. coli JM109 / pUC18, the regulation of lac promoter expression depends only on lac Iq on the F 'factor of host E. coli, so transcription occurs without catching up with the copy number of pUC18, and the effect of induction regulation by IPTG It is thought that there was not. In order to enable expression induction by IPTG, or to further increase OPBRase activity, it was decided to conduct an expression test by exchanging vectors and promoters.
[0068]
・ Effect of promoter replacement on OPBRase gene expression
・ Exchange from lac promoter to trc promoter
We tried to increase the activity by matching the frame between the pUC18 lac promoter and the start codon of the OPBRase gene, but further increasing its activity and reducing the number of amino acids upstream of the OPBRase gene as much as possible. In order to enable expression induction by the inducer IPTG, pTrc99A was used as a vector, and an attempt was made to express the OPBRase gene using the trc promoter of the vector. The vector pTrc99A has its own lacIq gene and can also express lacIq corresponding to the copy number of the vector, and it seems that expression induction by IPTG can be strictly performed. PTrc99A has a strong promoter trc upstream of the multicloning site and a strong transcription termination signal rrnB downstream. Therefore, pTrc99A was used.
[0069]
Method
pOPBR-LS and pOPBR-LL were each treated with EcoR I + Sal I, the insert was separated by electrophoresis, and the portion was recovered from the gel using DNA CELL. In order to match the amino acid frame of the OPBRase gene with the frame of the start codon on the vector pTrc99A, the fragment was blunted with Klenow Fragment, and pTrc99A treated with NcoI was blunted by the same method. These were ligated and a new expression plasmid under the control of the trc promoter was constructed.
By this method, the trc promoter of pTrc99A and the amino acid frame of this enzyme gene could be matched.
[0070]
・ Exchange from lac promoter to T7 promoter
In addition to the technique using the trc promoter, the OPBRase gene was expressed using the vector pET21b (+) having the T7 promoter, which is a strong promoter, in order to further increase the expression of the OPBRase gene. pET21b (+) is a vector with a strong promoter T7, and we attempted to express the gene by inserting the gene of interest so that the amino acid frame matches this downstream. E. coli BL21 (DE3) used as the host of this vector has a T7 RNA polymerase expression system on the genome. When the constructed expression plasmid is introduced into BL21 (DE3), T7 RNA polymerase on the BL21 (DE3) genome is first expressed by the induction of IPTG, and then the strong transcription of the target gene begins.
[0071]
Method
A new expression plasmid was constructed in the same manner as when an expression plasmid was constructed using pUC18. Using the primers (introduced earlier) with EcoR I and Sal I restriction enzyme recognition sites on the N-terminal side and C-terminal side of the ORF of the OPBRase gene created previously, the OPBRase gene Two types of fragments were created, one holding the terminator and one lacking. These fragments were treated with EcoR I + Sal I and ligated with similarly treated pET21b (+). E. coli JM109 was transformed by the heat shock method. A plasmid was extracted from each transformant, treated with an appropriate restriction enzyme, and then the presence or absence of an insert was confirmed by agarose gel electrophoresis. E. coli BL21 (DE3) was transformed again with the plasmid having the expected insert DNA, and an OPBRase gene expression system was constructed.
[0072]
·result
In order to further increase the expression of the OPBRase gene, we decided to use the trc promoter of the vector pTrc99A and the T7 promoter of pET21b (+). They were named pOPBR-7S and pOPBR-7L. Those with -T (7) S at the end of pOPBR do not retain the terminator of the OPBRase gene itself, and those with -T (7) L retain the terminator. Those with -TS (L) are constructed with pTrc99A, and those with -7S (L) are constructed with pET21b (+).
[0073]
In the plasmid constructed using pTrc99A, the inducer IPTG added to both pOPBR-TS and pOPBR-TL showed higher U / mg protein and U / ml broth values, and IPTG induced the expression of the enzyme gene. It seemed to be done. In addition, pOPBR-TL, which retains its own terminator, showed higher activity. This seems to be because the terminator is better positioned relative to the OPBRase structural gene, and transcription is performed more strictly, thus stabilizing the mRNA. On the other hand, in the plasmid constructed using pET21b (+), pOPBR-7L, which retains its own terminator, showed a higher activity as in pTrc99A.
However, in the relationship between the inducer IPTG and the activity, the activity was higher when IPTG was not added, contrary to the case of pTrc99A. In the pET system, by adding IPTG, the target gene is forcibly produced, which includes the possibility of forming inclusion bodies of the resulting protein. Therefore, it seems that the enzyme activity was lower than that in which IPTG was not added to the medium. In the confirmation of the produced protein by SDS-PAGE, no band that could be identified as OPBRase was detected in any case. As a result of comparison with all transformants E. coli, E. coli JM109 / pOPBR-TL having the highest activity per 1 mg of intracellular protein is considered to be suitable as the target enzyme-producing bacterium.
[0074]
As a result, regardless of which vector was used, high activity was confirmed in the plasmid having the terminator of the enzyme gene itself. The importance of the downstream region (terminator) of this gene in the expression of the enzyme according to the present invention was suggested. When pTrc99A was used, expression induction by IPTG was confirmed.
[0075]
・ Preparation and activity measurement of cell-free extract of each transformant
Each colony of the transformant E. coli JM109 was inoculated with a toothpick into 5 ml of LB medium containing 100 μl / ml ampicillin and cultured with shaking at 37 ° C. for 15 hours. The inducer IPTG was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM immediately after culturing. The culture was centrifuged at 3,000 rpm, 10 min, 4 ° C. to collect the cells, washed with a small amount of 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2), and centrifuged in the same manner. Growth at the time of cell collection was measured by measuring OD660 with a spectrophotometer (HITACHI U-1000). The suspension was suspended in 1 ml of 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.2), and the cells were disrupted by using an ultrasonic disrupter (Sonifier Model 250; Branson) twice under ice cooling for 1 minute. This was centrifuged at 15,000 rpm, 15 min, 4 ° C., and the supernatant was collected to obtain a cell-free extract. The assay method was performed with reference to a known method (Biosci. Biotech. Biochem., 57 (1), 160-161, 1993). Prepare a total volume of 2 ml of reaction solution containing 2-oxo-4-phenylbutyric acid at a final concentration of 10 mM, 0.1 mM NADPH, 100 μM potassium phosphate buffer (pH 6.0), and enzyme solution at 37 ° C. The decrease in NADPH absorbance at 340 nm was measured with a spectrophotometer (MILTON ROY SPECTRONIC 3000ARRAY). The amount of enzyme that oxidizes 1 μM NADPH per minute was defined as 1 U. A reaction system containing no substrate was prepared as a blank for enzyme reaction measurement. As a crude enzyme solution, a protein concentration of about 2 mg / ml is obtained. In an enzyme reaction, 200 μl of an enzyme reaction solution diluted 5 times with 100 μM potassium phosphate buffer (pH 6.0) is obtained. When added, a good linear decrease in NADPH was obtained. The amount of intracellular protein in the transformant was measured by the Lowry method. The results are summarized in Table 2.
[0076]
・ Activity measurement results
[Table 2]

[0077]
[Example 8] (Gene expression in transformed strain)
The transformant obtained in Example 7 was shaken and cultured overnight at 26 ° C on a liquid LB medium containing ampicillin (50 µg / mL), and 0.1 mM IPTG was added, followed by further 4 hours of shaking culture at 30 ° C. I did it. After cultivation, the cells are collected by centrifugation, the medium components are washed with physiological saline, and contain 50% Tris-HCl buffer (pH 7.0) containing 1% 2-oxo-4-phenylbutyric acid and 0.01% 2-mercaptoethanol. ), And a shaking reaction was performed at 30 ° C. for 6 hours as a reaction solution of 1 mL in total. As a control, Escherichia coli JM109 strain was used.
After completion of the reaction, sterilization was performed by centrifugation, and the amount of the produced R-2-hydroxy-4-phenylbutyric acid was determined from the reaction supernatant by high performance liquid chromatography using a chiral column (column: CHIRALPAK WH (4.6 × 250 mm ) (Daicel Chemical Industries, Ltd.), eluent: CH _Three CN / 0.5mM CuSO _Four = 8: 2, detection A220 nm, flow rate 1.5 mL / min, column temperature 50 ° C.), and optical purity was also measured.
In the transformant, 0.99 g / L (> 99% ee) of R-2-hydroxy-4-phenylbutyric acid was observed in the supernatant of the reaction solution, but in the control, R-2-hydroxy-4-phenylbutyric acid was present. Accumulation was not observed.
[0078]
【The invention's effect】
According to the present invention, the structure of the reductase derived from Leuconostoc oenos and the gene encoding it have been clarified. Using the determined nucleotide sequence of the gene, the reductase according to the present invention can be produced in large quantities and inexpensively as a gene recombinant.
The reductase of the present invention has high activity against 2-oxo-4-phenylbutyric acid and can efficiently produce R-2-hydroxy-4-phenylbutyric acid. R-2-hydroxy-4-phenylbutyric acid that can be synthesized by the reductase of the present invention is a useful compound as a pharmaceutical raw material.
[0079]
[Sequence Listing]

Claims (9)

The polynucleotide according to (a) or (b) below.
(A) A polynucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
(B) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The polynucleotide according to any of (c) to (e) below.
(C) a polynucleotide that hybridizes under high stringency conditions with a DNA comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1, and has the physicochemical properties described in i) and ii) below: polynucleotide encoding a protein having,
(D) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, and has the physicochemical properties described in i) and ii) below. A polynucleotide encoding a protein having reductase activity , or
(E) a polynucleotide encoding a protein having reductase activity having at least 90% sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and having the physicochemical properties set forth in i) and ii) below:
i) Action: Acts on 2-oxocarboxylic acid to produce R-hydroxycarboxylic acid.
ii) Substrate specificity: acts on 2-oxo-4-phenylbutyric acid to yield R-2-hydroxy-4-phenylbutyric acid. A recombinant protein encoded by the polynucleotide of any one of claims 1 or 2. A vector into which the polynucleotide according to claim 1 or 2 is inserted. The vector according to claim 4, wherein a terminator comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is operably linked to the polynucleotide of claim 1 or 2. A terminator consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3. A transformant that holds the polynucleotide according to claim 1 or 2 and / or the vector according to claim 4 or 5 in an expressible manner. A method for producing the protein according to claim 3, comprising culturing the transformant according to claim 7 and recovering the expression product. The protein according to claim 3 and / or the transformant according to claim 7 is represented by the following formula (1):
[Chemical 1]
Formula (1)

(Wherein X1 and X2 may be the same or different, H, NH ₄ , metal atom, n = 1-4), or a salt thereof. A method for producing R-2-hydroxycarboxylic acid, which is characterized.