JP4395645B2

JP4395645B2 - Method for producing N-acetylmannosamine

Info

Publication number: JP4395645B2
Application number: JP25758899A
Authority: JP
Inventors: 淳大西; 勇史丸; 泰弘太田; 陽二塚田
Original assignee: Japan Food and Liquor Alliance Inc
Current assignee: Japan Food and Liquor Alliance Inc
Priority date: 1999-09-10
Filing date: 1999-09-10
Publication date: 2010-01-13
Anticipated expiration: 2019-09-10
Also published as: JP2001078794A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素反応により基質から酵素反応生成物を高収率で得るための技術に関し、詳しくはN-アセチルマンノサミンを高収率で且つ容易に大量・安価で生産することができるN-アセチルマンノサミンの製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
N-アセチルグルコサミンの異性体であるN-アセチルマンノサミンは、例えば、医薬品や医薬品原料となるシアル酸（N-アセチルノイラミン酸）の酵素合成原料として用いられている。また、N-アセチルマンノサミンは、その誘導体から、シアル酸誘導体を酵素合成することが可能であり、産業上、重要な物質である。
【０００３】
従来、N-アセチルグルコサミンをアシルグルコサミン2-エピメラーゼで異性化しN-アセチルマンノサミンを製造する方法や、N-アセチルグルコサミンをアルカリ条件下で処理しN-アセチルマンノサミンを製造する方法が知られている。
【０００４】
しかしながら、これらの製造法では、N-アセチルグルコサミンからN-アセチルマンノサミンへのモル変換収率が20％程度と低い。また、N-アセチルマンノサミンと、その原料であるN-アセチルグルコサミンは異性体であり、両者を分割、精製することは容易ではない。Spivakらは、加熱エタノールによる両者の溶解度の差で精製することを開示しているが、高純度のN-アセチルマンノサミンが得られず、さらに、回収率が低いため、大量・安価に製造することができない[Journal of the American Chemical Society, 81，2403-2404(1959)]。
【０００５】
また、N-アセチルグルコサミンをアルカリ条件下で異性化する際に、ホウ酸又はホウ酸塩を添加することにより、N-アセチルマンノサミンへのモル変換収率を増大させる方法を提案しているが、そのモル変換収率は23〜33％程度である（特開平10-182685号）。N-アセチルマンノサミンの精製は、ホウ酸を移動相に添加したイオン排除クロマトグラフィーで行うことを特徴としており、精製効率が悪く、さらに、混入するホウ酸を除去しなければならないという問題点がある。
【０００６】
一方、N-アセチルマンノサミンを製造する方法としては、精製シアル酸（N-アセチルノイラミン酸）をN-アセチルノイラミン酸リアーゼを用いて酵素分解して得る方法も知られている。しかしながら、シアル酸からのN-アセチルマンノサミンへのモル変換収率は80％程度に留まる。さらに原料として高価な精製シアル酸を使用するため、原料費が高価になる問題がある。また、精製シアル酸に代えて、粗シアル酸を原料として用いる方法もあるが、例えばN-アセチルグルコサミンのような夾雑物質の分離が困難であり、高純度のN-アセチルマンノサミンが得られない。
【０００７】
以上の様に、これら従来の方法では、N-アセチルマンノサミンを大量・安価に製造することができない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような従来の問題点を解決するため、酵素反応生成物の分離が容易で、酵素反応生成物を高収率に製造する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の製造法を提供するものである。
【００１０】
項１．基質を担体に結合させる工程並びに担体に結合した基質と酵素とを反応させる工程を含む酵素反応生成物の製造法。
【００１１】
項２．基質がシアル酸である項１に記載の製造法。
【００１２】
項３．酵素がN-アセチルノイラミン酸リアーゼで、酵素反応生成物がN-アセチルマンノサミンである項２に記載の製造法。
【００１３】
項４．担体が陰イオン交換体である項３に記載の製造法。
【００１４】
項５．基質を担体に結合させる工程が、N-アセチルグルコサミンとピルビン酸にアルカリ条件下でN-アセチルノイラミン酸リアーゼを作用させた反応液を陰イオン交換体に通液する工程であることを特徴とする項４に記載の製造法。
【００１５】
項６．基質を担体に結合させる工程が、N-アセチルグルコサミンとピルビン酸にアシルグルコサミン2−エピメラーゼ及びN-アセチルノイラミン酸リアーゼとを作用させた反応液を陰イオン交換体に通液する工程であることを特徴とする項４に記載の製造法。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明は、基質を担体に結合させる工程並びに担体に結合した基質と酵素とを反応させる工程を含む酵素反応生成物の製造法である。即ち、本発明は、担体と結合した基質に酵素を反応させた後、反応液と担体を分離し、必要に応じて反応液中の反応生成物と酵素を分離する製造法である。
【００１７】
該製造法によれば、酵素反応において、酵素反応液中の酵素反応生成物以外の物質が担体に結合されることによって、酵素反応後の酵素反応生成物の分離・精製が容易になり、且つ、高純度の物質が得られる。また、基質が担体に結合されることにより、酵素反応の平衡が、酵素反応生成物側にシフトし、酵素反応生成物の生成が促進され、収率が向上する。この場合において、反応液中の酵素反応生成物以外の物質のうち、該物質と酵素反応生成物との分離が容易である場合には、該物質が担体に結合されなくてもかまわない。しかしながら、該物質が基質である場合には、前記のように、該物質が担体に結合することにより酵素反応が酵素反応生成物生成側へシフトするため、担体と結合することが好ましい。
【００１８】
本発明において、基質としては、担体に結合するものであれば特に制限されず、例えば、糖質、タンパク質、脂質、核酸、ビタミン類等や、その他の高分子又は低分子の有機化合物等を使用することができる。好ましくは、コロミン酸、シアル酸を含んだ糖質、糖タンパク質、糖脂質、糖ヌクレオチドであり、さらに好ましくはシアル酸である。但し、ここで言うシアル酸とは、N-アセチルノイラミン酸、N-グリコリルノイラミン酸、O-アセチルノイラミン酸、KDN、KDO等のシアル酸類全てを含み、その中でも最も好ましくは、N-アセチルノイラミン酸である。
【００１９】
本発明において、酵素としては、特に制限されないが、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼを使用でき、酵素反応生成物との分離が容易であるものが好ましい。
【００２０】
酸化還元酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素、酸素添加酵素、ペルオキシダーゼ等が使用できる。例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースデヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、シトクロムｃオキシダーゼ、アセトアセチル−CoAレダクターゼ、アシル−CoAデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等を使用できる。
【００２１】
転移酵素としては、例えば、アセテートキナーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、クレアチンキナーゼ、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、アシルノイラミン酸シチジリルトランスフェラーゼ、N-アシル−Ｄ−マンノサミンキナーゼ等を使用できる。
【００２２】
加水分解酵素としては、エステラーゼ、グリコシダーゼ、エーテルヒドロラーゼ、チオエーテルヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、アミダーゼ、酸無水物ヒドロラーゼ、その他のヒドロラーゼ等を使用できる。例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、インベルターゼ、イソアミラーゼ、プロテアーゼ、パパイン、ペプシン、レンニン、セルラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、リゾチーム、グルコアミラーゼ、β−フルクトフラノシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、セルラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、キモトリプシン、トリプシン、アルギナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アシルホスファターゼ、エラスターゼ等を使用できる。
【００２３】
リアーゼとしては、例えば、N-アセチルノイラミン酸リアーゼ、ペクチンリアーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、N-アシルノイラミン酸−9−リン酸シンターゼ、O‐アセチルセリンリアーゼ、アセトアセテートデカルボキシラーゼ、カルボン酸デヒドラターゼ等を使用できる。
【００２４】
イソメラーゼとしては、ラセマーゼ、エピメラーゼ、シストランスイソメラーゼ、ケトールイソメラーゼ、トートメラーゼ、ムターゼ、シクロイソメラーゼ等を使用できる。例えば、グルコースイソメラーゼ、アシルグルコサミン 2−エピメラーゼ、アシルグルコサミン−6−リン酸 2−エピメラーゼ、リボースリン酸イソメラーゼ、アミノ酸ラセマーゼ等を使用できる。
【００２５】
リガーゼとしては、例えば、アシル−CoAシンテターゼ、アセチル−CoAカルボキシラーゼ、アセチル−CoAシンテターゼ、グルタミンシンテターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、DNAリガーゼ、RNAリガーゼ、各種−tRNAシンテターゼ等を使用できる。
【００２６】
特に、通常反応で平衡状態になる酵素が本発明に適しているが、例えば、酸化還元酵素、リアーゼ、イソメラーゼであり、好ましくはイソメラーゼ、リアーゼである。さらに好ましい酵素は、リアーゼである。最も好ましいのは、N-アセチルノイラミン酸リアーゼである。
【００２７】
本発明において、酵素反応生成物としては、特に制限されず、前記基質から、前記酵素の酵素反応により生成する物質を使用できる。殊に担体と結合しない物質が好ましい。好ましくは、N-アセチルマンノサミンである。
【００２８】
本発明において、担体としては、基質と結合し且つ酵素反応生成物と結合しない限り特に制限されないが、イオン交換体、ゲル濾過剤、その他の各種クロマトグラフィー用充填剤、多糖、ポリマー、活性炭等を使用することができる。好ましいのはイオン交換体及びゲル濾過剤である。
【００２９】
前記イオン交換体は、有機イオン交換体、無機イオン交換体、陽イオン交換体、陰イオン交換体を問わない。イオン交換体の支持体としては、樹脂、膜、セルロース、繊維、多糖、ポリマー、セラミック、多孔質体、ゲル、活性炭、デキストラン、アガロース、シリカ等の少なくとも１種を使用することができる。好ましい支持体は、樹脂及びセルロースである。イオン交換体の陰イオン官能基としては、ジエチルアミノエチル（DEAE）、トリエチルアミノエチル（TEAE）、トリメチルヒドロキシプロピルアミン（QA）、トリメチルベンジルアンモニウム、ジメチルヒドロキシエチルベンジルアンモニウム、３級アミン、３級及び４級アミン混合基等の少なくとも１種が使用できる。陽イオン官能基としては、スルホプロピル（SP）、スルホエチル（SE）、カルボキシメチル（CM）、オルトリン酸塩（P）、スルホン酸、カルボン酸等の少なくとも１種が使用できる。好ましくは、陰イオン官能基である。イオン交換体の支持体と官能基との組み合わせは、特に制限されず、酵素反応条件等に応じて適宜選択される。
【００３０】
好ましいイオン交換樹脂としては、アンバーライト、ダウエックス、ダウエックスマラソンA、デュオライト、ダイヤイオンシリーズ等を使用することができる。
【００３１】
好ましいイオン交換セルロースとしては、DEAE‐セルロース、TEAE-セルロース、QEA‐セルロース、SP‐セルロース、SE‐セルロース、CM‐セルロース等を使用することができる。
【００３２】
前記ゲル濾過剤としては、デキストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、シリカ等を使用することができる。好ましくは、セファデックス、バイオゲル、セファロース、トヨパール、アガロース、セファクリル、セルロファイン、キトビーズ等を使用することができる。
【００３３】
その他の各種クロマトグラフィー用充填剤としては、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤、疎水性クロマトグラフィー用充填剤、合成吸着剤、キレートクロマトグラフィー用充填剤、分配クロマトグラフィー用充填剤等を使用できる。
【００３４】
本発明において使用されるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、特に制限されない。該充填剤の支持体としては、例えばアガロースゲル等を使用できる。該充填剤の官能基としては、例えばレクチン、セロトニン、3‐ヒドロキシインドール酢酸、アミノ、カルボキシル、アルデヒド、フェノール、イミダゾール等の少なくとも１種を使用できる。該充填剤の支持体と官能基との組み合わせは、特に制限されず、酵素反応条件等に応じて適宜選択される。
【００３５】
本発明において使用される疎水性クロマトグラフィー用充填剤は、特に制限されない。該充填剤の支持体としては、例えばアガロースゲル等を使用できる。該充填剤の官能基としては、例えばアミノ、カルボキシル、アルデヒド、フェノール、イミダゾール等の少なくとも１種を使用できる。該充填剤の支持体と官能基との組み合わせは、特に制限されず、酵素反応条件等に応じて適宜選択される。
【００３６】
本発明において使用されるキレートクロマトグラフィー用充填剤は特に制限されない。該充填剤の支持体としては、例えば架橋ポリスチレン等を使用できる。該充填剤の官能基としては、例えばイミノジ酢酸、ポリアミン等の少なくとも１種を使用できる。該充填剤の支持体と官能基との組み合わせは、特に制限されず、酵素反応条件等に応じて適宜選択される。
【００３７】
本発明において使用される分配クロマトグラフィー用充填剤は特に制限されない。該充填剤の支持体としては、例えば化学結合型シリカゲル、ポーラスポリマーゲル、親水性ポリマーゲル等を使用できる。該充填剤の官能基としては、例えばアミド、オクタデシル、フェニル等の少なくとも１種を使用できる。該充填剤の支持体と官能基との組み合わせは、特に制限されず、酵素反応条件等に応じて適宜選択される。
【００３８】
酵素反応の温度、ｐＨ、時間、酵素量等は、使用する酵素、基質等により決定される。
【００３９】
以下、基質としてシアル酸、酵素としてN-アセチルノイラミン酸リアーゼを用い、酵素反応生成物としてN-アセチルマンノサミンを製造する場合について例示する。
【００４０】
シアル酸にN-アセチルノイラミン酸リアーゼを作用させた場合、シアル酸は、N-アセチルマンノサミンとピルビン酸に分解される。一般に、N-アセチルノイラミン酸リアーゼによるシアル酸分解・合成反応は可逆反応であるため、シアル酸からN-アセチルマンノサミンへのモル変換収率は80％程度である。
【００４１】
本発明では、担体に結合したシアル酸にN-アセチルノイラミン酸リアーゼを作用させると、N-アセチルマンノサミンとピルビン酸が生成してくるが、該ピルビン酸は担体と結合し、N-アセチルマンノサミンは遊離する。このため、反応終了後に反応系から担体及びN-アセチルノイラミン酸リアーゼを分離するだけで、N-アセチルマンノサミンのみが容易に且つ高純度で回収でき、煩雑な精製工程を必要としない。また、ピルビン酸が担体と結合することにより、N-アセチルマンノサミンからシアル酸への逆反応が抑制されるため、シアル酸からN-アセチルマンノサミンへのモル変換収率が100％となる。
【００４２】
シアル酸の供給源としては、N-アセチルグルコサミンとピルビン酸を、アルカリ条件下において、N-アセチルノイラミン酸リアーゼを作用させてシアル酸を得るシアル酸製造法が報告されている（特開平5‐211884号）。このシアル酸合成反応液を中和、または、中和後にN‐アセチルノイラミン酸リアーゼを補添することによって、N‐アセチルマンノサミンが生成するが、この反応液からN‐アセチルマンノサミンを精製することは困難である。なぜなら、N‐アセチルグルコサミンとN‐アセチルマンノサミンの分離が困難であるからである。そこで、シアル酸合成反応液（N-アセチルグルコサミンからシアル酸へのモル変換収率50％）を、陰イオン交換体に通液すると、ピルビン酸及びシアル酸は陰イオン交換体に結合するが、N-アセチルグルコサミンは結合しないので、洗浄によってN‐アセチルグルコサミンの混入は容易に除去できる。その後、シアル酸及びピルビン酸が結合した該陰イオン交換体に、N-アセチルノイラミン酸リアーゼを作用させると、前記記載のように高純度のN-アセチルマンノサミンが、シアル酸からのモル変換収率100％（N-アセチルグルコサミンからのモル変換収率では50％）で得られる。
【００４３】
また、N-アセチルグルコサミンとピルビン酸を、中性条件下において、N-アセチルノイラミン酸リアーゼ及びアシルグルコサミン2−エピメラーゼを作用させてシアル酸を得るシアル酸製造法が報告されている[Carbohydrate Research，306，575‐578（1998）]。シアル酸を含んだこの反応液（N-アセチルグルコサミンからシアル酸へのモル変換収率では80％）を前記と同様に陰イオン交換体に通液し、シアル酸及びピルビン酸が結合した該陰イオン交換体に、N-アセチルノイラミン酸リアーゼを作用させると、シアル酸からのモル変換収率100％（N-アセチルグルコサミンからのモル変換収率では80％）で高純度のN-アセチルマンノサミンが容易に得られる。
【００４４】
本発明に対し、シアル酸を含んだ後者反応液を、担体を用いずに反応させた場合にはピルビン酸などの夾雑物質の影響で、シアル酸からのモル変換収率は55％（N-アセチルグルコサミンからのモル変換収率では44％）であり、精製も困難である。特に、未反応のN‐アセチルグルコサミンが混入するため、該物質の除去が極めて困難である。
【００４５】
本発明のN-アセチルマンノサミンの製造法において、シアル酸としては、当然、高純度のものも使用できるが、不純物が酵素反応に悪影響を及ぼさなければ、不純物を含んでいる粗シアル酸も使用できる。例えば、特開平5-211884号やCarbohydrate Research，306，575‐578（1998）に記載されているようなシアル酸合成反応液、鶏卵、牛乳、海燕の巣、コロミン酸、その他シアル酸のポリマー、糖タンパク質、糖脂質、糖ヌクレオチド等のようなシアル酸を含有する物質を、シアル酸が遊離している場合はそのまま、或いはシアル酸がある物質と結合している場合は酸分解、酵素分解等でシアル酸を遊離させることにより使用することができる。
【００４６】
担体に結合させるシアル酸量には制限がなく、担体に結合する可能な限りのシアル酸を結合できる。例えば、陰イオン交換体であるダウエックスマラソンAを担体として用いた場合には、湿潤樹脂1ml当り、150mg程度のシアル酸が結合できる。
【００４７】
本発明のN-アセチルマンノサミンの製造法において使用するN-アセチルノイラミン酸リアーゼとしてはその起源を問わない。また、不純物が酵素反応に悪影響を及ぼさなければ、粗N-アセチルノイラミン酸リアーゼも使用でき、特に精製されたものでなくてもよい。
【００４８】
本発明のN-アセチルマンノサミンの製造法において、担体としては、シアル酸と結合し且つN-アセチルマンノサミンと結合しない限り特に制限されないが、イオン交換体、ゲル濾過剤、その他の各種クロマトグラフィー用充填剤、多糖、ポリマー、活性炭等を使用することができる。好ましいのはイオン交換体及びゲル濾過剤である。特に、陰イオン交換樹脂が好ましい。陰イオン交換樹脂としては、アンバーライト、ダウエックス、ダウエックスマラソンＡ、デュオライト、ダイヤイオンシリーズ等を使用することができる。好ましいその他の担体の例示は前記の通りである。
【００４９】
酵素反応の温度、ｐＨ、時間、酵素量等は、使用する酵素、基質等により決定される。
【００５０】
担体に結合したシアル酸のN-アセチルノイラミン酸リアーゼとの反応方法は、バッチ法でも、カラムに充填しても、そのモル変換収率に変化はなく、特に限定されない。好ましくは、カラムに充填する方法、バッチ法による振とう反応、バッチ法による静置反応方法等である。
【００５１】
反応液からN-アセチルノイラミン酸リアーゼを除去する方法としては、限外濾過膜、熱変性除去、酸変性除去、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、タンパク質固定化担体、タンパク質吸着剤等により除去する方法等を使用することができる。
【００５２】
酵素反応の温度は、酵素反応が進行する限り特に制限されないが、５〜８０℃、好ましくは２０〜６０℃である。
【００５３】
酵素反応のｐＨは、酵素反応が進行する限り特に制限されないが、ｐＨ３．５〜ｐＨ１１、好ましくはｐＨ３．５〜ｐＨ８である。
【００５４】
酵素反応時間、酵素量等は、使用するシアル酸の量、温度、ｐＨ等に応じて適宜選択される。
【００５５】
【実施例】
以下、本発明の具体例を実施例として示す。
[実施例１]
シアル酸1.2gを24mlの水に溶解し、これに陰イオン交換樹脂（ダウエックスマラソンA）を湿潤樹脂量として8mlを加え、室温で30分間攪拌した。攪拌後、樹脂を水にて洗浄し、樹脂に吸着したシアル酸量を測定すると、湿潤樹脂1mlにシアル酸150mgが吸着していた。
【００５６】
このシアル酸が吸着した樹脂にN-アセチルノイラミン酸リアーゼを30U添加し、37℃で往復振とう反応を行なった。反応ｐＨは6〜7に調整した。
【００５７】
経時的にサンプリングして、N-アセチルマンノサミン脱水素酵素により変換されたN-アセチルマンノサミン量を定量分析したところ、図１に示されるように、3時間後のシアル酸のN-アセチルマンノサミンへのモル変換収率は100％であった。
【００５８】
この反応液の少量を限外濾過し、HPLCで分析したところ、樹脂からのシアル酸及びピルビン酸の遊離は認められず、N-アセチルマンノサミンのみが遊離していた。
【００５９】
反応終了後、反応液と陰イオン交換樹脂中に残存する反応液を水で洗い出し、分画分子量10,000の限外濾過膜を使用してN-アセチルノイラミン酸リアーゼを除去し、凍結乾燥後、白色粉末0.8gを得た。
【００６０】
得られたN-アセチルマンノサミンのHPLC純度は100％であった。
[実施例２]
N-アセチルグルコサミン18g及びピルビン酸ナトリウム18gを100mlの水に溶解し、10N NaOH水溶液にてｐＨ10.5に調整後、1,000UのN-アセチルノイラミン酸リアーゼを添加し、シアル酸合成反応を行なった。30℃で120時間反応後、反応液中のシアル酸濃度を定量した結果、126mg/mlのシアル酸が生成した。
【００６１】
この反応液40ml（シアル酸として5.04g）を脱塩処理後、陰イオン交換樹脂（ダウエックスマラソンA）100mlを充填したカラムに通液することで、湿潤樹脂1mlにシアル酸50.4mgが吸着した。
【００６２】
このシアル酸が吸着した樹脂100mlにN-アセチルノイラミン酸リアーゼを500U添加し、37℃で反応を行なった。
【００６３】
経時的にサンプリングして、N-アセチルマンノサミン量を定量分析したところ、3時間後のシアル酸のN-アセチルマンノサミンへのモル変換収率は100％であった。反応液の少量を限外濾過し、HPLCで分析したところ、樹脂から反応液へのシアル酸及びピルビン酸の混入は認めらずN-アセチルマンノサミンのみが認められた。
【００６４】
これらの結果、使用したN-アセチルグルコサミンからN-アセチルマンノサミンへのモル変換収率は、50％であった。
【００６５】
反応終了後、反応液と陰イオン交換樹脂中に残存する反応液を水で洗い出し、分画分子量10,000の限外濾過膜を使用してN-アセチルノイラミン酸リアーゼを除去後、凍結乾燥し、白色粉末3.4gを得た。
【００６６】
得られたN-アセチルマンノサミンのHPLC純度は100％であった。
[実施例３]
N-アセチルグルコサミン17.7g、ピルビン酸ナトリウム5.3g、塩化マグネシウム0.2g及びATP5.5gを100mlの水に溶解し、10N NaOH水溶液にてｐＨ7.2に調整後、1,000UのN-アセチルノイラミン酸リアーゼ及び200Uのアシルグルコサミン2-エピメラーゼを添加し、シアル酸合成反応を行なった。
【００６７】
30℃で反応し、50時間後及び120時間後に3Mピルビン酸ナトリウム溶液を夫々25ml、14ml添加した。反応液中のシアル酸濃度を定量した結果、反応180時間後に140mg/ml（19.5ｇ生成）のシアル酸が生成した。
【００６８】
この反応液40ml（シアル酸として5.6g）を脱塩処理後、陰イオン交換樹脂（ダウエックスマラソンA）100mlを充填したカラムに通液することで、湿潤樹脂1mlにシアル酸56.0mgが吸着した。
【００６９】
このシアル酸が吸着した樹脂100mlにN-アセチルノイラミン酸リアーゼを500U添加し、37℃で反応を行なった。
【００７０】
経時的にサンプリングして、N-アセチルマンノサミン量を定量分析したところ、3時間後のシアル酸のN-アセチルマンノサミンへのモル変換収率は100％であり、反応液の少量を限外濾過し、HPLCで分析したところ、樹脂から反応液へのシアル酸及びピルビン酸の混入は認められなかった。反応終了後、反応液と陰イオン交換樹脂中に残存する反応液を水で洗い出し、分画分子量10,000の限外濾過膜を使用してN-アセチルノイラミン酸リアーゼを除去後、凍結乾燥し、白色粉末3.8gを得た。得られたN-アセチルマンノサミンのHPLC純度は100％であった。
【００７１】
これらの結果、使用したN-アセチルグルコサミンからN-アセチルマンノサミンへのモル変換収率は、79％であった。
【００７２】
一方、この反応液を担体を用いずに反応した場合は、シアル酸からのモル変換収率55％、N-アセチルグルコサミンからのモル変換収率では44％であった（図１）。
[実施例４]
[実施例１]から[実施例３]の結果をふまえて、実際に反応規模を大きくしてN-アセチルマンノサミンを製造した。
【００７３】
N-アセチルグルコサミン1,770ｇ、ピルビン酸ナトリウム530g、塩化マグネシウム20g及びATP 55gを10lの水に溶解し、10N NaOH水溶液にてｐＨ7.2に調整後、100kUのN-アセチルノイラミン酸リアーゼ及び20kUのアシルグルコサミン2-エピメラーゼを添加し、シアル酸合成反応を行なった。
【００７４】
30℃で反応し、50時間後及び120時間後に3Mピルビン酸ナトリウム溶液を夫々2.5l、1.4l添加した。反応液中のシアル酸濃度を定量した結果、反応180時間後に140mg/mlのシアル酸が生成した。
【００７５】
この反応液13.9l（シアル酸として1,946g）を脱塩処理後、陰イオン交換樹脂（ダウエックスマラソンA）35lを充填したカラムに通液した。脱塩処理液を陰イオン交換樹脂に通液後、水にて洗浄することで、湿潤樹脂1mlにシアル酸55.6mgが吸着した。
【００７６】
このシアル酸が吸着した陰イオン交換樹脂35lが充填されたカラムにN-アセチルノイラミン酸リアーゼ150kUを図２に示すように循環させた。本反応は、37℃で行なった。
【００７７】
経時的にサンプリングして、反応液の少量を限外濾過し、N-アセチルマンノサミン量を定量分析したところ、40時間後にはシアル酸が完全分解し、N-アセチルマンノサミンへのモル変換収率が100％となった（図３）。
【００７８】
反応終了後、反応液と陰イオン交換樹脂の洗浄液から、N-アセチルマンノサミンが1,390ｇが得られた。
【００７９】
この反応液から、分画分子量1,000の限外濾過膜を使用してN-アセチルノイラミン酸リアーゼを除去し、減圧濃縮した。
【００８０】
この濃縮液を凍結乾燥し、白色粉末1,320gを得た。得られた粉末を下記条件のHPLCで測定したところ、純度は100％であった（図４）。
【００８１】
カラム：Aminex HPX-87H（Bio-Rad）
移動相：10mM H₂SO₄
流速：0.5ml/min
検出：205nm
温度：室温
また、凍結乾燥以外にもエタノール等の有機溶媒を使用して、粉末が得られることも確認した。さらに、濃縮することで過飽和結晶が得られることも確認した。
【００８２】
得られたN-アセチルマンノサミン凍結乾燥粉末のN-アセチルグルコサミンからのモル変換収率は約80％と算出され、本発明の優れた効果が確認できた。
【００８３】
これらの結果から、シアル酸あるいはシアル酸を含んだ溶液から、シアル酸を陰イオン交換体に結合させ、N-アセチルノイラミン酸リアーゼを作用させることで、N-アセチルマンノサミンのみが遊離し、夾雑物もなく、精製が非常に簡便になることが確認できた。また、N-アセチルグルコサミンとピルビン酸からいったん原料となるシアル酸を合成する反応は、スケールアップも容易で且つ制限がないことから、本発明が提案するN-アセチルマンノサミンの製造法は高純度のN-アセチルマンノサミンを非常に容易に且つ大量に供給することが可能になった。
【００８４】
【発明の効果】
本発明によれば、酵素反応において、酵素反応液中の酵素反応生成物以外の物質が担体に結合されることによって、酵素反応後の酵素反応生成物の分離・精製が容易になる。また、基質が担体に結合されることにより、酵素反応の平衡が酵素反応生成物側にシフトし、酵素反応生成物への生成が促進され、収率が向上する。
【００８５】
特に、本発明のN-アセチルマンノサミンの製造法では、精製が容易で収率がほぼ100％になり、N-アセチルマンノサミンの大量・安価な供給が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の[実施例１]におけるシアル酸からのN-アセチルマンノサミン（ManNAc）へのモル変換収率を示すグラフである。
【図２】本発明の[実施例４]における反応装置の概略である。
【図３】本発明の[実施例４]におけるシアル酸からのN-アセチルマンノサミン（ManNAc）へのモル変換収率を示すグラフである。
【図４】本発明の[実施例４]における調製したN-アセチルマンノサミンのHPLCクロマトグラムである。縦軸は保持時間を示し、その単位は分である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a technique for obtaining an enzyme reaction product from a substrate in a high yield by an enzyme reaction. Specifically, N-acetylmannosamine can be easily produced in a large yield and at a low yield in a high yield. -It relates to a method for producing acetylmannosamine.
[0002]
[Prior art]
N-acetylmannosamine, which is an isomer of N-acetylglucosamine, is used, for example, as a raw material for enzyme synthesis of sialic acid (N-acetylneuraminic acid) that is used as a pharmaceutical or a raw material for pharmaceuticals. In addition, N-acetylmannosamine is an industrially important substance because it can synthesize a sialic acid derivative from its derivative.
[0003]
Conventionally, N-acetylglucosamine is isomerized with acylglucosamine 2-epimerase to produce N-acetylmannosamine, and N-acetylglucosamine is treated under alkaline conditions to produce N-acetylmannosamine. It has been.
[0004]
However, in these production methods, the molar conversion yield from N-acetylglucosamine to N-acetylmannosamine is as low as about 20%. Moreover, N-acetyl mannosamine and its raw material N-acetylglucosamine are isomers, and it is not easy to separate and purify them. Spivak et al. Disclose that they are purified by the difference in solubility between them using heated ethanol. However, because high-purity N-acetylmannosamine cannot be obtained and the recovery rate is low, it is manufactured in large quantities and at low cost. [Journal of the American Chemical Society, 81, 2403-2404 (1959)].
[0005]
In addition, when N-acetylglucosamine is isomerized under alkaline conditions, a method for increasing the molar conversion yield to N-acetylmannosamine by adding boric acid or borate is proposed. However, the molar conversion yield is about 23 to 33% (Japanese Patent Laid-Open No. 10-182685). N-acetylmannosamine is purified by ion-exclusion chromatography with boric acid added to the mobile phase, resulting in poor purification efficiency and the need to remove contaminating boric acid. There is.
[0006]
On the other hand, as a method for producing N-acetylmannosamine, a method is also known in which purified sialic acid (N-acetylneuraminic acid) is obtained by enzymatic decomposition using N-acetylneuraminic acid lyase. However, the molar conversion yield from sialic acid to N-acetyl mannosamine is only about 80%. Furthermore, since expensive purified sialic acid is used as a raw material, there is a problem that the raw material cost becomes high. In addition, there is a method in which crude sialic acid is used as a raw material instead of purified sialic acid, but separation of contaminants such as N-acetylglucosamine is difficult, and high-purity N-acetylmannosamine is obtained. Absent.
[0007]
As described above, these conventional methods cannot produce N-acetylmannosamine in large quantities and at low cost.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
In order to solve the conventional problems as described above, it is an object of the present invention to provide a method for easily producing an enzyme reaction product in a high yield so that the enzyme reaction product can be easily separated.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides the following production methods.
[0010]
Item 1. A method for producing an enzyme reaction product, comprising a step of binding a substrate to a carrier and a step of reacting the substrate bound to the carrier with an enzyme.
[0011]
Item 2. Item 2. The production method according to Item 1, wherein the substrate is sialic acid.
[0012]
Item 3. Item 3. The method according to Item 2, wherein the enzyme is N-acetylneuraminic acid lyase and the enzyme reaction product is N-acetylmannosamine.
[0013]
Item 4. Item 4. The method according to Item 3, wherein the carrier is an anion exchanger.
[0014]
Item 5. The step of binding the substrate to the carrier is a step of passing a reaction solution obtained by reacting N-acetylglucosamine and pyruvate with N-acetylneuraminate lyase under alkaline conditions through an anion exchanger. Item 5. The manufacturing method according to Item 4.
[0015]
Item 6. The step of binding the substrate to the carrier is a step of passing a reaction solution in which acylglucosamine 2-epimerase and N-acetylneuraminate lyase are allowed to act on N-acetylglucosamine and pyruvate through an anion exchanger. Item 5. The production method according to Item 4, wherein
[0016]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is a method for producing an enzyme reaction product comprising a step of binding a substrate to a carrier and a step of reacting the substrate bound to the carrier with an enzyme. That is, the present invention is a production method in which an enzyme is reacted with a substrate bonded to a carrier, and then a reaction solution and a carrier are separated, and a reaction product and an enzyme in the reaction solution are separated as necessary.
[0017]
According to the production method, in the enzyme reaction, substances other than the enzyme reaction product in the enzyme reaction solution are bound to the carrier, so that the enzyme reaction product after the enzyme reaction can be easily separated and purified, and A highly pure substance is obtained. In addition, by binding the substrate to the carrier, the equilibrium of the enzyme reaction is shifted to the enzyme reaction product side, the production of the enzyme reaction product is promoted, and the yield is improved. In this case, of the substances other than the enzyme reaction product in the reaction solution, if the substance and the enzyme reaction product are easily separated, the substance may not be bound to the carrier. However, when the substance is a substrate, as described above, since the enzyme reaction is shifted to the enzyme reaction product production side when the substance is bound to the carrier, it is preferably bound to the carrier.
[0018]
In the present invention, the substrate is not particularly limited as long as it binds to a carrier. For example, carbohydrates, proteins, lipids, nucleic acids, vitamins, and other high molecular or low molecular organic compounds are used. can do. Preferred are colominic acid, carbohydrates containing sialic acid, glycoproteins, glycolipids, sugar nucleotides, and more preferred is sialic acid. However, the sialic acid referred to herein includes all sialic acids such as N-acetylneuraminic acid, N-glycolylneuraminic acid, O-acetylneuraminic acid, KDN, KDO, and most preferably, N -Acetylneuraminic acid.
[0019]
In the present invention, the enzyme is not particularly limited, but an oxidoreductase, transferase, hydrolase, lyase, isomerase, and ligase can be used, and those that can be easily separated from the enzyme reaction product are preferable.
[0020]
As the oxidoreductase, dehydrogenase, reductase, oxidase, oxygenase, peroxidase and the like can be used. For example, glucose oxidase, galactose dehydrogenase, isocitrate dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, ascorbate oxidase, cytochrome c oxidase, acetoacetyl-CoA reductase, acyl-CoA dehydrogenase, alcohol oxidase, alcohol dehydrogenase and the like can be used.
[0021]
Examples of the transferase include acetate kinase, cyclomaltodextrin glucanotransferase, alanine transaminase, aspartate transaminase, creatine kinase, ornithine carbamoyltransferase, acylneuraminic acid cytidylyltransferase, N-acyl-D-mannosamine kinase and the like. Can be used.
[0022]
As hydrolase, esterase, glycosidase, ether hydrolase, thioether hydrolase, peptidase, amidase, acid anhydride hydrolase, other hydrolase, and the like can be used. For example, α-amylase, β-amylase, invertase, isoamylase, protease, papain, pepsin, rennin, cellulase, pectinase, lipase, lactase, lysozyme, glucoamylase, β-fructofuranosidase, β-galactosidase, cellulase, polylase Galacturonase, chymotrypsin, trypsin, arginase, acetylcholinesterase, acyl phosphatase, elastase and the like can be used.
[0023]
Examples of lyases include N-acetylneuraminate lyase, pectin lyase, fructose bisphosphate aldolase, N-acylneuraminate-9-phosphate synthase, O-acetylserine lyase, acetoacetate decarboxylase, carboxylic acid dehydratase, etc. it can.
[0024]
As isomerase, racemase, epimerase, cis-trans isomerase, ketol isomerase, totomerase, mutase, cycloisomerase, etc. can be used. For example, glucose isomerase, acylglucosamine 2-epimerase, acylglucosamine-6-phosphate 2-epimerase, ribose phosphate isomerase, amino acid racemase and the like can be used.
[0025]
Examples of ligases that can be used include acyl-CoA synthetase, acetyl-CoA carboxylase, acetyl-CoA synthetase, glutamine synthetase, pyruvate carboxylase, DNA ligase, RNA ligase, and various tRNA synthetases.
[0026]
In particular, an enzyme that is in an equilibrium state in a normal reaction is suitable for the present invention, and examples thereof include oxidoreductase, lyase, and isomerase, and preferably isomerase and lyase. A more preferred enzyme is lyase. Most preferred is N-acetylneuraminic acid lyase.
[0027]
In the present invention, the enzyme reaction product is not particularly limited, and a substance produced from the substrate by the enzyme reaction of the enzyme can be used. In particular, a substance that does not bind to the carrier is preferred. N-acetylmannosamine is preferable.
[0028]
In the present invention, the carrier is not particularly limited as long as it binds to a substrate and does not bind to an enzyme reaction product, but includes an ion exchanger, a gel filter, other various chromatographic fillers, polysaccharides, polymers, activated carbon, and the like. Can be used. Preference is given to ion exchangers and gel filtration agents.
[0029]
The ion exchanger may be an organic ion exchanger, an inorganic ion exchanger, a cation exchanger, or an anion exchanger. As a support for the ion exchanger, at least one of resin, membrane, cellulose, fiber, polysaccharide, polymer, ceramic, porous body, gel, activated carbon, dextran, agarose, silica and the like can be used. Preferred supports are resins and cellulose. The anion functional groups of the ion exchanger include diethylaminoethyl (DEAE), triethylaminoethyl (TEAE), trimethylhydroxypropylamine (QA), trimethylbenzylammonium, dimethylhydroxyethylbenzylammonium, tertiary amine, tertiary and 4 At least one such as a secondary amine mixed group can be used. As the cationic functional group, at least one of sulfopropyl (SP), sulfoethyl (SE), carboxymethyl (CM), orthophosphate (P), sulfonic acid, carboxylic acid and the like can be used. An anionic functional group is preferable. The combination of the support of the ion exchanger and the functional group is not particularly limited, and is appropriately selected according to enzyme reaction conditions and the like.
[0030]
As preferred ion exchange resins, Amberlite, Dowex, Dowex Marathon A, Duolite, Diaion Series, and the like can be used.
[0031]
As preferred ion exchange cellulose, DEAE-cellulose, TEAE-cellulose, QEA-cellulose, SP-cellulose, SE-cellulose, CM-cellulose and the like can be used.
[0032]
As the gel filtration agent, dextran gel, polyacrylamide gel, agarose gel, silica and the like can be used. Preferably, Sephadex, Biogel, Sepharose, Toyopearl, Agarose, Sephacryl, Cellulofine, Chitobead and the like can be used.
[0033]
As other various chromatographic packing materials, affinity chromatography packing materials, hydrophobic chromatography packing materials, synthetic adsorbents, chelate chromatography packing materials, partition chromatography packing materials, and the like can be used.
[0034]
The packing material for affinity chromatography used in the present invention is not particularly limited. As the support for the filler, for example, agarose gel can be used. As the functional group of the filler, for example, at least one of lectin, serotonin, 3-hydroxyindoleacetic acid, amino, carboxyl, aldehyde, phenol, imidazole and the like can be used. The combination of the support of the filler and the functional group is not particularly limited, and is appropriately selected according to enzyme reaction conditions and the like.
[0035]
The packing material for hydrophobic chromatography used in the present invention is not particularly limited. As the support for the filler, for example, agarose gel can be used. As the functional group of the filler, for example, at least one of amino, carboxyl, aldehyde, phenol, imidazole and the like can be used. The combination of the support of the filler and the functional group is not particularly limited, and is appropriately selected according to enzyme reaction conditions and the like.
[0036]
The filler for chelate chromatography used in the present invention is not particularly limited. As the support for the filler, for example, crosslinked polystyrene or the like can be used. As the functional group of the filler, for example, at least one kind such as iminodiacetic acid and polyamine can be used. The combination of the support of the filler and the functional group is not particularly limited, and is appropriately selected according to enzyme reaction conditions and the like.
[0037]
The packing material for partition chromatography used in the present invention is not particularly limited. As the support for the filler, for example, chemically bonded silica gel, porous polymer gel, hydrophilic polymer gel and the like can be used. As the functional group of the filler, for example, at least one of amide, octadecyl, phenyl and the like can be used. The combination of the support of the filler and the functional group is not particularly limited, and is appropriately selected according to enzyme reaction conditions and the like.
[0038]
The temperature, pH, time, amount of enzyme, etc. of the enzyme reaction are determined by the enzyme, substrate, etc. used.
[0039]
Hereinafter, the case of producing N-acetylmannosamine as an enzyme reaction product using sialic acid as a substrate, N-acetylneuraminic acid lyase as an enzyme will be exemplified.
[0040]
When N-acetylneuraminic acid lyase is allowed to act on sialic acid, sialic acid is decomposed into N-acetylmannosamine and pyruvic acid. Generally, since the sialic acid decomposition / synthesis reaction by N-acetylneuraminic acid lyase is a reversible reaction, the molar conversion yield from sialic acid to N-acetylmannosamine is about 80%.
[0041]
In the present invention, when N-acetylneuraminic acid lyase is allowed to act on sialic acid bound to a carrier, N-acetylmannosamine and pyruvic acid are produced, but the pyruvic acid binds to the carrier, Acetylmannosamine is liberated. For this reason, only the carrier and N-acetylneuraminic acid lyase are separated from the reaction system after completion of the reaction, so that only N-acetylmannosamine can be easily recovered with high purity, and no complicated purification step is required. Moreover, since the reverse reaction from N-acetylmannosamine to sialic acid is suppressed by binding pyruvic acid to the carrier, the molar conversion yield from sialic acid to N-acetylmannosamine is 100%. Become.
[0042]
As a supply source of sialic acid, a method for producing sialic acid in which N-acetylglucosamine and pyruvic acid are allowed to act on N-acetylneuraminic acid lyase under alkaline conditions to produce sialic acid has been reported (Japanese Patent Laid-open No. Hei 5). -211884). N-acetylmannosamine is produced by neutralizing this sialic acid synthesis reaction solution or supplementing with N-acetylneuraminate lyase after neutralization. N-acetylmannosamine is produced from this reaction solution. Is difficult to purify. This is because it is difficult to separate N-acetylglucosamine and N-acetylmannosamine. Therefore, when the sialic acid synthesis reaction liquid (molar conversion yield of N-acetylglucosamine to sialic acid 50%) is passed through the anion exchanger, pyruvic acid and sialic acid bind to the anion exchanger. Since N-acetylglucosamine does not bind, contamination with N-acetylglucosamine can be easily removed by washing. Thereafter, when N-acetylneuraminic acid lyase is allowed to act on the anion exchanger to which sialic acid and pyruvic acid are bound, as described above, high-purity N-acetylmannosamine is converted into a mole from sialic acid. The conversion yield is 100% (50% in terms of molar conversion yield from N-acetylglucosamine).
[0043]
In addition, a method for producing sialic acid by producing N-acetylglucosamine and pyruvic acid by reacting N-acetylneuraminic acid lyase and acylglucosamine 2-epimerase under neutral conditions has been reported [Carbohydrate Research , 306, 575-578 (1998)]. This reaction solution containing sialic acid (80% in terms of molar conversion yield from N-acetylglucosamine to sialic acid) was passed through the anion exchanger in the same manner as described above, and the anion with sialic acid and pyruvic acid bound thereto was obtained. When N-acetylneuraminic acid lyase is allowed to act on an ion exchanger, N-acetylmannaldehyde is highly pure with a molar conversion yield of 100% from sialic acid (80% molar conversion yield from N-acetylglucosamine). Nosamine is easily obtained.
[0044]
In contrast to the present invention, when the latter reaction solution containing sialic acid was reacted without using a carrier, the molar conversion yield from sialic acid was 55% (N- The molar conversion yield from acetylglucosamine is 44%), and purification is difficult. In particular, since unreacted N-acetylglucosamine is mixed, removal of the substance is extremely difficult.
[0045]
In the method for producing N-acetylmannosamine of the present invention, as the sialic acid, naturally high purity can be used, but if the impurity does not adversely affect the enzyme reaction, the crude sialic acid containing the impurity can also be used. Can be used. For example, sialic acid synthesis reaction solution, chicken egg, milk, sea nest, colominic acid, other sialic acid polymers, as described in JP-A No. 5-11884 and Carbohydrate Research, 306, 575-578 (1998), Sialic acid-containing substances such as glycoproteins, glycolipids, sugar nucleotides, etc., when sialic acid is liberated, or as it is bound to a substance with sialic acid, acid degradation, enzymatic degradation, etc. Can be used by liberating sialic acid.
[0046]
There is no limitation on the amount of sialic acid to be bound to the carrier, and as much sialic acid as possible to be bound to the carrier can be bound. For example, when Dowex Marathon A, an anion exchanger, is used as a carrier, about 150 mg of sialic acid can be bound per 1 ml of wet resin.
[0047]
The origin of the N-acetylneuraminic acid lyase used in the method for producing N-acetylmannosamine of the present invention is not limited. In addition, crude N-acetylneuraminic acid lyase can be used as long as impurities do not adversely affect the enzyme reaction, and it may not be particularly purified.
[0048]
In the method for producing N-acetyl mannosamine of the present invention, the carrier is not particularly limited as long as it is bound to sialic acid and not bound to N-acetyl mannosamine, but an ion exchanger, a gel filter, and other various types. Chromatographic fillers, polysaccharides, polymers, activated carbon and the like can be used. Preference is given to ion exchangers and gel filtration agents. An anion exchange resin is particularly preferable. As the anion exchange resin, Amberlite, Dowex, Dowex Marathon A, Duolite, Diaion series and the like can be used. Examples of other preferred carriers are as described above.
[0049]
The temperature, pH, time, amount of enzyme, etc. of the enzyme reaction are determined by the enzyme, substrate, etc. used.
[0050]
The reaction method of the sialic acid bound to the carrier with the N-acetylneuraminic acid lyase is not particularly limited, regardless of whether it is a batch method or packed in a column, and its molar conversion yield does not change. Preferred are a method of packing in a column, a shaking reaction by a batch method, a stationary reaction method by a batch method, and the like.
[0051]
Methods for removing N-acetylneuraminic acid lyase from the reaction solution include methods using ultrafiltration membranes, heat denaturation removal, acid denaturation removal, gel filtration column chromatography, protein immobilization carriers, protein adsorbents, etc. Can be used.
[0052]
The temperature of the enzyme reaction is not particularly limited as long as the enzyme reaction proceeds, but it is 5 to 80 ° C, preferably 20 to 60 ° C.
[0053]
The pH of the enzyme reaction is not particularly limited as long as the enzyme reaction proceeds, but is pH 3.5 to pH 11, preferably pH 3.5 to pH 8.
[0054]
The enzyme reaction time, the amount of enzyme, and the like are appropriately selected according to the amount of sialic acid used, temperature, pH, and the like.
[0055]
【Example】
Hereinafter, specific examples of the present invention will be shown as examples.
[Example 1]
1.2 g of sialic acid was dissolved in 24 ml of water, 8 ml of an anion exchange resin (Dawex Marathon A) was added as a wet resin amount, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. After stirring, the resin was washed with water, and when the amount of sialic acid adsorbed on the resin was measured, 150 mg of sialic acid was adsorbed on 1 ml of the wet resin.
[0056]
30 U of N-acetylneuraminic acid lyase was added to the resin adsorbed with sialic acid, and a reciprocal shaking reaction was performed at 37 ° C. The reaction pH was adjusted to 6-7.
[0057]
The amount of N-acetyl mannosamine converted by N-acetyl mannosamine dehydrogenase was sampled over time and quantitatively analyzed. As shown in FIG. The molar conversion yield to acetyl mannosamine was 100%.
[0058]
When a small amount of the reaction solution was ultrafiltered and analyzed by HPLC, sialic acid and pyruvic acid were not released from the resin, and only N-acetylmannosamine was released.
[0059]
After completion of the reaction, the reaction solution and the reaction solution remaining in the anion exchange resin were washed out with water, N-acetylneuraminate lyase was removed using an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 10,000, and after lyophilization, 0.8 g of white powder was obtained.
[0060]
The HPLC purity of the obtained N-acetylmannosamine was 100%.
[Example 2]
Dissolve 18 g of N-acetylglucosamine and 18 g of sodium pyruvate in 100 ml of water, adjust to pH 10.5 with 10N NaOH aqueous solution, add 1,000 U of N-acetylneuraminic acid lyase, and perform sialic acid synthesis reaction It was. After the reaction at 30 ° C. for 120 hours, the sialic acid concentration in the reaction solution was quantified. As a result, 126 mg / ml sialic acid was produced.
[0061]
After 40 ml of this reaction solution (5.04 g as sialic acid) was desalted and passed through a column packed with 100 ml of an anion exchange resin (Dowex Marathon A), 50.4 mg of sialic acid was adsorbed to 1 ml of wet resin. .
[0062]
500 U of N-acetylneuraminic acid lyase was added to 100 ml of this resin adsorbed with sialic acid, and the reaction was carried out at 37 ° C.
[0063]
The amount of N-acetylmannosamine was quantitatively analyzed by sampling over time, and the molar conversion yield of sialic acid to N-acetylmannosamine after 3 hours was 100%. When a small amount of the reaction solution was ultrafiltered and analyzed by HPLC, sialic acid and pyruvic acid were not mixed into the reaction solution from the resin, and only N-acetylmannosamine was observed.
[0064]
As a result, the molar conversion yield from N-acetylglucosamine used to N-acetylmannosamine was 50%.
[0065]
After completion of the reaction, the reaction solution and the reaction solution remaining in the anion exchange resin are washed out with water, N-acetylneuraminate lyase is removed using an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 10,000, and then lyophilized. 3.4 g of white powder was obtained.
[0066]
The HPLC purity of the obtained N-acetylmannosamine was 100%.
[Example 3]
N-acetylglucosamine 17.7 g, sodium pyruvate 5.3 g, magnesium chloride 0.2 g and ATP 5.5 g are dissolved in 100 ml of water, adjusted to pH 7.2 with 10N NaOH aqueous solution, and then 1,000 U of N-acetylneuraminic acid A sialic acid synthesis reaction was performed by adding lyase and 200 U of acylglucosamine 2-epimerase.
[0067]
The mixture was reacted at 30 ° C., and after 50 hours and 120 hours, 25 ml and 14 ml of 3M sodium pyruvate solution were added, respectively. As a result of quantifying the concentration of sialic acid in the reaction solution, 140 mg / ml (19.5 g produced) of sialic acid was produced after 180 hours of reaction.
[0068]
40 ml of this reaction solution (5.6 g as sialic acid) was desalted and then passed through a column packed with 100 ml of an anion exchange resin (Dowex Marathon A), thereby adsorbing 56.0 mg of sialic acid on 1 ml of wet resin. .
[0069]
500 U of N-acetylneuraminic acid lyase was added to 100 ml of this resin adsorbed with sialic acid, and the reaction was carried out at 37 ° C.
[0070]
Sampling over time and quantitatively analyzing the amount of N-acetylmannosamine, the molar conversion yield of sialic acid to N-acetylmannosamine after 3 hours was 100%, When ultrafiltered and analyzed by HPLC, no contamination of sialic acid and pyruvic acid from the resin to the reaction solution was observed. After completion of the reaction, the reaction solution and the reaction solution remaining in the anion exchange resin are washed out with water, N-acetylneuraminate lyase is removed using an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 10,000, and then lyophilized. 3.8 g of white powder was obtained. The HPLC purity of the obtained N-acetylmannosamine was 100%.
[0071]
As a result, the molar conversion yield from N-acetylglucosamine used to N-acetylmannosamine was 79%.
[0072]
On the other hand, when this reaction solution was reacted without using a carrier, the molar conversion yield from sialic acid was 55%, and the molar conversion yield from N-acetylglucosamine was 44% (FIG. 1).
[Example 4]
Based on the results of [Example 1] to [Example 3], the reaction scale was actually increased to produce N-acetylmannosamine.
[0073]
N-acetylglucosamine 1,770 g, sodium pyruvate 530 g, magnesium chloride 20 g and ATP 55 g are dissolved in 10 l water, adjusted to pH 7.2 with 10 N NaOH aqueous solution, 100 kU N-acetylneuraminic acid lyase and 20 kU Acylglucosamine 2-epimerase was added to carry out a sialic acid synthesis reaction.
[0074]
The mixture was reacted at 30 ° C., and 2.5 and 1.4 liters of 3M sodium pyruvate solution were added after 50 and 120 hours, respectively. As a result of quantifying the sialic acid concentration in the reaction solution, 140 mg / ml sialic acid was produced after 180 hours of the reaction.
[0075]
13.9 l of this reaction solution (1,946 g as sialic acid) was desalted and then passed through a column packed with 35 l of an anion exchange resin (Dawex Marathon A). The desalting solution was passed through an anion exchange resin and then washed with water, so that 55.6 mg of sialic acid was adsorbed to 1 ml of wet resin.
[0076]
As shown in FIG. 2, N-acetylneuraminic acid lyase 150 kU was circulated through a column packed with 35 l of an anion exchange resin adsorbed with sialic acid. This reaction was performed at 37 ° C.
[0077]
Sampling over time, ultrafiltering a small amount of the reaction mixture and quantitatively analyzing the amount of N-acetylmannosamine, sialic acid was completely decomposed after 40 hours, and moles to N-acetylmannosamine The conversion yield was 100% (FIG. 3).
[0078]
After completion of the reaction, 1,390 g of N-acetylmannosamine was obtained from the reaction solution and the washing solution of the anion exchange resin.
[0079]
From this reaction solution, N-acetylneuraminic acid lyase was removed using an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off of 1,000, followed by concentration under reduced pressure.
[0080]
This concentrated solution was freeze-dried to obtain 1,320 g of a white powder. When the obtained powder was measured by HPLC under the following conditions, the purity was 100% (FIG. 4).
[0081]
Column: Aminex HPX-87H (Bio-Rad)
Mobile phase: 10 mM H₂SO_Four
Flow rate: 0.5ml / min
Detection: 205nm
Temperature: Room temperature
In addition to freeze-drying, it was confirmed that powders were obtained using an organic solvent such as ethanol. Furthermore, it was also confirmed that supersaturated crystals can be obtained by concentration.
[0082]
The molar conversion yield of the obtained N-acetylmannosamine lyophilized powder from N-acetylglucosamine was calculated to be about 80%, confirming the excellent effect of the present invention.
[0083]
From these results, only N-acetyl mannosamine is released by binding sialic acid to an anion exchanger from N-acetylneuraminic acid lyase from sialic acid or a solution containing sialic acid. It was confirmed that there was no impurities and purification was very simple. In addition, since the reaction for synthesizing sialic acid as a raw material once from N-acetylglucosamine and pyruvic acid is easy to scale up and there is no restriction, the method for producing N-acetylmannosamine proposed by the present invention is highly effective. It has become possible to supply pure N-acetylmannosamine very easily and in large quantities.
[0084]
【The invention's effect】
According to the present invention, in the enzyme reaction, substances other than the enzyme reaction product in the enzyme reaction solution are bound to the carrier, so that the enzyme reaction product after the enzyme reaction can be easily separated and purified. In addition, since the substrate is bound to the carrier, the equilibrium of the enzyme reaction is shifted to the enzyme reaction product side, the production to the enzyme reaction product is promoted, and the yield is improved.
[0085]
In particular, according to the method for producing N-acetylmannosamine of the present invention, purification is easy and the yield is almost 100%, and a large amount and low-cost supply of N-acetylmannosamine becomes possible.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the molar conversion yield from sialic acid to N-acetylmannosamine (ManNAc) in [Example 1] of the present invention.
FIG. 2 is a schematic of a reaction apparatus in [Example 4] of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the molar conversion yield from sialic acid to N-acetylmannosamine (ManNAc) in [Example 4] of the present invention.
FIG. 4 is an HPLC chromatogram of N-acetylmannosamine prepared in [Example 4] of the present invention. The vertical axis indicates the holding time, and its unit is minutes.

Claims

A method for producing an enzyme reaction product comprising a step of binding a substrate to a carrier and a step of reacting the substrate bound to the carrier with an enzyme,
The substrate is sialic acid, the carrier is an anion exchanger, and the enzyme is N-acetylneuraminic acid lyase,
A method for producing an enzyme reaction product.

The process according to claim 1 , wherein the enzyme reaction product is N-acetylmannosamine.

The step of binding the substrate to the carrier is a step of passing a reaction solution obtained by reacting N-acetylglucosamine and pyruvate with N-acetylneuraminate lyase under alkaline conditions through an anion exchanger. The manufacturing method of Claim 2 .

The step of binding the substrate to the carrier is a step of passing a reaction solution in which acylglucosamine 2-epimerase and N-acetylneuraminate lyase are allowed to act on N-acetylglucosamine and pyruvate through an anion exchanger. The manufacturing method of Claim 3 characterized by these.