JP4390422B2

JP4390422B2 - Pyrimidine-specific 5'-nucleotidase

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Publication number: JP4390422B2
Application number: JP2002085696A
Authority: JP
Inventors: 和久関水; 敏行中西
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2002-03-26
Filing date: 2002-03-26
Publication date: 2009-12-24
Anticipated expiration: 2022-03-26
Also published as: JP2003274968A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新たなピリミジン特異的５’―ヌクレオチダーゼに関し、さらに詳しくは、該ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼの阻害により、ピリミジン系薬剤の薬効低下を防止する方法あるいは低下したピリミジン系薬剤の薬効を回復させる方法、さらに薬剤耐性の出現頻度が低減されたピリミジン系薬剤をスクリーニングする方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、真菌や悪性腫瘍細胞の増殖に対して阻害効果を示す多くのピリミジン系の薬剤が知られている。例えば、フルシトシン（５−ＦＣ）は、真菌の臓器感染症に対し有効性を示すことが確認されている数少ない抗真菌剤の一つである。また、フルオロウラシル（５−ＦＵ）やその類縁体であるテガフール（ＴＧＦ）、ドキシフルリジン（５’−ＤＦＵＲ）といった薬剤は、種々の癌に対し臨床的に著明な効果を奏する。しかしながら、これらの薬剤に関しては耐性菌あるいは耐性細胞が容易に出現し、薬効が低下することが問題となっている（ＭａｄｅｒＲ．，ｅｔａｌ，ＧｅｎＰｈａｒｍａｃ．３１，６６１−６６６（１９９８）、ＢｏｓｓｃｈｅＨ．，ｅｔａｌ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２，３９３−４００（１９９４））。特にフルシトシンに関しては、薬剤耐性菌の出現が主原因となりその使用が制限されている。
【０００３】
一部の抗悪性腫瘍剤については、多剤耐性タンパク質：ＭＲＰ１（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）等の薬剤排出ポンプの発現が薬剤耐性形質の獲得と密接に関係している（ＨｉｐｆｎｅｒＤ．Ｒ．，ｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１４６１，３５９−３７６（１９９９））。
【０００４】
しかしながら、ピリミジン系の薬剤については、薬剤耐性の生じる詳細な機作は未だ解明されておらず、したがって、その有効な解決方法も知られていない。
【０００５】
一方、ＲＮＡポリメラーゼに対する数多くの伸長促進因子が知られているが、その一つにＳ−ＩＩがある。Ｓ−ＩＩは転写産物を正常な長さに進展するのに重要な役割を果たしていると考えられている（ＳｅｋｉｍｉｚｕＫ．，ｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８，１５８２−１５８８（１９７９））。また、哺乳類から酵母、昆虫および植物に至る真核生物で広範に発現しており、その配列は高度に保存されている。
【０００６】
ところで、酵母におけるＳ−ＩＩ発現欠損株は、ヌクレオチド三リン酸合成経路阻害剤の一つであり、上記ピリミジン系の薬剤の一例である６−アザウラシル（６−ＡＵ）に高い感受性を示すことが知られている（ＮａｋａｎｉｓｈｉＴ．，ｅｔａｌ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２７０，８９９１−８９９５（１９９５））。６−ＡＵは以下の機序により酵母の増殖を阻害する。すなわち、６−ＡＵは酵母内でリボシル化およびリン酸化を受け、活性体の６−アザウリジン−リン酸（６−ａｚａＵＭＰ）へと変換される。６−ａｚａＵＭＰは、それぞれプリン合成経路およびピリミジン合成経路の鍵酵素として知られている、イノシン−リン酸（ＩＭＰ）脱水素酵素とオロチジル酸脱炭酸酵素活性を阻害し、その結果として、ヌクレオチド三リン酸の合成が抑制され、転写伸長反応が阻害される。以上の事実から、６−ＡＵの代謝に関与する何らかの因子がＳ−ＩＩによって発現制御を受けるものと考えられる（ＮａｋａｎｉｓｈｉＴ．，ｅｔａｌ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２７０，８９９１−８９９５（１９９５））。
【０００７】
一方、Ｓ−ＩＩ発現欠損株の６−ＡＵに対する感受性を抑制する因子としてＳＤＴ１（ＳＳＭ１とも称される）が知られている（ＳｈｉｍｏａｒａｉｓｏＭ．，ｅｔａｌ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７５，２９６２３−２９６２７（２０００））が、その生物学的機能については不明であるとされている。しかしながら、ＳＤＴ１が上述の通りＳ−ＩＩ発現欠損株の６−ＡＵに対する感受性を抑制すること、また、ＳＤＴ１発現欠損株が６−ＡＵに関して感受性を示す（ＳｈｉｍｏａｒａｉｓｏＭ．，ｅｔａｌ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７５，２９６２３―２９６２７（２０００））ことから、ＳＤＴ１機能を抑制することにより６−ＡＵに対する感受性の低下を回復できると考えられる。
【０００８】
したがって、ＳＤＴ１の機能が解明できれば、上述のピリミジン系薬剤に関して問題となっている薬剤耐性を克服する新たな方法が提示されることが期待できると考えた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、ＳＤＴ１の機能を明らかにすることにより、ピリミジン系薬剤の薬剤耐性を解決する方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、本発明者は、ＳＤＴ１を過剰発現した酵母は、野生株と比較して、ピリミジン系薬剤に対する感受性が極端に低下する一方、イノシン５’−モノリン酸（ＩＭＰ）脱水素酵素阻害剤であるマイコフェノール酸（ＭＰＡ）に対しては野生株とほぼ同等の感受性を示すことを見出した。また、該ＳＤＴ１過剰発現株の抽出液には、野生株のそれと比較して非常に高いウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）脱リン酸化活性（ＵＭＰａｓｅ活性）が観察されることを見出した。
【００１１】
さらに本発明者は、遺伝子工学的手法を用いて組換えＳＤＴ１を発現・精製し、ＳＤＴ１が、ピリミジン５’−リボヌクレオチドを良好に加水分解する一方、ピリミジン５’−デオキシリボヌクレオチドに対しては極めて弱い加水分解活性しか示さず、またプリン５’−リボヌクレオチドとプリン５’−デオキシリボヌクレオチドについても弱い加水分解活性しか示さないという基質特異性を有するピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼであることを見出した。このような基質特異性を示す５’−ヌクレオチダーゼは現在知られていない。
【００１２】
以上の結果により、ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼであるＳＤＴ１の過剰発現が、抗真菌剤に関して臨床現場において問題となっている薬剤耐性の一因であると考えられる。さらに、抗真菌剤に限らず、ピリミジン系薬剤の薬剤耐性は、ＳＤＴ１と同じ基質特異性を有するピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼの過剰発現により生じていると考えられる。
【００１３】
これらの知見に基づき、本発明者は、（１）ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼを阻害する手段を講じることにより、ピリミジン系薬剤の薬効低下を防止する方法、あるいは該ピリミジン系薬剤の薬効を回復する方法、ならびに（２）真菌内あるいは悪性腫瘍細胞内で代謝されリン酸化をされたピリミジン系薬剤の活性代謝物が、ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼによる脱リン酸化を受けないような薬剤を選抜する工程を含む、ピリミジン系薬物をスクリーニングする方法、を見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
１．下記▲１▼から▲３▼の基質特異性を有するピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼ；
▲１▼ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）を加水分解し、
▲２▼デオキシウリジン５’−モノリン酸（５’−ｄＵＭＰ）またはデオキシシチジン５’−モノリン酸（５’−ｄＣＭＰ）を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示し、
▲３▼プリンヌクレオシド５’−モノリン酸を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示す。
【００１５】
２．（１）ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）を加水分解し、
（２）デオキシウリジン５’−モノリン酸（５’−ｄＵＭＰ）またはデオキシシチジン５’−モノリン酸（５’−ｄＣＭＰ）を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示し、
（３）プリンヌクレオシド５’−モノリン酸を基質とした場合には、５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを基質とした場合の１／１０以下の加水分解活性を示す、ポリペプチドであって、下記の群より選ばれるポリペプチド；
▲１▼配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
▲２▼前記▲１▼のポリペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、および、
▲３▼前記▲１▼のポリペプチドにおいて１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入を有するポリペプチド。
【００１６】
３．１．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、ピリミジン系薬剤の薬効低下を防止する方法。
４．１．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、ピリミジン系抗真菌剤またはピリミジン系抗悪性腫瘍剤の薬効低下を防止する方法。
５．１．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、６−アザウラシル（６−ＡＵ）、フルシトシン（５−ＦＣ）またはフルオロウラシル（５−ＦＵ）の薬効低下を防止する方法。
【００１７】
６．１．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、該ピリミジン系薬剤の薬効を回復する方法。
7．１．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、ピリミジン系抗真菌剤に対し薬剤耐性を示す真菌あるいはピリミジン系抗悪性腫瘍剤に対し薬剤耐性を示す悪性腫瘍細胞において、該ピリミジン抗真菌剤または該ピリミジン系抗悪性腫瘍剤の薬効を回復する方法。
８．１．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、６−アザウラシル（６−ＡＵ）またはフルシトシン（５−ＦＣ）に対し薬剤耐性を示す真菌において、６−ＡＵまたは５−ＦＣの薬効を回復する方法。
９．１．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、フルオロウラシル（５−ＦＵ）に対し薬剤耐性を示す悪性腫瘍細胞において、５−ＦＵの薬効を回復する方法。
【００１８】
１０．１．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニング方法。
１１．１０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物。
１２．１０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも１つ含有する医薬組成物。
【００１９】
１３．１０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも１つ含有するピリミジン系薬剤の薬効低下防止剤。
１４．１０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも１つ含有するピリミジン系抗真菌剤あるいはピリミジン系抗悪性腫瘍剤の薬効低下防止剤。
１５．１０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも１つ含有する６−アザウラシル（６−ＡＵ）、フルシトシン（５−ＦＣ）、またはフルオロウラシル（５−ＦＵ）の薬効低下防止剤。
【００２０】
１６．１０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも１つ含有するピリミジン系薬剤の薬効回復剤。
１７．１０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも１つ含有するピリミジン系抗真菌剤またはピリミジン系抗悪性腫瘍剤の薬効回復剤。
１８．１０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも１つ含有する６−アザウラシル（６−ＡＵ）、フルシトシン（５−ＦＣ）、またはフルオロウラシル（５−ＦＵ）の薬効回復剤。
【００２１】
１９．１０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも一つ含有するピリミジン系薬剤。
２０．１０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも一つ含有するピリミジン系抗真菌剤。
２１．１０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも一つと６−アザウラシル（６−ＡＵ）またはフルシトシン（５−ＦＣ）とを含有するピリミジン系抗真菌剤。
【００２２】
２２．１０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも一つ含有するピリミジン系抗悪性腫瘍剤。
２３．１０．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも一つとフルオロウラシル（５−ＦＵ）とを含有するピリミジン系抗悪性腫瘍剤。
【００２３】
２４．１．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害する化合物を含有する、ピリミジン系薬剤の薬効低下防止剤。
２５．１．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害する化合物を含有する、ピリミジン系薬剤の薬効回復剤。
２６．１．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害する化合物を含有する、ピリミジン系抗真菌剤。
２７．１．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害する化合物を含有する、ピリミジン系抗悪性腫瘍剤。
【００２４】
２８．１．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドが供試化合物の活性代謝物を脱リン酸化する活性を測定する工程を含む、ピリミジン系薬剤のスクリーニング方法。
２９．ピリミジン系抗真菌剤またはピリミジン系抗悪性腫瘍剤のスクリーニング方法であって、１．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドが供試化合物の活性代謝物を脱リン酸化する活性を測定し、該供試化合物の活性代謝物が脱リン酸化を受け難い化合物を選抜する工程を含む、ピリミジン系抗真菌剤またはピリミジン系抗悪性腫瘍剤のスクリーニング方法。
【００２５】
３０．２８．または２９．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物。
３１．２８．または２９．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、またはそれらの水和物を少なくとも一つ含有する医薬組成物。
３２．２８．または２９．に記載のスクリーニング方法により得られた化合物、生理学的に許容されるその塩、およびそれらの水和物を少なくとも一つ含有する抗真菌剤あるいは抗悪性腫瘍剤。
【００２６】
３３．１．に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは２．に記載のポリペプチドと５’−ＵＭＰまたは５’−ＣＭＰを含む、１０．または２８．もしくは２９．に記載のスクリーニング方法で使用するための試薬キット。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明におけるピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼは、ヌクレオチドのリン酸エステル結合加水分解して、リン酸とヌクレオシドを生じさせる活性を有する、５’−ヌクレオチダーゼ（ＥＣ３．１．３．５）に属する。
さらに、本発明におけるピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼとは、ウリジン５’−モノリン酸（５’−ＵＭＰ）とシチジン５’−モノリン酸（５’−ＣＭＰ）に対しては強い加水分解活性を示す一方、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、デオキシヌクレオチド、アデニンもしくはグアニンを塩基として有するプリンヌクレオチド、ウリジン−２’（３’）モノリン酸（２’（３’）―ＵＭＰ）、およびアデノシン−２’（３’）モノリン酸（２’（３’）―ＡＭＰ）については弱い加水分解活性しか示さない、加水分解酵素あるいは脱リン酸化酵素を意味する。本明細書においては、以降、特にことわりが無い限り、単に、ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼと称した場合も、上述の基質特異性を示す、ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼを指すものとする。
【００２８】
５’−ヌクレオチダーゼ活性は、既に文献にて報告されている５’−ヌクレオチダーゼの活性測定方法の中から、適当な方法を選択して測定することができる（ＷｉｄｎｅｌｌＣ．Ｃ．,ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ３２，３６８−３７４（１９７３）、ＡｍｉｃｉＡ．，ｅｔａｌ，ＦＥＢＳｌｅｔｔ．４１９，２６３−２６７（１９９７）等）。基質の種類以外は同じ条件にて活性測定を行った場合、５’−ＵＭＰあるいは５’−ＣＭＰを基質とした場合の活性と比較して、好ましくは１／１０以下、さらに好ましくは１／２０以下、の活性しか示さない基質については、５’−ヌクレオチダーゼが弱い活性しか示さない基質と判断できる。
【００２９】
例えば、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を有するＳＤＴ１は、酵母において見出された、ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼの一例である。ＳＤＴ１遺伝子は、文献（ＳｈｉｍｏａｒａｉｓｏＭ．，ｅｔａｌ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７５，２９６２３―２９６２７（２０００））に記載された方法で、取得することが可能である。すなわち、市販の酵母ゲノムライブラリーから、配列表の配列番号２と配列番号３に記載された塩基配列をプライマーとしたＰＣＲ法で、自己発現に必要なプロモーターなどを含めてＳＤＴ１遺伝子を増幅することが可能である。あるいは市販の酵母ｃＤＮＡライブラリーから、配列表の配列番号４と配列番号５に記載された塩基配列をプライマーとしてＰＣＲ法を用いて取得することも出来る。
【００３０】
得られたＳＤＴ１遺伝子を通常の遺伝子工学的手法を用いて適当な宿主細胞にて発現し、これを精製することによりＳＤＴ１を取得することが可能である。勿論、検出もしくは精製を容易にするために、または別の機能を付加するために、そのＮ末端側やＣ末端側に別の蛋白質、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片もしくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を、あるいはＦＬＡＧ−ｔａｇもしくはＨｉｓ×６−ｔａｇ等のペプチドを、直接またはリンカーペプチド等を介して間接的に公知の遺伝子工学的方法を用いて付加することもできる。
【００３１】
ＳＤＴ１のアミノ酸配列と少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチドであって、ＳＤＴ１と同様の基質特異性を示すピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼも本発明の範囲に包含される。アミノ酸配列上の相同性は少なくとも約７０％以上であればよいが、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上である。このような相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ＳＤＴ１遺伝子をプローブとして使用して酵母以外の他の生物由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーなどをスクリーニングすることによっても取得することができる。このような相同遺伝子の取得方法は公知であり、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年）等に記載された方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することが出来る。
【００３２】
ＳＤＴ１において１個ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入等の変異を導入し、さらにＳＤＴ１と同様の基質特異性を示すピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼも本発明の範囲に包含される。欠失、置換、付加および／または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年）等に記載された方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することが出来る。このような変異の導入において、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、その構成アミノ基もしくはカルボキシル基等を修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。また、適宜糖鎖を付加することも可能である。
【００３３】
本発明において、ピリミジン系の薬剤とは、ピリミジン環をその構造内に保持する、微生物等の増殖を阻害する薬効を有する薬剤を意味する。例えば、ピリミジン系の抗真菌剤として広く臨床で使用されているフルシトシン（５−ＦＣ）が挙げられる。また、臨床では用いられてはいないが、６−アザウラシル（６−ＡＵ）もピリミジン系抗真菌剤の一例である。あるいは、ピリミジン系抗悪性腫瘍剤として、臨床にて用いられている、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、テガフール、テガフール・ウラシル配合剤、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、カルモフール、ドキシフルリジン（５’−ＤＦＵＲ）等もピリミジン系薬剤の一例である。あるいは、抗ウィルス剤であるラミブジン、ザルシタビン（ジデオキシシチジン）等のヌクレオシドアナログもピリミジン系薬剤に含まれる。これらの薬剤は、生体にとって不都合な真菌、悪性腫瘍細胞あるいはウィルス等の増殖を阻害することにより、それら不都合な増殖により誘引された疾患を治療する目的で医薬品として使用される。あるいは、防腐剤としても利用できる。
【００３４】
薬剤耐性とは、一般に、ある薬剤を長期にわたって使用した場合に、その薬効が低下する現象、あるいは薬剤に対する感受性が低下する現象を指す。抗悪性腫瘍剤等についてこのような現象が生じうることはよく知られており、文献にて詳細に報告されている（ＭａｄｅｒＲ．，ｅｔａｌ，ＧｅｎＰｈａｒｍａｃ．３１，６６１−６６６（１９９８）、ＢｏｓｓｃｈｅＨ．，ｅｔａｌ，ＴｒｅｎｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２，３９３−４００（１９９４））。
【００３５】
本発明において、ピリミジン系薬剤の薬効低下を防止する方法とは、上記のピリミジン系薬剤について薬剤耐性の出現を防止する方法、すなわち、該ピリミジン系薬剤の投与とともに以下に記載の５’−ピリミジン特異的ヌクレオチダーゼの機能を阻害する何らかの手段を講じることにより、真菌あるいは悪性腫瘍細胞等の薬剤耐性獲得を抑制して薬剤耐性菌あるいは耐性細胞等の出現頻度を低下する方法を意味する。本防止方法を用いることにより、上記ピリミジン系薬剤を、薬剤耐性を考慮することなく使用することが可能となる。また、薬剤耐性のモニタリングの必要なしに一定の投与量で長期間治療することが可能となり、治療の簡素簡便化が達成されるものと期待できる。
【００３６】
ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼの働きを阻害する手段としては、具体的には、上記ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼのアンチセンスＲＮＡ、上記ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼに対する抗体、上記ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼの一部を改変し、ヌクレオチダーゼ活性を有しないものの基質に対する親和性は上記ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼのそれと等しいような変異体（ドミナントネガティブ変異体）、下記スクリーニング系により選別された化合物等が挙げられる。
【００３７】
本発明において、ピリミジン系薬剤の薬効を回復する方法とは、ピリミジン系薬剤に対する耐性菌あるいは耐性細胞等において該ピリミジン系薬剤の薬効を改善する方法を意味する。たとえば、該ピリミジン系の薬剤が抗真菌剤である場合には、該抗真菌剤が奏効しなくなった真菌あるいは真菌感染症を罹患し該抗真菌剤が奏効しなくなった患者に対し、該ピリミジン系の薬剤が抗悪性腫瘍剤である場合には、該抗悪性腫瘍剤が奏効しなくなった悪性腫瘍細胞あるいは該抗悪性腫瘍剤が奏効しなくなった癌患者に対し、上述の５’−ピリミジン特異的ヌクレオチダーゼを阻害する何らかの手段を講じることにより、該ピリミジン系薬剤が再度薬効を示すようにする方法、を意味する。
【００３８】
本発明において、ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法とは、ピリミジン特異的5’−ヌクレオチダーゼ阻害物質の同定方法である。これは、例えば文献（ＷｉｄｎｅｌｌＣ．Ｃ．,ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ３２，３６８−３７４（１９７３））で報告されている５’−ヌクレオチダーゼの活性測定方法を用いて、本発明のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼを酵素源として使用することにより具体的に実施することが可能である。例えば、マグネシウム塩を含有したトリス緩衝液に、１〜１０ｍＭの基質（５’−ＵＭＰあるいは５’−ＣＭＰ）とＳＤＴ１とを適当量添加し、３０〜３７℃にて５〜１２０分加温した後、分光学的手法、あるいはＨＰＬＣで生成したリン酸を定量することによりヌクレオチダーゼ活性を測定することが出来る。この測定系に供試化合物を添加した場合としなかった場合の生成したリン酸量を比較することにより、供試化合物のヌクレオチダーゼ阻害活性を定量することが可能である。
【００３９】
あるいは、ＳＤＴ１を遺伝子導入した酵母に対しピリミジン系薬剤と共に供試化合物を添加し、野生株と比較して該ピリミジン系薬剤の感受性が低下しないような化合物を選別するといった方法で、上記ピリミジン特異的5’−ヌクレオチダーゼ阻害化合物をスクリーニングすることも可能である。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法に供される供試化合物の種類は特に限定されず、任意の化合物を供試化合物として使用することができる。供試化合物は、個々の低分子化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは低分子化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよく、これらは全て本明細書で言う化合物の範疇に属するものとする。医薬品としての用途を勘案した場合、供試化合物としては、低分子化合物あるいは低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。供試化合物としては、ピリミジン系化合物を使用することもできる。
【００４１】
こうして見出されたピリミジン特異的5’−ヌクレオチダーゼ阻害活性を有する薬物をピリミジン系薬剤と共に投与すれば、上述の通り該ピリミジン系薬剤に対する薬剤耐性が生じ難くなる。
【００４２】
あるいは、薬剤耐性を獲得し薬剤が効果を示さなくなった患者にピリミジン特異的5’−ヌクレオチダーゼ阻害活性を有する薬物を投与すれば、該薬剤に対する抵抗性を回復することができる。
【００４３】
また、ピリミジン特異的5’−ヌクレオチダーゼ阻害活性を有する薬物をピリミジン系薬剤との合剤として、抗真菌剤あるいは抗悪性腫瘍剤等とすることもできる。単剤としてピリミジン系薬剤と共に投与する場合には、投与割合を個体に応じて変化させることが可能であるし、合剤とした場合には患者にとっては服用しやすくなることが予測されるが、患者に好適の手段を選択すればよい。
【００４４】
一方、本発明において、ピリミジン系薬剤のスクリーニング方法とは、供試化合物の真菌あるいは悪性腫瘍細胞等に対する増殖阻害作用効果を測定する工程と共に、該供試化合物の活性代謝物である５’−リン酸化合物が上記ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼにより脱リン酸化されるかどうかを判別する工程を、薬剤選抜の指標の一つとして含むスクリーニング方法を意味する。活性代謝物とは、投与したピリミジン系薬剤が代謝されて生成する、ピリミジン合成経路またはプリン合成経路に関わる酵素を直接阻害する活性をもつ化合物を意味し、たとえば、６−ＡＵについては６−ａｚａＵＭＰが相当する。したがって、一般的には、例えば、ピリミジン化合物をリボシル化し５’位をリン酸化した化合物をピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼが加水分解するか否かを判定する工程を含むスクリーニング方法を意味する。
【００４５】
あるいは、ピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼを過剰発現した細胞に対しても、野生株と同程度の阻害活性を示す薬剤を選抜するとの工程を追加することによっても、本発明のスクリーニング方法を実施することが出来る。例えば、ＳＤＴ１を過剰発現した酵母と野生型酵母において、同等の増殖阻害活性を示すピリミジン系薬剤をスクリーニングすればよい。
【００４６】
このようなスクリーニング方法によって選抜されてきたピリミジン系薬剤は、通常のスクリーニング系のみで選抜されてきたピリミジン系薬剤と比較して、真菌あるいは悪性腫瘍細胞に対して薬剤耐性を生じ難い性質を示すことが期待できる。したがって、真菌感染症の患者あるいは癌を罹患した患者に対して、長期にわたり安定して薬効を示しうる薬剤となる。
【００４７】
本発明に関わるピリミジン特異的5’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害する活性を有する化合物、あるいはピリミジン系薬剤スクリーニング方法により得られた化合物は、医薬品を開発する際に通常実施される試験を経た後、医薬品として提供することが可能である。
【００４８】
本発明の薬剤の投与形態は特に制限されず、経口的・非経口的に投与することができる。本発明の薬剤としては、有効成分である化合物をそのまま用いてもよいが、有効成分の化合物と薬理学的及び製剤学的に許容しうる製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で提供されることが好ましい。
【００４９】
薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、pH調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、又はシロップ剤等を挙げることができる。非経口投与に適する製剤としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、又は貼付剤等を挙げることができる。
【００５０】
本発明の薬剤の投与量は特に限定されず、有効成分の薬効、治療又は予防の目的、患者の年齢や症状、投与経路などの種々の条件に応じて適宜の投与量を選択することが可能であるが、一般的には、０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ／日／成人ヒト、である。
【００５１】
さらに本発明によれば、本発明のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼと、基質として５’−ＵＭＰあるいは５’−ＣＭＰを含む試薬キットを供給することも可能である。これらのキットを用いることにより、上述のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害する化合物あるいは薬剤耐性の生じ難いピリミジン系化合物のスクリーニングを簡便に行うことができる。
【００５２】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
実施例１
（ＳＤＴ１過剰発現株の樹立）
文献（ＳｈｉｍｏａｒａｉｓｏＭ．，ｅｔａｌ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７５，２９６２３〜２９６２７（２０００））に記載された方法を用いて、ＳＤＴ１を含むプラスミドを、酵母ゲノムライブラリーより調製した。このプラスミドを、Ｋｐｎ１−ＮｃｏＩで切断することによりＳＤＴ１遺伝子の１．８Ｋｂｐ断片を得た。当該遺伝子断片をマルチコピーシャトルベクターであるｐＹＯ３２３（ｐＲＳ３１３（ＳｉｋｏｒｓｋｉＲ．Ｓ．ａｎｄＨｉｅｔｅｒＰ．,Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２２,１９−２７（１９８９））からＣＥＮ６とＡＲＳＨ４を削除して作成した。）のＳｍａＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＨ１２７５を調製した。得られたｐＨ１２７５をＢＹ４７４２酵母（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ導入し、ＳＤＴ１過剰発現株を取得した。
【００５３】
（薬剤感受性試験方法）
上記ＳＤＴ１過剰発現株および野生株（ベクターのみを遺伝子導入した、ＢＹ４７２７酵母）、それぞれの各薬剤に対する感受性は、微量培養希釈法（Ｅｓｐｉｎｅｌ−ＩｎｇｒｏｆｆＡ．，ｅｔａｌ，ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２９，１０８９−１０９４（１９９１））を用いて検定した。９６ウェルプレート中、ウェルあたり約２０００の酵母（０．０００１ＯＤｕｎｉｔｓ）を、１００μｇ／ｍｌリジン、２５０μｇ／ｍｌロイシン、薬剤、および１％ＤＭＳＯを含んだ２００μｌのＳＤ培地（アミノ酸非含有０．６７％ｙｅａｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｓｅ及び２％グルコースを含む）に播種した。３０℃で４０時間培養後、波長５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定することにより、各薬剤の酵母の増殖に与える影響を検討した。
【００５４】
（ＵＭＰａｓｅ活性の測定方法）
ＵＭＰａｓｅ活性は、文献（ＷｉｄｎｅｌｌＣ．Ｃ．,ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ３２，３６８−３７４（１９７３））に記載された方法に従って、以下に述べる方法で測定した。９６ウェルプレートの各ウェルに６０μｌの反応液（適当量のタンパク質を添加した０．１Ｍトリス塩酸ｐＨ８．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭジチオトレイトール、１０ｍＭＵＭＰを含む溶液）を調製し、３０℃で１０分間加温した。ここに１５０μｌの展開液（１．４％アスコルビン酸、０．３６％モリブデン酸アンモニウム、０．８６Ｎ硫酸）を添加し、４５℃で２０分間加温した後、８２０ｎｍの波長における吸光度を測定した。生成したリン酸量は、リン酸一カリウム溶液を用いて作成した標準曲線を用いて換算した。１分間に１μｍｏｌのリン酸を５’−ＵＭＰより遊離する酵素活性を１ユニットと定義した。
【００５５】
（ＳＤＴ１過剰発現株の薬剤感受性）
ＳＤＴ１を過剰発現した酵母と野生型酵母それぞれの増殖に及ぼす各種抗真菌剤の効果を、図１に示す。また、ＩＣ５０値を表１に示す。
【００５６】
【表１】

【００５７】
ピリミジン系以外の抗真菌剤であるアンホテリシンＢとフルコナゾール、あるいはＩＭＰ脱水素酵素の阻害剤であるＭＰＡ（マイコフェノール酸）は、野生株とＳＤＴ１過剰発現株について同等の増殖阻害活性を示した。これに対し、ピリミジン系薬剤については、今回用いたいずれの薬剤についても、ＳＤＴ１過剰発現株における薬剤の増殖阻害活性は、野生株のそれと比較して減弱した。これらの結果により、ＳＤＴ１がピリミジン系薬物に対する薬剤耐性と密接に関係していることが示された。
【００５８】
（ＳＤＴ１過剰発現株抽出液中のＵＭＰａｓｅ活性の測定）
ＳＤＴ１はハロ酸脱ハロゲン化酵素様加水分解酵素のコンセンサス配列を有している。また、６−ＡＵはＦＵＲ１タンパク質により６−ａｚａＵＭＰに代謝されること、そして６−ａｚａＵＭＰは、ＩＭＰ脱水素酵素やオロチジル酸脱炭酸酵素を阻害することが知られている（ＥｘｉｎｇｅｒＦ．ａｎｄＬａｃｖｏｕｆｅＦ．，ＣｕｒｒＧｅｎｅｔ２２，９−１１、ＨａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒＲ．Ｅ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２３５，２９１７−２９１９（１９６０））。さらに、これら６−ａｚａＵＭＰの酵素阻害活性は６―ａｚａウリジンへ脱リン酸されることにより消失することも知られている（ＨａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈＲ．ａｎｄＰａｓｔｅｒｎａｋＣ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｓ．Ａｃｔａ２３４，４５１−４５２（１９５８））。
【００５９】
これらの事実から、ＳＤＴ１がＵＭＰの脱リン酸に関わっているのではないかと推察し、ＳＤＴ１過剰発現株、ＳＤＴ１無発現変異株（ＳｈｉｍｏａｒａｉｓｏＭ．，ｅｔａｌ，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７５，２９６２３〜２９６２７（２０００）、および野生株、それぞれの酵母から細胞抽出液を調製し、これらのＵＭＰａｓｅ活性を定量した。その結果、ＳＤＴ１過剰発現株より調製した抽出液のＵＭＰａｓｅ活性は野生株より調製した抽出液の、およそ２．５倍の活性を示した。一方、無発現変異体株については、野生株の半分以下の活性しか示さなかった。以上の結果により、ＳＤＴ１がＵＭＰａｓｅ活性を有することが明らかとなった。
【００６０】
実施例２
（大腸菌における組換えＳＤＴ１蛋白質の発現と精製）
ｐＨ１２７５のＳＤＴ１遺伝子部分を、配列番号４および５に記載されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＣＲ法にて増幅し、ｐＥＴ２１ｃ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入し、Ｈｉｓ−ｔａｇ融合蛋白質の取得に用いた。すなわち、得られたＨｉｓ−ｔａｇ融合ＳＤＴ１発現プラスミド（ｐＨ１１７１）をＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に導入し、これをＬＢ培地で培養した。０．４ｍＭＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加した後、１８℃で１８時間培養することによりＨｉｓ−ｔａｇ融合ＳＤＴ１（以下、組換えＳＤＴ１と称する）の発現を誘導した。
【００６１】
組換えＳＤＴ１を発現した大腸菌を、抽出緩衝液（０．１Ｍトリス塩酸、ｐＨ７．６、１ｍＭＵＭＰ、１ｍＭＭｇＣｌ₂、０．８ｍＭＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオリド）、１７ｍＭスペルミジン、０．２１ｍｇ／ｍｌライソゾーム、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）で溶解し、溶解液を１００，０００ｘｇで１時間超遠心することにより、透明な上清を得た。
【００６２】
この上清を、Ｎｉ樹脂（Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ社）に供し、キットに添付された溶出緩衝液に１ｍＭＵＭＰと１ｍＭＭｇＣｌ₂とを添加した溶出緩衝液により組換えＳＤＴ１を溶出した。イミダゾールをＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（AｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社）により除去し、さらに、緩衝液１（０．１Ｍトリス塩酸ｐＨ７．６、１ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＵＭＰ）で平衡化したＨｉＴｒａｐＣｈｅｌａｔｉｎｇカラム（AｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社）に供した。当該カラムに吸着した組換えＳＤＴ１は、１０−３００ｍＭの直線濃度勾配イミダゾールを溶解した緩衝液１により溶出した。
【００６３】
上記の方法により精製された組換えＳＤＴ１の分子量は、緩衝液２（２０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．６、１ｍＭＵＭＰ、１ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１５ＭＮａＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム（AｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社）を使用し、ウシ血清アルブミン（分子量＝６７０００）、β−ラクトグロブリン（分子量＝３５０００）、およびシトクロームＣ（分子量＝１２４００）を標準蛋白としたゲルろ過により決定した。
【００６４】
蛋白濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ７２，２４８−２５４（１９７６））により求めた。イミダゾールの濃度は、３２０ｎｍの吸光度により求めた。
【００６５】
上記の方法に従ってＨｉｓ−ｔａｇ融合組換えＳＤＴ１を、大腸菌で発現し、これを電気泳動的に単一になるまで精製した。Ｎｉ−カラムに吸着したＳＤＴ１蛋白質は、図２に示すように、イミダゾール直線濃度勾配緩衝液により、ＵＭＰａｓｅ活性と同じピークとして溶出された。ＵＭＰａｓｅ活性および蛋白質のピークフラクションを集め、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、クマジブリリアントブルーによる染色にて、組換えＳＤＴ１は単一のバンドとして検出された。
【００６６】
（組換えＳＤＴ１の分子量の推定）
これまでに報告されているヌクレオチダーゼの多くはオリゴマーを形成することが知られている（ＺｉｍｍｅｒｍａｎｎＨＢｉｏｃｈｅｍＪ２８５，３４５−３６５（１９９２））。今回上記の方法により発現、精製したＨｉｓ−Ｔａｇ融合組換えＳＤＴ１の分子量は、ゲルろ過法により約３３０００と推察された。これは、アミノ酸配列より推定したＳＤＴ１の分子量３２０００とほぼ等しかったことにより、ＳＤＴ１は既知の多くのヌクレオチダーゼとは異なり、溶液中では単量体で存在することが推察された。
【００６７】
（速度量論の算出）
組換えＳＤＴ１について、見掛けＫｍ値および相対Ｖｍａｘを、Lineweaver-Burkプロットから求めた。精製組み換えＳＤＴ１のＫｍは５’−ＵＭＰおよび５’−ＣＭＰについてそれぞれ１．２ｍＭおよび２．３ｍＭであった。５’−ＵＭＰおよび５’−ＣＭＰについてのＶｍａｘはそれぞれ２３μｍｏｌ／分／ｍｇおよび２０μｍｏｌ／分／ｍｇであった。
【００６８】
（組換えＳＤＴ１の基質特異性の検討）
次に、上記方法で精製した組換えＳＤＴ１を用いて、ＳＤＴ１の基質特異性について検討した。活性測定は実施例1に記載した方法に従って、表２に記載したヌクレオチドを基質として用いて行った。活性値は、５’−ＵＭＰを基質とした時の加水分解活性を１００とした比活性で示した。表２に示すように、ＳＤＴ１は５’−ＵＭＰおよび５’−ＣＭＰを特異的に脱リン酸化することが明らかとなった。プリンヌクレオチド、２’−ＵＭＰ、３’−ＵＭＰ、デオキシヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、オロチジン−５’−リン酸あるいはＰＮＰＰに対しては、脱リン酸活性を示さなかった。
【００６９】
【表２】

【００７０】
現在までに様々な基質特異性を示す５’−ヌクレオチダーゼが知られている（ＺｉｍｍｅｒｍａｎｎＨ．，ＢｉｏｃｈｅｍＪ２８５，３４５−３６５（１９９２）、ＡｍｉｃｉＡ．，ｅｔａｌ，ＢｉｏｃｈｅｍＪ３０４，９８７−９９２（１９９４）、ＲａｍｏａｚｚｏＣ．，ｅｔａｌ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７５，５４０９−５４１５（２０００）等）。そのなかにはピリミジンヌクレオチドを特異的に加水分解する活性を示すものがある。しかしながら、それらの酵素は、ピリミジンリボヌクレオチドと同様にピリミジンデオキシリボヌクレオチドについても良好なヌクレオチダーゼ活性を示す。したがって、ＳＤＴ１はこれらの現在までに知られているピリミジン特異的ヌクレオチダーゼとは異なる基質特異性を示すヌクレオチダーゼであることが判明した。
【００７１】
これらの知見は以下に述べることを示唆している。すなわち、ＳＤＴ１を過剰発現した酵母は、６−ＡＵ、５−ＦＣあるいは５−ＦＵの増殖阻害に対して抵抗性を示したことから、現在臨床の場において非常に問題とされている、ピリミジン系抗真菌剤に関する薬剤耐性は、ＳＤＴ１の過剰発現により生じている場合がある。本研究により、ＳＤＴ１は、５’−ＵＭＰと５’−ＣＭＰに対し特異的に脱リン酸化活性を示す５’−ヌクレオチダーゼであることが明らかになったことにより、ＳＤＴ１の脱リン酸化活性を阻害するような化合物を、ピリミジン系抗真菌剤と同時に投与することにより、薬剤耐性を予防することが出来るし、すでに薬剤耐性を獲得してしまった場合にもその低下した薬効を回復出来る。
【００７２】
さらに、ＳＤＴ１の活性阻害物質は、５’−ＵＭＰと５’−ＣＭＰを基質としてスクリーニング出来る。あるいは、ピリミジン系薬剤の活性本体は細胞内でリボシル化および5位リン酸化をうけたものであることが知られている（ＢｏｓｓｃｈｅＨ．，ｅｔａｌ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２，３９３−４００（１９９４））ので、薬剤のスクリーニングの過程で、その５位がリン酸化された活性体がＳＤＴ１の基質とならないような薬剤を選抜することにより、長期間安定した薬効を示しうるピリミジン系薬剤を提供できる。
【００７３】
一方、５−ＦＵ等の抗悪性腫瘍剤もピリミジン系の薬剤であるが、これらの薬剤についても、抗真菌剤と同様に薬剤耐性形質の獲得が非常に問題となっている（ＭａｄｅｒＲ．，ｅｔａｌ，ＧｅｎＰｈａｒｍａｃ．３１，６６１−６６６（１９９８））。上記、実施例１により、ＳＤＴ１過剰発現株においては５―ＦＵに対する感受性も６−ＡＵあるいは５−ＦＣと同様に低下していることから、ピリミジン系抗悪性腫瘍剤に関する薬剤耐性についても、ＳＤＴ１と同様の基質特異性を示すヌクレオチダーゼが関与している可能性が考えられる。したがって、ＳＤＴ１と同様の基質特異性を示すヌクレオチダーゼの活性を阻害することにより、これら抗悪性腫瘍剤において問題となっている薬剤耐性についても克服できる。
【００７４】
【発明の効果】
本発明により、ピリミジン系薬剤の薬剤耐性の問題を解決する有効な手段が提供される。したがって、これまで薬剤耐性が問題となって使用が制限されていたピリミジン系の薬剤を、一定の用量で長期間投与することが可能となり、従来の真菌感染症あるいは癌の治療剤と比較してさらに有用な治療方法、治療剤を提供できる。
【００７５】
【配列表フリーテキスト】
配列表の配列番号１：ＳＤＴ１タンパク質のアミノ酸配列
配列表の配列番号２：酵母ゲノムＤＮＡライブラリーからＳＤＴ１遺伝子を増幅するときに用いるプライマー
配列表の配列番号３：酵母ゲノムＤＮＡライブラリーからＳＤＴ１遺伝子を増幅するときに用いるプライマー
配列表の配列番号４：酵母ｃＤＮＡライブラリーからＳＤＴ１遺伝子を増幅するときに用いるプライマー
配列表の配列番号５：酵母ｃＤＮＡライブラリーからＳＤＴ１遺伝子を増幅するときに用いるプライマー
【００７６】
【配列表】

【００７７】

【００７８】

【００７９】

【００８０】

【００８１】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｐＨ１２７５を遺伝子導入しＳＤＴ１を過剰発現したＢＹ４７４２酵母（Ａ）と、ベクターのみを遺伝子導入した野生型酵母（Ｂ）の増殖に、各種ピリミジン系薬剤が及ぼす効果を示す。６−ＡＵ；６-アザウラシル、５−ＦＵ；フルオロウラシル、５−ＦＣ；フルシトシン、ＭＰＡ；マイコフェノール酸、ＡＭＰＨ；アンフォテリシンＢ、ＦＬＣＺ；フルコナゾール。
【図２】図２は、Ｎｉキレーティングカラムに吸着したＨｉｓ−ｔａｇ融合組換えＳＤＴ１を、イミダゾール直線濃度勾配緩衝液にて溶出したクロマトグラフを示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel pyrimidine-specific 5′-nucleotidase, and more specifically, a method for preventing a decrease in the efficacy of a pyrimidine drug by inhibiting the pyrimidine-specific 5′-nucleotidase or a reduced pyrimidine drug. The present invention relates to a method for recovering drug efficacy, a method for screening a pyrimidine-based drug with reduced frequency of drug resistance, and the like.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, many pyrimidine drugs showing an inhibitory effect on the growth of fungi and malignant tumor cells are known. For example, flucytosine (5-FC) is one of the few antifungal agents that have been shown to be effective against fungal organ infections. In addition, drugs such as fluorouracil (5-FU) and its analogs tegafur (TGF) and doxyfluridine (5′-DFUR) have clinically significant effects on various cancers. However, with respect to these drugs, resistant bacteria or resistant cells easily appear and the efficacy is reduced (Madder R., et al, Gen Pharmac. 31, 661-666 (1998), Bossche). H., et al, Trends in Microbiol. 2, 393-400 (1994)). In particular, the use of flucytosine is restricted due to the emergence of drug-resistant bacteria.
[0003]
For some antineoplastic agents, the expression of a drug efflux pump such as a multidrug resistance protein: MRP1 (multidrug resistant protein) is closely related to the acquisition of drug resistance traits (Hipfner DR, et al. Biochem. Biophys. Acta 1461, 359-376 (1999)).
[0004]
However, for pyrimidine drugs, the detailed mechanism of drug resistance has not yet been elucidated, and therefore an effective solution is not known.
[0005]
On the other hand, many elongation promoting factors for RNA polymerase are known, one of which is S-II. S-II is thought to play an important role in developing transcripts to normal length (Sekimizu K., et al, Biochemistry 18, 1582-1588 (1979)). It is also widely expressed in eukaryotes from mammals to yeast, insects and plants, and its sequence is highly conserved.
[0006]
By the way, an S-II expression-deficient strain in yeast is one of the nucleotide triphosphate synthesis pathway inhibitors, and exhibits high sensitivity to 6-azauracil (6-AU), which is an example of the pyrimidine-based drug. (Nakanishi T., et al, J Biol Chem, 270, 8991-895 (1995)). 6-AU inhibits yeast growth by the following mechanism. That is, 6-AU undergoes ribosylation and phosphorylation in yeast and is converted to the active 6-azauridine-phosphate (6-azaUMP). 6-azaUMP inhibits inosine-phosphate (IMP) dehydrogenase and orotidylate decarboxylase activities, known as key enzymes in the purine and pyrimidine synthesis pathways, respectively, resulting in nucleotide triphosphates. Acid synthesis is suppressed and the transcription elongation reaction is inhibited. From the above facts, it is considered that some factor involved in the metabolism of 6-AU is subject to expression control by S-II (Nakanishi T., et al, J Biol Chem, 270, 8991-895 (1995)).
[0007]
On the other hand, SDT1 (also referred to as SSM1) is known as a factor that suppresses the sensitivity of S-II expression-deficient strains to 6-AU (Shimaroiso M., et al, J Biol Chem 275, 29623-29627 (2000). )), But its biological function is unknown. However, SDT1 suppresses the sensitivity of S-II expression-deficient strains to 6-AU as described above, and SDT1 expression-deficient strains are sensitive to 6-AU (Shimaroiso M., et al, J Biol Chem 275). , 29623-29627 (2000)), it is considered that the decrease in sensitivity to 6-AU can be recovered by suppressing the SDT1 function.
[0008]
Therefore, if the function of SDT1 could be clarified, it was expected that a new method for overcoming drug resistance, which has been a problem with the pyrimidine drugs described above, could be expected.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
The problem to be solved by the present invention is to provide a method for solving the drug resistance of pyrimidine drugs by clarifying the function of SDT1.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that yeast overexpressing SDT1 has extremely reduced sensitivity to pyrimidine drugs compared to wild-type strains, while inosine 5′- It was found that mycophenolic acid (MPA), which is a monophosphate (IMP) dehydrogenase inhibitor, exhibits almost the same sensitivity as the wild type. Further, it has been found that uridine 5′-monophosphate (5′-UMP) dephosphorylation activity (UMPase activity) is observed in the extract of the strain overexpressing SDT1 as compared with that of the wild strain. It was.
[0011]
Furthermore, the present inventor expressed and purified recombinant SDT1 using genetic engineering techniques, and SDT1 hydrolyzes pyrimidine 5′-ribonucleotides well, whereas pyrimidine 5′-deoxyribonucleotides are extremely It has been found that it is a pyrimidine-specific 5'-nucleotidase having a substrate specificity of showing only weak hydrolysis activity and also showing weak hydrolysis activity for purine 5'-ribonucleotide and purine 5'-deoxyribonucleotide. It was. No 5′-nucleotidase exhibiting such substrate specificity is currently known.
[0012]
Based on the above results, it is considered that overexpression of SDT1, which is a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase, contributes to drug resistance that is a problem in clinical practice regarding antifungal agents. Furthermore, not only antifungal agents, but also drug resistance of pyrimidine drugs is considered to be caused by overexpression of pyrimidine-specific 5′-nucleotidase having the same substrate specificity as SDT1.
[0013]
Based on these findings, the present inventor has (1) a method for preventing a decrease in the efficacy of pyrimidine drugs by taking a means for inhibiting pyrimidine-specific 5′-nucleotidase, or the efficacy of the pyrimidine drugs. And (2) a drug in which an active metabolite of a pyrimidine-based drug metabolized and phosphorylated in a fungus or malignant tumor cell is not dephosphorylated by a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase The present invention was completed by finding a method for screening a pyrimidine-based drug, which comprises a step of selecting.
[0014]
That is, the present invention provides the following inventions.
1. Pyrimidine-specific 5′-nucleotidase having the substrate specificity of (1) to (3) below;
(1) Hydrolyzing uridine 5′-monophosphate (5′-UMP) and cytidine 5′-monophosphate (5′-CMP),
(2) When deoxyuridine 5′-monophosphate (5′-dUMP) or deoxycytidine 5′-monophosphate (5′-dCMP) is used as a substrate, 5′-UMP or 5′-CMP is used as the substrate. 1/10 or less hydrolytic activity when
(3) When purine nucleoside 5'-monophosphate is used as a substrate, it exhibits a hydrolytic activity of 1/10 or less when 5'-UMP or 5'-CMP is used as a substrate.
[0015]
2. (1) Hydrolyzing uridine 5′-monophosphate (5′-UMP) and cytidine 5′-monophosphate (5′-CMP),
(2) When deoxyuridine 5′-monophosphate (5′-dUMP) or deoxycytidine 5′-monophosphate (5′-dCMP) is used as a substrate, 5′-UMP or 5′-CMP is used as the substrate. 1/10 or less hydrolytic activity when
(3) When purine nucleoside 5′-monophosphate is used as a substrate, the polypeptide exhibits 1/10 or less hydrolysis activity when 5′-UMP or 5′-CMP is used as a substrate, A polypeptide selected from the following group;
(1) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
(2) A polypeptide having at least about 70% amino acid sequence homology with the polypeptide of (1), and
(3) A polypeptide having a deletion, substitution, addition and / or insertion of 1 to several amino acids in the polypeptide of (1).
[0016]
3. 1. Or a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase according to 1. A method for preventing a decrease in the efficacy of a pyrimidine drug by inhibiting the 5′-nucleotidase activity of the polypeptide described in 1.
4). 1. Or a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase according to 1. A method for preventing a decrease in the efficacy of a pyrimidine antifungal agent or a pyrimidine antineoplastic agent by inhibiting 5′-nucleotidase activity of the polypeptide according to 1.
5. 1. Or a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase according to 1. A method for preventing a decrease in the efficacy of 6-azauracil (6-AU), flucytosine (5-FC) or fluorouracil (5-FU) by inhibiting the 5′-nucleotidase activity of the polypeptide described in 1.
[0017]
6). 1. Or a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase according to 1. A method for recovering the efficacy of the pyrimidine-based drug by inhibiting the 5′-nucleotidase activity of the polypeptide described in 1.
7． 1. Or a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase according to 1. By inhibiting the 5′-nucleotidase activity of the polypeptide described in 1), the pyrimidine in a fungus exhibiting drug resistance to a pyrimidine antifungal agent or a malignant tumor cell exhibiting drug resistance to a pyrimidine anticancer agent A method for recovering the efficacy of an antifungal agent or the pyrimidine anticancer agent.
8). 1. Or a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase according to 1. In fungi exhibiting drug resistance to 6-azauracil (6-AU) or flucytosine (5-FC) by inhibiting the 5′-nucleotidase activity of the polypeptide described in 1. How to restore medicinal properties.
9. 1. Or a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase according to 1. A method for recovering the efficacy of 5-FU in malignant tumor cells exhibiting drug resistance to fluorouracil (5-FU) by inhibiting the 5′-nucleotidase activity of the polypeptide described in 1.
[0018]
10. 1. Or a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase according to 1. A method for screening a compound that inhibits the 5′-nucleotidase activity of the polypeptide described in 1.
11. 10. Or a physiologically acceptable salt or hydrate thereof obtained by the screening method described in 1. above.
12 10. A pharmaceutical composition comprising at least one compound obtained by the screening method described in 1., a physiologically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
[0019]
13. 10. An agent for preventing a decrease in the efficacy of a pyrimidine-based drug comprising at least one compound obtained by the screening method described in 1), a physiologically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
14 10. A pyrimidine antifungal agent or pyrimidine antineoplastic agent containing at least one compound obtained by the screening method described in 1), a physiologically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
15. 10. 6-azauracil (6-AU), flucytosine (5-FC), or fluorouracil containing at least one compound obtained by the screening method described in 1), a physiologically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof (5-FU) A medicinal effect lowering preventive agent.
[0020]
16. 10. An agent for recovering the efficacy of a pyrimidine-based drug comprising at least one compound obtained by the screening method described in 1., a physiologically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
17. 10. A pyrimidine antifungal agent or a pyrimidine antineoplastic agent containing at least one compound obtained by the screening method described in 1), a physiologically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
18. 10. 6-azauracil (6-AU), flucytosine (5-FC), or fluorouracil containing at least one compound obtained by the screening method described in 1), a physiologically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof (5-FU) A drug recovery agent.
[0021]
19. 10. A pyrimidine-based drug comprising at least one compound obtained by the screening method described in 1., a physiologically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
20. 10. A pyrimidine-based antifungal agent containing at least one compound obtained by the screening method described in 1., a physiologically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
21. 10. A pyrimidine containing at least one of the compound obtained by the screening method described in the above, a physiologically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof and 6-azauracil (6-AU) or flucytosine (5-FC) Antifungal agent.
[0022]
22. 10. A pyrimidine-based antineoplastic agent comprising at least one compound obtained by the screening method described in 1., a physiologically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
23. 10. A pyrimidine-based antineoplastic agent containing at least one compound obtained by the screening method described in 1), a physiologically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof and fluorouracil (5-FU).
[0023]
24. 1. Or a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase according to 1. An agent for preventing a decrease in the efficacy of a pyrimidine drug, comprising a compound that inhibits the 5′-nucleotidase activity of the polypeptide described in 1.
25. 1. Or a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase according to 1. An agent for recovering the efficacy of a pyrimidine drug, comprising a compound that inhibits the 5′-nucleotidase activity of the polypeptide described in 1.
26. 1. Or a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase according to 1. A pyrimidine-based antifungal agent comprising a compound that inhibits the 5′-nucleotidase activity of the polypeptide according to.
27. 1. Or a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase according to 1. A pyrimidine-based antineoplastic agent comprising a compound that inhibits the 5′-nucleotidase activity of the polypeptide described in 1.
[0024]
28. 1. Or a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase according to 1. A method for screening a pyrimidine-based drug, comprising the step of measuring the activity of the polypeptide described in 1 for dephosphorylating an active metabolite of a test compound.
29. A screening method for a pyrimidine antifungal agent or a pyrimidine antineoplastic agent, comprising: Or a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase according to 1. A method comprising measuring the activity of the polypeptide according to 1 to dephosphorylate an active metabolite of a test compound, and selecting a compound in which the active metabolite of the test compound is not easily dephosphorylated. Screening method for drugs or pyrimidine-based antineoplastic agents.
[0025]
30. 28. Or 29. Or a physiologically acceptable salt or hydrate thereof obtained by the screening method described in 1. above.
31. 28. Or 29. A pharmaceutical composition comprising at least one compound obtained by the screening method described in 1., a physiologically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
32. 28. Or 29. An antifungal agent or an antineoplastic agent containing at least one compound obtained by the screening method described in 1., a physiologically acceptable salt thereof, and a hydrate thereof.
[0026]
33. 1. Or a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase according to 1. 9. 5′-UMP or 5′-CMP and the polypeptide according to Or 28. Or 29. A reagent kit for use in the screening method described in 1.
[0027]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The pyrimidine-specific 5′-nucleotidase according to the present invention has a 5′-nucleotidase (EC 3.1.3.5) having an activity of phosphoric acid ester bond hydrolysis of nucleotides to produce a phosphate and a nucleoside. Belonging to.
Furthermore, the pyrimidine-specific 5′-nucleotidase in the present invention has a strong hydrolysis activity against uridine 5′-monophosphate (5′-UMP) and cytidine 5′-monophosphate (5′-CMP). While nucleoside diphosphates, nucleoside triphosphates, deoxynucleotides, purine nucleotides having adenine or guanine as a base, uridine-2 '(3') monophosphate (2 '(3')-UMP), and adenosine- As for 2 ′ (3 ′) monophosphate (2 ′ (3 ′)-AMP), it means a hydrolase or phosphatase that shows only weak hydrolytic activity. In the present specification, unless otherwise specified, hereinafter, the term “pyrimidine-specific 5′-nucleotidase” refers to a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase that exhibits the above-mentioned substrate specificity even when referred to as a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase. To do.
[0028]
The 5′-nucleotidase activity can be measured by selecting an appropriate method from among methods for measuring 5′-nucleotidase activity already reported in the literature (Widnell CC, Methods in). Enzymol 32, 368-374 (1973), Amici A., et al, FEBS lett. 419, 263-267 (1997), etc.). When the activity is measured under the same conditions except for the type of substrate, the activity is preferably 1/10 or less, more preferably 1/20, compared to the activity when 5′-UMP or 5′-CMP is used as the substrate. In the following, a substrate exhibiting only the following activity can be judged as a substrate for which 5′-nucleotidase exhibits only weak activity.
[0029]
For example, SDT1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is an example of a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase found in yeast. The SDT1 gene can be obtained by the method described in the literature (Shimoraiso M., et al, J Biol Chem 275, 29623-29627 (2000)). That is, the SDT1 gene including a promoter necessary for self-expression is amplified from a commercially available yeast genome library by PCR using the nucleotide sequences described in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 in the sequence listing as primers. Is possible. Alternatively, it can also be obtained from a commercially available yeast cDNA library using a PCR method using the nucleotide sequences described in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 in the sequence listing as primers.
[0030]
It is possible to obtain SDT1 by expressing the obtained SDT1 gene in a suitable host cell using a normal genetic engineering technique and purifying it. Of course, in order to facilitate detection or purification, or to add another function, another protein such as alkaline phosphatase, β-galactosidase, IgG, etc., immunoglobulin Fc fragment is added to the N-terminal side or C-terminal side. Alternatively, glutathione-S-transferase (GST) or a peptide such as FLAG-tag or His × 6-tag may be added directly or indirectly via a linker peptide or the like using a known genetic engineering method. it can.
[0031]
A pyrimidine-specific 5′-nucleotidase that is a polypeptide having at least about 70% amino acid sequence homology with the amino acid sequence of SDT1 and exhibits the same substrate specificity as SDT1 is also encompassed within the scope of the present invention. . The homology on the amino acid sequence may be at least about 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 97%. That's it. A gene encoding such a homologous amino acid sequence can also be obtained by screening a genomic DNA or cDNA library derived from other organisms other than yeast using the SDT1 gene as a probe. Methods for obtaining such homologous genes are known and are described, for example, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (edited by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). This method can be carried out according to the methods described above or by modifying those methods.
[0032]
A pyrimidine-specific 5′-nucleotidase that introduces mutations such as deletion, substitution, addition, and / or insertion of one or several amino acids in SDT1 and further exhibits the same substrate specificity as SDT1 is also within the scope of the present invention. Is included. Means for introducing mutations such as deletion, substitution, addition and / or insertion are known per se. For example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (edited by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor) , New York, 1989), etc., or by modifying those methods. In introducing such mutations, for example, mutual substitution between homologous amino acids (polar amino acids, nonpolar amino acids, hydrophobic amino acids, hydrophilic amino acids, positively charged amino acids, negatively charged amino acids, aromatic amino acids, etc.) is easy. is assumed. Furthermore, the structural amino group or carboxyl group can be modified to such an extent that the function is not significantly changed. It is also possible to add sugar chains as appropriate.
[0033]
In the present invention, a pyrimidine-based drug means a drug that retains a pyrimidine ring in its structure and has a medicinal effect to inhibit the growth of microorganisms and the like. For example, flucytosine (5-FC) widely used clinically as a pyrimidine-based antifungal agent can be mentioned. Although not used clinically, 6-azauracil (6-AU) is an example of a pyrimidine antifungal agent. Alternatively, fluorouracil (5-FU), tegafur, tegafur / uracil combination drug, tegafur / gimeracil / oteracil potassium combination drug, carmofur, doxyfluridine (5′−), which is used clinically as a pyrimidine-based antineoplastic agent DFUR) and the like are also examples of pyrimidine drugs. Alternatively, nucleoside analogs such as lamivudine and zalcitabine (dideoxycytidine), which are antiviral agents, are also included in the pyrimidine drugs. These drugs are used as pharmaceuticals for the purpose of treating diseases induced by such unfavorable growth by inhibiting the growth of fungi, malignant tumor cells, viruses or the like that are inconvenient for the living body. Alternatively, it can be used as a preservative.
[0034]
Drug resistance generally refers to a phenomenon in which the effectiveness of a certain drug decreases or the sensitivity to the drug decreases when a certain drug is used over a long period of time. It is well known that such a phenomenon can occur for antineoplastic agents and the like, and it has been reported in detail in the literature (Mader R., et al, Gen Pharmac. 31, 661-666 (1998)). Bossche H., et al, Trens in Microbiol. 2, 393-400 (1994)).
[0035]
In the present invention, the method for preventing a decrease in the efficacy of a pyrimidine drug is a method for preventing the emergence of drug resistance for the pyrimidine drug, that is, the 5′-pyrimidine specific described below together with the administration of the pyrimidine drug. It means a method of reducing the appearance frequency of drug-resistant bacteria or resistant cells by suppressing the acquisition of drug resistance such as fungi or malignant tumor cells by taking some means to inhibit the function of the target nucleotidase. By using this prevention method, the pyrimidine-based drug can be used without considering drug resistance. In addition, it is possible to perform long-term treatment with a fixed dose without the need for monitoring drug resistance, and it can be expected that simple and simplified treatment will be achieved.
[0036]
Specific examples of means for inhibiting the action of pyrimidine-specific 5′-nucleotidase include antisense RNA of the pyrimidine-specific 5′-nucleotidase, antibody against the pyrimidine-specific 5′-nucleotidase, and the pyrimidine A mutant (dominant negative mutant) in which a part of a specific 5′-nucleotidase is modified and has no nucleotidase activity but has an affinity for a substrate equal to that of the pyrimidine-specific 5′-nucleotidase, Examples include compounds selected by a screening system.
[0037]
In the present invention, the method for recovering the drug effect of a pyrimidine drug means a method for improving the drug effect of the pyrimidine drug in resistant bacteria or resistant cells to the pyrimidine drug. For example, when the pyrimidine-based drug is an antifungal agent, the pyrimidine-based drug is used for a patient suffering from a fungus or a fungal infection in which the antifungal agent has failed to respond and the antifungal agent has failed to respond. When the drug is an antineoplastic agent, the 5′-pyrimidine-specific agent described above can be used against malignant tumor cells in which the anti-neoplastic agent has failed to respond or cancer patients in which the antineoplastic agent has failed to respond. It means a method in which the pyrimidine-based drug is re-emerged by taking some means for inhibiting nucleotidase.
[0038]
In the present invention, the method for screening a compound that inhibits the activity of pyrimidine-specific 5′-nucleotidase is a method for identifying a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase inhibitor. This can be achieved by, for example, using the method for measuring the activity of 5′-nucleotidase reported in the literature (Widnell CC, Methods in Enzymol 32, 368-374 (1973)). -It can be carried out specifically by using nucleotidase as the enzyme source. For example, an appropriate amount of 1 to 10 mM substrate (5′-UMP or 5′-CMP) and SDT1 was added to Tris buffer containing magnesium salt, and heated at 30 to 37 ° C. for 5 to 120 minutes. Thereafter, the nucleotidase activity can be measured by spectroscopic techniques or by quantifying the phosphate produced by HPLC. The nucleotidase inhibitory activity of the test compound can be quantified by comparing the amount of phosphoric acid produced with and without the test compound added to this measurement system.
[0039]
Alternatively, by adding a test compound together with a pyrimidine drug to yeast into which SDT1 has been introduced, and selecting a compound that does not decrease the sensitivity of the pyrimidine drug compared to the wild strain, the pyrimidine-specific compound is selected. It is also possible to screen for 5′-nucleotidase inhibitor compounds.
[0040]
The kind of the test compound used for the screening method of the present invention is not particularly limited, and any compound can be used as the test compound. The test compound may be an individual small molecule compound, a compound present in a natural product extract, or a small molecule compound library, a phage display library, or a combinatorial library, all of which are described herein. It belongs to the category of the compound said. In consideration of the use as a pharmaceutical, the test compound is preferably a low molecular compound or a compound library of low molecular compounds. As the test compound, a pyrimidine-based compound can also be used.
[0041]
When a drug having pyrimidine-specific 5′-nucleotidase inhibitory activity found in this manner is administered together with a pyrimidine drug, drug resistance to the pyrimidine drug is hardly generated as described above.
[0042]
Alternatively, when a drug having pyrimidine-specific 5′-nucleotidase inhibitory activity is administered to a patient who has acquired drug resistance and has no effect, the resistance to the drug can be recovered.
[0043]
In addition, a drug having pyrimidine-specific 5′-nucleotidase inhibitory activity can be used as a combination with a pyrimidine-based drug, such as an antifungal agent or an antineoplastic agent. When administered with a pyrimidine-based drug as a single agent, the administration ratio can be changed according to the individual, and when combined, it is predicted that it will be easier for patients to take, What is necessary is just to select a means suitable for a patient.
[0044]
On the other hand, in the present invention, the pyrimidine drug screening method includes the step of measuring the growth inhibitory effect of a test compound on fungi or malignant tumor cells, etc., and 5′-phosphorus which is an active metabolite of the test compound. It means a screening method comprising a step of determining whether or not an acid compound is dephosphorylated by the pyrimidine-specific 5′-nucleotidase as one of the indices for drug selection. The active metabolite means a compound having an activity of directly inhibiting an enzyme involved in a pyrimidine synthesis pathway or a purine synthesis pathway, which is produced by metabolism of an administered pyrimidine-based drug. For example, for 6-AU, 6-azaUMP Corresponds. Therefore, in general, for example, it means a screening method including a step of determining whether a pyrimidine-specific 5′-nucleotidase is hydrolyzed by a compound obtained by ribosylating a pyrimidine compound and phosphorylating the 5 ′ position.
[0045]
Alternatively, the screening method of the present invention is carried out by adding a step of selecting a drug exhibiting inhibitory activity comparable to that of the wild type even for cells overexpressing pyrimidine-specific 5′-nucleotidase. I can do it. For example, in yeast and wild type yeast overexpressing SDT1, a pyrimidine-based drug showing equivalent growth inhibitory activity may be screened.
[0046]
Pyrimidine drugs that have been selected by such screening methods are more resistant to fungal or malignant tumor cells than pyrimidine drugs that have been selected only by ordinary screening systems. Can be expected. Therefore, it is a drug that can stably show a medicinal effect over a long period of time for a patient with a fungal infection or a patient with cancer.
[0047]
The compound having the activity of inhibiting the pyrimidine-specific 5′-nucleotidase activity related to the present invention, or the compound obtained by the pyrimidine-based drug screening method is subjected to a test usually conducted when developing a drug, Can be provided as
[0048]
The administration form of the drug of the present invention is not particularly limited, and can be administered orally or parenterally. The active ingredient compound may be used as it is as the drug of the present invention, but it is provided in the form of a pharmaceutical composition comprising the active ingredient compound and a pharmacologically and pharmaceutically acceptable additive for pharmaceutical preparation. It is preferred that
[0049]
Examples of pharmacologically and pharmaceutically acceptable additives include excipients, disintegrating agents or disintegrating aids, binders, lubricants, coating agents, dyes, diluents, bases, solubilizers or Solubilizers, tonicity agents, pH adjusters, stabilizers, propellants, adhesives, and the like can be used. Examples of preparations suitable for oral administration include, for example, tablets, capsules, powders, fine granules, granules, liquids, syrups and the like. Examples of preparations suitable for parenteral administration include injections, drops, suppositories, inhalants, transdermal absorption agents, eye drops, ear drops, ointments, creams, or patches. .
[0050]
The dose of the drug of the present invention is not particularly limited, and an appropriate dose can be selected according to various conditions such as the efficacy of the active ingredient, the purpose of treatment or prevention, the age and symptoms of the patient, the administration route, etc. However, in general, it is 0.01 mg to 500 mg / day / adult human.
[0051]
Furthermore, according to the present invention, a reagent kit containing the pyrimidine-specific 5'-nucleotidase of the present invention and 5'-UMP or 5'-CMP as a substrate can be supplied. By using these kits, screening for a compound that inhibits the above-described pyrimidine-specific 5'-nucleotidase activity or a pyrimidine-based compound that hardly causes drug resistance can be performed.
[0052]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated concretely based on an Example, this invention is not limited to the following Example.
Example 1
(Establishment of strain overexpressing SDT1)
A plasmid containing SDT1 was prepared from a yeast genomic library using the method described in the literature (Shimoaraiso M., et al, J Biol Chem 275, 29623-29627 (2000)). This plasmid was cut with Kpn1-NcoI to obtain a 1.8 Kbp fragment of the SDT1 gene. The gene fragment was prepared by deleting CEN6 and ARSH4 from pYO323 (pRS313 (Sikorski RS and Hieter P., Genetics 122, 19-27 (1989))) which is a multicopy shuttle vector. The plasmid pH1275 was prepared by insertion. The obtained pH 1275 was introduced into BY4742 yeast (Invitrogen) to obtain a strain overexpressing SDT1.
[0053]
(Drug sensitivity test method)
The above-mentioned SDT1 overexpression strain and wild strain (BY4727 yeast into which only the vector was introduced) and the sensitivity to each drug were determined by microculture dilution method (Espinel-Ingroff A., et al, J Clin Microbiol 29, 1089-1094). (1991)). In a 96-well plate, approximately 2000 yeast (0.0001 ODunits) per well was added to 200 μl SD medium (amino acid free 0.67% yeast) containing 100 μg / ml lysine, 250 μg / ml leucine, drug, and 1% DMSO. Nitrogen base and 2% glucose). After culturing at 30 ° C. for 40 hours, the absorbance at a wavelength of 595 nm was measured using a microplate reader to examine the influence of each drug on yeast growth.
[0054]
(Measurement method of UMpase activity)
The UMPase activity was measured by the method described below in accordance with the method described in the literature (Widnell CC, Methods in Enzymol 32, 368-374 (1973)). In each well of a 96-well plate, 60 μl of reaction solution (0.1 M Tris-HCl pH 8.5 with appropriate amount of protein added, 10 mM MgCl ₂ 1 mM dithiothreitol, a solution containing 10 mM UMP) was prepared and heated at 30 ° C. for 10 minutes. 150 μl of a developing solution (1.4% ascorbic acid, 0.36% ammonium molybdate, 0.86N sulfuric acid) was added thereto and heated at 45 ° C. for 20 minutes, and then the absorbance at a wavelength of 820 nm was measured. The amount of phosphoric acid produced was converted using a standard curve created using a monopotassium phosphate solution. Enzyme activity that liberates 1 μmol of phosphoric acid from 5′-UMP per minute was defined as 1 unit.
[0055]
(Drug sensitivity of SDT1 overexpression strain)
The effects of various antifungal agents on the growth of yeasts overexpressing SDT1 and wild type yeasts are shown in FIG. IC50 values are shown in Table 1.
[0056]
[Table 1]

[0057]
Amphotericin B and fluconazole, which are antifungal agents other than pyrimidines, or MPA (mycophenolic acid), which is an inhibitor of IMP dehydrogenase, showed comparable growth inhibitory activities for wild-type strains and SDT1-overexpressing strains. In contrast, for the pyrimidine drugs, the growth inhibition activity of the drug in the strain overexpressing SDT1 was attenuated compared to that of the wild strain for any of the drugs used this time. These results indicated that SDT1 is closely related to drug resistance to pyrimidine drugs.
[0058]
(Measurement of UMPase activity in SDT1 overexpression strain extract)
SDT1 has a consensus sequence for a haloacid dehalogenase-like hydrolase. It is also known that 6-AU is metabolized to 6-azaUMP by FUR1 protein, and 6-azaUMP inhibits IMP dehydrogenase and orotidylate decarboxylase (Exinger F. and Lacwolfe F Curr Genet 22, 9-11, Handschumacher RE, J Biol Chem 235, 2917-2919 (1960)). Furthermore, it is also known that the enzyme inhibitory activity of these 6-azaUMPs is lost by dephosphorylation to 6-azauridine (Handschumach R. and Pasternak C., Biochim. Biophyss. Acta 234, 451-452). (1958)).
[0059]
From these facts, it is presumed that SDT1 is involved in the dephosphorylation of UMP, and SDT1 overexpressing strain, SDT1 non-expressing mutant strain (Shimoaraiso M., et al, J Biol Chem 275, 29623-29627 2000) and wild strains, cell extracts were prepared from the respective yeasts, and their UMpase activity was quantified, so that the UMpase activity of the extract prepared from the SDT1 overexpressing strain was the same as that of the extract prepared from the wild strain. On the other hand, the non-expressing mutant strain showed less than half the activity of the wild strain, and the above results reveal that SDT1 has UMpase activity. It was.
[0060]
Example 2
(Expression and purification of recombinant SDT1 protein in E. coli)
The SDT1 gene part at pH 1275 was amplified by PCR using the oligonucleotides described in SEQ ID NOs: 4 and 5 as primers and inserted into pET21c (+) (Novagen) for use in obtaining a His-tag fusion protein. It was. That is, the obtained His-tag fusion SDT1 expression plasmid (pH 1171) was introduced into BL21 (DE3) CodonPlus-RIL (Stratagene) and cultured in LB medium. After adding 0.4 mM IPTG (isopropyl-β-thiogalactopyranoside), the cells were cultured at 18 ° C. for 18 hours to induce the expression of His-tag fusion SDT1 (hereinafter referred to as recombinant SDT1).
[0061]
Escherichia coli expressing recombinant SDT1 was extracted with an extraction buffer (0.1 M Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM UMP, 1 mM MgCl. ₂ , 0.8 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride), 17 mM spermidine, 0.21 mg / ml lysosome, 0.5% sodium deoxycholate), and the lysate is ultracentrifuged at 100,000 × g for 1 hour. A clear supernatant was obtained.
[0062]
This supernatant was subjected to Ni resin (His-Bind resin, Novagen), and 1 mM UMP and 1 mM MgCl were added to the elution buffer attached to the kit. ₂ Recombinant SDT1 was eluted with an elution buffer supplemented with Imidazole was removed with a HiPrep 26/10 desalting column (Amersham Pharmacia Biotech) and buffer 1 (0.1 M Tris-HCl pH 7.6, 1 mM MgCl ₂ (1 mM UMP) equilibrated with HiTrapChelating column (Amersham Pharmacia Biotech). Recombinant SDT1 adsorbed on the column was eluted with Buffer 1 in which 10-300 mM linear concentration gradient imidazole was dissolved.
[0063]
The molecular weight of recombinant SDT1 purified by the above method is as follows: Buffer 2 (20 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM UMP, 1 mM MgCl ₂ Superose 12 column (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with 1 mM dithiothreitol (DTT, 0.15 M NaCl) was used, bovine serum albumin (molecular weight = 67000), β-lactoglobulin (molecular weight = 35000), And it was determined by gel filtration using cytochrome C (molecular weight = 12400) as a standard protein.
[0064]
The protein concentration was determined by the method of Bradford (Bradford, MM AnalBiochem 72, 248-254 (1976)). The concentration of imidazole was determined by absorbance at 320 nm.
[0065]
According to the above method, His-tag fusion recombinant SDT1 was expressed in E. coli and purified to electrophoretic singleness. As shown in FIG. 2, the SDT1 protein adsorbed on the Ni-column was eluted with the imidazole linear concentration gradient buffer as the same peak as the UMPase activity. The UMPase activity and protein peak fractions were collected and subjected to SDS-PAGE. As a result, the recombinant SDT1 was detected as a single band by staining with Kumaji Brilliant Blue.
[0066]
(Estimation of molecular weight of recombinant SDT1)
Many of the nucleotidases reported so far are known to form oligomers (Zimmermann H Biochem J 285, 345-365 (1992)). The molecular weight of His-Tag fusion recombinant SDT1 expressed and purified by the above method was estimated to be about 33000 by gel filtration. This was almost equal to the molecular weight 32000 of SDT1 estimated from the amino acid sequence, and it was inferred that SDT1 exists as a monomer in solution, unlike many known nucleotidases.
[0067]
(Calculation of speed quantity theory)
For recombinant SDT1, the apparent Km value and relative Vmax were determined from the Lineweaver-Burk plot. The Km of purified recombinant SDT1 was 1.2 mM and 2.3 mM for 5′-UMP and 5′-CMP, respectively. The Vmax for 5′-UMP and 5′-CMP was 23 μmol / min / mg and 20 μmol / min / mg, respectively.
[0068]
(Examination of substrate specificity of recombinant SDT1)
Next, the substrate specificity of SDT1 was examined using recombinant SDT1 purified by the above method. The activity was measured according to the method described in Example 1, using the nucleotides described in Table 2 as a substrate. The activity value was shown as a specific activity with the hydrolysis activity as 100 when 5′-UMP was used as a substrate. As shown in Table 2, it was revealed that SDT1 specifically dephosphorylates 5′-UMP and 5′-CMP. Does not exhibit dephosphorylation activity against purine nucleotides, 2'-UMP, 3'-UMP, deoxynucleoside monophosphate, nucleoside diphosphate, nucleoside triphosphate, orotidine-5'-phosphate or PNPP It was.
[0069]
[Table 2]

[0070]
To date, 5′-nucleotidases exhibiting various substrate specificities are known (Zimmermann H., Biochem J 285, 345-365 (1992), Amici A., et al, Biochem J 304, 987-992. (1994), Ramoazzo C., et al. J Biol Chem 275, 5409-5415 (2000), etc.). Some of them exhibit an activity of specifically hydrolyzing pyrimidine nucleotides. However, these enzymes show good nucleotidase activity for pyrimidine deoxyribonucleotides as well as pyrimidine ribonucleotides. Therefore, SDT1 was found to be a nucleotidase that exhibits a substrate specificity different from these known pyrimidine-specific nucleotidases.
[0071]
These findings suggest the following. That is, since the yeast overexpressing SDT1 showed resistance to the growth inhibition of 6-AU, 5-FC or 5-FU, the pyrimidine system, which is currently very problematic in clinical settings, Drug resistance with respect to antifungal agents may be caused by overexpression of SDT1. The present study revealed that SDT1 is a 5′-nucleotidase that specifically exhibits dephosphorylation activity against 5′-UMP and 5′-CMP, and thus SDT1 has a dephosphorylation activity. By administering a compound that inhibits at the same time as the pyrimidine antifungal agent, drug resistance can be prevented, and even when drug resistance has already been acquired, the reduced drug efficacy can be recovered.
[0072]
Furthermore, SDT1 activity inhibitors can be screened using 5′-UMP and 5′-CMP as substrates. Alternatively, it is known that the active body of a pyrimidine-based drug has undergone ribosylation and 5-position phosphorylation in cells (Bossche H., et al, Trends in Microbiol 2, 393-400 (1994)). Therefore, in the process of drug screening, by selecting a drug whose active substance phosphorylated at position 5 does not become a substrate of SDT1, a pyrimidine drug that can exhibit a stable drug effect for a long period of time can be provided.
[0073]
On the other hand, anti-malignant tumor agents such as 5-FU are also pyrimidine-based drugs. However, acquisition of drug resistance traits is very problematic for these drugs as well as antifungal agents (Mader R.,). et al, Gen Pharma. 31, 661-666 (1998)). According to Example 1 described above, the sensitivity to 5-FU in the strain overexpressing SDT1 is also reduced in the same manner as 6-AU or 5-FC. It is possible that a nucleotidase showing similar substrate specificity is involved. Therefore, by inhibiting the activity of nucleotidase having the same substrate specificity as SDT1, it is possible to overcome the drug resistance that is a problem in these antineoplastic agents.
[0074]
【The invention's effect】
The present invention provides an effective means for solving the drug resistance problem of pyrimidine drugs. Therefore, it has become possible to administer pyrimidine drugs, which have been limited in use due to drug resistance, for a long time at a fixed dose, compared to conventional fungal infections or cancer treatments. Further useful treatment methods and therapeutic agents can be provided.
[0075]
[Sequence Listing Free Text]
SEQ ID NO: 1: amino acid sequence of SDT1 protein
Sequence number 2 of a sequence table: Primer used when amplifying the SDT1 gene from a yeast genomic DNA library
Sequence number 3 of a sequence table: Primer used when amplifying the SDT1 gene from a yeast genomic DNA library
Sequence number 4 of a sequence table: Primer used when amplifying the SDT1 gene from a yeast cDNA library
Sequence number 5 of a sequence table: Primer used when amplifying the SDT1 gene from a yeast cDNA library
[0076]
[Sequence Listing]

[0077]

[0078]

[0079]

[0080]

[0081]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the effect of various pyrimidines on the growth of BY4742 yeast (A) in which pH 1275 has been introduced and SDT1 is overexpressed, and wild-type yeast (B) in which only a vector has been introduced. . 6-AU; 6-azauracil, 5-FU; fluorouracil, 5-FC; flucytosine, MPA; mycophenolic acid, AMPH; amphotericin B, FLCZ; fluconazole.
FIG. 2 shows a chromatograph in which His-tag fusion recombinant SDT1 adsorbed on a Ni chelating column was eluted with an imidazole linear concentration gradient buffer.

Claims

(1) Hydrolyzing uridine 5′-monophosphate (5′-UMP) and cytidine 5′-monophosphate (5′-CMP),
(2) When deoxyuridine 5′-monophosphate (5′-dUMP) or deoxycytidine 5′-monophosphate (5′-dCMP) is used as a substrate, 5′-UMP or 5′-CMP is used as the substrate. 1/10 or less hydrolytic activity when
(3) When purine nucleoside 5′-monophosphate is used as a substrate, the polypeptide exhibits 1/10 or less hydrolysis activity when 5′-UMP or 5′-CMP is used as a substrate, A polypeptide selected from the following group;
(i) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
(ii) a polypeptide having 95% or more amino acid sequence identity with the polypeptide of (i), and
(iii) a polypeptide having a deletion, substitution, addition and / or insertion of 1 to several amino acids in the polypeptide of (i);
A method for preventing a decrease in the efficacy of pyrimidine drugs in vitro by inhibiting the 5'-nucleotidase activity of

(1) Hydrolyzing uridine 5′-monophosphate (5′-UMP) and cytidine 5′-monophosphate (5′-CMP),
(2) When deoxyuridine 5′-monophosphate (5′-dUMP) or deoxycytidine 5′-monophosphate (5′-dCMP) is used as a substrate, 5′-UMP or 5′-CMP is used as the substrate. 1/10 or less hydrolytic activity when
(3) When purine nucleoside 5′-monophosphate is used as a substrate, the polypeptide exhibits 1/10 or less hydrolysis activity when 5′-UMP or 5′-CMP is used as a substrate, A polypeptide selected from the following group;
(i) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
(ii) a polypeptide having 95% or more amino acid sequence identity with the polypeptide of (i), and
(iii) a polypeptide having a deletion, substitution, addition and / or insertion of 1 to several amino acids in the polypeptide of (i);
A method for preventing a decrease in the efficacy of a pyrimidine antifungal agent or a pyrimidine anticancer agent in vitro by inhibiting the 5′-nucleotidase activity of

(1) Hydrolyzing uridine 5′-monophosphate (5′-UMP) and cytidine 5′-monophosphate (5′-CMP),
(2) When deoxyuridine 5′-monophosphate (5′-dUMP) or deoxycytidine 5′-monophosphate (5′-dCMP) is used as a substrate, 5′-UMP or 5′-CMP is used as the substrate. 1/10 or less hydrolytic activity when
(3) When purine nucleoside 5′-monophosphate is used as a substrate, the polypeptide exhibits 1/10 or less hydrolysis activity when 5′-UMP or 5′-CMP is used as a substrate, A polypeptide selected from the following group;
(i) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
(ii) a polypeptide having 95% or more amino acid sequence identity with the polypeptide of (i), and
(iii) a polypeptide having a deletion, substitution, addition and / or insertion of 1 to several amino acids in the polypeptide of (i);
A method for preventing a decrease in the efficacy of 6-azauracil (6-AU), flucytosine (5-FC) or fluorouracil (5-FU) in vitro by inhibiting the 5'-nucleotidase activity of

(1) Hydrolyzing uridine 5′-monophosphate (5′-UMP) and cytidine 5′-monophosphate (5′-CMP),
(2) When deoxyuridine 5′-monophosphate (5′-dUMP) or deoxycytidine 5′-monophosphate (5′-dCMP) is used as a substrate, 5′-UMP or 5′-CMP is used as the substrate. 1/10 or less hydrolytic activity when
(3) When purine nucleoside 5′-monophosphate is used as a substrate, the polypeptide exhibits 1/10 or less hydrolysis activity when 5′-UMP or 5′-CMP is used as a substrate, A polypeptide selected from the following group;
(i) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
(ii) a polypeptide having 95% or more amino acid sequence identity with the polypeptide of (i), and
(iii) a polypeptide having a deletion, substitution, addition and / or insertion of 1 to several amino acids in the polypeptide of (i);
A method for recovering the efficacy of pyrimidine drugs in vitro by inhibiting the 5′-nucleotidase activity of

(1) Hydrolyzing uridine 5′-monophosphate (5′-UMP) and cytidine 5′-monophosphate (5′-CMP),
(2) When deoxyuridine 5′-monophosphate (5′-dUMP) or deoxycytidine 5′-monophosphate (5′-dCMP) is used as a substrate, 5′-UMP or 5′-CMP is used as the substrate. 1/10 or less hydrolytic activity when
(3) When purine nucleoside 5′-monophosphate is used as a substrate, the polypeptide exhibits 1/10 or less hydrolysis activity when 5′-UMP or 5′-CMP is used as a substrate, A polypeptide selected from the following group;
(i) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
(ii) a polypeptide having 95% or more amino acid sequence identity with the polypeptide of (i), and
(iii) a polypeptide having a deletion, substitution, addition and / or insertion of 1 to several amino acids in the polypeptide of (i);
By inhibiting the 5′-nucleotidase activity of a fungus exhibiting drug resistance to a pyrimidine antifungal agent or a malignant tumor cell exhibiting drug resistance to a pyrimidine anticancer agent, the pyrimidine antifungal agent or the A method for recovering the efficacy of a pyrimidine antineoplastic agent in vitro .

(1) Hydrolyzing uridine 5′-monophosphate (5′-UMP) and cytidine 5′-monophosphate (5′-CMP),
(2) When deoxyuridine 5′-monophosphate (5′-dUMP) or deoxycytidine 5′-monophosphate (5′-dCMP) is used as a substrate, 5′-UMP or 5′-CMP is used as the substrate. 1/10 or less hydrolytic activity when
(3) When purine nucleoside 5′-monophosphate is used as a substrate, the polypeptide exhibits 1/10 or less hydrolysis activity when 5′-UMP or 5′-CMP is used as a substrate, A polypeptide selected from the following group;
(i) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
(ii) a polypeptide having 95% or more amino acid sequence identity with the polypeptide of (i), and
(iii) a polypeptide having a deletion, substitution, addition and / or insertion of 1 to several amino acids in the polypeptide of (i);
Inhibits the efficacy of 6-AU or 5-FC in vitro in fungi that exhibit drug resistance to 6-azauracil (6-AU) or flucytosine (5-FC) by inhibiting the 5'-nucleotidase activity of how to.

(1) Hydrolyzing uridine 5′-monophosphate (5′-UMP) and cytidine 5′-monophosphate (5′-CMP),
(2) When deoxyuridine 5′-monophosphate (5′-dUMP) or deoxycytidine 5′-monophosphate (5′-dCMP) is used as a substrate, 5′-UMP or 5′-CMP is used as the substrate. 1/10 or less hydrolytic activity when
(3) When purine nucleoside 5′-monophosphate is used as a substrate, the polypeptide exhibits 1/10 or less hydrolysis activity when 5′-UMP or 5′-CMP is used as a substrate, A polypeptide selected from the following group;
(i) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
(ii) a polypeptide having 95% or more amino acid sequence identity with the polypeptide of (i), and
(iii) a polypeptide having a deletion, substitution, addition and / or insertion of 1 to several amino acids in the polypeptide of (i);
A method for recovering the efficacy of 5-FU in vitro in malignant tumor cells exhibiting drug resistance to fluorouracil (5-FU) by inhibiting the activity of 5′-nucleotidase.

(1) Hydrolyzing uridine 5′-monophosphate (5′-UMP) and cytidine 5′-monophosphate (5′-CMP),
(2) When deoxyuridine 5′-monophosphate (5′-dUMP) or deoxycytidine 5′-monophosphate (5′-dCMP) is used as a substrate, 5′-UMP or 5′-CMP is used as the substrate. 1/10 or less hydrolytic activity when
(3) When purine nucleoside 5′-monophosphate is used as a substrate, the polypeptide exhibits 1/10 or less hydrolysis activity when 5′-UMP or 5′-CMP is used as a substrate, A polypeptide selected from the following group;
(i) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
(ii) a polypeptide having 95% or more amino acid sequence identity with the polypeptide of (i), and
(iii) a polypeptide having a deletion, substitution, addition and / or insertion of 1 to several amino acids in the polypeptide of (i);
A method for screening a compound that inhibits the 5′-nucleotidase activity.

(1) Hydrolyzing uridine 5′-monophosphate (5′-UMP) and cytidine 5′-monophosphate (5′-CMP),
(2) When deoxyuridine 5′-monophosphate (5′-dUMP) or deoxycytidine 5′-monophosphate (5′-dCMP) is used as a substrate, 5′-UMP or 5′-CMP is used as the substrate. 1/10 or less hydrolytic activity when
(3) When purine nucleoside 5′-monophosphate is used as a substrate, the polypeptide exhibits 1/10 or less hydrolysis activity when 5′-UMP or 5′-CMP is used as a substrate, A polypeptide selected from the following group;
(i) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
(ii) a polypeptide having 95% or more amino acid sequence identity with the polypeptide of (i), and
(iii) a polypeptide having a deletion, substitution, addition and / or insertion of 1 to several amino acids in the polypeptide of (i);
A method for screening a pyrimidine-based drug, comprising measuring the activity of dephosphorylating an active metabolite of a test compound.

A screening method for a pyrimidine antifungal agent or a pyrimidine antineoplastic agent comprising:
(1) Hydrolyzing uridine 5′-monophosphate (5′-UMP) and cytidine 5′-monophosphate (5′-CMP),
(2) When deoxyuridine 5′-monophosphate (5′-dUMP) or deoxycytidine 5′-monophosphate (5′-dCMP) is used as a substrate, 5′-UMP or 5′-CMP is used as the substrate. 1/10 or less hydrolytic activity when
(3) When purine nucleoside 5′-monophosphate is used as a substrate, the polypeptide exhibits 1/10 or less hydrolysis activity when 5′-UMP or 5′-CMP is used as a substrate, A polypeptide selected from the following group;
(i) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
(ii) a polypeptide having 95% or more amino acid sequence identity with the polypeptide of (i), and
(iii) a polypeptide having a deletion, substitution, addition and / or insertion of 1 to several amino acids in the polypeptide of (i);
Measuring the activity of dephosphorylating an active metabolite of a test compound, and selecting a compound in which the active metabolite of the test compound is not easily dephosphorylated, comprising a pyrimidine antifungal agent or a pyrimidine antifungal agent Screening method for malignant tumor agent.

(1) Hydrolyzing uridine 5′-monophosphate (5′-UMP) and cytidine 5′-monophosphate (5′-CMP),
(2) When deoxyuridine 5′-monophosphate (5′-dUMP) or deoxycytidine 5′-monophosphate (5′-dCMP) is used as a substrate, 5′-UMP or 5′-CMP is used as the substrate. 1/10 or less hydrolytic activity when
(3) When purine nucleoside 5′-monophosphate is used as a substrate, the polypeptide exhibits 1/10 or less hydrolysis activity when 5′-UMP or 5′-CMP is used as a substrate, A polypeptide selected from the following group;
(i) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
(ii) a polypeptide having 95% or more amino acid sequence identity with the polypeptide of (i), and
(iii) a polypeptide having a deletion, substitution, addition and / or insertion of 1 to several amino acids in the polypeptide of (i);
A reagent kit for use in the screening method according to claim 8, comprising 5′-UMP or 5′-CMP.