JP4390175B2 - Pharmaceutical or cosmetic - Google Patents

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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特に水生生物由来の生理活性物質の医薬または化粧料としての用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
水生生物由来の生理活性物質としてはフコイダンが知られている。フコイダンとは藻類、棘皮動物等に含まれている硫酸化フコース含有多糖であり、硫酸化フコースを構成糖として含むものである。
【０００３】
フコイダンの生理作用としては、がん増殖抑制活性、がん転移抑制活性、抗凝血活性、抗ウィルス活性等が知られており、医薬品等としての用途開発が期待されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はフコイダンの用途に関し、より好適なフコイダン画分を利用した医薬または化粧料を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、フコイダン高分子画分を有効成分として含有することを特徴とするβ型トランスフォーミング増殖因子産生増強を必要とする疾患の治療剤又は予防剤、しわ改善剤又は予防剤、皮膚の弾性向上剤又は維持剤、皮膚肥厚改善剤又は予防剤、又はコラーゲン産生増強剤又は減少抑制剤、のいずれかとして使用される医薬に関する。
【０００６】
本発明の第２の発明は、フコイダン高分子画分を有効成分として含有することを特徴とするβ型トランスフォーミング増殖因子産生増強用、しわ改善用又は予防用、皮膚の弾性向上用又は維持用、皮膚肥厚改善用又は予防用、又はコラーゲン産生増強用又は減少抑制用、のいずれかに使用される化粧料に関する。
【０００７】
本発明の第１および第２の発明において、フコイダン高分子画分としては、藻類由来のフコイダン高分子画分が例示され、また藻類としては褐藻類が例示される。また、フコイダン高分子画分はフコイダン含有画分から分子量１０万未満の画分が排除されたフコイダン高分子画分が例示される。
また、本発明の第２の発明において、化粧料の形態としては、ローション類、乳液類、クリーム類、パック類、浴用剤、洗顔剤、浴用石けん、浴用洗剤または軟膏が例示される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の医薬および化粧料は、フコイダン高分子画分を有効成分として含有することを特徴とする。本発明の所望の効果の発現は、本発明者らが見出した当該有効成分により発揮される、β型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）産生増強作用、しわ改善作用もしくは予防作用、皮膚の弾性向上作用もしくは維持作用、皮膚肥厚改善作用もしくは予防作用、及び／又はコラーゲン産生増強作用もしくは減少抑制作用に基づくものである（以下、これらの有効成分の作用を単に「生理作用」という場合がある）。
【０００９】
なお、本明細書において「増強」には、本発明の有効成分の作用前に比し、作用後において目的物質の量が増加するという態様と共に、本発明の有効成分を作用させることにより目的物質を生起せしめるという態様（誘導）を含む。
【００１０】
本発明者らは先にフコイダンのβ型トランスフォーミング増殖因子産生増強作用、しわ改善用又は予防作用、皮膚の弾性向上作用又は維持作用、皮膚肥厚改善作用又は予防作用、及びコラーゲン産生増強作用又は減少抑制作用を見出している（国際公開第０２／０６３５１号パンフレット）。しかし、これらの生理作用に対する最適なフコイダン含有画分については知られていない。
【００１１】
本発明において、フコイダンとは硫酸化フコースを構成成分として含む硫酸化フコース含有多糖であり、フコイダン高分子画分としては、前記生理作用を有していれば良く、特に限定はない。フコイダン高分子画分の好適な材料としては、藻類、例えばガゴメ、マコンブ、トロロコンブ、ワカメ、クロメ、アラメ、カジメ、ジャイアントケルプ、レッソニア ニグレセンス、モズク、オキナワモズク、アスコフィラム ノドッサム、エクロニア マキシマ（Ecklonia maxima）、ダービリア（Durvillaea）等のコンブ目、ながまつも目、ひばまた目等の褐藻類に属する海藻等、および棘皮動物、例えばナマコ、ウニ、ヒトデ等が例示される。中でも、コンブ目の海藻は優れたＴＧＦ−β産生増強作用を有する高分子のフコイダンを多く含んでおり、原料として好適である。従って、本発明において有効成分として使用されるフコイダン高分子画分としては藻類由来のものが好ましく、褐藻類由来のものがより好ましい。また、棘皮動物、例えばナマコ、ウニ、ヒトデ等由来のフコイダン高分子画分を使用してもよい。
【００１２】
本発明においてフコイダン高分子画分とは、フコイダン含有画分からその高分子画分を分画することにより得られた高分子のフコイダンを含有する画分を意味し、例えば、フコイダン含有画分から低分子のフコイダンが排除されたフコイダン画分が例示され、好適には分子量が５万未満のフコイダンが排除されたフコイダン高分子画分、より好適には分子量が１０万未満のフコイダンが排除されたフコイダン高分子画分が例示される。
【００１３】
本明細書において、フコイダン高分子画分とは、低分子画分が排除されているフコイダン画分であれば特に限定はなく、例えば粗精製のフコイダンや精製されたＦ−、Ｕ−又はＧ−フコイダンからその高分子画分を分画することにより得ることができる。分画方法としては特に限定はなく、例えばゲル濾過法、分子量分画膜による分画法等により分画することができる。
【００１４】
例えばガゴメからフコイダンを調製し、該フコイダンからグルクロン酸含有フコイダン（以下、Ｕ−フコイダンと称す）とグルクロン酸非含有フコイダン（以下、Ｆ−フコイダンと称す）を分離できる。また、ガゴメから硫酸化フコガラクタン（以下、Ｇ−フコイダンと称す）を調製できる。これらの精製されたフコイダンから高分子画分を分離して本発明に使用できる。
【００１５】
Ｕ−フコイダン及びＦ−フコイダンは、例えばガゴメからフコイダンを調製後、陰イオン交換樹脂、界面活性剤等を用いて分離される。ガゴメ由来Ｕ−フコイダン及びＦ−フコイダンの存在比は約１：２であり、Ｕ−フコイダンはフコース、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸等を含み硫酸含量は約２０％、Ｆ−フコイダンはフコースとガラクトースを含み、硫酸含量は約５０％である。
【００１６】
例えばガゴメから調製したフコイダン溶液をＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにアプライ後、ＮａＣｌ含有緩衝液にて濃度勾配法により溶出させることにより、Ｕ−フコイダンとＦ−フコイダンに分離できる。第１図にその１例を示す。すなわち第１図はＵ−フコイダンとＦ−フコイダンの分離を示す図であり、図中前ピークがＵ−フコイダン、後ピークがＦ−フコイダンである。
【００１７】
また、ガゴメ由来フコイダンを、アルテロモナス ｓｐ．ＳＮ−１００９（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７４７）が産生するＦ−フコイダン特異的分解酵素およびフラボバクテリウム ｓｐ． ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）が産生するＵ−フコイダン特異的分解酵素で分解し、得られた分解物を排除して、前記Ｇ−フコイダンを調製できる。
【００１８】
本発明のフコイダン高分子画分は、限外ろ過膜を用いて工業的に調製することができ、例えば排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機を用いて分子量分画することによって、フコイダン高分子画分を調製することができる。
【００１９】
また、本発明において使用するフコイダン高分子画分としては、分画操作を施さなくとも、低分子画分が排除されている高分子のフコイダン含有物であれば、そのまま本発明の有効成分として使用することもできる。
【００２０】
また、本発明において、フコイダンとはフコイダンの塩も包含する。フコイダンの塩としては、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、有機塩基等との塩が例示される。たとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、またはジエタノールアミン、エチレンジアミン等との塩が挙げられる。これらの塩は、たとえば、フコイダン等に存在する硫酸基やカルボキシル基を公知の方法により塩に変換することで得られる。かかる塩としては薬理学的に許容され得る塩が好ましい。
また、後述の製造例２−（２）に記載のごとく、フコイダンに対し硫酸基をさらに付加してなる高硫酸化体も本発明のフコイダンとして使用できる。
すなわち、これらのフコイダンの塩やフコイダンの高硫酸化体からフコイダンの高分子画分を分画して本発明の有効成分として使用できる。
【００２１】
なお、本発明の有効成分の生理作用の発現は後述の実施例に記載の方法により評価することができる。たとえば、ＴＧＦ−β産生増強作用およびコラーゲン産生増強作用については実施例１に記載の方法により、しわ改善作用もしくは予防作用、皮膚の弾性向上作用もしくは維持作用、皮膚肥厚改善作用もしくは予防作用、およびコラーゲン減少抑制作用については、実施例２に記載の方法により評価することができる。なお、細胞内でのＩ型コラーゲンの産生量は、その前駆体であるＩ型プロコラーゲン（typeI pro-collagen）産生量に反映される。すなわち、Ｉ型プロコラーゲン産生量を調べることにより、Ｉ型コラーゲン産生量の変化を知ることができる。
【００２２】
本発明の第１の態様である医薬は、本発明における前記有効成分を含有してなるものであり、ＴＧＦ−β産生増強を必要とする疾患の治療剤もしくは予防剤、しわ改善剤もしくは予防剤、皮膚の弾性向上剤もしくは維持剤、皮膚肥厚改善剤もしくは予防剤、またはコラーゲン産生増強剤もしくは減少抑制剤として提供される。
【００２３】
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）にはα型（ＴＧＦ−α）とβ型（ＴＧＦ−β）が存在する。特にＴＧＦ−βは細胞増殖の抑制、細胞分化の促進、免疫機能の抑制、繊維芽細胞の走化性の亢進など多彩な生理活性を有し、さまざまな疾患の治癒に関連すると考えられており、例えば糖尿病性網膜症、粥状動脈硬化の初期病変、骨折、心筋梗塞、虚血再還流後の心筋梗塞、脳梗塞、網膜剥離などの治療または予防効果、創傷治癒促進効果などが知られている。従って、ＴＧＦ−β産生を増強することにより、これらの疾患の治療または予防効果が期待される。
【００２４】
すなわち、本発明において、ＴＧＦ−β産生増強を必要とする疾患とはＴＧＦ−β産生を増強することにより治療または予防することが可能な疾患であり、例えば糖尿病性網膜症、粥状動脈硬化、骨折、心筋梗塞、虚血再還流後の心筋梗塞、脳梗塞、網膜剥離、創傷などが例示される。本発明の有効成分はＴＧＦ−β産生増強作用を有しており、当該有効成分を含有してなる、本発明の治療剤または予防剤は、かかる疾患の治療または予防に有効である。なお、ＴＧＦ−βには様々なアイソフォームが存在するが、本発明において有効成分として使用されるフコイダン高分子画分は、ＴＧＦ−βのアイソフォームの中でも、特にＴＧＦ−β１を産生増強する作用に優れており、当該有効成分により産生増強されるＴＧＦ−βとしては好適にはＴＧＦ−β１が例示される。また、本発明の有効成分は、しわ改善作用もしくは予防作用、皮膚の弾性向上作用もしくは維持作用、皮膚肥厚改善作用もしくは予防作用、およびコラーゲン産生増強作用もしくは減少抑制作用を有する。従って、当該有効成分を含有してなる、本発明のしわ改善剤もしくは予防剤、皮膚の弾性向上剤もしくは維持剤、皮膚肥厚改善剤もしくは予防剤、あるいはコラーゲン産生増強剤もしくは減少抑制剤は、しわ改善もしくは予防等に優れた効果を発揮する。たとえば、本発明のしわ改善剤もしくは予防剤、皮膚の弾性向上剤もしくは維持剤、皮膚肥厚改善剤もしくは予防剤、またはコラーゲン産生増強剤もしくは減少抑制剤を肌に塗布することにより、日光曝露、紫外線照射、乾燥等の外的要因、および老化現象として起こる内的要因により誘発される、いずれのしわ形成、皮膚の弾性の低下、皮膚の肥厚の増大またはコラーゲン減少をも改善または予防することができる。なお、本発明において、しわ改善とは、しわの長さを短くする、しわの深さを浅くする、もしくはしわをなくすことを意味する。
【００２５】
続いて、本発明の医薬の製造方法について説明する。本発明の医薬は、フコイダン高分子画分を有効成分とするものであり、当該有効成分を公知の医薬用担体と組合せて製剤化すれば良い。一般的には、本発明にかかる有効成分を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、所望により、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とする。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品や、外用剤とすることもできる。
【００２６】
医薬用担体は、本発明の医薬の投与形態および剤型に応じて選択することができ、経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。
【００２７】
一方、非経口剤の場合は、常法に従い本発明の有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、所望により殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製することができる。
【００２８】
外用剤としては、経皮投与用の固体、半固体または液状の製剤が含まれる。また、座剤なども含まれる。たとえば、乳剤、ローション剤などの乳濁剤、外用チンキ剤などの液状製剤、油性軟膏、親水性軟膏などの軟膏剤、フィルム剤、テープ剤、パップ剤などの経皮投与用の貼付剤などとすることもできる。
【００２９】
本発明の医薬は、適宜、製薬分野における公知の方法により製造することができる。本発明の医薬における本発明の有効成分の含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該医薬を用いて好ましくは後述の投与量範囲で当該有効成分を投与できるような量であれば特に限定されるものではない。
【００３０】
本発明の医薬は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与できる。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。本発明のしわ改善剤もしくは予防剤、皮膚の弾性向上剤もしくは維持剤、皮膚肥厚改善剤もしくは予防剤、あるいはコラーゲン産生増強剤もしくは減少抑制剤については、前記外用剤として皮膚に塗布して投与するのが特に好適であり、それにより所望の効果、例えばしわ改善または予防効果を得ることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができる。
【００３１】
本発明の医薬の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及び当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一般には、製剤中に含有される有効成分の投与量で、好ましくは成人１日当り０．１〜２０００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。また、本発明の医薬はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。また、本発明のフコイダン高分子画分をＴＧＦ−β産生増強用、しわ改善用もしくは予防用、皮膚の弾性向上用もしくは維持用、皮膚肥厚改善用もしくは予防用、および／またはコラーゲン産生増強用もしくは減少抑制用の飲食品の原料として用いても良い。
【００３２】
また、本発明において有効成分として使用されるフコイダン高分子画分はその生理作用により、ＴＧＦ−βの機能研究、しわ形成、皮膚の弾性の低下、皮膚の肥厚、コラーゲン減少のメカニズムの研究や、また、本発明の医薬の他、種々のＴＧＦ−βが関連する疾病用医薬、しわ改善剤または予防剤、皮膚の弾性向上剤または維持剤、皮膚肥厚改善剤または予防剤、およびコラーゲン産生増強剤または減少抑制剤のスクリーニングにも有用である。
【００３３】
本発明の第２の態様である化粧料は本発明の前記有効成分を含有してなり、ＴＧＦ−β産生増強用化粧料、しわ改善用もしくは予防用化粧料、皮膚の弾性向上用もしくは維持用化粧料、皮膚肥厚改善用もしくは予防用化粧料、またはコラーゲン産生増強用もしくは減少抑制用化粧料として提供される。本発明の化粧料の所望の効果の発現は、かかる化粧料に含まれる有効成分が有する前記生理作用に基づくものである。また、皮膚内部でＴＧＦ−β産生が増強されれば、皮膚の張りや弾性を高めることができるものと推定され、ＴＧＦ−β産生増強作用は、しわ改善作用もしくは予防作用等に対し相乗的に働くものと考えられる。従って、本発明の化粧料によれば、たとえば、皮膚の張りや弾性を効果的に向上させることができる。すなわち、本発明によりフコイダン高分子画分を有効成分とするＴＧＦ−β産生増強作用、しわ改善作用もしくは予防作用、皮膚の弾性向上作用もしくは維持作用、皮膚肥厚改善作用もしくは予防作用、またはコラーゲン産生増強作用もしくは減少抑制作用に優れた化粧料が提供される。
【００３４】
なお、有効成分として使用するフコイダン高分子画分は藻類由来であるものが好ましく、藻類としては褐藻類であるのが好ましい。
本発明の化粧料における本発明の有効成分の含有量は、通常、好ましくは０．０００１〜２０重量％、より好ましくは０．００１〜５重量％、更に好ましくは０．０３〜３重量％である。
【００３５】
また、本発明の化粧料には、本発明の有効成分以外のその他の成分として、所望により１，３−ブチレングリコール、ピロリドンカルボン酸塩等の保湿剤、流動パラフィン、ワセリン、オリーブ油、スクワラン、ラノリン、合成エステル油等の皮膚柔軟剤、ヤシ油、パームオイル等の油脂類、ビタミンＥ等のビタミン類、ミツロウ、プロピレングリコールモノステアレート、ステアリン酸等の界面活性剤、ステアリルアルコール等の乳化安定助剤、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の可溶化剤、メチルパラベン等の防腐剤、顔料、抗酸化剤、紫外線吸収剤、薬理活性物質、基剤、界面活性剤等を含有させることができる。さらに、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸に代表される多糖類等の保水作用を有するものを併用してもよい。
【００３６】
本発明の化粧料の形状としては、有効成分の前記生理作用を期待しうるものであれば特に限定はなく、たとえば、ローション類、乳液類、クリーム類、パック類、浴用剤、洗顔剤、浴用石ケン、浴用洗剤または軟膏が好適である。
【００３７】
本発明の化粧料は、本発明の有効成分および所望により前記その他の成分を原料として用い、化粧品分野における公知の方法に従って適宜製造することができる。また、たとえば、後述の食品、飲料等と同様にして飲食品分野における公知の方法に従って経口摂取に適する化粧料を製造することもできる。
【００３８】
たとえば、本発明の有効成分を前記含有量範囲で含む化粧料を、それぞれの用途形態に応じて所望の量、例えばローション類であれば、例えばヒトの顔面全体に適用するような場合、１回の使用当たり好ましくは０．０１〜５ｇ、より好ましくは０．１〜２ｇ程度を用いれば、ＴＧＦ−βの産生増強効果、しわ改善効果もしくは予防効果、皮膚の弾性向上効果もしくは維持効果、皮膚肥厚改善効果もしくは予防効果、およびコラーゲン産生増強効果もしくは減少抑制効果が得られ、肌に張りや艶を与え、美肌効果が得られる等、本発明の所望の効果が得られる。
【００３９】
また、経口摂取に適する化粧料とした場合、当該化粧料の経口摂取のための有効量としては、本発明の有効成分がその生理作用を示し得る量を摂取できるような量であればよく、特に限定はないが、たとえば、通常、成人一日当たり好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｇ、より好ましくは２ｍｇ〜５ｇ、さらに好ましくは１０ｍｇ〜２ｇである。
【００４０】
なお、本明細書中に記載の皮膚とは、顔、首、胸、背中、腕、手、脚、足、臀部、及び頭皮などの人や動物の外側を覆い包んでいる部分すべてを含む。
【００４１】
また、本発明の第３の態様として、フコイダン高分子画分を個体に投与することを特徴とする、ＴＧＦ−β産生増強方法、しわ改善方法もしくは予防方法、皮膚の弾性向上方法もしくは維持方法、皮膚肥厚改善方法もしくは予防方法、またはコラーゲン産生増強方法もしくは減少抑制方法を提供する。
【００４２】
本発明の態様において使用するフコイダン高分子画分は、本発明における前記有効成分と同様であり、個体に投与するフコイダン高分子画分は藻類由来であるものが好ましい。また、藻類としては褐藻類であるのが好ましい。なお、本明細書において「個体」とは哺乳動物、中でもヒトである。
【００４３】
かかる方法は、たとえば、ＴＧＦ−β産生の増強が必要であると予想される、または、その必要のあるヒトに対し、前記有効成分を、好ましくは、本発明の治療剤または予防剤として投与することにより行うことができ、かかる投与によりＴＧＦ−βの産生を増強せしめる。その結果、たとえば、ＴＧＦ−β産生増強を必要とする疾患の治療または予防効果が期待できる。また、かかる方法は、しわ改善もしくは予防等を所望するヒトに対し、前記有効成分を、好ましくは、本発明のしわ改善剤もしくは予防剤、皮膚の弾性向上剤もしくは維持剤、皮膚肥厚改善剤もしくは予防剤、またはコラーゲン産生増強剤もしくは減少抑制剤として投与することにより行うことができ、かかる投与により、しわ改善もしくは予防等の所望の効果を得ることができる。有効成分の投与方法、投与量などは、当該有効成分の投与に使用する本発明の医薬の投与方法、投与量などに従えばよい。なお、本発明の態様においては、本発明により提供される、前記化粧料や後述の食品、飲料または飼料を用いることもできる。
【００４４】
また、本発明の別の態様として、本発明にかかる前記有効成分を含有、添加および／または希釈してなる、ＴＧＦ−β産生増強用、しわ改善用もしくは予防用、皮膚の弾性向上用もしくは維持用、皮膚肥厚改善用もしくは予防用、またはコラーゲン産生増強用もしくは減少抑制用の食品、飲料または飼料を提供する。本発明の食品、飲料または飼料は、有効成分の生理作用により、本発明の有効成分に感受性を示す個体における、ＴＧＦ−β産生増強を必要とする疾患の症状改善もしくは予防、しわ改善もしくは予防、皮膚の弾性向上もしくは維持、皮膚肥厚に伴う症状改善もしくは予防、およびコラーゲン減少に伴う症状の改善もしくは予防に極めて有用である。
【００４５】
なお、本発明の態様において、「含有」とは食品、飲料、または飼料中に本発明で使用される有効成分が含まれるという態様を、「添加」とは食品、飲料、または飼料の原料に、本発明で使用される有効成分を添加するという態様を、「希釈」とは本発明で使用される有効成分を、食品、飲料、または飼料の原料で希釈するという態様をいうものである。また、本発明の前記化粧料についての記載における「含有」の語は、本発明の態様にいう含有、添加、希釈の意を含むものである。
【００４６】
本発明の食品または飲料の製造法は特に限定されるものではなく、調理、加工及び一般に用いられている食品または飲料の製造法による製造を挙げることができ、製造された食品または飲料に本発明で有効成分として使用されるフコイダン高分子画分が含有、添加及び／又は希釈されていれば良い。
【００４７】
本発明の食品または飲料としては特に限定はないが、例えば穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜・果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等）、菓子類（チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等）、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料（緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料等）、調味料（しょうゆ、ソース、酢、みりん等）、缶詰・瓶詰め・袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥又は濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麺類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープ等）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シュウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテル等）、固形食品、液体食品（スープ等）、香辛料類等の農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。
【００４８】
本発明の食品または飲料における本発明の有効成分の含有量は特に限定されず、その官能と作用発現の観点から適宜選択できるが、たとえば、食品１００重量部当たり好ましくは０．０００１重量部以上、より好ましくは０．００１〜１０重量部であり、たとえば、飲料１００重量部当たり好ましくは０．０００１重量部以上、より好ましくは０．００１〜１０重量部である。
【００４９】
また、本発明により、本発明の前記有効成分を含有、添加及び／又は希釈してなる生物用の飼料（以下、本発明の飼料と称することがある。）が提供され、さらに、別の一態様として、前記有効成分を生物に投与することを特徴とする生物の飼育方法が提供される。さらに本発明の別の一態様として、前記有効成分を含有することを特徴とする生物飼育用剤が提供される。
【００５０】
これらの発明において、生物とは例えば養殖動物、ペット動物等であり、養殖動物としては家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類又は貝類が例示される。飼料としては体調の維持及び／又は改善用飼料が例示される。生物飼育用剤としては浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤が例示される。
【００５１】
これらの発明によれば、それらを適用する前記例示するような生物において、本発明における有効成分の生理作用に基づき、本発明の医薬と同様の効果が期待できる。たとえば、しわ改善効果もしくは予防効果、皮膚の弾性向上効果もしくは維持効果、皮膚肥厚改善効果もしくは予防効果、およびコラーゲン産生増強効果もしくは減少抑制効果の他、ＴＧＦ−β産生増強を必要とする疾患、たとえば、糖尿病性網膜症、粥状動脈硬化、骨折、心筋梗塞、虚血再還流後の心筋梗塞、脳梗塞、網膜剥離の治療もしくは予防効果または創傷治癒促進効果を得ることができる。
【００５２】
本発明の飼料において、本発明で使用される前記有効成分は通常、対象生物の体重１ｋｇ、１日当たり０．０１〜２０００ｍｇ投与される。投与は、たとえば、当該有効成分を、人工配合飼料の原料中に添加混合して調製した飼料を用いて行う、または、人工配合飼料の粉末原料と混合した後、その他の原料とさらに添加混合して調製した飼料を用いて行うことができる。対象生物用の飼料中の本発明の有効成分の含有量は特に限定はなく、目的に応じて設定すれば良いが、好ましくは０．００１〜１５重量％の割合が適当である。
【００５３】
人工配合飼料としては、魚粉、カゼイン、イカミールなどの動物性原料、大豆粕、小麦粉、デンプンなどの植物性原料、飼料用酵母などの微生物原料、タラ肝油、イカ肝油などの動物性油脂、大豆油、菜種油などの植物性油脂、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸、抗酸化剤などを原料とする人工配合飼料が挙げられる。また魚肉ミンチ等の魚類用飼料が挙げられる。
【００５４】
本発明の飼料の製造方法に特に限定はなく、一般の飼料に準じて製造することができ、製造された飼料中に本発明の前記有効成分の有効量が含有、添加および／または希釈されていればよい。
【００５５】
また、本発明の有効成分をプール、水槽、保持タンクまたは飼育領域の水、海水等に直接、添加し、対象生物を浸漬することにより、投与することもできる。この浸漬方法は対象生物の飼料摂取量が低下したときに特に有効である。水または海水中の本発明で使用される前記有効成分の濃度は特に限定はなく、目的に応じて適宜設定すれば良いが、好ましくは０．００００１〜１重量％の割合が適当である。
【００５６】
また、本発明の有効成分を含有する飲料を飼育用飲料として対象生物に摂取させても良い。飲料中の本発明の有効成分の濃度は特に限定はなく、目的に応じて適宜設定すれば良いが、好ましくは０．０００１〜１重量％の割合が適当である。本発明の有効成分を含んでなる生物飼育用剤、例えば浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤はそれ自体公知の方法で調製すれば良い。該生物飼育用剤における有効成分の含有量は、本発明の所望の効果が得られ得る限り特に限定されるものではない。
【００５７】
本発明のこれらの飼料等が適用できる生物としては限定はないが、前記養殖動物としては、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマ等の家畜、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験動物、ニワトリ、アヒル、七面鳥、ダチョウ等の家禽、マダイ、イシダイ、ヒラメ、カレイ、ブリ、ハマチ、ヒラマサ、マグロ、シマアジ、アユ、サケ・マス類、トラフグ、ウナギ、ドジョウ、ナマズ等の魚類、クルマエビ、ブラックタイガー、タイショウエビ、ガザミ等の甲殻類、アワビ、サザエ、ホタテ貝、カキ等の貝類が、前記ペット動物としてはイヌ、ネコ等が挙げられ、陸上・水中動物に広く適用できる。
【００５８】
本発明により提供される、本発明の有効成分を生物に投与する生物の飼育方法は、たとえば、前記本発明の飼料および／または生物用飼育用剤を、それらにより本発明の所望の効果が得られ得るように投与対象の生物に対し投与することにより行うことができる。
【００５９】
本発明の飼料を摂取させること、または本発明の有効成分の含有液に対象生物を浸漬することにより、家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類、貝類、ペット動物等の体調を良好に維持したり、改善させたりすることができる。
【００６０】
本発明の食品、飲料または飼料としては、本発明で有効成分として使用されるフコイダン高分子画分が含有、添加および／または希釈されており、その生理作用を発現させるための有効量が含有されていれば特にその形状に限定はなく、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の経口的に摂取可能な形状物も包含する。なお、本発明にかかる有効成分は、当該生理作用と食物繊維機能とを合わせ持つ健康食品素材として、食品、飲料または飼料の製造素材として極めて有用である。
【００６１】
さらに、本発明の別の態様として、ＴＧＦ−β産生増強、しわ改善もしくは予防、皮膚の弾性向上もしくは維持、皮膚肥厚改善もしくは予防、およびコラーゲン産生増強もしくは減少抑制、のいずれかを行う薬剤を製造するための、フコイダン高分子画分の使用を提供する。
【００６２】
なお、本発明において有効成分として使用されるフコイダン高分子画分はラットへの経口投与において１ｇ／ｋｇ体重を経口単回投与しても死亡例は認められない。また、副作用の発生も認められない。
【００６３】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。なお、実施例における％は特段の事情がない限り重量％を意味する。
【００６４】
製造例１
（１）ガゴメを充分乾燥後、乾燥物２０ｋｇを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕した。
水道水９００リットルに塩化カルシウム二水和物（日本曹達社製）７．３ｋｇを溶解し、次にガゴメ粉砕物２０ｋｇを混合した。液温１２℃から液温９０℃となるまで４０分間の水蒸気吹込みにより水温を昇温させ、次いでかくはん下９０〜９５℃に１時間保温し、次いで冷却し、冷却物１１００リットルを得た。 次いで固液分離装置（ウエストファリアセパレーター社製ＣＮＡ型）を用い、冷却物の固液分離を行い、約９００リットルの固液分離上清液を調製した。
固液分離上清液３６０リットルをダイセル社製ＦＥ１０−ＦＣ−ＦＵＳ０３８２（分画分子量３万）を用い、２０リットルまで濃縮した。次いで水道水を２０リットル加え、また２０リットルまで濃縮するという操作を５回行い、脱塩処理を行い、ガゴメ由来の抽出液２５リットルを調製した。
該溶液１リットルを凍結乾燥し、ガゴメ由来フコイダン乾燥物１３ｇを得た。
【００６５】
（２）製造例１−（１）記載のフコイダン乾燥物７ｇを、５０ｍＭ塩化ナトリウムと１０％エタノールを含む２０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ８）７００ｍＬに溶解し、遠心分離により不溶物を除去した。ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム（φ１１．４ｃｍ×４８ｃｍ）（生化学工業社製）を同緩衝液にて平衡化し、遠心分離上清をアプライ後、同緩衝液で洗い、５０ｍＭから１．９５Ｍの塩化ナトリウム濃度勾配により溶出させた（１フラクション：２５０ｍＬ）。フェノール硫酸法及びカルバゾール硫酸法にて、総糖量及びウロン酸含量を各々求め、溶出順にフラクション４３〜４９、フラクション５０〜５５、フラクション５６〜６７の画分を得た。次に、これらの画分を電気透析により脱塩後凍結乾燥し、フラクション４３〜４９よりＩ画分（３４０ｍｇ）、フラクション５０〜５５よりＩＩ画分（８７０ｍｇ）、フラクション５６〜６７よりＩＩＩ画分（２．６４ｇ）をそれぞれ調製した。
第１図にガゴメ由来フコイダンのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム溶出パターンを示す。第１図において縦軸はカルバゾール硫酸法での５３０ｎｍの吸光度（図中黒丸）、フェノール硫酸法での４８０ｎｍの吸光度（図中白丸）、及び導電率（ｍＳ／ｃｍ：図中白四角）、横軸はフラクション番号を示す。図中前ピークがＵ−フコイダン、後ピークがＦ−フコイダンである。
【００６６】
（３）ガゴメから硫酸化フコース含有多糖画分を調製した。すなわち、市販の乾燥ガゴメ２ｋｇを穴径１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミル（増幸産業社製）で破砕し、２０リットルの８０％エタノール中に懸濁後２５℃で３時間攪拌し、ろ紙でろ過した。得られた残渣を４０リットルの１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、９５℃で２時間処理後、穴径１０６μｍのステンレス製ふるいでろ過した。このろ液に２００ｇの活性炭、４．５リットルのエタノール、１２，０００Ｕのアルギン酸リアーゼＫ（ナガセ生化学工業社製）を添加し、２５℃で２０時間攪拌後、遠心分離した。得られた上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で４リットルに濃縮後、遠心分離で不溶物を除去し、５℃で２４時間放置した。生じた沈殿を遠心分離で除去し、得られた上清を限外ろ過機を用いて１００ｍＭ塩化ナトリウムで溶媒交換した。この溶液を４℃以下に冷却後、塩酸でｐＨを２とし、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清のｐＨを水酸化ナトリウムで８とし、４リットルに濃縮後、限外ろ過機により２０ｍＭ塩化ナトリウムに溶媒交換した。この溶液中の不溶物を遠心分離で除去後、凍結乾燥し、ガゴメ由来フコイダンの乾燥物７６ｇを得た。また、上記と同様の方法でマコンブ由来フコイダン、レッソニア ニグレセンス由来フコイダン、エクロニア マキシマ由来フコイダン、ダービリア由来フコイダンをそれぞれ調製した。
【００６７】
（４）乾燥ガゴメ５００ｇを細断し、１０リットルの８０％エタノールで洗浄後、５０リットルの１ｍＭ塩化カリウムを含有する１０％エタノール中にて、２５℃で３日間攪拌し、網目の直径３２μｍのステンレス金網でろ過してＦ−フコイダン含有ろ液約４５リットルを得た。
【００６８】
（５） 実施例１−（４）の方法によ得られたＦ−フコイダン含有ろ液２リットルを、排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により２００ｍｌに濃縮した。得られたろ過液を低分子画分とした。一方、濃縮液に１ｍＭ塩化カリウムを含む１０％エタノールを２リットル加え再度２００ｍｌに濃縮した。濃縮液を限外ろ過機から取り出し、１ｍＭ塩化カリウムを含む１０％エタノールを加えて２リットルとし、高分子画分とした。
【００６９】
（６）乾燥ガゴメ５００ｇを細断し、１０リットルの８０％エタノールで洗浄後、５０リットルの１ｍＭ塩化カリウムを含有する１０％エタノール中にて、２５℃で３日間攪拌し、網目の直径３２μｍのステンレス金網でろ過してろ液約４５リットルを得た。このろ液３４リットルを８０℃で３時間加熱した後、５０℃まで冷却した。これを排除分子量１万の限外ろ過ＯＭＥＧＡカセット（フィルトロン社製）で液温５０℃に保ちながら濃縮した。さらに５０℃に加温した蒸留水５リットルで脱塩を行い、同蒸留水２００ｍＬを加えて流路を２回洗浄して回収し濃縮液１．５リットルを得た。これを凍結乾燥し、８．２ｇのＦ−ｒｉｃｈフコイダンを得た。なお、Ｆ−ｒｉｃｈフコイダンとは、硫酸化フコースを構成糖の主成分として含むフコイダンをいう。
【００７０】
製造例２
（１）アルテロモナス ｓｐ． ＳＮ−１００９ （ＦＥＲＭ ＢＰ−５７４７）を、グルコース ０．２５％、ペプトン １．０％、酵母エキス ０．０５％を添加した人工海水（ジャマリンラボラトリー社製）ｐＨ８．２からなる培地６００ｍＬを分注して殺菌した（１２０℃、２０分間）２リットルの三角フラスコに接種し、２５℃で２６時間培養して種培養液とした。ペプトン １．０％、酵母エキス ０．０２％、下記製造例２−（２）に記載の硫酸化多糖 ０．２％、及び消泡剤（信越化学工業社製ＫＭ７０）０．０１％を添加した人工海水ｐＨ８からなる培地２０リットルを３０リットル容のジャーファメンターに入れて１２０℃、２０分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液６００ｍＬを接種し、２４℃で２４時間、毎分１０リットルの通気量と毎分２５０回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。この培養上清を、排除分子量１万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により濃縮後８５％飽和硫安塩析し、生じた沈殿を遠心分離により集め、１０分の１濃度の人工海水を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に対して充分透析し、硫酸化多糖に選択的に作用するエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｆ−フコイダン特異的分解酵素）液６００ｍＬを調製した。
【００７１】
（２）製造例１−（２）記載の方法で調製したＦ−フコイダン９８ｍｇを５ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、室温にてピペリジン硫酸９８０ｍｇを添加した後、８０℃にて２時間攪拌した。反応液を冷却後、排除分子量１０００の透析膜にて２日間透析した。得られた透析内液を陽イオン交換カラム〔アンバーライトＩＲＡ−１２０（Ｎａ＋）〕（オルガノ社製）に供じた後、減圧乾固することによりＦ−フコイダンの高硫酸化体９８ｍｇを調製した。
【００７２】
製造例３
（１）乾燥ガゴメ２ｋｇを穴径１ｍｍのスクリーンを装着したカッターミル（増幸産業社製）により破砕し、２０リットルの８０％エタノール中で２５℃、３時間攪拌後ろ過、洗浄した。得られた残渣を５０ｍＭ塩化カルシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０％エタノール、及び製造例２−（１）で調製したアルテロモナス ｓｐ． ＳＮ−１００９由来Ｆ−フコイダン特異的分解酵素を１Ｕ含む２０リットルの３０ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ８．２）に懸濁し、２５℃で２日間攪拌し、穴径３２μｍのステンレス金網でろ過し、洗浄した。得られた残渣を１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０％エタノール、及び４ｇのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業製）を含む４０リットルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）に懸濁し、２５℃で４日間攪拌後、遠心分離し上清を得た。この上清中に含まれるアルギン酸の低分子化物を除去するため排除分子量１０万のホロファイバーを装着した限外ろ過機により２リットルに濃縮後、１０％エタノールを含む１００ｍＭ塩化ナトリウムで溶媒交換した。この溶液に等量の４００ｍＭ酢酸カルシウムを添加攪拌後、遠心分離し、得られた上清を氷冷しながら、１Ｎ塩酸でｐＨ２とした。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を１Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨ８とした。この溶液を限外ろ過により１リットルに濃縮後、１００ｍＭ塩化ナトリウムで溶媒交換した。この時生じた沈殿は遠心分離により除去した。得られた上清中の疎水性物質を除去するため、上清に１Ｍとなるように塩化ナトリウムを加えて、１Ｍ塩化ナトリウムで平衡化した３リットルのフェニルセルロファインカラム（生化学工業製）にかけ、素通り画分を集めた。この画分を限外ろ過機により濃縮後、２０ｍＭ塩化ナトリウムで溶媒交換し、凍結乾燥した。凍結乾燥物の重量は２９．３ｇであった。
【００７３】
（２）上記の凍結乾燥物１５ｇを４００ｍＭ塩化ナトリウム、国際公開第９７／２６８９６号パンフレット記載のフラボバクテリウム ｓｐ． ＳＡ−００８２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０２）を培養して得られたエンド型硫酸化多糖分解酵素（Ｕ−フコイダン特異的分解酵素）を、９Ｕ含む１．５リットルの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液に溶解し、２５℃で６日間反応後、エバポレーターで約３００ｍＬに濃縮した。濃縮液を排除分子量３５００の透析チューブに入れて徹底的に透析し、透析チューブ内に残った液を、５０ｍＭ塩化ナトリウムで平衡化した４リットルのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラムにかけ、５０ｍＭ塩化ナトリウムで充分洗浄後、５０〜６５０ｍＭの塩化ナトリウムの濃度勾配によるカラム吸着物の溶出を行った。更に同カラム吸着物を６５０ｍＭ塩化ナトリウムで充分溶出させた。溶出画分のうち６５０ｍＭ塩化ナトリウムで溶出した画分を硫酸化フコガラクタン（Ｇ−フコイダン）画分として集め、排除分子量１０万の限外ろ過機により濃縮後、１０ｍＭ塩化ナトリウムで溶液を置換し、凍結乾燥して硫酸化フコガラクタンの凍結乾燥物を０．８５ｇ得た。得られた硫酸化フコガラクタンは、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比は、約２：１であった。
【００７４】
製造例４
市販のワカメ メカブの乾燥物１ｋｇを穴の径が１ｍｍのスクリーンを装着させたカッターミルで破砕後、１０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、３時間攪拌後、ろ紙でろ過し、残渣を得た。残渣を５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）２０リットルに懸濁し９５℃で２時間処理した。処理液を３７℃まで冷却後、１０％となるようにエタノールを添加し、市販のアルギン酸リアーゼＫ（ナガセ生化学工業社製）を１２０００Ｕ添加後、室温で２４時間攪拌した。得られた処理液を遠心分離し、その上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で２リットルに濃縮後、生じた沈殿を遠心分離で除去した。得られた上清を５℃に冷却後０．５Ｎ塩酸を添加してｐＨを２とした後３０分間攪拌し、生じた沈殿を遠心分離で除去した。上清のｐＨを０．５Ｎ水酸化ナトリウムで８とし、限外ろ過で溶媒を２０ｍＭ塩化ナトリウムに置換した。溶液のｐＨを８に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、９０．５ｇのワカメ メカブ由来フコイダンを得た。
【００７５】
製造例５
市販の塩蔵モズク５ｋｇを２０リットルのエタノールと混合し、はさみで細断した。１晩放置後ろ紙でろ過し、得られた残渣を１２．５リットルの水に懸濁し、９５℃で２時間処理した。処理液をろ紙でろ過後、３５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２．５％塩化セチルピリジニウム溶液を２６００ｍＬ添加し３日放置した。上清部分を廃棄し、沈殿部分を遠心分離して、その上清も廃棄した。得られた沈殿に２．５リットルの３５０ｍＭ塩化ナトリウムを添加後ホモジナイザーで均一にし遠心分離した。この洗浄操作を３回繰り返した。得られた沈殿に４００ｍＬの４００ｍＭ塩化ナトリウムを添加後、ホモジナイザーで均一にし、８０％となるようにエタノールを添加して３０分間攪拌後ろ紙でろ過した。得られた残渣に５００ｍＬの塩化ナトリウム飽和８０％エタノールを添加後、ホモジナイザーで均一にし、１リットルとなるように塩化ナトリウム飽和エタノールを添加して３０分間攪拌後ろ紙でろ過した。この洗浄操作をろ液の吸光度（波長２６０ｎｍ）が実質的に０になるまで繰り返した（通常５回）。得られた残渣を１．５リットルの２Ｍ塩化ナトリウムに溶解後、不溶物を遠心分離で除去し、２Ｍ塩化ナトリウムで平衡化した１００ｍＬのＤＥＡＥセルロファインＡ−８００のカラムを素通りさせた。素通り画分を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で２リットルに濃縮後、限外ろ過により溶媒を２ｍＭ塩化ナトリウムに置換した。この溶液を遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、２２．９ｇのモズク由来フコイダンを得た。
【００７６】
製造例６
マナマコ５ｋｇを解体し、内臓を除去し、体壁を集めた。体壁湿重量２００ｇ当り５００ｍＬのアセトンを加え、ホモジナイザーで処理後ろ過し、残渣をこれ以上着色物質がでなくなるまでアセトンで洗浄した。この残渣を吸引乾燥し、１４０ｇの乾燥物を得た。この乾燥物に０．４Ｍ塩化ナトリウム水溶液２．８リットルを加え、１００℃で１時間処理後、ろ過し、残渣を０．４Ｍ塩化ナトリウム水溶液で充分洗浄し、抽出液３．７リットルを得た。この抽出液に５％のセチルピリジニウムクロリドをこれ以上沈殿が生じなくなるまで加え、生じた沈殿を遠心分離で集めた。この沈殿を０．４Ｍ塩化ナトリウム水溶液に懸濁後再度遠心分離し、得られた沈殿に１リットルの４Ｍ塩化ナトリウム水溶液を添加し、ホモジナイザーで処理後、かくはんしながら４リットルのエタノールを添加し、１時間かくはん後、ろ過し、沈殿を得た。この沈殿に対して、８０％エタノールに懸濁後ろ過という工程を上清の吸光度（波長２６０ｎｍ）が実質的に０になるまで繰り返した。得られた沈殿を２リットルの２Ｍ塩化ナトリウム水溶液に懸濁し、不溶物を遠心分離により除去した。上清を排除分子量３万の膜を備えた限外ろ過機により限外ろ過し、完全に脱塩後、凍結乾燥し３．７ｇのナマコ由来フコイダンを得た。
【００７７】
製造例７
市販の塩蔵オキナワモズク６２５ｇを４３７５ｍＬの３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、ホモジナイザーにより８０００回転／分で５分間処理後、９５℃で１時間処理し、遠心分離して上清を得た。この上清に１０ｇの活性炭を添加後３０分間攪拌し、遠心分離して上清を得た。この上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で２リットルに濃縮後、２０ｍＭ の塩化ナトリウムで溶媒置換し、凍結乾燥して１０．９ｇのオキナワモズク由来フコイダン画分の乾燥物を得た。
【００７８】
製造例８
粉砕したヒバマタ（Fucus vesiculosus ）の乾燥物１ｋｇを、１０リットルの８０％エタノール中に懸濁し、３時間攪拌後、ろ紙によりろ過し、残渣を得た。残渣を１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）３０リットルに懸濁し９５℃で２時間処理した。処理液を３７℃まで冷却後、１００ｇの活性炭を添加し３０分間攪拌した。市販のアルギン酸リアーゼＫを３０００Ｕ添加後、１０％となるようにエタノールを添加し室温で２４時間攪拌した。得られた処理液を遠心分離し、その上清を排除分子量１０万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で２リットルに濃縮後、生じた沈殿を遠心分離して除去した。この上清に１００ｍＭ 塩化ナトリウムを加えながら限外ろ過し、色素を除去した。得られた非ろ過液を５℃に冷却後０．５Ｎの塩酸を添加してｐＨを２とした後３０分間攪拌し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清のｐＨを０．５Ｎの水酸化ナトリウムにより８とし、限外ろ過により溶媒を２０ｍＭの塩化ナトリウムに置換した。溶液のｐＨを８に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、７１ｇのヒバマタ由来フコイダンを得た。
【００７９】
実施例１
正常ヒト皮膚繊維芽細胞であるＨｓ６８（新生児包皮線維芽細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６３５）を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、バイオウィッタカー社製）、２ｍＭグルタミン、１ｇ／Ｌグルコースを含むＤＭＥＭ培地（バイオウィッタカー社製）にて、５％ＣＯ２存在下、３７℃でコンフルエントになるまで培養し、Ｒｅａｇｅｎｔ ＰａｃｋＴＭ（トリプシン−ＥＤＴＡセート、バイオウィッタカー社製）を用いて細胞を５×１０４個／ｍＬとなるように上記培地に懸濁し、４８穴マイクロタイタ−プレ−トの各ウェルに５００μＬずつ分注した。培養開始から３〜４日後、単層ヒト皮膚繊維芽細胞がサブ−コンフルエントになった時点で培地を捨て、被検物質として各種フコイダン画分（製造例１−（５）記載の高分子画分および低分子画分）を、又はコントロールとして同量の生理食塩水を各々添加した１．５％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地を添加し、４８時間培養後、培養上清中のｔｙｐｅＩ ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ量およびＴＧＦ−β１量をそれぞれＰｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ［ＰＩＰ］ＥＩＡ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）およびＴＧＦ−β１ＥｍａｘＴＭ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ 社製）により定量を行い、各サンプルのｔｙｐｅＩ ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ産生増強作用およびＴＧＦ−β１産生増強作用について調べた。これらの結果を表１、２に示す。各被検試料の培地中の濃度は表１および２に各々示す。表中は対照のｔｙｐｅＩ ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ量およびＴＧＦ−β１量をそれぞれ１００％として百分率により増強率（％）として表した。
【００８０】
【表１】

Figure 0004390175
【００８１】
【表２】
Figure 0004390175
【００８２】
表１と２に示すように、正常ヒト皮膚繊維芽細胞であるＨｓ６８において、フコイダン高分子画分によるtypeI pro-collagen産生増強作用およびＴＧＦ−β１産生増強作用が確認された。また低分子画分にはこれらの作用は認められなかった。
また、Premix WST-1 Cell proliferation Assay System, MK400（タカラバイオ社製）を用いてＭＴＴアッセイを行い、本実施例で使用した各種フコイダン画分のＨｓ６８への影響を調べたところ、Ｈｓ６８への毒性は認められなかった。
【００８３】
参考例１
雌性ＨＯＳ：ＨＲ−１ヘアレスマウスを日本ＳＬＥ社から購入し、予備飼育の後５週齢より実験に用い、低用量（紅斑にならない投与量）紫外線（ＵＶＢ，２９０〜３２０ｎｍ）の背部皮膚への照射によりしわ形成を誘導し、マウス皮膚しわ形成モデルを作製した。すなわち、最初１週目にはＵＶＢ照射量を５回／週、６５ｍＪ／ｃｍ２とし、これから１週間ごとにＵＶＢ照射量を１０ｍＪ／ｃｍ２ずつ増加させ、４週目から１２週目までのＵＶＢ照射量を９５ｍＪ／ｃｍ２とした。対照群はＵＶＢ照射されなかった同週齢正常マウスを用いた。１２週間ＵＶＢを照射したマウスの皮膚に形成されたしわを、Ｂｉｓｅｔｔ法（ＢｉｓｅｔｔＤＬ， ｅｔ ａｌ．： Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ ＆ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ， ４６： ３６７， １９８７）によってしわ形成の変化を数値化して判断した。すなわち、しわの評価は、０：正常皮膚、１：小しわ、２：中しわ、３：大しわとした。また、皮膚弾性をキュートメーターＳＥＭ５７５（インテグラル社製）を用いて測定した。これらの結果を表３、４に示す。表４については、正常対照群の皮膚弾性を１００％として百分率により表した。また、表３および表４中の数値は、１０例の平均値±標準誤差を表す。
上記の実験系において、ＵＶＢ照射２週目には、対照群と比べＵＶＢ照射群マウスの皮膚は本来正常皮膚にあるつやつや感が消失し、かさかさとなった。ＵＶＢ照射４週目になると、小しわが観察され、８週目になると中しわが観察され、１１週目以後には大しわが確認された。また、皮膚弾性についてはＵＶＢ照射群では明らかに低下していた。
【００８４】
【表３】
Figure 0004390175
【００８５】
【表４】
Figure 0004390175
【００８６】
実施例２
雌性ＨＯＳ：ＨＲ−１ヘアレスマウスを日本ＳＬＣ社から購入し、予備飼育の後５週齢より実験に用いた。マウス皮膚しわ形成モデルの作製過程及びその条件は参考例１で記述した実験法と同様にした。製造例１−（５）で調製した高分子画分、低分子画分または溶媒をＵＶＢ照射しわ誘導期において、あらかじめ１週目からマウス背部に１匹あたり２５０μｌずつ塗布した。塗布は１日１回とし、５回／週、１２週間連続で行った。溶媒塗布群には１ｍＭ 塩化カリウムを含む１０％エタノールを塗布した。また、１週目から１２週目までなにも塗布しない群も設けた。１２週目において形成されたしわの評価、皮膚弾性の測定を参考例１と同様の方法で行った。さらに１３週目以降はＵＶＢ照射は行わず、製造例１−（５）で調製した高分子画分、低分子画分または溶媒をさらに１２週間連日塗布する群、１２週目まではなにも塗布せず１３週目以降のみ製造例１−（５）で調製した高分子画分、低分子画分または溶媒を塗布する群を設け、２４週目において形成されたしわの評価、皮膚弾性、皮膚厚さ、皮膚コラーゲン量の測定を行った。しわの評価及び皮膚弾性の測定については参考例１と同様の方法を用いた。皮膚厚さについては、被験部位の皮膚を採取し、組織標本を作製した後、ヘマトキシリン・エオジンで染色した後、測定した。また、皮膚コラーゲン量は皮膚を採取し、Ｓｉｒｃｏｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社製）を用いて、全タンパク質１ｍｇ中のコラーゲン含量を測定した。これらの結果を表５〜８に示す。表中の数値は、１０例の平均値±標準誤差を表す。表６〜８については、正常対照群を１００％として百分率により表す。
【００８７】
【表５】
Figure 0004390175
【００８８】
【表６】
Figure 0004390175
【００８９】
【表７】
Figure 0004390175
【００９０】
【表８】
Figure 0004390175
【００９１】
１週目から２４週目まで高分子画分を塗布した群では、低分子画分、溶媒塗布群及びＵＶＢ照射群と比較して有意にしわの形成を予防し、皮膚の弾性の低下についても予防した。また、ＵＶＢによる皮膚の厚さの増大を予防した。また、ＵＶＢによる皮膚コラーゲン量減少を抑制した。また、１３週目から２４週目まで高分子画分を塗布した群では、低分子画分、溶媒塗布群及びＵＶＢ照射群と比較して有意に形成されたしわが改善され、皮膚の弾性も改善された。また、ＵＶＢによる皮膚の厚さの増大も改善され、またＵＶＢによる皮膚コラーゲン量の低下も改善された。
【００９２】
【発明の効果】
本発明により、フコイダン高分子画分を有効成分とするβ型トランスフォーミング増殖因子産生増強を必要とする疾患の治療剤又は予防剤、しわ改善剤又は予防剤、皮膚の弾性向上剤又は維持剤、皮膚肥厚改善剤又は予防剤、又はコラーゲン産生増強剤又は減少抑制剤が提供される。該医薬は、β型トランスフォーミング増殖因子産生増強作用、しわ改善作用又は予防作用、皮膚の弾性向上作用又は維持作用、皮膚肥厚改善作用又は予防作用、又はコラーゲン産生増強作用又は減少抑制作用を有し、β型トランスフォーミング増殖因子産生増強を必要とする疾患の治療または予防、しわ形成の改善または予防、皮膚の弾性の向上または弾性の維持、皮膚肥厚の増大の改善又は予防、皮膚のコラーゲンの産生の増強又は減少を抑制するのに極めて有用である。更に、本発明により、β型トランスフォーミング増殖因子産生増強作用、しわ改善作用又は予防作用、皮膚の弾性向上作用又は維持作用、皮膚肥厚改善作用又は予防作用、又はコラーゲン産生増強作用又は減少抑制作用を有するフコイダン高分子画分を用いて、β型トランスフォーミング増殖因子産生増強用化粧料、しわ改善用又は予防用化粧料、皮膚の弾性向上用又は維持用化粧料、皮膚肥厚改善用又は予防用化粧料、又はコラーゲン産生増強用又は減少抑制用化粧料が提供される。
【００９３】
【図面の簡単な説明】
【図１】ガゴメ由来フコイダンのＤＥＡＥ−セルロファインＡ−８００カラム溶出パターンを示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention particularly relates to the use of physiologically active substances derived from aquatic organisms as pharmaceuticals or cosmetics.
[0002]
[Prior art]
Fucoidan is known as a bioactive substance derived from aquatic organisms. Fucoidan is a sulfated fucose-containing polysaccharide contained in algae, echinoderms, etc., and contains sulfated fucose as a constituent sugar.
[0003]
As the physiological action of fucoidan, cancer growth inhibitory activity, cancer metastasis inhibitory activity, anticoagulant activity, antiviral activity and the like are known, and application development as pharmaceuticals and the like is expected.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention relates to the use of fucoidan and to provide a medicine or cosmetic using a more preferable fucoidan fraction.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
Briefly describing the present invention, the first invention of the present invention comprises a fucoidan polymer fraction as an active ingredient, which is characterized in that it is a therapeutic or preventive agent for diseases requiring enhanced β-type transforming growth factor production. The present invention relates to a medicament used as any of an agent, an agent for improving or preventing wrinkles, an agent for improving or maintaining skin elasticity, an agent for improving or preventing skin thickening, or an agent for enhancing or reducing collagen production.
[0006]
The second invention of the present invention contains a fucoidan polymer fraction as an active ingredient, for enhancing β-type transforming growth factor production, for improving or preventing wrinkles, for improving or maintaining skin elasticity The present invention relates to a cosmetic used for any one of the followings: skin thickening amelioration or prevention, collagen production enhancement or decrease suppression.
[0007]
In the first and second inventions of the present invention, the fucoidan polymer fraction is exemplified by algae-derived fucoidan polymer fraction, and the algae is exemplified by brown algae. The fucoidan polymer fraction is exemplified by a fucoidan polymer fraction in which a fraction having a molecular weight of less than 100,000 is excluded from a fucoidan-containing fraction.
In the second aspect of the present invention, examples of cosmetics include lotions, emulsions, creams, packs, bath preparations, facial cleansers, bath soaps, bath detergents and ointments.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The medicament and cosmetic of the present invention are characterized by containing a fucoidan polymer fraction as an active ingredient. The expression of the desired effect of the present invention is caused by the β-type transforming growth factor (TGF-β) production enhancing action, wrinkle improving action or preventing action, skin elasticity exhibited by the active ingredient found by the present inventors. It is based on improving or maintaining action, skin thickening improving or preventing action, and / or collagen production enhancing action or decreasing inhibitory action (hereinafter, the action of these active ingredients may be simply referred to as “physiological action”) .
[0009]
In the present specification, “enhancement” means that the target substance is obtained by acting the active ingredient of the present invention together with an embodiment in which the amount of the target substance is increased after the action compared to before the action of the active ingredient of the present invention. Including the mode (induction) of causing
[0010]
The present inventors previously improved β-type transforming growth factor production of fucoidan, wrinkle improving or preventing action, skin elasticity improving or maintaining action, skin thickening improving or preventing action, and collagen production enhancing action or reduction. An inhibitory action has been found (WO 02/06351 pamphlet). However, the optimal fucoidan-containing fraction for these physiological actions is not known.
[0011]
In the present invention, fucoidan is a sulfated fucose-containing polysaccharide containing sulfated fucose as a constituent, and the fucoidan polymer fraction is not particularly limited as long as it has the physiological action. Suitable materials for the fucoidan polymer fraction include algae such as gagome, macombu, trollocomb, wakame, kurome, arame, kajime, giant kelp, lessonia nigressen, mozuku, okinawa mozuku, ascofilum nodotsum, echlonia maxima, Illustrative examples include the seaweeds belonging to brown algae such as Durvillaea and other brown algae such as Durvillaea, and echinoderms such as sea cucumbers, sea urchins and starfish. Among them, seaweeds of the order of the order include a large amount of high-molecular fucoidan having an excellent TGF-β production enhancing action and are suitable as a raw material. Therefore, the fucoidan polymer fraction used as an active ingredient in the present invention is preferably derived from algae, and more preferably derived from brown algae. Further, a fucoidan polymer fraction derived from echinoderms such as sea cucumber, sea urchin, starfish and the like may be used.
[0012]
In the present invention, the fucoidan polymer fraction means a fraction containing a high molecular fucoidan obtained by fractionating the high molecular fraction from the fucoidan-containing fraction. The fucoidan fraction from which fucoidan having a molecular weight of less than 100,000 is preferably excluded, more preferably a fucoidan polymer fraction from which fucoidan having a molecular weight of less than 50,000 is excluded, and more preferably fucoidan having a molecular weight of less than 100,000 is excluded. Examples are molecular fractions.
[0013]
In the present specification, the fucoidan polymer fraction is not particularly limited as long as it is a fucoidan fraction from which a low molecular fraction is excluded. For example, crude fucoidan or purified F-, U- or G- It can be obtained by fractionating the polymer fraction from fucoidan. The fractionation method is not particularly limited, and for example, fractionation can be performed by a gel filtration method, a fractionation method using a molecular weight fractionation membrane, or the like.
[0014]
For example, fucoidan can be prepared from gagome and glucuronic acid-containing fucoidan (hereinafter referred to as U-fucoidan) and glucuronic acid-free fucoidan (hereinafter referred to as F-fucoidan) can be separated from the fucoidan. Further, sulfated fucogalactan (hereinafter referred to as G-fucoidan) can be prepared from gagome. The polymer fraction can be separated from these purified fucoidans and used in the present invention.
[0015]
U-fucoidan and F-fucoidan are separated using, for example, an anion exchange resin and a surfactant after preparing fucoidan from gagome. The abundance ratio of gagome-derived U-fucoidan and F-fucoidan is about 1: 2, U-fucoidan contains fucose, mannose, galactose, glucuronic acid, etc., and the sulfuric acid content is about 20%, and F-fucoidan contains fucose and galactose. Including the sulfuric acid content is about 50%.
[0016]
For example, U-fucoidan and F-fucoidan can be separated by applying a fucoidan solution prepared from Gagome to a DEAE-Cellulofine A-800 column and then eluting with a NaCl-containing buffer using a concentration gradient method. An example is shown in FIG. That is, FIG. 1 is a diagram showing the separation of U-fucoidan and F-fucoidan, where the front peak is U-fucoidan and the back peak is F-fucoidan.
[0017]
In addition, Gagome-derived fucoidan was converted to Alteromonas sp. SN-1009 (FERM BP-5747) produces F-fucoidan-specific degrading enzyme and Flavobacterium sp. The G-fucoidan can be prepared by degrading with a U-fucoidan-specific degrading enzyme produced by SA-0082 (FERM BP-5402) and eliminating the resulting degradation product.
[0018]
The fucoidan polymer fraction of the present invention can be industrially prepared using an ultrafiltration membrane, for example, molecular weight fractionation using an ultrafilter equipped with a holofiber having an excluded molecular weight of 100,000. Thus, a fucoidan polymer fraction can be prepared.
[0019]
In addition, the fucoidan polymer fraction used in the present invention can be used as an active ingredient of the present invention as long as it is a high molecular fucoidan-containing product from which a low molecular fraction is excluded without performing a fractionation operation. You can also
[0020]
In the present invention, fucoidan also includes fucoidan salts. Examples of fucoidan salts include salts with alkali metal salts, alkaline earth metal salts, organic bases, and the like. For example, a salt with sodium, potassium, calcium, magnesium, ammonium, diethanolamine, ethylenediamine or the like can be mentioned. These salts can be obtained, for example, by converting a sulfate group or a carboxyl group present in fucoidan or the like into a salt by a known method. Such a salt is preferably a pharmacologically acceptable salt.
Further, as described in Production Example 2- (2) described later, a highly sulfated product obtained by further adding a sulfate group to fucoidan can be used as the fucoidan of the present invention.
That is, the polymer fraction of fucoidan can be fractionated from these fucoidan salts and fucoidan highly sulfated and used as the active ingredient of the present invention.
[0021]
In addition, the expression of the physiological action of the active ingredient of the present invention can be evaluated by the method described in Examples described later. For example, for the TGF-β production enhancing action and the collagen production enhancing action, the method described in Example 1 is used to improve or prevent wrinkles, improve or maintain the elasticity of skin, improve or prevent skin thickening, and collagen. The reduction inhibiting action can be evaluated by the method described in Example 2. The production amount of type I collagen in cells is reflected in the production amount of type I pro-collagen, which is a precursor thereof. That is, by examining the production amount of type I procollagen, it is possible to know the change in the production amount of type I collagen.
[0022]
The medicament according to the first aspect of the present invention comprises the above-mentioned active ingredient in the present invention, and is a therapeutic or preventive agent, a wrinkle improving agent or a preventive agent for a disease requiring enhancement of TGF-β production. It is provided as an agent for improving or maintaining skin elasticity, an agent for improving or preventing skin thickening, or a collagen production enhancer or decrease inhibitor.
[0023]
The transforming growth factor (TGF) has α type (TGF-α) and β type (TGF-β). In particular, TGF-β has various physiological activities such as suppression of cell proliferation, promotion of cell differentiation, suppression of immune function, enhancement of chemotaxis of fibroblasts, and is considered to be related to healing of various diseases. For example, diabetic retinopathy, initial lesion of atherosclerosis, fracture, myocardial infarction, myocardial infarction after ischemia reperfusion, cerebral infarction, retinal detachment, etc. Yes. Therefore, the treatment or prevention effect of these diseases is expected by enhancing TGF-β production.
[0024]
That is, in the present invention, a disease requiring TGF-β production enhancement is a disease that can be treated or prevented by enhancing TGF-β production, such as diabetic retinopathy, atherosclerosis, Examples include fractures, myocardial infarction, myocardial infarction after ischemia reperfusion, cerebral infarction, retinal detachment, and wounds. The active ingredient of the present invention has a TGF-β production enhancing action, and the therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention comprising the active ingredient is effective for treating or preventing such diseases. Although various isoforms exist in TGF-β, the fucoidan polymer fraction used as an active ingredient in the present invention is TGF-β, particularly among TGF-β isoforms. 1 Is preferably used as TGF-β that is enhanced by the active ingredient. 1 Is exemplified. In addition, the active ingredient of the present invention has a wrinkle improving action or preventing action, a skin elasticity improving action or maintaining action, a skin thickening improving action or preventing action, and a collagen production enhancing action or decrease suppressing action. Therefore, the wrinkle improving agent or preventive agent of the present invention, the skin elasticity improving agent or maintaining agent, the skin thickening improving agent or preventing agent, or the collagen production enhancer or decrease inhibitor comprising the active ingredient is a wrinkle improving agent. Exhibits excellent effects in improvement or prevention. For example, by applying the wrinkle improving agent or preventive agent, skin elasticity improving agent or maintaining agent, skin thickening improving agent or preventive agent, or collagen production enhancer or decrease inhibitor of the present invention to the skin, exposure to sunlight, ultraviolet rays Can improve or prevent any wrinkle formation, reduced skin elasticity, increased skin thickening or collagen loss induced by external factors such as irradiation, dryness, and internal factors that occur as an aging phenomenon . In the present invention, wrinkle improvement means shortening the wrinkle length, decreasing the wrinkle depth, or eliminating wrinkles.
[0025]
Then, the manufacturing method of the pharmaceutical of this invention is demonstrated. The medicament of the present invention comprises a fucoidan polymer fraction as an active ingredient, and the active ingredient may be formulated in combination with a known pharmaceutical carrier. In general, the active ingredient according to the present invention is blended with a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier and, if desired, a solvent, a dispersant, an emulsifier, a buffer, a stabilizer, an excipient, a binder, Disintegrating agents, lubricants and the like are added to form solid preparations such as tablets, granules, powders, powders and capsules, and liquid preparations such as ordinary liquid preparations, suspensions and emulsions. Moreover, it can also be set as the dried product and external preparation which can be made into a liquid state by addition of a suitable support | carrier before use.
[0026]
The pharmaceutical carrier can be selected according to the administration form and dosage form of the pharmaceutical of the present invention. In the case of an oral preparation, for example, starch, lactose, sucrose, mannitol, carboxymethylcellulose, corn starch, inorganic salt, etc. are used. Is done. In preparation of the oral preparation, a binder, a disintegrant, a surfactant, a lubricant, a fluidity promoter, a corrigent, a colorant, a fragrance and the like can be further blended.
[0027]
On the other hand, in the case of parenteral preparations, distilled water for injection, physiological saline, aqueous dextrose solution, vegetable oil for injection, sesame oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, propylene as an effective ingredient of the present invention as a diluent according to a conventional method It can be prepared by dissolving or suspending in glycol, polyethylene glycol or the like and adding a bactericidal agent, stabilizer, tonicity agent, soothing agent or the like as desired.
[0028]
External preparations include solid, semi-solid or liquid preparations for transdermal administration. Also included are suppositories and the like. For example, emulsions such as emulsions and lotions, liquid preparations such as external tinctures, ointments such as oily ointments and hydrophilic ointments, patches for transdermal administration such as films, tapes and poultices, etc. You can also
[0029]
The medicament of the present invention can be appropriately produced by a known method in the pharmaceutical field. The content of the active ingredient of the present invention in the medicament of the present invention is such that the active ingredient can be administered using the medicament, preferably within the dosage range described below, in consideration of the administration form, administration method and the like. It is not particularly limited.
[0030]
The medicament of the present invention can be administered by an appropriate administration route according to the preparation form. There is no particular limitation on the administration method, and internal administration, external application, and injection can be used. The wrinkle improving agent or preventive agent, skin elasticity improving agent or maintaining agent, skin thickening improving agent or preventive agent, or collagen production enhancer or decrease inhibitor of the present invention is applied to the skin as the above-mentioned external preparation and administered. Is particularly suitable, whereby a desired effect, for example a wrinkle improvement or prevention effect, can be obtained. The injection can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, or the like.
[0031]
The dosage of the medicament of the present invention is appropriately set depending on the preparation form, administration method, purpose of use, and age, weight, and symptoms of the patient to whom the medicament is administered, and is not constant. In general, the dose of the active ingredient contained in the preparation is preferably 0.1 to 2000 mg / kg per day for an adult. Of course, since the dosage varies depending on various conditions, an amount smaller than the above dosage may be sufficient or may be necessary beyond the range. Administration may be carried out in a single dose or divided into several doses within a desired dose range. Moreover, the medicament of the present invention can be orally administered as it is, or can be added to any food or drink and taken on a daily basis. Further, the fucoidan polymer fraction of the present invention is used for TGF-β production enhancement, wrinkle improvement or prevention, skin elasticity improvement or maintenance, skin thickening improvement or prevention, and / or collagen production enhancement or You may use as a raw material of the food-drinks for a reduction | decrease suppression.
[0032]
In addition, the fucoidan polymer fraction used as an active ingredient in the present invention, due to its physiological action, TGF-β functional research, wrinkle formation, skin elasticity reduction, skin thickening, collagen reduction mechanism, In addition to the medicament of the present invention, various TGF-β-related disease medicaments, wrinkle improving agents or preventive agents, skin elasticity improving agents or maintaining agents, skin thickening improving agents or preventing agents, and collagen production enhancers It is also useful for screening for a decrease inhibitor.
[0033]
The cosmetic according to the second aspect of the present invention contains the above-mentioned active ingredient of the present invention, and is a cosmetic for enhancing TGF-β production, a cosmetic for wrinkle improvement or prevention, for improving or maintaining skin elasticity. It is provided as a cosmetic, a cosmetic for improving or preventing skin thickening, or a cosmetic for enhancing or suppressing decrease in collagen production. The expression of the desired effect of the cosmetic of the present invention is based on the physiological action of the active ingredient contained in the cosmetic. In addition, if TGF-β production is enhanced inside the skin, it is presumed that the tension and elasticity of the skin can be increased, and the TGF-β production enhancing action is synergistic with the wrinkle improving action or the preventive action. Considered to work. Therefore, according to the cosmetic of the present invention, for example, skin tension and elasticity can be effectively improved. That is, according to the present invention, TGF-β production enhancing action, wrinkle improving action or preventing action, skin elasticity improving action or maintaining action, skin thickening improving action or preventing action, or collagen production enhancing using the fucoidan polymer fraction as an active ingredient according to the present invention Cosmetics excellent in action or reduction-suppressing action are provided.
[0034]
The fucoidan polymer fraction used as an active ingredient is preferably derived from algae, and the algae is preferably brown algae.
The content of the active ingredient of the present invention in the cosmetic of the present invention is usually preferably 0.0001 to 20% by weight, more preferably 0.001 to 5% by weight, still more preferably 0.03 to 3% by weight. is there.
[0035]
In addition, the cosmetic of the present invention may contain other ingredients other than the active ingredient of the present invention as desired, such as humectants such as 1,3-butylene glycol and pyrrolidone carboxylate, liquid paraffin, petrolatum, olive oil, squalane, lanolin. , Emollients such as synthetic ester oils, oils and fats such as palm oil and palm oil, vitamins such as vitamin E, beeswax, surfactants such as propylene glycol monostearate and stearic acid, stearyl alcohol, etc. Agent, solubilizers such as polyoxyethylene cetyl ether and polyoxyethylene hydrogenated castor oil, preservatives such as methylparaben, pigments, antioxidants, UV absorbers, pharmacologically active substances, bases, surfactants, etc. be able to. Furthermore, you may use together what has a water holding | maintenance effect | action, such as polysaccharide represented by glycerin, propylene glycol, polyethyleneglycol, and hyaluronic acid.
[0036]
The shape of the cosmetic of the present invention is not particularly limited as long as the physiological action of the active ingredient can be expected. For example, lotions, emulsions, creams, packs, bath preparations, facial cleansers, bath use Soap, bath detergent or ointment are preferred.
[0037]
The cosmetic of the present invention can be appropriately produced according to a known method in the cosmetics field using the active ingredient of the present invention and, if desired, the above-mentioned other ingredients as raw materials. In addition, for example, cosmetics suitable for oral intake can be produced according to known methods in the food and drink field in the same manner as foods and beverages described later.
[0038]
For example, if the cosmetic containing the active ingredient of the present invention in the above content range is applied in a desired amount according to each application form, for example, lotions, for example, once applied to the entire human face, once If it is preferably used in an amount of about 0.01 to 5 g, more preferably about 0.1 to 2 g, TGF-β production enhancing effect, wrinkle improving effect or preventing effect, skin elasticity improving effect or maintaining effect, skin thickening The desired effect of the present invention can be obtained, such as an effect of improving or preventing, an effect of enhancing collagen production or an effect of suppressing decrease of collagen, imparting tension and luster to the skin, and obtaining a skin-beautifying effect.
[0039]
Moreover, when it is a cosmetic suitable for oral intake, the effective amount for oral intake of the cosmetic may be an amount that allows the active ingredient of the present invention to ingest an amount capable of exhibiting its physiological action, Although there is no particular limitation, for example, it is usually preferably 0.1 mg to 10 g, more preferably 2 mg to 5 g, and further preferably 10 mg to 2 g per day for an adult.
[0040]
The skin described in the present specification includes all parts covering the outside of a person or animal such as the face, neck, chest, back, arms, hands, legs, feet, buttocks, and scalp.
[0041]
Further, as a third aspect of the present invention, a TGF-β production enhancing method, a wrinkle improving method or preventing method, a skin elasticity improving method or maintaining method, characterized by administering a fucoidan polymer fraction to an individual, A method for improving or preventing skin thickening, or a method for enhancing collagen production or a method for suppressing decrease thereof are provided.
[0042]
The fucoidan polymer fraction used in the embodiment of the present invention is the same as the active ingredient in the present invention, and the fucoidan polymer fraction to be administered to an individual is preferably derived from algae. The algae is preferably brown algae. In the present specification, the “individual” is a mammal, particularly a human.
[0043]
In such a method, for example, the active ingredient is preferably administered as a therapeutic agent or a preventive agent of the present invention to a human who is expected or required to enhance TGF-β production. And such administration enhances the production of TGF-β. As a result, for example, a therapeutic or prophylactic effect for a disease requiring enhancement of TGF-β production can be expected. In addition, such a method is effective for the human who desires wrinkle improvement or prevention, preferably the active ingredient, preferably the wrinkle improving agent or preventive agent of the present invention, the skin elasticity improving agent or maintaining agent, the skin thickening improving agent or It can be performed by administering as a prophylactic agent, or a collagen production enhancer or decrease inhibitor, and such administration can provide a desired effect such as wrinkle improvement or prevention. The administration method, dosage and the like of the active ingredient may be in accordance with the administration method, dosage and the like of the medicament of the present invention used for administration of the active ingredient. In addition, in the aspect of this invention, the said cosmetics provided by this invention, the below-mentioned foodstuff, drink, or feed can also be used.
[0044]
Further, as another aspect of the present invention, it comprises TGF-β production enhancement, wrinkle improvement or prevention, skin elasticity improvement or maintenance, comprising, adding and / or diluting the active ingredient according to the present invention. Foods, beverages or feeds for use in the improvement, prevention of skin thickening or prevention, or enhancement or reduction of collagen production. The food, beverage or feed of the present invention is a symptom improvement or prevention of a disease requiring enhancement of TGF-β production in an individual sensitive to the active ingredient of the present invention due to the physiological action of the active ingredient, wrinkle improvement or prevention, It is extremely useful for improving or preventing skin elasticity, improving or preventing symptoms associated with skin thickening, and improving or preventing symptoms associated with collagen reduction.
[0045]
In the embodiment of the present invention, “containing” refers to an embodiment in which the active ingredient used in the present invention is contained in food, beverage or feed, and “addition” refers to a raw material for food, beverage or feed. The embodiment in which the active ingredient used in the present invention is added, and the “dilution” means the embodiment in which the active ingredient used in the present invention is diluted with a raw material for food, beverage or feed. In addition, the term “containing” in the description of the cosmetic of the present invention includes the meanings of inclusion, addition, and dilution in the aspect of the present invention.
[0046]
The method for producing the food or beverage of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include cooking, processing, and production by a generally used method for producing food or beverage. The fucoidan polymer fraction used as an active ingredient may be contained, added and / or diluted.
[0047]
The food or beverage of the present invention is not particularly limited, but for example, processed cereal products (processed flour products, processed starch products, premix processed products, noodles, macaroni, breads, bean paste, buckwheat, rice cake, rice noodles) , Harusame, packaging candy, etc.), processed fats and oils (plastic oil, tempura oil, salad oil, mayonnaise, dressing, etc.), processed soybean products (tofu, miso, natto, etc.), processed meat products (ham, bacon, press ham) , Sausages, etc.), fishery products (frozen surimi, kamaboko, chikuwa, hanpen, fried sweet potato, fish, ham, sausage, bonito, processed egg products, canned fish, canned fish, etc.), dairy products (raw milk, cream) Yogurt, butter, cheese, condensed milk, milk powder, ice cream, etc.), processed vegetables and fruits (pastes, jams, pickles, fruit drinks, vegetable drinks, Beverages), confectionery (chocolate, biscuits, confectionery breads, cakes, rice cakes, rice confectionery, etc.), alcoholic beverages (sake, Chinese sake, wine, whiskey, shochu, vodka, brandy, gin, rum, beer , Soft alcoholic beverages, fruit liquor, liqueur, etc.), beverages (green tea, black tea, oolong tea, coffee, soft drinks, lactic acid beverages, etc.), seasonings (soy sauce, sauce, vinegar, mirin, etc.), canned / bottled / bagged Food (beef rice, kettle rice, red rice, curry, other cooked foods), semi-dried or concentrated food (lever paste, other spreads, buckwheat noodle soup, concentrated soup), dried food (instant noodles, instant Curry, instant coffee, powdered juice, powdered soup, instant miso soup, cooked food, cooked beverage, cooked soup, etc.), frozen food (Sukiyaki, Chawanmushi, Unagi Kabayaki, Hamburg steak, Shumai, dumplings, various sticks, fruit cocktails, etc.), solid foods, liquid foods (soups, etc.), spices and other agricultural and forestry processed products, livestock processed products, marine processed products Etc.
[0048]
The content of the active ingredient of the present invention in the food or beverage of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected from the viewpoint of its functionality and expression of action, for example, preferably 0.0001 parts by weight or more per 100 parts by weight of food More preferably, it is 0.001-10 weight part, For example, Preferably it is 0.0001 weight part or more per 100 weight part of drinks, More preferably, it is 0.001-10 weight part.
[0049]
In addition, the present invention provides a biological feed (hereinafter sometimes referred to as the feed of the present invention) obtained by containing, adding and / or diluting the active ingredient of the present invention. As an aspect, there is provided a method for breeding an organism characterized by administering the active ingredient to the organism. Furthermore, as another aspect of the present invention, there is provided a biological breeding agent comprising the active ingredient.
[0050]
In these inventions, organisms are, for example, farm animals, pet animals, and the like, and examples of farm animals include domestic animals, laboratory animals, poultry, fish, shellfish or shellfish. Examples of the feed include a feed for maintaining and / or improving physical condition. Examples of biological breeding agents include soaking agents, feed additives, and beverage additives.
[0051]
According to these inventions, the same effects as those of the medicament of the present invention can be expected based on the physiological action of the active ingredient in the present invention in the living organisms to which they are applied. For example, in addition to wrinkle improving effect or preventing effect, skin elasticity improving effect or maintaining effect, skin thickening improving effect or preventing effect, collagen production enhancing effect or reduction inhibiting effect, diseases requiring TGF-β production enhancing, It is possible to obtain the effect of treating or preventing diabetic retinopathy, atherosclerosis, fracture, myocardial infarction, myocardial infarction after cerebral infarction, cerebral infarction, retinal detachment, or promoting wound healing.
[0052]
In the feed of the present invention, the active ingredient used in the present invention is usually administered at a body weight of 1 kg of the target organism and 0.01 to 2000 mg per day. For example, the administration is performed using a feed prepared by adding and mixing the active ingredient into the raw material of the artificially mixed feed, or after mixing with the powdered raw material of the artificially mixed feed, the active ingredient is further added and mixed with the other raw materials. Can be performed using the prepared feed. The content of the active ingredient of the present invention in the feed for the target organism is not particularly limited and may be set according to the purpose, but a ratio of 0.001 to 15% by weight is preferable.
[0053]
Artificial blended feeds include animal raw materials such as fish meal, casein and squid meal, vegetable raw materials such as soybean meal, wheat flour and starch, microbial raw materials such as feed yeast, animal fats such as cod liver oil and squid liver oil, soybean oil And artificial feeds made from vegetable oils such as rapeseed oil, vitamins, minerals, amino acids, antioxidants and the like. Moreover, fish feeds such as fish mince are listed.
[0054]
The method for producing the feed of the present invention is not particularly limited, and can be produced according to a general feed, and the effective amount of the active ingredient of the present invention is contained, added and / or diluted in the produced feed. Just do it.
[0055]
Moreover, the active ingredient of this invention can also be administered by adding directly to the water, seawater, etc. of a pool, a water tank, a holding tank or a breeding area, and immersing a target organism. This dipping method is particularly effective when the feed intake of the target organism is reduced. The concentration of the active ingredient used in the present invention in water or seawater is not particularly limited and may be appropriately set depending on the purpose, but a ratio of 0.00001 to 1% by weight is preferable.
[0056]
Moreover, you may make a target organism ingest the drink containing the active ingredient of this invention as a drink for breeding. The concentration of the active ingredient of the present invention in the beverage is not particularly limited and may be appropriately set according to the purpose, but a ratio of 0.0001 to 1% by weight is preferable. What is necessary is just to prepare the biological breeding agent which contains the active ingredient of this invention, for example, an immersion agent, a feed additive, and a drink additive by a well-known method. The content of the active ingredient in the biological breeding agent is not particularly limited as long as the desired effect of the present invention can be obtained.
[0057]
There are no limitations on the organisms to which these feeds of the present invention can be applied. Examples of the farmed animals include horses, cows, pigs, sheep, goats, camels, llamas, and other livestock, mice, rats, guinea pigs, rabbits, and the like. Laboratory animals, poultry such as chickens, ducks, turkeys, ostriches, red sea bream, sea bream, flatfish, flounder, yellowtail, yellowtail, larvae, tuna, rainbow trout, ayu, salmon and trout, trough puffers, eels, loach, catfish Crustaceans such as prawns, black tigers, tiger shrimp, crab, and shellfish such as abalone, turban shell, scallops, oysters, etc. Examples of the pet animals include dogs, cats, etc., and can be widely applied to land and underwater animals.
[0058]
The method for breeding organisms provided by the present invention wherein the active ingredient of the present invention is administered to an organism is, for example, the feed and / or biological breeding agent of the present invention, and the desired effects of the present invention are thereby obtained. It can be performed by administering to the organism to be administered, as can be done.
[0059]
Maintaining the physical condition of livestock, laboratory animals, poultry, fish, shellfish, shellfish, pet animals, etc. by ingesting the feed of the present invention or immersing the target organism in the liquid containing the active ingredient of the present invention Can be improved.
[0060]
The food, beverage or feed of the present invention contains, adds and / or dilutes the fucoidan polymer fraction used as an active ingredient in the present invention, and contains an effective amount for expressing its physiological action. If it is, the shape is not particularly limited, and forms such as tablets, granules, capsules and the like that can be taken orally are also included. In addition, the active ingredient concerning this invention is very useful as a manufacturing material of a foodstuff, a drink, or a feed as a health food material which has the said physiological effect and a dietary fiber function.
[0061]
Furthermore, as another aspect of the present invention, a drug is produced that performs any of TGF-β production enhancement, wrinkle improvement or prevention, skin elasticity improvement or maintenance, skin thickening improvement or prevention, and collagen production enhancement or reduction suppression. To provide the use of fucoidan polymer fractions.
[0062]
The fucoidan polymer fraction used as an active ingredient in the present invention does not cause death even when a single oral dose of 1 g / kg body weight is orally administered to rats. In addition, no side effects are observed.
[0063]
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated further more concretely, this invention is not limited to these description at all. In the examples, “%” means “% by weight” unless otherwise specified.
[0064]
Production Example 1
(1) After fully drying the gagome, 20 kg of the dried product was pulverized by a free pulverizer (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.).
In 900 liters of tap water, 7.3 kg of calcium chloride dihydrate (manufactured by Nippon Soda Co., Ltd.) was dissolved, and then 20 kg of gagome ground product was mixed. The water temperature was raised by steam blowing for 40 minutes from the liquid temperature of 12 ° C. to 90 ° C., then kept at 90 to 95 ° C. under stirring for 1 hour, and then cooled to obtain 1100 liters of a cooled product. Next, using a solid-liquid separation device (CNA type manufactured by Westphalia Separator Co., Ltd.), the cooled product was subjected to solid-liquid separation to prepare about 900 liters of solid-liquid separation supernatant.
360 liters of the solid-liquid separation supernatant was concentrated to 20 liters using FE10-FC-FUS0382 (fraction molecular weight 30,000) manufactured by Daicel. Next, the operation of adding 20 liters of tap water and concentrating to 20 liters was performed 5 times to perform desalting treatment, thereby preparing 25 liters of gagome-derived extract.
One liter of the solution was freeze-dried to obtain 13 g of dried gagome-derived fucoidan.
[0065]
(2) 7 g of dried fucoidan described in Production Example 1- (1) was dissolved in 700 mL of 20 mM imidazole buffer (pH 8) containing 50 mM sodium chloride and 10% ethanol, and insoluble matters were removed by centrifugation. A DEAE-Cellulofine A-800 column (φ11.4 cm × 48 cm) (manufactured by Seikagaku Corporation) was equilibrated with the same buffer solution, and the centrifugation supernatant was applied, washed with the same buffer solution, and 50 mM to 1.95 M. Was eluted with a sodium chloride concentration gradient (1 fraction: 250 mL). The total amount of sugar and uronic acid content were determined by the phenol sulfate method and the carbazole sulfate method, respectively, and fractions 43 to 49, fractions 50 to 55, and fractions 56 to 67 were obtained in the order of elution. Next, these fractions were desalted by electrodialysis and then freeze-dried. From fractions 43 to 49, fraction I (340 mg), from fractions 50 to 55, II fraction (870 mg), and from fractions 56 to 67, fraction III (2.64 g) were prepared respectively.
FIG. 1 shows a DEAE-Culorofine A-800 column elution pattern of gagome-derived fucoidan. In FIG. 1, the vertical axis indicates the absorbance at 530 nm by the carbazole sulfate method (black circle in the figure), the absorbance at 480 nm by the phenol sulfuric acid method (white circle in the figure), and conductivity (mS / cm: white square in the figure), horizontal The axis indicates the fraction number. In the figure, the front peak is U-fucoidan and the rear peak is F-fucoidan.
[0066]
(3) A sulfated fucose-containing polysaccharide fraction was prepared from Gagome. That is, 2 kg of commercially available dried gagome was crushed with a cutter mill (manufactured by Masuko Sangyo Co., Ltd.) equipped with a screen with a hole diameter of 1 mm, suspended in 20 liters of 80% ethanol, stirred at 25 ° C. for 3 hours, and filtered with paper. Filtered. The resulting residue was suspended in 40 liters of 30 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5) containing 100 mM sodium chloride, treated at 95 ° C. for 2 hours, and then filtered through a stainless steel sieve having a hole diameter of 106 μm. To this filtrate, 200 g of activated carbon, 4.5 liters of ethanol, and 12,000 U of alginate lyase K (manufactured by Nagase Seikagaku Corporation) were added, stirred at 25 ° C. for 20 hours, and then centrifuged. The obtained supernatant was concentrated to 4 liters with an ultrafilter equipped with a holofiber having an exclusion molecular weight of 100,000, insoluble matters were removed by centrifugation, and the mixture was allowed to stand at 5 ° C. for 24 hours. The resulting precipitate was removed by centrifugation, and the obtained supernatant was subjected to solvent exchange with 100 mM sodium chloride using an ultrafilter. The solution was cooled to 4 ° C. or lower, adjusted to pH 2 with hydrochloric acid, and the resulting precipitate was removed by centrifugation. The pH of the obtained supernatant was adjusted to 8 with sodium hydroxide, concentrated to 4 liters, and the solvent was exchanged with 20 mM sodium chloride using an ultrafilter. Insoluble matter in this solution was removed by centrifugation and then lyophilized to obtain 76 g of dried gagome-derived fucoidan. In addition, Macombu-derived fucoidan, Lessonia nigrescen-derived fucoidan, Echronia maxima-derived fucoidan, and Daviglia-derived fucoidan were prepared in the same manner as described above.
[0067]
(4) Shred 500 g of dried gagome, wash with 10 liters of 80% ethanol, stir in 10% ethanol containing 50 liters of 1 mM potassium chloride for 3 days at 25 ° C., and have a mesh diameter of 32 μm. About 45 liters of filtrate containing F-fucoidan was obtained by filtration through a stainless steel wire mesh.
[0068]
(5) 2 liters of the F-fucoidan-containing filtrate obtained by the method of Example 1- (4) was concentrated to 200 ml by an ultrafilter equipped with a holofiber having an excluded molecular weight of 100,000. The obtained filtrate was used as a low molecular fraction. On the other hand, 2 liters of 10% ethanol containing 1 mM potassium chloride was added to the concentrated solution, and concentrated again to 200 ml. The concentrated solution was taken out from the ultrafilter and 10% ethanol containing 1 mM potassium chloride was added to make 2 liters to obtain a polymer fraction.
[0069]
(6) 500 g of dried gagome is shredded, washed with 10 liters of 80% ethanol, stirred in 10% ethanol containing 50 liters of 1 mM potassium chloride at 25 ° C. for 3 days, and the mesh diameter is 32 μm. Filtration through a stainless steel wire mesh gave about 45 liters of filtrate. 34 liters of this filtrate was heated at 80 ° C. for 3 hours and then cooled to 50 ° C. This was concentrated while keeping the liquid temperature at 50 ° C. with an ultrafiltration OMEGA cassette (manufactured by Filtron) having an excluded molecular weight of 10,000. Further, desalting was performed with 5 liters of distilled water heated to 50 ° C., 200 mL of the distilled water was added, and the flow path was washed twice and recovered to obtain 1.5 liters of concentrated liquid. This was freeze-dried to obtain 8.2 g of F-rich fucoidan. In addition, F-rich fucoidan means fucoidan containing sulfated fucose as a main component of constituent sugar.
[0070]
Production Example 2
(1) Alteromonas sp. SN-1009 (FERM BP-5747) was mixed with 600 mL of a medium consisting of artificial seawater (jamalin laboratory) pH 8.2 supplemented with 0.25% glucose, 1.0% peptone and 0.05% yeast extract. Poured and sterilized (120 ° C., 20 minutes) inoculated into a 2 liter Erlenmeyer flask and cultured at 25 ° C. for 26 hours to form a seed culture solution. Peptone 1.0%, yeast extract 0.02%, sulfated polysaccharide 0.2% described in the following Production Example 2- (2), and antifoaming agent (KM70 manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) 0.01% added 20 liters of the medium consisting of artificial seawater pH 8 was placed in a 30 liter jar fermenter and sterilized at 120 ° C. for 20 minutes. After cooling, 600 mL of the above seed culture solution was inoculated and cultured at 24 ° C. for 24 hours under conditions of an aeration rate of 10 liters per minute and a stirring rate of 250 revolutions per minute. After completion of the culture, the culture solution was centrifuged to obtain bacterial cells and culture supernatant. The culture supernatant was concentrated by an ultrafilter equipped with a holofiber with a molecular weight exclusion of 10,000 and then salted out with 85% saturated ammonium sulfate. The resulting precipitate was collected by centrifugation, and 1/10 concentration of artificial seawater was collected. The resulting 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.2) was sufficiently dialyzed to prepare 600 mL of an endo-type sulfated polysaccharide degrading enzyme (F-fucoidan-specific degrading enzyme) solution that selectively acts on the sulfated polysaccharide.
[0071]
(2) 98 mg of F-fucoidan prepared by the method described in Production Example 1- (2) was dissolved in 5 mL of DMSO, 980 mg of piperidine sulfate was added at room temperature, and the mixture was stirred at 80 ° C. for 2 hours. The reaction solution was cooled and dialyzed with a dialysis membrane having an excluded molecular weight of 1000 for 2 days. The obtained dialysis internal solution was added to a cation exchange column [Amberlite IRA-120 (Na + )] (Manufactured by Organo Co., Ltd.), followed by drying under reduced pressure to prepare 98 mg of highly sulfated F-fucoidan.
[0072]
Production Example 3
(1) 2 kg of dried gagome was crushed by a cutter mill (manufactured by Masuko Sangyo Co., Ltd.) equipped with a screen having a hole diameter of 1 mm, stirred in 20 liters of 80% ethanol at 25 ° C. for 3 hours, filtered and washed. The obtained residue was mixed with 50 mM calcium chloride, 100 mM sodium chloride, 10% ethanol, and Alteromonas sp. Prepared in Production Example 2- (1). The suspension was suspended in 20 liters of 30 mM imidazole buffer (pH 8.2) containing 1 U of SN-1009-derived F-fucoidan-specific degrading enzyme, stirred at 25 ° C. for 2 days, filtered through a stainless wire mesh with a hole diameter of 32 μm, and washed. . The obtained residue was suspended in 40 liters of sodium phosphate buffer (pH 6.6) containing 100 mM sodium chloride, 10% ethanol, and 4 g of alginate lyase (manufactured by Nagase Seikagaku Corporation) and stirred at 25 ° C. for 4 days. Thereafter, centrifugation was performed to obtain a supernatant. In order to remove the low molecular weight product of alginic acid contained in the supernatant, the solution was concentrated to 2 liters using an ultrafilter equipped with a holofiber having an excluded molecular weight of 100,000, and the solvent was exchanged with 100 mM sodium chloride containing 10% ethanol. To this solution, an equal amount of 400 mM calcium acetate was added and stirred, followed by centrifugation. The resulting supernatant was adjusted to pH 2 with 1N hydrochloric acid while cooling with ice. The resulting precipitate was removed by centrifugation, and the resulting supernatant was adjusted to pH 8 with 1N sodium hydroxide. This solution was concentrated to 1 liter by ultrafiltration, and the solvent was exchanged with 100 mM sodium chloride. The precipitate formed at this time was removed by centrifugation. In order to remove the hydrophobic substance in the obtained supernatant, sodium chloride was added to the supernatant to 1 M, and it was applied to a 3 liter phenyl cellulose fine column (manufactured by Seikagaku Corporation) equilibrated with 1 M sodium chloride. , Collected the passing fractions. This fraction was concentrated with an ultrafilter, and then the solvent was exchanged with 20 mM sodium chloride and lyophilized. The weight of the lyophilized product was 29.3 g.
[0073]
(2) 15 g of the lyophilized product was added to 400 mM sodium chloride, Flavobacterium sp. Described in WO 97/26896 pamphlet. Endo-sulfated polysaccharide-degrading enzyme (U-fucoidan-specific degrading enzyme) obtained by culturing SA-0082 (FERM BP-5402) was dissolved in 1.5 L of 50 mM Tris-HCl buffer containing 9 U. After reacting at 25 ° C. for 6 days, the mixture was concentrated to about 300 mL with an evaporator. The concentrated solution is thoroughly dialyzed into a dialysis tube having an exclusion molecular weight of 3500, and the liquid remaining in the dialysis tube is applied to a 4 liter DEAE-Cellulofine A-800 column equilibrated with 50 mM sodium chloride, and 50 mM sodium chloride is applied. The column adsorbate was eluted with a concentration gradient of 50 to 650 mM sodium chloride. Further, the column adsorbate was sufficiently eluted with 650 mM sodium chloride. Among the eluted fractions, the fraction eluted with 650 mM sodium chloride was collected as a sulfated fucogalactan (G-fucoidan) fraction, concentrated with an ultrafilter having an excluded molecular weight of 100,000, and the solution was replaced with 10 mM sodium chloride and frozen. By drying, 0.85 g of a freeze-dried sulfated fucogalactan was obtained. The obtained sulfated fucogalactan contained galactose and fucose as constituent sugars, and the molar ratio was about 2: 1.
[0074]
Production Example 4
1 kg of dried wakame mekabu on the market was crushed with a cutter mill equipped with a screen with a hole diameter of 1 mm, suspended in 10 liters of 80% ethanol, stirred for 3 hours, and filtered with filter paper to obtain a residue. It was. The residue was suspended in 20 liters of 40 mM phosphate buffer (pH 6.5) containing 50 mM sodium chloride and treated at 95 ° C. for 2 hours. After the treatment liquid was cooled to 37 ° C., ethanol was added so as to be 10%, and 12,000 U of commercially available alginate lyase K (manufactured by Nagase Seikagaku Corporation) was added, followed by stirring at room temperature for 24 hours. The obtained treatment solution was centrifuged, and the supernatant was concentrated to 2 liters using an ultrafilter equipped with a holofiber having an excluded molecular weight of 100,000, and the resulting precipitate was removed by centrifugation. The obtained supernatant was cooled to 5 ° C., 0.5N hydrochloric acid was added to adjust the pH to 2, the mixture was stirred for 30 minutes, and the resulting precipitate was removed by centrifugation. The pH of the supernatant was adjusted to 8 with 0.5N sodium hydroxide, and the solvent was replaced with 20 mM sodium chloride by ultrafiltration. After adjusting the pH of the solution to 8, the supernatant obtained by centrifugation was lyophilized to obtain 90.5 g of Wakame Mekabu-derived fucoidan.
[0075]
Production Example 5
5 kg of commercially available salted mozuku was mixed with 20 liters of ethanol and chopped with scissors. The mixture was left overnight and filtered through back paper. The resulting residue was suspended in 12.5 liters of water and treated at 95 ° C. for 2 hours. After the treatment liquid was filtered with filter paper, 2600 mL of a 2.5% cetylpyridinium chloride solution containing 350 mM sodium chloride was added and left for 3 days. The supernatant portion was discarded, the precipitate portion was centrifuged, and the supernatant was also discarded. To the resulting precipitate, 2.5 liters of 350 mM sodium chloride was added, and then homogenized and homogenized and centrifuged. This washing operation was repeated three times. 400 mL of 400 mM sodium chloride was added to the resulting precipitate, and the mixture was homogenized with a homogenizer. Ethanol was added to 80%, and the mixture was filtered with paper after stirring for 30 minutes. 500 mL of sodium chloride saturated 80% ethanol was added to the resulting residue, and the mixture was homogenized with a homogenizer. Sodium chloride saturated ethanol was added to 1 liter, and the mixture was filtered for 30 minutes after stirring. This washing operation was repeated until the absorbance (wavelength 260 nm) of the filtrate was substantially 0 (usually 5 times). The obtained residue was dissolved in 1.5 liters of 2M sodium chloride, insoluble matters were removed by centrifugation, and a column of 100 mL DEAE Cellulofine A-800 equilibrated with 2M sodium chloride was passed through. The flow-through fraction was concentrated to 2 liters using an ultrafilter equipped with a holofiber having an excluded molecular weight of 100,000, and the solvent was replaced with 2 mM sodium chloride by ultrafiltration. The supernatant obtained by centrifuging this solution was lyophilized to obtain 22.9 g of mozuku-derived fucoidan.
[0076]
Production Example 6
5 kg of manamako was dismantled, the internal organs were removed, and the body wall was collected. 500 mL of acetone was added per 200 g of wet weight of the body wall, and after filtration with a homogenizer, the residue was washed with acetone until no more colored substances were left. This residue was suction-dried to obtain 140 g of a dried product. To this dried product was added 2.8 liter of 0.4M sodium chloride aqueous solution, treated at 100 ° C. for 1 hour, filtered, and the residue was sufficiently washed with 0.4M sodium chloride aqueous solution to obtain 3.7 liter of extract. . To this extract was added 5% cetylpyridinium chloride until no further precipitation occurred, and the resulting precipitate was collected by centrifugation. This precipitate was suspended in 0.4 M aqueous sodium chloride solution and centrifuged again. 1 liter of 4 M aqueous sodium chloride solution was added to the resulting precipitate, treated with a homogenizer, and then 4 liters of ethanol was added with stirring. After stirring for 1 hour, the mixture was filtered to obtain a precipitate. For this precipitation, the process of suspending in 80% ethanol and filtration was repeated until the absorbance (wavelength 260 nm) of the supernatant was substantially zero. The obtained precipitate was suspended in 2 liters of 2M sodium chloride aqueous solution, and insoluble matters were removed by centrifugation. The supernatant was ultrafiltered with an ultrafilter equipped with a membrane having an excluded molecular weight of 30,000, completely desalted and lyophilized to obtain 3.7 g of sea cucumber-derived fucoidan.
[0077]
Production Example 7
625 g of commercially available salted Okinawa Mozuku was suspended in 4375 mL of 30 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0), treated with a homogenizer at 8000 rpm for 5 minutes, then treated at 95 ° C. for 1 hour, centrifuged, and the supernatant Got. To this supernatant, 10 g of activated carbon was added, stirred for 30 minutes, and centrifuged to obtain a supernatant. This supernatant was concentrated to 2 liters with an ultrafilter equipped with a holofiber with an exclusion molecular weight of 100,000, then solvent-replaced with 20 mM sodium chloride, freeze-dried, and 10.9 g of Okinawa mozuku-derived fucoidan fraction. A dried product was obtained.
[0078]
Production Example 8
1 kg of ground dried Hibamata (Fucus vesiculosus) was suspended in 10 liters of 80% ethanol, stirred for 3 hours, and filtered through filter paper to obtain a residue. The residue was suspended in 30 liters of 30 mM phosphate buffer (pH 6) containing 100 mM sodium chloride and treated at 95 ° C. for 2 hours. After cooling the treatment liquid to 37 ° C., 100 g of activated carbon was added and stirred for 30 minutes. After adding 3000 U of commercially available alginate lyase K, ethanol was added so that it might become 10%, and it stirred at room temperature for 24 hours. The obtained treatment solution was centrifuged, and the supernatant was concentrated to 2 liters with an ultrafilter equipped with a holofiber having an excluded molecular weight of 100,000, and the resulting precipitate was removed by centrifugation. The supernatant was ultrafiltered while adding 100 mM sodium chloride to remove the dye. The obtained non-filtrate was cooled to 5 ° C., 0.5N hydrochloric acid was added to adjust the pH to 2, the mixture was stirred for 30 minutes, and the resulting precipitate was removed by centrifugation. The pH of the supernatant was adjusted to 8 with 0.5N sodium hydroxide, and the solvent was replaced with 20 mM sodium chloride by ultrafiltration. After adjusting the pH of the solution to 8, the supernatant obtained by centrifugation was lyophilized to obtain 71 g of Hibamata-derived fucoidan.
[0079]
Example 1
Normal human skin fibroblast Hs68 (neonatal foreskin fibroblast, ATCC CRL-1635) was added to 10% fetal calf serum (FCS, manufactured by BioWittaker), DMEM medium (BioWhittaker) containing 2 mM glutamine and 1 g / L glucose. 5% CO 2 Incubate at 37 ° C until confluent in the presence of Reagent Pack TM Using trypsin-EDTA sate (manufactured by BioWhittaker), the cells were 5 × 10 4 500 μL was suspended in each well of a 48-well microtiter plate. Three to four days after the start of the culture, when the monolayer human dermal fibroblasts became sub-confluent, the medium was discarded, and various fucoidan fractions (polymer fractions described in Production Example 1- (5) as test substances) And low molecular fraction) or 1.5% FCS-DMEM medium supplemented with the same amount of physiological saline as a control, and after culturing for 48 hours, the amount of type I pro-collagen and TGF in the culture supernatant -Β 1 Pro-collagen type C-peptide [PIP] EIA Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) and TGF-β respectively 1 Emax TM Quantification was carried out using an Immuno Assay System (Promega), and the type I pro-collagen production enhancing action and TGF-β of each sample were determined. 1 The production enhancing action was examined. These results are shown in Tables 1 and 2. The concentrations of each test sample in the medium are shown in Tables 1 and 2, respectively. The table shows the amount of control type I pro-collagen and TGF-β. 1 The amount was expressed as percentage (%) as a percentage with each amount taken as 100%.
[0080]
[Table 1]
Figure 0004390175
[0081]
[Table 2]
Figure 0004390175
[0082]
As shown in Tables 1 and 2, in Hs68, a normal human dermal fibroblast, type I pro-collagen production enhancing action and TGF-β by the fucoidan polymer fraction 1 The production enhancing action was confirmed. These effects were not observed in the low molecular fraction.
In addition, MTT assay was performed using Premix WST-1 Cell proliferation Assay System, MK400 (manufactured by Takara Bio Inc.), and the effects of various fucoidan fractions used in this example on Hs68 were examined. Toxicity to Hs68 Was not recognized.
[0083]
Reference example 1
Female HOS: HR-1 hairless mice were purchased from Japan SLE, and used for experiments from 5 weeks of age after preliminary breeding, and applied to the back skin of low dose (does not cause erythema) ultraviolet rays (UVB, 290 to 320 nm). Wrinkle formation was induced by irradiation, and a mouse skin wrinkle formation model was prepared. That is, in the first week, the UVB irradiation dose is 5 times / week, 65 mJ / cm. 2 And a UVB dose of 10 mJ / cm every week from now on 2 Increase the UVB irradiation dose from 4th week to 12th week by 95mJ / cm 2 It was. The control group used normal mice of the same week that were not irradiated with UVB. Wrinkles formed on the skin of mice irradiated with UVB for 12 weeks were judged by quantifying changes in wrinkle formation by the Bisett method (Bistett DL, et al .: Photochem & Photobiol, 46: 367, 1987). That is, the evaluation of wrinkles was 0: normal skin, 1: small wrinkles, 2: medium wrinkles, 3: large wrinkles. The skin elasticity was measured using a cut meter SEM575 (manufactured by Integral). These results are shown in Tables 3 and 4. For Table 4, the skin elasticity of the normal control group was expressed as a percentage with 100%. The numerical values in Tables 3 and 4 represent the average value ± standard error of 10 cases.
In the above experimental system, at the second week of UVB irradiation, the skin of the UVB-irradiated group mice disappeared from the normal skin and became bulky compared to the control group. Small wrinkles were observed after 4 weeks of UVB irradiation, medium wrinkles were observed after 8 weeks, and large wrinkles were confirmed after 11 weeks. Skin elasticity was clearly reduced in the UVB irradiation group.
[0084]
[Table 3]
Figure 0004390175
[0085]
[Table 4]
Figure 0004390175
[0086]
Example 2
Female HOS: HR-1 hairless mice were purchased from Japan SLC and used for experiments from 5 weeks of age after preliminary breeding. The production process and conditions of the mouse skin wrinkle formation model were the same as the experimental method described in Reference Example 1. In the UVB irradiation wrinkle induction period, 250 μl each of the polymer fraction, the low molecular fraction or the solvent prepared in Production Example 1- (5) was applied to the back of the mouse in advance from the first week. Application was performed once a day, 5 times / week for 12 consecutive weeks. The solvent application group was applied with 10% ethanol containing 1 mM potassium chloride. In addition, a group in which nothing was applied from week 1 to week 12 was also provided. Evaluation of wrinkles formed in the 12th week and measurement of skin elasticity were performed in the same manner as in Reference Example 1. Further, UVB irradiation is not performed after the 13th week, and the polymer fraction, the low molecular fraction or the solvent prepared in Production Example 1- (5) are further applied every day for 12 weeks. Without application, a group to which the polymer fraction, low molecular fraction or solvent prepared in Production Example 1- (5) was applied only after the 13th week was provided, evaluation of wrinkles formed in the 24th week, skin elasticity, The skin thickness and the amount of skin collagen were measured. For the evaluation of wrinkles and the measurement of skin elasticity, the same method as in Reference Example 1 was used. The skin thickness was measured after the skin of the test site was collected and a tissue specimen was prepared and then stained with hematoxylin and eosin. The amount of skin collagen was obtained by collecting skin and measuring the collagen content in 1 mg of total protein using Sircol Collagen Assay kit (manufactured by Biocolor). These results are shown in Tables 5-8. The numerical values in the table represent the average value ± standard error of 10 cases. For Tables 6-8, the normal control group is expressed as a percentage with 100%.
[0087]
[Table 5]
Figure 0004390175
[0088]
[Table 6]
Figure 0004390175
[0089]
[Table 7]
Figure 0004390175
[0090]
[Table 8]
Figure 0004390175
[0091]
In the group to which the high molecular fraction was applied from the first week to the 24th week, the formation of wrinkles was significantly prevented as compared with the low molecular weight fraction, the solvent application group, and the UVB irradiation group. Prevented. Moreover, the increase in the thickness of the skin by UVB was prevented. Moreover, the reduction | decrease in the amount of skin collagen by UVB was suppressed. In addition, in the group to which the high molecular fraction was applied from the 13th week to the 24th week, the wrinkles formed significantly were improved as compared with the low molecular weight fraction, the solvent application group and the UVB irradiation group, and the elasticity of the skin was also improved. Improved. Moreover, the increase in skin thickness due to UVB was also improved, and the decrease in the amount of skin collagen due to UVB was also improved.
[0092]
【The invention's effect】
According to the present invention, a therapeutic or preventive agent for diseases requiring enhancement of β-type transforming growth factor production comprising a fucoidan polymer fraction as an active ingredient, a wrinkle improving agent or a preventive agent, a skin elasticity improving agent or a maintaining agent, A skin thickening improving agent or preventive agent, or a collagen production enhancer or decrease inhibitor is provided. The pharmaceutical has β-type transforming growth factor production enhancing action, wrinkle improving action or preventing action, skin elasticity improving action or maintaining action, skin thickening improving action or preventing action, or collagen production enhancing action or decrease inhibiting action. , Treatment or prevention of diseases requiring enhanced β-type transforming growth factor production, improvement or prevention of wrinkle formation, improvement or maintenance of skin elasticity, improvement or prevention of increased skin thickening, production of skin collagen It is extremely useful in suppressing the increase or decrease in Further, according to the present invention, β-type transforming growth factor production enhancing action, wrinkle improving action or preventing action, skin elasticity improving action or maintaining action, skin thickening improving action or preventing action, or collagen production enhancing action or decrease inhibiting action Using a fucoidan polymer fraction, β-type transforming growth factor production enhancing cosmetics, wrinkle improving or preventing cosmetics, skin elasticity improving or maintaining cosmetics, skin thickening improving or preventing cosmetics Or a cosmetic for enhancing or suppressing the decrease in collagen production.
[0093]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a DEAE-Cellulofine A-800 column elution pattern of gagome-derived fucoidan.

Claims (3)

分子量１０万未満の画分が排除されたフコイダン高分子画分を有効成分として含有することを特徴とする創傷の治療剤又は予防剤として使用される医薬であって、前記のフコイダン高分子画分が下記（１）及び（２）の工程を含む方法によって得られるフコイダン高分子画分である、医薬。
（１）細断した乾燥ガゴメ、及び塩化カリウムを含有する１０％エタノールを２５℃で３日間攪拌した後、ろ過を行ってＦ−フコイダン含有ろ液を得る工程、並びに
（２）排除分子量１０万のホロファイバーによる限外ろ過によって、工程（１）で得たろ液より分子量が１０万未満のフコイダンを排除し、フコイダン高分子画分を得る工程A pharmaceutical fraction having a molecular weight of less than 100,000 is used as a therapeutic or preventive agent for wound wounds, characterized in that it contains as an active ingredient a fucoidan polymer fraction was eliminated, the fucoidan polymer A pharmaceutical wherein the fraction is a fucoidan polymer fraction obtained by a method comprising the following steps (1) and (2).
(1) A step of stirring chopped dry gagome and 10% ethanol containing potassium chloride at 25 ° C. for 3 days, followed by filtration to obtain an F-fucoidan-containing filtrate, and (2) an excluded molecular weight of 100,000 A step of eliminating fucoidan having a molecular weight of less than 100,000 from the filtrate obtained in step (1) by ultrafiltration using holofiber to obtain a fucoidan polymer fraction 分子量１０万未満の画分が排除されたフコイダン高分子画分を有効成分として含有することを特徴とする創傷治療用に使用される化粧料であって、前記のフコイダン高分子画分が下記（１）及び（２）の工程を含む方法によって得られるフコイダン高分子画分である、化粧料。
（１）細断した乾燥ガゴメ、及び塩化カリウムを含有する１０％エタノールを２５℃で３日間攪拌した後、ろ過を行ってＦ−フコイダン含有ろ液を得る工程、並びに
（２）排除分子量１０万のホロファイバーによる限外ろ過によって、工程（１）で得たろ液より分子量が１０万未満のフコイダンを排除し、フコイダン高分子画分を得る工程A cosmetic used for wound treatment, comprising a fucoidan polymer fraction from which a fraction having a molecular weight of less than 100,000 has been excluded as an active ingredient, wherein the fucoidan polymer fraction is: A cosmetic which is a fucoidan polymer fraction obtained by a method comprising the steps of 1) and (2).
(1) A step of stirring chopped dry gagome and 10% ethanol containing potassium chloride at 25 ° C. for 3 days, followed by filtration to obtain an F-fucoidan-containing filtrate, and (2) an excluded molecular weight of 100,000 A step of eliminating fucoidan having a molecular weight of less than 100,000 from the filtrate obtained in step (1) by ultrafiltration using holofiber to obtain a fucoidan polymer fraction ローション類、乳液類、クリーム類、パック類、浴用剤、洗顔剤、浴用石けん、浴用洗剤または軟膏である請求項２に記載の化粧料。The cosmetic according to claim 2, which is a lotion, emulsion, cream, pack, bath preparation, facial cleanser, bath soap, bath detergent or ointment.
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