JP4378069B2

JP4378069B2 - Cell screening substrate and manufacturing method thereof, cell screening method and cell screening apparatus using the same

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Publication number: JP4378069B2
Application number: JP2002096840A
Authority: JP
Inventors: 憲治西口; 健宮崎; 良一松田; 耕平渡辺
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Priority date: 2001-03-29
Filing date: 2002-03-29
Publication date: 2009-12-02
Anticipated expiration: 2022-03-29
Also published as: JP2002355025A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞の接着、増殖、分化、生存、未分化状態の維持及び細胞死の少なくとも１つに寄与する物質を特定する為に用いることのできる細胞スクリーニング基板とその製造方法、それを用いた細胞のスクリーニング方法および細胞スクリーニング装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、動植物の細胞を種々の条件下において培養する研究、あるいは特定の培養細胞による産生物の研究が活発に行われており、特に人工的には合成が不可能であるか、あるいは合成が極めて困難な物質を特定の細胞活動を利用して製造することが多方面において検討されている。
【０００３】
また、細胞の増殖・分化に影響を与える物質を特定し、目的に応じて所望の細胞を増殖、分化させようという研究が行われており、細胞工学や医工学の急速な進歩とともに、細胞を用いた超小型バイオセンサーや人工臓器、更にはニューロコンピューターなどが注目を集め、これらに応用すべく活発な研究活動がなされている。
【０００４】
しかしながら前述のように生体外で細胞を利用するには、細胞を望むように配列させ、その増殖、分化や物質産出を制御することが不可欠であるが、細胞を配列させ、その増殖、分化や物質産生を制御する機構が十分解明されておらず、この様な観点で細胞を制御しながら培養することは極めて困難で、前述のような細胞を利用した研究開発の進展の大きな障壁となっている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
細胞の配列を制御する試みとしては、USP5108926号公報のように、インクジェットプリンターを用いて細胞接着性蛋白質を塗布してパターンを形成し、この上で細胞を培養した例がある。この方法では、細胞接着性蛋白質が塗布されたパターン上で細胞を培養することはできるが、その増殖・分化や物質産出の制御を行い、細胞をスクリーニングすることはできない。
【０００６】
また、「蛋白質・核酸・酵素」、45〜5、727〜734(2000)では、細胞の増殖・分化に影響を与える細胞成長因子を基板上にフォトリソグラフィ技術を用いて固定化し、細胞の増殖・分化に与える影響の検討をしている。しかしながら、細胞成長因子を固定化した基板を細胞のスクリーニング手段として用いておらず、また、フォトリソグラフィ法では、生体内に少量しか存在しないこれら生体物質を浪費し、露光、現像といったプロセスを繰り返さなければならず製造工程が複雑となる。
【０００７】
また、特表2000-512009号公報では、細胞接着性に影響を与える物質を基板上に固定化し、細胞のスクリーニングを行う方法について提案がなされている。ここでは、基板上に設けられた反応性官能基と細胞接着性物質を二価の架橋試薬により固定化している。反応性官能基と細胞接着性物質を結合させる際にフォトリソグラフィを用いており、前述したことと同様の課題が生じるだけでなく、複数の細胞接着性物質を固定化する際には、すでに固定化されている物質と新たに固定化する物質が所望でない位置で二価の架橋試薬で結合されることを回避することは極めて困難で、所望の位置に、細胞接着性物質を配置することは極めて困難である。また、増殖や分化、更には、物質産出に影響する物質を固定化することはなく、細胞を各ウェルに接着性物質により固定化し、培養液により培養される過程で細胞が産生する物質を捉えることで細胞をスクリーニングするものであり、本発明のように細胞の接着性や増殖、分化、生存、未分化状態の維持、細胞死及び物質産出の少なくとも１つに影響する物質をスクリーニングするためのものではない。
【０００８】
本発明の目的は、上述の従来例の持つ課題を解消せしめ簡便な工程で形成できる細胞スクリーニング基板及びその製造方法を提供し、細胞工学等の研究をさらに発展させ、また細胞を利用した各種デバイスを作製するための基盤となる技術を提供することにある。
【０００９】
さらに、本発明の目的は、これら細胞スクリーニング基板上で培養された細胞を用いて、細胞の接着性や増殖、分化、生存、未分化状態の維持、細胞死及び物質産出の少なくとも１つに影響する物質のスクリーニングを行う方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の細胞スクリーニング基板は、複数の細胞スクリーニング物質を微小液滴吐出手段でベース上の所望の領域に配置して固定化し、異なる細胞スクリーニング機能を有する複数の領域を有することを特徴とするものである。
【００１１】
この細胞スクリーニング基板の複数の領域には、固定化されている細胞スクリーニング物質の組合せが異なる複数の領域が含まれていてもよい。また、前記複数の領域に、固定化されている細胞スクリーニング物質の密度が異なる複数の領域が含まれていてもよい。更に、各領域、あるいは、２つ以上の各領域から形成される領域群が凹部内に形成されていてもよい。また、各領域、あるいは、２つ以上の各領域から形成される領域群が凸状の壁状構造物により囲まれていてもよい。
【００１２】
一方、本発明の細胞スクリーニング基板の製造方法は、微小液滴吐出手段により各細胞スクリーニング物質をベース上の所望の領域に配置する工程と、該ベース上の各領域で細胞スクリーニング物質を固定化する工程を含むことを特徴とするものである。
【００１３】
この微小液滴吐出手段としては、サーマルインクジェット法による吐出手段や、ピエゾインクジェット法による吐出手段を用いることができる。また、この固定化工程に、外部から固定のためのエネルギーを加える工程をさらに含んでいてもよい。
【００１４】
本発明にかかる細胞スクリーニング法は、上記の構成の細胞スクリーニング基板を用いた細胞スクリーニング法であって、前記細胞スクリーニング基板の細胞スクリーニング物質の固定領域に接触する培養液中で細胞を培養する工程を有することを特徴とするものである。
【００１５】
上記細胞スクリーニング法は、固定領域と接触する培養液中に前記細胞のスクリーニングに必要な物質を補充する工程を有していてもよい。また、前記固定領域が前記培養液の流れに接触している、例えば培養液を灌流させて培養を行う態様を採るものであってもよい。
【００１６】
上記細胞スクリーニング方法は、更に、所望の領域での細胞の形態変化を観察する工程を含むものであってもよく、評価の際に細胞を染色する方法を用いることもできる。更に、上記細胞スクリーニング法は、前記基板上の所望の領域での細胞内で合成された物質の定量を行う工程を含むこともでき、また、前記基板上の所望の領域での細胞内に取り込まれた物質の定量を行う工程を含むこともできる。物質の定量には、放射線量測定、蛍光量測定、発光量測定及び吸光度測定の少なくとも１種を用いることができる。
【００１７】
すなわち、本発明にかかる細胞スクリーニング法におけるスクリーニングは、例えば、以下の項目に基づいて行うことができる。
１）基板上の所望の領域での細胞の形態変化を評価する。
２）基板上の所望の領域での細胞内で合成された物質の定量を行う。
３）基板上の所望の領域での細胞内に取り込まれた物質の定量を行う。
４）放射線量測定により物質の定量を行う。
５）蛍光量測定により物質の定量を行う。
６）発光量測定により物質の定量を行う。
７）吸光度測定により物質の定量を行う。
【００１８】
本発明にかかる細胞スクリーニング装置は、上記の構成の細胞スクリーニング基板を用いる細胞スクリーニング装置であって、
前記細胞スクリーニング基板の細胞スクリーニング物質の固定領域に接触する培養液中で細胞を培養する手段を有することを特徴とするものである。
【００１９】
この装置は、更に、前記培養手段による細胞の形態変化の評価手段、細胞内で合成された物質の定量手段および細胞内に取り込まれた物質の定量手段の少なくとも一手段を有しているものであってもよい。また、更に、前記細胞スクリーニング基板を製造する手段を有するものであってもよい。
【００２０】
本発明にかかる細胞スクリーニング基板を用いたスクリーニングによれば、スクリーニングの結果、細胞の増殖・分化、生存および未分化状態の維持、細胞死または、物質産出に必要な因子を特定でき、細胞を効率的に培養するための方法を決定することが可能となる。また、固定化する物質を薬にすれば、培養された細胞がどのような薬の組合せや量の場合に最も効果があるかを評価できる。例えば、いわゆる環境ホルモンといわれる化学物質を封入したアクリルアミドゲルなどの徐放性のカプセルを固定化した基板を用いれば、環境ホルモンが該カプセルから徐々に培養液中に流出し、これら化学物質に対する人の感受性を評価することが可能となる。更にこれら評価結果に基づいて、種々の疾患に対する人それぞれの診断法を決定することが可能となる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
本発明の細胞スクリーニング基板の一例を説明する。図２に示すように、細胞スクリーニング基板１は、図１に示すベース（基体）１１上に２種類以上（図２においては、４種類）の細胞スクリーニング物質１２が所望の位置（１２１〜１２４）に配置されており、各細胞スクリーニング物質１２はベース１１上に固定化されている。２種類以上の細胞スクリーニング物質１２を固定化することにより、高度な細胞の接着、増殖、及び分化の少なくとも１つの制御が可能となる。
【００２３】
また、本発明において細胞スクリーニング物質１２は、細胞のベース１１上への接着性や、細胞の増殖、分化、生存および未分化状態の維持、細胞死、または、物質産出に影響を与える培養制御用の物質のことをいい、これには、細胞外基質蛋白質や細胞の表面と特異的結合能を有する抗体、サイトカインの他、細胞と結合、あるいは、細胞内に取り込まれ、細胞の増殖、分化、生存および未分化状態の維持、細胞死、または、物質産出に影響を与える化学物質などが含まれる。
【００２４】
例えば、細胞外基質蛋白質としては、コラーゲンやエラスチン、フィブロネクチン、ラミニンなどが挙げられる。また、サイトカインの中には、細胞成長因子やホルモンと呼ばれるものが含まれ、細胞成長因子には、神経成長因子（NGF）、上皮細胞成長因子（EGF）、繊維芽細胞成長因子（FGF）などが挙げられる。また、ホルモンとしてはインスリンやアドレナリンなどが挙げられる。また、これ以外の化学物質として、アレルギーを引き起こすアレルゲンなどの物質や、いわゆる環境ホルモンと呼ばれる種々の化学物質が挙げられる。
【００２５】
固定化された細胞スクリーニング物質１２は、ベース１１上で固定化されている細胞スクリーニング物質１２の種類や配置パターンといった化学的・物理的性質の違いにより領域を形成している。
【００２６】
また、細胞スクリーニング物質１２については、ベース１１上の領域あるいは２つ以上の領域から形成される領域群により固定化されている細胞スクリーニング物質１２の組合せが異なっていてもよい。これにより細胞スクリーニング物質１２の組合せによる細胞の接着性や増殖、分化、生存、未分化状態の維持、細胞死及び物質産出の少なくとも１つの違いを見ることができる。
【００２７】
また、細胞スクリーニング物質１２については、ベース１１上の領域あるいは２つ以上の領域から形成される領域群により、固定化されている細胞スクリーニング物質１２の密度が異なっていてもよい。これにより細胞スクリーニング物質１２の密度の変化による細胞の接着性や増殖、分化生存、未分化状態の維持、細胞死あるいは物質産出の違いを、より詳細に見ることができる。そして、液滴吐出手段を用いることの大きな利点の１つは、このように、１つの固定化領域に任意の割合で細胞スクリーニング物質を容易に配置することができることである。
【００２８】
細胞スクリーニング物質１２のベース１１上への固定化は、共有結合を介してでも、静電引力を介してでも、生物学的親和性を用いてもよい。共有結合を介してベース１１上に固定化する場合は、強固な力で細胞スクリーニング物質１２を固定化でき、細胞や培養液などによりその結合力は影響を受けにくく、安定してベース１１上に固定化されている。
【００２９】
ここで、一具体例として、細胞の接着性や増殖、分化、生存、未分化状態の維持、細胞死及び物質産出の少なくとも１つに影響する物質１２として、インスリンを用いる場合の、インスリンをベース１１上に共有結合で固定化する方法を図１を用いて説明する。先ず、インスリンにリンカーとしての4-Azidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester を導入する（下式参照）：
【００３０】
【化１】

【００３１】
こうして得られたリンカーが結合したインスリン１２の溶液を液滴吐出手段13（インクジェットプリンタ）を用いて、例えばポリエチレンテレフタレート（PET）製の基板11上に吐出する。次いで、この基板に対して図１に１５として示した光源から光、例えばUV光を照射すると、リンカーのアジド基が開裂してPET製基板の炭素原子とアミド結合を形成し、その結果としてインスリン１２が下記式に示すように基板表面に共有結合で固定される。
【００３２】
【化２】

【００３３】
また、静電引力による固定化の場合は、化学的な処理を行わなくてもベース１１上に固定化でき、化学的な処理による細胞スクリーニング物質１２の変性を抑制することができる。さらに生物学的親和性を用いて基板上１１に固定化する場合は、細胞スクリーニング物質１２の固定化に必要な処理が比較的容易であり、安定した固定化が可能である。
【００３４】
ベース１１は、細胞スクリーニング物質１２を安定して固定化できるものであれば材質や形状はいずれでもよい。具体的には、ガラス基板、プラスチックプレート、プラスチックシート、ポリマーフィルム、紙などを好適に用いることができる。さらにベース１１は透明であっても、遮光性のものであっても、さらには着色されていてもよい。また、ベース１１上に細胞スクリーニング物質１２を固定化するため、あるいは、ベース１１上での細胞スクリーニング物質１２の安定性を高めるため、ベース１１上の一部、あるいは全面を化学物質により処理したり、放射線を照射する処理をおこなったりしてもよい。
【００３５】
また、ベース１１は、細胞スクリーニング物質１２が固定化されている個々の領域、または、２つ以上の領域から形成される領域群が窪んでいてもよい。このことにより、微小液滴吐出手段により配置される液滴の配置を容易にすることができ、更に、窪みにより連結されている個々の領域または領域群ごとに培養液を変えて細胞を培養することができる。このような窪みを有する基板は、樹脂材料の金型成型や、フォトリソグラフィ技術などを用いたエッチング法などにより作製することができる。
【００３６】
また、ベース１１は、細胞スクリーニング物質１２が固定化されている個々の領域、または、２つ以上の領域から形成される領域群が壁状構造物により囲まれていてもよい。このことにより、微小液滴吐出手段により配置される液滴の配置を容易にすることができ、更に、窪みにより連結されている個々の領域または領域群ごとに培養液を変えて細胞を培養することができる。このような基板は、フォトリソグラフィ法などを用いることで微細な壁状構造物の作製が可能である。
【００３７】
このような細胞スクリーニング基板１は以下のようにして作製できる（図１参照）。ベース１１はまず、必要に応じて前述した処理を行ってもよい。具体的には、ベース１１の洗浄を行い、所望でない物質を取り去ったり、紫外線をはじめとする放射線の照射やコロナ放電を行ったりすることなど様々な化学的物理的処理を行うことができる。また、ポリマー材料やシランカップリング剤などを必要に応じてベース１１上の一部あるいは全面に塗布してもよい。
【００３８】
このようなベース１１上に細胞スクリーニング物質１２を配置する。配置には、微小液滴吐出手段１３を用いる。微小液滴吐出手段１３とは、1滴あたりの体積が１００ｐｌ以下の液滴が吐出可能なもので、マイクロピペット、マイクロディスペンサーや、インクジェット法を用いた吐出装置が挙げられる。吐出装置が安価に作製でき、微小な液滴が吐出できる点でインクジェット法を用いた吐出装置を好適に用いることができる。さらにインクジェット法の中でも、サーマルインクジェット法とピエゾインクジェット法を好適に用いることができ、サーマルインクジェット法による吐出装置は、吐出口の微細加工が容易で、細胞スクリーニング物質１２を高密度に配置することができる。また、ピエゾインクジェット法による吐出装置は、圧電素子の変位により、吐出エネルギーを発生させるので、細胞スクリーニング物質１２に熱的なストレスを付加することがなく、細胞スクリーニング物質１２を安定して吐出できる。
【００３９】
また、細胞スクリーニング物質１２は、液体化するため適切な溶媒に溶解される。溶剤としては、細胞スクリーニング物質１２を安定して溶解させることができるものであればいずれでもよいが、水が好適に用いられる。水としてはイオン交換水(脱イオン水)や細胞スクリーニング物質１２を安定して溶解させるため種々の緩衝液を使用するのが好ましい。
【００４０】
また、必要に応じて水溶性溶剤を用いることができる。水溶性溶剤は水に溶解するものであればいずれでもよく、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、n-プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、n-ブチルアルコール、sec-ブチルアルコール、tert-ブチルアルコール等の炭素数1〜4のアルキルアルコール類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類；アセトン、ジアセトンアルコール等のケトンまたはケトアルコール類；テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類；ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、トリエチレングリコール、1,2,6-ヘキサントリオール、チオジグリコール、ヘキシレングリコール、ジエチレングリコール等のアルキレン基が2から6個の炭素原子を含むアルキレングリコール類；グリセリン；エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、トリエチレングリコールモノメチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコールモノブチルエーテル等の多価アルコールの低級アルキルエーテル類；N-メチル-２-ピロリドン、2-ピロリドン、1,3-ジメチル-2-イミダゾリン等が挙げられる。これらの1種又は2種以上を適宜選択して使用できる。
これらの多くの水溶性有機溶剤の中でもジエチレングリコールなどの多価アルコール、トリエチレングリコールモノメチルエーテル等の低級アルキルエーテルが好ましい。
【００４１】
これらの中でもエタノールあるいはイソプロピルアルコール、又は多価アルコールの低級アルキルエーテル類を添加することによって、サーマルジェットタイプの場合には、インクジェットの吐出口内の薄膜抵抗体上でのインクの発泡をより安定に行うことができるため好適に用いることができる。
【００４２】
また、本発明にかかる少なくとも細胞スクリーニング物質１２を含む液体には、上記成分のほかに必要に応じて所望の物性値を持つ溶液とするために、界面活性剤、消泡剤、防腐剤、無機塩類、有機塩類等を添加することができる。
【００４３】
例えば、界面活性剤としては細胞スクリーニング物質１２に対して保存安定性等の悪影響を及ぼさないものであればいずれでも用いることができ、例えば、脂肪酸塩類、高級アルコール硫酸エステル塩類、液体脂肪油硫酸エステル塩類、アルキルアリルスルホン酸塩類等の陰イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルエステル類、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル類、アセチレンアルコール、アセチレングリコール等の非イオン性界面活性剤があり、これらの1種又は2種以上を適宜選択して使用できる。
【００４４】
微小液滴手段１３によりベース１１上の所望の位置に細胞スクリーニング物質１２を配置した後、細胞スクリーニング物質１２をベース１１上に固定化する。ベース１１上に細胞スクリーニング物質１２を固定化するために、細胞スクリーニング物質１２に予め固定化に必要な処理を行ってもよいし、基板上に予め固定化に必要な処理を行ってもよい。細胞スクリーニング物質１２への処理としては、共有結合に必要なアミノ基、カルボキシル基、ジスルフィド基、エポキシ基、カルボジイミド基、マレイミド基などの官能基を細胞スクリーニング物質１２へ導入してもよく、静電引力を介して結合させるのに必要な金属および無機酸化物微粒子やカチオン性高分子やアニオン性高分子など帯電可能な物質を結合させてもよい。また、生物学的親和性を用いて結合させるために、アビジン分子やビオチン分子を結合させてもよく、抗原分子や抗体分子など生物学的親和力により結合しうる物質を結合させてもよい。また、基板表面に、高分子やシランカップリング剤をコーティングし、共有結合に必要なアミノ基、カルボキシル基、ジスルフィド基、エポキシ基、カルボジイミド基、マレイミド基などの官能基を導入してもよいし、基板表面を帯電させるため、金、銀、白金、鉄などの金属やインジウム錫酸化物、酸化チタン、酸化亜鉛などの無機酸化物さらにはポリアセチレン、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェンなどの導電性高分子など、導電体層や半導体層を予め基板表面に形成してもよい。更には細胞スクリーニング物質１２に導入した生物学的親和性を有する物質と結合力を有するビオチン分子やアビジン分子、抗体分子や抗原分子、抗体結合能を有するプロテインＡなどの蛋白質をベース１１表面に設けてもよい。これら物質を導入することにより、ベース１１表面と細胞スクリーニング物質１２の結合力を強固なものにすることができる。
【００４５】
固定化の際には、光をはじめとする放射線照射や、加熱などによりエネルギーを外部から加えてもよい。これらエネルギーを外部から加えることでベース１１表面と細胞スクリーニング物質１２の結合を促進することができる。
【００４６】
以上のようにして細胞スクリーニング基板１が作製できる。
【００４７】
次に前述した細胞スクリーニング基板１上で細胞を培養する方法について述べる。このような基板上で細胞を培養することにより、細胞が接着性や増殖・分化、生存、未分化状態の維持、細胞死または物質産出に対し影響を受けながら培養されることとなる。細胞は特に制限されるものはなく、いずれの細胞でも用いることができる。また、一度にスクリーニングする細胞は1種類でもまた2種類以上であってもよい。細胞を培養する前に必要に応じて細胞スクリーニング基板１上に紫外線などを照射したり、アルコール溶液で洗浄することにより殺菌処理してもよい。これにより所望でない微生物などにより培養が阻害されないようにすることができる。なお、細胞スクリーニング基板１全体を培養液に浸漬して細胞培養を行ってもよいが、少なくとも細胞スクリーニング物質が固定化されている領域が培養液に浸漬されていれば、細胞の接着性や増殖・分化、生存、未分化状態の維持、細胞死さらには物質産出に影響を与えながら培養することが可能である。
【００４８】
また、細胞スクリーニング基板１上で細胞を培養している際、あるいは一定期間の細胞培養後、所望の領域の培養液中に所望の物質を添加してもよい。これにより細胞の増殖・分化、生存、未分化状態の維持、細胞死あるいは物質産生を変化させたり、基板上への接着性を変化させたりすることができる。または、細胞培養後のスクリーニングの際に指示薬など所望の物質を所望の領域に添加してもよい。これにより、スクリーニングを容易に行うことが可能となる。
【００４９】
また、細胞スクリーニング基板１上で細胞を培養している際、あるいは一定期間の細胞培養後、培養細胞群を基板上から取り外してもよい。こうすることで培養細胞が取り除かれた基板を再度利用することができ、また、取り外した培養細胞群を人工的に作製した生体組織あるいはその一部として利用することもできる。具体的な方法としては、培養後のスクリーニング基板をトリプシン処理することにより、培養された細胞群を取り除くことができる。これにより再度基板を利用することができる。この基板の再利用は、細胞スクリーニング物質を基板に固定したことで、細胞が当該スクリーニング物質を代謝系に取り込めなくしたことによって得られる効果の一つである。また、ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）のような温度により水溶性が変化するポリマーを予め基板上に塗布し、その上で細胞培養すると、温度を約30℃以下にすれば、培養された細胞群はポリマー表面の水和状態の変化により基板から取り外すことができる。これにより細胞群を生体組織などに利用することができる。
【００５０】
次に前述した細胞スクリーニング基板１上で細胞を培養し、細胞および基板上に固定化された物質のスクリーニング法について述べる。スクリーニング手段としては前述した細胞スクリーニング基板１上で培養された細胞の形態変化を観察する方法を用いることができる。顕微鏡は、光学顕微鏡はもちろんのこと、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡や走査型プローブ顕微鏡、蛍光顕微鏡など、細胞の形態が観察可能なものであればいずれでもよい。細胞が培養された細胞スクリーニング基板を前記顕微鏡の観察位置に配置し、顕微鏡観察により細胞の形態を観察する。顕微鏡により細胞形態を観察することのみでスクリーニングが可能であり、簡易な方法で評価を行うことができる。また、評価の際には細胞を染色してもよい。細胞染色を行うことにより、細胞が高密度に増殖した場合や、分化により細胞同士が融合し、多核細胞となった場合などは顕微鏡での観察による評価を容易に行うことができる。
【００５１】
また、形態観察以外にも細胞が基板上に接着し、または増殖や分化をする過程やその結果、細胞で産出された物質や細胞内に取り込まれた物質を定量し、スクリーニング手段として用いてもよい。ここで、定量対象が直接評価できない場合は、その代替となる物質を定量してもよく、具体的には遺伝子工学の手法を用いて、所望の定量対象となる蛋白質の遺伝子付近に定量可能な蛋白質の遺伝子を組み入れ、その定量可能な蛋白質を定量することで所望の蛋白質を定量してもよい。これら物質を評価することで、基板上に固定化された物質により細胞内でどのような変化が起きているかを詳細に調べることができ、細胞内での情報伝達機構の解明にもつながる。細胞内に取り込まれた物質で評価を行う場合は、予め取り込まれるであろう物質に評価可能な指標を設けておくことも可能で比較的容易に定量が可能である。
【００５２】
これら物質の定量には、放射性化合物より放出される放射線量を測定する方法や、蛍光物質で標識された物質から発せられる蛍光量を測定する方法、更には、発光物質から発せられる発光量を測定する方法や色素の吸光度を測定する方法がある。
【００５３】
放射性化合物より放出される放射線量を測定する方法では、水素、炭素、窒素、リン、硫黄などの生体内に多く含まれる元素の放射性同位元素により置換された化合物を用いて、それら化合物から放出される放射線量を測定する方法が非常に感度がよく、しかも、これら物質は化学的な性質は通常の化合物と変わらないので、細胞の代謝活動に影響を与えず、生体内と同様の現象が観察可能である。
【００５４】
また、蛍光物質による標識は比較的容易で、低分子化合物でもあるので細胞の代謝活動に与える影響が少ない。また、抗原抗体反応を用いた定量法によって細胞で産出された物質などを定量する場合、蛍光物質で標識された抗体は種々市販されており、測定感度も高いので、蛍光測定による評価は有効である。
【００５５】
さらに発光物質から発せられる発光量を測定する方法では、発光量は高感度に測定が可能なため、ごくわずかな変化も捕らえることが可能である。スクリーニング物質による接着や増殖、分化、あるいは物質産出に伴って発現される遺伝子が特定されている場合には、その遺伝子付近にホタルルシフェラーゼ遺伝子などを導入しておき、遺伝子発現とともに産出されるホタルルシフェラーゼ量をATPとルシフェリンの添加で生じる発光量により測定する。このことにより、スクリーニング物質による影響を発光量で評価することが可能である。
【００５６】
色素の吸光度を測定する方法では、酵素反応などを併用することにより色素による吸光度の増幅が可能で、微量の物質の定量も可能となる。
【００５７】
また、前述した細胞スクリーニング基板上で細胞を培養し、細胞及び基板上に固定化された物質のスクリーニングを行うための装置について述べる。微小液滴吐出手段によって２種類以上の細胞スクリーニング物質を基板上の所望の領域に配置して固定化し、且つ、異なる細胞スクリーニング機能を有する複数の領域を有する細胞スクリーニング基板の細胞スクリーニング物質の固定領域に接触する培養液中で細胞を培養する手段を有することが特徴であるが、更に、前記細胞スクリーニング基板を製造する手段、あるいは、前記培養手段による細胞の形態変化の評価手段、細胞内で合成された物質の定量手段および細胞内に取り込まれた物質の定量手段の少なくとも一手段を有していてもよい。
本願発明にかかる装置の一例を図６に示す。該装置の基板投入室（６０１）より基板（６００）を投入し、スクリーニング物質付与室（６０２）にて、微小液滴吐出手段を用いて基板上にスクリーニング物質を付与した後、固定化室（６０３）で、前記スクリーニング物質を光や熱照射等によって固定化し細胞スクリーニング基板が製造される。次に、培養室（６０４）に基板が運ばれ、前記した方法で該基板上の細胞を培養した後、検出室（６０５）で、細胞の形態変化、細胞の接着性、増殖・分化、生存、未分化状態の維持、細胞死さらには物質産出を観察あるいは前記した定量手段によって細胞のスクリーニングを行う。
【００５８】
ここで、６０１〜６０３は例えば、図7に示されるような装置であっても良い。図７中、７１０は微小液滴吐出装置である。基板６００はストッカー７１１にセットされており、搬送機７１２によりベルトコンベアー７１３に送られ、トレー７１５に送り出される。７１４は、送りのための補助ローラである。トレー７１５に送られた基板６００は、ポンプ７１６での吸引によりトレー上にしっかりと吸着固定される。トレー７１５上の基板６００が第１の処理工程が行われる領域に送り込まれる。７０４はＵＶ／Ｏ₃ランプであり、基板の前処理を行う。７１７の送りモータで第１の工程の領域から基板が搬出されると、微小液滴吐出手段７１０によって、細胞スクリーニング物質が付与される。スクリーニング物質が付与された基板は、第３の工程の固化処理が行われる領域に直ちに搬送され該物質は基板上に固定化される。ここで、７０６はＵＶ照射ランプである。以上の３つの処理工程を経た基板は、ベルトコンベアー７２０と送りローラ７２１を介して次の６０４の工程に搬送される。
【００５９】
しかしながら、本願発明にかかる細胞スクリーニング装置は、これら以外の態様であっても、前記目的が達成されるものであれば特に限られるものではない。
【００６０】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明のより一層の深い理解のために示される具体例であって、本発明は、これらの具体例に何ら限定されるものではない。
実施例１
（細胞の増殖因子を評価する細胞スクリーニング法）
細胞スクリーニング物質は基板上に固定化するため、以下の方法により、官能基を導入した。50mmolのジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）のテトラヒドロフラン（THF）溶液をN-ヒドロキシスクシンイミド50mmolと４-アジドベンゼンカルボン酸45mmolのTHF溶液に滴下し、4℃で24時間攪拌しながら反応させた。反応生成物を減圧乾燥後、イソプロパノール/ジイソプロパノール溶液中で再結晶化し精製した。続いてこの反応生成物をジメチルホルムアミドで溶解し、リン酸等張緩衝液（ｐH7.0）中に溶解して細胞スクリーニング物質を少量ずつ滴下していった。4℃で、48時間攪拌し、細胞スクリーニング物質にアジド基を導入した。
【００６１】
ここで、細胞スクリーニング物質としてはインスリン、塩基性繊維芽細胞成長因子（basic-FGF）、上皮細胞成長因子（EGF）、トランスフォーミング成長因子β（TGF-β）を用い、それぞれにアジド基を導入した。インクカートリッジを精製水で洗浄した後、官能基が導入された各細胞スクリーニング物質を含むリン酸等張緩衝液（ｐＨ7.0）を50％メタノール溶液で希釈し、50μｇ/ｍｌの濃度としたものを充填した。
【００６２】
続いて、図1に示すように、ポリエチレンテレフタレート（PET）フィルムのベース１１上に、各細胞スクリーニング物質１２をインクジェットプリンターで吐出した。それぞれの細胞スクリーニング物質１２が互いに重なり合わないように、図２で示すように、インスリン固定化領域１２１、塩基性繊維芽細胞成長因子固定化領域１２２、上皮細胞成長因子固定化領域１２３、トランスフォーミング成長因子固定化領域１２４にそれぞれ吐出した。液滴が乾燥後、紫外線ランプを用いて、ベース１１表面に紫外線を照射し、細胞スクリーニング物質１２を固定化した。未反応の細胞スクリーニング物質１２を取り去るため、リン酸等張緩衝液（ｐＨ=7.0）により、ベース１１上を洗浄した。このようにして細胞スクリーニング基板１を作製した。
【００６３】
この細胞スクリーニング基板１上で細胞のスクリーニングを行った。
【００６４】
予め殺菌灯で殺菌したスクリーニング基板をガラスシャーレに入れ、10μg/ml Transferrin を添加したDMEM（Dulbecco's Modified Eagle's minimum essential medium）培地を培養液として用いた。スクリーニング基板上で血管内皮細胞を培養し、５％CO₂を含む湿潤空気中で37℃、24時間培養した。また、培養液には、³H-チミジンを加え、増殖の程度を評価するため、培養後の増殖により細胞中に取り込まれた³H-チミジンの量を³Hの放射線量により測定した。
【００６５】
培養後の基板を顕微鏡観察すると、インスリン、basic-FGF、EGF固定化領域では、細胞が増殖している様子が観察された。しかし、TGF-β固定化領域では、細胞の増殖は観察されなかった。
【００６６】
また、³Hの放射線量により細胞の増殖密度を求めると、インスリン固定化領域が、10000個/mm²、basic-FGF固定化領域では、6000個/mm²、EGF固定化領域では、8000個/mm²であった。また、TGF-β固定化領域では、100個/mm²であった。以上の結果から、インスリン、basic-FGF、EGFには血管上皮細胞の増殖効果があり、TGF-βには増殖効果がないことがわかった。
【００６７】
実施例２
（細胞の増殖・分化因子を評価する細胞スクリーニング法）
上記固定化官能基導入法により、インスリン様成長因子-１（IGF-1）、basicFGF122、EGF、TGF−βにアジド基を導入した。実施例1と同様にインクジェットプリンターを用いて、PETフィルム上に各細胞スクリーニング物質を吐出し、基板上に固定化した。この時、配置パターンは図3のとおりである。図３のように、基板上には、4つの細胞スクリーニング物質がそれぞれ単独で固定化された、単独固定化領域１２ａと、2つの細胞スクリーニング物質が近接して固定化された、２物質固定化領域１２ｂがある。なお、この様に、同一基板上で、２種以上の細胞スクリーニング物質が固定化された位置の関係を変化させた複数の領域を容易に形成できることは、細胞スクリーニング物質の基板への付与に、液滴吐出手段を用いることの大きな利点の１つである。
【００６８】
この基板上で、ニワトリ骨格筋細胞を培養した。10μg/mlフィブロネクチンを添加したDMEM培地を培養液として用い、実施例1と同様の条件で培養を行った。増殖、及び分化の状況をAmersham Cell proliferation kitを用いて評価した。これは、5-bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)のフルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識抗体を用いて、DNA合成量を蛍光抗体法で評価するものである。また、培養後の細胞を染色して増殖密度の評価を行った。その手順は、培養後の細胞をメタノールで30分処理、乾燥後、Hoechst33258を1万倍に希釈し、5分反応させ、核を染色した。余分な染色液をリン酸等張緩衝液で洗った。この基板をスライドグラス上に置き、グリセリンを滴下した後、カバーガラスを被せた。このようにして調製した基板を蛍光顕微鏡で観察、染色されている核の数を評価した。また、蛍光定量法によりBrdUで標識されたDNAを含む核の数を定量した。その結果、IGF-1 、EGFでは、蛍光量が増加し、細胞の核が密集している様子が観察された。このことから細胞の増殖、分化が促進されていることがわかる。また、basicFGFでは、蛍光量は増加されたが、細胞核は分散していた。このことから、増殖は活性化されたが、分化は促進されなかった。TGF−βについては、蛍光量の増加はそれほど観察されなかった。よって、増殖が促進されなかったと考えられる。また、2つの細胞スクリーニング物質が組み合わされた領域では、互いに増殖、分化に対し活性があったIGF-1とEGFが組み合わされた領域で、蛍光量の増加が見られず、増殖が抑制されていた。このように単独では、活性がある細胞スクリーニング物質も組み合わされると抑制効果を発現することがわかった。
【００６９】
実施例３
（アレルゲンスクリーニング法）
本実施例では、アレルゲンとなりうる物質を基板上に固定化し、その基板上で人から採取した細胞を培養したときに細胞から産出される炎症惹起物質であるヒスタミンを定量することで、その人がアレルギー体質を有するかどうかを評価するものである。
【００７０】
本実施例では図４に示すようなスギ花粉、牛乳、ハウスダスト、小麦に対するアレルギー体質であるかどうかを評価する基板を作製した。各アレルゲンが単独で固定化された領域１２ａと複数のアレルゲンの相乗効果によりアレルギーを発症するかを診断できるようにするため、各アレルゲンが近接して固定化されている、２物質固定化領域１２ｂ、３物質固定化領域１２ｃ、４物質固定化領域１２ｄを設けた。
【００７１】
スギ花粉、ハウスダスト、小麦については、予めホモジナイザーを用いて十分にすりつぶしておいた。そして、各アレルゲンを含む水溶液を遠心分離した後、沈降分を除く溶解成分を固定化することとした。続いて各アレルゲン溶液を50％メタノール溶液で希釈し、50μg／mlの濃度として、実施例１記載の方法で、PETフィルム上にインクジェットプリンターを用いて固定化した。固定化パターンは図４に従った。また、固定化されていない領域はウシ血清アルブミンにより非特異吸着が起こらないように被覆した。
【００７２】
細胞は、評価対象の人から血液を採取し、密度勾配遠心分離法により、血液成分を分離し、アレルギー反応性細胞を取り出した。
【００７３】
培養液を10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM培地とし、抗ヒスタミン抗体（ウサギ）を添加して基板上で細胞を培養した。
【００７４】
培養後の基板を取り出し、リン酸等張緩衝液で洗浄した。メタノールで30分処理、乾燥後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ウサギIg抗体を用いて、酵素抗体法によりo-フェニレンジアミンの吸光度変化からヒスタミン量を定量した。その結果、ハウスダストから抽出された物質を固定化した領域からヒスタミンが多量に検出されたことから、この人はハウスダストに対しアレルギー体質であると考えられる。また、スギ花粉、牛乳、小麦に対しては、陰性と考えられるが、牛乳、小麦が近接して固定化された領域では、ヒスタミンが多量に検出されたので、2つを同時に摂取するとアレルギーを発症する可能性があることがわかった。
【００７５】
このように、本基板を用いることで、何に対するアレルギーがあるかを診断することが可能である。特に、本実施例のように、複数のアレルゲンに対するアレルギー反応を診断することができる。
実施例４
（固定化物質の密度による増殖・分化スクリーニング基板）
繊維芽細胞であるNRK細胞がEGFとTGF-βにより細胞増殖に受ける影響を調べることとした。実施例1に基づき、２つの細胞成長因子EGFとTGF-βにはそれぞれ予めアジド基を導入しておいた。基板は、PETフィルムを用い、インクジェットプリンターを用いて各細胞成長因子を基板の位置により、密度が異なる組み合わせとなるよう図５に従って基板上に吐出し、乾燥後、紫外線を照射し固定化した。なお、吐出量はプリンタを接続したコンピューターから送信した描画データのドット密度を各領域において設定することにより制御した。図５中の数字は、各成長因子の行方向あるいは列方向の相対的なドット密度で、２つの数字が交差する領域は、この数字により設定されたドット密度で各成長因子が固定化されていることを示している。
【００７６】
このようにして作製した基板上でNRK細胞を培養した。培養液はBrdUを添加し、0.5ｗｔ％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中を用い、５％ＣＯ₂濃度の湿潤空気下で、37℃で48時間培養した。
【００７７】
培養後は、Amersham Cell proliferation kitを用いて評価した。評価結果は表1に示す通りである。
【００７８】
【表１】

【００７９】
NRK細胞はEGF、TGF-βの単独の作用により増殖の促進を受けると考えられるが、両者の組み合わせにより、増殖阻害効果が発現するものと考えられる。このようにしてNRK細胞に対するEGF、TGF-βの細胞増殖に与える効果から、EGF、TGF-βが共存しない培養液において培養することがよいことがわかった。
【００８０】
【発明の効果】
本発明の細胞スクリーニング基板は、細胞スクリーニング物質を簡易な工程で確実に所望の位置に固定化でき、細胞の接着性や増殖、分化、生存、未分化状態の維持、細胞死及び物質産出の少なくとも１つに影響する物質をスクリーニングすることができる。
【００８１】
本発明の細胞スクリーニング法により、１枚の基板上で様々な物質による細胞への影響を調べることが可能で、また、様々な物質が種々の細胞に与える影響の違いを調べることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の細胞スクリーニング基板の製造方法の一例である。
【図２】実施例1の細胞スクリーニング基板における細胞スクリーニング物質の配列法の一例である。
【図３】実施例２の細胞スクリーニング基板における細胞スクリーニング物質の配列法の一例である。
【図４】実施例３のアレルゲンスクリーニング基板におけるアレルゲンの配列法の一例である。
【図５】実施例4のスクリーニング基板における細胞スクリーニング物質の配列法の一例である。
【図６】本願発明にかかる細胞スクリーニング装置の一例である。
【図７】本願発明にかかる細胞スクリーニング装置の細胞スクリーニング基板製造手段の一例である。
【符号の説明】
１細胞スクリーニング基板
１１ベース基板
１２細胞スクリーニング物質
１２ａ単独固定化領域
１２ｂ物質固定化領域
１２ｃ物質固定化領域
１２ｄ物質固定化領域
１３微小液滴吐出手段
１５紫外線照射ランプ
１２１インスリン固定化領域
１２２塩基性繊維芽細胞成長因子固定化領域
１２３上皮細胞成長因子固定化領域
１２４トランスフォーミング成長因子β固定化領域[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a cell screening substrate that can be used to specify a substance that contributes to at least one of cell adhesion, proliferation, differentiation, survival, maintenance of undifferentiated state, and cell death, a method for producing the same, and use thereof The present invention relates to a cell screening method and a cell screening apparatus.
[0002]
[Prior art]
In recent years, research on culturing animal and plant cells under various conditions, or research on products by specific cultured cells, has been actively carried out, and in particular, synthesis is impossible artificially or synthesis is extremely difficult. The production of difficult substances using specific cellular activities has been studied in many ways.
[0003]
In addition, research has been conducted to identify substances that affect cell growth and differentiation, and to grow and differentiate desired cells according to the purpose. With rapid progress in cell engineering and medical engineering, The ultra-small biosensors, artificial organs, and neurocomputers that have been used are attracting attention, and active research activities are being conducted to apply them.
[0004]
However, as described above, in order to use cells in vitro, it is indispensable to arrange cells as desired and control their growth, differentiation and substance production. The mechanism for controlling substance production has not been fully elucidated, and it is extremely difficult to cultivate cells while controlling cells from this perspective, and this is a major obstacle to the progress of research and development using cells as described above. Yes.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
As an attempt to control the arrangement of cells, there is an example in which a cell adhesion protein is applied using an ink jet printer to form a pattern, and cells are cultured thereon, as in US Pat. No. 5,108,926. In this method, cells can be cultured on a pattern coated with a cell adhesion protein, but the cells cannot be screened by controlling their growth / differentiation and substance production.
[0006]
In “Proteins / Nucleic Acids / Enzymes”, 45-5, 727-734 (2000), cell growth factors that affect cell proliferation / differentiation are immobilized on the substrate using photolithography technology.・ We are examining the effects on differentiation. However, a substrate on which cell growth factors are immobilized is not used as a screening means for cells, and in the photolithography method, these biological materials that are present in a small amount in the living body are wasted, and the processes such as exposure and development must be repeated. The manufacturing process must be complicated.
[0007]
In Japanese translation of PCT publication 2000-512009, a method for screening a cell by immobilizing a substance that affects cell adhesion on a substrate has been proposed. Here, the reactive functional group provided on the substrate and the cell adhesive substance are immobilized by a divalent crosslinking reagent. Photolithography is used to bind the reactive functional group and the cell adhesive substance, which not only causes the same problems as described above, but also immobilizes multiple cell adhesive substances when immobilizing them. It is extremely difficult to avoid that a substance to be immobilized and a substance to be newly immobilized are bound with a divalent cross-linking reagent at an undesired position, and it is difficult to place a cell adhesive substance at a desired position. It is extremely difficult. In addition, substances that affect proliferation, differentiation, and substance production are not immobilized, but cells are immobilized in each well with an adhesive substance, and the substances produced by the cells in the process of being cultured in a culture solution are captured. In order to screen for substances that affect at least one of cell adhesion, proliferation, differentiation, survival, maintenance of undifferentiated state, cell death, and substance production as in the present invention. It is not a thing.
[0008]
An object of the present invention is to provide a cell screening substrate and a method for producing the same that can solve the problems of the above-described conventional examples and can be formed by a simple process, further develop cell engineering research, and various devices using cells. It is to provide a technology that is the basis for manufacturing the device.
[0009]
Furthermore, an object of the present invention is to influence at least one of cell adhesion, proliferation, differentiation, survival, maintenance of undifferentiated state, cell death and substance production using cells cultured on these cell screening substrates. The present invention provides a method for screening a substance to be screened.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The cell screening substrate of the present invention is characterized in that a plurality of cell screening substances are arranged and fixed in a desired region on the base by means of micro droplet ejection means, and have a plurality of regions having different cell screening functions. It is.
[0011]
The plurality of regions of the cell screening substrate may include a plurality of regions with different combinations of immobilized cell screening substances. In addition, the plurality of regions may include a plurality of regions having different densities of the immobilized cell screening substance. Further, each region or a group of regions formed from two or more regions may be formed in the recess. Each region or a group of regions formed from two or more regions may be surrounded by a convex wall-shaped structure.
[0012]
On the other hand, in the method for producing a cell screening substrate of the present invention, the step of disposing each cell screening substance in a desired region on the base by the fine droplet discharge means, and immobilizing the cell screening substance in each region on the base It is characterized by including a process.
[0013]
As the minute droplet discharge means, a discharge means by a thermal ink jet method or a discharge means by a piezo ink jet method can be used. Further, this immobilization step may further include a step of applying energy for immobilization from the outside.
[0014]
The cell screening method according to the present invention is a cell screening method using the cell screening substrate having the above-described configuration, and includes a step of culturing cells in a culture solution in contact with a fixed region of the cell screening substance on the cell screening substrate. It is characterized by having.
[0015]
The cell screening method may include a step of replenishing a substance necessary for the cell screening into a culture solution in contact with the fixed region. Further, the fixing region may be in contact with the flow of the culture solution. For example, the culture may be performed by perfusing the culture solution.
[0016]
The cell screening method may further include a step of observing cell shape change in a desired region, and a method of staining cells at the time of evaluation can also be used. Further, the cell screening method may include a step of quantifying a substance synthesized in a cell in a desired region on the substrate, and may be incorporated into the cell in a desired region on the substrate. It is also possible to include a step of quantifying the determined substance. For quantification of the substance, at least one of radiation dose measurement, fluorescence measurement, luminescence measurement, and absorbance measurement can be used.
[0017]
That is, screening in the cell screening method according to the present invention can be performed based on the following items, for example.
1) Evaluate the morphological change of cells in a desired area on the substrate.
2) The substance synthesized in the cells in a desired region on the substrate is quantified.
3) Quantify the substance taken up into cells in a desired region on the substrate.
4) Quantify substances by measuring radiation dose.
5) Quantify substances by measuring fluorescence.
6) Quantify the substance by measuring the amount of luminescence.
7) Quantify the substance by measuring the absorbance.
[0018]
A cell screening apparatus according to the present invention is a cell screening apparatus using the cell screening substrate having the above-described configuration,
It has means for culturing cells in a culture solution in contact with a fixed area of a cell screening substance on the cell screening substrate.
[0019]
The apparatus further includes at least one means for evaluating the change in cell morphology by the culture means, the means for quantifying the substance synthesized in the cell, and the means for quantifying the substance taken into the cell. There may be. Furthermore, it may have means for producing the cell screening substrate.
[0020]
According to the screening using the cell screening substrate according to the present invention, as a result of the screening, factors necessary for cell proliferation / differentiation, survival and maintenance of undifferentiated state, cell death, or substance production can be identified, and cells can be efficiently used. It is possible to determine the method for cultivating automatically. In addition, if the substance to be immobilized is a drug, it is possible to evaluate what kind of drug combination and amount the cultured cells are most effective for. For example, if a substrate on which a sustained-release capsule such as an acrylamide gel encapsulating a chemical substance called so-called environmental hormone is immobilized is used, the environmental hormone gradually flows out from the capsule into the culture solution, and humans against these chemical substances are used. It becomes possible to evaluate the sensitivity. Furthermore, based on these evaluation results, it becomes possible to determine each person's diagnostic method for various diseases.
[0021]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is described in detail below.
[0022]
An example of the cell screening substrate of the present invention will be described. As shown in FIG. 2, the cell screening substrate 1 has two or more (four in FIG. 2) cell screening substances 12 on desired positions (121 to 124) on the base (substrate) 11 shown in FIG. Each cell screening substance 12 is immobilized on the base 11. By immobilizing two or more kinds of cell screening substances 12, it is possible to control at least one of advanced cell adhesion, proliferation, and differentiation.
[0023]
In the present invention, the cell screening substance 12 is used for culture control that affects the adhesion of cells to the base 11, maintenance of cell proliferation, differentiation, survival and undifferentiation, cell death, or substance production. In addition to extracellular matrix proteins and antibodies that have specific binding ability to the surface of cells, cytokines, they bind to cells, or are taken into cells to proliferate, differentiate, Examples include chemical substances that affect survival and maintenance of undifferentiated states, cell death, or substance production.
[0024]
For example, examples of the extracellular matrix protein include collagen, elastin, fibronectin, laminin and the like. Cytokines include those called cell growth factors and hormones. Cell growth factors include nerve growth factor (NGF), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), etc. Is mentioned. In addition, examples of hormones include insulin and adrenaline. Other chemical substances include substances such as allergens that cause allergies, and various chemical substances called so-called environmental hormones.
[0025]
The immobilized cell screening substance 12 forms a region due to a difference in chemical and physical properties such as the type and arrangement pattern of the cell screening substance 12 immobilized on the base 11.
[0026]
Moreover, about the cell screening substance 12, the combination of the cell screening substance 12 fixed by the area | region group formed from the area | region on the base 11, or two or more area | regions may differ. Thereby, at least one difference in cell adhesion, proliferation, differentiation, survival, maintenance of undifferentiated state, cell death, and substance production by the combination of the cell screening substances 12 can be seen.
[0027]
As for the cell screening substance 12, the density of the immobilized cell screening substance 12 may be different depending on the area on the base 11 or a group of areas formed from two or more areas. Thereby, the difference in cell adhesion and proliferation, differentiation survival, maintenance of undifferentiated state, cell death or substance production due to the change in density of the cell screening substance 12 can be seen in more detail. One of the great advantages of using the droplet discharge means is that the cell screening substance can be easily arranged at an arbitrary ratio in one immobilization region as described above.
[0028]
For immobilization of the cell screening substance 12 on the base 11, biological affinity may be used either through a covalent bond or through electrostatic attraction. When immobilized on the base 11 via a covalent bond, the cell screening substance 12 can be immobilized with a strong force, and the binding force is not easily affected by cells, culture medium, etc. It is fixed.
[0029]
Here, as one specific example, insulin is used when insulin is used as the substance 12 that affects at least one of cell adhesion, proliferation, differentiation, survival, maintenance of undifferentiated state, cell death, and substance production. A method of immobilizing the polymer 11 on a covalent bond will be described with reference to FIG. First, 4-Azidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester as a linker is introduced into insulin (see the following formula):
[0030]
[Chemical 1]

[0031]
The solution of insulin 12 bound with the linker thus obtained is discharged onto a substrate 11 made of, for example, polyethylene terephthalate (PET) using a droplet discharge means 13 (inkjet printer). Next, when this substrate is irradiated with light, for example, UV light, shown as 15 in FIG. 1, the azide group of the linker is cleaved to form an amide bond with the carbon atom of the PET substrate, resulting in insulin. 12 is fixed to the substrate surface by a covalent bond as shown in the following formula.
[0032]
[Chemical formula 2]

[0033]
In addition, in the case of immobilization by electrostatic attraction, it can be immobilized on the base 11 without performing chemical treatment, and denaturation of the cell screening substance 12 by chemical treatment can be suppressed. Furthermore, when immobilizing on the substrate 11 using biological affinity, the processing necessary for immobilizing the cell screening substance 12 is relatively easy, and stable immobilization is possible.
[0034]
The base 11 may be any material and shape as long as the cell screening substance 12 can be stably immobilized. Specifically, a glass substrate, a plastic plate, a plastic sheet, a polymer film, paper, or the like can be preferably used. Furthermore, the base 11 may be transparent, light-shielding, or colored. Further, in order to immobilize the cell screening substance 12 on the base 11 or to improve the stability of the cell screening substance 12 on the base 11, a part or the entire surface of the base 11 is treated with a chemical substance. A process of irradiating radiation may be performed.
[0035]
In addition, the base 11 may be recessed in individual regions where the cell screening substance 12 is immobilized, or a group of regions formed from two or more regions. This facilitates the placement of the droplets placed by the microdroplet discharge means, and further cultivates the cells by changing the culture solution for each region or group of regions connected by the depressions. be able to. A substrate having such a depression can be manufactured by molding a resin material, an etching method using a photolithography technique, or the like.
[0036]
In the base 11, individual regions where the cell screening substance 12 is immobilized, or a region group formed of two or more regions may be surrounded by a wall-like structure. This facilitates the placement of the droplets placed by the microdroplet discharge means, and further cultivates the cells by changing the culture solution for each region or group of regions connected by the depressions. be able to. For such a substrate, a fine wall-shaped structure can be manufactured by using a photolithography method or the like.
[0037]
Such a cell screening substrate 1 can be produced as follows (see FIG. 1). First, the base 11 may perform the above-described processing as necessary. Specifically, various chemical-physical treatments such as cleaning the base 11 to remove undesired substances, irradiating ultraviolet rays and other radiation, and performing corona discharge can be performed. Further, a polymer material, a silane coupling agent, or the like may be applied to a part or the entire surface of the base 11 as necessary.
[0038]
A cell screening substance 12 is placed on such a base 11. For the arrangement, the fine droplet discharge means 13 is used. The micro droplet ejection means 13 is capable of ejecting droplets having a volume of 100 pl or less per droplet, and examples include a micropipette, a micro dispenser, and an ejection device using an inkjet method. A discharge device using an ink jet method can be preferably used in that the discharge device can be manufactured at low cost and fine droplets can be discharged. Further, among the ink jet methods, the thermal ink jet method and the piezo ink jet method can be suitably used, and the ejection device based on the thermal ink jet method can easily process the fineness of the ejection port, and can arrange the cell screening substance 12 at a high density. it can. Further, since the ejection device based on the piezo ink jet method generates ejection energy by displacement of the piezoelectric element, the cell screening material 12 can be ejected stably without applying thermal stress to the cell screening material 12.
[0039]
In addition, the cell screening substance 12 is dissolved in an appropriate solvent to be liquefied. Any solvent can be used as long as it can stably dissolve the cell screening substance 12, but water is preferably used. As the water, it is preferable to use various buffer solutions for stably dissolving ion-exchanged water (deionized water) and the cell screening substance 12.
[0040]
Moreover, a water-soluble solvent can be used as needed. Any water-soluble solvent may be used as long as it is soluble in water. For example, methyl alcohol, ethyl alcohol, n-propyl alcohol, isopropyl alcohol, n-butyl alcohol, sec-butyl alcohol, tert-butyl alcohol, etc. 1-4 alkyl alcohols; amides such as dimethylformamide and dimethylacetamide; ketones or ketoalcohols such as acetone and diacetone alcohol; ethers such as tetrahydrofuran and dioxane; polyalkylene glycols such as polyethylene glycol and polypropylene glycol ; Alkylene such as ethylene glycol, propylene glycol, butylene glycol, triethylene glycol, 1,2,6-hexanetriol, thiodiglycol, hexylene glycol, diethylene glycol, etc. Alkylene glycols containing 2 to 6 carbon atoms; glycerin; ethylene glycol monomethyl ether, ethylene glycol monoethyl ether, ethylene glycol monobutyl ether, diethylene glycol monomethyl ether, diethylene glycol monoethyl ether, diethylene glycol monobutyl ether, triethylene glycol Lower alkyl ethers of polyhydric alcohols such as monomethyl ether, triethylene glycol monoethyl ether, triethylene glycol monobutyl ether; N-methyl-2-pyrrolidone, 2-pyrrolidone, 1,3-dimethyl-2-imidazoline, etc. It is done. One or more of these can be appropriately selected and used.
Of these many water-soluble organic solvents, polyhydric alcohols such as diethylene glycol and lower alkyl ethers such as triethylene glycol monomethyl ether are preferred.
[0041]
Among these, by adding ethanol, isopropyl alcohol, or lower alkyl ethers of polyhydric alcohol, in the case of the thermal jet type, the foaming of the ink on the thin film resistor in the discharge port of the ink jet is performed more stably. Therefore, it can be preferably used.
[0042]
In addition to the above components, the liquid containing at least the cell screening substance 12 according to the present invention may include a surfactant, an antifoaming agent, a preservative, an inorganic substance, in order to obtain a solution having desired physical properties as required. Salts, organic salts and the like can be added.
[0043]
For example, any surfactant can be used as long as it does not adversely affect the cell screening substance 12 such as storage stability. For example, fatty acid salts, higher alcohol sulfates, liquid fatty oil sulfates Anionic surfactants such as salts and alkylallyl sulfonates, nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene alkyl esters, polyoxyethylene sorbitan alkyl esters, acetylene alcohol and acetylene glycol One or two or more of these can be appropriately selected and used.
[0044]
After the cell screening substance 12 is arranged at a desired position on the base 11 by the microdroplet means 13, the cell screening substance 12 is immobilized on the base 11. In order to immobilize the cell screening substance 12 on the base 11, processing necessary for immobilization may be performed on the cell screening substance 12 in advance, or processing necessary for immobilization may be performed on the substrate in advance. As the treatment for the cell screening substance 12, functional groups such as amino groups, carboxyl groups, disulfide groups, epoxy groups, carbodiimide groups, maleimide groups and the like necessary for covalent bonding may be introduced into the cell screening substance 12, and electrostatic Metals necessary for bonding through attractive force and chargeable substances such as inorganic oxide fine particles, cationic polymers, and anionic polymers may be bonded. Further, in order to bind using biological affinity, an avidin molecule or biotin molecule may be bound, or a substance that can be bound by biological affinity such as an antigen molecule or an antibody molecule may be bound. Alternatively, the substrate surface may be coated with a polymer or a silane coupling agent, and functional groups such as amino groups, carboxyl groups, disulfide groups, epoxy groups, carbodiimide groups, and maleimide groups necessary for covalent bonding may be introduced. In order to charge the substrate surface, metals such as gold, silver, platinum and iron, inorganic oxides such as indium tin oxide, titanium oxide and zinc oxide, and conductive polymers such as polyacetylene, polypyrrole, polyaniline and polythiophene A conductor layer or a semiconductor layer may be formed on the substrate surface in advance. Furthermore, a protein such as a biotin molecule or avidin molecule having a binding force with a substance having biological affinity introduced into the cell screening substance 12, an antibody molecule or an antigen molecule, or a protein A having an antibody binding ability is provided on the surface of the base 11. May be. By introducing these substances, the binding force between the surface of the base 11 and the cell screening substance 12 can be strengthened.
[0045]
At the time of immobilization, energy may be applied from the outside by irradiation with light such as light or heating. By adding these energies from the outside, the binding between the surface of the base 11 and the cell screening substance 12 can be promoted.
[0046]
The cell screening substrate 1 can be produced as described above.
[0047]
Next, a method for culturing cells on the aforementioned cell screening substrate 1 will be described. By culturing cells on such a substrate, the cells are cultured while being affected by adhesion, proliferation / differentiation, survival, maintenance of an undifferentiated state, cell death or substance production. The cell is not particularly limited, and any cell can be used. In addition, the cells to be screened at one time may be one type or two or more types. Before culturing the cells, the cell screening substrate 1 may be sterilized by irradiating it with ultraviolet rays or washing with an alcohol solution as necessary. Thereby, it is possible to prevent the culture from being inhibited by an undesired microorganism. In addition, cell culture may be performed by immersing the entire cell screening substrate 1 in a culture solution. However, if at least a region where a cell screening substance is immobilized is immersed in the culture solution, cell adhesion and proliferation are performed. -It can be cultured while affecting differentiation, survival, maintenance of undifferentiated state, cell death and substance production.
[0048]
Further, a desired substance may be added to a culture solution in a desired region when cells are cultured on the cell screening substrate 1 or after cell culture for a certain period. As a result, cell proliferation / differentiation, survival, maintenance of an undifferentiated state, cell death or substance production can be changed, and adhesion to a substrate can be changed. Alternatively, a desired substance such as an indicator may be added to a desired region during screening after cell culture. Thereby, screening can be easily performed.
[0049]
Further, the cultured cell group may be removed from the substrate when cells are cultured on the cell screening substrate 1 or after cell culture for a certain period. By doing so, the substrate from which the cultured cells have been removed can be used again, and the detached cultured cell group can also be used as an artificially produced biological tissue or a part thereof. As a specific method, the cultured cell group can be removed by trypsinizing the cultured screening substrate. As a result, the substrate can be used again. This reuse of the substrate is one of the effects obtained by immobilizing the cell screening substance on the substrate and preventing the cells from taking up the screening substance into the metabolic system. In addition, when a polymer such as poly (N-isopropylacrylamide) whose water solubility changes depending on the temperature is applied on the substrate in advance and the cells are cultured on it, the cultured cell group is reduced to about 30 ° C. or less. Can be removed from the substrate by changing the hydration state of the polymer surface. Thereby, a cell group can be utilized for a biological tissue etc.
[0050]
Next, a method for screening cells and substances immobilized on the substrate by culturing the cells on the aforementioned cell screening substrate 1 will be described. As the screening means, the method of observing the morphological change of the cells cultured on the cell screening substrate 1 described above can be used. The microscope may be any optical microscope, scanning electron microscope, transmission electron microscope, scanning probe microscope, fluorescent microscope, or the like as long as the cell morphology can be observed. A cell screening substrate on which cells are cultured is placed at the observation position of the microscope, and the morphology of the cells is observed by microscopic observation. Screening is possible only by observing cell morphology with a microscope, and evaluation can be performed by a simple method. Moreover, you may dye | stain a cell in the case of evaluation. By performing cell staining, evaluation by observation with a microscope can be easily performed when cells proliferate at a high density or when cells are fused by differentiation to become multinucleated cells.
[0051]
In addition to morphological observation, the process of cell adhesion or proliferation and differentiation, and as a result, the substance produced in the cell and the substance taken into the cell can be quantified and used as a screening tool. Good. Here, if the quantification target cannot be directly evaluated, the alternative substance may be quantified. Specifically, it can be quantified in the vicinity of the gene of the desired protein to be quantified using genetic engineering techniques. A desired protein may be quantified by incorporating a protein gene and quantifying the quantifiable protein. By evaluating these substances, it is possible to examine in detail what kind of changes are occurring in the cells due to the substances immobilized on the substrate, which leads to the elucidation of the information transmission mechanism in the cells. In the case where the evaluation is performed with a substance taken up into cells, it is possible to provide an index that can be evaluated for a substance that will be taken up in advance, and it is possible to quantify relatively easily.
[0052]
These substances are quantified by measuring the amount of radiation emitted from radioactive compounds, measuring the amount of fluorescence emitted from substances labeled with fluorescent substances, and measuring the amount of luminescence emitted from luminescent substances. And a method for measuring the absorbance of the dye.
[0053]
In the method of measuring the amount of radiation emitted from radioactive compounds, compounds substituted with radioactive isotopes of elements such as hydrogen, carbon, nitrogen, phosphorus, sulfur, etc. The method of measuring the radiation dose is very sensitive, and the chemical properties of these substances are not different from those of ordinary compounds, so it does not affect the metabolic activity of cells and the same phenomenon as in vivo is observed. Is possible.
[0054]
In addition, labeling with a fluorescent substance is relatively easy, and since it is a low molecular compound, it has little influence on the metabolic activity of cells. In addition, when quantifying substances produced in cells by a quantification method using an antigen-antibody reaction, various antibodies labeled with fluorescent substances are commercially available and have high measurement sensitivity, so evaluation by fluorescence measurement is effective. is there.
[0055]
Furthermore, in the method of measuring the amount of luminescence emitted from a luminescent substance, the amount of luminescence can be measured with high sensitivity, so that even a slight change can be captured. When a gene expressed by adhesion, proliferation, differentiation, or substance production by a screening substance is specified, a firefly luciferase gene or the like is introduced near the gene and firefly luciferase produced along with gene expression is introduced. The amount is measured by the amount of luminescence produced by the addition of ATP and luciferin. Thus, the influence of the screening substance can be evaluated by the amount of luminescence.
[0056]
In the method of measuring the absorbance of the dye, the absorbance can be amplified by the dye by using an enzyme reaction or the like together, and a trace amount of substance can be quantified.
[0057]
An apparatus for culturing cells on the aforementioned cell screening substrate and screening the cells and substances immobilized on the substrate will be described. Two or more kinds of cell screening substances are arranged and fixed in a desired area on the substrate by means of micro droplet ejection means, and the cell screening substance fixing area of the cell screening board having a plurality of areas having different cell screening functions It is characterized in that it has means for culturing cells in a culture solution in contact with the cell, but further means for producing the cell screening substrate, means for evaluating cell shape change by the means for culturing, synthesis in the cell There may be provided at least one means for quantifying the determined substance and quantifying means for the substance taken into the cells.
An example of an apparatus according to the present invention is shown in FIG. A substrate (600) is loaded from the substrate loading chamber (601) of the apparatus, and a screening substance is applied onto the substrate in the screening substance applying chamber (602) using a microdroplet discharge means, and then the immobilization chamber ( In step 603), the screening substance is immobilized by light, heat irradiation, or the like to manufacture a cell screening substrate. Next, the substrate is transferred to the culture chamber (604), and the cells on the substrate are cultured by the above-described method. Then, in the detection chamber (605), cell shape change, cell adhesion, proliferation / differentiation, survival. Then, maintenance of an undifferentiated state, cell death, and substance production are observed, or cells are screened by the above-described quantitative means.
[0058]
Here, 601 to 603 may be, for example, an apparatus as shown in FIG. In FIG. 7, reference numeral 710 denotes a micro droplet discharge device. The substrate 600 is set in the stocker 711, sent to the belt conveyor 713 by the transporter 712, and sent to the tray 715. Reference numeral 714 denotes an auxiliary roller for feeding. The substrate 600 sent to the tray 715 is firmly fixed on the tray by suction by the pump 716. The substrate 600 on the tray 715 is sent to an area where the first processing step is performed. 704 is UV / O _Three It is a lamp and performs pretreatment of the substrate. When the substrate is unloaded from the region of the first step by the feed motor 717, the cell screening substance is applied by the microdroplet discharge means 710. The substrate to which the screening substance is applied is immediately transferred to the area where the solidification process in the third step is performed, and the substance is fixed on the substrate. here, 706 Is a UV irradiation lamp. The substrate that has undergone the above three processing steps is conveyed to the next step 604 via the belt conveyor 720 and the feed roller 721.
[0059]
However, the cell screening device according to the present invention is not particularly limited as long as the above-described object is achieved even in other modes.
[0060]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. These examples are specific examples shown for a deeper understanding of the present invention, and the present invention is not limited to these specific examples. It is not limited to examples.
Example 1
(Cell screening method to evaluate cell growth factors)
In order to immobilize the cell screening substance on the substrate, a functional group was introduced by the following method. A tetrahydrofuran (THF) solution of 50 mmol of dicyclohexylcarbodiimide (DCC) was added dropwise to a THF solution of 50 mmol of N-hydroxysuccinimide and 45 mmol of 4-azidobenzenecarboxylic acid, and reacted at 4 ° C. with stirring for 24 hours. The reaction product was dried under reduced pressure, recrystallized in an isopropanol / diisopropanol solution and purified. Subsequently, this reaction product was dissolved in dimethylformamide, dissolved in phosphate isotonic buffer (pH 7.0), and cell screening substances were added dropwise in small portions. The mixture was stirred at 4 ° C. for 48 hours to introduce an azide group into the cell screening substance.
[0061]
Here, insulin, basic fibroblast growth factor (basic-FGF), epithelial cell growth factor (EGF), and transforming growth factor β (TGF-β) were used as cell screening substances, and an azide group was introduced into each. did. After washing the ink cartridge with purified water, a phosphate isotonic buffer solution (pH 7.0) containing each cell screening substance into which a functional group has been introduced is diluted with a 50% methanol solution to a concentration of 50 μg / ml Filled.
[0062]
Then, as shown in FIG. 1, each cell screening substance 12 was discharged with the inkjet printer on the base 11 of the polyethylene terephthalate (PET) film. As shown in FIG. 2, an insulin-immobilized region 121, a basic fibroblast growth factor-immobilized region 122, an epithelial cell growth factor-immobilized region 123, a transforming so that the cell screening substances 12 do not overlap each other. It discharged to the growth factor fixed area | region 124, respectively. After the droplets were dried, the cell screening substance 12 was immobilized by irradiating the surface of the base 11 with ultraviolet rays using an ultraviolet lamp. In order to remove the unreacted cell screening substance 12, the base 11 was washed with a phosphate isotonic buffer (pH = 7.0). In this way, the cell screening substrate 1 was produced.
[0063]
Cells were screened on this cell screening substrate 1.
[0064]
A screening substrate previously sterilized with a germicidal lamp was placed in a glass petri dish, and a DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's minimum essential medium) medium supplemented with 10 μg / ml Transferrin was used as a culture solution. Vascular endothelial cells are cultured on the screening substrate and 5% CO ₂ The cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours in moist air containing In addition, ^Three H-thymidine was added and taken up into cells by growth after culture to assess the extent of growth ^Three H-thymidine amount ^Three It was measured by the radiation dose of H.
[0065]
When the substrate after the culture was observed with a microscope, it was observed that cells were proliferating in the insulin, basic-FGF, and EGF-immobilized regions. However, no cell proliferation was observed in the TGF-β immobilized region.
[0066]
Also, ^Three When the cell growth density is determined by the radiation dose of H, the insulin immobilization area is 10,000 / mm. ² In the basic-FGF immobilization area, 6000 / mm ² 8000 pieces / mm in EGF immobilization area ² Met. In the TGF-β immobilization region, 100 / mm ² Met. From the above results, it was found that insulin, basic-FGF, and EGF have a proliferative effect on vascular epithelial cells, and TGF-β has no proliferative effect.
[0067]
Example 2
(Cell screening method to evaluate cell growth / differentiation factors)
Azide groups were introduced into insulin-like growth factor-1 (IGF-1), basic FGF122, EGF, and TGF-β by the above-described immobilized functional group introduction method. In the same manner as in Example 1, each cell screening substance was discharged onto a PET film and immobilized on a substrate using an inkjet printer. At this time, the arrangement pattern is as shown in FIG. As shown in FIG. 3, on the substrate, a single cell immobilization region 12a in which four cell screening substances are individually immobilized and a two cell screening substance are immobilized in close proximity to each other. There is a region 12b. As described above, the ability to easily form a plurality of regions in which the relationship between the positions where two or more cell screening substances are immobilized is changed on the same substrate, This is one of the great advantages of using the droplet discharge means.
[0068]
Chicken skeletal muscle cells were cultured on this substrate. Culturing was performed under the same conditions as in Example 1, using a DMEM medium supplemented with 10 μg / ml fibronectin as a culture solution. The state of proliferation and differentiation was evaluated using the Amersham Cell proliferation kit. In this method, the amount of DNA synthesis is evaluated by a fluorescent antibody method using a fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled antibody of 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU). In addition, the proliferation density was evaluated by staining the cultured cells. In this procedure, the cultured cells were treated with methanol for 30 minutes, dried, Hoechst33258 was diluted 10,000 times, reacted for 5 minutes, and the nucleus was stained. Excess staining solution was washed with phosphate isotonic buffer. This substrate was placed on a slide glass, glycerin was dropped, and then a cover glass was put on. The substrate thus prepared was observed with a fluorescence microscope, and the number of stained nuclei was evaluated. In addition, the number of nuclei containing DNA labeled with BrdU was quantified by fluorescence quantification. As a result, in IGF-1 and EGF, the amount of fluorescence increased and the cell nucleus was observed to be dense. This shows that cell proliferation and differentiation are promoted. In basicFGF, the amount of fluorescence was increased, but the cell nucleus was dispersed. From this, proliferation was activated, but differentiation was not promoted. For TGF-β, the increase in fluorescence was not observed so much. Therefore, it is considered that proliferation was not promoted. In addition, in the region where two cell screening substances are combined, the increase in the amount of fluorescence is not seen in the region where IGF-1 and EGF, which were active in proliferation and differentiation, are suppressed, and proliferation is suppressed. It was. As described above, it has been found that by itself, when an active cell screening substance is combined, an inhibitory effect is expressed.
[0069]
Example 3
(Allergen screening method)
In this example, a substance that can become an allergen is immobilized on a substrate, and when histamine, which is an inflammation-inducing substance produced from the cells when cells collected from the person are cultured on the substrate, the person is quantified. Evaluate whether or not you have an allergic constitution.
[0070]
In this example, a substrate for evaluating whether or not it is allergic to cedar pollen, milk, house dust, and wheat as shown in FIG. In order to be able to diagnose whether allergens develop due to the synergistic effect of a region 12a in which each allergen is independently immobilized and a plurality of allergens, a two-substance immobilization region 12b in which each allergen is immobilized in close proximity. Three substance immobilization regions 12c and four substance immobilization regions 12d were provided.
[0071]
Cedar pollen, house dust, and wheat were sufficiently ground in advance using a homogenizer. And after centrifuging the aqueous solution containing each allergen, it decided to fix | immobilize the melt | dissolution component except a sediment. Subsequently, each allergen solution was diluted with a 50% methanol solution to a concentration of 50 μg / ml and immobilized on a PET film using an ink jet printer by the method described in Example 1. The immobilization pattern was according to FIG. The non-immobilized region was covered with bovine serum albumin so that nonspecific adsorption did not occur.
[0072]
For the cells, blood was collected from the person to be evaluated, blood components were separated by density gradient centrifugation, and allergic reactive cells were taken out.
[0073]
The culture solution was DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), and anti-histamine antibody (rabbit) was added to culture the cells on the substrate.
[0074]
The substrate after the culture was taken out and washed with a phosphate isotonic buffer. After treatment with methanol for 30 minutes and drying, the amount of histamine was quantified from the change in absorbance of o-phenylenediamine by an enzyme antibody method using a horseradish peroxidase-labeled anti-rabbit Ig antibody. As a result, since a large amount of histamine was detected from the region where the substance extracted from house dust was immobilized, this person is considered to be allergic to house dust. In addition, cedar pollen, milk, and wheat are considered negative, but histamine was detected in large amounts in the area where milk and wheat were fixed in close proximity. It turns out that it may develop.
[0075]
Thus, by using this substrate, it is possible to diagnose what is allergic to. In particular, as in this example, allergic reactions to a plurality of allergens can be diagnosed.
Example 4
(Growth / differentiation screening substrate by density of immobilized substance)
We decided to investigate the influence of NGF cells, which are fibroblasts, on cell proliferation by EGF and TGF-β. Based on Example 1, an azide group was previously introduced into each of the two cell growth factors EGF and TGF-β. As the substrate, a PET film was used, and each cell growth factor was discharged onto the substrate according to FIG. 5 so as to have a different density depending on the position of the substrate using an ink jet printer, dried, and then irradiated with ultraviolet rays to be fixed. The ejection amount was controlled by setting the dot density of the drawing data transmitted from the computer connected to the printer in each region. The numbers in FIG. 5 are relative dot densities in the row direction or the column direction of each growth factor. In the region where two numbers intersect, each growth factor is fixed at the dot density set by this number. It shows that.
[0076]
NRK cells were cultured on the substrate thus prepared. For the culture solution, BrdU is added, and it is used in a DMEM medium containing 0.5 wt% FBS. ₂ The cells were cultured at 37 ° C. for 48 hours under a concentration of humid air.
[0077]
After the culture, evaluation was performed using an Amersham Cell proliferation kit. The evaluation results are as shown in Table 1.
[0078]
[Table 1]

[0079]
NRK cells are thought to be proliferated by the action of EGF and TGF-β alone, but the combination of both is considered to produce a growth inhibitory effect. Thus, from the effect of EGF and TGF-β on the cell proliferation of NRK cells, it was found that the culture was preferably carried out in a culture solution in which EGF and TGF-β did not coexist.
[0080]
【The invention's effect】
The cell screening substrate of the present invention can reliably fix a cell screening substance at a desired position in a simple process, and at least cell adhesion, proliferation, differentiation, survival, maintenance of undifferentiated state, cell death, and substance production. Substances that affect one can be screened.
[0081]
According to the cell screening method of the present invention, it is possible to examine the influence of various substances on cells on a single substrate, and to examine the difference in the influence of various substances on various cells. .
[Brief description of the drawings]
1 is an example of a method for producing a cell screening substrate of Example 1. FIG.
2 is an example of a method for arranging cell screening substances on the cell screening substrate of Example 1. FIG.
3 is an example of a method for arranging cell screening substances on the cell screening substrate of Example 2. FIG.
4 is an example of an allergen arrangement method on the allergen screening substrate of Example 3. FIG.
5 is an example of a method for arranging cell screening substances on the screening substrate of Example 4. FIG.
FIG. 6 is an example of a cell screening apparatus according to the present invention.
FIG. 7 is an example of a cell screening substrate manufacturing means of the cell screening apparatus according to the present invention.
[Explanation of symbols]
1 Cell screening substrate
11 Base substrate
12 Cell screening substances
12a Single immobilization area
12b Material immobilization area
12c Material immobilization region
12d Material immobilization area
13 Fine droplet discharge means
15 UV irradiation lamp
121 Insulin immobilization region
122 Basic fibroblast growth factor immobilization region
123 Epidermal growth factor immobilization region
124 Transforming growth factor β immobilization region

Claims

In a cell screening substrate having a region in which a cell screening substance is arranged and fixed on a base by means of a micro droplet ejection means ,
A cell screening substrate, wherein at least two types of cell screening substances selected from extracellular matrix proteins, antibodies and cytokines are immobilized in the region .

The cell screening substrate according to claim 1, wherein the region includes a plurality of regions having different combinations of immobilized cell screening substances.

The cell screening substrate according to claim 1, wherein the region has a plurality of regions having different densities of immobilized cell screening substances.

The cell screening substrate according to claim 1, wherein each region or a group of regions formed from two or more regions is formed in the recess.

Each region, or two or more regions group formed from each region, the cell screening substrate according to claim 1 surrounded by a convex wall-like structure.

Forming a region in which at least two kinds of cell screening substances are arranged close to each other on the base by means of a micro droplet ejection means, and immobilizing the cell screening substance arranged in the region ,
A method for producing a cell screening substrate, wherein the at least two types of cell screening substances are selected from extracellular matrix proteins, antibodies and cytokines .

The method for producing a cell screening substrate according to claim 6, wherein an ejection unit using a thermal ink jet method is used as the minute droplet ejection unit.

The method for producing a cell screening substrate according to claim 6, wherein a discharge means based on a piezo ink jet method is used as the fine droplet discharge means.

The method for producing a cell screening substrate according to any one of claims 6 to 8, further comprising a step of adding energy for fixation from outside to the immobilization step.

A cell screening method using the cell screening substrate according to claim 1, comprising a step of culturing cells in a culture solution in contact with a fixed region of a cell screening substance on the cell screening substrate. A cell screening method characterized by the above.

The culture solution that comes into contact with the fixed region is supplemented with a substance that changes cell growth / differentiation, survival, maintenance of an undifferentiated state, cell death or substance production, a substance that changes adhesion to a substrate , or an indicator . The cell screening method according to claim 10, further comprising the step of:

The cell screening method according to claim 10 or 11, wherein the fixed region is in contact with the flow of the culture solution.

The cell screening method according to claim 10, further comprising a step of observing the morphological change of the cells.

The cell screening method according to claim 13, wherein the cells are stained at the time of evaluation.

The cell screening method according to claim 10, further comprising a step of quantifying a substance synthesized in the cell.

The cell screening method according to any one of claims 10 to 14, further comprising a step of quantifying a substance incorporated into the cell.

The cell screening method according to claim 15 or 16, comprising a step of quantifying the substance by at least one of radiation dose measurement, fluorescence measurement, luminescence measurement, and absorbance measurement.

A cell screening apparatus using the cell screening substrate according to any one of claims 1 to 5, comprising means for culturing cells in a culture solution in contact with a fixed region of a cell screening substance on the cell screening substrate. A cell screening apparatus.

19. The apparatus according to claim 18, further comprising at least one means for evaluating cell shape change by the culture means, a means for quantifying a substance synthesized in the cell, and a means for quantifying a substance taken into the cell. Cell screening device.

Furthermore, the cell screening apparatus of Claim 18 or 19 which has a means to manufacture the said cell screening board | substrate.