JP4375784B2

JP4375784B2 - Method for measuring phosphate esters using catalyst carrier for chemical reaction

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Publication number: JP4375784B2
Application number: JP2003576108A
Authority: JP
Inventors: 哲也春山; 繁哉鈴木
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2003-03-14
Publication date: 2009-12-02
Anticipated expiration: 2023-03-14
Also published as: WO2003078060A1; JPWO2003078060A1

Description

技術分野
本発明は、化学物質の化学反応を触媒する担体及びそれを用いた化学物質の分解方法・測定方法に関する。
背景技術
触媒活性を有する担体の開発は、化学物質の合成、分解等に利用されるばかりではなく、化学物質を検出したり、化学物質の濃度を測定したりするセンサーへ応用できる可能性があり、環境、医学、薬学、臨床検査、バイオ研究等の分野において、非常に重要である。しかしながら、触媒活性を有する担体をセンサー等として応用し、実用化するには、その担体が安定であり、かつ高い活性を有していなければならない。
触媒活性を有する担体として、金属イオンを配位結合させた担体が知られているが、これらの担体は、ポルフィリン環骨格やクラウンエーテル骨格やサイクラム環骨格のように、予め金属イオンが配位する構造が決定している骨格を含むポリマーを使用したものであり、金属イオンの高密度集積が困難であった。また、これら従来の担体は化学反応を触媒する活性が低く、そのため、電気化学的または光学的な検出器と組み合わせても、センサーとして利用することはできなかった。
また、近年、触媒活性が高い担体として、生体触媒である酵素等が注目されているが、これらの酵素等は不安定なものが多く、担体に固定化する際に失活してしまう場合もある。そのため、高い触媒活性を維持した状態でセンサー等に利用するのは非常に難しく、安定でかつ高い触媒活性を有する担体の開発が求められている。
化学物質のうち、一酸化窒素は、酸性雨の原因となると考えられており、環境の分野で重要な物質であると考えられている。また、一酸化窒素は細胞の情報伝達物質のひとつと考えられており、医学、薬学、バイオ研究、医薬品開発、化学安全性評価等の分野において非常に重要な物質である。
現在、一酸化窒素の測定方法には、化学発光法や一酸化窒素を二酸化窒素に変換してからジアゾ反応により測定するグリース法やオキシヘモグロビン法や電子スピン共鳴による方法等があるが、どれも簡便な方法ではなく、特異性にも問題があり、簡便かつ特異性の高い測定方法の開発が求められている。
また、一酸化窒素の情報伝達物質としての働きとして、特定の刺激に応答して細胞から一酸化窒素が放出されることが知られている。例えば、心筋細胞は筋弛緩因子、血管内皮細胞は血管弛緩因子、マクロファージ細胞はアレルギー物質、脳神経細胞は神経撹乱物質の刺激を受けると一酸化窒素を放出する。これら細胞が放出する一酸化窒素を測定することができれば、細胞刺激物質に対する各種細胞の応答性を調べることができる。さらに、これらの細胞を基板上に集積し、細胞チップとして利用することができる。しかしながら、一酸化窒素は細胞から放出されるとすぐに二酸化窒素に変化してしまうため、従来の方法では正確に一酸化窒素の量を測定することは困難であった。また、センサーの検出部表面に、直接、細胞を培養することが可能になれば、細胞が放出する一酸化窒素を瞬時に測定できるが、従来の方法では、センサー検出部表面での細胞培養は非常に困難であったため、細胞が放出する一酸化窒素を測定することはできなかった。
化学物質のうち、リン酸エステル類には、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等のヌクレオチド、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸、グリセロールリン酸、グルコースリン酸等の代謝中間物質等、生体内において重要な役割を担っている物質が多く存在し、それらを測定することは、環境、医学、臨床検査、食品衛生、バイオ研究の分野において非常に重要である。
特に、ピロリン酸は、遺伝子診断等においてＤＮＡポリメラーゼ反応の反応量を示す指標となっており、それらを簡便に測定する方法の開発が求められている。ピロリン酸の検出方法としては、カルシウムやマグネシウムイオンとの沈殿反応や酵素を組み合わせた発色、発光反応を用いて測定する方法等があるが感度が低い。したがって、ＤＮＡの伸張を確かめるには、前処理としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行わなければならず、作業が複雑であり、検出装置の自動化や連続モニタリング化には適した方法ではなかった。
また、リン酸エステル類は、微生物や食物残渣等の汚れにも多く含まれているので、食品工場や厨房等における汚染度の指標としても適している。現在、汚染度の検査の指標には、タンパク質、糖、ＡＴＰ等が用いられているが、タンパク質、糖は感度が不十分であり、タンパク質、糖をほとんど含まない汚れも多く存在する。一方、ＡＴＰは微生物や食品残渣等に広く存在する物質であり、発光酵素のルシフェラーゼとその発光基質のルシフェリンを用いて高感度に検出できるので、汚染度の指標として適している。しかしながら、ルシフェラーゼやルシフェリンは高価であり、その測定には高価な検出器が必要であるという問題点があり、微生物や食品残渣に広く存在する指標を用い、かつ低コストな測定方法が求められている。リン酸エステル類を指標にした場合、ＡＴＰ以外のリン酸エステル類も検出できるため高感度化できるが、リン酸エステル類を幅広く、簡便に測定できる安価な測定方法はない。
化学物質のうち、テトラエチルピロリン酸等、有機リン系農薬もリン酸エステルを含んでいる。また、パラチオン、マラチオン等有機リン系農薬等もリン酸エステルに類似した構造であり、これらの有機リン系農薬も検査対象として非常に重要な物質であり、それらを測定する方法やセンサーは非常に有用であると言える。現在は、ガスクロマトグラフィや液体クロマトグラフィ等を用いて測定されるが、高価で大掛かりな装置が必要であり、安価で簡便なセンサー、測定方法の開発が求められている。
発明の開示
本発明の課題は、高い化学物質触媒活性を有する安定な担体を提供するとともに、この担体を利用した化学物質の分解方法・測定方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題について鋭意研究を重ねた結果、金属イオンを配位することにより構造が決定するポリマー、金属イオン、金属イオンを保持する機能を有するポリマー、電子吸引性の官能基を有するポリマーとを組み合わせることにより、化学物質の分解反応を触媒する担体が得られること、また、これらの担体を利用することにより特定の化学物質を分解できること、さらに特定の化学物質を測定できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下の方法に関する。
（１）金属イオンを保持する機能を有するポリマーと、銅イオンと、電子吸引性の官能基を有するポリマーとを含む化学反応触媒担体を用いるリン酸エステル類の測定方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．金属イオンを配位することにより構造が決定するポリマーと、金属イオンとを含み、化学物質の化学反応を触媒する担体
本発明の担体に含まれる金属イオンとしては、マグネシウムイオンや亜鉛イオン、チタニウムイオン等の典型金属イオンや鉄イオンやニッケルイオンやマンガンイオン等の遷移金属イオンが挙げられるが、その種類や荷電数を限定するものではない。金属イオンの種類を変えることにより、触媒活性の基質特異性を変えることができることが本発明の大きな特徴であり、例えば、鉄イオンを用いることにより一酸化窒素の分解を触媒することが可能となり、銅イオンを用いることによりリン酸エステル類の分解を触媒することが可能になる。
本発明の担体に含まれるポリマーとは、単量体が二以上重合反応させて得られる高分子化合物であればよく、単量体の種類や重合している分子数を問わない。また、一つのポリマーに単量体が一種類の場合だけでなく、二種類以上であるものも含まれる。ポリマーの種類を変えることにより、ポリマーの粘度や強度等を自由に変えることができ、用途にあわせたポリマーを選択することが可能になる。
金属イオンと配位することにより構造が決定するポリマーとは、ポリマー内に含まれる複数の配位子が金属イオンを中心に配位結合することにより、金属イオンを保持し、錯体構造が決定するポリマーを意味するものである。より詳細に説明すると、主鎖及び／又は側鎖に複数の配位子を有するポリマーであって、金属イオンが存在すると該配位子が金属イオンに配位可能なようにポリマー鎖のコンホメーション・立体構造が変化し、このようにしてポリマー鎖が変化することによりその錯体構造が決定・保持されるようなものをいう。よって、ポルフィリン環骨格やクラウンエーテル骨格やサイクラム環骨格等のように、金属イオンが配位する構造（例えば、空孔を有する環構造等）が予め決定又は固定された骨格を持つポリマーは含まれない。このような金属イオンと配位することにより構造が決定するポリマーは、該ポリマーの主鎖及び／又は側鎖に金属イオンと親和性のある官能基を含んでおり、金属イオンと親和性のある官能基として、チエニル基、テニル基、テノイル基、ピリジル基、ピペリジノ基、ピペリジル基、キノリル基、ピリダジル基、イミダゾール基、ピラゾール基、ピラジン基、ピリダジン基等の複素環、その他アミノ基、水酸基、メルカプト基及びカルボキシル基（カルボン酸イオン）等が挙げられるが、これら以外にも数多く存在し、その種類は限定されない。金属イオンと配位することにより構造が決定するポリマーは、金属イオンを中心として、高配位数の錯体構造を形成し、極めて密な構造を形成することができる。この高密度な集積により、高い触媒活性を獲得することができる。このような金属イオンと配位することにより構造が決定するポリマーとして、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリシステイン、ポリピリジン、ポリピリミジン、ポリチオフェン、ポリピロール等及びこれらの２種以上の共重合体等が挙げられるが、その種類を限定されるものではなく、用途に適したポリマーを選択することができる。
本発明の担体は、ポリマーと金属イオンを混合することにより、容易に作製することができる。ポリマーと金属イオンを混合する方法としては、例えば、試験管等に入れてボルテックスミキサーで混和する方法や、ビーカー等に入れて攪拌子と攪拌装置等を用いて混和する方法が挙げられるが、ポリマーと金属イオンとが接触していれば良く、ここで挙げた方法に限定されない。分子量、ポリマー全体に対する官能基の密度、官能基の種類等ポリマーの種類やポリマーの濃度、金属イオンの種類、濃度等を変えることにより、担体の基質特異性、触媒活性の強さ、担体の強度、粘度等自由に変えることができ、用途に合わせた担体の設計を自由に行うことが可能である。
本発明の担体が触媒する化学物質としては、一酸化窒素、リン酸エステル類が挙げられるが、その種類は限定されない。本発明の担体は、ポリマーと金属イオンの組み合わせを変えることにより、触媒の対象となる化学物質を変えることができる。
２．金属イオンを保持する機能を有するポリマーと、金属イオンと、電子吸引性の官能基を有するポリマーとを含み、化学物質の化学反応を触媒する担体
本発明の担体に含まれる金属イオンを保持する機能を有するポリマーとは、ポリマー内もしくはポリマー表面に金属イオンを留めておくことができるポリマーであり、上述の金属イオンと配位することにより構造が決定するポリマーのほかに、ポルフィリン環骨格やクラウンエーテル骨格やサイクラム環骨格等、金属イオンが配位する構造が予め決定された骨格を持つポリマーも含まれる。金属イオンを保持する結合の様式は配位結合が好ましいが、配位結合以外の結合でもよい。
本発明の担体に含まれる電子吸引性の官能基を有するポリマーのうち電子吸引性の官能基とは、分子内で水素を標準としたとき、他の電子を引きつける傾向がある官能基であり、ニトロ基、ニトリル基、シアノ基、アンモニオ基、アルデヒド基、カルボニル基、カルボキシル基、エトキシカルボニル基、スルホン基、メタンスルホニル基、トリクロロメチル基、トリフルオロメチル基等が挙げられるが、そのほかにも数多く存在し、その種類を問わない。
本発明の担体に含まれる電子吸引性の官能基を有するポリマーとしては、ポリスチレンスルホン酸、ポリスチレンアクリロニトリル、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン及びポリマレイン酸等及びこれらの２種以上の共重合体等が挙げられるが、その種類を限定されるものではなく、用途に適したポリマーを選択することができる。
本発明の担体に含まれる電子吸引性の官能基を有するポリマーと金属イオンを保持する機能を有するポリマーとは、異なるポリマーであることが好ましいが、電子吸引性の官能基と金属イオンを保持する機能を同時に有するポリマーを単独で用いてもよい。また、電子吸引性の官能基が金属イオンを保持する機能を同時に有するものでもよい。
本発明の担体は、ポリマーと金属イオンを混合することにより、容易に作製することができる。まず、金属イオンを保持する機能を有するポリマーと金属イオンを混和し、予め金属イオンを保持させ、その後、電子吸引性の官能基を有するポリマーを添加することにより、金属イオンが高密度に集積した安定なポリマーを作製することができるが、混合する順序は限定されない。ポリマーと金属イオンを混合する方法としては、例えば、試験管等に入れてボルテックスミキサーで混和する方法や、ビーカー等に入れて攪拌子と攪拌装置等を用いて混和する方法が挙げられるが、ポリマーと金属イオンとが接触していれば良く、ここで挙げた方法に限定されない。分子量、ポリマー全体に対する官能基の密度、官能基の種類等ポリマーの種類やポリマーの濃度、混合するポリマーの比率、金属イオンの種類、濃度等を変えることにより、担体の基質特異性、触媒活性の強さ、担体の強度、粘度、担体全体の電荷等自由に変えることができ、用途に合わせた担体の設計を自由に行うことが可能である。特に、担体全体の電荷の微調整については、金属を保持する機能を有するポリマーと電子吸引性の官能基を有するポリマーの混合比を調整することにより、容易に変えることができる。これにより、対象となる化学物質が担体に接近しやすくしたり、また対象となる化学物質以外の夾雑物質の接近を抑制したりすることが可能になり、担体の基質特異性を制御することが可能となる。
また、担体全体の電荷調整が容易であることから、担体を細胞培養に適した電荷に調整するができ、担体表面での細胞培養が可能になり、センサーの検出部と密接した状態で細胞培養が可能になる。これにより、特に、細胞が放出する化学物質が一酸化窒素やドーパミン等のように分解されやすい物質である場合でも、これらをより正確に検出することができる。
３．本発明の担体を用いる化学物質の分解方法
本発明の担体を用いる化学物質の分解方法としては、例えば、化学物質を含む測定試料と担体とを溶液中で接触させて反応させる方法や、フィルター等に固定化した担体に試料を接触させる方法などが挙げられるが、本発明の担体と化学物質とが接触した状態であればよく、また、基質となる化学物質は気体内、溶液内どちらに存在していてもよい。
本発明の担体を用いる化学物質の分解方法においては、担体に含まれるポリマーと金属イオンの組み合わせを変えることにより、分解対象となる化学物質を自由に変えることが可能である。例えば、金属イオンとして鉄イオンを用いることにより一酸化窒素を分解することができ、銅イオンを用いることによりリン酸エステル類を分解することができる。
本発明の分解方法は、測定試料を回収する必要がある場合に、遠心分離等することにより簡単に担体と分けることができ、試料の回収が可能である。
また、本発明の担体をフィルター等に固定化し、それに試料を通すことにより、効率よく化学物質を分解することが可能となる。そのため、空気清浄機やエアコン等のフィルターに担体を固定化することにより、空気の浄化を行うことも可能である。
本発明の分解方法は、化学物質の測定における前処理として測定試薬等、測定系に含まれる試薬ブランクの原因となる化学物質の分解に利用することができ、測定感度を高くすることができる。例えば、ＡＴＰを測定するためのルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬の場合、ＡＴＰが試薬中に混入していると試薬ブランクが高くなり、測定感度が低くなる。この場合、試薬中のＡＴＰを分解する目的で、リン酸エステル類を分解する担体を用いることができる。また、本発明の分解方法は、遠心分離等により担体を別回収することが可能であるため、化学物質の測定時に影響を与えないで試薬ブランクを下げることが可能となる。
さらに、本発明の分解方法に用いられる担体は、化学反応における励起状態を引き下げることが可能であるため、測定試料中の化学物質の濃度、ｐＨ、温度等の反応条件を最適化すれば、化学物質の分解だけでなく、合成も可能になる。
４．本発明の担体を用いる化学物質の測定（検出）方法
本発明の担体を用いる化学物質の測定方法における検出装置としては、電気化学的または光学的な検出装置を用いることが好ましいが、その検出装置は限定されない。
電気化学的な検出装置としては、電気化学測定装置や簡易化した電気回路を用いた装置等が挙げられる。また、光学的な検出装置としては、比色計、発光光度計、蛍光光度計、吸光光度計、ラマン光光度計等の装置等が挙げられる。また、光学的な検出装置としては、目視による確認も含まれる。いずれの装置も、電気化学的または光学的に検出できれば良く、限定されない。
電気化学測定装置を用いた測定としては、電極表面等に本発明の担体を展開し、試料中で二電極系あるいは三電極系を形成させ、定電位を印加した場合の電流値を測定する方法が挙げられる。
また、本発明の担体と酸化還元系発色色素と組み合わせることにより、吸光光度計や目視による測定も可能になる。例えば、試験管等に入った試料に本発明の担体と酸化還元系発色色素を加え、攪拌する。その後、遠心分離装置を用いて、担体と試料により発色した発色色素を分離し、目視あるいは吸光光度計を用いて測定する方法等がある。
測定対象となる化学物質は、ポリマーと金属イオンの組み合わせを変えることにより変えることが可能である。例えば、金属イオンとして鉄イオンを用いた場合は、測定対象となる化学物質は一酸化窒素となり、銅イオンを用いた場合は、リン酸エステル類となる。
試料を測定する場合、測定対象以外の夾雑物質が含まれる場合が多い。これら夾雑物質は酵素的または電気化学的に検出されない物質に分解したり、担体全体の電荷を調整して夾雑物質の接近を抑制したり、イオン交換膜や分子ふるい膜等の選択層を追加して標的物質への選択性を高めたりすることにより、基質特異性を高めることが可能である。
５．本発明の化学物質の測定方法による一酸化窒素の測定
一酸化窒素を測定する場合、金属イオンとして鉄イオンを用いる。測定対象である一酸化窒素は、気体中、溶液中のどちらに存在しても測定することができる。
本発明の化学物質の測定方法においては、酸性雨の原因物質となる大気中の一酸化窒素を測定することができる。また、溶液中に含まれる一酸化窒素の測定にも用いることができる。さらに、細胞が放出する一酸化窒素の測定に用いることができる。
細胞が放出する一酸化窒素の測定は、以下のように行う。まず、電気化学測定装置の電極表面に一酸化窒素分解活性を有する担体を集積させる。担体全体の電荷は、細胞が吸着し、かつ細胞が生育できる電荷に調整する。その表面に、心筋細胞、血管内皮細胞、マクロファージ細胞、脳神経細胞等、細胞刺激物質に応答して一酸化窒素を放出する細胞を培養し、細胞チップを作製する。次に、筋弛緩因子、血管弛緩因子、アレルギー物質、神経撹乱物質等の細胞刺激物質を添加し、放出された一酸化窒素に伴う電流値を測定する。これにより、細胞刺激因子に対する各種細胞の応答性を調べることができる。
６．本発明の化学物質の測定方法によるリン酸エステル類の測定
本発明の測定対象となる化学物質のうちリン酸エステル類とは、リン酸とアルコール性ヒドロキシル基とのエステル結合を含む化合物であり、エステル結合の数、エステル結合以外の分子構造等を問うものではない。また、リン酸エステル部分の酸素原子が硫黄原子に置き換わった物質等リン酸エステル結合に類似した物質も測定対象になる。ピロリン酸等のポリリン酸類、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）等のアデノシンリン酸エステル類、そのほかのヌクレオチド類、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸類、グルコース６−リン酸、リン脂質、有機リン系農薬等が測定対象として挙げられる。
リン酸エステル類を測定する場合、金属イオンとして銅イオンを用いる。
測定試料中には、測定対象以外のリン酸エステル類が夾雑しているが、夾雑物質を酵素的な手法や電気化学的な手法を用いる等して検出されない物質に分解することにより、特定のリン酸エステル類を選択的に測定することができる。また、担体全体の電荷を調整して夾雑物質の接近を抑制したり、担体表面に分子選択層を追加したりすることにより、選択性が高めることができる。
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、ＤＮＡのポリメラーゼ反応の生成物であるピロリン酸を指標に、ポリメラーゼ反応の反応量を測定する場合、ＤＮＡや未反応のデオキシヌクレオチド等のリン酸エステル類が夾雑している。このような場合、前処理として、試料中のＤＮＡを核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）により、デオキシヌクレオチドをアピラーゼ等デオキシヌクレオチド脱リン酸酵素により分解し、測定に影響がない程度に下げることができる。また、試料をイオン交換樹脂や分子ふるい樹脂等で処理することにより、ＤＮＡやデオキシヌクレオチドを除去し、測定に影響がないレベルに抑えることができる。あるいは、イオン交換膜や分子ふるい膜等の分子選択層で担体表面を被覆することにより、ピロリン酸以外の物質の担体表面への接近を防ぎ、測定に影響がないレベルに抑えることができる。
リン酸エステル類は、細胞中にも多く含まれており、細胞中に含まれるこれらリン酸エステル類の量を測定することにより、試料中の細胞数を推定することができる。
試料中の細胞数を推定する方法を以下に示す。
（１）トリクロロ酢酸、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等を用いて細胞内のリン酸エステル類を抽出した試料を調製する。
（２）（１）で調製した試料中のリン酸エステル類の量を、リン酸エステル類分解活性を有する触媒担体を展開した電極を用いて電気化学的な手法で測定する。あるいは、リン酸エステル類分解活性を有する触媒担体と酸化還元系発色試薬を共存させた試薬と（１）で調製した試料を反応させることにより、試料中のリン酸エステル類の量を、目視や吸光光度計等光学的な手法で測定する。
（３）（２）で測定したリン酸エステル類の値から、試料中の細胞数を推定する。
また、細胞表面のリン脂質を指標とする場合には、トリクロロ酢酸等により細胞内のリン酸エステル類を抽出する必要はなく、細胞が生きた状態で測定することができる。そのため、試料中の細胞数を推定した後に、食中毒菌等細胞の種類を同定することも可能である。
さらに、より正確に細胞数を測定するためには、測定試料を細胞の捕捉が可能な口径のろ過フィルターでろ過し、フィルター上に細胞を捕捉し、捕捉された細胞数を計測することができる。
捕捉した細胞を検出する方法の例として、一辺５０μｍ程度の電極が束状になったマイクロアレイ電極にリン酸エステル類分解活性を有する担体を集積したリン酸エステル類センサーを作製し、細胞を捕捉したフィルターをそのマイクロアレイリン酸エステル類センサー上にのせ、細胞中のリン酸エステル類を検出し、規定値以上の電流が流れた電極数を細胞数とみなす方法が挙げられる。あるいは、酸化還元系色素とリン酸エステル類用触媒担体を組み合わせた発色試薬を用いて、細胞中、細胞表面のリン酸エステル類を発色させて、その発色点の数を細胞数とみなす方法も挙げられる。
抗体を用いることにより、食中毒菌等特定細胞を特異的に検出することができる。例えば、一辺５０μｍ程度の電極が束状になったマイクロアレイ電極にリン酸エステル類分解活性を有する担体と標的細胞に特異的に結合する抗体を集積したリン酸エステル類センサーを作製し、それに試料液体を流し、標的細胞を捕捉し、細胞表面のリン脂質のリン酸エステル類を検出することにより、検出された電極数を細胞の個数とみなすことができる。
リン酸エステル類測定方法は、食品工場や厨房等における汚染度検査にも応用することができる。リン酸エステル類は食物残渣や微生物等の汚染原因物質にも広く含まれる。これら汚染原因物質中のリン酸エステル類を測定することにより、検査箇所の汚染度検査が可能になる。
例えば、検査箇所を綿棒、スタンプ等でふき取り、それを酸化還元系発色試薬と本発明の触媒担体を混合した試薬に懸濁し、遠心後上清の発色量を吸光度計や目視により光学的に測定し、汚染度を検査できる。あるいは、ふき取った綿棒等を水や生理的食塩水や緩衝液等に懸濁し、その溶液にリン酸エステル類分解活性を有する触媒担体を用いた電気化学的リン酸エステル類センサーの検出部を入れたり、検出部に溶液を滴下したりして、その電流値を測定することにより、汚染度を検査できる。
リン酸エステル類測定方法を用いて、食物等に残留した有機リン系農薬を測定することもできる。本発明において測定可能な有機リン酸系の農薬としては、リン酸エステルを含むテトラエチルピロリン酸が挙げられ、また、酸素原子が硫黄に置き換わったリン酸エステル類似構造を含むパラチオンやマラチオン等が挙げられる。
有機リン系農薬の検出方法としては、例えば、農作物の検体をストマッキング処理等により均一化したり、表面を水ですすいだりして調製した試料を、リン酸エステル類センサーを用いて、簡便かつ迅速に測定する方法が挙げられる。
本明細書は本願の優先権の基礎である特願２００２−７３１５０号の明細書に記載される内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
次に、以下実施例および参考例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔参考例１〕（ＡＴＰを分解する例）
終濃度４０ｍＭ塩酸水溶液に２００ｍＭＣｕＣｌ_２を溶解し、その後、溶液をＮａＯＨ溶液にて中和しながら２０ｍＭポリヒスチジン（シグマ社製）を添加した。これを２５℃にて一昼夜ボルテックスミキサーを用いて攪拌した後、２０ｍＭポリスチレンスルホン酸（アルドリッチ社製）を添加し、攪拌溶解した。その結果沈殿する金属イオンとポリマーを含む担体を、触媒担体として用いた。
この担体を含む溶液を遠心分離し得られた沈殿物を２０ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ／ＮａＯＨ緩衝液に溶解して使用した。十分攪拌して均一化した担体溶液と１０μＭＡＴＰ溶液を１：１の割合で混合し、ボルテックスミキサーを用いて攪拌しながら、分解を行った。また、上記のＣｕＣｌ_２のかわりにＦｅＣｌ_３、ＺｎＣｌ_２、ＮｉＣｌ_２を用いて得られた担体を使用して同様にＡＴＰの分解を行った。
ＡＴＰ濃度の測定は、上記分解反応液を遠心することにより、担体とＡＴＰ溶液を分離したのち、上清のＡＴＰ溶液の濃度をルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬（ルシフェール２５０、キッコーマン社製）により測定した。
その結果、図１に示すように、ＣｕＣｌ_２の場合は２分でＡＴＰが１００％分解したが、それ以外の金属イオンを用いて得られた担体を使用した場合では分解量は５〜４０％であった。ＣｕＣｌ_２を用いて得られた担体を用いることにより、効率的にＡＴＰを分解できることが明らかになった。
〔参考例２〕（電気化学的センサーを用いて一酸化窒素を測定する例）
終濃度４０ｍＭ塩酸水溶液に２００ｍＭＦｅＣｌ_３を溶解し、その後、溶液をＮａＯＨ溶液にて中和しながら２０ｍＭポリヒスチジン（シグマ社製）を添加した。これを２５℃にて一昼夜ボルテックスミキサーを用いて攪拌した後、２０ｍＭポリスチレンスルホン酸（アルドリッチ社製）を添加し、攪拌溶解した。その結果沈殿する金属イオンとポリマーを含む担体を、触媒担体として用いた。この担体を含む溶液をディスク型電極（電極径５ｍｍ）に滴下した後、風乾し、一酸化窒素センサー電極として用いた。
水溶液溶存一酸化窒素は、電気化学測定装置（北斗電工社製、型番ＨＺ−３０００）を用いて、１００ｍＶの定電位を印加して、上記一酸化窒素センサー電極に対極、参照極を加えた三電極系で測定した。０〜０．１ｍＭの各濃度の一酸化窒素水溶液に上記一酸化窒素センサーを浸漬し、電流値測定した。
その結果、図２に示すのように一酸化窒素量に依存した電流値の変化が見られた。
〔参考例３〕（細胞チップ集積した培養細胞が産生する一酸化窒素を測定する例）
終濃度４０ｍＭ塩酸水溶液に２００ｍＭＦｅＣｌ_３を溶解し、その後、溶液をＮａＯＨ溶液にて中和しながら２０ｍＭポリヒスチジン（シグマ社製）を添加した。これを２５℃にて一昼夜ボルテックスミキサーを用いて攪拌した後、２０ｍＭポリスチレンスルホン酸（アルドリッチ社製）を添加し、攪拌溶解した。その結果沈殿する金属イオンとポリマーを含む担体を、触媒担体として用いた。この担体を底面が金属薄膜でコートされた培養ディッシュ面に展開し、風乾することにより膜化した。これに対極、参照極を加え三電極系とし、一酸化窒素検出細胞チップ（以下、細胞チップという。図３に示す。）として用いた。細胞チップをアルコール噴霧により滅菌処理した後、細胞チップ上で直接血管内皮細胞を培養した細胞チップを作製した。培養ディッシュ内に血管弛緩因子を細胞に添加し、そのときの電流値を連続的に測定した。
その結果、図４に示すように、血管弛緩因子に応答して細胞が一酸化窒素を産生する挙動が連続的に測定できた。
〔実施例１〕（電気化学的センサーを用いてＡＴＰ、ＡＤＰを測定する例）
終濃度４０ｍＭ塩酸水溶液に２００ｍＭＣｕＣｌ_２を溶解し、その後、溶液をＮａＯＨ溶液にて中和しながら２０ｍＭポリヒスチジン（シグマ社製）を添加した。これを２５℃にて一昼夜ボルテックスミキサーを用いて攪拌した後、２０ｍＭポリスチレンスルホン酸（アルドリッチ社製）を添加し、攪拌溶解した。その結果沈殿する金属イオンとポリマーを含む担体を、触媒担体として用いた。この担体を含む溶液をディスク型電極（電極径５ｍｍ）に滴下し多後、風乾し、ＡＴＰ、ＡＤＰ測定用センサー電極として用いた。
ＡＴＰ、ＡＤＰは、電気化学測定装置（北斗電工社製、型番ＨＺ−３０００）を用いて、１００ｍＶの定電位を印加して、上記一酸化ＡＴＰ、ＡＤＰセンサー電極に対極、参照極を加えた三電極系で測定した。０〜２００ｍＭの各濃度のＡＴＰ、ＡＤＰ水溶液に上記ＡＴＰ、ＡＤＰセンサーを浸漬し、電流値測定した。
その結果、図５、図６に示すようにＡＴＰ、ＡＤＰ量に依存した電流値が得られた。
〔実施例２〕（電気化学的センサーを用いてピロリン酸を測定する例）
終濃度４０ｍＭ塩酸水溶液に２００ｍＭＣｕＣｌ_２を溶解し、その後、溶液をＮａＯＨ溶液にて中和しながら２０ｍＭポリヒスチジン（シグマ社製）を添加した。これを２５℃にて一昼夜ボルテックスミキサーを用いて攪拌した後、２０ｍＭポリスチレンスルホン酸（アルドリッチ社製）を添加し、攪拌溶解した。その結果沈殿する金属イオンとポリマーを含む担体を、触媒担体として用いた。
この担体を含む溶液をディスク型電極（電極径５ｍｍ）に滴下した後、風乾し、ピロリン酸測定用センサー電極として用いた。
ピロリン酸は、電気化学測定装置（北斗電工社製、型番ＨＺ−３０００）を用いて、１００ｍＶの定電位を印加して、上記ピロリン酸センサー電極に対極、参照極を加えた三電極系で測定した。０〜２００ｍＭの各濃度のピロリン酸水溶液に上記ピロリン酸センサーを浸漬し、電流値を測定した。
その結果、図７に示すようにピロリン酸量に依存した電流値が得られた。
〔参考例４〕（電子吸引性官能基（ベンゼンスルホン基）の導入効果を示す実験）
ポリマーを作製する際、電子吸引性の官能基として、側鎖に電子吸引性がより強いスルホン基が結合したベンゼンスルホン基と比較的吸引性の弱いカルボキシル基を各比率で導入した以下の（１）〜（４）のポリマーを用いた。
（１）ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム）（ｐｏｌｙ（ｓｏｄｉｕｍ−４−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ））（アルドリッチ製）（ベンゼンスルホン基１００％、カルボキシル基０％）
（２）ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸−マレイン酸）共重合体ナトリウム塩（ｐｏｌｙ（４−ｓｔｙｒｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ−ｃｏ−ｍａｌｅｉｃａｃｉｄ）ｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ）（スチレン／マレイン酸モル比３：１）（アルドリッチ製）（ベンゼンスルホン基６０％、カルボキシル基４０％）
（３）ポリ（ｐ−スチレンスルホン酸−マレイン酸）共重合体ナトリウム塩（ｐｏｌｙ（４−ｓｔｙｒｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ−ｃｏ−ｍａｌｅｉｃａｃｉｄ）ｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ）（スチレン／マレイン酸モル比１：１）（アルドリッチ製）（ベンゼンスルホン基３３％、カルボキシル基６７％）
（４）ポリマレイン酸（ｐｏｌｙ（ａｃｙｌｉｃａｃｉｄ）（アルドリッチ製）（ベンゼンスルホン基０％、カルボキシル基１００％））
終濃度４０ｍＭ塩酸水溶液に２００ｍＭＦｅＣｌ_３を溶解し、その後、溶液をＮａＯＨ溶液にて中和しながら２０ｍＭポリヒスチジン（シグマ社製）を添加した。これを２５℃にて一昼夜ボルテックスミキサーを用いて攪拌した。上記（１）〜（４）のポリマーをそれぞれ添加し、攪拌溶解した。その結果沈殿する金属イオンとポリマーを含む担体を、触媒担体として用いた。この担体を含む溶液をディスク型電極（電極径５ｍｍ）に滴下した後、風乾して一酸化窒素センサー電極として用いた。
水溶液溶存一酸化窒素は、電気化学測定装置（北斗電工社製、型番ＨＺ−３０００）を用いて、１００ｍＶの定電位を印加して、上記一酸化窒素センサー電極に対極、参照極を加えた三電極系で測定した。２ｍＭの各濃度の一酸化窒素水溶液に上記一酸化窒素センサーを浸漬して電流値を測定した。得られた電流値からベース電流値（ＮＯの無い環境での電流値）を差し引いた値を応答電流とし、ベンゼンスルホン基の導入率が０％の応答電流を１００％とし、それぞれ示した。その結果を図８に示す。
図８に示されるように、カルボキシル基よりも電子吸引性が強いベンゼンスルホン基がより多いほど、得られる応答電流が増大することが明らかになった。この結果から、本発明において、より電子吸引性が強い官能基を多く導入することにより、応答電流を増幅させる効果があると言える。また、ベンゼンスルホン基の導入により、分子環境が疎水的になることにより、よりＮＯが反応しやすい環境になり、触媒効率を上げることによる応答電流増大効果も考えられる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、金属イオンと配位することにより構造が決定するポリマーと、金属イオンを組み合わせた担体により、金属イオンの高密度集積が可能になり、安定で、かつ高い触媒活性を有する担体を得ることができる。また、金属イオンを保持する機能を有するポリマーと金属イオンと電子吸引性の官能基を持つポリマーを組み合わせた担体により、金属イオンの酸化還元電位を下げることが可能になり、安定で、かつ高い触媒活性を有する担体を得ることことができる。さらに、本発明で得られる担体は、金属イオンを変えることにより基質に対する特異性を変えることが可能となり、様々な化学物質の分解反応を触媒することができる。そのため、広い分野において利用できる化学物質の分解方法を提供することが可能となり、様々な化学物質を分解することができる。また、本発明で得られる担体を電気化学的または光学的な検出系と組み合わせることにより、様々な化学物質を測定することが可能になる。これにより、広い分野において利用可能なセンサーを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、リン酸エステル類分解活性を触媒する担体を用いた時のＡＴＰの分解率を示すグラフである。
図２は、一酸化窒素濃度と応答電流値を示すグラフである。
図３は、一酸化窒素分解活性を触媒する担体を用いた細胞チップを示す概略図である。なお、対極、参照極は図中より省略してある。
図４は、細胞チップに細胞刺激物質を添加した時の応答電流の経時的変化を示すグラフである。図中の（Ａ）の時点で薬剤を添加した。図中、（ａ）は２５０μＭ量の血管拡張剤を添加した場合であり、（ｂ）は１００μＭ量の血管拡張剤を添加した場合であり、（ｃ）は何も添加していない場合である。
図５は、各ＡＴＰ濃度におけるリン酸エステル類センサーの応答電流値を示すグラフである。
図６は、各ＡＤＰ濃度におけるリン酸エステル類センサーの応答電流値を示すグラフである。
図７は、各ピロリン酸濃度におけるリン酸エステル類センサーの応答電流値を示すグラフである。
図８は、ベンゼンスルホン基の導入率と応答電流との関係を示す図である。  Technical field
  The present invention relates to a carrier that catalyzes a chemical reaction of a chemical substance, and a chemical substance decomposition method and measurement method using the same.
Background art
  The development of a carrier having catalytic activity is not only used for the synthesis and decomposition of chemical substances, but may also be applied to sensors that detect chemical substances and measure the concentration of chemical substances. It is very important in the fields of medicine, pharmacy, clinical testing, bioresearch and so on. However, in order to apply a carrier having catalytic activity as a sensor and put it to practical use, the carrier must be stable and have high activity.
  As a carrier having catalytic activity, a carrier in which a metal ion is coordinated is known, and these carriers are previously coordinated with a metal ion like a porphyrin ring skeleton, a crown ether skeleton, or a cyclam ring skeleton. A polymer containing a skeleton whose structure is determined is used, and it is difficult to accumulate metal ions at high density. In addition, these conventional carriers have low activity for catalyzing chemical reactions, and therefore cannot be used as sensors even in combination with electrochemical or optical detectors.
  In recent years, enzymes that are biocatalysts have attracted attention as carriers having high catalytic activity. However, these enzymes are often unstable and may be deactivated when immobilized on carriers. is there. Therefore, it is very difficult to use for a sensor or the like while maintaining high catalytic activity, and there is a demand for the development of a carrier that is stable and has high catalytic activity.
  Among chemical substances, nitric oxide is considered to cause acid rain and is considered to be an important substance in the field of the environment. Nitric oxide is considered to be one of the cell signaling substances and is a very important substance in fields such as medicine, pharmacy, bioresearch, drug development, and chemical safety evaluation.
  Currently, methods for measuring nitric oxide include the chemiluminescence method, the grease method in which nitric oxide is converted to nitrogen dioxide, and then the diazo reaction, the oxyhemoglobin method, and the electron spin resonance method. There is a problem in specificity, not a simple method, and there is a demand for the development of a simple and highly specific measurement method.
  In addition, it is known that nitric oxide is released from cells in response to specific stimuli as a function of nitric oxide as an information transmitter. For example, cardiac muscle cells release muscle monoxide, vascular endothelial cells release vascular relaxing factors, macrophage cells release allergens, and brain neurons release nitric oxide when stimulated by nerve disruptors. If the nitric oxide released by these cells can be measured, the responsiveness of various cells to the cell stimulating substance can be examined. Furthermore, these cells can be integrated on a substrate and used as a cell chip. However, since nitric oxide is converted into nitrogen dioxide as soon as it is released from the cells, it has been difficult to accurately measure the amount of nitric oxide by the conventional method. In addition, if cells can be cultured directly on the sensor detection surface, the nitric oxide released by the cells can be measured instantaneously. However, with conventional methods, cell culture on the sensor detection surface is not possible. Due to the difficulty, it was not possible to measure the nitric oxide released by the cells.
  Among chemical substances, phosphate esters include nucleotides such as adenosine triphosphate (ATP), nucleic acids such as deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA), and metabolic intermediates such as glycerol phosphate and glucose phosphate. There are many substances that play an important role in the living body, and it is very important to measure them in the fields of environment, medicine, clinical examination, food hygiene, and bioresearch.
  In particular, pyrophosphate is an index indicating the reaction amount of a DNA polymerase reaction in genetic diagnosis and the like, and development of a method for simply measuring them is required. As methods for detecting pyrophosphoric acid, there are methods such as a precipitation reaction with calcium and magnesium ions, a color development combined with an enzyme, and a measurement using a luminescence reaction, but the sensitivity is low. Therefore, in order to confirm the extension of the DNA, the polymerase chain reaction (PCR) must be performed as a pretreatment, and the work is complicated, which is not a suitable method for automation of the detection apparatus or continuous monitoring.
  In addition, since the phosphate esters are contained in a large amount in dirt such as microorganisms and food residues, they are also suitable as an index of the degree of contamination in food factories and kitchens. Currently, proteins, sugars, ATP, and the like are used as indicators for inspection of the degree of contamination. However, proteins and sugars have insufficient sensitivity, and there are many stains that hardly contain proteins and sugars. On the other hand, ATP is a substance widely present in microorganisms, food residues, and the like, and can be detected with high sensitivity using luciferase, a luminescent enzyme, and luciferin, a luminescent substrate, and thus is suitable as an indicator of the degree of contamination. However, luciferase and luciferin are expensive, and there is a problem that an expensive detector is required for the measurement, and there is a need for a low-cost measurement method using indicators widely present in microorganisms and food residues. Yes. When phosphate esters are used as an index, phosphate esters other than ATP can be detected, so that the sensitivity can be increased. However, there is no inexpensive measurement method that can easily measure phosphate esters in a wide range.
  Among chemical substances, organophosphorus pesticides such as tetraethyl pyrophosphate also contain phosphate esters. In addition, organophosphorus pesticides such as parathion and malathion have a structure similar to phosphate esters, and these organophosphorus pesticides are also very important substances to be tested, and methods and sensors for measuring them are very important. It can be said that it is useful. Currently, measurement is performed using gas chromatography, liquid chromatography, or the like, but an expensive and large-scale apparatus is required, and development of an inexpensive and simple sensor and measurement method is required.
Disclosure of the invention
  An object of the present invention is to provide a stable carrier having high chemical substance catalytic activity, and to provide a method for decomposing and measuring chemical substances using this carrier.
  As a result of intensive research on the above problems, the present inventors have found a polymer whose structure is determined by coordinating metal ions, a metal ion, a polymer having a function of holding metal ions, and an electron-withdrawing functional group. It has been found that a carrier that catalyzes a decomposition reaction of a chemical substance can be obtained by combining with a polymer having, a specific chemical substance can be decomposed by using these supports, and a specific chemical substance can be measured. The present invention has been completed.
  That is, the present invention provides the following:MethodAbout.
(1)A method for measuring phosphate esters using a chemical reaction catalyst carrier comprising a polymer having a function of retaining metal ions, copper ions, and a polymer having an electron-withdrawing functional group.
  Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. A carrier that contains a polymer whose structure is determined by coordinating metal ions and a metal ion, and catalyzes a chemical reaction of a chemical substance.
  Examples of the metal ions contained in the carrier of the present invention include typical metal ions such as magnesium ions, zinc ions, and titanium ions, and transition metal ions such as iron ions, nickel ions, and manganese ions. It is not limited. It is a major feature of the present invention that the substrate specificity of the catalytic activity can be changed by changing the type of metal ion, for example, it becomes possible to catalyze the decomposition of nitric oxide by using iron ions, By using copper ions, it becomes possible to catalyze the decomposition of phosphate esters.
The polymer contained in the carrier of the present invention may be a polymer compound obtained by polymerization reaction of two or more monomers, regardless of the type of monomer or the number of molecules polymerized. Moreover, not only the case where there is one kind of monomer in one polymer, but also those having two or more kinds are included. By changing the type of polymer, the viscosity, strength, etc. of the polymer can be freely changed, and it becomes possible to select a polymer suitable for the application.
  A polymer whose structure is determined by coordinating with a metal ion means that a plurality of ligands contained in the polymer are coordinated and bonded around the metal ion, thereby holding the metal ion and determining the complex structure. It means a polymer. More specifically, it is a polymer having a plurality of ligands in the main chain and / or side chain, and in the presence of a metal ion, the polymer chain conformation can be coordinated to the metal ion. It means that the complex structure is determined and retained by changing the formation / steric structure and thus changing the polymer chain. Therefore, a polymer having a skeleton in which a metal ion coordination structure (for example, a ring structure having a vacancy) is predetermined or fixed, such as a porphyrin ring skeleton, a crown ether skeleton, or a cyclam ring skeleton is included. Absent. A polymer whose structure is determined by coordinating with such a metal ion includes a functional group having an affinity for the metal ion in the main chain and / or side chain of the polymer, and has an affinity for the metal ion. As functional groups, thienyl group, tenenyl group, tenoyl group, pyridyl group, piperidino group, piperidyl group, quinolyl group, pyridazyl group, imidazole group, pyrazole group, pyrazine group, pyridazine group and other heterocycles, other amino groups, hydroxyl groups, A mercapto group, a carboxyl group (carboxylate ion), etc. are mentioned, but many exist besides these, and the kind is not limited. A polymer whose structure is determined by coordination with a metal ion can form a complex structure with a high coordination number around the metal ion, and can form an extremely dense structure. With this high density accumulation, high catalytic activity can be obtained. Examples of the polymer whose structure is determined by coordination with such a metal ion include polyhistidine, polylysine, polycysteine, polypyridine, polypyrimidine, polythiophene, polypyrrole and the like, and copolymers of two or more of these. The type is not limited, and a polymer suitable for the application can be selected.
  The carrier of the present invention can be easily prepared by mixing a polymer and a metal ion. Examples of the method of mixing the polymer and the metal ion include a method of mixing in a test tube or the like and mixing with a vortex mixer, or a method of mixing in a beaker or the like using a stir bar and a stirring device. As long as the metal ions are in contact with each other, the method is not limited to the method described here. The substrate specificity of the carrier, the strength of the catalytic activity, the strength of the carrier can be changed by changing the molecular weight, the density of the functional group with respect to the whole polymer, the type of functional group, etc. The viscosity can be freely changed, and the carrier can be designed freely according to the application.
  Examples of the chemical substance catalyzed by the carrier of the present invention include nitric oxide and phosphate esters, but the type is not limited. The carrier of the present invention can change the chemical substance to be the target of the catalyst by changing the combination of the polymer and the metal ion.
2. A carrier comprising a polymer having a function of retaining a metal ion, a metal ion, and a polymer having an electron-withdrawing functional group and catalyzing a chemical reaction of a chemical substance
  The polymer having a function of retaining metal ions contained in the carrier of the present invention is a polymer that can keep metal ions in the polymer or on the polymer surface, and has a structure by coordination with the above metal ions. In addition to the polymer to be determined, a polymer having a skeleton whose metal ion coordination structure is previously determined, such as a porphyrin ring skeleton, a crown ether skeleton, or a cyclam ring skeleton, is also included. Coordination bonds are preferred as the form of bonds that hold metal ions, but bonds other than coordination bonds may be used.
  Among the polymers having an electron-withdrawing functional group contained in the carrier of the present invention, the electron-withdrawing functional group is a functional group that tends to attract other electrons when hydrogen is used as a standard in the molecule, Nitro group, nitrile group, cyano group, ammonio group, aldehyde group, carbonyl group, carboxyl group, ethoxycarbonyl group, sulfone group, methanesulfonyl group, trichloromethyl group, trifluoromethyl group, etc. It exists and does not matter.
  Examples of the polymer having an electron-withdrawing functional group contained in the carrier of the present invention include polystyrene sulfonic acid, polystyrene acrylonitrile, polysulfone, polytetrafluoroethylene and polymaleic acid, and copolymers of two or more of these. However, the type is not limited, and a polymer suitable for the application can be selected.
  The polymer having an electron-withdrawing functional group contained in the carrier of the present invention and the polymer having a function of holding metal ions are preferably different polymers, but hold the electron-withdrawing functional group and metal ions. A polymer having a function at the same time may be used alone. Further, the electron-withdrawing functional group may have a function of holding a metal ion at the same time.
  The carrier of the present invention can be easily prepared by mixing a polymer and a metal ion. First, a metal ion having a function of retaining metal ions is mixed with the metal ions, the metal ions are retained in advance, and then a polymer having an electron-withdrawing functional group is added, whereby the metal ions are accumulated at a high density. A stable polymer can be produced, but the order of mixing is not limited. Examples of the method of mixing the polymer and the metal ion include a method of mixing in a test tube or the like and mixing with a vortex mixer, or a method of mixing in a beaker or the like using a stir bar and a stirring device. As long as the metal ions are in contact with each other, the method is not limited to the method described here. By changing the molecular weight, the density of functional groups relative to the whole polymer, the type of functional groups, the type of polymer, the concentration of the polymer, the ratio of the polymer to be mixed, the type of metal ion, the concentration, etc., the substrate specificity of the carrier, the catalytic activity The strength, the strength of the carrier, the viscosity, the charge of the whole carrier, etc. can be freely changed, and the carrier can be designed freely according to the application. In particular, the fine adjustment of the charge of the entire carrier can be easily changed by adjusting the mixing ratio of the polymer having a function of holding a metal and the polymer having an electron-withdrawing functional group. As a result, it becomes possible to make the target chemical substance easily accessible to the carrier, or to suppress the approach of contaminants other than the target chemical substance, and to control the substrate specificity of the carrier. It becomes possible.
  In addition, since the charge of the entire carrier can be easily adjusted, the carrier can be adjusted to a charge suitable for cell culture, cell culture on the surface of the carrier is possible, and cell culture is performed in close contact with the detection part of the sensor. Is possible. Thereby, even when the chemical substance released by the cell is a substance that is easily decomposed, such as nitric oxide or dopamine, these can be detected more accurately.
3. Chemical substance decomposition method using the carrier of the present invention
  Examples of the method for decomposing a chemical substance using the carrier of the present invention include, for example, a method in which a measurement sample containing a chemical substance is brought into contact with a carrier in a reaction, and a method in which a sample is brought into contact with a carrier immobilized on a filter or the like. As long as the carrier of the present invention and the chemical substance are in contact with each other, the chemical substance serving as the substrate may be present in the gas or in the solution.
  In the chemical substance decomposition method using the carrier of the present invention, the chemical substance to be decomposed can be freely changed by changing the combination of the polymer and metal ions contained in the carrier. For example, nitric oxide can be decomposed by using iron ions as metal ions, and phosphate esters can be decomposed by using copper ions.
  In the decomposition method of the present invention, when the measurement sample needs to be collected, it can be easily separated from the carrier by centrifugation or the like, and the sample can be collected.
  Further, by immobilizing the carrier of the present invention on a filter or the like and passing the sample therethrough, it becomes possible to efficiently decompose the chemical substance. Therefore, it is possible to purify the air by fixing the carrier to a filter such as an air purifier or an air conditioner.
  The decomposition method of the present invention can be used for decomposing a chemical substance that causes a reagent blank contained in a measurement system, such as a measurement reagent, as a pretreatment in measuring a chemical substance, and can increase measurement sensitivity. For example, in the case of a luciferin-luciferase luminescence reagent for measuring ATP, if ATP is mixed in the reagent, the reagent blank increases and the measurement sensitivity decreases. In this case, a carrier capable of decomposing phosphate esters can be used for the purpose of decomposing ATP in the reagent. In addition, since the decomposition method of the present invention can separately recover the carrier by centrifugation or the like, the reagent blank can be lowered without affecting the measurement of chemical substances.
  Furthermore, since the carrier used in the decomposition method of the present invention can lower the excited state in a chemical reaction, if the reaction conditions such as the concentration, pH, and temperature of the chemical substance in the measurement sample are optimized, Not only decomposition of substances but also synthesis is possible.
4). Method for measuring (detecting) a chemical substance using the carrier of the present invention
  As the detection apparatus in the chemical substance measurement method using the carrier of the present invention, an electrochemical or optical detection apparatus is preferably used, but the detection apparatus is not limited.
  Examples of the electrochemical detection device include an electrochemical measurement device and a device using a simplified electric circuit. Examples of the optical detection device include devices such as a colorimeter, a luminescence photometer, a fluorimeter, an absorptiometer, and a Raman photometer. Further, the optical detection device includes visual confirmation. Any device is not limited as long as it can be detected electrochemically or optically.
  As a measurement using an electrochemical measuring device, a method of measuring a current value when a constant potential is applied by developing a carrier of the present invention on an electrode surface or the like to form a two-electrode system or a three-electrode system in a sample. Is mentioned.
  Further, by combining the carrier of the present invention with a redox coloring pigment, it is possible to perform measurement by an absorptiometer or visual observation. For example, the carrier of the present invention and the redox coloring dye are added to a sample in a test tube and stirred. Thereafter, there is a method of separating a coloring dye colored by a carrier and a sample using a centrifugal separator and measuring it visually or using an absorptiometer.
  The chemical substance to be measured can be changed by changing the combination of polymer and metal ion. For example, when iron ions are used as metal ions, the chemical substance to be measured is nitric oxide, and when copper ions are used, phosphate esters are used.
  When measuring a sample, there are many cases where contaminants other than the measurement target are included. These contaminants can be decomposed into substances that cannot be detected enzymatically or electrochemically, the charge of the entire carrier can be adjusted to suppress the approach of contaminants, and selective layers such as ion exchange membranes and molecular sieve membranes can be added. The substrate specificity can be increased by increasing the selectivity to the target substance.
5). Measurement of nitric oxide by the chemical substance measuring method of the present invention
  When measuring nitric oxide, iron ions are used as metal ions. Nitrogen monoxide, which is a measurement target, can be measured regardless of whether it is present in a gas or in a solution.
  In the method for measuring a chemical substance of the present invention, nitrogen monoxide in the atmosphere, which is a causative substance of acid rain, can be measured. It can also be used to measure nitric oxide contained in the solution. Furthermore, it can be used to measure nitric oxide released by cells.
  Measurement of nitric oxide released by cells is performed as follows. First, a carrier having nitric oxide decomposing activity is accumulated on the electrode surface of the electrochemical measuring device. The charge of the entire carrier is adjusted to a charge that allows the cells to adsorb and grow. On the surface, cells that release nitric oxide in response to a cell stimulating substance such as cardiomyocytes, vascular endothelial cells, macrophage cells, and brain neurons are cultured to prepare a cell chip. Next, a cell stimulating substance such as a muscle relaxing factor, a vascular relaxing factor, an allergic substance, or a nerve disturbing substance is added, and the current value associated with the released nitric oxide is measured. Thereby, the responsiveness of various cells with respect to a cell stimulating factor can be investigated.
6). Measurement of phosphate esters by the method for measuring chemical substances of the present invention
  Among the chemical substances to be measured in the present invention, phosphate esters are compounds containing an ester bond between phosphoric acid and an alcoholic hydroxyl group, and question the number of ester bonds, the molecular structure other than the ester bond, etc. is not. Substances similar to phosphate ester bonds, such as substances in which the oxygen atom of the phosphate ester moiety is replaced with a sulfur atom, are also subject to measurement. Polyphosphates such as pyrophosphate, adenosine phosphates such as adenosine 5′-triphosphate (ATP), other nucleotides, nucleic acids such as deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA), glucose 6-phosphorus Acids, phospholipids, organophosphorus pesticides and the like can be listed as measurement targets.
  When measuring phosphate esters, copper ions are used as metal ions.
  In the measurement sample, phosphate esters other than the target to be measured are contaminated, but by decomposing the contaminated substance into a substance that cannot be detected by using an enzymatic method or an electrochemical method, a specific sample is obtained. Phosphate esters can be selectively measured. In addition, the selectivity can be enhanced by adjusting the charge of the entire carrier to suppress the approach of contaminants or by adding a molecule selection layer on the surface of the carrier.
  For example, in the polymerase chain reaction (PCR), when the amount of polymerase reaction is measured using pyrophosphate, which is a product of DNA polymerase reaction, as an index, phosphate esters such as DNA and unreacted deoxynucleotides are contaminated. is doing. In such a case, as a pretreatment, the DNA in the sample can be degraded by a nucleolytic enzyme (nuclease), and the deoxynucleotide can be degraded by a deoxynucleotide phosphatase such as apyrase, so that the measurement is not affected. Further, by treating the sample with an ion exchange resin, a molecular sieve resin, or the like, DNA and deoxynucleotides can be removed and suppressed to a level that does not affect the measurement. Alternatively, by covering the carrier surface with a molecular selective layer such as an ion exchange membrane or a molecular sieve membrane, it is possible to prevent substances other than pyrophosphoric acid from approaching the carrier surface and to suppress the measurement to a level that does not affect the measurement.
  Many phosphate esters are also contained in cells, and the number of cells in the sample can be estimated by measuring the amount of these phosphate esters contained in the cells.
  A method for estimating the number of cells in the sample is shown below.
(1) A sample from which intracellular phosphates are extracted using trichloroacetic acid, benzalkonium chloride, benzethonium chloride or the like is prepared.
(2) The amount of phosphate ester in the sample prepared in (1) is measured by an electrochemical method using an electrode on which a catalyst carrier having phosphate ester decomposition activity is developed. Alternatively, by reacting the sample prepared in (1) with a reagent in which a catalyst carrier having phosphoric acid ester decomposition activity and a redox coloring reagent are allowed to coexist, the amount of phosphate esters in the sample can be visually or It is measured by an optical method such as an absorptiometer.
(3) The number of cells in the sample is estimated from the value of the phosphate ester measured in (2).
When phospholipids on the cell surface are used as an index, it is not necessary to extract intracellular phosphate esters with trichloroacetic acid or the like, and measurement can be performed while the cells are alive. Therefore, after estimating the number of cells in the sample, it is also possible to identify the type of cells such as food poisoning bacteria.
  Furthermore, in order to measure the number of cells more accurately, it is possible to filter the measurement sample with a filter having a caliber capable of capturing cells, capture the cells on the filter, and measure the number of captured cells. .
  As an example of a method for detecting captured cells, a phosphate ester sensor in which a carrier having phosphate ester decomposition activity is integrated on a microarray electrode in which electrodes having a side of about 50 μm are bundled is produced, and the cells are captured. There is a method in which a filter is placed on the microarray phosphate ester sensor, phosphate esters in the cells are detected, and the number of electrodes through which a current exceeding a specified value flows is regarded as the number of cells. Alternatively, using a coloring reagent that combines a redox dye and a catalyst carrier for phosphoric acid esters, the phosphoric acid esters on the cell surface are colored in cells, and the number of coloring points is regarded as the number of cells. Can be mentioned.
  By using the antibody, specific cells such as food poisoning bacteria can be specifically detected. For example, a phosphoric acid ester sensor in which a carrier having phosphoric acid ester decomposition activity and an antibody that specifically binds to a target cell are collected on a microarray electrode in which electrodes having a side of about 50 μm are bundled is prepared, and a sample liquid , Capture target cells, and detect phospholipid phosphates on the cell surface, so that the number of detected electrodes can be regarded as the number of cells.
  The method for measuring phosphate esters can also be applied to contamination level inspections in food factories and kitchens. Phosphate esters are also widely included in contaminants such as food residues and microorganisms. By measuring the phosphate esters in these pollutants, it is possible to inspect the degree of contamination at the inspection site.
  For example, wipe the test area with a cotton swab, stamp, etc., suspend it in a reagent mixed with a redox coloring reagent and the catalyst carrier of the present invention, and optically measure the color of the supernatant after centrifugation with an absorptiometer or visual inspection. And the degree of contamination can be inspected. Alternatively, a wiped cotton swab or the like is suspended in water, physiological saline, buffer solution, or the like, and the detection unit of an electrochemical phosphate ester sensor using a catalyst carrier having phosphate ester decomposition activity is put in the solution. Alternatively, the degree of contamination can be inspected by measuring the current value by dropping a solution on the detection unit.
  An organophosphorus pesticide remaining in food or the like can also be measured using a method for measuring phosphate esters. Examples of organophosphate pesticides that can be measured in the present invention include tetraethyl pyrophosphate containing a phosphate ester, and parathion and malathion containing a phosphate ester-like structure in which an oxygen atom is replaced with sulfur. .
  As a method for detecting organophosphorus pesticides, for example, a sample prepared by homogenizing a crop sample by stomaching or rinsing the surface with water can be easily and quickly prepared using a phosphate ester sensor. The method of measuring is mentioned.
This specification includes the contents described in the specification of Japanese Patent Application No. 2002-73150 which is the basis of the priority of the present application.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  Next, examplesAnd reference examplesThe present invention will be described in detail with reference toTo theseIt is not limited.
[Reference example 1] (Example of decomposing ATP)
200 mM CuCl in a final concentration 40 mM hydrochloric acid aqueous solution₂After that, 20 mM polyhistidine (manufactured by Sigma) was added while neutralizing the solution with NaOH solution. This was stirred at 25 ° C. all day and night using a vortex mixer, and then 20 mM polystyrene sulfonic acid (manufactured by Aldrich) was added and dissolved by stirring. The support containing the metal ions and polymer that precipitated as a result was used as the catalyst support.
The precipitate obtained by centrifuging the solution containing this carrier was dissolved in 20 mM Tricine / NaOH buffer and used. The carrier solution that had been sufficiently stirred and homogenized was mixed with a 10 μM ATP solution at a ratio of 1: 1, and decomposition was performed while stirring using a vortex mixer. In addition, the above-mentioned CuCl₂Instead of FeCl₃ZnCl₂NiCl₂ATP was decomposed in the same manner using the carrier obtained using the above.
  The ATP concentration was measured by centrifuging the decomposition reaction solution to separate the carrier and the ATP solution, and then measuring the concentration of the supernatant ATP solution with a luciferin-luciferase luminescence reagent (Lucifer 250, manufactured by Kikkoman).
  As a result, as shown in FIG.₂In the case of ATP, ATP decomposed 100% in 2 minutes. However, when a carrier obtained using other metal ions was used, the decomposition amount was 5 to 40%. CuCl₂It was revealed that ATP can be efficiently decomposed by using the carrier obtained by using the above.
[Reference example 2] (Example of measuring nitric oxide using an electrochemical sensor)
  200 mM FeCl in 40 mM HCl aqueous solution₃After that, 20 mM polyhistidine (manufactured by Sigma) was added while neutralizing the solution with NaOH solution. This was stirred at 25 ° C. all day and night using a vortex mixer, and then 20 mM polystyrene sulfonic acid (manufactured by Aldrich) was added and dissolved by stirring. The support containing the metal ions and polymer that precipitated as a result was used as the catalyst support. A solution containing this carrier was dropped onto a disk-type electrode (electrode diameter: 5 mm), air-dried, and used as a nitric oxide sensor electrode.
  The aqueous solution dissolved nitric oxide was applied by applying a constant potential of 100 mV using an electrochemical measuring device (model number HZ-3000, manufactured by Hokuto Denko Co., Ltd.), and adding a counter electrode and a reference electrode to the nitric oxide sensor electrode. Measured with an electrode system. The said nitric oxide sensor was immersed in the nitric oxide aqueous solution of each concentration of 0-0.1 mM, and the electric current value was measured.
  As a result, as shown in FIG. 2, a change in current value depending on the amount of nitric oxide was observed.
[Reference example 3] (Example of measuring nitric oxide produced by cultured cells with cell chips)
  200 mM FeCl in 40 mM HCl aqueous solution₃After that, 20 mM polyhistidine (manufactured by Sigma) was added while neutralizing the solution with NaOH solution. This was stirred at 25 ° C. all day and night using a vortex mixer, and then 20 mM polystyrene sulfonic acid (manufactured by Aldrich) was added and dissolved by stirring. The support containing the metal ions and polymer that precipitated as a result was used as the catalyst support. The carrier was spread on a culture dish surface whose bottom surface was coated with a metal thin film and air-dried to form a film. A counter electrode and a reference electrode were added thereto to form a three-electrode system, which was used as a nitric oxide detection cell chip (hereinafter referred to as a cell chip, shown in FIG. 3). After the cell chip was sterilized by spraying with alcohol, a cell chip was prepared by directly culturing vascular endothelial cells on the cell chip. A vasorelaxation factor was added to the cells in the culture dish, and the current value at that time was continuously measured.
  As a result, as shown in FIG. 4, the behavior of the cells producing nitric oxide in response to the vasorelaxant could be measured continuously.
[Example 1] (Example of measuring ATP and ADP using an electrochemical sensor)
  200 mM CuCl in a final concentration 40 mM hydrochloric acid aqueous solution₂After that, 20 mM polyhistidine (manufactured by Sigma) was added while neutralizing the solution with NaOH solution. This was stirred at 25 ° C. all day and night using a vortex mixer, and then 20 mM polystyrene sulfonic acid (manufactured by Aldrich) was added and dissolved by stirring. The support containing the metal ions and polymer that precipitated as a result was used as the catalyst support. A solution containing this carrier was dropped onto a disk-type electrode (electrode diameter: 5 mm) and then air-dried, and used as a sensor electrode for ATP and ADP measurement.
  ATP and ADP were applied by applying a constant potential of 100 mV using an electrochemical measuring device (model number HZ-3000, manufactured by Hokuto Denko), and adding a counter electrode and a reference electrode to the ATP and ADP sensor electrodes. Measured with an electrode system. The ATP and ADP sensors were immersed in ATP and ADP aqueous solutions having respective concentrations of 0 to 200 mM, and current values were measured.
  As a result, current values depending on the amounts of ATP and ADP were obtained as shown in FIGS.
[Example 2] (Example of measuring pyrophosphate using an electrochemical sensor)
  200 mM CuCl in a final concentration 40 mM hydrochloric acid aqueous solution₂After that, 20 mM polyhistidine (manufactured by Sigma) was added while neutralizing the solution with NaOH solution. This was stirred at 25 ° C. all day and night using a vortex mixer, and then 20 mM polystyrene sulfonic acid (manufactured by Aldrich) was added and dissolved by stirring. The support containing the metal ions and polymer that precipitated as a result was used as the catalyst support.
  A solution containing this carrier was dropped onto a disk-type electrode (electrode diameter: 5 mm), then air-dried and used as a sensor electrode for measuring pyrophosphate.
  Pyrophosphate was measured with a three-electrode system in which a constant potential of 100 mV was applied using an electrochemical measurement device (Hokuto Denko, model number HZ-3000), and a counter electrode and a reference electrode were added to the pyrophosphate sensor electrode. did. The pyrophosphate sensor was immersed in an aqueous pyrophosphate solution having a concentration of 0 to 200 mM, and the current value was measured.
  As a result, as shown in FIG. 7, a current value depending on the amount of pyrophosphate was obtained.
[Reference example 4] (Experiment showing the effect of introducing an electron-withdrawing functional group (benzenesulfone group))
  When the polymer was produced, a benzenesulfone group in which a sulfone group having a higher electron-withdrawing property was bonded to a side chain as a functional group having an electron-withdrawing property and a carboxyl group having a relatively weak attraction property were introduced in the following ratios (1 The polymers of (4) to (4) were used.
(1) Poly (sodium p-styrenesulfonate) (poly (sodium-4-sulfonate)) (manufactured by Aldrich) (benzenesulfone group 100%, carboxyl group 0%)
(2) Poly (p-styrenesulfonic acid-maleic acid) copolymer sodium salt (poly (4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt) (styrene / maleic acid molar ratio 3: 1) (manufactured by Aldrich) (60% benzenesulfone group, 40% carboxyl group)
(3) Poly (p-styrenesulfonic acid-maleic acid) copolymer sodium salt (poly (4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt) (styrene / maleic acid molar ratio 1: 1) (manufactured by Aldrich) (33% benzenesulfone group, 67% carboxyl group)
(4) Polymaleic acid (poly (acy acid) (manufactured by Aldrich) (benzenesulfone group 0%, carboxyl group 100%))
  200 mM FeCl in 40 mM HCl aqueous solution₃After that, 20 mM polyhistidine (manufactured by Sigma) was added while neutralizing the solution with NaOH solution. This was stirred at 25 ° C. overnight using a vortex mixer. The above polymers (1) to (4) were added and dissolved by stirring. The support containing the metal ions and polymer that precipitated as a result was used as the catalyst support. A solution containing this carrier was dropped onto a disk-type electrode (electrode diameter: 5 mm) and then air-dried to be used as a nitric oxide sensor electrode.
  The aqueous solution dissolved nitric oxide was applied by applying a constant potential of 100 mV using an electrochemical measuring device (model number HZ-3000, manufactured by Hokuto Denko Co., Ltd.), and adding a counter electrode and a reference electrode to the nitric oxide sensor electrode. Measured with an electrode system. The nitric oxide sensor was immersed in a 2 mM aqueous solution of nitric oxide at each concentration, and the current value was measured. A value obtained by subtracting a base current value (current value in an environment without NO) from the obtained current value was defined as a response current, and a response current with a benzenesulfone group introduction rate of 0% was defined as 100%. The result is shown in FIG.
  As shown in FIG. 8, it was revealed that the more benzenesulfone groups having stronger electron withdrawing properties than carboxyl groups, the higher the response current obtained. From this result, it can be said that the present invention has an effect of amplifying the response current by introducing a large number of functional groups having higher electron-withdrawing properties. In addition, the introduction of a benzenesulfone group makes the molecular environment hydrophobic, so that the environment in which NO reacts more easily becomes possible, and an effect of increasing the response current by increasing the catalyst efficiency can be considered.
  All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.
Industrial applicability
  According to the present invention, a polymer having a structure determined by coordinating with metal ions and a carrier combining the metal ions enable high-density accumulation of metal ions, and a stable and highly catalytic activity carrier. Can be obtained. In addition, a carrier that combines a metal ion-retaining polymer, a metal ion, and a polymer having an electron-withdrawing functional group makes it possible to lower the oxidation-reduction potential of the metal ion, making it a stable and high catalyst. A carrier having activity can be obtained. Furthermore, the carrier obtained by the present invention can change the specificity for the substrate by changing the metal ion, and can catalyze the decomposition reaction of various chemical substances. Therefore, it is possible to provide a method for decomposing chemical substances that can be used in a wide range of fields, and various chemical substances can be decomposed. In addition, various chemical substances can be measured by combining the carrier obtained in the present invention with an electrochemical or optical detection system. Thereby, the sensor which can be utilized in a wide field | area can be provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the decomposition rate of ATP when a carrier that catalyzes the activity of decomposing phosphate esters is used.
FIG. 2 is a graph showing the nitric oxide concentration and the response current value.
FIG. 3 is a schematic view showing a cell chip using a carrier that catalyzes nitric oxide decomposition activity. The counter electrode and the reference electrode are omitted from the figure.
FIG. 4 is a graph showing changes in response current over time when a cell stimulating substance is added to a cell chip. The drug was added at the point (A) in the figure. In the figure, (a) is a case where a 250 μM amount of a vasodilator is added, (b) is a case where a 100 μM amount of a vasodilator is added, and (c) is a case where nothing is added. .
FIG. 5 is a graph showing the response current value of the phosphate ester sensor at each ATP concentration.
FIG. 6 is a graph showing the response current value of the phosphate ester sensor at each ADP concentration.
FIG. 7 is a graph showing the response current value of the phosphate ester sensor at each pyrophosphate concentration.
FIG. 8 is a graph showing the relationship between the introduction rate of benzenesulfone groups and the response current.

Claims

A method for measuring phosphate esters using a chemical reaction catalyst carrier comprising a polymer having a function of retaining metal ions, copper ions, and a polymer having an electron-withdrawing functional group.