JP4374230B2 - Biopolymer detection method and biochip - Google Patents
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Description
本発明は、DNAやRNA(RNAはDNAからの転写産物、すなわちmRNAまたはrRNAまたはtRNAまたは低分子RNAなどである)、タンパク質などの生体高分子を検出する方法およびそれに用いられるバイオチップに関するものである。 The present invention relates to a method for detecting biopolymers such as DNA and RNA (RNA is a transcription product from DNA, ie, mRNA, rRNA, tRNA, or small RNA), and a protein, and a biochip used therefor. is there.
従来より、マイクロアレイチップを用いて生体高分子(以下DNAを例にとる)を解読する技術はよく知られている(例えば、特許文献1参照)。そして、この種のDNAのマイクロアレイチップは通常次のように形成され、DNAを解読することができるようになっている。 Conventionally, a technique for decoding a biopolymer (hereinafter, DNA is taken as an example) using a microarray chip is well known (see, for example, Patent Document 1). And this kind of DNA microarray chip is usually formed as follows, and can decode DNA.
ガラス(あるいはプラスチック)基板上に、ターゲットとなるmRNA(cDNA)と相補的配列をもつプローブDNAをアレイ状にスポッティングして固定する。その上に、ターゲットとなるmRNA(cDNA)に蛍光ラベルを付けたものを滴下する。このとき、相補的配列同士のプローブとターゲットはハイブリダイズして結合するが、そうでないものは結合しない。 On a glass (or plastic) substrate, probe DNA having a sequence complementary to the target mRNA (cDNA) is spotted and fixed in an array. On top of that, a target mRNA (cDNA) with a fluorescent label is dropped. At this time, the probe and target of complementary sequences hybridize and bind, but those that do not bind do not.
十分ハイブリダイゼーションが進行した後、基板上をウォッシングバッファ液で洗浄し、ハイブリダイズしなかったターゲットを洗い流す。次に、読取装置で光学的に蛍光ラベルの位置および光量を読み取ることにより、ターゲットとなるmRNA(cDNA)の有無およびその量を測定することができる(例えば、特許文献2参照)。 After the hybridization has progressed sufficiently, the substrate is washed with a washing buffer solution, and the unhybridized target is washed away. Next, the presence and amount of mRNA (cDNA) as a target can be measured by optically reading the position and light amount of the fluorescent label with a reader (see, for example, Patent Document 2).
しかしながら、従来のDNAマイクロアレイは上記のような一連のプロトコルにより目的とするデータが得られるが、実際には各段階のプロトコル上で色々な問題点を抱えている。その結果、得られたデータには確かさ、再現性、繰り返し特性、感度などの課題が多く、それゆえ実験データの標準化が進まず、更にはコンテンツ面での問題点と相俟って臨床現場でDNAマイクロアレイが普及するには至っていない。
色々な問題点のうち特に問題となる項目は、S/N比、検出感度、検出時間、確からしさ、再現性である。
However, the conventional DNA microarray can obtain the target data by the series of protocols as described above, but actually has various problems on the protocol at each stage. As a result, the obtained data has many problems such as certainty, reproducibility, repetitive characteristics, sensitivity, etc. Therefore, standardization of experimental data does not progress, and in addition to the problems in terms of content, it is a clinical site. However, DNA microarrays have not yet become widespread.
Among the various problems, items that are particularly problematic are S / N ratio, detection sensitivity, detection time, accuracy, and reproducibility.
本発明は、上記の課題を解決するもので、S/N比の向上、検出感度の向上、検出時間の短縮を図った抗原抗体反応利用の生体高分子検出方法およびその方法に用いられるバイオチップを実現することを目的とするものである。 The present invention solves the above-mentioned problems, and provides a biopolymer detection method using an antigen-antibody reaction that improves the S / N ratio, improves the detection sensitivity, and shortens the detection time, and the biochip used in the method It aims at realizing.
このような課題を達成するために、本発明では、
ターゲット生体高分子を基板側に捕捉してターゲット生体高分子を検出する生体高分子検出方法であって、
蛍光標識したターゲット生体高分子と、プローブ生体高分子およびビーズのID認識用のポリクローナル抗体またはアドレスプローブペプチドまたは生体高分子であるアドレスリンカーを表面に固定したビーズとを溶液中に入れて、ターゲット生体高分子とプローブ生体高分子をハイブリダイズさせた後、基板上に固定の前記アドレスリンカーとは抗原・抗体の関係にあるアドレスプローブペプチドまたは生体高分子またはポリクローナル抗体で前記アドレスリンカーを抗原・抗体反応により捕捉することを特徴とする。
In order to achieve such a problem, in the present invention,
A biopolymer detection method for detecting a target biopolymer by capturing the target biopolymer on the substrate side,
A target biopolymer labeled with fluorescence and a bead having a probe biopolymer and a polyclonal antibody for addressing ID recognition of beads or an address probe peptide or a biopolymer address linker immobilized on a surface are placed in a solution, and the target biopolymer After hybridizing the polymer and the probe biopolymer, the address linker is antigen-antibody reaction with the address probe peptide or biopolymer or polyclonal antibody that has an antigen / antibody relationship with the address linker immobilized on the substrate. It is characterized by capturing.
本発明ではビーズを使用しているため、ビーズの表面積は従来のDNAチップの表面積に比べ格段に大きくなり、そのビーズ表面に沢山のプローブ生体高分子を固定することができ、これによりビーズ上のプローブ生体高分子と溶液中のターゲット生体高分子とが邂逅する機会が格段に高まり、ターゲット生体高分子を極めて高い感度で捕捉することができる。一般にDNAアレイの約1000倍以上の感度である。
ビーズには、さらにID認識用のアドレスリンカーが固定されている。アドレスリンカーとしては、ポリクローナル抗体またはアドレスプローブペプチドまたは生体高分子が使用される。
Since beads are used in the present invention, the surface area of the beads is much larger than the surface area of conventional DNA chips, and many probe biopolymers can be immobilized on the surface of the beads. Opportunities between the probe biopolymer and the target biopolymer in the solution are greatly increased, and the target biopolymer can be captured with extremely high sensitivity. Generally, the sensitivity is about 1000 times or more that of a DNA array.
An address linker for ID recognition is further fixed to the beads. As the address linker, a polyclonal antibody, an address probe peptide, or a biopolymer is used.
一方、基板上のサイトには前記アドレスリンカーと抗原・抗体の関係にある(DNAとDNAのハイブリダイゼーションに比較して格段に強力な結合力がある)アドレスプローブペプチドまたは生体高分子またはポリクローナル抗体が固定されている。基板に前記ビーズを注ぐと、抗原・抗体反応によりアドレスリンカーはアドレスプローブペプチドまたは生体高分子またはポリクローナル抗体に強力な結合力で捕捉される。
このようにして、高S/N比、高検出感度でターゲット生体高分子を基板上に捕捉することができる。
On the other hand, the site on the substrate contains an address probe peptide, biopolymer, or polyclonal antibody that has a relationship between the address linker and the antigen / antibody (having a much stronger binding force than DNA-DNA hybridization). It is fixed. When the beads are poured onto the substrate, the address linker is captured with a strong binding force to the address probe peptide, the biopolymer or the polyclonal antibody by the antigen-antibody reaction.
In this way, the target biopolymer can be captured on the substrate with a high S / N ratio and high detection sensitivity.
この場合、請求項2のように、ターゲット生体高分子とビーズをバッファ溶液と共に容器中に入れ、物理的もしくは電気的もしくは化学的手段により攪拌すると、従来方式が単にブラウン運動にて相補的プローブを探すことに比べ、本発明では他からのエネルギーを得て相補的プローブを探すことになるので、邂逅する機会が格段に高まり、その結果プローブ生体高分子とターゲット生体高分子のハイブリダイゼーションを高速化することができる。 In this case, as in claim 2, when the target biopolymer and beads are placed in a container together with a buffer solution and stirred by physical, electrical, or chemical means, the conventional method simply uses a Brownian motion to provide a complementary probe. Compared to searching, the present invention searches for complementary probes by obtaining energy from other sources, which greatly increases the chance of hesitation, resulting in faster hybridization between the probe biopolymer and the target biopolymer. can do.
ビーズとしては、請求項3のように磁気ビーズ、もしくは金属またはプラスチックを用いたビーズを使用する。また、ターゲット生体高分子は、請求項4のようにDNAからの転写産物であるRNA(mRNAまたはrRNAまたはtRNAまたは低分子RNA)、またはcDNA、またはタンパク質である。
As the beads, magnetic beads as described in
以上説明したことから明らかなように、本発明によれば次のような効果がある。
(1)ビーズは表面積が大きいため沢山のプローブDNAを結合でき、したがって溶液中の微量のターゲット生体高分子を極めて高い感度(一般のDNAアレイの約1000倍以上の感度)で容易に捕捉することができる。
(2)1つのビーズに結合した沢山のプローブDNAにターゲットDNAをハイブリダイズさせ結合させ得るので、容易にS/N比を上げることができる。
As is apparent from the above description, the present invention has the following effects.
(1) Since the beads have a large surface area, they can bind a large amount of probe DNA. Therefore, a very small amount of target biopolymer in the solution can be easily captured with extremely high sensitivity (sensitivity about 1000 times that of a general DNA array). Can do.
(2) Since the target DNA can be hybridized and bound to many probe DNAs bound to one bead, the S / N ratio can be easily increased.
(3)1つのビーズに沢山のプローブDNAを結合していることと、溶液を攪拌することにより、ターゲットDNAとプローブDNAとの邂逅の機会が多くなり、検出時間(主としてハイブリダイゼーションに要する時間)を容易に短縮することができると同時に、極めて高い感度でターゲットDNAとプローブDNAとをハイブリダイズさせることができる。 (3) Since many probe DNAs are bound to one bead and the solution is stirred, the chance of wrinkling between the target DNA and the probe DNA increases, and the detection time (mainly the time required for hybridization) The target DNA and the probe DNA can be hybridized with extremely high sensitivity.
本発明では、ビーズの良いところとDNAアレイの良いところを組合わせている。ビーズの良いところは、表面積が大きいためプローブDNAを沢山結合しておくことができ(平板状のサイトにプローブDNAを結合するのに比して格段に多い)、しかも溶液中を自由に移動することができるので、溶液中のターゲット生体高分子と邂逅する機会が飛躍的に向上し、その結果溶液中の微量のターゲットDNAを極めて高い感度で捕捉することができる(一般にDNAアレイの約1000倍以上である)点である。 In the present invention, the advantages of beads and the advantages of DNA arrays are combined. The good thing about beads is that they have a large surface area that allows you to bind a lot of probe DNA (much more than binding probe DNA to a flat site) and move freely through the solution. As a result, the chance to clash with the target biopolymer in the solution is dramatically improved, and as a result, a very small amount of the target DNA in the solution can be captured with extremely high sensitivity (generally about 1000 times the DNA array That is the point.
しかしながら、一方で、各ビーズのIDすなわちどのビーズにどのDNAが結合したかが分らないという欠点がある。このビーズのIDを認識するため、通常、カラービーズを使ったり、2色の光源で識別したりと色々な試みがなされているが、識別できる数が少ないという問題と、装置が複雑化、高額化、大型化し、そして取り扱いが難しくなるという問題がある。本発明ではビーズ上とアレイ上のタンパク質の抗原・抗体反応により識別できるようにして、この問題をうまく解決している。 However, on the other hand, there is a drawback that it is not known which DNA is bound to which bead ID, that is, which bead. In order to recognize the ID of this bead, various attempts have been made such as using color beads or identifying with two color light sources, but the problem is that the number that can be identified is small, and the device is complicated and expensive. There is a problem that the size, size, and handling become difficult. In the present invention, the problem can be solved well by distinguishing the protein on the beads and the array by the antigen-antibody reaction.
以下図面を用いて本発明を詳しく説明する。図1ないし図3は本発明に係る生体高分子検出方法の一例の原理を説明する図である。なお、ここでは、生体高分子がDNAである場合について説明する。
図1ないし図3は本発明に係る生体高分子検出方法の一例の原理を説明する図である。なお、ここでは、生体高分子がDNAである場合について説明する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings. 1 to 3 are diagrams for explaining the principle of an example of the biopolymer detection method according to the present invention. Here, the case where the biopolymer is DNA will be described.
1 to 3 are diagrams for explaining the principle of an example of the biopolymer detection method according to the present invention. Here, the case where the biopolymer is DNA will be described.
図1に示すように、ビーズ1の表面にプローブDNA2を固定する。ビーズとしては、磁気ビーズや金属もしくはプラスチックを用いたビーズなどが使用できる。
ビーズ1の表面には、それに加えてビーズの識別情報(ID)を認識するためのアドレスリンカー3を固定する。アドレスリンカー3としては、アドレス判定用抗原もしくはアドレス判定用抗体(モノクローナルまたはポリクローナル)が使用される。
他方、ターゲットとなるRNAあるいはcDNAあるいはタンパク質(以下これらを代表してRNAという)4には、蛍光タグ5を付加(標識)する。
As shown in FIG. 1, probe DNA 2 is immobilized on the surface of beads 1. As the beads, magnetic beads, beads using metal or plastic, and the like can be used.
In addition, an address linker 3 for recognizing bead identification information (ID) is fixed on the surface of the bead 1. As the address linker 3, an antigen for address determination or an antibody for address determination (monoclonal or polyclonal) is used.
On the other hand, a fluorescent tag 5 is added (labeled) to the target RNA, cDNA or protein (hereinafter referred to as RNA) 4.
上記のようにして作成されたビーズ1とターゲットRNA4、そしてバッファ溶液6を共に容器7中に入れ、必要に応じて物理的もしくは電気的もしくは化学的手段によって攪拌する。その結果、ビーズ1表面のプローブDNA2には、これと相補的関係にあるターゲットRNA4が結合する。 The beads 1, the target RNA 4, and the buffer solution 6 prepared as described above are put together in a container 7, and stirred by physical, electrical, or chemical means as necessary. As a result, the target DNA 4 in a complementary relationship with the probe DNA 2 on the surface of the bead 1 is bound.
次に、前記結合したビーズを図2に示すバイオチップ10のアレイ状のサイト11上に注ぐ。なお、同図(a)は側面図、同図(b)は平面図である。
サイト11上には、ビーズ1表面に固定されたID認識用アドレスリンカー3を抗原・抗体反応により捕捉するアドレスプローブタンパク質12があらかじめ固定してある。なお、図3は図2の丸囲み部分Aの拡大図である。
Next, the bound beads are poured onto the arrayed sites 11 of the biochip 10 shown in FIG. 2A is a side view, and FIG. 2B is a plan view.
On the site 11, an address probe protein 12 that captures the ID recognition address linker 3 immobilized on the surface of the bead 1 by an antigen-antibody reaction is immobilized in advance. 3 is an enlarged view of a circled portion A in FIG.
アドレスリンカー3とアドレスプローブタンパク質12は抗原・抗体反応により結合する。ビーズ1がどのプローブサイト11のアドレスプローブタンパク質12に結合したかは蛍光ラベル5によって認識することができる。蛍光ラベルは蛍光読取装置(図示せず)により容易に検出できる。
このようにしてターゲットRNA4の存在およびその量を効率よく測定することができる。
The address linker 3 and the address probe protein 12 are bound by an antigen / antibody reaction. The fluorescent label 5 can recognize which probe site 11 the bead 1 is bound to the address probe protein 12. The fluorescent label can be easily detected by a fluorescent reader (not shown).
In this way, the presence and amount of the target RNA 4 can be measured efficiently.
なお、以上の説明は、本発明の説明および例示を目的として特定の好適な実施例を示したに過ぎない。したがって本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。 The above description merely shows a specific preferred embodiment for the purpose of explaining and illustrating the present invention. Therefore, the present invention is not limited to the above-described embodiments, and includes many changes and modifications without departing from the essence thereof.
例えば、アドレスリンカーとしては、ポリクローナル抗体の他にアドレスプローブペプチドまたは生体高分子を用いることができる。この場合、これに対応して基板上にはアドレスリンカーとは抗原・抗体の関係にあるアドレスプローブペプチドまたは生体高分子またはポリクローナル抗体のいずれかを固定する。 For example, as an address linker, an address probe peptide or a biopolymer can be used in addition to a polyclonal antibody. In this case, either an address probe peptide, a biopolymer or a polyclonal antibody having an antigen / antibody relationship with the address linker is immobilized on the substrate correspondingly.
1 ビーズ
2 プローブタンパク
3 アドレスリンカー
4 ターゲットRNA
5 蛍光タグ
6 溶液
7 容器
10 基板
11 サイト
12 アドレスプローブタンパク
1 Bead 2
5 Fluorescent tag 6 Solution 7 Container 10 Substrate 11 Site 12 Address probe protein
Claims (4)
蛍光標識したターゲット生体高分子と、プローブ生体高分子およびビーズのID認識用のポリクローナル抗体またはアドレスプローブペプチドまたは生体高分子であるアドレスリンカーを表面に固定したビーズとを溶液中に入れて、ターゲット生体高分子とプローブ生体高分子をハイブリダイズさせた後、基板上に固定の前記アドレスリンカーとは抗原・抗体の関係にあるアドレスプローブペプチドまたは生体高分子またはポリクローナル抗体で前記アドレスリンカーを抗原・抗体反応により捕捉することを特徴とする生体高分子検出方法。 A biopolymer detection method for detecting a target biopolymer by capturing the target biopolymer on the substrate side,
A target biopolymer labeled with fluorescence and a probe biopolymer and a bead having a polyclonal antibody for address ID recognition of beads or an address probe peptide or a biopolymer address linker immobilized on the surface are placed in a solution, and the target biopolymer After hybridizing the polymer and the probe biopolymer, the address linker is antigen-antibody reaction with the address probe peptide or biopolymer or polyclonal antibody that has an antigen / antibody relationship with the address linker immobilized on the substrate. The biopolymer detection method characterized by capturing by this.
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