JP4365379B2

JP4365379B2 - FRET detection method and apparatus

Info

Publication number: JP4365379B2
Application number: JP2006054347A
Authority: JP
Inventors: 憲明木村; 成幸中田; 恭二土井
Original assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Holdings Co Ltd
Current assignee: Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd; Mitsui E&S Holdings Co Ltd
Priority date: 2006-03-01
Filing date: 2006-03-01
Publication date: 2009-11-18
Anticipated expiration: 2026-03-01
Also published as: JP2007232559A

Description

本発明は、レーザ光の照射によって励起された第１の分子が発する蛍光が励起光として第２の分子を励起し、この励起された第２の分子が発する蛍光を受光することによって、第1の分子のエネルギーが第２の分子のエネルギーに移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer：蛍光共鳴エネルギー移動）を検出する方法及び装置に関する。具体的には、蛍光分子であるドナー分子と蛍光分子であるアクセプター分子との対に関して、両分子の相互作用を蛍光によって検出するＦＲＥＴ検出技術に関する。 In the present invention, the fluorescence emitted from the first molecule excited by the irradiation of the laser light excites the second molecule as excitation light, and the first molecule is received by receiving the fluorescence emitted from the excited second molecule. The present invention relates to a method and apparatus for detecting FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in which the energy of one molecule moves to the energy of a second molecule. Specifically, the present invention relates to a FRET detection technique for detecting the interaction of both molecules by fluorescence with respect to a pair of a donor molecule that is a fluorescent molecule and an acceptor molecule that is a fluorescent molecule.

現在、医療、創薬、食品産業におけるポストゲノム関連技術として、タンパク質の機能解析が重要となっている。特に、細胞の作用を解析するために、生細胞における生体物質であるタンパク質と、他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用（結合、分離）の研究が必要である。
このようなタンパク質の他のタンパク質や低分子化合物との間の相互作用について、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）現象を利用して解析することが最近行われている。すなわち、数ナノメータの領域での分子間の相互作用を蛍光を用いて検出する。このようなＦＲＥＴ現象を利用した検出は、主に顕微鏡システムを用いて行われる。 At present, functional analysis of proteins is important as a post-genome related technology in the medical, drug discovery and food industries. In particular, in order to analyze the action of cells, it is necessary to study the interaction (binding and separation) between proteins that are biological substances in living cells and other proteins and low-molecular compounds.
Recently, the interaction between such proteins and other proteins and low-molecular compounds has been analyzed using the fluorescence resonance energy transfer (FRET) phenomenon. That is, the interaction between molecules in the region of several nanometers is detected using fluorescence. Detection using such a FRET phenomenon is mainly performed using a microscope system.

下記特許文献１は、ＦＲＥＴを用いた一分子蛍光解析を開示している。この文献では、ＦＲＥＴ現象を用いて、受光した蛍光に基づいて蛍光相関分析法又は蛍光強度分布解析を行う。しかし、この方法では、短時間にＦＲＥＴの検出を行うことのできる細胞等のサンプル数は、せいぜい数十個程度に限られており、多くの細胞を解析対象として短時間に統計的に解析することは難しい。 Patent Document 1 below discloses single molecule fluorescence analysis using FRET. In this document, a fluorescence correlation analysis method or a fluorescence intensity distribution analysis is performed based on received fluorescence using the FRET phenomenon. However, in this method, the number of samples of cells or the like that can detect FRET in a short time is limited to about several tens at most, and many cells are statistically analyzed in a short time as an analysis target. It ’s difficult.

特開２００５−２０７８２３号公報JP 2005-207823 A

そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、ドナー分子及びアクセプター分子を含むサンプルについて短時間に多数のサンプルを解析することのできるＦＲＥＴ検出方法及び装置を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a FRET detection method and apparatus capable of analyzing a large number of samples in a short time for samples containing donor molecules and acceptor molecules in order to solve the above-described problems.

上記目的を達成するために、本発明は、レーザ光の照射によって励起された第１の分子のエネルギーが第２の分子に移動するＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）を検出するＦＲＥＴ検出方法であって、第１の分子を励起するために、第１の周波数で強度変調した第１のレーザ光を第１の分子に照射するとともに、第２の分子を励起するために、第１の周波数と異なる第２の周波数で強度変調した第２のレーザ光を第２の分子に照射するステップと、第２の分子が発する蛍光を受光するステップと、受光した第２の分子が発する蛍光の蛍光信号のうちの前記第１の周波数の信号成分の、第１のレーザ光の強度変調に対する第１の位相遅れと、受光した前記第２の分子が発する蛍光の蛍光信号のうちの前記第２の周波数の信号成分の、第２のレーザ光の強度変調に対する第２の位相遅れとを取り出し、この第１の位相遅れと第２の位相遅れとに基づいて、第１の分子のエネルギーが第２の分子に移動するエネルギー移動の有無を判定するステップと、を有することを特徴とするＦＲＥＴ検出方法を提供する。 In order to achieve the above object, the present invention is a FRET detection method for detecting FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in which the energy of a first molecule excited by laser light irradiation moves to a second molecule. In order to excite the first molecule, the first molecule irradiated with the first laser light whose intensity is modulated at the first frequency is different from the first frequency in order to excite the second molecule. A step of irradiating the second molecule with a second laser beam whose intensity is modulated at the second frequency, a step of receiving fluorescence emitted by the second molecule, and a fluorescence signal of the fluorescence emitted by the received second molecule The first phase lag of the first frequency signal component of the first laser beam relative to the intensity modulation of the first laser beam, and the second frequency of the fluorescence signal of the fluorescence emitted by the received second molecule. Second of the signal component Taking out a second phase delay with respect to the intensity modulation of the laser beam, the first based on a phase delay and a second phase delay, the presence or absence of energy transfer the energy of the first molecule is moved to a second molecule having the steps of: determining to provide a FRET detection method according to claim.

ここで、前記エネルギー移動は、前記第２の位相遅れに対する前記第１の位相遅れの比によって判定されることが好ましい。
又、前記第１のレーザ光は、前記第１のレーザ光の強度変調のために第１の周波数を有する第１の変調信号を用いて強度変調され、前記第２のレーザ光は、前記第２のレーザ光の強度変調のために第２の周波数を有する第２の変調信号を用いて強度変調され、前記第１の周波数の変調信号は、前記第２の周波数の変調信号に、前記差分周波数の生成信号を合成して得られた信号であり、受光した前記第２の分子が発する蛍光の蛍光信号は、前記差分周波数の生成信号に同期して、前記差分周波数の整数倍の周波数をサンプリング周波数としてサンプリングされることが好ましい。その際、前記サンプリングされた蛍光信号を前記差分周波数の整数分の１の周波数を周波数分解能として周波数分析をすることにより、前記蛍光信号のうちの前記第１の周波数の信号成分と蛍光信号のうちの前記第２の周波数の信号成分とを抽出することが好ましい。 Here, it is preferable that the energy transfer is determined by a ratio of the first phase lag to the second phase lag.
The first laser light is intensity-modulated using a first modulation signal having a first frequency for intensity modulation of the first laser light, and the second laser light is Intensity modulation is performed using a second modulation signal having a second frequency for intensity modulation of the second laser light, and the first frequency modulation signal is converted into the second frequency modulation signal by the difference This is a signal obtained by synthesizing the frequency generation signal, and the fluorescence signal emitted from the received second molecule has a frequency that is an integral multiple of the difference frequency in synchronization with the difference frequency generation signal. It is preferably sampled as the sampling frequency. At that time, the sampled fluorescence signal is subjected to frequency analysis with a frequency that is 1 / integer of the difference frequency as a frequency resolution, so that among the signal component of the first frequency and the fluorescence signal of the fluorescence signal. It is preferable to extract the signal component of the second frequency.

又、前記第２の分子が発する蛍光を受光する際、さらに、前記第１の分子が発する蛍光を受光し、受光した前記第１の分子の発する蛍光の蛍光信号の、第１のレーザ光の強度変調に対する第３の位相遅れを算出し、この第３の位相遅れをＦＲＥＴの発生の有無の判定に用いることもできる。 Further, when receiving the fluorescence emitted from the second molecule, the fluorescence emitted from the first molecule is further received, and the fluorescence signal of the fluorescence emitted from the received first molecule is reflected in the first laser beam. It is also possible to calculate a third phase lag with respect to the intensity modulation and use the third phase lag to determine whether or not FRET has occurred .

本発明は、さらに、レーザ光の照射によって励起された第１の分子のエネルギーが第２の分子に移動するＦＲＥＴを検出するＦＲＥＴ検出装置であって、第１の分子を励起するために、第１のレーザ光を第１の分子に照射するとともに、第２の分子を励起するために、第２のレーザ光を第２の分子に照射するレーザ光源部と、第２の分子が発する蛍光を受光する受光部と、前記レーザ光源部から出射する第１のレーザ光を第１の周波数で強度変調させ、かつ前記レーザ光源部から出射する第２のレーザ光を第１の周波数と異なる第２の周波数で強度変調させるために、変調信号を生成する光源制御部と、受光した第２の分子が発する蛍光の蛍光信号のうちの前記第１の周波数の信号成分の、第１のレーザ光の強度変調に対する第１の位相遅れと、受光した前記第２の分子が発する蛍光の蛍光信号のうちの前記第２の周波数の信号成分の、第２のレーザ光の強度変調に対する第２の位相遅れとを取り出し、この第１の位相遅れと第２の位相遅れとに基づいて、第１の分子のエネルギーが第２の分子に移動するエネルギー移動の有無を判定する処理部と、を有することを特徴とするＦＲＥＴ検出装置を提供する。 The present invention further provides a FRET detection apparatus for detecting FRET in which energy of a first molecule excited by irradiation with a laser beam moves to a second molecule, and for exciting the first molecule, In order to irradiate the first molecule with the first laser beam and to excite the second molecule, a laser light source unit that irradiates the second molecule with the second laser beam, and fluorescence emitted from the second molecule A light receiving unit that receives light, a second laser beam that is intensity-modulated at a first frequency with a first laser beam emitted from the laser light source unit, and a second laser beam that is emitted from the laser light source unit is different from the first frequency. Of the first laser light of the signal component of the first frequency in the fluorescence signal of the fluorescence emitted by the received second molecule and the light source control unit that generates the modulation signal. First phase lag for intensity modulation The second phase delay of the signal component of the second frequency in the fluorescence signal of the fluorescence emitted from the received second molecule with respect to the intensity modulation of the second laser light is extracted, and this first phase is extracted. delay and on the basis of the second phase delay, the energy of the first molecule to provide a FRET detection device, characterized in that it comprises a processing unit for determining the presence or absence of energy transfer to move to a second molecule, the .

その際、前記処理部は、前記第２の位相差に対する前記第１の位相差の比によって前記エネルギー移動を判定することが好ましい。
又、前記光源制御部は、前記第１のレーザ光を、前記第１のレーザ光の強度変調のために第１の周波数を有する第１の変調信号を用いて強度変調させ、前記第２のレーザ光を、前記第２のレーザ光の強度変調のために第２の周波数を有する第２の変調信号を用いて強度変調させ、前記第１の周波数の変調信号は、前記第２の周波数の変調信号に、前記差分周波数の生成信号を合成して得られた信号であり、前記処理部は、受光した前記第２の分子が発する蛍光の蛍光信号を、前記差分周波数の生成信号に同期して、前記差分周波数の整数倍の周波数をサンプリング周波数としてサンプリングすることが好ましい。その際、前記処理部は、前記サンプリングされた蛍光信号を前記差分周波数の整数分の１の周波数を周波数分解能として周波数分析をすることにより、前記蛍光信号のうちの前記第１の周波数の信号成分と前記蛍光信号のうちの前記第２の周波数の信号成分とを抽出することが好ましい。 In that case, it is preferable that the processing unit determines the energy transfer based on a ratio of the first phase difference to the second phase difference.
Further, the light source controller modulates the intensity of the first laser light using a first modulation signal having a first frequency for intensity modulation of the first laser light, and The laser light is intensity-modulated using a second modulation signal having a second frequency for intensity modulation of the second laser light, and the modulation signal of the first frequency is The signal obtained by synthesizing the generation signal of the difference frequency with the modulation signal, and the processing unit synchronizes the fluorescence signal of the fluorescence emitted from the received second molecule with the generation signal of the difference frequency. Thus, it is preferable to sample a frequency that is an integral multiple of the difference frequency as a sampling frequency. At this time, the processing unit performs frequency analysis on the sampled fluorescence signal using a frequency that is a fraction of the difference frequency as a frequency resolution, so that a signal component of the first frequency in the fluorescence signal is obtained. And a signal component of the second frequency in the fluorescence signal are preferably extracted.

又、前記受光部は、前記第２の分子が発する蛍光の他に、前記第１の分子が発する蛍光を受光し、前記処理部は、前記受光部で受光した第１の分子が発する蛍光の蛍光信号の、第１のレーザ光の強度変調に対する第３の位相遅れを算出し、この第３の位相遅れをＦＲＥＴの発生の有無の判定に用いることもできる。 In addition to the fluorescence emitted by the second molecule, the light receiving unit receives the fluorescence emitted by the first molecule, and the processing unit emits the fluorescence emitted by the first molecule received by the light receiving unit. It is also possible to calculate a third phase lag of the fluorescence signal with respect to the intensity modulation of the first laser beam, and use the third phase lag to determine whether or not FRET has occurred .

本発明は、第１の分子の励起用レーザ光と、第２の分子の励起用レーザ光とを用い、これらのレーザ光を所定の周波数で強度変調を行い、かつ、そのときの強度変調の周波数を、蛍光の識別のために周波数をずらす。さらに、これらのレーザ光によって発する蛍光の受光後、強度変調の周波数が異なることを利用してこの２つの周波数における第２の分子が発する蛍光の位相遅れを求め、これらの位相遅れを用いてＦＲＥＴを検出する。このような信号処理は短時間にできるので、短時間に効率よくサンプルの測定ができ、統計的にＦＲＥＴ検出結果を纏めることができる。
特に、上記２つの位相遅れの比は、ＦＲＥＴの発生により大きく変化する。このため、この比の値を用いることで、ＦＲＥＴ効率が低い場合でもＦＲＥＴの検出を精度良く行うことができる。又、本発明を、フローサイトメータに適用すると、一定速度で測定点を通過するサンプルからの蛍光の信号処理を行うことでＦＲＥＴの検出ができるので、短時間に効率よくサンプルの測定ができ、統計的にＦＲＥＴ検出結果を纏めることができ、注目する分子の相互作用を効率良く調べることができる。 The present invention uses the first molecule excitation laser beam and the second molecule excitation laser beam, modulates the intensity of these laser beams at a predetermined frequency, and performs the intensity modulation at that time. The frequency is shifted for fluorescence identification. Furthermore, after receiving the fluorescence emitted by these laser beams, the phase lag of the fluorescence emitted by the second molecule at these two frequencies is obtained using the fact that the frequency of intensity modulation is different, and FRET is calculated using these phase lags. Is detected. Since such signal processing can be performed in a short time, the sample can be efficiently measured in a short time, and the FRET detection results can be statistically collected.
In particular, the ratio of the two phase delays varies greatly with the occurrence of FRET. For this reason, by using the value of this ratio, it is possible to detect FRET with high accuracy even when the FRET efficiency is low. In addition, when the present invention is applied to a flow cytometer, FRET can be detected by performing signal processing of fluorescence from a sample passing through a measurement point at a constant speed, so that the sample can be measured efficiently in a short time. The FRET detection results can be summarized statistically, and the interaction of the molecules of interest can be efficiently examined.

以下、本発明のＦＲＥＴ検出方法及び装置について詳細に説明する。
図１は、本発明のＦＲＥＴ検出装置の一実施形態であるフローサイトメータ１０の概略構成図である。
フローサイトメータ１０は、レーザ光の照射によって励起された第１の分子（ドナー分子）が発する蛍光を励起光として第２の分子（アクセプター分子）を励起し、この励起されたアクセプター分子が発する蛍光を受光することによって、ドナー分子のエネルギーがアクセプター分子のエネルギーに移動するか否かを判定するものである。このようなエネルギー移動の検出のために、ドナー分子及びアクセプター分子に照射するレーザ光は、一定の周波数で強度変調され、このレーザ光の照射に応答して発する蛍光の位相遅れを、以下に示すように測定することにより、ＦＲＥＴの発生を検出することを特徴とする。 Hereinafter, the FRET detection method and apparatus of the present invention will be described in detail.
FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a flow cytometer 10 which is an embodiment of the FRET detection apparatus of the present invention.
The flow cytometer 10 excites the second molecule (acceptor molecule) using the fluorescence emitted from the first molecule (donor molecule) excited by the laser light irradiation as excitation light, and the fluorescence emitted from the excited acceptor molecule. Is received to determine whether the energy of the donor molecule moves to the energy of the acceptor molecule. In order to detect such energy transfer, the laser light applied to the donor molecule and the acceptor molecule is intensity-modulated at a constant frequency, and the phase delay of the fluorescence emitted in response to the laser light irradiation is shown below. Thus, the occurrence of FRET is detected by measuring as described above.

フローサイトメータ１０は、レーザ光の照射により蛍光するドナー分子及びアクセプター分子のサンプル１２を一定速度で流し、このときサンプル１２にレーザ光を照射し、このサンプル１２が発する蛍光の蛍光信号を検出する検出部２０と、検出部２０で得られた処理結果からサンプル１２においてＦＲＥＴが発生しているか否かの検出を行なう分析装置（コンピュータ）８０とを有する。 The flow cytometer 10 allows a sample 12 of donor molecules and acceptor molecules that fluoresce when irradiated with laser light to flow at a constant speed. At this time, the sample 12 is irradiated with laser light, and a fluorescent fluorescence signal emitted from the sample 12 is detected. The detection unit 20 includes an analysis device (computer) 80 that detects whether FRET has occurred in the sample 12 from the processing result obtained by the detection unit 20.

検出部２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４，２６と、レーザ光源部２２からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部、及びサンプル１２からの蛍光信号を処理する処理部を有する制御・処理部２８と、高速流を形成するシース液とともにサンプル１２を流してフローセルを形成する管路３０と、を有する。
管路３０の出口には、回収容器３２が設けられている。 The detection unit 20 includes a laser light source unit 22, light receiving units 24 and 26, a control unit that modulates the intensity of the laser light from the laser light source unit 22 at a predetermined frequency, and a processing unit that processes the fluorescence signal from the sample 12. The control / processing unit 28 and the pipe line 30 that flows the sample 12 together with the sheath liquid that forms a high-speed flow to form a flow cell.
A recovery container 32 is provided at the outlet of the conduit 30.

レーザ光源部２２は、ドナー分子及びアクセプター分子がレーザ光を吸収して励起状態となる所定の波長のレーザ光を出射するドナー励起光源２２ａ及びアクセプター励起光源２２ｂを有する。
図２は、レーザ光源部２２の概略構成図である。
ドナー励起光源２２ａは、ドナー分子を励起するレーザ光を出射する光源である。アクセプター励起光源２２ｂは、アクセプター分子を励起するレーザ光を出射する光源である。ドナー分子を励起するレーザ光と、アクセプター分子を励起するレーザ光とは、ドナー分子、アクセプター分子をそれぞれ好適に励起することができるように波長帯域が異なっている。例えば、ドナー分子としてＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）を用いる場合、波長４０５〜４４０ｎｍのレーザ光が用いられ、アクセプター分子としてＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）を用いる場合、波長４７０〜５３０ｎｍのレーザ光が用いられる。レーザ光源部２２は、このような可視光帯域の連続波のレーザ光を所定の周波数で強度変調して出射する部分である。 The laser light source unit 22 includes a donor excitation light source 22a and an acceptor excitation light source 22b that emit laser light having a predetermined wavelength that causes a donor molecule and an acceptor molecule to absorb laser light and enter an excited state.
FIG. 2 is a schematic configuration diagram of the laser light source unit 22.
The donor excitation light source 22a is a light source that emits laser light that excites donor molecules. The acceptor excitation light source 22b is a light source that emits laser light that excites acceptor molecules. The wavelength bands of the laser light for exciting the donor molecule and the laser light for exciting the acceptor molecule are different so that the donor molecule and the acceptor molecule can be suitably excited. For example, when CFP (Cyan Fluorescent Protein) is used as the donor molecule, laser light with a wavelength of 405 to 440 nm is used, and when YFP (Yellow Fluorescent Protein) is used as the acceptor molecule, laser light with a wavelength of 470 to 530 nm is used. The laser light source unit 22 is a portion that emits such a continuous wave laser beam in the visible light band after intensity modulation at a predetermined frequency.

各光源のレーザ光の光路上には、レーザ光を同一位置に集束する光学レンズ２３ａ，２３ｂが設けられ、この集束位置を測定対象のサンプル１２が通過するようになっている。
各レーザ光源には、それぞれの光源を駆動してレーザ光を出射させるレーザドライバ３４ａ，３４ｂが接続されており、レーザドライバ３４ａ，３４ｂは、後述する信号生成部（図４参照）４０からの信号によって、レーザ光を強度変調するように制御される。 Optical lenses 23a and 23b for converging the laser light at the same position are provided on the optical path of the laser light of each light source, and the sample 12 to be measured passes through this converging position.
Each laser light source is connected with laser drivers 34a and 34b that drive the respective light sources to emit laser light, and the laser drivers 34a and 34b receive signals from a signal generator 40 (see FIG. 4) described later. Is controlled to modulate the intensity of the laser beam.

レーザ光を出射するドナー励起光源２２ａ及びアクセプター励起光源として例えば半導体レーザが用いられ、例えば５〜１００ｍＷ程度の出力でレーザ光が出射される。レーザ光の強度変調の周波数（変調周波数）は、その強度変調の周期がドナー分子、アクセプター分子が発する蛍光の蛍光緩和時間に比べて長く、例えば１０〜１００ＭＨｚである。ドナー分子を励起するためのレーザ光とアクセプター分子を励起するためのレーザ光とは、強度変調の周波数が１００ｋＨｚ〜２ＭＨｚ異なり、ドナー分子を励起するレーザ光の強度変調の周波数が高くなっている。本発明においては、アクセプター分子を励起するレーザ光の強度変調の周波数がドナー分子を励起するためのレーザ光の強度変調の周波数に比べて高くてもよい。このように、レーザ光の強度変調の周波数を僅かに変えるのは、後述するように、受光した蛍光の蛍光信号の処理が短時間に行われるようにするためである。 For example, a semiconductor laser is used as the donor excitation light source 22a and the acceptor excitation light source that emit laser light, and the laser light is emitted with an output of, for example, about 5 to 100 mW. The intensity modulation frequency (modulation frequency) of the laser light has a period of intensity modulation longer than the fluorescence relaxation time of the fluorescence emitted by the donor molecule and the acceptor molecule, for example, 10 to 100 MHz. The laser light for exciting the donor molecule and the laser light for exciting the acceptor molecule are different in intensity modulation frequency from 100 kHz to 2 MHz, and the intensity modulation frequency of the laser light exciting the donor molecule is high. In the present invention, the frequency of intensity modulation of the laser light for exciting the acceptor molecule may be higher than the frequency of intensity modulation of the laser light for exciting the donor molecule. The reason why the intensity modulation frequency of the laser light is slightly changed in this manner is to allow the processing of the fluorescence signal of the received fluorescence to be performed in a short time, as will be described later.

レーザ光源部２２は、レーザ光がドナー分子及びアクセプター分子をそれぞれ励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光によって発する蛍光は、サンプル１２中のドナー分子及びアクセプター分子の発する蛍光であり、サンプル１２は管路３０を通過する際、測定点でレーザ光の照射を受けて蛍光分子特有の波長で蛍光を発する。 The laser light source unit 22 oscillates in a predetermined wavelength band so that the laser light excites the donor molecule and the acceptor molecule to emit fluorescence in a specific wavelength band. The fluorescence emitted by the laser light is the fluorescence emitted by the donor molecule and the acceptor molecule in the sample 12. When the sample 12 passes through the conduit 30, the sample 12 is irradiated with the laser light at the measurement point and fluoresces at a wavelength specific to the fluorescent molecule. To emit.

受光部２４は、管路３０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、測定点を通過するサンプル１２によってレーザ光が前方散乱することにより、サンプル１２が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この受光部２４から出力される信号は、制御・処理部２８に供給され、制御・処理部２８において標識サンプル１２が管路３０中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。 The light receiving unit 24 is disposed so as to face the laser light source unit 22 with the pipe line 30 interposed therebetween, and the sample 12 passes through the measurement point by the forward scattering of the laser light by the sample 12 passing through the measurement point. A photoelectric converter that outputs a detection signal to that effect. The signal output from the light receiving unit 24 is supplied to the control / processing unit 28, and is used as a trigger signal informing the timing at which the marker sample 12 passes through the measurement point in the pipe 30.

一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して直交方向であって、かつ管路３０中のサンプル１２の移動方向に対して直交方向に配置されている。受光部２６は、測定点にて照射されたサンプル１２が発する蛍光を受光するフォトマルチプライヤ（光電子倍増管）やアバランシュフォトダイオード等の光電変換器が用いられる。
図３は、受光部２６の一例の概略の構成を示す概略構成図である。 On the other hand, the light receiving unit 26 is disposed in a direction orthogonal to the emission direction of the laser light emitted from the laser light source unit 22 and in a direction orthogonal to the moving direction of the sample 12 in the pipe 30. . The light receiving unit 26 is a photoelectric converter such as a photomultiplier (photomultiplier) or an avalanche photodiode that receives fluorescence emitted from the sample 12 irradiated at the measurement point.
FIG. 3 is a schematic configuration diagram illustrating a schematic configuration of an example of the light receiving unit 26.

図３に示す受光部２６は、サンプル１２からの蛍光の蛍光信号を集束させるレンズ系２６ａと、ダイクロイックミラー２６ｂと、バンドパスフィルタ２６ｃ_１,２６ｃ₂と、光電子倍増管やアバランシュフォトダイオード等の光電変換器２７ａ,２７ｂと、を有する。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２７ａ，２７ｂの受光面に集束させるように構成される。 The light receiving unit 26 shown in FIG. 3 includes a lens system 26a for focusing the fluorescence signal of the fluorescence from the sample 12, a dichroic mirror 26b, bandpass filters 26c ₁ and 26c ₂ , and photoelectric elements such as a photomultiplier tube and an avalanche photodiode. Converters 27a and 27b.
The lens system 26a is configured to focus the fluorescence incident on the light receiving unit 26 on the light receiving surfaces of the photoelectric converters 27a and 27b.

ダイクロイックミラー２６ｂは、アクセプター分子の蛍光を透過し、ドナー分子の蛍光を反射させるように、反射、透過の波長特性が定められて構成されたミラーである。バンドパスフィルタ２６ｃ_１，２６ｃ₂でフィルタリングして光電変換器２７ａ，２７ｂは、それぞれドナー分子の蛍光及びアクセプター分子の蛍光所定の波長帯域の蛍光を取り込む。したがって、光電変換器２７ａは、ドナー分子の発する蛍光を受光し、光電変換器２７ｂは、アクセプター分子の発する蛍光を受光する。 The dichroic mirror 26b is a mirror that is configured with reflection and transmission wavelength characteristics so as to transmit the fluorescence of the acceptor molecule and reflect the fluorescence of the donor molecule. Filtering by the bandpass filters 26c ₁ and 26c ₂ , the photoelectric converters 27a and 27b capture the fluorescence of the donor molecule and the fluorescence of the acceptor molecule, respectively, in a predetermined wavelength band. Therefore, the photoelectric converter 27a receives the fluorescence emitted from the donor molecule, and the photoelectric converter 27b receives the fluorescence emitted from the acceptor molecule.

バンドパスフィルタ２６ｃ_１，２６ｃ₂は、各光電変換器２７ａ，２７ｂの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、ドナー分子の蛍光及びアクセプター分子の蛍光の波長帯域に対応して設定されており、互いに異なる波長帯域となっている。 The band-pass filters 26c ₁ and 26c ₂ are filters that are provided in front of the light receiving surfaces of the photoelectric converters 27a and 27b and transmit only fluorescence in a predetermined wavelength band. The wavelength band of the transmitted fluorescence is set corresponding to the wavelength band of the fluorescence of the donor molecule and the fluorescence of the acceptor molecule, and is different from each other.

光電変換器２７ａ，２７ｂは、例えば光電子倍増管を備えたセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。ここで、受光する蛍光は強度変調されたレーザ光の照射によって発する位相が遅れた蛍光であり、この蛍光は、位相遅れの情報を持った光信号として受光される。このため、出力される電気信号は位相差の信号情報を持った蛍光信号となる。この蛍光信号は、制御・処理部２８に供給され、増幅器で増幅される。 The photoelectric converters 27a and 27b are sensors that include, for example, a sensor including a photomultiplier tube, and convert light received by the photoelectric surface into an electrical signal. Here, the received fluorescence is fluorescence with a phase lag caused by irradiation of intensity-modulated laser light, and this fluorescence is received as an optical signal having phase lag information. For this reason, the output electrical signal is a fluorescence signal having signal information of the phase difference. This fluorescence signal is supplied to the control / processing unit 28 and amplified by an amplifier.

制御・処理部２８は、図４に示すように、信号生成部４０と、信号処理部４２と、コントローラ４４と、を有して構成される。信号生成部４０は、所定の周波数の変調信号を生成する本発明の光源制御部を形成する。又、コントローラ４４及び後述の分析装置８０は、本発明における処理部を形成する。
信号生成部４０は、レーザ光の強度を所定の周波数で変調（振幅変調）するための変調信号を生成する部分である。
具体的には、信号生成部４０は、発振器４６，４７、パワースプリッタ４８及びＳＳＢ（Single Side Band）変調器５０及びアンプ５２を有し、生成される変調信号を、レーザ光源部２２のレーザドライバ３４ａ，３４ｂに供給するとともに、信号処理部４２に供給する部分である。信号処理部４２に変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換機２７ａ,２７ｂから出力される蛍光信号の位相差検出のための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定の周波数の正弦波信号であり、１０〜１００ＭＨｚの範囲の周波数に設定される。レーザドライバ３４ｂに供給する変調信号の周波数をｆとすると、ｆは上述したようにアクセプター分子を励起するレーザ光の変調信号の周波数であり、１０〜１００ＭＨｚである。レーザドライバ３４ａに供給する変調信号の周波数は、ドナー分子を励起するレーザ光の周波数であり、ｆ＋Δｆとなる。このときのΔｆは、１００ｋＨｚ〜２ＭＨｚであり、ｆ＝１０〜１００ＭＨｚに比べてその周波数は小さい。 As shown in FIG. 4, the control / processing unit 28 includes a signal generation unit 40, a signal processing unit 42, and a controller 44. The signal generation unit 40 forms a light source control unit of the present invention that generates a modulation signal having a predetermined frequency. Further, the controller 44 and the analysis device 80 described later form a processing unit in the present invention.
The signal generator 40 is a part that generates a modulation signal for modulating (amplitude modulation) the intensity of the laser light at a predetermined frequency.
Specifically, the signal generation unit 40 includes oscillators 46 and 47, a power splitter 48, an SSB (Single Side Band) modulator 50, and an amplifier 52, and generates a modulation signal as a laser driver of the laser light source unit 22. This is a portion that is supplied to 34 a and 34 b and is also supplied to the signal processing unit 42. The reason why the modulation signal is supplied to the signal processing unit 42 is that it is used as a reference signal for detecting the phase difference of the fluorescence signals output from the photoelectric converters 27a and 27b, as will be described later. The modulation signal is a sine wave signal having a predetermined frequency, and is set to a frequency in the range of 10 to 100 MHz. Assuming that the frequency of the modulation signal supplied to the laser driver 34b is f, as described above, f is the frequency of the modulation signal of the laser light that excites the acceptor molecule, and is 10 to 100 MHz. The frequency of the modulation signal supplied to the laser driver 34a is the frequency of the laser beam that excites the donor molecule, and is f + Δf. Δf at this time is 100 kHz to 2 MHz, and its frequency is smaller than that of f = 10 to 100 MHz.

発振器４６は、周波数ｆの正弦波信号を生成し、発振器４７は周波数Δｆの正弦波信号を生成する。ＳＳＢ変調器５０は、周波数ｆの正弦波信号に周波数Δｆの正弦波信号を合成して、高周波側の合成信号（ＵＳＢ信号）である周波数ｆ＋Δｆの正弦波信号を生成する。この正弦波信号は、変調信号としてレーザドライバ３４ａに供給される。レーザドライバ３４ｂには、パワースプリッタ４８から周波数ｆの正弦波信号が変調信号として供給される。 The oscillator 46 generates a sine wave signal having a frequency f, and the oscillator 47 generates a sine wave signal having a frequency Δf. The SSB modulator 50 synthesizes a sine wave signal having a frequency Δf with a sine wave signal having a frequency f to generate a sine wave signal having a frequency f + Δf, which is a combined signal (USB signal) on the high frequency side. This sine wave signal is supplied to the laser driver 34a as a modulation signal. A sine wave signal having a frequency f is supplied as a modulation signal from the power splitter 48 to the laser driver 34b.

図５は、ＳＳＢ変調器５０のブロック構成図である。
ＳＳＢ変調器５０は、９０度ハイブリッド５０ａ、ミキサ５０ｂ，５０ｃ、９０度位相器５０ｄ、１８０度ハイブリッド５０ｅを有して構成される。
９０度ハイブリッド５０ａは、発振器４６から供給される周波数ｆの正弦波信号の位相を０度及び９０度に分離するハイブリッドリングを備える高周波素子であり、０度及び９０度に分離された正弦波信号をミキサ５０ｂ，５０ｃに供給する。一方、９０度位相器５０ｄは、発振器４７から供給された周波数Δｆの正弦波信号を位相０度及び９０度に変えてミキサ５０ｂ，５０ｃに供給する。
１８０度ハイブリッド５０ｅは、受光信号の位相を０度及び１８０度に分離するハイブリッドリングを備える高周波素子であり、端子の一方では、正弦波信号の位相情報を保持したまま、高周波側に周波数ΔｆシフトさせたＵＳＢ信号が生成され、他方の端子では、受光信号の位相情報を保持したまま、低周波側に周波数ΔｆシフトさせたＬＳＢ信号が生成される。
ＳＳＢ変調器５０は、ＵＳＢ信号を出力してレーザドライバ３４ａに供給する。 FIG. 5 is a block diagram of the SSB modulator 50.
The SSB modulator 50 includes a 90 degree hybrid 50a, mixers 50b and 50c, a 90 degree phase shifter 50d, and a 180 degree hybrid 50e.
The 90-degree hybrid 50a is a high-frequency element including a hybrid ring that separates the phase of a sine wave signal having a frequency f supplied from the oscillator 46 into 0 degree and 90 degrees, and the sine wave signal separated into 0 degree and 90 degrees. Is supplied to the mixers 50b and 50c. On the other hand, the 90-degree phase shifter 50d changes the sine wave signal of the frequency Δf supplied from the oscillator 47 to 0 degrees and 90 degrees, and supplies it to the mixers 50b and 50c.
The 180-degree hybrid 50e is a high-frequency element including a hybrid ring that separates the phase of the received light signal into 0 degree and 180 degrees, and one terminal has a frequency Δf shift toward the high-frequency side while retaining the phase information of the sine wave signal. The generated USB signal is generated, and the other terminal generates an LSB signal shifted by the frequency Δf to the low frequency side while maintaining the phase information of the received light signal.
The SSB modulator 50 outputs a USB signal and supplies it to the laser driver 34a.

信号処理部４２は、光電変換器２７ａ,２７ｂから出力される蛍光信号を用いて、レーザ光の照射によりサンプル１２が発する蛍光の位相遅れに関する情報（位相差）を抽出する部分である。信号処理部４２は、光電変換器２７ａ,２７ｂから出力される蛍光信号を増幅するアンプ５４ａ,５４ｂと、増幅された蛍光信号のそれぞれを信号生成部４０から供給された周波数ｆの正弦波信号である変調信号を分配するパワースプリッタ５６、及び増幅された蛍光信号を上記変調信号に合成するＩＱミキサ５８ａ，５８ｂを有する。 The signal processing unit 42 is a part that extracts information (phase difference) related to the phase delay of the fluorescence emitted from the sample 12 by the laser light irradiation, using the fluorescence signals output from the photoelectric converters 27a and 27b. The signal processor 42 amplifies the fluorescence signals output from the photoelectric converters 27a and 27b, and each of the amplified fluorescence signals is a sine wave signal having a frequency f supplied from the signal generator 40. A power splitter 56 for distributing a certain modulation signal and IQ mixers 58a and 58b for synthesizing the amplified fluorescence signal with the modulation signal are provided.

ＩＱミキサ５８ａ，５８ｂは、光電変換器２７ａ，２７ｂから供給されるドナー分子の蛍光及びアクセプター分子の発する蛍光の蛍光信号を、信号生成部４０から供給される変調信号を参照信号として同期して合成するために、光電変換器２７ａ，２７ｂの別に設けられている。変調信号を参照信号として同期して合成することで、後述するように、蛍光の位相遅れを求めることができる。
具体的には、ＩＱミキサのそれぞれは、参照信号を蛍光信号（ＲＦ信号）と乗算して、蛍光信号のｃｏｓ成分（実数部）と高周波成分を含む処理信号を算出するとともに、参照信号の位相を９０度シフトさせた信号を蛍光信号と乗算して、蛍光信号のｓｉｎ成分（虚数部）と高周波成分を含む処理信号を算出する。処理信号は、ドナー分子の発した蛍光の信号及びアクセプター分子の発した２つの蛍光の信号である。このｃｏｓ成分を含む処理信号及びｓｉｎ成分を含む処理信号は、コントローラ４４に供給される。 The IQ mixers 58a and 58b synthesize the fluorescence signal of the donor molecule supplied from the photoelectric converters 27a and 27b and the fluorescence signal of the fluorescence emitted from the acceptor molecule in synchronization with the modulation signal supplied from the signal generator 40 as a reference signal. Therefore, the photoelectric converters 27a and 27b are provided separately. By synchronizing and synthesizing the modulation signal as a reference signal, the phase delay of the fluorescence can be obtained as will be described later.
Specifically, each of the IQ mixers multiplies the reference signal by the fluorescence signal (RF signal) to calculate a processing signal including a cos component (real part) and a high frequency component of the fluorescence signal, and the phase of the reference signal. Is multiplied by the fluorescence signal to calculate a processing signal including a sin component (imaginary part) and a high frequency component of the fluorescence signal. The processing signal is a fluorescence signal emitted by the donor molecule and two fluorescence signals emitted by the acceptor molecule. The processing signal including the cos component and the processing signal including the sin component are supplied to the controller 44.

コントローラ４４は、信号生成部４０に周波数ｆ及びΔｆの正弦波信号を生成させるように制御するとともに、信号処理部４２にて求められた蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を含む処理信号から、高周波成分を取り除いて蛍光信号のｃｏｓ成分及びｓｉｎ成分を求める部分である。 The controller 44 controls the signal generation unit 40 to generate a sine wave signal having a frequency f and Δf, and generates a high frequency signal from the processing signal including the cos component and the sin component of the fluorescence signal obtained by the signal processing unit 42. This is a part for removing the component and obtaining the cos component and the sin component of the fluorescence signal.

具体的には、コントローラ４４は、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイトメータ１０の全動作を制御管理するシステム制御器６０と、信号処理部４２で演算されたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に高周波成分が加算された処理信号から高周波成分を取り除くローパスフィルタ６２と、高周波成分の取り除かれたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号を増幅するアンプ６４と、増幅された処理信号をサンプリングするＡ／Ｄ変換器６６と、を有する。Ａ／Ｄ変換器６６では、高周波成分の取り除かれたｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分の処理信号がサンプリングされて、分析装置８０に供給される。サンプリングは、上述の周波数Δｆの整数倍（好ましくは３倍以上の整数倍）の周波数をサンプリング周波数とする。ローパスフィルタ６２は、Ａ／Ｄ変換器６６によるデジタル化のときのアンチエリアジングのために、かつ周波数Δｆの信号成分を通過させるために、周波数特性が定められる。 Specifically, the controller 44 gives an instruction for operation control of each part, and controls a system controller 60 that controls and manages all operations of the flow cytometer 10, and a cos component calculated by the signal processing unit 42, A low-pass filter 62 that removes the high frequency component from the processed signal obtained by adding the high frequency component to the sin component, a cos component from which the high frequency component has been removed, an amplifier 64 that amplifies the processed signal of the sin component, and the amplified processed signal are sampled. An A / D converter 66. In the A / D converter 66, the processing signals of the cos component and the sin component from which the high frequency component has been removed are sampled and supplied to the analyzer 80. Sampling uses a frequency that is an integral multiple (preferably an integral multiple of 3 or more) of the above-described frequency Δf as a sampling frequency. The low-pass filter 62 has a frequency characteristic for anti-aliasing at the time of digitization by the A / D converter 66 and for passing a signal component of the frequency Δf.

分析装置８０は、供給された処理信号を用いて、上述したΔｆの正弦波信号に同期させて、Δｆの整数分の１の周波数を周波数分解能とする周波数分析を行い、周波数分析を行った０Ｈｚにおける振幅と位相を求めるとともに、周波数Δｆにおける処理信号の振幅と位相を求める。求められた位相は、上述したように周波数ｆにおける正弦波信号を参照信号として同期して合成された処理信号に基づくため、これらの位相は、上記正弦波信号（レーザ光の強度変調）に対する位相遅れとなっている。又、処理信号は、上述したように、レーザ光の照射によりドナー分子の発する蛍光の蛍光信号に由来するものと、アクセプター分子の発する蛍光の蛍光信号に由来するものとを含むので、この２つの蛍光信号を分離するために、周波数０Ｈｚと周波数Δｆにおける振幅と位相が別々に取り出される。 The analysis device 80 uses the supplied processing signal to synchronize with the above-described sine wave signal of Δf, performs frequency analysis with a frequency of 1 / integer of Δf as frequency resolution, and performs frequency analysis to 0 Hz. Is obtained, and the amplitude and phase of the processing signal at the frequency Δf are obtained. Since the obtained phase is based on the processing signal synthesized in synchronism with the sine wave signal at the frequency f as described above as described above, these phases are relative to the sine wave signal (laser light intensity modulation). It is late. In addition, as described above, the processing signals include those derived from the fluorescence signal emitted from the donor molecule upon irradiation with the laser beam and those derived from the fluorescence signal emitted from the acceptor molecule. In order to separate the fluorescence signals, the amplitude and phase at frequency 0 Hz and frequency Δf are taken separately.

分析装置８０は、アクセプター分子の発する蛍光の処理信号の０Ｈｚにおける位相と、周波数Δｆにおける位相を求め、周波数Δｆにおける位相の、０Ｈｚにおける位相に対する比を算出し、この比の値の大小によって、上述したＦＲＥＴ発生の有無を判定する。例えば、上記比が予め設定された閾値を超えた場合、ＦＲＥＴの発生として判定する。 The analyzer 80 obtains the phase at 0 Hz and the phase at the frequency Δf of the fluorescence processing signal emitted from the acceptor molecule, calculates the ratio of the phase at the frequency Δf to the phase at 0 Hz, and determines the ratio according to the magnitude of this ratio. Whether or not FRET has occurred is determined. For example, when the ratio exceeds a preset threshold value, it is determined that FRET has occurred.

このように、アクセプターの発する蛍光の処理信号の０Ｈｚにおける位相と周波数Δｆにおける位相を用いるのは、０Ｈｚにおける処理信号の位相は、アクセプター分子が周波数ｆで強度変調されたレーザ光の照射によって発した蛍光の位相遅れを表し、周波数Δｆにおける処理信号の位相は、周波数ｆ＋Δｆで強度変調されたレーザ光の照射によって発したドナー分子の蛍光を励起光としてアクセプター分子が吸収し、この結果励起したアクセプター分子が発する蛍光の位相遅れ、つまり、ＦＲＥＴの発生により生じた位相遅れを表すからである。 In this way, the phase at 0 Hz and the phase at the frequency Δf of the fluorescence processing signal emitted by the acceptor are used because the phase of the processing signal at 0 Hz is emitted by irradiation of laser light whose acceptor molecule is intensity-modulated at the frequency f. This represents the phase delay of the fluorescence, and the phase of the processing signal at the frequency Δf is that the acceptor molecule absorbs the fluorescence of the donor molecule emitted by the irradiation of the laser light whose intensity is modulated at the frequency f + Δf as the excitation light, and as a result This is because it represents the phase delay of the fluorescence emitted from the light, that is, the phase delay caused by the occurrence of FRET.

周波数Δｆにおける処理信号の位相、すなわちＦＲＥＴの発生により生じた位相遅れは、後述するように、レーザ光が照射されて発するドナー分子の蛍光の蛍光放射速度及びＦＲＥＴの発生速度と、ＦＲＥＴを介して励起したアクセプター分子が発する蛍光の蛍光放射速度と、レーザ光が照射されたアクセプター分子が発する蛍光の蛍光放射速度によって表される。また、０Ｈｚにおける処理信号の位相、すなわちレーザ光の照射によって発した蛍光の位相遅れは、後述するように、レーザ光の照射されてアクセプター分子が発する蛍光の蛍光放射速度によって表される。このため、後述するように、位相遅れの比を求めることで、ＦＲＥＴの発生の有無を判定することができる。特に、ＦＲＥＴの速度はドナー分子の蛍光放射速度及びアクセプター分子の蛍光放射速度に比べてその値が極めて小さい場合が多く、さらにドナー分子及びアクセプター分子の放射速度が比較的等しい場合、上記比の値は２になる。したがって、分析装置８０は、測定結果である位相遅れの比を算出することにより、ＦＲＥＴの発生を上記比の値によって比較的容易に検出することができる。 As will be described later, the phase delay of the processing signal at the frequency Δf, that is, the phase delay caused by the generation of FRET, is caused by the fluorescence emission rate of the donor molecule emitted by the laser light irradiation and the generation rate of FRET, and the FRET This is expressed by the fluorescence emission rate of fluorescence emitted by the excited acceptor molecule and the fluorescence emission rate of fluorescence emitted by the acceptor molecule irradiated with the laser beam. Further, the phase of the processing signal at 0 Hz, that is, the phase delay of the fluorescence emitted by the laser light irradiation, is expressed by the fluorescence emission speed of the fluorescence emitted from the acceptor molecule when irradiated with the laser light, as will be described later. For this reason, as will be described later, the presence or absence of occurrence of FRET can be determined by obtaining the phase delay ratio. In particular, the FRET rate is often very small compared to the fluorescence emission rate of the donor molecule and the fluorescence emission rate of the acceptor molecule, and when the emission rate of the donor molecule and the acceptor molecule is relatively equal, Becomes 2. Therefore, the analyzer 80 can detect the occurrence of FRET relatively easily from the value of the ratio by calculating the ratio of the phase delay as the measurement result.

また、ＦＲＥＴが発生したとき、ドナー分子が発する蛍光の処理信号のΔｆＨｚにおける位相は、ＦＲＥＴの発生に応じて変わる。この位相の変化を用いてＦＲＥＴの発生を検出することもできる。すなわち、ドナー分子の発する蛍光の蛍光信号から、ドナー分子の励起用のレーザ光の強度変調に対する位相遅れを取り出し、この位相遅れをＦＲＥＴの検出に用いることもできる。
勿論、分析装置８０では、処理信号の０Ｈｚ及び周波数Δｆにおける振幅を用いて、ドナー分子及びアクセプター分子が発する蛍光強度を定量的に求めることもでき、周波数Δｆにおける蛍光強度によって、ＦＲＥＴの発生を検出することもできる。
以上が、本発明を実施するフローサイトメータ１０の説明である。 Further, when FRET occurs, the phase at Δf Hz of the fluorescence processing signal emitted by the donor molecule changes according to the occurrence of FRET. The occurrence of FRET can also be detected using this phase change. That is, a phase lag with respect to intensity modulation of the laser light for exciting the donor molecule can be extracted from the fluorescence signal of the fluorescence emitted by the donor molecule, and this phase lag can be used for FRET detection.
Of course, the analyzer 80 can quantitatively determine the fluorescence intensity emitted from the donor molecule and the acceptor molecule by using the amplitude of the processing signal at 0 Hz and the frequency Δf, and the occurrence of FRET is detected by the fluorescence intensity at the frequency Δf. You can also
The above is description of the flow cytometer 10 which implements this invention.

次に、このフローサイトメータ１０で行われるＦＲＥＴの検出方法を説明する。図６は、ＦＲＥＴの発生の検出の流れを示すフローチャートである。 Next, a method for detecting FRET performed by the flow cytometer 10 will be described. FIG. 6 is a flowchart showing a flow of detection of occurrence of FRET.

まず、コントローラ４４からの指示により、周波数ｆの正弦波信号を発振器４６に発生させ、さらに周波数Δｆの正弦波信号を発振器４７に発生させる。周波数ｆの正弦波信号は、パワースプリッタ４８で分けられ、一方は、ＳＳＢ変調器５０に、他方はアンプ５２に供給される。周波数Δｆの正弦波信号はＳＳＢ変調器５０に供給される。
ＳＳＢ変調器５０では、供給された周波数ｆの正弦波信号は周波数Δｆの正弦波信号と合成されて、高周波側の合成信号である周波数ｆ＋Δｆの正弦波信号が生成され、レーザドライバ３４ａに強度変調信号として供給される。 First, in response to an instruction from the controller 44, a sine wave signal having a frequency f is generated in the oscillator 46, and a sine wave signal having a frequency Δf is further generated in the oscillator 47. The sine wave signal having the frequency f is divided by the power splitter 48, and one is supplied to the SSB modulator 50 and the other is supplied to the amplifier 52. A sine wave signal having a frequency Δf is supplied to the SSB modulator 50.
In the SSB modulator 50, the supplied sine wave signal of frequency f is synthesized with a sine wave signal of frequency Δf to generate a sine wave signal of frequency f + Δf, which is a high frequency side synthesized signal, and intensity modulated to the laser driver 34a. Supplied as a signal.

一方、パワースプリッタ４８で分けられた周波数ｆの正弦波信号は、レーザドライバ３４ｂに強度変調信号として供給される。
この状態で、サンプル１２が管路３０を流れ、シースフローが形成される。シースフローは、例えば１００μｍの流路径に１〜１０ｍ／秒の流速を有する。また、サンプル１２にはレーザ光の照射により蛍光を発するドナー分子とアクセプター分子が含まれる。
レーザ光は、ドナー励起光源２２ａから周波数ｆ＋Δｆで強度変調されたレーザ光と、アクセプター励起光源２２ｂから周波数ｆで強度変調されたレーザ光とが同時にサンプル１２に向けて照射される（ステップＳ１０）。
測定点でこれらのレーザ光による照射が成され、受光部２４でサンプル１２の通過を検出すると、検出信号がコントローラ４４にトリガ信号として出力される。 On the other hand, the sine wave signal of frequency f divided by the power splitter 48 is supplied to the laser driver 34b as an intensity modulation signal.
In this state, the sample 12 flows through the conduit 30 and a sheath flow is formed. The sheath flow has a flow rate of 1 to 10 m / sec over a channel diameter of 100 μm, for example. The sample 12 includes donor molecules and acceptor molecules that emit fluorescence when irradiated with laser light.
The laser light is irradiated toward the sample 12 simultaneously from the donor excitation light source 22a and the laser light intensity modulated at the frequency f + Δf and the acceptor excitation light source 22b at the frequency f (step S10).
When irradiation with these laser beams is performed at the measurement point and the passage of the sample 12 is detected by the light receiving unit 24, a detection signal is output to the controller 44 as a trigger signal.

信号処理部４２及びコントローラ４４では、この検出信号をトリガ信号として、ドナー分子が発する蛍光の受光が光電変換器２７ａにて、アクセプター分子が発する蛍光の受光が光電変換器２７ｂにてそれぞれ開始されて、受光された蛍光の蛍光信号の信号処理が行われる（ステップＳ２０）。
具体的には、アンプ５２から供給された周波数ｆの正弦波信号を参照信号として、ＩＱミキサ５４ａ，５４ｂで合成され、ｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に高周波成分が加算された処理信号が生成される。この処理信号は、コントローラ４４に供給される。 In the signal processing unit 42 and the controller 44, with the detection signal as a trigger signal, the light reception of the fluorescence emitted by the donor molecule is started by the photoelectric converter 27a, and the light reception of the fluorescence emitted by the acceptor molecule is started by the photoelectric converter 27b. Then, signal processing of the fluorescence signal of the received fluorescence is performed (step S20).
Specifically, a sine wave signal of frequency f supplied from the amplifier 52 is used as a reference signal and synthesized by the IQ mixers 54a and 54b, and a processing signal in which a high frequency component is added to the cos component and the sin component is generated. This processing signal is supplied to the controller 44.

コントローラ４４では、フィルタリング処理が行われ、ｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分に高周波成分が加算された処理信号から高周波成分が取り除かれ、蛍光信号のｃｏｓ成分、ｓｉｎ成分からなる処理信号が取り出される。この信号は、アンプ６４を介してＡ／Ｄ変換器６６に供給される。
ここで、コントローラ４４のシステム制御器６０には、発振器４７にて生成される周波数Δｆの正弦波信号の整数倍の周波数（ｎ・Δｆ）を持つ信号が供給され、この信号に同期してＡ／Ｄ変換器６６にてドナー分子の発する蛍光の処理信号及びアクセプター分子の発する蛍光の処理信号のサンプリングが行われる（ステップＳ３０）。
こうしてデジタル化された処理信号は、分析装置８０に供給される。 The controller 44 performs a filtering process, removes the high frequency component from the processing signal obtained by adding the high frequency component to the cos component and the sin component, and extracts a processing signal including the cos component and the sin component of the fluorescent signal. This signal is supplied to the A / D converter 66 via the amplifier 64.
Here, the system controller 60 of the controller 44 is supplied with a signal having a frequency (n · Δf) that is an integral multiple of the sine wave signal of the frequency Δf generated by the oscillator 47, and in synchronization with this signal, A The / D converter 66 samples the fluorescence processing signal emitted from the donor molecule and the fluorescence processing signal emitted from the acceptor molecule (step S30).
The processed signal thus digitized is supplied to the analyzer 80.

分析装置８０では、サンプリングされたアクセプター分子の蛍光の処理信号に対して周波数分析が行われる（ステップＳ４０）。周波数分析は、周波数Δｆの整数分の１の周波数を周波数分解能として、行われる。周波数分析後の、０Ｈｚにおける処理信号の成分は、アクセプター分子にレーザ光が照射されて発した蛍光の蛍光信号成分である。周波数Δｆにおける処理信号の成分は、ＦＲＥＴにより発したアクセプター分子の蛍光の蛍光信号成分である。このように、蛍光信号成分は、レーザ光の強度変調の周波数の違いを利用して取り出される。
得られた周波数分析の結果から、０Ｈｚにおけるアクセプター分子の蛍光の処理信号の位相に対する、ΔｆＨｚにおけるアクセプター分子の蛍光の処理信号の位相遅れの比を求める。この比が予め設定された閾値と比較され、この閾値を超える場合、ＦＲＥＴが発生したと判定することで、ＦＲＥＴの検出が行われる（ステップＳ５０）。
その際、アクセプター分子の蛍光の処理信号の他に、ドナー分子の蛍光の処理信号の位相遅れの比を求め、この比を用いて、ＦＲＥＴの検出を綜合的に行うこともできる。
最後に、フローサイトメータ１０にて測定点を通過して測定されるサンプル数が所定の数に達したか、例えばサンプル数が１０００に達したか否かを判定し、サンプル数が所定の数に達するまで測定を続ける。 In the analyzer 80, frequency analysis is performed on the sampled fluorescence processing signal of the acceptor molecule (step S40). The frequency analysis is performed using a frequency that is 1 / integer of the frequency Δf as frequency resolution. The component of the processed signal at 0 Hz after the frequency analysis is a fluorescent signal component of fluorescence emitted by irradiating the acceptor molecule with laser light. The component of the processing signal at the frequency Δf is a fluorescence signal component of the fluorescence of the acceptor molecule emitted by FRET. As described above, the fluorescence signal component is extracted using the difference in the intensity modulation frequency of the laser light.
From the obtained frequency analysis results, the ratio of the phase delay of the acceptor molecule fluorescence processing signal at ΔfHz to the phase of the acceptor molecule fluorescence treatment signal at 0 Hz is determined. This ratio is compared with a preset threshold value, and if it exceeds this threshold value, FRET is detected by determining that FRET has occurred (step S50).
At this time, in addition to the fluorescence processing signal of the acceptor molecule, the phase delay ratio of the fluorescence processing signal of the donor molecule can be obtained, and FRET detection can be performed comprehensively using this ratio.
Finally, it is determined whether the number of samples measured by passing through the measurement points in the flow cytometer 10 has reached a predetermined number, for example, whether the number of samples has reached 1000, and the number of samples is a predetermined number. Continue measuring until it reaches.

このように、強度変調したレーザ光をサンプル中のドナー分子に照射してアクセプター分子から発する蛍光を受光し、信号処理し、レーザ光の強度変調に対する位相遅れを求めることで、ＦＲＥＴの発生の有無の判定を短時間に行うことができ、測定点を通過するサンプルのＦＲＥＴの検出を効率よく行うことができる。 As described above, whether or not FRET is generated by irradiating the donor molecule in the sample with the intensity-modulated laser light, receiving the fluorescence emitted from the acceptor molecule, processing the signal, and obtaining the phase delay with respect to the intensity modulation of the laser light. Can be performed in a short time, and FRET detection of the sample passing through the measurement point can be efficiently performed.

図７は、ドナー分子のエネルギー吸収と蛍光及びアクセプター分子の吸収と蛍光のスペクトルの例を示す図である。図８は、ＦＲＥＴの発生を判り易く説明した説明図である。
図７では、ドナー分子がＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、アクセプター分子がＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）であるときのエネルギーの吸収、蛍光放射の特性を示している。図７中、曲線Ａ₁はＣＦＰのエネルギー吸収スペクトルを、曲線Ａ₂はＣＦＰの蛍光放射スペクトルを、曲線Ｂ₁はＹＦＰのエネルギー吸収スペクトルを、曲線Ｂ₂はＹＦＰの蛍光放射スペクトルをそれぞれ示す。図７中、斜線の部分は、ＣＦＰが放射した蛍光をＹＦＰがエネルギー吸収して、ＦＲＥＴが生じる波長帯域を示す。 FIG. 7 is a diagram illustrating examples of energy absorption and fluorescence of donor molecules and absorption and fluorescence spectra of acceptor molecules. FIG. 8 is an explanatory diagram explaining the occurrence of FRET in an easily understandable manner.
FIG. 7 shows the characteristics of energy absorption and fluorescence emission when the donor molecule is CFP (Cyan Fluorescent Protein) and the acceptor molecule is YFP (Yellow Fluorescent Protein). In FIG. 7, curve A ₁ shows the energy absorption spectrum of CFP, curve A ₂ shows the fluorescence emission spectrum of CFP, curve B ₁ shows the energy absorption spectrum of YFP, and curve B ₂ shows the fluorescence emission spectrum of YFP. In FIG. 7, the shaded portion indicates the wavelength band in which the fluorescence emitted by CFP is absorbed by YFP and FRET occurs.

一般に、ＦＲＥＴは、ドナー分子がレーザ光により励起され、その一部分が蛍光を放射し、一部のエネルギーはクーロン相互作用によりアクセプター分子へ流れる。このエネルギー移動は、２ｎｍ以下の極めて至近距離によって生じるものであり、このエネルギー移動が、分子の相互作用（結合）を表す。したがって、エネルギー移動が起きることで、アクセプター分子が励起されてアクセプター分子から蛍光が放射される。このとき、図７に示すように、ドナー分子の蛍光放射波長帯域と、アクセプター分子のエネルギー吸収の波長帯域とが一部分で重なっていることが、ＦＲＥＴの発生において必要である。 In general, in FRET, a donor molecule is excited by laser light, a part thereof emits fluorescence, and a part of energy flows to an acceptor molecule by Coulomb interaction. This energy transfer is caused by a very close distance of 2 nm or less, and this energy transfer represents a molecular interaction (bonding). Therefore, when energy transfer occurs, the acceptor molecule is excited and fluorescence is emitted from the acceptor molecule. At this time, as shown in FIG. 7, it is necessary for generation of FRET that the fluorescence emission wavelength band of the donor molecule and the wavelength band of energy absorption of the acceptor molecule partially overlap.

本発明では、図８に示すように、周波数ｆ＋Δｆで強度変調したレーザ光が照射されたドナー分子は蛍光を放射し、その蛍光がアクセプター分子を励起して、周波数ｆ＋Δｆで蛍光強度の変化する蛍光をアクセプター分子は放射する。同時に、周波数ｆで強度変調されたレーザ光が照射されたアクセプター分子は周波数ｆで蛍光強度が変化する蛍光を放射する。これによって、周波数ｆ+Δｆの蛍光と周波数ｆの蛍光を同時に受光するが、この２つの蛍光の蛍光信号は、上記周波数の違いによって分離することができる。 In the present invention, as shown in FIG. 8, the donor molecule irradiated with the laser beam whose intensity is modulated at the frequency f + Δf emits fluorescence, and the fluorescence excites the acceptor molecule, and the fluorescence whose fluorescence intensity changes at the frequency f + Δf. The acceptor molecule emits. At the same time, the acceptor molecule irradiated with the laser beam whose intensity is modulated at the frequency f emits fluorescence whose fluorescence intensity changes at the frequency f. As a result, the fluorescence having the frequency f + Δf and the fluorescence having the frequency f are simultaneously received. The fluorescence signals of the two fluorescences can be separated by the difference in the frequencies.

このようなＦＲＥＴの現象を、１次の緩和過程により以下のように簡単に説明することができる。具体的に、ＦＲＥＴ現象は、以下の方程式で規定される。 Such a FRET phenomenon can be simply explained as follows by a first-order relaxation process. Specifically, the FRET phenomenon is defined by the following equation.

ここで、Ｗ_dはドナー分子の励起状態密度、Ｗ_aはアクセプター分子の励起状態密度、ｋ_dはドナー分子の蛍光放射速度、k_aはアクセプターの蛍光放射速度、k_daはＦＲＥＴ速度をそれぞれ表す。また、ｐe^jωｔはレーザ光により単位時間に励起される状態密度であり、ωは２πｆ（ｆは強度変調の周波数）を表す（角周波数）。

Here, W _d represents the excited state density of the donor molecule, W _a represents the excited state density of the acceptor molecule, k _d represents the fluorescence emission rate of the donor molecule, k _a represents the fluorescence emission rate of the acceptor, and k _da represents the FRET rate. . Further, pe ^jωt is a density of states excited per unit time by laser light, and ω represents 2πf (f is the frequency of intensity modulation) (angular frequency).

ここで、Ｗ_d及びＷ_aは角周波数ωを用いて下記式（３）、（４）で表される。

Here, W _d and W _a are expressed by the following formulas (3) and (4) using the angular frequency ω.

上記式（３）、（４）におけるＷ_d、Ｗ_aの位相は、下記式（５），（６）となる。
一方、レーザ光がアクセブター分子を直接励起して蛍光を発するとき、蛍光は下記式（７）にしたがって表される。 The phases of W _d and W _a in the above formulas (3) and (4) are the following formulas (5) and (6).
On the other hand, when the laser light directly excites the acceptor molecule and emits fluorescence, the fluorescence is expressed according to the following formula (7).

レーザ光の照射により励起したアクセプター分子が蛍光を発するとき、Ｗ_aは、上記式（７）から下記式（８）で表され、下記式（９）に示す位相を生じる。 When the acceptor molecule excited by the irradiation of laser light emits fluorescence, W _a is expressed by the following formula (8) from the above formula (7), and the phase shown by the following formula (9) is generated.

このとき、上記式（６）及び式（９）から位相の比を求めると、下記式（１０）のようになる。 At this time, when the phase ratio is obtained from the above equations (6) and (9), the following equation (10) is obtained.

上記式（１０）で求められる比は、アクセプター分子に直接レーザ光を照射したときの位相遅れに対する、ドナー分子にレーザ光を照射しＦＲＥＴを介してアクセプター分子が発する蛍光の位相遅れの比を表す。したがって、この比の値と予め設定された閾値とを比較して、比の値が閾値よりが大きい場合ＦＲＥＴが発生していると判定する。
特に、多くのドナー分子及びアクセプター分子において、ｋ_d，ｋ_a＞＞k_daであるので、上記式（１０）は、下記式（１１）のように表すことができ、ｋ_d,ｋ_aにて比を表すことができる。さらに、ω²＜＜ｋ_d・ｋ_aのとき、上記比は、下記式（１２）のように表される。
特に、上記放射速度ｋ_d,ｋ_aが比較的等しい場合、上記式（１２）で定まる比の値は２になる。したがって、分析装置８０では、アクセプター分子の放射する蛍光の測定結果である位相遅れの比を算出することにより、ＦＲＥＴの発生の有無を精度良く判定することができる。 The ratio obtained by the above formula (10) represents the ratio of the phase delay of the fluorescence emitted from the acceptor molecule via FRET when the donor molecule is irradiated with the laser light, with respect to the phase delay when the acceptor molecule is directly irradiated with the laser beam. . Therefore, this ratio value is compared with a preset threshold value, and if the ratio value is larger than the threshold value, it is determined that FRET has occurred.
In particular, since k _d , k _a >> k _da in many donor molecules and acceptor molecules, the above formula (10) can be expressed as the following formula (11), and k _d , k _a To express the ratio. Furthermore, when ^{_{_{ω 2 << k d · k a}}} , the ratio is expressed by the following equation (12).
In particular, when the radiation velocities k _d and k _a are relatively equal, the value of the ratio determined by the above equation (12) is 2. Therefore, the analyzer 80 can accurately determine the presence or absence of FRET by calculating the ratio of the phase delay that is the measurement result of the fluorescence emitted from the acceptor molecule.

フローサイトメータ１０では、単独のドナー分子をレーザ光で照射したときの蛍光の位相遅れと、レーザ光を照射してアクセプター分子との間でＦＲＥＴが発生したときのドナー分子の蛍光の位相遅れとの比を求めることもできるが、アクセプター分子における位相遅れの比の値が上述したように２になるとき、ドナー分子における位相遅れの比の値は１近傍の値となり、アクセプター分子における位相遅れの比に比べてＦＲＥＴの検出が難しくなる。このため、本発明では、アクセプター分子の蛍光の位相遅れの比を求める。勿論、アクセプター分子の蛍光の位相遅れの比に加えて、ドナー分子の蛍光の位相遅れの比を用いてＦＲＥＴを綜合的に検出することもできる。 In the flow cytometer 10, the phase delay of fluorescence when a single donor molecule is irradiated with laser light and the phase delay of fluorescence of the donor molecule when FRET is generated between the acceptor molecule by irradiation with laser light. However, when the value of the phase lag ratio in the acceptor molecule becomes 2, as described above, the value of the phase lag ratio in the donor molecule becomes a value close to 1, and the value of the phase lag in the acceptor molecule It becomes difficult to detect FRET compared to the ratio. For this reason, in the present invention, the ratio of the phase delay of the fluorescence of the acceptor molecule is obtained. Of course, in addition to the ratio of the phase delay of the fluorescence of the acceptor molecule, the ratio of the phase delay of the fluorescence of the donor molecule can be used to detect FRET in a comprehensive manner.

従来、ドナー分子の励起用レーザ光をドナー分子に照射し、ＦＲＥＴを介して発するアクセプター分子の蛍光強度を測定する方法が行われている。しかし、この方法の場合、アクセプター分子がドナー分子の励起用レーザ光によって励起されて蛍光を発することもあり、ＦＲＥＴにより励起されたアクセプター分子の発する蛍光の他、ドナー分子の励起用レーザ光によって励起されて発するアクセプター分子の蛍光を余分に受光する。このため、発生効率の低いＦＲＥＴの場合ＦＲＥＴの誤検出を行うといった問題が生じる。しかし、本発明は、ドナー分子の励起用レーザ光と、アクセプター分子の励起用レーザ光とを用い、これらのレーザ光を所定の周波数で強度変調を行い、かつ、そのときの強度変調の周波数を、蛍光の識別のために周波数Δｆずらす。さらに、これらのレーザ光によって発する蛍光の受光後、ＦＲＥＴを介して発するアクセプター分子の蛍光の位相遅れと、アクセプター分子がレーザ光で励起されて発する蛍光の位相遅れとを求め、これらの位相遅れを用いてＦＲＥＴを検定する。このとき位相遅れの比の値は、上述したようにＦＲＥＴの有無により比較的大きく変化する。このため、ＦＲＥＴ効率が低い場合でも検出を精度良く行うことができる。又、上記フローサイトメータにおいて、信号処理を行うことでＦＲＥＴの検出ができるので、短時間に効率よくサンプルの測定ができ、統計的にＦＲＥＴ検出結果を纏めることができ、注目する分子の相互作用を調べることができる。 Conventionally, a method of measuring the fluorescence intensity of an acceptor molecule emitted through FRET by irradiating the donor molecule with a laser beam for exciting the donor molecule has been performed. However, in this method, the acceptor molecule may be excited by the excitation laser beam of the donor molecule to emit fluorescence. In addition to the fluorescence emitted by the acceptor molecule excited by FRET, the acceptor molecule is excited by the excitation laser beam of the donor molecule. Then, the fluorescence of the acceptor molecule emitted is received extra. For this reason, there arises a problem that FRET is erroneously detected in the case of FRET with low generation efficiency. However, the present invention uses the excitation laser light of the donor molecule and the excitation laser light of the acceptor molecule, modulates the intensity of these laser lights at a predetermined frequency, and sets the frequency of the intensity modulation at that time. The frequency Δf is shifted for fluorescent identification. Further, after receiving the fluorescence emitted by these laser beams, the phase lag of the fluorescence of the acceptor molecule emitted via FRET and the phase lag of the fluorescence emitted when the acceptor molecule is excited by the laser beam are obtained. Use to test FRET. At this time, the value of the phase lag ratio changes relatively greatly depending on the presence or absence of FRET as described above. For this reason, even when the FRET efficiency is low, detection can be performed with high accuracy. In addition, since the FRET can be detected by performing signal processing in the above flow cytometer, the sample can be measured efficiently in a short time, the FRET detection results can be summarized statistically, and the interaction of the molecule of interest Can be examined.

以上、本発明のＦＲＥＴ検出方法及び装置について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。 As mentioned above, although the FRET detection method and apparatus of this invention were demonstrated in detail, this invention is not limited to the said embodiment, In the range which does not deviate from the main point of this invention, you may make various improvement and a change. Of course.

本発明のＦＲＥＴ検出装置の一実施形態であるフローサイトメータの概略構成図である。It is a schematic block diagram of the flow cytometer which is one Embodiment of the FRET detection apparatus of this invention. 図１に示すフローサイトメータにおけるレーザ光源部の概略構成図である。It is a schematic block diagram of the laser light source part in the flow cytometer shown in FIG. 図１に示すフローサイトメータにおける受光部の概略構成図である。It is a schematic block diagram of the light-receiving part in the flow cytometer shown in FIG. 図１に示すフローサイトメータにおける制御・処理部の概略構成図である。It is a schematic block diagram of the control and processing part in the flow cytometer shown in FIG. 図４に示す制御・処理部におけるＳＳＢ変調器のブロック構成図である。FIG. 5 is a block configuration diagram of an SSB modulator in the control / processing unit shown in FIG. 4. 本発明のＦＲＥＴ検出方法の一例の流れを示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the flow of an example of the FRET detection method of this invention. ドナー分子のエネルギー吸収と蛍光及びアクセプター分子の吸収と蛍光のスペクトルの例を示す図である。It is a figure which shows the example of the energy absorption and fluorescence of a donor molecule, and the absorption and fluorescence spectrum of an acceptor molecule. ＦＲＥＴの発生を説明する説明図である。It is explanatory drawing explaining generation | occurrence | production of FRET.

Explanation of symbols

１０フローサイトメータ
１２サンプル
２０検出部
２２レーザ光源部
２２ａドナー励起光源
２２ｂアクセプター励起光源
２３ａ，２３ｂレンズ系
２４，２６受光部
２６ａレンズ系
２６ｂダイクロイックミラー
２６ｃ₁，２６ｃ₂ バンドパスフィルタ
２７ａ，２７ｂ光電変換器
２８制御・処理部
３０管路
３２回収容器
３４ａ，３４ｂレーザドライバ
４０信号生成部
４２信号処理部
４４コントローラ
４６，４７発振器
４８，５６パワースプリッタ
５０ＳＳＢ変調器
５０ａ９０度ハイブリッド
５０ｂ，５０ｃミキサ
５０ｄ９０°移相器
５２，５４ａ，５４ｂ，６４増幅器
５８ａ，５８ｂＩＱミキサ
６０システム制御器
６２ローパスフィルタ
６６Ａ／Ｄ変換器
８０分析装置 10 flow cytometer 12 sample 20 detector 22 laser light source unit 22a donor excitation light source 22b acceptor excitation light source 23a, 23b lens systems 24, 26 light-receiving portion 26a lens system 26b dichroic mirror 26c _1, 26c ₂ bandpass filters 27a, 27b Photoelectric conversion Controller 28 Control / Processing Unit 30 Pipe Line 32 Recovery Containers 34a, 34b Laser Driver 40 Signal Generation Unit 42 Signal Processing Unit 44 Controller 46, 47 Oscillator 48, 56 Power Splitter 50 SSB Modulator 50a 90 Degree Hybrid 50b, 50c Mixer 50d 90 ° Phase shifters 52, 54a, 54b, 64 Amplifiers 58a, 58b IQ mixer 60 System controller 62 Low-pass filter 66 A / D converter 80 Analyzer

Claims

A FRET detection method for detecting FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in which energy of a first molecule excited by laser light irradiation moves to a second molecule,
In order to excite the first molecule, the first molecule is irradiated with the first laser light whose intensity is modulated at the first frequency, and the second molecule is excited to be different from the first frequency. Irradiating the second molecule with a second laser beam modulated in intensity at a frequency of two;
Receiving the fluorescence emitted by the second molecule;
The first phase delay of the signal component of the first frequency in the fluorescence signal of the fluorescence emitted from the received second molecule with respect to the intensity modulation of the first laser beam, and the received second molecule emits. A second phase lag of the signal component of the second frequency in the fluorescence signal of the fluorescence with respect to the intensity modulation of the second laser light is extracted, and based on the first phase lag and the second phase lag. Te, FRET detection method characterized by comprising the steps of determining the presence or absence of energy transfer the energy of the first molecule is moved to a second molecule, the.

The FRET detection method according to claim 1, wherein the energy transfer is determined by a ratio of the first phase lag to the second phase lag.

The first laser beam is intensity-modulated using a first modulation signal having a first frequency for intensity modulation of the first laser beam, and the second laser beam is the second laser beam Intensity modulation is performed using a second modulation signal having a second frequency for intensity modulation of laser light, and the modulation signal of the first frequency is converted into the modulation signal of the second frequency by the difference frequency. It is a signal obtained by synthesizing the generated signal,
3. The FRET according to claim 1, wherein a fluorescence signal of fluorescence emitted from the received second molecule is sampled with a frequency that is an integral multiple of the difference frequency as a sampling frequency in synchronization with the generation signal of the difference frequency. Detection method.

The sampled fluorescence signal is subjected to frequency analysis with a frequency that is a fraction of an integer of the difference frequency as a frequency resolution, whereby the first frequency component of the fluorescence signal and the first of the fluorescence signals. 4. The FRET detection method according to claim 3, wherein a signal component having a frequency of 2 is extracted.

When receiving the fluorescence emitted by the second molecule, further receiving the fluorescence emitted by the first molecule;
A third phase lag with respect to the intensity modulation of the first laser light of the fluorescence signal emitted from the first molecule received is calculated, and the third phase lag is used to determine whether or not FRET has occurred. Item 5. The FRET detection method according to any one of Items 1 to 4.

A FRET detection device that detects FRET in which energy of a first molecule excited by laser light irradiation moves to a second molecule,
A laser light source that irradiates the first molecule with the first laser beam to excite the first molecule and irradiates the second molecule with the second laser beam to excite the second molecule. And
A light receiving portion for receiving fluorescence emitted by the second molecule;
The intensity of the first laser beam emitted from the laser light source unit is modulated at a first frequency, and the intensity of the second laser beam emitted from the laser light source unit is modulated at a second frequency different from the first frequency. A light source control unit that generates a modulation signal;
The first phase delay of the signal component of the first frequency in the fluorescence signal of the fluorescence emitted from the received second molecule with respect to the intensity modulation of the first laser beam, and the received second molecule emits. A second phase lag of the signal component of the second frequency in the fluorescence signal of the fluorescence with respect to the intensity modulation of the second laser light is extracted, and based on the first phase lag and the second phase lag. Te, FRET detection device, characterized in that it comprises a processing unit for energy of the first molecule to determine the presence or absence of energy transfer to move to a second molecule, the.

Wherein the processing unit, FRET detection device according to claim 6 to determine the energy transfer by the ratio of the first phase difference with respect to the second phase difference.

The light source control unit modulates the intensity of the first laser light using a first modulation signal having a first frequency for intensity modulation of the first laser light, and the second laser light. Is intensity-modulated using a second modulation signal having a second frequency for intensity modulation of the second laser beam, and the modulation signal of the first frequency is the modulation signal of the second frequency And a signal obtained by synthesizing the generated signal of the difference frequency,
The said processing part samples the fluorescence signal of the fluorescence which the said 2nd molecule | numerator received light synchronizes with the production | generation signal of the said difference frequency as a sampling frequency using the frequency of the integral multiple of the said difference frequency. The FRET detection device according to 1.

The processing unit performs frequency analysis on the sampled fluorescence signal using a frequency that is a fraction of the difference frequency as an integer, so that the signal component of the first frequency of the fluorescence signal and the fluorescence The FRET detection apparatus according to claim 8, wherein a signal component of the second frequency is extracted from a signal.

The light receiving unit receives the fluorescence emitted by the first molecule in addition to the fluorescence emitted by the second molecule,
The processing unit calculates a third phase delay of the fluorescence signal of the fluorescence emitted by the first molecule received by the light receiving unit with respect to the intensity modulation of the first laser beam, and calculates the third phase delay of the FRET. The FRET detection apparatus according to any one of claims 6 to 9, which is used to determine whether or not the occurrence has occurred .