JP4345427B2 - Nucleotide chain cleavage method - Google Patents

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Description

本発明は、例えば、ｓｓＤＮＡやｃＤＮＡ等の一本鎖のヌクレオチド鎖を切断する方法に関する。   The present invention relates to a method for cleaving a single-stranded nucleotide chain such as ssDNA or cDNA.

現在、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列されたいわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、「ＤＮＡチップ」と総称する。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。   Currently, an integrated substrate for a bioassay called a so-called DNA chip or a DNA microarray (hereinafter collectively referred to as “DNA chip”) in which predetermined DNA is finely arranged by microarray technology is used for gene mutation analysis, SNPs (single bases). Polymorphism) analysis, gene expression frequency analysis, etc., and has begun to be widely used in drug discovery, clinical diagnosis, pharmacogenomics, forensic medicine and other fields.

ＤＮＡチップは、ガラスやシリコン等の基板上にＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（Complementary DNA）等の検出用のＤＮＡ（ＤＮＡプローブ）が配置されており、そのＤＮＡプローブに対して検体等から抽出された一本鎖のターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーションさせることにより、ＤＮＡ解析を行うことができる。   In a DNA chip, a DNA oligo chain or a detection DNA (DNA probe) such as cDNA (Complementary DNA) is arranged on a substrate such as glass or silicon, and the DNA probe is extracted from a specimen or the like. DNA analysis can be performed by hybridizing the target DNA of this strand.

ＤＮＡチップによるＤＮＡの解析は、ハイブリダイゼーションしたＤＮＡプローブ及びターゲットＤＮＡに対してインターカレータ等を挿入し、所定の検出器で蛍光測定を行うことによってターゲットＤＮＡの塩基配列を判断する。   For DNA analysis using a DNA chip, an intercalator or the like is inserted into a hybridized DNA probe and target DNA, and fluorescence measurement is performed with a predetermined detector to determine the base sequence of the target DNA.

特表２０００−５０３８４５号Special table 2000-503845

ところで、ターゲットＤＮＡは、自然な状態では数キロベースにも及ぶ長さとなってしまう。   By the way, the target DNA naturally has a length of several kilobases.

そのため、ターゲットＤＮＡがランダムコイル状になり、立体障害によりハイブリダイゼーションを阻害してしまう。また、図１３に示すように、ＤＮＡプローブ（Ｐ）とターゲットＤＮＡ（Ｔ）とをハイブリダイゼーションを行ったとしても、ターゲットＤＮＡ（Ｔ）ハイブリダイゼーションが行われていない余剰部分が多い。そのため、その余剰部分が自身でハイブリダイゼーションを起してしまい、この部分が蛍光検出を行った時のノイズとなってしまう。   Therefore, the target DNA becomes a random coil shape, and hybridization is inhibited due to steric hindrance. Further, as shown in FIG. 13, even if the DNA probe (P) and the target DNA (T) are hybridized, there are many surplus portions where the target DNA (T) hybridization is not performed. Therefore, the surplus part causes hybridization by itself, and this part becomes noise when fluorescence detection is performed.

このような問題を解決するために、ＤＮＡプローブの塩基配列とは関係しない部位（解析対象となっていない部位）に関しては、ハイブリダイゼーションの後に、又は、ハイブリダイゼーションの前から、ターゲットＤＮＡから除去することが望ましい（特許文献１参照。）。   In order to solve such a problem, a portion not related to the base sequence of the DNA probe (a portion not to be analyzed) is removed from the target DNA after hybridization or before hybridization. It is desirable (see Patent Document 1).

一般に、ｃＤＮＡ等を切断する手法として、超音波により切断する手法が知られている。しかしながら、超音波を用いる手法の場合、切断位置を特定することができずｃＤＮＡの長さがまちまちとなり、例えば蛍光測定等を行った時に蛍光の検出強度が安定しない。   In general, as a technique for cutting cDNA or the like, a technique for cutting by ultrasonic waves is known. However, in the case of the technique using ultrasonic waves, the cutting position cannot be specified, and the length of the cDNA varies, and the fluorescence detection intensity is not stable when, for example, fluorescence measurement is performed.

そこで、以上のような問題を解決するため、ｃＤＮＡ等の一本鎖のヌクレオチド鎖を特定の位置で切断することができるヌクレオチド鎖の切断方法を提供すること目的とする。   Therefore, in order to solve the above problems, an object is to provide a method for cleaving a nucleotide chain that can cleave a single-stranded nucleotide chain such as cDNA at a specific position.

本発明に係るヌクレオチド鎖の切断方法は、切断対象となるヌクレオチド鎖（ターゲット）に対して、制限酵素の認識配列を含むプライマをハイブリダイゼーションし、上記プライマが結合された上記ターゲットを上記所定の制限酵素を用いて切断する。   In the method for cleaving a nucleotide chain according to the present invention, a primer containing a recognition sequence of a restriction enzyme is hybridized to a nucleotide chain (target) to be cleaved, and the target to which the primer is bound is bound to the predetermined restriction. Cleave with an enzyme.

例えば、本発明に係るヌクレオチド鎖の切断方法は、切断対象となるターゲットの塩基配列のうち必要な領域を特定し、該必要な領域以外の領域から、該必要な領域を挟んだ、同一の又は異なる２つの所定の制限酵素の認識配列を検出し、検出した同一の又は異なる２つの所定の制限酵素の認識配列のそれぞれに対して、該制限酵素の認識配列を少なくとも含むとともに該認識配列と連続している３´側及び５´側の塩基配列を含めることによって、上記必要な領域の塩基配列に対して特異な１種又は２種の配列を形成し、上記１種の配列に対して又は上記２種の配列のそれぞれに対して相補的な塩基配列であるプライマを生成し、上記ターゲットと上記プライマとをハイブリダイゼーションすることによって、上記ターゲットにプライマを結合させ、プライマが結合されたターゲットを上記所定の制限酵素を用いて切断する。 For example, in the method for cleaving a nucleotide chain according to the present invention, a necessary region is identified from the target base sequence to be cleaved , and the necessary region is sandwiched between the regions other than the necessary region. Two different restriction enzyme recognition sequences are detected, and each of the detected identical or different two restriction enzyme recognition sequences includes at least the restriction enzyme recognition sequence and is continuous with the recognition sequence. and by including in that 3'-side and 5'-side nucleotide sequence, said to form a sequence of specific one or relative nucleotide sequence of the region required, or for the one sequence A primer that is a base sequence complementary to each of the two types of sequences is generated, and the target and the primer are hybridized to bind the primer to the target. Is case, the target primer is bound to cut with the predetermined restriction enzymes.

本発明に係るヌクレオチド鎖の切断方法では、切断対象となるヌクレオチド鎖（ターゲット）に対して、制限酵素の認識配列を含むプライマをハイブリダイゼーションし、プライマ所定の制限酵素を用いて切断するので、特定の位置でｃＤＮＡ等の一本鎖のヌクレオチド鎖を切断することが、また、切断後に残存するヌクレオチド鎖の長さを特定することができる。   In the method for cleaving a nucleotide chain according to the present invention, a primer containing a restriction enzyme recognition sequence is hybridized to a nucleotide chain (target) to be cleaved, and the primer is cleaved using a predetermined restriction enzyme. It is possible to cleave a single-stranded nucleotide chain such as cDNA at the position of, and to specify the length of the nucleotide chain remaining after cleavage.

以下、本発明の実施の形態として、ハイブリダイゼーションを行う際におけるターゲットＤＮＡの切断の方法について説明をする。   Hereinafter, as an embodiment of the present invention, a method of cleaving a target DNA when performing hybridization will be described.

なお、ここで、ターゲットＤＮＡとは、解析対象となる一本鎖のヌクレオチド鎖であり、例えばｃＤＮＡやｓｓＤＮＡ、一本鎖のＲＮＡ等である。また、プローブとは、ターゲットＤＮＡの解析対象となる部位の塩基配列に対して相補的な塩基配列とされているヌクレオチド鎖である。通常、プローブは、ＤＮＡチップ上のウェル内に固定化されている。   Here, the target DNA is a single-stranded nucleotide chain to be analyzed, such as cDNA, ssDNA, single-stranded RNA, or the like. The probe is a nucleotide chain having a base sequence complementary to the base sequence of the site to be analyzed of the target DNA. Usually, the probe is immobilized in a well on the DNA chip.

まず、ターゲットＤＮＡの塩基配列に基づき切断用プライマを作成する。   First, a cutting primer is prepared based on the base sequence of the target DNA.

図１（Ａ）に示すように、ハイブリダイゼーションの対象となるターゲットＤＮＡの塩基配列中で、プローブがハイブリダイゼーションする塩基配列の領域（プローブ設計領域[Ｐ]）を特定する。   As shown in FIG. 1A, the base sequence region (probe design region [P]) to which the probe hybridizes is specified in the base sequence of the target DNA to be hybridized.

続いて、図１（Ｂ）に示すように、ターゲットＤＮＡのプローブ設計領域[Ｐ]を除く領域で、任意の制限酵素認識配列と同一の配列の領域（制限酵素認識領域：[Ｘ１]，[Ｘ２]，[Ｘ３]…）を見つけ出す。なお、制限酵素とは、特定の塩基配列のパターンを検出して、そこで二本鎖のＤＮＡを切断する酵素のことである。制限酵素は、その種類毎にそれぞれ特異的な切断パターンを持っており、そこでしか二本鎖のＤＮＡは切断されないものである。また、見つけ出す制限酵素認識領域は、複数の制限酵素の認識配列を含んでいてもよい。 Subsequently, as shown in FIG. 1 (B), in a region excluding the probe design region [P] of the target DNA, a region having the same sequence as any restriction enzyme recognition sequence (restriction enzyme recognition region: [X 1 ], [X 2 ], [X 3 ] ...) are found out. The restriction enzyme is an enzyme that detects a pattern of a specific base sequence and cleaves double-stranded DNA there. Each restriction enzyme has a specific cleavage pattern for each type, and double-stranded DNA is cleaved only there. In addition, the restriction enzyme recognition region to be found may include a plurality of restriction enzyme recognition sequences.

続いて、図１（Ｃ）に示すように、見つけ出した複数の制限酵素認識領域（[Ｘ１]，[Ｘ２]，[Ｘ３]…）のなかから、プローブ設計領域[Ｐ]を挟んで２つの制限酵素認識領域[Ｙ１]，[Ｙ２]を選択する。選択した２つの制限酵素認識領域[Ｙ１]，[Ｙ２]の間に挟まれた領域のことを領域のことを、ここでは選択領域[Ｚ]という。 Subsequently, as shown in FIG. 1 (C), the probe design region [P] is sandwiched from the plurality of restriction enzyme recognition regions found ([X 1 ], [X 2 ], [X 3 ]...). To select two restriction enzyme recognition regions [Y 1 ], [Y 2 ]. A region sandwiched between two selected restriction enzyme recognition regions [Y 1 ] and [Y 2 ] is referred to herein as a selection region [Z].

なお、図１（Ｄ）に示すように、１つの制限酵素認識領域[Ｙ１]のみを選択して、一方をターゲットＤＮＡの末端としてもよい。この場合、選択領域[Ｚ]は、選択した制限酵素認識領域[Ｙ１]から、プローブ設計領域[Ｐ]を挟んで反対側にある末端までの領域となる。 Note that, as shown in FIG. 1D, only one restriction enzyme recognition region [Y 1 ] may be selected, and one of them may be the end of the target DNA. In this case, the selection region [Z] is a region from the selected restriction enzyme recognition region [Y 1 ] to the terminal on the opposite side across the probe design region [P].

続いて、図１（Ｅ）に示すように、制限酵素認識領域[Ｙ１]及び制限酵素認識領域[Ｙ２]のそれぞれに対して、制限酵素認識領域[Ｙ１]（又は制限酵素認識領域[Ｙ２]）を少なくとも含み、さらに、制限酵素認識領域[Ｙ１]の３´側及び５´側の塩基配列を含んだ領域（プライマ特定領域[Ｒ]）を特定する。 Subsequently, as shown in FIG. 1 (E), the restriction enzyme recognition region [Y 1 ] (or restriction enzyme recognition region) for each of the restriction enzyme recognition region [Y 1 ] and the restriction enzyme recognition region [Y 2 ]. [Y 2]) includes at least a further identifies a region including the base sequence of the 3'-side and 5'-side of the restriction enzyme recognition regions [Y 1] (primer specific area [R]).

ここで、プライマ特定領域[Ｒ]は、選択領域[Ｚ]内で特異な配列でなければならない。つまり、プライマ特定領域[Ｒ]と同一の塩基配列が、選択領域[Ｚ]内に存在してはならない。従って、選択領域[Ｚ]内で特異な配列となるように、３´側及び５´側の塩基の数を増減しながら、プライマ特定領域[Ｒ]を決定する。なお、プライマ特定領域[Ｒ]は、選択領域[Ｚ]内で特異な配列にさえなっていれば、制限酵素認識領域[Ｙ１]の３´側及び５´側のいずれか一方の塩基配列又は両者の塩基配列を、含んでいなくてもよい。 Here, the primer specific region [R] must be a unique sequence within the selection region [Z]. That is, the same base sequence as the primer specific region [R] must not exist in the selected region [Z]. Accordingly, the primer specifying region [R] is determined while increasing or decreasing the number of bases on the 3 ′ side and the 5 ′ side so that a unique sequence is obtained in the selected region [Z]. As long as the primer specific region [R] has a unique sequence within the selected region [Z], either the 3′-side or 5′-side base sequence of the restriction enzyme recognition region [Y 1 ] Alternatively, the base sequences of both may not be included.

続いて、図１（Ｆ）に示すように、プライマ特定領域[Ｒ]の塩基配列と相補的な塩基配列のプライマ（切断用プライマ１０）を生成する。   Subsequently, as shown in FIG. 1 (F), a primer having a base sequence complementary to the base sequence of the primer specifying region [R] (cutting primer 10) is generated.

この切断用プライマ１０がターゲットＤＮＡの切断に用いられる。   This cutting primer 10 is used for cutting the target DNA.

つぎに、ＤＮＡチップを用いたＤＮＡ解析を行う際における、ハイブリダイゼーション後のターゲットＤＮＡの余剰部分の切断手順を説明する。   Next, a procedure for cleaving the surplus portion of the target DNA after hybridization when performing DNA analysis using a DNA chip will be described.

図２は、溶液中で、一方の末端がウェルの側壁等に固定化されたプローブ１１と切断対象となるターゲットＤＮＡ１２とがハイブリダイゼーションした後の状態の図を示す。ターゲットＤＮＡ１２は、プローブ設計領域[Ｐ]に対応する部位がプローブ１１と結合して二本鎖を形成し、その他の部位は一本鎖の状態のままとなっている。   FIG. 2 shows a state after hybridization of the probe 11 having one end immobilized on the side wall of the well or the like and the target DNA 12 to be cleaved in the solution. In the target DNA 12, the site corresponding to the probe design region [P] is combined with the probe 11 to form a double strand, and the other sites remain in a single strand state.

この状態から、図３に示すように上述の切断用プライマ１０を溶液に添加し、溶液温度を上昇させてターゲットＤＮＡ１２とプライマ１０とをハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーションさせると、図３に示すように、切断用プライマ１０がプライマ特定領域[Ｒ]に対応する部位に結合し、この部位が二重鎖となる。   From this state, as shown in FIG. 3, the above-described cleavage primer 10 is added to the solution, and the solution temperature is raised to hybridize the target DNA 12 and the primer 10. When hybridized, as shown in FIG. 3, the cleavage primer 10 binds to a site corresponding to the primer specific region [R], and this site becomes a double strand.

続いて、溶液中に、プライマ特定領域[Ｒ]を切断する制限酵素を添加する。このように制限酵素を添加すると、図４に示すように、ターゲットＤＮＡの余剰部分を切断することができる。   Subsequently, a restriction enzyme that cleaves the primer specific region [R] is added to the solution. When a restriction enzyme is added in this way, the surplus portion of the target DNA can be cleaved as shown in FIG.

なお、ここではプローブ設計領域[Ｐ]の片側のみしか切断していないが、プローブ設計領域[Ｐ]の両側を切断してもよい。このようにプローブ設計領域[Ｐ]の両側を切断する場合であり、且つ、両者の制限酵素が異なる場合には、対応する２種類の制限酵素を添加すればよい。   Although only one side of the probe design region [P] is cut here, both sides of the probe design region [P] may be cut. In this way, when both sides of the probe design region [P] are cleaved and the restriction enzymes are different, two corresponding restriction enzymes may be added.

以上のように本発明が適用されたターゲットＤＮＡの切断の方法では、ターゲットＤＮＡを目的の位置で切断することができ、そのためターゲットＤＮＡの長さを特定することができる。   As described above, in the method for cleaving a target DNA to which the present invention is applied, the target DNA can be cleaved at a target position, and therefore the length of the target DNA can be specified.

具体的には、制限酵素認識領域[Ｙ１]の切断位置から[Ｙ２]の切断位置までの間が、切断後のターゲットＤＮＡとなる。従って、制限酵素認識領域[Ｙ１]，[Ｙ２]を最適に選択すれば、ターゲットＤＮＡを目的の長さに切断することができる。 Specifically, the target DNA after cleavage is from the cleavage position of the restriction enzyme recognition region [Y 1 ] to the cleavage position of [Y 2 ]. Therefore, if the restriction enzyme recognition regions [Y 1 ] and [Y 2 ] are optimally selected, the target DNA can be cleaved to a desired length.

このことにより、例えば、ＤＮＡチップ上でターゲットＤＮＡをプローブとハイブリダイゼーションさせ、二重鎖となった部分にインターカレータを挿入し、その蛍光を検出することによって当該ターゲットＤＮＡの塩基配列を解析するＤＮＡ解析に上述した切断方法を適用すれば、蛍光の発光強度を均一にすることができ、ノイズのない正確な測定をすることができる。   Thus, for example, DNA that analyzes the base sequence of the target DNA by hybridizing the target DNA with a probe on a DNA chip, inserting an intercalator into the double-stranded portion, and detecting the fluorescence. If the above-described cutting method is applied to the analysis, the fluorescence emission intensity can be made uniform, and accurate measurement without noise can be performed.

なお、本実施の形態の説明では、ハイブリダイゼーション後の余剰の一本鎖部分の切断に本発明を適用した場合について説明をしたが、本発明は一本鎖のヌクレオチド鎖を切断する場合であれば、特にハイブリダイゼーションの後に行う切断以外の場面での切断に適用してもよい。   In the description of the present embodiment, the case where the present invention is applied to the cutting of an excess single-stranded portion after hybridization has been described. However, the present invention may be applied to a case where a single-stranded nucleotide chain is cut. For example, the present invention may be applied to cutting at a scene other than the cutting performed after hybridization.

つぎに、具体例について説明をする。   Next, a specific example will be described.

図５に、マウスの時計遺伝子である“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”の塩基配列の一部分を示す。 “Ｐｅｒ２ＲＮＡ”には、下線部分で示すように、“ＧＧＡＴＣＣ”という塩基配列が存在する。この“ＧＧＡＴＣＣ”という塩基配列は、制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”の認識配列である。この“ＧＧＡＴＣＣ”と、３´側の４塩基及び５´側の４塩基を含めると、少なくとも図５中では特異な配列となる。なお、制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”は、図６に示すような二本鎖配列を切断する制限酵素である。   FIG. 5 shows a part of the base sequence of “Per2RNA” which is a mouse clock gene. “Per2RNA” has a base sequence “GGATCC” as indicated by the underlined portion. The base sequence “GGATCC” is a recognition sequence for the restriction enzyme “BamHI”. When this “GGATCC” and 4 ′ base on the 3 ′ side and 4 bases on the 5 ′ side are included, at least a unique sequence is obtained in FIG. The restriction enzyme “BamHI” is a restriction enzyme that cleaves a double-stranded sequence as shown in FIG.

従って、“ＧＧＡＴＣＣ”と、３´側の４塩基及び５´側の４塩基の相補配列である“ＡＴＴＧＣＣＴＡＧＧＧＴＧＣ”という切断用プライマを生成し、この切断用プライマをハイブリダイゼーションさせ、制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”を添加すると、図７に示すように、“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”を切断することができる。   Therefore, a cleavage primer “ATTGCTCTAGGGTC”, which is a complementary sequence of “GGATCC” and 4 ′ on the 3 ′ side and 4 ′ on the 5 ′ side, is generated, and this cleavage primer is hybridized with the restriction enzyme “BamHI”. When “is added,“ Per2RNA ”can be cleaved as shown in FIG.

図８に、マウスの時計遺伝子である“Ｐｅｒ１ＲＮＡ”の塩基配列の一部分を示す。 “Ｐｅｒ１ＲＮＡ”には、下線部分で示すように、“ＧＧＡＴＣＣ”という塩基配列が２つ存在する。この“ＧＧＡＴＣＣ”という塩基配列は、上述したように制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”の認識配列である。この“ＧＧＡＴＣＣ”という配列と、３´側の４塩基及び５´側の４塩基を含めると、少なくとも図８中では特異な配列となる。   FIG. 8 shows a part of the base sequence of “Per1 RNA” which is a mouse clock gene. “Per1RNA” has two base sequences “GGATCC” as indicated by the underlined portion. This base sequence “GGATCC” is a recognition sequence of the restriction enzyme “BamHI” as described above. Including the sequence “GGATCC” and 4 bases on the 3 ′ side and 4 bases on the 5 ′ side, the sequence becomes a unique sequence at least in FIG.

従って、“ＧＧＡＴＣＣ”と、３´側の４塩基及び５´側の４塩基の相補配列である“ＴＧＧＣＣＣＴＡＧＧＴＣＣＣ”という切断用プライマ、“ＴＧＧＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＧ”を生成し、この切断用プライマをハイブリダイゼーションさせ、制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”を添加すると、図９に示すように、“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”を切断することができる。   Therefore, a cleavage primer called “TGGGCCCTAGGGTCCC”, which is a complementary sequence of “GGATCC” and 4 ′ on the 3 ′ side and 4 ′ on the 5 ′ side, “TGGGCCTAGGGGAGG” is generated, and this cleavage primer is hybridized and restricted. When the enzyme “BamHI” is added, “Per2RNA” can be cleaved as shown in FIG.

図１０に、マウスの時計遺伝子である“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”の塩基配列の一部分を示す。 “Ｐｅｒ２ＲＮＡ”には、下線部分で示すように、“ＡＡＧＣＴＴ”という塩基配列が存在する。この“ＡＡＧＣＴＴ”という塩基配列は、制限酵素“ＨｉｎｄＩＩＩ”の認識配列である。この“ＡＡＧＣＴＴ”と、３´側の４塩基及び５´側の４塩基を含めると、少なくとも図１０中では特異な配列となる。なお、制限酵素“ＨｉｎｄＩＩＩ”は、図１１に示すような二本鎖配列を切断する制限酵素である。   FIG. 10 shows a part of the base sequence of “Per2RNA” which is a mouse clock gene. “Per2RNA” has a base sequence “AAGCTT” as indicated by the underlined portion. The base sequence “AAGCTT” is a recognition sequence for the restriction enzyme “HindIII”. When this “AAGCTT” and 4 ′ base on the 3 ′ side and 4 bases on the 5 ′ side are included, a unique sequence is obtained at least in FIG. The restriction enzyme “HindIII” is a restriction enzyme that cleaves a double-stranded sequence as shown in FIG.

従って、“ＡＡＧＣＴＴ”と、３´側の４塩基及び５´側の４塩基の相補配列である“ＡＡＴＧＴＴＣＧＡＡＧＧＣＧ”という切断用プライマを生成し、この切断用プライマをハイブリダイゼーションさせ、制限酵素“ＨｉｎｄＩＩＩ”を添加すると、図１２に示すように、“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”を切断することができる。   Therefore, a cleavage primer called “AAGTTCGAAGGCG” which is a complementary sequence of “AAGCTT” and 4 ′ on the 3 ′ side and 4 ′ on the 5 ′ side is generated, and this cleavage primer is hybridized with the restriction enzyme “HindIII”. As shown in FIG. 12, “Per2RNA” can be cleaved.

（Ａ）はターゲットＤＮＡのプローブ設計領域Ｐを示す図であり、（Ｂ）はターゲットＤＮＡの制限酵素認識領域Ｘを示す図であり、（Ｃ）は両端が制限酵素の場合の選択領域Ｚを示す図であり、（Ｄ）は一端が末端となっている場合の選択領域Ｚを示す図であり、（Ｅ）はプライマ特定領域Ｒを示す図であり、（Ｆ）は切断用プライマを示す図である。(A) is a diagram showing a probe design region P of the target DNA, (B) is a diagram showing a restriction enzyme recognition region X of the target DNA, and (C) is a selection region Z when both ends are restriction enzymes. (D) is a diagram showing a selection region Z when one end is a terminal, (E) is a diagram showing a primer specific region R, and (F) is a cutting primer. FIG. ハイブリダイゼーションされたターゲットとプローブを示す図である。It is a figure which shows the hybridized target and probe. ターゲットに切断用プライマをハイブリダイゼーションさせた図である。It is the figure which hybridized the primer for cutting to the target. ターゲットを切断した図である。It is the figure which cut | disconnected the target. 制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”の認識配列と、マウスの時計遺伝子である“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”の塩基配列の一部分を示す図である。It is a figure which shows a part of base sequence of the recognition sequence of restriction enzyme "BamHI" and "Per2RNA" which is a mouse | mouth clock gene. 制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”を説明するための図である。It is a figure for demonstrating restriction enzyme "BamHI". 制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”により切断された上記“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”の塩基配列を示す図である。It is a figure which shows the base sequence of said "Per2RNA" cut | disconnected by restriction enzyme "BamHI". マウスの時計遺伝子である“Ｐｅｒ１ＲＮＡ”の塩基配列の一部分を示す図である。It is a figure which shows a part of base sequence of "Per1RNA" which is a clock gene of a mouse | mouth. 制限酵素“ＢａｍＨ Ｉ”により切断された上記“Ｐｅｒ１ＲＮＡ”の塩基配列を示す図である。It is a figure which shows the base sequence of said "Per1RNA" cut | disconnected by restriction enzyme "BamHI". 制限酵素“ＨｉｎｄＩＩＩ”の認識配列と、マウスの時計遺伝子である“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”の塩基配列の一部分を示す図である。It is a figure which shows a part of recognition sequence of restriction enzyme "HindIII", and a part of base sequence of "Per2RNA" which is a mouse clock gene. 制限酵素“ＨｉｎｄＩＩＩ”を説明するための図である。It is a figure for demonstrating restriction enzyme "HindIII." 制限酵素“ＨｉｎｄＩＩＩ”により切断された上記“Ｐｅｒ２ＲＮＡ”の塩基配列を示す図である。It is a figure which shows the base sequence of said "Per2RNA" cut | disconnected by restriction enzyme "HindIII". ハイブリダイゼーションされた状態のターゲットとプローブを示す図である。It is a figure which shows the target and probe of the state by which it was hybridized.

符号の説明Explanation of symbols

１０ 切断用プライマ、１１ プローブＤＮＡ、１２ ターゲット   10 Primer for cutting, 11 Probe DNA, 12 Target

Claims (1)

切断対象となるヌクレオチド鎖（ターゲット）の塩基配列のうち必要な領域を特定し、該必要な領域以外の領域から、該必要な領域を挟んだ、同一の又は異なる２つの所定の制限酵素の認識配列を検出し、
検出した同一の又は異なる２つの所定の制限酵素の認識配列のそれぞれに対して、該制限酵素の認識配列を少なくとも含むとともに該認識配列と連続している３´側及び５´側の塩基配列を含めることによって、上記必要な領域の塩基配列に対して特異な１種又は２種の配列を形成し、
上記１種の配列に対して又は上記２種の配列のそれぞれに対して相補的な塩基配列であるプライマを生成し、
上記ターゲットと上記プライマとをハイブリダイゼーションすることによって上記ターゲットにプライマを結合させ、
上記プライマが結合された上記ターゲットを上記所定の制限酵素を用いて切断する
ヌクレオチド鎖の切断方法。 Identifying a necessary region in the nucleotide sequence of a nucleotide chain (target) to be cleaved, and recognizing two identical or different predetermined restriction enzymes sandwiching the necessary region from a region other than the necessary region Detect the sequence,
For each of the detected identical or different two restriction enzyme recognition sequences, a 3′-side and 5′-side base sequence that contains at least the restriction enzyme recognition sequence and is continuous with the recognition sequence By including one or two kinds of sequences specific to the base sequence of the necessary region,
Generating a primer that is a base sequence complementary to the one sequence or to each of the two sequences;
To bind the primer to the target by hybridization and the target and the primer,
A method for cleaving a nucleotide chain, wherein the target to which the primer is bound is cleaved using the predetermined restriction enzyme.
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