JP4340749B2

JP4340749B2 - Monoclonal antibody recognizing serine-threonine protein kinase

Info

Publication number: JP4340749B2
Application number: JP2002243368A
Authority: JP
Inventors: 康茂里; 吉郎達; 昇湯元; 敦彦石田; 敏之柘植; 勝一郎岡崎; 勇亀下
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2002-08-23
Filing date: 2002-08-23
Publication date: 2009-10-07
Anticipated expiration: 2022-08-23
Also published as: JP2004083429A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素に反応性を示すモノクローナル抗体及び該抗体を用いたセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の検出又は測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞の情報伝達系は、主に細胞膜上に伝達された刺激が、細胞膜上の受容体やチャンネルタンパク質などを活性化することにより始まる。次いでカルシウムイオンやcAMPなどのセカンドメッセンジャーの増減や、各種タンパク質リン酸化酵素の活性化及び不活性化が起こることにより、刺激は順次細胞内に伝達されていく（Cano,E., and Mahadevan, L. (1995) Parallel signal processing among mammalian MAPKs. Trends Biochem. Sci. 20, 117-122）。
【０００３】
それらの一連の情報伝達系で重要な働きを担っているタンパク質リン酸化酵素は、動植物細胞内には、千種類以上が存在すると言われており、これまでに数百種の酵素の一次構造が決定され報告されている。これらのタンパク質リン酸化酵素は大きく二つに分けられる。一つは、ターゲットとなるタンパク質のTyr残基をリン酸化するタンパク質で、Tyrタンパク質リン酸化酵素と呼ばれている。このリン酸化酵素は、増殖因子受容体自身である場合が多い。もう一つは、ターゲットとなるタンパク質のSer又はThr残基をリン酸化するセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素である。セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の代表的なものとして、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、多機能性Ca²⁺/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ(CaMKI、CaMKII、CaMKIV)、MAPキナーゼ、MAPキナーゼキナーゼなどがあげられる。
【０００４】
これまで報告されたセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の一次構造の比較により、タンパク質リン酸化酵素間で共通に保存された11ヶ所のサブドメイン構造が存在することが知られている（Hanks, S. K., and Hunter, T. (1995) The eukaryotic protein kinase superfamily: kinase (catalytic) domain structure and classification. FASEB J. 9, 576-596）。従来の研究では、特定の酵素に対し特異性の高い抗体を調製して、目的の酵素の細胞内での動向を調べたり、分布を調べたりすることが盛んに行われてきた。しかし、最近は、ポストゲノムの時代となり、遺伝子の多様な機能を発見することが求められている。そのような状況において、数多くの遺伝子の中から、前記のように情報伝達系で重要な働きを担っているセリンートレオニンタンパク質リン酸化酵素をコードする遺伝子を網羅的に単離同定することは非常に有用である。しかしながら、実用に耐える検出方法は未だ供給されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素に反応性を示すモノクローナル抗体及び該抗体を用いたセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の検出又は測定方法の提供を目的とする。
【０００６】
項１． CaMKIIの132位から146位のシークエンスのうち連続した13〜15個のアミノ酸からなるペプチドとキャリア用タンパク質との複合体を免疫原として得られたモノクローナル抗体。
【０００７】
項２．ペプチドが、配列番号１で表されるペプチド又は配列番号２で表されるペプチドであることを特徴とする項１に記載のモノクローナル抗体。
【０００８】
項３．配列番号１で表されるペプチド又は配列番号２で表されるペプチドを認識するモノクローナル抗体。
【０００９】
項４．セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素のエピトープと反応性を有するモノクローナル抗体であって、CaMKIIの132位から146位のアミノ酸配列中のエピトープに対する反応性を有するモノクローナル抗体。
【００１０】
項５．さらに、CaMKI、CaMKII、CaMKIV、CaMKキナーゼ、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、MAPキナーゼ、MAPキナーゼキナーゼ及びリボソームS6 プロテインキナーゼの全てのタンパク質に反応性を示す項１〜４に記載のモノクローナル抗体。
【００１１】
項６．配列番号１で表されるペプチド、配列番号２で表されるペプチド及びそれらのキャリア用蛋白質結合体からなる群から選択される少なくとも１種を免疫抗原として、ヒトを除く温血動物に免疫して得られる項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【００１２】
項７．マウス抗血清である項６に記載のモノクローナル抗体。
【００１３】
項８．項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体の少なくとも１種を使用して免疫学的アッセイを行うことを特徴とする、セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素を検出又は測定する方法。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸などの略号による表示はＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００１５】
なお、本明細書においては、Ca²⁺/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼをCaMKと称する。
【００１６】
CaMKIIのサブドメインVIB部分とは、CaMKIIのαアイソフォームではアミノ酸配列の132位〜144位をいう（Tobimatsu, T., Kameshita, I., and Fujisawa, H. (1988) Molecular cloning of the cDNA encoding the third polypeptide of brain calmodulin-dependent protein kinase II. J. Biol. Chem. 263, 16082-16086）。本発明では、(1)132位から146位のアミノ酸配列（配列番号２）のうち連続した13〜15個のアミノ酸からなるペプチドとキャリア用タンパク質との複合体を免疫源として得られたモノクローナル抗体、(2)132位から144位（配列番号１）のペプチド又は132位から146位（配列番号２）のペプチドを認識するモノクローナル抗体、或いは(3)セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素のエピトープと反応性を有するモノクローナル抗体であって、CaMKIIの132位から146位のアミノ酸配列中のエピトープに対する反応性を有するモノクローナル抗体をセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の検出又は測定に利用する。
【００１７】
なお、抗体が反応性を有するとは、抗体が抗原抗体反応を示すことをいう。
【００１８】
また、上記のセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素としては、例えば、CaMKI、CaMKII、CaMKIV、CaMKキナーゼ、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、MAPキナーゼ、MAPキナーゼキナーゼ、リボソームS6 プロテインキナーゼなどが挙げられる。これら酵素は、例えば、CaMKIIα、CaMKIIβなどのように、さらに細かく分類されることがあるが、それら酵素も上記例示の酵素に包含される。
【００１９】
上記(1)〜(3)のいずれかの抗体は、CaMKI、CaMKII、CaMKIV、CaMKキナーゼ、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、MAPキナーゼ、MAPキナーゼキナーゼ及びリボソームS6 プロテインキナーゼから選択される２種以上、好適には３種以上、より好適には４種以上、最も好適には全て、のタンパク質に反応性を示す。
【００２０】
本発明に係るモノクローナル抗体は、CaMKIIの132位から146位のシークエンスのうち連続した13〜15個のアミノ酸からなるペプチド（好適には、配列番号１で表されるペプチド、配列番号２で表されるペプチド）、これらの混合ペプチド、これらペプチドのキャリア用蛋白質結合体、これらを含む免疫抗原などを利用して、一般的なモノクローナル抗体の製造法に従い製造することができる。
【００２１】
かかる特性を有する本発明抗体は、免疫抗原を温血動物（ヒトを除く）に免疫することにより収得することができ、その方法乃至手法は、常法に従うことができる。例えば、免疫抗原となる配列番号１で表されるペプチドを温血動物に免疫することによって、モノクローナル抗体を該温血動物の血液等の体液内、該温血動物が産卵した卵内などに産生させ、それらより取得することができる。
【００２２】
前記免疫抗原としては、CaMKIIの132位から146位のシークエンスのうち連続した13〜15個のアミノ酸からなるペプチド（好適には配列番号１で表されるペプチド、配列番号２で表されるペプチド）、これらの混合ペプチド、これらペプチドのキャリア用蛋白質結合体、及びそれらの混合物等が使用される。上記ペプチドは常法にしたがったペプチド合成により製造できる。上記のペプチドのキャリア用蛋白質結合体は、該ペプチドを、常法に従い、例えば該ペプチドのＮ末端にシステインを付加し、これにキーホールリンペットヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin ）（KLH）とコンジュゲートさせることにより製造される。前記キャリア用蛋白質としては、抗原乃至ハプテンの免疫原性を高めるものとして当該分野で慣用される各種キャリア用蛋白質をいずれも使用できる。その例としては、アルブミン、グロブリン、ヘモシアニン等の各種動物タンパク質やポリリジン等の人工ポリペプチド等を例示できる。これらキャリア用蛋白質は、慣用の試薬を用いた縮合反応等により、ペプチドとの結合体とすることができる。該試薬としては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＣＤＩ）等のような水溶性カルボジイミド類や、ジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ）のような縮合剤等が使用される。前記のようにして得られるキャリア用蛋白質結合体は、それ自体所望の免疫原性を有し、本発明抗体製造用の免疫抗原として使用できる。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、上記免疫抗原をフロイントの完全アジュバントとともにマウスに１又は複数回投与して免疫化し、抗体を産生させるとともに、例えば細胞融合法等の常法に従い得られる抗体産生細胞と骨髄脾細胞とを融合し、クローニングし、目的とする抗体を産生する単一クローン細胞を分離し、該細胞の培養により取得することができる。
【００２４】
このようにして得られる本発明のモノクローナル抗体は、所望により、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の常法に従いさらに精製することができる。
【００２５】
而して、本発明のモノクローナル抗体の取得に際しては、精製されたモノクローナル抗体と免疫抗原との反応性を試験することにより、さらに必要に応じてセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素との反応性を試験することにより、例えば、免疫された温血動物の個体間より、或いはクローン化された単一クローン間より、適宜行うことができる。当該反応性の試験は、モノクローナル抗体と供試物との免疫反応性が確認できる限りにおいて特に制限はなく、例えば後述の実施例に記載の測定法に従い良好に実施することができる。
【００２６】
かくして得られる本発明のモノクローナル抗体を使用し、スクリーニング対象であるタンパク質との反応性を免疫学的アッセイにて確認することによりセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の検出又は測定が可能である。該免疫学的アッセイとしては、例えば、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素イムノメトリックアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ等を制限なく使用することができる。これらのアッセイは、一般的な競合法やサンドイッチ法等の手法に従って実施することができる。好ましくは、ＥＩＡが使用される。
【００２７】
ＥＩＡ法において、本発明の抗体は固相化抗体として使用され、固相化する担体としては、特に制限はなくＥＩＡ法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。抗体を固相化させるには、例えば、抗体を含む緩衝液を担体上に載せ、４℃で一晩静置することによって行える。緩衝液の組成、濃度は常法に従えばよい。本発明の抗体の抗原は、酵素と結合させられ、酵素結合体となる。結合させる方法は酵素と抗原とが結合する方法であれば特に制限はなく、常法に従えばよい。前記のようにして得られた固相化抗体と酵素標識抗原とを用いたＥＩＡ法によって、セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の検出、測定が可能である。
【００２８】
尚、前記セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の測定・検出を行うに際しては、本発明の抗体を有効成分として含有する測定キットを利用するのが簡便である。かかるキットには、本発明抗体に加えて、当該測定・検出を実施するに際して必要な任意の他の試薬を更に包含させることができる。その例としては、前記の標識抗原及び／又は標準抗原液、さらにはアッセイ緩衝液等を例示することができる。
【００２９】
また、本発明のモノクローナル抗体のスクリーニング対象は、タンパク質であれば特に制限されない。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００３１】
(i)Ca²⁺/カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素IIの132位〜144位のアミノ酸配列（配列番号１）及び132位〜146位のアミノ酸配列（配列番号２）のN末端にシステインを付加したペプチド14PEN（配列番号３）及びペプチド16PEN（配列番号４）は、島津製作所製のペプチド固相合成機PSSM8を使用し、フルオレニルメトキシカルボニルペプチド（fmoc）合成法により合成した。合成したペプチドは逆相カラムクロマトグラフィー(ODS-80Tm,トーソー社製)を用い、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。ペプチドの分子量決定には、飛行時間型質量分析機（Shimadzu/Kratos Kompact MALDI II）を用いた。
【００３２】
(ii) BALB/cマウスは、日本クレア株式会社から入手した。BALB/cマウス由来骨髄腫細胞Sp2/0細胞（ミエローマ細胞）は、大阪大学微生物研究所から供与を受けたものを使用した。
【００３３】
(iii)ウエスタンブロット法は既存の方法により行った（Harlow, E., and Lane, D. (1988) Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００３４】
(iv) CaMKII、CaMKIV、プロテインキナーゼＡ、MAPキナーゼは、次のようにして調製／入手した。
CaMKIIは、次の文献記載の方法に従って、ラット脳から精製した。
（Ishida, A., Kitani, T., Okuno, S., and Fujisawa, H. (1994) Inactivation of Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase II by Ca²⁺/calmodulin. J. Biochem. 115, 1075-1082）
CaMKIVは、次の文献記載の方法に従って、ラット脳から精製した。
（Kameshita, I. and Fujisawa, H. (1995) Preparation and characterization of calmodulin-dependent protein kinase IV (CaM-Kinase IV) free of CaM-kinase IV kinase from rat cerebral cortex. J. Biochem. 117, 85-90）
プロテインキナーゼ A（触媒サブユニット）は、次の文献記載の方法に従って、牛心臓から精製した。
（Okuno, S. and Fujisawa, H. (1990) Stabilization, purification and crystallization of catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase from bovine heart. Biochim. Biophys. Acta 1038, 201-208）
MAPキナーゼはUpstate Biotechnology社から購入した。
【００３５】
実施例１
（１）抗原溶液の作成
前記(i)において合成された合成ペプチドである14PEN及び16PENのN末端のシステインを、それぞれ、キャリアタンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin (KLH)）と結合させ、抗原性を増した14PEN結合体及び16PEN結合体を得るために、以下の操作を行った。KLHを10mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.2)に溶かし14.5 (mg/ml)の溶液を546μl作成した。N-(6-マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド（N-(6-maleimidocaproyloxy) succinimide） (同仁化学製)をジメチルホルムアミドに溶かした溶液(24.5 mg/ml) を56μl加え、室温で30分攪拌した。10,000rpmで5分遠心し、上清をゲル濾過クロマトグラフィーSephadex G50 (Amersham Pharmacia Biotech社製)に負荷し、50 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0)で溶出し、280 nmにピークのある画分を回収した。1mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH 4.0)の1mlに合成ペプチドの5mgを溶解した溶液をさらに加え、室温で3時間撹拌し、14PEN抗原溶液及び16PEN抗原溶液を作成した。
【００３６】
（２）マウスの免疫
注射器内で、それぞれの抗原溶液と完全フロイントアジュバント（Freund's complete adjuvant）(FCA)を混合して乳濁液を作成し、それぞれの乳濁液をBALB/cマウス４匹づつに免疫した。二週間後に不完全フロイントアジュバント（Freund's incomplete adjuvant）で免疫をしたあとは、それぞれの抗原溶液をそのまま腹腔内注射し、二週間間隔で合計４〜５回の免疫を行った。各マウスの抗体産生をチェックして最も抗体価の上がったマウスをそれぞれ１匹ずつモノクローナル抗体の調製に用いた。
【００３７】
（３）脾臓細胞の調製
マウスの左側腹部を切開し、脾臓を摘出して生理食塩水で10回洗浄した。さらにダルベッコ変法培地を5ml加え、ホモジナイザーで脾臓をつぶし、脾細胞懸濁液とした。その後細胞を遠心で集め赤血球溶解試薬（水100ml中、NH₄Cl 829mg、KHCO₃ 100mg及びEDTA・2Na 37mgを含有する。pH7.4）を3ml加えて懸濁し赤血球を破壊した。その後ダルベッコ変法培地10mlで4回洗浄した。
【００３８】
（４）ミエローマ細胞の調製
ミエローマ細胞はBALB/cマウス由来骨髄腫細胞Sp2/0細胞を、10%胎児牛血清を含むダルベッコ変法培地で培養したものを用いた。培養したミエローマ細胞はダルベッコ変法培地10mlで3回洗浄した。
【００３９】
（５）細胞融合
脾細胞とミエローマ細胞（Sp2/0）を以下のようにして細胞融合した。
【００４０】
脾細胞の全細胞とその5分の1のSp2/0細胞を混合、遠心し細胞を集めた。この混合細胞を37℃で2〜3分静置した後、37℃に暖めておいた50%ポリエチレングリコール溶液1mlを加えた。2分間37℃に静置後、ダルベッコ変法培地7mlを加え、さらに10%胎児牛血清を含むダルベッコ変法培地8mlを加えた。遠心後細胞ペレットに10%胎児牛血清を含むダルベッコ変法培地2mlを加え細胞を完全に懸濁し、適当量の上記牛血清を含む培地を加え融合細胞懸濁液とした。
この融合細胞懸濁液を48ウェルプレートに0.25mlずつ播種し培養を行った。24時間後に2倍濃度のHAT選択培養液を0.25mlずつ加えハイブリドーマ（融合細胞）の選択を行った。その後3日ごとにHAT選択培養液を交換し融合細胞の選択を行った。なお、HAT選択培養液は、HAT(Hypoxanthine 13.6 mg/ml, Aminopterin 0.18mg/ml, Thymidine 3.9mg/ml)及び10%胎児牛血清を含むダルベッコ変法培地のことである。
【００４１】
（６）モノクローナル抗体の産生
細胞融合から３週間後に各ウェルの培養上清を採取し、Dot Immunobinding Assay(DIA)により抗体産生の有無を検討した（Harlow, E., and Lane, D. (1988) Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press）。抗原にはペプチド14PEN及びペプチド16PENを用いた。DIAの結果、陽性と判定されたウェルは限界希釈法により限界希釈し培養した。再度培養上清をサンプリングし、DIAにより陽性ウェルを確認した。その後、DIAの結果がすべてのウェルで陽性となるまで繰り返し、モノクローナル抗体産生融合細胞を得た。
【００４２】
また、BALB/ｃマウスの腹腔に0.5mlプリスタン（2,6,10,14テトラメチルペンタデカン）を注射し、２〜３週間後に１０⁸のハイブリドーマを腹腔内に投与すると、約1週間で腹水が貯留した。この腹水を採取し、この中に非常に高い濃度でモノクローナル抗体が生成した。
【００４３】
モノクローナル抗体産生融合細胞の上清またはBALB/cマウス腹水中で増やしたモノクローナル抗体を適当な希釈倍率で薄めて実験に用いた。
【００４４】
（７）モノクローナル抗体の解析
ペプチド14PENに対するモノクローナル抗体は１種類得られ、これを4-Dと名付けた。また、ペプチド16PENに対するモノクローナル抗体は２種類得られ、これを1-C及び8-Cと名付けた。これら抗体の反応特異性を調べるために、精製した４種類のセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素（CaMKII、CaMKIV、プロテインキナーゼＡ、MAPキナーゼ）の20から100ngをSDS電気泳動で分離した後、ニトロセルロース膜に転写しタンパク質染色とウエスタンブロット法を行った。モノクローナル抗体は、腹水を1000分の1希釈したものを用いた。
【００４５】
その結果、4-D、1-C抗体及び8-C抗体はCaMKII、CaMKIV、プロテインキナーゼＡ及びMAPキナーゼと反応することが確認された。
【００４６】
また、1-C抗体及び8-C抗体と、ラット大脳、小脳及び脳幹のタンパク質とをウエスタンブロット法で反応させたところ、抗体が多くの脳組織中のタンパク質と反応していることが確認された（図１）。
【００４７】
なお、組織抽出液としては１レーンあたり20μgのタンパク質をアプライしている。また組織抽出液の調製法としては以下の論文に記載の方法を用いた。
（Kameshita, I and Fujisawa, H (1996) Detection of protein kinase acitivities toward oligopeptides in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel. Anal. Biochem. 237, 198-203）
次に8-C抗体をセファロースに固定化し、ラット大脳抽出液を使用し免疫沈降反応を行った。ラット大脳抽出液と免疫沈降物を合成ペプチド（マルタイド）を用いたゲル内リン酸化法（Kameshita, I., Taketani, S., Ishida, A., and Fujisawa H. (1999) Detection of a variety of Ser/Thr protein kinases using a synthetic peptide with multiple phosphorylation sites. J. Biochem. 126, 991-995）で分析したところ、免疫沈降物の方に強く複数のセリン-トレオニンタンパク質リン酸化酵素の活性バンドを検出することができた（図２）。このように8-C抗体は、ウエスタンブロット法だけでなく、免疫沈降法でもタンパク質リン酸化酵素を検出できることが確認された。
【００４８】
なお、大脳抽出液の調製法は、上記のKameshita, I and Fujisawa, H (1996) Detection of protein kinase acitivities toward oligopeptides in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel. Anal. Biochem. 237, 198-203に記載の方法を用いており、インゲルでの活性検出には１００μｇの大脳抽出液を用いて免疫沈降を行ったサンプルを用いている。またマルタイドの調製法は、Kameshita, I., Taketani, S., Ishida, A., and Fujisawa H. (1999) Detection of a variety of Ser/Thr protein kinases using a synthetic peptide with multiple phosphorylation sites. J. Biochem. 126, 991-995に記載の方法を用いた。
【００４９】
（８）モノクローナル抗体を使用したセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素のスクリーニング
1-C抗体と8-C抗体の混合抗体を使用して、マウス脳組織のcDNAライブラリー内のさまざまなセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の遺伝子クローニングをおこなった。マウス脳λZAPIIライブラリー（ストラタジーン製）を大腸菌（XL1-Blue株）に感染させ、LB寒天培地を固めたプラスチックプレート（9ｃｍ径）に蒔き、ファージプラークを形成させた。10mMIPTGを染み込ませたニトロセルロース膜をプレートに貼り付け各プラークに含まれるｃDNAによりコードされるタンパク質の発現を誘導し、同時にニトロセルロース膜にブロットした。タンパク質をブロットした膜を1-Cと8-C抗体の混合抗体と反応させ、抗体と反応するタンパク質を発現しているクローンのスクリーニングを行った。
【００５０】
得られたポジティブクローンの塩基配列を決定し、各種セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の遺伝子配列と比較したところ、ポジティブクローンは、以下のセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の遺伝子配列を有していた。本発明のモノクローナル抗体が各種のセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素を検出できることが確認された。
カルモジュリンキナーゼI
カルモジュリンキナーゼI β-2
カルモジュリンキナーゼII α
カルモジュリンキナーゼII β
カルモジュリンキナーゼII δ
カルモジュリンキナーゼII γ
カルモジュリンキナーゼIV
カルモジュリンキナーゼキナーゼα
MAPキナーゼキナーゼ-5
プロテインキナーゼA
リボソームS6 プロテインキナーゼ
【００５１】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体は、タンパク質の中から網羅的に広くセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素を検出できる。このため、該酵素の１次スクリーニングに有用である。
【００５２】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ラット脳組織中のタンパク質と、8-C、1-Cモノクローナル抗体の反応性試験（ウエスタンブロット法）の結果を示す。
【図２】ラット大脳抽出液中のタンパク質と8-Cモノクローナル抗体の免疫沈降反応及びウエスタンブロット法の結果を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a monoclonal antibody reactive to serine-threonine protein kinase and a method for detecting or measuring serine-threonine protein kinase using the antibody.
[0002]
[Prior art]
The cell signal transduction system starts when a stimulus transmitted mainly on the cell membrane activates a receptor or a channel protein on the cell membrane. Next, stimulation is sequentially transmitted into the cell by increasing or decreasing second messengers such as calcium ions and cAMP, and activation and inactivation of various protein kinases (Cano, E., and Mahadevan, L (1995) Parallel signal processing among mammalian MAPKs. Trends Biochem. Sci. 20, 117-122).
[0003]
It is said that there are over 1,000 types of protein kinases that play an important role in such a series of information transmission systems, and the primary structure of several hundred enzymes has been reported so far. Determined and reported. These protein kinases can be roughly divided into two. One is a protein that phosphorylates the Tyr residue of the target protein and is called Tyr protein kinase. This phosphorylase is often the growth factor receptor itself. The other is a serine-threonine protein kinase that phosphorylates Ser or Thr residues of the target protein. Typical examples of serine-threonine protein kinase include protein kinase A, protein kinase C, multifunctional Ca ²⁺ / calmodulin-dependent protein kinase (CaMKI, CaMKII, CaMKIV), MAP kinase, MAP kinase kinase, etc. can give.
[0004]
By comparing the primary structure of serine-threonine protein kinase reported so far, it is known that there are 11 subdomain structures conserved in common among protein kinases (Hanks, SK, and Hunter, T. (1995) The eukaryotic protein kinase superfamily: kinase (catalytic) domain structure and classification. FASEB J. 9, 576-596). In conventional research, it has been actively conducted to prepare antibodies with high specificity for a specific enzyme, and to investigate the intracellular movement or distribution of the target enzyme. However, recently, it has become the post-genomic era, and it is required to discover various functions of genes. In such a situation, it is very difficult to comprehensively isolate and identify the gene encoding serine threonine protein kinase that plays an important role in the signal transduction system as described above from a large number of genes. Useful for. However, a detection method that can withstand practical use has not yet been provided.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody reactive to serine-threonine protein kinase and a method for detecting or measuring serine-threonine protein kinase using the antibody.
[0006]
Item 1. A monoclonal antibody obtained by using a complex of a peptide consisting of 13 to 15 consecutive amino acids in the sequence from positions 132 to 146 of CaMKII and a carrier protein as an immunogen.
[0007]
Item 2. Item 2. The monoclonal antibody according to Item 1, wherein the peptide is the peptide represented by SEQ ID NO: 1 or the peptide represented by SEQ ID NO: 2.
[0008]
Item 3. A monoclonal antibody that recognizes the peptide represented by SEQ ID NO: 1 or the peptide represented by SEQ ID NO: 2.
[0009]
Item 4. A monoclonal antibody having reactivity with an epitope of serine-threonine protein kinase, and having reactivity with an epitope in the amino acid sequence of positions 132 to 146 of CaMKII.
[0010]
Item 5. Item 5. The monoclonal antibody according to Item 1-4, which is reactive to all proteins of CaMKI, CaMKII, CaMKIV, CaMK kinase, protein kinase A, protein kinase C, MAP kinase, MAP kinase kinase, and ribosomal S6 protein kinase.
[0011]
Item 6. Immunizing a warm-blooded animal excluding humans with at least one selected from the group consisting of the peptide represented by SEQ ID NO: 1, the peptide represented by SEQ ID NO: 2 and the protein conjugate for carrier thereof as an immunizing antigen Item 6. The monoclonal antibody according to any one of Items 1 to 5.
[0012]
Item 7. Item 7. The monoclonal antibody according to Item 6, which is a mouse antiserum.
[0013]
Item 8. Item 8. A method for detecting or measuring serine-threonine protein kinase, comprising performing an immunological assay using at least one monoclonal antibody according to any one of Items 1 to 7.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
Abbreviations of amino acids, peptides, base sequences, nucleic acids, etc. in this specification are defined by IUPAC, IUB, “Guidelines for creating specifications etc. including base sequences or amino acid sequences” (edited by the Japan Patent Office) and related fields It shall follow the idiomatic symbols in.
[0015]
In the present specification, Ca ²⁺ / calmodulin-dependent protein kinase is referred to as CaMK.
[0016]
The subdomain VIB part of CaMKII refers to positions 132 to 144 of the amino acid sequence in the α isoform of CaMKII (Tobimatsu, T., Kameshita, I., and Fujisawa, H. (1988) Molecular cloning of the cDNA encoding the third polypeptide of brain calmodulin-dependent protein kinase II. J. Biol. Chem. 263, 16082-16086). In the present invention, (1) a monoclonal antibody obtained by using a complex of a peptide consisting of 13 to 15 consecutive amino acids in the amino acid sequence from position 132 to position 146 (SEQ ID NO: 2) and a protein for carrier as an immunogen , (2) a monoclonal antibody that recognizes a peptide from positions 132 to 144 (SEQ ID NO: 1) or a peptide from positions 132 to 146 (SEQ ID NO: 2), or (3) reacts with an epitope of serine-threonine protein kinase A monoclonal antibody having reactivity with an epitope in the amino acid sequence of positions 132 to 146 of CaMKII is used for detection or measurement of serine-threonine protein kinase.
[0017]
The term “antibody has reactivity” means that the antibody exhibits an antigen-antibody reaction.
[0018]
Examples of the serine-threonine protein kinase include CaMKI, CaMKII, CaMKIV, CaMK kinase, protein kinase A, protein kinase C, MAP kinase, MAP kinase kinase, and ribosomal S6 protein kinase. These enzymes may be further finely classified as, for example, CaMKIIα, CaMKIIβ, etc., and these enzymes are also included in the above exemplified enzymes.
[0019]
The antibody of any one of (1) to (3) is at least two selected from CaMKI, CaMKII, CaMKIV, CaMK kinase, protein kinase A, protein kinase C, MAP kinase, MAP kinase kinase, and ribosomal S6 protein kinase Preferably 3 or more, more preferably 4 or more, and most preferably all proteins are reactive.
[0020]
The monoclonal antibody according to the present invention is a peptide consisting of consecutive 13 to 15 amino acids in the sequence of positions 132 to 146 of CaMKII (preferably a peptide represented by SEQ ID NO: 1, represented by SEQ ID NO: 2). Peptide), mixed peptides thereof, protein conjugates for carriers of these peptides, immunizing antigens containing them, and the like, and can be produced according to a general method for producing monoclonal antibodies.
[0021]
The antibody of the present invention having such characteristics can be obtained by immunizing a warm-blooded animal (excluding humans) with an immunizing antigen, and the method or method thereof can be in accordance with conventional methods. For example, by immunizing a warm-blooded animal with the peptide represented by SEQ ID NO: 1 as an immunizing antigen, a monoclonal antibody is produced in a body fluid such as blood of the warm-blooded animal or in an egg laid by the warm-blooded animal. Let them get more from them.
[0022]
As the immunizing antigen, a peptide consisting of consecutive 13 to 15 amino acids in the sequence of positions 132 to 146 of CaMKII (preferably a peptide represented by SEQ ID NO: 1, a peptide represented by SEQ ID NO: 2) These mixed peptides, protein conjugates for carriers of these peptides, and mixtures thereof are used. The peptide can be produced by peptide synthesis according to a conventional method. The protein conjugate for carrier of the above peptide is prepared by adding a cysteine to the N-terminus of the peptide according to a conventional method and conjugating the peptide with keyhole limpet hemocyanin (KLH). It is manufactured by. As the carrier protein, any of various carrier proteins commonly used in the art as enhancing the immunogenicity of antigens or haptens can be used. Examples thereof include various animal proteins such as albumin, globulin and hemocyanin, and artificial polypeptides such as polylysine. These carrier proteins can be made into a conjugate with a peptide by a condensation reaction using a conventional reagent. Examples of the reagent include water-soluble carbodiimides such as 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (ECDI) and condensing agents such as dimethyl suberimidate (DMS). used. The protein conjugate for carriers obtained as described above has a desired immunogenicity per se and can be used as an immunizing antigen for producing the antibody of the present invention.
[0023]
The monoclonal antibody of the present invention is, for example, an antibody-producing cell obtained by immunizing a mouse with one or more times of the above immunizing antigen together with Freund's complete adjuvant to produce an antibody and, for example, an antibody-producing cell obtained according to a conventional method such as a cell fusion method And bone marrow spleen cells can be fused, cloned, and single clonal cells producing the desired antibody can be isolated and obtained by culturing the cells.
[0024]
The monoclonal antibody of the present invention thus obtained can be further purified according to conventional methods such as ammonium sulfate salting out, ion exchange chromatography, gel chromatography, affinity chromatography and the like, if desired.
[0025]
Thus, in obtaining the monoclonal antibody of the present invention, the reactivity between the purified monoclonal antibody and the immunizing antigen is tested, and if necessary, the reactivity with the serine-threonine protein kinase is tested. By doing so, for example, it can be appropriately carried out between immunized warm-blooded animals or between cloned single clones. The reactivity test is not particularly limited as long as the immunoreactivity between the monoclonal antibody and the test sample can be confirmed. For example, the reactivity test can be carried out satisfactorily according to the measurement methods described in the examples described later.
[0026]
By using the monoclonal antibody of the present invention thus obtained and confirming the reactivity with the protein to be screened by an immunological assay, it is possible to detect or measure serine-threonine protein kinase. As the immunological assay, for example, enzyme immunoassay (EIA), enzyme immunometric assay (ELISA), fluorescence immunoassay, luminescence immunoassay and the like can be used without limitation. These assays can be performed according to a general competitive method or a sandwich method. Preferably EIA is used.
[0027]
In the EIA method, the antibody of the present invention is used as a solid-phased antibody, and the carrier to be solid-phased is not particularly limited, and any of those commonly used in the EIA method can be used. An example is a 96-well microtiter plate made of polystyrene. In order to immobilize the antibody, for example, a buffer containing the antibody is placed on a carrier and allowed to stand at 4 ° C. overnight. The composition and concentration of the buffer may be according to conventional methods. The antigen of the antibody of the present invention is combined with an enzyme to form an enzyme conjugate. The binding method is not particularly limited as long as it is a method in which an enzyme and an antigen are bound to each other. Serine-threonine protein phosphorylase can be detected and measured by the EIA method using the immobilized antibody and enzyme-labeled antigen obtained as described above.
[0028]
When measuring / detecting the serine-threonine protein kinase, it is easy to use a measurement kit containing the antibody of the present invention as an active ingredient. In addition to the antibody of the present invention, such a kit can further include any other reagent necessary for carrying out the measurement / detection. Examples thereof include the aforementioned labeled antigen and / or standard antigen solution, and further an assay buffer solution.
[0029]
Moreover, the screening target of the monoclonal antibody of the present invention is not particularly limited as long as it is a protein.
[0030]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, these are not for limiting the technical scope of this invention. Those skilled in the art can easily modify and change the present invention based on the description of the present specification, and these are included in the technical scope of the present invention.
[0031]
(i) Addition of cysteine to the N-terminus of the amino acid sequence of positions 132 to 144 (SEQ ID NO: 1) and the amino acid sequence of positions 132 to 146 (SEQ ID NO: 2) of Ca ²⁺ / calmodulin-dependent protein kinase II Peptide 14PEN (SEQ ID NO: 3) and peptide 16PEN (SEQ ID NO: 4) were synthesized by a fluorenylmethoxycarbonyl peptide (fmoc) synthesis method using a peptide solid phase synthesizer PSSM8 manufactured by Shimadzu Corporation. The synthesized peptide was purified by high performance liquid chromatography using reverse phase column chromatography (ODS-80Tm, manufactured by Tosoh Corporation). A time-of-flight mass spectrometer (Shimadzu / Kratos Kompact MALDI II) was used to determine the molecular weight of the peptide.
[0032]
(ii) BALB / c mice were obtained from CLEA Japan. BALB / c mouse-derived myeloma cells Sp2 / 0 cells (myeloma cells) used were those provided by the Institute for Microbiology, Osaka University.
[0033]
(iii) Western blotting was performed by existing methods (Harlow, E., and Lane, D. (1988) Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press).
[0034]
(iv) CaMKII, CaMKIV, protein kinase A, and MAP kinase were prepared / obtained as follows.
CaMKII was purified from rat brain according to the method described in the following literature.
(Ishida, A., Kitani, T., Okuno, S., and Fujisawa, H. (1994) Inactivation of Ca ²⁺ / calmodulin-dependent protein kinase II by Ca ²⁺ / calmodulin. J. Biochem. 115, 1075 -1082)
CaMKIV was purified from rat brain according to the method described in the following literature.
(Kameshita, I. and Fujisawa, H. (1995) Preparation and characterization of calmodulin-dependent protein kinase IV (CaM-Kinase IV) free of CaM-kinase IV kinase from rat cerebral cortex. J. Biochem. 117, 85-90 )
Protein kinase A (catalytic subunit) was purified from bovine heart according to the method described in the following literature.
(Okuno, S. and Fujisawa, H. (1990) Stabilization, purification and crystallization of catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase from bovine heart. Biochim. Biophys. Acta 1038, 201-208)
MAP kinase was purchased from Upstate Biotechnology.
[0035]
Example 1
(1) Preparation of antigen solution The N-terminal cysteines of 14PEN and 16PEN, which are the synthetic peptides synthesized in (i) above, are combined with keyhole limpet hemocyanin (KLH), which is a carrier protein, respectively. In order to obtain 14PEN conjugate and 16PEN conjugate with increased antigenicity, the following operation was performed. KLH was dissolved in 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.2) to prepare 546 μl of a 14.5 (mg / ml) solution. 56 μl of a solution (24.5 mg / ml) of N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide (manufactured by Dojindo) dissolved in dimethylformamide was added and stirred at room temperature for 30 minutes. Centrifuge at 10,000 rpm for 5 minutes, apply the supernatant to gel filtration chromatography Sephadex G50 (Amersham Pharmacia Biotech), elute with 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0), and peak at 280 nm. Minutes were collected. A solution in which 5 mg of the synthetic peptide was dissolved in 1 ml of 1 mM sodium acetate buffer (pH 4.0) was further added, followed by stirring at room temperature for 3 hours to prepare a 14PEN antigen solution and a 16PEN antigen solution.
[0036]
(2) In the mouse's immunization syringe, each antigen solution and Freund's complete adjuvant (FCA) are mixed to make an emulsion, and each emulsion is transferred to 4 BALB / c mice. I was immunized. Two weeks later, after immunization with incomplete Freund's incomplete adjuvant, each antigen solution was intraperitoneally injected as it was, and a total of 4 to 5 immunizations were performed at 2-week intervals. Each mouse was checked for antibody production, and one mouse with the highest antibody titer was used to prepare a monoclonal antibody.
[0037]
(3) Preparation of spleen cells The left flank of the mouse was incised, and the spleen was removed and washed 10 times with physiological saline. Further, 5 ml of Dulbecco's modified medium was added, and the spleen was crushed with a homogenizer to obtain a spleen cell suspension. Thereafter, the cells were collected by centrifugation, and 3 ml of red blood cell lysis reagent (containing NH ₄ Cl 829 mg, KHCO ₃ 100 mg and EDTA · 2Na 37 mg in 100 ml of water, pH 7.4) was added and suspended to destroy the red blood cells. Thereafter, it was washed 4 times with 10 ml of Dulbecco's modified medium.
[0038]
(4) Preparation of myeloma cells As myeloma cells, BALB / c mouse-derived myeloma cells Sp2 / 0 cells were cultured in Dulbecco's modified medium containing 10% fetal bovine serum. The cultured myeloma cells were washed 3 times with 10 ml of Dulbecco's modified medium.
[0039]
(5) Cell fusion Splenocytes and myeloma cells (Sp2 / 0) were cell-fused as follows.
[0040]
All the spleen cells and one fifth of Sp2 / 0 cells were mixed and centrifuged to collect the cells. The mixed cells were allowed to stand at 37 ° C. for 2 to 3 minutes, and then 1 ml of a 50% polyethylene glycol solution warmed to 37 ° C. was added. After standing at 37 ° C. for 2 minutes, 7 ml of Dulbecco's modified medium was added, and 8 ml of Dulbecco's modified medium containing 10% fetal bovine serum was further added. After centrifugation, 2 ml of Dulbecco's modified medium containing 10% fetal bovine serum was added to the cell pellet to completely suspend the cells, and a medium containing an appropriate amount of the above bovine serum was added to obtain a fused cell suspension.
This fused cell suspension was seeded in a 48-well plate at a rate of 0.25 ml and cultured. After 24 hours, 0.25 ml of 2 times concentrated HAT selection culture solution was added to select hybridomas (fusion cells). Then, every 3 days, the HAT selection medium was changed to select fused cells. The HAT selective culture medium is Dulbecco's modified medium containing HAT (Hypoxanthine 13.6 mg / ml, Aminopterin 0.18 mg / ml, Thymidine 3.9 mg / ml) and 10% fetal bovine serum.
[0041]
(6) Monoclonal antibody production Three weeks after cell fusion, the culture supernatant of each well was collected and examined for antibody production by Dot Immunobinding Assay (DIA) (Harlow, E., and Lane, D. (1988) ) Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Peptide 14PEN and peptide 16PEN were used as antigens. As a result of DIA, wells determined to be positive were subjected to limiting dilution by the limiting dilution method and cultured. The culture supernatant was sampled again, and positive wells were confirmed by DIA. Thereafter, the DIA result was repeated until all the wells were positive, and a monoclonal antibody-producing fused cell was obtained.
[0042]
Moreover, when 0.5 ml pristane (2,6,10,14 tetramethylpentadecane) was injected into the abdominal cavity of BALB / c mice, and 10 ⁸ hybridomas were administered intraperitoneally two to three weeks later, ascites was observed in about one week. Reserved. This ascites was collected and monoclonal antibodies were produced in it at very high concentrations.
[0043]
Monoclonal antibody-producing fusion cell supernatant or monoclonal antibody increased in BALB / c mouse ascites was diluted at an appropriate dilution ratio and used in the experiment.
[0044]
(7) Analysis of monoclonal antibody One monoclonal antibody against peptide 14PEN was obtained and named 4-D. Two types of monoclonal antibodies against peptide 16PEN were obtained and named 1-C and 8-C. In order to investigate the reaction specificity of these antibodies, 20 to 100 ng of four kinds of purified serine-threonine protein kinases (CaMKII, CaMKIV, protein kinase A, MAP kinase) were separated by SDS electrophoresis, and then nitrocellulose. The membrane was transferred to a membrane and subjected to protein staining and Western blotting. As the monoclonal antibody, ascites was diluted 1/1000.
[0045]
As a result, it was confirmed that 4-D, 1-C antibody and 8-C antibody react with CaMKII, CaMKIV, protein kinase A and MAP kinase.
[0046]
In addition, when the 1-C antibody and 8-C antibody were reacted with rat cerebrum, cerebellum and brain stem proteins by Western blotting, it was confirmed that the antibodies reacted with proteins in many brain tissues. (FIG. 1).
[0047]
As a tissue extract, 20 μg of protein is applied per lane. The method described in the following paper was used as a method for preparing the tissue extract.
(Kameshita, I and Fujisawa, H (1996) Detection of protein kinase acitivities toward oligopeptides in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel. Anal. Biochem. 237, 198-203)
Next, the 8-C antibody was immobilized on Sepharose, and an immunoprecipitation reaction was performed using rat cerebral extract. Intragel phosphorylation of rat cerebral extract and immunoprecipitate using synthetic peptide (maltaide) (Kameshita, I., Taketani, S., Ishida, A., and Fujisawa H. (1999) Detection of a variety of Ser. Thr protein kinases using a synthetic peptide with multiple phosphorylation sites. J. Biochem. 126, 991-995), detected multiple active bands of serine-threonine protein kinases strongly against immunoprecipitates (Fig. 2). Thus, it was confirmed that 8-C antibody can detect protein phosphorylase not only by Western blotting but also by immunoprecipitation.
[0048]
The method for preparing the cerebrum extract is the method described in Kameshta, I and Fujisawa, H (1996) Detection of protein kinase acitivities toward oligopeptides in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel. Anal. Biochem. 237, 198-203. In the in-gel activity detection, a sample subjected to immunoprecipitation using 100 μg of cerebral extract is used. The preparation method of maltaid is described in Kameshta, I., Taketani, S., Ishida, A., and Fujisawa H. (1999) Detection of a variety of Ser / Thr protein kinases using a synthetic peptide with multiple phosphorylation sites. The method described in Biochem. 126, 991-995 was used.
[0049]
(8) Screening for serine-threonine protein kinase using monoclonal antibody
Using a mixed antibody of 1-C antibody and 8-C antibody, gene cloning of various serine-threonine protein kinases in cDNA library of mouse brain tissue was performed. A mouse brain λZAPII library (manufactured by Stratagene) was infected with Escherichia coli (XL1-Blue strain) and spread on a plastic plate (9 cm diameter) on which an LB agar medium was hardened to form phage plaques. A nitrocellulose membrane soaked with 10 mM IPTG was attached to a plate to induce the expression of the protein encoded by the cDNA contained in each plaque, and simultaneously blotted onto the nitrocellulose membrane. The membrane on which the protein was blotted was reacted with a mixed antibody of 1-C and 8-C antibodies, and a clone expressing a protein that reacts with the antibody was screened.
[0050]
When the base sequence of the obtained positive clone was determined and compared with the gene sequences of various serine-threonine protein kinases, the positive clones had the following gene sequences of serine-threonine protein kinases. It was confirmed that the monoclonal antibody of the present invention can detect various serine-threonine protein kinases.
Calmodulin kinase I
Calmodulin kinase I β-2
Calmodulin kinase II α
Calmodulin kinase II β
Calmodulin kinase II δ
Calmodulin kinase II γ
Calmodulin kinase IV
Calmodulin kinase kinase α
MAP kinase kinase-5
Protein kinase A
Ribosome S6 protein kinase [0051]
【The invention's effect】
The monoclonal antibody of the present invention can detect serine-threonine protein phosphorylase comprehensively from a wide range of proteins. Therefore, it is useful for primary screening of the enzyme.
[0052]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of a reactivity test (Western blotting) between proteins in rat brain tissue and 8-C, 1-C monoclonal antibodies.
FIG. 2 shows the results of immunoprecipitation reaction and Western blotting of protein and 8-C monoclonal antibody in rat cerebral extract.

Claims

At least one member selected from the group consisting of peptide and protein conjugate for their carrier represented by SEQ ID NO: 2 as an immunogen, Ru obtained by immunizing a warm-blooded animal, except humans, tables in SEQ ID NO: 2 Including a plurality of monoclonal antibodies that recognize the peptide
Reactive to all proteins of CaMKI, CaMKII, CaMKIV, CaMK kinase, protein kinase A , MAP kinase and MAP kinase kinase ,
Mixed-antibody.

A method for detecting or measuring serine-threonine protein kinase, wherein an immunological assay is performed using the mixed antibody according to claim 1.