JP4337026B2 - Water-soluble polymer primer for sugar chain synthesis - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖鎖製造に有用な水溶性高分子プライマーおよび該水溶性高分子プライマーを用いた糖鎖の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖は核酸や蛋白質と並んで生体を構成する主要な成分であるが、核酸や蛋白質と比べ、その構造あるいは機能はあまりよく理解されていない。糖は、通常糖鎖と呼ばれる重合体を形成し、さらにそれらが蛋白質や脂質と結合して糖蛋白質、糖脂質あるいはプロテオグリカンと総称される極めて複雑な複合分子を形成している。さらに、核酸あるいは蛋白質がその構成単位であるヌクレオチドあるいはアミノ酸が直線的に結合した高分子であるのに対して、糖鎖は分子内に複数の分岐点があるばかりでなく、その構成単位である単糖の結合様式も多様であるため、その構造は核酸や蛋白質と比較にならないほど複雑である。これら構造の複雑さは、この分野の研究を遅らせている大きな原因の一つとなっている。
【０００３】
しかし、近年糖鎖が細胞認識、免疫、分化、受精、老化、ガン化などに関与することが徐々にわかってくるにつれて、非常に注目される研究分野となってきた。このような現状より、天然の構造を有する糖鎖や新規な糖鎖を合成する試みが盛んになされている。核酸や蛋白質については自動合成技術が確立されており、このことにより、この分野の研究が著しく進歩したことは誰もが認めるところであり、糖鎖についても、その自動合成技術の確立は切望されている。
【０００４】
これまでに糖鎖の自動合成を試みたいくつかの報告があり、その手法は大きく分けて２つある。１つは化学合成によるものであるが、糖残基と糖残基を立体選択的に結合させる方法が十分確立されておらず、さらに保護基を結合させたり、あるいは脱離させたりと工程が煩雑であるという問題がある。もう１つは酵素合成によるものであり、保護基を必要とせず、また糖残基と糖残基を立体選択的に結合させることができるので化学合成に比べ、非常に有利であり、近年いくつかの方法が提案されるようになってきた。これには、最近各種糖転移酵素の遺伝子が単離され、遺伝子組換え技術による糖転移酵素の大量生産が可能になってきたという背景がある。また、自動合成では通常反応開始点となる糖残基を特定の担体上に特定の条件で開裂することのできるリンカーを介して結合されたもの（プライマーとも呼ばれる）が出発物質として用いられる。リンカーの種類によって製造される糖鎖化合物は異なり、オリゴ糖、配糖体、糖ペプチド、糖脂質など種々の形で担体より遊離される。しかしながら、合成した糖鎖化合物を種々の用途に利用することを考えると、やはりオリゴ糖が最も好ましい。
【０００５】
糖転移酵素を用いた糖鎖の自動合成の例としては、U. Zehaviらがアミノエチル基あるいはアミノヘキシル基を結合させたポリアクリルアミドゲルを固相担体とした糖転移酵素による固相合成を報告している（例えば、非特許文献１、２参照）。この方法は、適当な単糖を４−カルボキシ−２−ニトロベンジルグリコシドとした後、上記担体のアミノ基と結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素により糖鎖伸長反応を行ない、その後光分解により伸長させた糖鎖をオリゴ糖として遊離させるというものである。しかし、糖転移酵素による糖転移収率は低く、１０％にも満たない。
【０００６】
また、これまで糖転移酵素は固相担体上に結合させた糖あるいはオリゴ糖とはあまり反応せず、糖鎖伸長反応を効率よく行うことは困難であるとされてきたが、U. Zehaviらは４−カルボキシ−２−ニトロベンジルグリコシドと固相担体との間をヘキサメチレン基やオクタメチレン基など鎖長の長いリンカーで結合させることにより、糖転移収率を最大５１％まで向上したと報告している（例えば、非特許文献３、４参照）。しかしながら、この方法においても収率的には十分なレベルとは言えない。
【０００７】
その他の例として、C.-H. Wongらはアミノ化シリカに下記化３（式中、Ａｃはアセチル基、Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニル基を示す）の基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、α−キモトリプシンの加水分解作用を利用し伸長させた糖鎖を糖ペプチドの形で切り出す方法を報告している（例えば、非特許文献５参照）。しかしながら、糖転移酵素による糖鎖伸長反応の収率は５５〜６５％であり、十分なものとは言えない。
【０００８】
【化３】
また、C.-H. Wongらは、固相担体であるアミノ化シリカに結合させる基を下記化４（式中、Ａｃはアセチル基を示す）に改良し、糖転移酵素により糖鎖を伸長させた後、ヒドラジン分解により糖鎖を遊離させる方法を報告しており、酵素による糖転移反応をほぼ定量的に行うことができたとも報告している（例えば、非特許文献６参照）。この方法によれば、伸長した糖鎖は６−カルボヒドラジドヘキサノール配糖体として遊離される。
【００１０】
【化４】
さらに、C.-H. Wongらは、アクリルアミド−アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体のアクリルアミド残基に下記化５（式中、Ａｃはアセチル基を示す）の基を結合させた水溶性のポリマーをプライマーとし、糖転移酵素により糖鎖を伸長させた後、硝酸二アンモニウムセリウム(IV)により遊離させる方法を報告している（例えば、非特許文献７参照）。この方法によれば、酵素による糖転移反応は８０〜９０％の収率で進行し、伸長した糖鎖はｐ−ホルミルフェノール配糖体として遊離される。
【００１２】
【化５】
M. Meldal らは、ジアミノ化ポリエチレングリコールのモノおよびジアクリロイル化体の重合体ゲルに、下記化６（式中、Ａｃはアセチル基を示す）の基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、トリフロロ酢酸により糖鎖を糖ペプチドとして遊離させる方法を報告しており、糖転移反応もほぼ定量的に進行したと報告している（例えば、非特許文献８参照）。この方法で得られる糖ペプチドのペプチド鎖はＡｓｎ（アスパラギン）−Ｇｌｙ（グリシン）であり、Ｃ末側のグリシン残基はグリシンアミド残基となっており、通常の糖ペプチドとは異なる。
【００１４】
【化６】
さらに、本発明者らがポリアクリルアミドのアミド態窒素原子に、下記化７（式中、Ａｃはアセチル基を示す）に示した基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、α−キモトリプシンの加水分解作用を利用して伸長させた糖鎖を遊離させる方法を報告している（例えば、非特許文献９、１０参照）。本方法によれば、酵素による糖転移反応は定量的に進行し、伸長した糖鎖は６−アミノヘキサノール配糖体として得られる。
【００１６】
【化７】
上述したこれらの方法は、いずれも得られる糖鎖化合物がオリゴ糖ではないこと、必ずしも糖転移反応の収率が十分でないことが欠点として挙げられる。また、遺伝子組換えにより大量生産が可能になってきたとはいえ、まだまだ糖転移酵素は非常に高価であり、繰り返して使用できる固定化糖転移酵素の利用が望まれるが、上記の方法のうちのいくつかは不溶性担体上で糖鎖伸長反応を行うため、固定化糖転移酵素を利用できないという欠点もある。固定化糖転移酵素を利用するためには、不溶性担体ではなく、水溶性担体上で糖鎖伸長反応を行う必要がある。
【００１８】
S. Rothらは、まず、糖転移酵素の糖受容体を固相担体に結合させ、これをアフィニティ吸着体とし、この糖受容体と結合することのできる糖転移酵素を含む組織抽出液を接触させることにより、糖転移酵素をアフィニティ吸着体に結合させ、次いで、この糖転移酵素が結合したアフィニティ吸着体をこの糖転移酵素が糖供与体として利用できる糖ヌクレオチドを含む溶液と接触させることにより、糖転移酵素をアフィニティ吸着体から遊離させるとともに糖受容体に糖残基を一つ伸長させ、さらに、この糖残基が一つ伸長した糖受容体と結合することのできる糖転移酵素を含む組織抽出液を接触させ、同様のことを繰り返し所望の糖鎖を固相担体上に合成する方法を開示している。（例えば、特許文献１参照）しかしながら、この方法の有用性を示す具体的なデータは示されておらず、得られた糖鎖を固相担体から遊離させる方法も開示されていない。
【００１９】
糖転移酵素を用いた糖鎖の自動合成であり、得られる糖鎖化合物がオリゴ糖である例としては、T. NorbergらがSepharose 6B(アマシャムファルマシア社製)に下記化８に示した基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、臭素あるいはアンモニア／硼酸アンモニウムにより伸長させた糖鎖を遊離させる方法を報告している（例えば、非特許文献１１参照）。酵素による糖転移反応は定量的に進行しており、収率的には問題はないが、プライマーを製造に高価な３，４−ジエトキシ−３−シクロブテン−１，２−ジオンを用いており、経済的ではない。また、不溶性担体上での糖鎖伸長反応を行うため、固定化糖転移酵素を利用できないという欠点もある。
【００２０】
【化８】
また、本発明者らはポリアクリルアミド中のアミド態窒素原子の５個に１個の割合で、下記化９（式中、Ａｃはアセチル基を示す）に示した基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、水素化分解により伸長させた糖鎖を遊離させる方法を報告している（例えば、特許文献１２、１３参照）。本方法によれば、酵素による糖転移反応は定量的に進行するが、後述するようにそれは遊離酵素の場合であり、固定化酵素では必ずしもそのようには進行しない。
【００２２】
【化９】
【特許文献１】
特表平５−５００９０５号公報
【００２４】
【非特許文献１】
Carbohydr. Res., 124, 23 (1983)
【００２５】
【非特許文献２】
Carbohydr. Res., 228, 255 (1992)
【００２６】
【非特許文献３】
React. Polym., 22, 171 (1994),
【００２７】
【非特許文献４】
Carbohydr. Res., 265, 161 (1994)
【００２８】
【非特許文献５】
J. Am. Chem. Soc., 116, 1136 (1994)
【００２９】
【非特許文献６】
J. Am. Chem. Soc., 116, 11315 (1994)
【００３０】
【非特許文献７】
Adv. Synth. Catal., 343, 675 (2001)
【００３１】
【非特許文献８】
J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1849 (1994)
【００３２】
【非特許文献９】
Tetrahedron Lett., 36, 9493 (1995)
【００３３】
【非特許文献１０】
Carbohydr. Res., 305, 443 (1998)
【００３４】
【非特許文献１１】
Carbohydr. Res., 319, 80 （1999）
【００３５】
【非特許文献１２】
Tetrahedron Lett., 35, 5657 (1994)
【００３６】
【非特許文献１３】
Carbohydr. Res., 305, 443 (1998)
【００３７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、オリゴ糖の自動合成に適したプライマーを提供することにある。
【００３８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記問題点を解決するために鋭意検討した結果、アクリル酸残基を２０〜８０％を含む水溶性ポリマーの側鎖に選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介して単糖残基あるいはオリゴ糖残基を結合させることにより、上記問題点を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００３９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００４０】
（１）単糖残基あるいはオリゴ糖残基が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介し、水溶性ポリマーの側鎖に結合した糖鎖合成用水溶性高分子プライマーであって、該水溶性ポリマーがビニル系共重合体であり、該ビニル系共重合体中に、単糖残基あるいはオリゴ糖残基が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介して結合したアクリルアミド誘導体と、アクリル酸と、ビニル系単量体とを含み、該アクリル酸の全ビニル系共重合体中に占める割合が２０〜８０モル％であることを特徴とする糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【００４１】
（２）前記ビニル系単量体が、アクリルアミド類、メタクリルアミド類、メタクリル酸、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレン類、及び脂肪酸ビニルエステル類からなる群から選ばれた１種または２種以上のビニル系単量体である、請求項１に記載の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【００４２】
（３）前記リンカーに含まれる選択的に開裂可能な結合が、水素化分解あるいは２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノンによる酸化工程である、（１）又は（２）の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【００４３】
（４）単糖残基あるいはオリゴ糖残基および選択的に開裂可能な結合を含むリンカーが、一般式（Ｉ）（式中、Ｒ１は単糖あるいはオリゴ糖残基、Ｒ２はメチレン基４〜２０個分の長さを有するリンカー、ＸはＮＨを示す）で表された基である、（１）〜（３）のいずれかの糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【００４４】
【化１０】
（５）前記Ｒ１が、
Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコース残基、ラクトース残基である、（４）の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【００４６】
（６）Ｒ２が、ペンチレン基である、（４）又は（５）の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【００４７】
（７）単糖残基あるいはオリゴ糖残基が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介して結合したアクリルアミド誘導体が、一般式（ＩＩ）（式中、Ｒ ３ は単糖残基あるいはオリゴ糖残基、Ｒ ４ はメチレン基４〜２０個分の長さを有するリンカーを示す）で表されるアクリルアミド誘導体である、（１）〜（３）のいずれかに記載の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
【００４８】
【化１１】
【発明の実施の形態】
本発明の糖鎖合成用水溶性高分子プライマーは、単糖残基あるいはオリゴ糖残基が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介し水溶性ポリマーの側鎖に結合したポリマーであって、該水溶性ポリマー中にアクリル酸残基を２０〜８０％含む糖鎖合成用水溶性高分子プライマーである。
【００５４】
本発明に用いられる水溶性ポリマーは、特に制限されるものではないが、例えばアクリルアミド類、メタクリルアミド類、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレン類、脂肪酸ビニルエステル類からなる群から選ばれた１種または２種以上のビニル系単量体の重合体などが好適に用いられる。
【００５５】
前記アクリルアミド類としては、例えばアクリルアミドやＮ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどのＮ−アルキルアクリルアミド類などが好適に用いられる。
【００５６】
前記メタクリルアミド類としては、例えばメタクリルアミド、Ｎ−メチルメタクリルアミドやＮ−イソプロピルメタクリルアミドなどのＮ−アルキルメタクリルアミド類などが好適に用いられる。
【００５７】
前記アクリル酸エステル類としては、例えばアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸ジメチルアミノエチルなどが好適に用いられる。
【００５８】
前記メタクリル酸エステル類としては、例えばメタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ジメチルアミノエチルなどが好適に用いられる。
【００５９】
前記スチレン類としては、例えばスチレン、ｐ−ヒドロキシスチレンなどが好適に用いられる。
【００６０】
脂肪酸ビニルエステル類としては、例えば酢酸ビニル、酪酸ビニルなどが好適に用いられる。
【００６１】
選択的に開裂可能な結合は、糖鎖部分を分解することなく開裂することのできる結合であれば、特に限定されないが、例えば水素化分解あるいは２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノンによる酸化などが挙げられる。
【００６２】
水溶性ポリマーの側鎖に選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介し結合した単糖残基あるいはオリゴ糖残基として、具体的には、一般式（Ｉ）（式中、Ｒ1は単糖あるいはオリゴ糖残基、Ｒ2はメチレン基４〜２０個分の長さを有するリンカー、ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す）で表される基を挙げることができる。
【００６３】
【化１２】
Ｒ1の単糖残基あるいはオリゴ糖残基としては、特に制限はなく、グルコース残基、ガラクトース残基、マンノース残基、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、キシロース残基、ラクトース残基、Ｎ−アセチルラクトサミン残基、キトビオース残基などが挙げられる。
【００６５】
Ｒ2のリンカーとしては、例えばブチレン基、ペンチレン基、ヘプチレン基、ドデシレン基などが挙げられる。
【００６６】
本発明の糖鎖合成用水溶性高分子プライマーは、一般式（II）で表されるアクリルアミド誘導体とアクリル酸と少なくとも１種類のビニル系単量体とを共重合することにより製造することができる。そのときのアクリル酸の全ビニル系共重合体中に占める割合は２０〜８０モル％であり、好ましくは４０〜６０モル％である。
【００６７】
前記共重合は、例えばラジカル重合、カチオン重合、アニオン重合などの手法を好適に用いることができ、中でもペルオキソ二硫酸アンモニウムなどを触媒とするラジカル重合がより好適に用いることができる。
【００６８】
前記ビニル系単量体としては、例えばアクリルアミド類、メタクリルアミド類、メタクリル酸、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレン類、脂肪酸ビニルエステル類が挙げられる。
【００６９】
アクリルアミド類としては、アクリルアミドやＮ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどのＮ−アルキルアクリルアミド類などが例示される。
【００７０】
メタクリルアミド類としてはメタクリルアミド、Ｎ−メチルメタクリルアミドやＮ−イソプロピルメタクリルアミドなどのＮ−アルキルメタクリルアミド類などが例示される。
【００７１】
アクリル酸エステル類としてはアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸ジメチルアミノエチルなどが例示される。
【００７２】
メタクリル酸エステル類としてはメタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ジメチルアミノエチルなどが例示される。
【００７３】
スチレン類としてはスチレン、ｐ−ヒドロキシスチレンなどが例示される。脂肪酸ビニルエステル類としては酢酸ビニル、酪酸ビニルなどが例示される。
【００７４】
共重合体の一般的な分子量は約１００００〜約５００００００であり、好ましくは２００００〜２００００００、より好ましくは５００００〜１００００００である。
【００７５】
一般式（II）で表されるアクリルアミド誘導体は、通常用いられている各種有機合成化学的な手法により合成することができる。例えば、一般式（III）で表される糖オキサゾリン誘導体や一般式（IV）で表されるハロゲン化糖あるいはトリクロロアセトイミデート誘導体とｐ−ニトロベンジルアルコールとを適当な触媒存在下で縮合させた後、ニトロ基を還元してアミノ基へと変換する。その後、一般式(V)で表されるω−アミノ脂肪酸と塩化アクリロイルとの縮合により得られる一般式（VI）で表されるアクリルアミド誘導体と上記化合物とを適当な縮合剤存在下、縮合させることにより得られる。
【００７６】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
本発明のオリゴ糖製造方法の第１工程は、水溶性高分子プライマーに糖ヌクレオチドの存在下に糖転移酵素と接触させることにより、糖ヌクレオチドより糖残基を該水溶性高分子プライマーに転移させる。
【００８１】
糖ヌクレオチドより水溶性高分子プライマーへの糖の転移は、通常水溶性高分子プライマーと糖ヌクレオチドとを含む中性の緩衝液中で、１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃で、１〜１２０時間、好ましくは２〜７２時間、糖転移酵素と接触させることにより行われる。
【００８２】
また、反応液中には必要に応じて金属塩を添加してもよい。添加できる金属イオンとしては、例えば、マグネシウム、マンガン、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛などがあり、通常塩化物等の形で添加することができる。
【００８３】
本発明で用いる糖転移酵素は、糖ヌクレオチド類を糖供与体として利用できるものであればよく特に限定されない。このような酵素としてLeloir経路の糖転移酵素類を挙げることができる。例えば、ガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、フコース転移酵素、シアル酸転移酵素、マンノース転移酵素、キシロース転移酵素、グルクロン酸転移酵素などが挙げられる。なお、これらの酵素は遊離酵素であっても、固定化酵素であっても構わないが、固定化酵素が好ましい。
【００８４】
本発明で用いる糖ヌクレオチド類は、上記酵素が利用できるものであれば特に限定されない。例えば、ウリジン−５’−ジリン酸ガラクトース、ウリジン−５’−ジリン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ウリジン−５’−ジリン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ウリジン−５’−ジリン酸グルクロン酸、ウリジン−５’−ジリン酸キシロース、グアノシン−５’−ジリン酸フコース、グアノシン−５’−ジリン酸マンノース、シチジン−５’−モノリン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸およびこれらのナトリウム塩などが挙げられる。
【００８５】
本発明のオリゴ糖製造方法の第２工程は、工程１を１回または２回以上繰り返して、複数の糖残基を転移させることにより、糖鎖を伸長させる。
【００８６】
本発明のオリゴ糖製造方法の第３工程は、必要に応じて、副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類を除去する。副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類などを除去する方法は、水溶性高分子プライマーとヌクレオチド類および糖ヌクレオチド類などとを分離できる方法であれば特に限定されない。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、透析、限外ろ過などにより除去することができる。
【００８７】
本発明のオリゴ糖製造方法の第４工程は、工程１〜工程３を複数回繰り返した後、複数の糖残基が転移して糖鎖が伸長した水溶性高分子プライマーからオリゴ糖を遊離させる。本発明の水溶性高分子プライマーより、伸長した糖鎖を遊離させる方法としては、伸長した糖鎖を分解することなく、遊離させることのできる方法であれば、特に制限はないが、例えば接触水素化分解や２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノンによる酸化反応などが挙げられる。
【００８８】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲はかかる実施例に何ら限定されるものではない。
【００８９】
参考例１ ２−メチル−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−α−Ｄ−グルコピラノ）−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリンの合成
２−アセトアミド−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド６．０ｇを１，２−ジクロロエタン４０ｍｌに溶かし、ここにトリメチルシリルトリフロロメタンスルホン酸３．２ｍｌを加え、５０℃で７時間撹拌しながら反応させた。反応後、室温まで冷却した後、トリエチルアミン１０．８ｍｌを加えた。反応液を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；トルエン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝１００：２００：１）で目的物を分離し、目的物を５．０ｇ得た。
【００９０】
参考例２ ｐ−ニトロベンジル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例１で得た２−メチル−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−α−Ｄ−グルコピラノ）−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン２．８ｇをジクロロエタン４０ｍｌに溶解し、ここにｐ−ニトロベンジルアルコール１０．４ｇとＤ−カンファー−１０−スルホン酸０．２ｇを加え、８０℃で２時間撹拌しながら反応させた。反応後、室温まで冷却し、トリエチルアミン４．０ｍｌを加えた。反応液を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：酢酸エチル：メタノール＝２００：４０：５）で目的物を分離し、目的物を３．７ｇ得た。
【００９１】
参考例３ ６−アクリロイルアミノカプロン酸の合成
６−アミノカプロン酸１０．０ｇを１．２７Ｍ水酸化ナトリウム水溶液６０ｍｌに溶解し、塩化アクリロイル７．８ｍｌを２０ｍｌのテトラヒドロフランに溶かしたものを氷冷下で滴下した。このとき、ｐＨ８〜９になるように４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いて調整した。滴下後、徐々に室温に戻しながら２時間撹拌した。次いで、反応液に１Ｎ塩酸をｐＨ３になるまで加えた後、酢酸エチルで生成物を抽出した。抽出液を水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。硫酸マグネシウムをろ別し、ろ液を減圧濃縮した。残渣を少量の酢酸エチルに溶かし、ヘキサンで再結晶し、目的物９．６ｇを得た。
【００９２】
参考例４ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例２で得たｐ−ニトロベンジル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド１．６ｇをメタノール５０ｍｌに溶解し、ここにギ酸アンモニウム２．１ｇおよび１０％パラジウム−炭素１７０ｍｇを加えた。室温で５分間撹拌した後、触媒をろ別し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をクロロホルムで溶解した。蒸留水で有機層を洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥後、硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を減圧濃縮した。残渣をジクロロエタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１０：１の混合溶媒４４ｍｌで溶かし、ここに参考例３で得た６−アクリロイルアミノカプロン酸０．６ｇを加えた。さらに、トリエチルアミン０．４６ｍｌと１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩６５ｍｇを０℃で撹拌しながら加えた。撹拌しながら室温まで戻し、２２時間反応させた。反応液にクロロホルム６０ｍｌを加え、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムをろ別し、ろ液を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：エタノール＝３０：１）で目的物を分離し、目的物を１．１ｇ得た。
【００９３】
実施例１ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例４で得たｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド６６０ｍｇをメタノール７０ｍｌに溶解し、ここにナトリウムメトキシド５０ｍｇを加え、室温で撹拌しながら１５時間反応させた。反応後、Ｈ+型の陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ−８（ダウケミカル社製）をｐＨ７になるまで加えた。イオン交換樹脂をろ別し、ろ液を減圧濃縮し、目的物を５２０ｍｇ得た。
【００９４】
実施例２ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：２：７、プライマーＡ）の合成
実施例１で得たｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド６１．７ｍｇ、アクリル酸１８．０ｍｇ、アクリルアミド６２．２ｍｇをジメチルスルホキシド：蒸留水＝３：１の混合溶媒１ｍｌに溶解し、アスピレーターで十分に脱気した後、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（以下、ＴＥＭＥＤと略する）１１．６μｌと過硫酸アンモニウム８．６ｍｇを加え、室温で２４時間撹拌し重合させた。反応後、反応液に蒸留水２ｍｌを加え、Sephadex G-50（アマシャムファルマシア社製）を用いたカラムクロマトグラフィー（溶出液：５０ｍＭ酢酸アンモニウム）により目的物を分離した。得られた目的物画分を凍結乾燥し、目的物１３８ｍｇを得た。
【００９５】
実施例３ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：４：５、プライマーＢ）の合成
アクリル酸３６．０ｍｇ、アクリルアミド４４．４ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１３８ｍｇを得た。
【００９６】
実施例４ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：６：３、プライマーＣ）の合成
アクリル酸５４．０ｍｇ、アクリルアミド２６．７ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１３９ｍｇを得た。
【００９７】
実施例５ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：８：１、プライマーＤ）の合成
アクリル酸７２．１ｍｇ、アクリルアミド８．９ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１３９ｍｇを得た。
【００９８】
参考例５ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリルアミド共重合体（共重合比１：９、プライマーＥ）の合成
アクリル酸を用いずに、アクリルアミド８０．０ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１３８ｍｇを得た。
【００９９】
参考例６ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル −２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸共重合体（共重合比１：９、プライマーＦ）の合成
アクリルアミドを用いずに、アクリル酸８１．１ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１３９ｍｇを得た。
【０１００】
実施例６ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：２：７、プライマーＧ）の合成
アクリルアミドの代わりにＮ−イソプロピルアクリルアミドを９９．０ｍｇ用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１７４ｍｇを得た。
【０１０１】
実施例７ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：４：５、プライマーＨ）の合成
アクリル酸３６．０ｍｇ、アクリルアミドの代わりにＮ−イソプロピルアクリルアミドを７０．７ｍｇ用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１６４ｍｇを得た。
【０１０２】
実施例８ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：６：３、プライマーＩ）の合成
アクリル酸５４．０ｍｇ、アクリルアミドの代わりにＮ−イソプロピルアクリルアミドを４２．４ｍｇ用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１５４ｍｇを得た。
【０１０３】
実施例９ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル −２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：８：１、プライマーＪ）の合成
アクリル酸７２．１ｍｇ、アクリルアミドの代わりにＮ−イソプロピルアクリルアミドを１４．１ｍｇ用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１４４ｍｇを得た。
【０１０４】
参考例７ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：９、プライマーＫ）の合成
アクリル酸を用いずに、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１２７．３ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１８３ｍｇを得た。
【０１０５】
参考例８ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリルアミド−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：５：４、プライマーＬ）の合成
アクリル酸を用いずに、アクリルアミド４４．４ｍｇ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド５６．６ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１５８ｍｇを得た。
【０１０６】
実施例１０ β１，４−ガラクトース転移酵素による各種プライマーへのガラクトース転移
β１，４−ガラクトース転移酵素（東洋紡績社製）１Ｕ、ウリジン−５’−ジホスホガラクトース１０ｍＭ、塩化マンガン１０ｍＭ、α−ラクトアルブミン０．２６ｍｇ／ｍｌを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）２．０ｍｌに実施例２〜９および参考例５〜８で得たプライマーＡ〜Ｌをそれぞれ２０ｍｇ加え、３７℃で２４時間反応させた。反応後、１００℃で３分間加熱することにより反応を停止させた。反応液を遠心分離して得られた上清より、Sephadex G-25カラムクロマトグラフィー（溶出液：蒸留水）で生成物画分を分離し、凍結乾燥することにより生成物１９ｍｇを得た。得られた生成物の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、そのスペクトルよりガラクトースの転移がいずれも定量的に進行していることを確認した。
【０１０７】
参考例９ 固定化α２，３−シアル酸転移酵素の調製
NHS活性化Sepharose（アマシャムファルマシア社製）０．５ｇをとり、１ｍＭ塩酸１００ｍｌを３回に分けて洗浄した。これにブタ肝臓由来α２，３−シアル酸転移酵素１Ｕ、シチジン−５’−ジホスフェート１ｍＭを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍｌを加え、４℃で一晩、穏やかに振とうした。固定化α２，３−シアル酸転移酵素をガラスフィルターでろ別し、α２，３−シアル酸転移酵素を除く上記緩衝液５ｍｌで洗浄した。０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌを加え、担体中の未反応の活性化基をブロックし、さらに洗浄した後、α２，３−シアル酸転移酵素をシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（以下、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃと略する）１ｍＭを含む２５ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に浸漬し、４℃で保存した。得られた固定化酵素の活性は１１０ｍＵ／ｍｌであった。
【０１０８】
実施例１１ 固定化α２，３−シアル酸転移酵素による各種プライマーへのシアル酸転移
参考例９で得た固定化α２，３−シアル酸転移酵素０．０５ｍｌ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ５０ｍＭ、塩化マンガン１０ｍＭ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ ＣＦ−５４を含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌに実施例１０で得たガラクトシル化されたプライマーＡ〜Ｌをそれぞれ６．５ｍｇ（プライマーＡ〜Ｆ）、８．０ｍｇ、７．５ｍｇ、７．１ｍｇ、６．７ｍｇ、８．４ｍｇ、７．３ｍｇ（Ｎ−アセチルラクトサミン残基で５μｍｏｌｅに相当）加え、３０℃で２４時間振とうしながら反応させた。反応後、遠心分離することにより反応液を上清として得た後、実施例１０と同様の方法で生成物を分離し、生成物をそれぞれ６．０ｍｇ（プライマーＡ〜Ｆ）、７．５ｍｇ、７．０ｍｇ、６．５ｍｇ、６．２ｍｇ、７．８ｍｇ、６．８ｍｇ得た。生成物をそれぞれ１ｍｇとり、蒸留水：エタノール＝３：１の混合溶媒１ｍｌに溶かし、ここに１０％パラジウム−炭素１ｍｇを加え、常圧下水素ガスにより室温で２４時間接触還元した。触媒をろ別した後、ろ液を限外ろ過ユニットウルトラフリーＭＣ（分画分子量１０，０００、ミリポア社製）でろ過し、通過液画分として遊離させたオリゴ糖を集めた。通過液画分を凍結乾燥し、得られた固形分を定法に従い、ピリジルアミノ化し、ＨＰＬＣにてシアリルラクトサミン、ラクトサミンの存在比を分析することにより、糖転移収率を求めた。
【０１０９】
【表１】
参考例１０ ｐ−ニトロベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ− ガラクトシル−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシドの合成
１−ブロモ−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクトシル−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシド５．０ｇをジクロロエタン５０ｍｌに溶解し、ここにｐ−ニトロベンジルアルコール２３．５ｇとモレキュラーシーブス４Aを５．０ｇ加え０℃で撹拌した。窒素気流下で銀トリフレートを２．９ｇ加えで徐々に室温に戻しながら１２時間撹拌しながら反応させた。反応液をクロロホルムで希釈してセライトパッド上で濾過したのち、ろ液を飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。ろ過により硫酸マグネシウムを除去し、ろ液を減圧下で濃縮したのち、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝５０：１）で目的物を分離し、目的物を５．６ｇ得た。
【０１１１】
参考例１１ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）−ベンジル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクトシル−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例１０で得たｐ−ニトロベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクトシル−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシ３．０ｇをメタノール５０ｍｌに溶解し、ここにギ酸アンモニウムを１．８ｇおよび１０％パラジウム-炭素を２００ｍｇを加えた。室温で５分間撹拌した後、触媒をろ別し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をクロロホルムで溶解した。蒸留水で有機層を洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥後、硫酸マグネシウムをろ別した後、ろ液を減圧濃縮した。残渣をジクロロエタン：Ｎ，Ｎ，−ジメチルホルムアミド＝１０：１の混合溶媒４０ｍｌで溶かし、ここで参考例３で得た６−アクリロイルアミノカプロン酸を０．８５ｇ加えた。続いてトリエチルアミン６３４μｌと１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩８７０ｍｇを加えて氷冷から室温に戻しながら２２時間撹拌した。反応液をクロロホルムで希釈し、１Ｎ硫酸および飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。濾過により硫酸マグネシウムを除去し、ろ液を減圧下で濃縮したのち、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：エタノール＝２０：１）で目的物を分離し、目的物を１．１ｇ得た。
【０１１２】
実施例１２ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）−ベンジル−Ｄ−ガラクトシル−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例１１で得たｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）−ベンジル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクトシル−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシド１．０ｇをメタノール１０ｍＬに溶解させた。そこにナトリウムメトキシド２４ｍｇを加え室温で１５時間撹拌した。反応終了後、反応液をイオン交換樹脂ダウエックス５０Ｗ-Ｘ８（Ｈ+）で中和した。樹脂をろ別し、ろ液を減圧濃縮し、目的物を６５０ｍｇ得た。
【０１１３】
実施例１３ ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）−ベンジル−Ｄ−ガラクトシル−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：４：５、プライマーＭ）の合成
実施例１２で得たｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）−ベンジル−Ｄ−ガラクトシル−Ｄ−グルコピラノシド７６．８ｍｇ、アクリル酸３６．０ｍｇ、アクリルアミド４４．４ｍｇを用いて、実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１５１ｍｇを得た。
【０１１４】
実施例１４ 固定化α２，３−シアル酸転移酵素によるプライマーＭへのシアル酸転移
参考例６で得た固定化α２，３−シアル酸転移酵素０．３ｍｌ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ５０ｍＭ、塩化マンガン１０ｍＭを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１．０ｍｌに実施例１３で得たプライマーＭを６．３ｍｇ（ラクトース残基で５μｍｏｌｅに相当）加え、３０℃で２４時間振とうしながら反応させた。反応後、遠心分離することにより反応液を上清として得た後、実施例１０と同様の方法で生成物を分離し、生成物を５ｍｇ得た。生成物の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、そのスペクトルよりシアル酸転移反応の収率を求めたところ、８８％であった。
【０１１５】
【発明の効果】
本発明の糖鎖合成用高分子プライマーを用いることにより、種々のオリゴ糖を効率よく合成でき、自動合成にも適用することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a water-soluble polymer primer useful for sugar chain production and a method for producing a sugar chain using the water-soluble polymer primer.
[0002]
[Prior art]
Sugar is a major component of living organisms along with nucleic acids and proteins, but its structure or function is not well understood compared to nucleic acids and proteins. Sugars usually form polymers called sugar chains, and they combine with proteins and lipids to form extremely complex complex molecules collectively called glycoproteins, glycolipids, or proteoglycans. Furthermore, a nucleic acid or protein is a polymer in which nucleotides or amino acids, which are constituent units, are linearly linked, whereas a sugar chain is not only a plurality of branch points in the molecule but also a constituent unit. Because of the variety of monosaccharide linkages, the structure is so complex that it cannot be compared to nucleic acids and proteins. The complexity of these structures is one of the major reasons for delaying research in this area.
[0003]
In recent years, however, it has become a research area that has received much attention as it gradually becomes known that sugar chains are involved in cell recognition, immunity, differentiation, fertilization, aging, canceration, and the like. Under such circumstances, attempts have been actively made to synthesize sugar chains having a natural structure or novel sugar chains. Automatic synthesis technology has been established for nucleic acids and proteins, and this is where everyone acknowledges that research in this field has made significant progress, and the establishment of automated synthesis technology for sugar chains is also anxious. Yes.
[0004]
There have been several reports of attempts to synthesize sugar chains, and there are two main approaches. One is by chemical synthesis. However, a method for stereoselectively binding a sugar residue and a sugar residue has not been established yet, and a process for binding or leaving a protecting group can be performed. There is a problem that it is complicated. The other is based on enzymatic synthesis, which does not require a protecting group and can be linked stereoselectively between sugar residues and sugar residues, which is very advantageous compared to chemical synthesis. Some methods have been proposed. This is due to the fact that genes for various glycosyltransferases have recently been isolated, and mass production of glycosyltransferases by means of gene recombination technology has become possible. In addition, in automatic synthesis, a sugar residue (usually referred to as a primer) in which a sugar residue that is a reaction initiation point is bonded to a specific carrier through a linker that can be cleaved under specific conditions is used as a starting material. The sugar chain compound produced differs depending on the type of linker, and is released from the carrier in various forms such as oligosaccharides, glycosides, glycopeptides and glycolipids. However, in view of utilizing the synthesized sugar chain compound for various purposes, oligosaccharides are still most preferable.
[0005]
As an example of automated sugar chain synthesis using glycosyltransferases, U. Zehavi et al. Reported solid-phase synthesis by glycosyltransferases using polyacrylamide gels with aminoethyl groups or aminohexyl groups bound as solid phase carriers. (For example, see Non-Patent Documents 1 and 2). In this method, an appropriate monosaccharide is converted into 4-carboxy-2-nitrobenzylglycoside, and then a primer bonded to the amino group of the carrier is used to perform a sugar chain elongation reaction with a glycosyltransferase, followed by photolysis. The sugar chain extended by 1 is released as an oligosaccharide. However, the glycosyltransferase yield by glycosyltransferase is low and less than 10%.
[0006]
In addition, glycosyltransferases have not so much reacted with sugars or oligosaccharides bound on a solid support, and it has been difficult to efficiently carry out a sugar chain elongation reaction, but U. Zehavi et al. Reported that the sugar transfer yield was improved up to 51% by connecting 4-carboxy-2-nitrobenzylglycoside and solid support with a long chain linker such as hexamethylene or octamethylene. (For example, see Non-Patent Documents 3 and 4). However, even in this method, the yield is not sufficient.
[0007]
As another example, C.-H. Wong et al. Used a primer obtained by binding a group of the following chemical formula 3 (wherein Ac represents an acetyl group and Boc represents a t-butoxycarbonyl group) to aminated silica, A method has been reported in which a sugar chain is elongated using a glycosyltransferase, and then the elongated sugar chain is cut out in the form of a glycopeptide using the hydrolysis action of α-chymotrypsin (see, for example, Non-Patent Document 5). ). However, the yield of the sugar chain elongation reaction by glycosyltransferase is 55 to 65%, which is not sufficient.
[0008]
[Chemical 3]
In addition, C.-H. Wong et al. Improved the group bonded to the aminated silica, which is a solid phase carrier, to the following chemical formula 4 (where Ac represents an acetyl group) and extended the sugar chain by glycosyltransferase. After that, a method for releasing sugar chains by hydrazine decomposition has been reported, and it has also been reported that the glycosyltransferase reaction by the enzyme has been carried out almost quantitatively (see, for example, Non-Patent Document 6). According to this method, the extended sugar chain is released as a 6-carbohydrazide hexanol glycoside.
[0010]
[Formula 4]
Furthermore, C.-H. Wong et al. Are water-soluble in which a group of the following chemical formula 5 (wherein Ac represents an acetyl group) is bonded to an acrylamide residue of an acrylamide-acrylic acid-N-isopropylacrylamide copolymer. A method of extending a sugar chain with glycosyltransferase and then releasing it with diammonium cerium (IV) nitrate using a polymer as a primer (see, for example, Non-Patent Document 7). According to this method, the glycosyltransferase reaction by the enzyme proceeds with a yield of 80 to 90%, and the extended sugar chain is released as a p-formylphenol glycoside.
[0012]
[Chemical formula 5]
M. Meldal et al. Used a polymer gel of mono- and diacryloylated diaminated polyethylene glycol with a group of the following chemical formula 6 (where Ac represents an acetyl group) as a primer, After extending the sugar chain using an enzyme, a method of releasing the sugar chain as a glycopeptide with trifluoroacetic acid has been reported, and the transglycosylation reaction has also progressed almost quantitatively (for example, non-patented) Reference 8). The peptide chain of the glycopeptide obtained by this method is Asn (asparagine) -Gly (glycine), and the glycine residue on the C-terminal side is a glycinamide residue, which is different from a normal glycopeptide.
[0014]
[Chemical 6]
Furthermore, the present inventors used as a primer a group obtained by binding the group shown in the following chemical formula 7 (wherein Ac represents an acetyl group) to the amide nitrogen atom of polyacrylamide, and using sugar transferase After extending the chain, a method for releasing the extended sugar chain by utilizing the hydrolysis action of α-chymotrypsin has been reported (for example, see Non-Patent Documents 9 and 10). According to this method, the glycosyltransferase reaction by the enzyme proceeds quantitatively, and the extended sugar chain is obtained as a 6-aminohexanol glycoside.
[0016]
[Chemical 7]
These methods mentioned above are disadvantageous in that the sugar chain compound obtained is not an oligosaccharide, and the yield of the transglycosylation reaction is not always sufficient. In addition, although mass production has become possible by genetic recombination, glycosyltransferases are still very expensive, and it is desirable to use immobilized glycosyltransferases that can be used repeatedly. Some have the disadvantage that the immobilized glycosyltransferase cannot be used because the sugar chain elongation reaction is carried out on an insoluble carrier. In order to use the immobilized glycosyltransferase, it is necessary to perform a sugar chain elongation reaction on a water-soluble carrier, not an insoluble carrier.
[0018]
S. Roth et al. First bind a glycosyltransferase sugar receptor to a solid support and use it as an affinity adsorbent to contact a tissue extract containing a glycosyltransferase that can bind to this sugar receptor. By allowing the glycosyltransferase to bind to the affinity adsorbent, and then bringing the glycosyltransferase-bound affinity adsorbent into contact with a solution containing a sugar nucleotide that the glycosyltransferase can use as a sugar donor, A tissue containing a glycosyltransferase that releases a glycosyltransferase from an affinity adsorbent, extends a sugar residue to a sugar receptor, and can bind to a sugar receptor in which this sugar residue is extended by one A method of synthesizing a desired sugar chain on a solid phase carrier by contacting the extract and repeating the same process is disclosed. However, specific data showing the usefulness of this method is not shown, and a method for releasing the obtained sugar chain from the solid phase carrier is not disclosed.
[0019]
As an example in which sugar chains are automatically synthesized using a glycosyltransferase and the resulting sugar chain compound is an oligosaccharide, T. Norberg et al. In Sepharose 6B (manufactured by Amersham Pharmacia) has the group shown in the following chemical formula 8. A method has been reported in which a bound chain is used as a primer, a sugar chain is elongated using glycosyltransferase, and then the sugar chain elongated by bromine or ammonia / ammonium borate is released (for example, Non-Patent Document 11). reference). The glycosyltransferase reaction by the enzyme proceeds quantitatively, and there is no problem in yield, but expensive 3,4-diethoxy-3-cyclobutene-1,2-dione is used for producing the primer, Not economical. In addition, since a sugar chain elongation reaction is performed on an insoluble carrier, there is a disadvantage that an immobilized glycosyltransferase cannot be used.
[0020]
[Chemical 8]
In addition, the present inventors used a primer obtained by binding a group shown in the following chemical formula 9 (wherein Ac represents an acetyl group) at a ratio of 1 to 5 amide nitrogen atoms in polyacrylamide. And a method of releasing a sugar chain extended by hydrogenolysis after extending the sugar chain using a glycosyltransferase (see, for example, Patent Documents 12 and 13). According to this method, the glycosyltransferase reaction by the enzyme proceeds quantitatively, but as will be described later, it is a case of a free enzyme and does not necessarily proceed so in an immobilized enzyme.
[0022]
[Chemical 9]
[Patent Document 1]
Japanese National Patent Publication No. 5-500905
[0024]
[Non-Patent Document 1]
Carbohydr. Res., 124, 23 (1983)
[0025]
[Non-Patent Document 2]
Carbohydr. Res., 228, 255 (1992)
[0026]
[Non-Patent Document 3]
React. Polym., 22, 171 (1994),
[0027]
[Non-Patent Document 4]
Carbohydr. Res., 265, 161 (1994)
[0028]
[Non-Patent Document 5]
J. Am. Chem. Soc., 116, 1136 (1994)
[0029]
[Non-Patent Document 6]
J. Am. Chem. Soc., 116, 11315 (1994)
[0030]
[Non-Patent Document 7]
Adv. Synth. Catal., 343, 675 (2001)
[0031]
[Non-Patent Document 8]
J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1849 (1994)
[0032]
[Non-patent document 9]
Tetrahedron Lett., 36, 9493 (1995)
[0033]
[Non-Patent Document 10]
Carbohydr. Res., 305, 443 (1998)
[0034]
[Non-Patent Document 11]
Carbohydr. Res., 319, 80 (1999)
[0035]
[Non-Patent Document 12]
Tetrahedron Lett., 35, 5657 (1994)
[0036]
[Non-Patent Document 13]
Carbohydr. Res., 305, 443 (1998)
[0037]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a primer suitable for the automatic synthesis of oligosaccharides.
[0038]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive investigations to solve the above problems, the present inventors have found that an acrylic acid residue is simply bonded via a linker containing a bond that can be selectively cleaved to a side chain of a water-soluble polymer containing 20 to 80%. The present inventors have found that the above problems can be solved by linking sugar residues or oligosaccharide residues, and have completed the present invention.
[0039]
That is, the present invention includes the following inventions.
[0040]
(1) Via a linker containing a bond that can be selectively cleaved by a monosaccharide residue or oligosaccharide residue,Bound to the side chain of water-soluble polymerWater-soluble polymer primer for sugar chain synthesisBecauseThe water-soluble polymer is a vinyl copolymer, and an acrylamide derivative in which a monosaccharide residue or an oligosaccharide residue is bonded to the vinyl copolymer via a linker that can be selectively cleaved; And acrylic acid and a vinyl monomer, and the proportion of the acrylic acid in the total vinyl copolymer is 20 to 80 mol%.That featuresToWater-soluble polymer primer for sugar chain synthesis.
[0041]
(2) The aboveVinyl monomerAcrylamides, methacrylamides, methacrylic acid, acrylic esters, methacrylic esters, styrenes,as well asOne or more vinyl monomers selected from the group consisting of fatty acid vinyl esters,The water-soluble polymer primer for sugar chain synthesis according to claim 1.
[0042]
(3)AboveThe selectively cleavable bond contained in the linker is hydrogenolysis or an oxidation step with 2,3-dichloro-5,6-dicyanobenzoquinone.,The water-soluble polymer primer for sugar chain synthesis according to (1) or (2).
[0043]
(4) A linker containing a monosaccharide residue or oligosaccharide residue and a selectively cleavable bond,General formula (I) (wherein R1Is a monosaccharide or oligosaccharide residue, R2Is a linker having a length of 4 to 20 methylene groups,X is NHIs a group represented by,(1)Any of (3)Water-soluble polymer primer for sugar chain synthesis.
[0044]
[Chemical Formula 10]
(5)AboveR1 is,
N-acetylglucosamine residue, glucose residue, lactose residue,(4) The water-soluble polymer primer for sugar chain synthesis.
[0046]
(6) R2 is,Is a pentylene group,The water-soluble polymer primer for sugar chain synthesis according to (4) or (5).
[0047]
(7) An acrylamide derivative in which a monosaccharide residue or an oligosaccharide residue is bonded via a linker containing a selectively cleavable bond is represented by the general formula (II) (wherein R 3 Is a monosaccharide residue or oligosaccharide residue, R 4 The water-soluble polymer primer for sugar chain synthesis according to any one of (1) to (3), which is an acrylamide derivative represented by a linker having a length of 4 to 20 methylene groups).
[0048]
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DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The water-soluble polymer primer for sugar chain synthesis of the present invention is a polymer in which a monosaccharide residue or an oligosaccharide residue is bonded to a side chain of a water-soluble polymer via a linker containing a bond that can be selectively cleaved, It is a water-soluble polymer primer for sugar chain synthesis containing 20-80% of acrylic acid residues in the water-soluble polymer.
[0054]
The water-soluble polymer used in the present invention is not particularly limited. For example, acrylamides, methacrylamides, acrylic acid, methacrylic acid, acrylic esters, methacrylic esters, styrenes, fatty acid vinyl esters A polymer of one or two or more vinyl monomers selected from the group consisting of is preferably used.
[0055]
As the acrylamides, for example, N-alkylacrylamides such as acrylamide, N-methylacrylamide, N-ethylacrylamide, N-isopropylacrylamide, and the like are preferably used.
[0056]
As said methacrylamide, N-alkyl methacrylamides, such as methacrylamide, N-methyl methacrylamide, N-isopropyl methacrylamide, etc. are used suitably, for example.
[0057]
As the acrylic esters, for example, methyl acrylate, ethyl acrylate, hydroxyethyl acrylate, dimethylaminoethyl acrylate and the like are preferably used.
[0058]
As the methacrylic acid esters, for example, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, hydroxyethyl methacrylate, dimethylaminoethyl methacrylate and the like are preferably used.
[0059]
As the styrenes, for example, styrene, p-hydroxystyrene and the like are preferably used.
[0060]
As fatty acid vinyl esters, for example, vinyl acetate, vinyl butyrate and the like are preferably used.
[0061]
The selectively cleavable bond is not particularly limited as long as it is a bond that can be cleaved without decomposing the sugar chain moiety. For example, hydrogenolysis or by 2,3-dichloro-5,6-dicyanobenzoquinone Examples include oxidation.
[0062]
Specific examples of the monosaccharide residue or oligosaccharide residue bonded to the side chain of the water-soluble polymer via a linker containing a cleavable bond include those represented by the general formula (I) (wherein R1Is a monosaccharide or oligosaccharide residue, R2Is a linker having a length of 4 to 20 methylene groups, and X is O, S or NH.
[0063]
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R1There are no particular limitations on the monosaccharide residue or oligosaccharide residue of glucose, galactose residue, mannose residue, N-acetylglucosamine residue, N-acetylgalactosamine residue, xylose residue, lactose residue. Group, N-acetyllactosamine residue, chitobiose residue and the like.
[0065]
R2Examples of the linker include a butylene group, a pentylene group, a heptylene group, and a dodecylene group.
[0066]
The water-soluble polymer primer for sugar chain synthesis of the present invention can be produced by copolymerizing an acrylamide derivative represented by the general formula (II), acrylic acid and at least one vinyl monomer. The proportion of acrylic acid in the total vinyl copolymer at that time is 20 to 80 mol%, preferably 40 to 60 mol%.
[0067]
For the copolymerization, for example, techniques such as radical polymerization, cationic polymerization, and anionic polymerization can be preferably used, and among them, radical polymerization using ammonium peroxodisulfate as a catalyst can be more preferably used.
[0068]
Examples of the vinyl monomer include acrylamides, methacrylamides, methacrylic acid, acrylic esters, methacrylic esters, styrenes, and fatty acid vinyl esters.
[0069]
Examples of acrylamides include N-alkylacrylamides such as acrylamide, N-methylacrylamide, N-ethylacrylamide, and N-isopropylacrylamide.
[0070]
Examples of methacrylamides include N-alkyl methacrylamides such as methacrylamide, N-methyl methacrylamide and N-isopropyl methacrylamide.
[0071]
Examples of the acrylate esters include methyl acrylate, ethyl acrylate, hydroxyethyl acrylate, dimethylaminoethyl acrylate, and the like.
[0072]
Examples of the methacrylic acid esters include methyl methacrylate, ethyl methacrylate, hydroxyethyl methacrylate, dimethylaminoethyl methacrylate and the like.
[0073]
Examples of styrenes include styrene and p-hydroxystyrene. Examples of the fatty acid vinyl esters include vinyl acetate and vinyl butyrate.
[0074]
The general molecular weight of the copolymer is about 10,000 to about 5,000,000, preferably 20,000 to 2,000,000, more preferably 50,000 to 1,000,000.
[0075]
The acrylamide derivative represented by the general formula (II) can be synthesized by various commonly used organic synthetic chemistry techniques. For example, a sugar oxazoline derivative represented by the general formula (III), a halogenated sugar represented by the general formula (IV) or a trichloroacetimidate derivative and p-nitrobenzyl alcohol were condensed in the presence of an appropriate catalyst. After that, the nitro group is reduced and converted to an amino group. Thereafter, the acrylamide derivative represented by the general formula (VI) obtained by condensation of the ω-amino fatty acid represented by the general formula (V) and acryloyl chloride is condensed with the above compound in the presence of a suitable condensing agent. Is obtained.
[0076]
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In the first step of the oligosaccharide production method of the present invention, a sugar residue is transferred from a sugar nucleotide to the water-soluble polymer primer by contacting the water-soluble polymer primer with a glycosyltransferase in the presence of the sugar nucleotide. .
[0081]
The sugar transfer from the sugar nucleotide to the water-soluble polymer primer is usually performed at 10 to 60 ° C., preferably 20 to 40 ° C. in a neutral buffer containing the water-soluble polymer primer and the sugar nucleotide. It is carried out by contacting with glycosyltransferase for 120 hours, preferably 2 to 72 hours.
[0082]
Moreover, you may add a metal salt in a reaction liquid as needed. Examples of metal ions that can be added include magnesium, manganese, cobalt, nickel, copper, zinc, and the like, and can be usually added in the form of chloride or the like.
[0083]
The glycosyltransferase used in the present invention is not particularly limited as long as sugar nucleotides can be used as a sugar donor. Examples of such enzymes include Leloir pathway glycosyltransferases. For example, galactose transferase, N-acetyl glucosamine transferase, N-acetyl galactosamine transferase, fucose transferase, sialyltransferase, mannose transferase, xylose transferase, glucuronyl transferase and the like can be mentioned. These enzymes may be free enzymes or immobilized enzymes, but immobilized enzymes are preferred.
[0084]
The sugar nucleotides used in the present invention are not particularly limited as long as the enzyme can be used. For example, uridine-5′-diphosphate galactose, uridine-5′-diphosphate-N-acetylglucosamine, uridine-5′-diphosphate-N-acetylgalactosamine, uridine-5′-diphosphate glucuronic acid, uridine-5 Examples include '-diphosphate xylose, guanosine-5'-diphosphate fucose, guanosine-5'-diphosphate mannose, cytidine-5'-monophosphate-N-acetylneuraminic acid, and sodium salts thereof.
[0085]
In the second step of the oligosaccharide production method of the present invention, Step 1 is repeated once or twice or more to transfer a plurality of sugar residues, thereby extending the sugar chain.
[0086]
The third step of the oligosaccharide production method of the present invention removes by-produced nucleotides and unreacted sugar nucleotides as necessary. The method for removing by-produced nucleotides and unreacted sugar nucleotides is not particularly limited as long as it is a method capable of separating a water-soluble polymer primer from nucleotides and sugar nucleotides. For example, it can be removed by gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, dialysis, ultrafiltration and the like.
[0087]
In the fourth step of the oligosaccharide production method of the present invention, Steps 1 to 3 are repeated a plurality of times, and then the oligosaccharide is released from the water-soluble polymer primer having a plurality of sugar residues transferred and sugar chains extended. . The method for releasing the extended sugar chain from the water-soluble polymer primer of the present invention is not particularly limited as long as it is a method that can release the extended sugar chain without decomposing it. And an oxidation reaction with 2,3-dichloro-5,6-dicyanobenzoquinone.
[0088]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these are merely examples, and the scope of the present invention is not limited to the examples.
[0089]
Reference Example 1 Synthesis of 2-methyl- (3,4,6-tri-O-acetyl-1,2-dideoxy-α-D-glucopyrano)-[2,1-d] -2-oxazoline
6.0 g of 2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-D-glucopyranoside was dissolved in 40 ml of 1,2-dichloroethane, and 3.2 ml of trimethylsilyltrifluoromethanesulfonic acid was added thereto. In addition, the mixture was reacted at 50 ° C. with stirring for 7 hours. After the reaction, after cooling to room temperature, 10.8 ml of triethylamine was added. After concentrating the reaction solution under reduced pressure, the desired product was separated by silica gel column chromatography (eluent: toluene: ethyl acetate: triethylamine = 100: 200: 1) to obtain 5.0 g of the desired product.
[0090]
Reference Example 2 Synthesis of p-nitrobenzyl-2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-D-glucopyranoside
2.8 g of 2-methyl- (3,4,6-tri-O-acetyl-1,2-dideoxy-α-D-glucopyrano)-[2,1-d] -2-oxazoline obtained in Reference Example 1 Was dissolved in 40 ml of dichloroethane, and 10.4 g of p-nitrobenzyl alcohol and 0.2 g of D-camphor-10-sulfonic acid were added thereto and reacted at 80 ° C. with stirring for 2 hours. After the reaction, the reaction mixture was cooled to room temperature and 4.0 ml of triethylamine was added. After concentrating the reaction solution under reduced pressure, the desired product was separated by silica gel column chromatography (eluent: chloroform: ethyl acetate: methanol = 200: 40: 5) to obtain 3.7 g of the desired product.
[0091]
Reference Example 3 Synthesis of 6-acryloylaminocaproic acid
A solution of 10.0 g of 6-aminocaproic acid in 60 ml of 1.27 M aqueous sodium hydroxide solution and 7.8 ml of acryloyl chloride dissolved in 20 ml of tetrahydrofuran was added dropwise under ice cooling. At this time, it adjusted using 4N sodium hydroxide aqueous solution so that it might become pH 8-9. After dropping, the mixture was stirred for 2 hours while gradually returning to room temperature. Next, 1N hydrochloric acid was added to the reaction solution until the pH reached 3, and then the product was extracted with ethyl acetate. The extract was washed with water and dried over anhydrous magnesium sulfate. Magnesium sulfate was filtered off, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in a small amount of ethyl acetate and recrystallized from hexane to obtain 9.6 g of the desired product.
[0092]
Reference Example 4 Synthesis of pN- (6-acryloylaminohexanoyl) amino-benzyl-2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-D-glucopyranoside
1.6 g of p-nitrobenzyl-2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-D-glucopyranoside obtained in Reference Example 2 was dissolved in 50 ml of methanol. 1 g and 170 mg of 10% palladium-carbon were added. After stirring at room temperature for 5 minutes, the catalyst was filtered off and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved with chloroform. The organic layer was washed with distilled water and dried over anhydrous sodium sulfate. After drying, sodium sulfate was filtered off, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in 44 ml of a mixed solvent of dichloroethane: N, N-dimethylformamide = 10: 1, and 0.6 g of 6-acryloylaminocaproic acid obtained in Reference Example 3 was added thereto. Further, 0.46 ml of triethylamine and 65 mg of 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride were added at 0 ° C. with stirring. The mixture was returned to room temperature with stirring and reacted for 22 hours. To the reaction solution, 60 ml of chloroform was added, washed with 1N aqueous sodium hydroxide solution, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and saturated brine in that order, and dried over anhydrous sodium sulfate. Sodium sulfate was removed by filtration, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. Then, the target product was separated by silica gel column chromatography (eluent; chloroform: ethanol = 30: 1) to obtain 1.1 g of the target product.
[0093]
Example 1 Synthesis of pN- (6-acryloylaminohexanoyl) amino-benzyl-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranoside
660 mg of pN- (6-acryloylaminohexanoyl) amino-benzyl-2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-D-glucopyranoside obtained in Reference Example 4 was added to 70 ml of methanol. After dissolution, 50 mg of sodium methoxide was added thereto, and the mixture was reacted at room temperature with stirring for 15 hours. After reaction, H+A cation exchange resin Dowex 50WX-8 (manufactured by Dow Chemical Co.) was added until the pH reached 7. The ion exchange resin was filtered off, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain 520 mg of the desired product.
[0094]
Example 2 pN- (6-acryloylaminohexanoyl) amino-benzyl-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranoside-acrylic acid-acrylamide copolymer (copolymerization ratio 1: 2: 7, primer A ) Synthesis
PN- (6-Acryloylaminohexanoyl) amino-benzyl-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranoside obtained in Example 1 was converted to 61.7 mg, acrylic acid 18.0 mg and acrylamide 62.2 mg as dimethyl sulfoxide. : Dissolved in 1 ml of a mixed solvent of distilled water = 3: 1, sufficiently deaerated with an aspirator, and then 11.6 μl of N, N, N ′, N′-tetramethylethylenediamine (hereinafter abbreviated as TEMED) 8.6 mg of ammonium sulfate was added, and the mixture was stirred and polymerized at room temperature for 24 hours. After the reaction, 2 ml of distilled water was added to the reaction solution, and the target product was separated by column chromatography (eluent: 50 mM ammonium acetate) using Sephadex G-50 (Amersham Pharmacia). The obtained target product fraction was freeze-dried to obtain 138 mg of the target product.
[0095]
Example 3 pN- (6-acryloylaminohexanoyl) amino-benzyl-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranoside-acrylic acid-acrylamide copolymer (copolymerization ratio 1: 4: 5, primer B ) Synthesis
Copolymerization was carried out in the same manner as in Example 2 except that 36.0 mg of acrylic acid and 44.4 mg of acrylamide were used to obtain 138 mg of the desired product.
[0096]
Example 4 pN- (6-acryloylaminohexanoyl) amino-benzyl-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranoside-acrylic acid-acrylamide copolymer (copolymerization ratio 1: 6: 3, primer C ) Synthesis
Copolymerization was carried out in the same manner as in Example 2 except that 54.0 mg of acrylic acid and 26.7 mg of acrylamide were used to obtain 139 mg of the desired product.
[0097]
Example 5 p-N- (6-acryloylaminohexanoyl) amino-benzyl-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranoside-acrylic acid-acrylamide copolymer (copolymerization ratio 1: 8: 1, primer D ) Synthesis
Copolymerization was carried out in the same manner as in Example 2 except that 72.1 mg of acrylic acid and 8.9 mg of acrylamide were used to obtain 139 mg of the desired product.
[0098]
Reference Example 5 Synthesis of pN- (6-acryloylaminohexanoyl) amino-benzyl-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranoside-acrylamide copolymer (copolymerization ratio 1: 9, primer E)
Copolymerization was carried out in the same manner as in Example 2 except that 80.0 mg of acrylamide was used without using acrylic acid, to obtain 138 mg of the desired product.
[0099]
Reference Example 6 pN- (6-acryloylaminohexanoyl) amino-benzyl Synthesis of 2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranoside-acrylic acid copolymer (copolymerization ratio 1: 9, primer F)
Copolymerization was carried out in the same manner as in Example 2 except that 81.1 mg of acrylic acid was used without using acrylamide to obtain 139 mg of the desired product.
[0100]
Example 6 p-N- (6-acryloylaminohexanoyl) amino-benzyl-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranoside-acrylic acid-N-isopropylacrylamide copolymer (copolymerization ratio 1: 2: 7 Synthesis of primer G)
Copolymerization was carried out in the same manner as in Example 2 except that 99.0 mg of N-isopropylacrylamide was used instead of acrylamide to obtain 174 mg of the desired product.
[0101]
Example 7 p-N- (6-acryloylaminohexanoyl) amino-benzyl-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranoside-acrylic acid-N-isopropylacrylamide copolymer (copolymerization ratio 1: 4: 5 , Synthesis of primer H)
Copolymerization was carried out in the same manner as in Example 2 except that 36.0 mg of acrylic acid and 70.7 mg of N-isopropylacrylamide were used instead of acrylamide to obtain 164 mg of the desired product.
[0102]
Example 8 p-N- (6-acryloylaminohexanoyl) amino-benzyl-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranoside-acrylic acid-N-isopropylacrylamide copolymer (copolymerization ratio 1: 6: 3 Synthesis of primer I)
Copolymerization was carried out in the same manner as in Example 2 except that 54.0 mg of acrylic acid and 42.4 mg of N-isopropylacrylamide were used instead of acrylamide to obtain 154 mg of the desired product.
[0103]
Example 9 p-N- (6-acryloylaminohexanoyl) amino-benzyl Synthesis of 2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranoside-acrylic acid-N-isopropylacrylamide copolymer (copolymerization ratio 1: 8: 1, primer J)
Copolymerization was carried out in the same manner as in Example 2 except that 72.1 mg of acrylic acid and 14.1 mg of N-isopropylacrylamide were used instead of acrylamide to obtain 144 mg of the desired product.
[0104]
Reference Example 7 p-N- (6-acryloylaminohexanoyl) amino-benzyl-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranoside-N-isopropylacrylamide copolymer (copolymerization ratio 1: 9, primer K) Composition
Copolymerization was carried out in the same manner as in Example 2 except that 127.3 mg of N-isopropylacrylamide was used without using acrylic acid to obtain 183 mg of the desired product.
[0105]
Reference Example 8 p-N- (6-acryloylaminohexanoyl) amino-benzyl-2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranoside-acrylamide-N-isopropylacrylamide copolymer (copolymerization ratio 1: 5: 4, Synthesis of primer L)
Copolymerization was carried out in the same manner as in Example 2 except that 44.4 mg of acrylamide and 56.6 mg of N-isopropylacrylamide were used without using acrylic acid, to obtain 158 mg of the desired product.
[0106]
Example 10 Galactose transfer to various primers by β1,4-galactose transferase
1. 50 mM HEPES buffer (pH 7.5) containing 1 U of β1,4-galactose transferase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), 10 mM uridine-5′-diphosphogalactose, 10 mM manganese chloride, 0.26 mg / ml α-lactalbumin 20 mg of each of the primers A to L obtained in Examples 2 to 9 and Reference Examples 5 to 8 was added to 0 ml and reacted at 37 ° C. for 24 hours. After the reaction, the reaction was stopped by heating at 100 ° C. for 3 minutes. From the supernatant obtained by centrifuging the reaction solution, the product fraction was separated by Sephadex G-25 column chromatography (eluent: distilled water) and freeze-dried to obtain 19 mg of product. Of the resulting product1The H-NMR spectrum was measured, and it was confirmed from the spectrum that all of the galactose transfer proceeded quantitatively.
[0107]
Reference Example 9 Preparation of immobilized α2,3-sialyltransferase
NHS activated Sepharose (manufactured by Amersham Pharmacia) (0.5 g) was taken and washed with 100 ml of 1 mM hydrochloric acid in three portions. To this, 5 ml of 50 mM HEPES buffer (pH 7.5) containing 1 U of porcine liver-derived α2,3-sialyltransferase and 1 mM of cytidine-5′-diphosphate was added and gently shaken at 4 ° C. overnight. The immobilized α2,3-sialyltransferase was filtered off with a glass filter, and washed with 5 ml of the above buffer solution excluding α2,3-sialyltransferase. 5 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) was added to block unreacted activating groups in the carrier, and after washing, α2,3-sialyltransferase was converted to cytidine-5′-monophospho- It was immersed in a 25 mM cacodylate buffer solution (pH 7.4) containing 1 mM N-acetylneuraminic acid (hereinafter abbreviated as CMP-NeuAc) and stored at 4 ° C. The activity of the obtained immobilized enzyme was 110 mU / ml.
[0108]
Example 11 Sialic acid transfer to various primers by immobilized α2,3-sialyltransferase
To 0.5 ml of 50 mM HEPES buffer (pH 7.0) containing 0.05 ml of immobilized α2,3-sialyltransferase obtained in Reference Example 9, 50 mM of CMP-NeuAc, 10 mM of manganese chloride, and 0.1% Triton CF-54 6.5 mg (primers A to F), 8.0 mg, 7.5 mg, 7.1 mg, 6.7 mg, 8.4 mg, and 7.3 mg of the galactosylated primers A to L obtained in Example 10, respectively ( N-acetyllactosamine residue (corresponding to 5 μmole) was added, and the reaction was carried out with shaking at 30 ° C. for 24 hours. After the reaction, the reaction solution was obtained as a supernatant by centrifuging, and then the product was separated in the same manner as in Example 10, and the products were 6.0 mg (primers A to F), 7.5 mg, 7.5 mg, 7.0 mg, 6.5 mg, 6.2 mg, 7.8 mg, and 6.8 mg were obtained. 1 mg of each product was taken, dissolved in 1 ml of a mixed solvent of distilled water: ethanol = 3: 1, 1 mg of 10% palladium-carbon was added thereto, and catalytic reduction was performed with hydrogen gas under normal pressure at room temperature for 24 hours. After the catalyst was filtered off, the filtrate was filtered through an ultrafiltration unit Ultra Free MC (fractionated molecular weight 10,000, manufactured by Millipore) to collect oligosaccharides released as a passing liquid fraction. The flow-through fraction was freeze-dried, and the resulting solid content was pyridylaminated according to a conventional method, and the absorptive ratio of sialyllactosamine and lactosamine was analyzed by HPLC to determine the sugar transfer yield.
[0109]
[Table 1]
Reference Example 10 p-nitrobenzyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D- Synthesis of galactosyl-2,3,6-tri-O-acetyl-D-glucopyranoside
Dissolve 5.0 g of 1-bromo-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-galactosyl-2,3,6-tri-O-acetyl-D-glucopyranoside in 50 ml of dichloroethane, and p -23.5 g of nitrobenzyl alcohol and 5.0 g of molecular sieves 4A were added and stirred at 0 ° C. Under a nitrogen stream, 2.9 g of silver triflate was added, and the mixture was allowed to react with stirring for 12 hours while gradually returning to room temperature. The reaction solution was diluted with chloroform and filtered on a celite pad. The filtrate was washed with saturated brine, and the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. Magnesium sulfate was removed by filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure, and then the desired product was separated by silica gel chromatography (eluent: chloroform: methanol = 50: 1) to obtain 5.6 g of the desired product.
[0111]
Reference Example 11 p-N- (6-acryloylaminohexanoyl) -benzyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-galactosyl-2,3,6-tri-O-acetyl-D- Synthesis of glucopyranoside
P-Nitrobenzyl 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-galactosyl-2,3,6-tri-O-acetyl-D-glucopyranoshi (3.0 g) obtained in Reference Example 10 was added to 50 ml of methanol. After dissolution, 1.8 g of ammonium formate and 200 mg of 10% palladium-carbon were added. After stirring at room temperature for 5 minutes, the catalyst was filtered off and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved with chloroform. The organic layer was washed with distilled water and dried over anhydrous magnesium sulfate. After drying, magnesium sulfate was filtered off, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in 40 ml of a mixed solvent of dichloroethane: N, N, -dimethylformamide = 10: 1, and 0.85 g of 6-acryloylaminocaproic acid obtained in Reference Example 3 was added thereto. Subsequently, 634 μl of triethylamine and 870 mg of 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide hydrochloride were added, and the mixture was stirred for 22 hours while returning from ice cooling to room temperature. The reaction solution was diluted with chloroform, washed successively with 1N sulfuric acid, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate, and saturated brine, and the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. Magnesium sulfate was removed by filtration, the filtrate was concentrated under reduced pressure, and then the desired product was separated by silica gel chromatography (eluent: chloroform: ethanol = 20: 1) to obtain 1.1 g of the desired product.
[0112]
Example 12 Synthesis of pN- (6-acryloylaminohexanoyl) -benzyl-D-galactosyl-D-glucopyranoside
PN- (6-acryloylaminohexanoyl) -benzyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-galactosyl-2,3,6-tri-O-acetyl obtained in Reference Example 11 -1.0 g of D-glucopyranoside was dissolved in 10 mL of methanol. Thereto was added 24 mg of sodium methoxide, and the mixture was stirred at room temperature for 15 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was neutralized with an ion exchange resin Dowex 50W-X8 (H +). The resin was filtered off, and the filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain 650 mg of the desired product.
[0113]
Example 13 Synthesis of pN- (6-acryloylaminohexanoyl) -benzyl-D-galactosyl-D-glucopyranoside-acrylic acid-acrylamide copolymer (copolymerization ratio 1: 4: 5, primer M)
Using 76.8 mg of pN- (6-acryloylaminohexanoyl) -benzyl-D-galactosyl-D-glucopyranoside obtained in Example 12, 36.0 mg of acrylic acid, and 44.4 mg of acrylamide, Copolymerization was carried out in the same manner to obtain 151 mg of the desired product.
[0114]
Example 14 Sialic Acid Transfer to Primer M by Immobilized α2,3-Sialyltransferase
Primer M obtained in Example 13 was added to 1.0 ml of 50 mM HEPES buffer solution (pH 7.0) containing 0.3 ml of immobilized α2,3-sialyltransferase obtained in Reference Example 6, CMP-NeuAc 50 mM, and manganese chloride 10 mM. 6.3 mg (corresponding to 5 μmole of lactose residue) was added and reacted at 30 ° C. with shaking for 24 hours. After the reaction, the reaction solution was obtained as a supernatant by centrifuging, and then the product was separated in the same manner as in Example 10 to obtain 5 mg of the product. Product1When the 1 H-NMR spectrum was measured and the yield of the sialic acid transfer reaction was determined from the spectrum, it was 88%.
[0115]
【The invention's effect】
By using the polymer primer for sugar chain synthesis of the present invention, various oligosaccharides can be efficiently synthesized and applied to automatic synthesis.
Claims (7)
該ビニル系共重合体中に、単糖残基あるいはオリゴ糖残基が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介して結合したアクリルアミド誘導体と、アクリル酸と、ビニル系単量体とを含み、該アクリル酸の全ビニル系共重合体中に占める割合が２０〜８０モル％であることを特徴とする糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。A water-soluble polymer primer for sugar chain synthesis in which a monosaccharide residue or an oligosaccharide residue is bonded to a side chain of a water-soluble polymer through a linker containing a cleavable bond, wherein the water-soluble polymer is vinyl. A copolymer,
The vinyl copolymer includes an acrylamide derivative bonded via a linker that includes a cleavable bond of a monosaccharide residue or an oligosaccharide residue, acrylic acid, and a vinyl monomer. , for oligosaccharide synthesis soluble polymer primer, wherein the percentage in the total vinyl copolymer of the acrylic acid is 20 to 80 mol%.
アクリルアミド類、メタクリルアミド類、メタクリル酸、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレン類、及び脂肪酸ビニルエステル類からなる群から選ばれた１種または２種以上のビニル系単量体である、
請求項１に記載の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。The vinyl monomer is
One or more vinyl monomers selected from the group consisting of acrylamides, methacrylamides, methacrylic acid, acrylic esters, methacrylic esters, styrenes, and fatty acid vinyl esters ,
The water-soluble polymer primer for sugar chain synthesis according to claim 1.
水素化分解あるいは２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノンによる酸化工程である、
請求項１又は２に記載の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。The selectively cleavable bond contained in the linker is
Hydrogenolysis or oxidation step with 2,3-dichloro-5,6-dicyanobenzoquinone ,
The water-soluble polymer primer for sugar chain synthesis according to claim 1 or 2.
一般式（Ｉ）（式中、Ｒ１は単糖あるいはオリゴ糖残基、Ｒ２はメチレン基４〜２０個分の長さを有するリンカー、ＸはＮＨを示す）で表された基である、
請求項１〜３のいずれかに記載の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。
A group represented by the general formula (I) (wherein R 1 is a monosaccharide or oligosaccharide residue, R 2 is a linker having a length of 4 to 20 methylene groups, and X is NH ) ,
The water-soluble polymer primer for sugar chain synthesis according to any one of claims 1 to 3 .
Ｎ−アセチルグルコサミン残基、グルコース残基、ラクトース残基である、
請求項４に記載の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。Wherein R1 is,
N-acetylglucosamine residue, glucose residue, lactose residue ,
The water-soluble polymer primer for sugar chain synthesis according to claim 4.
一般式（ＩＩ）（式中、ＲGeneral formula (II) (wherein R ３3 は単糖残基あるいはオリゴ糖残基、ＲIs a monosaccharide residue or oligosaccharide residue, R ４4 はメチレン基４〜２０個分の長さを有するリンカーを示す）で表されるアクリルアミド誘導体である、Is an acrylamide derivative represented by a linker having a length of 4 to 20 methylene groups),
請求項１〜３のいずれかに記載の糖鎖合成用水溶性高分子プライマー。The water-soluble polymer primer for sugar chain synthesis according to any one of claims 1 to 3.
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