JP4332618B2

JP4332618B2 - Anti-HIV agent

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Publication number: JP4332618B2
Application number: JP2002283411A
Authority: JP
Inventors: 信孝藤井; 章大高; 雅雄松岡
Original assignee: Kyoto University
Current assignee: Kyoto University
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2002-09-27
Publication date: 2009-09-16
Anticipated expiration: 2022-09-27
Also published as: JP2003176298A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規ポリペプチド及びその複合体に関し、特にその抗HIV剤、AIDSの発症予防剤又はAIDSの治療剤としての用途に関する。
【０００２】
また、本発明は、該ポリペプチド又はその複合体を有効成分として含有する医薬組成物、更には、AIDSの発症予防方法又はAIDSの治療方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
現在、AIDS（後天性免疫不全症候群）の治療法として、HIV（ヒト免疫不全ウイルス）に対する逆転写酵素阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤等を組み合わせる多剤併用療法が一般的に行われているが、多剤耐性菌の出現、副作用、高コストという問題が生じている。
【０００４】
従って、上記阻害剤とは異なるメカニズムを有する薬剤、例えば、HIVの宿主細胞への侵入を阻害する薬剤が望まれている。
【０００５】
HIVが宿主細胞へ侵入するメカニズムの１つとして、HIVのgp41タンパク質中のα−へリックス構造を有するC34（カルボキシ末端側のC領域中の、gp160におけるアミノ酸配列の628〜661位；図1参照（図1では628位のアミノ酸を1位として表してある。））の3量体が、α−へリックス構造を有するN36（アミノ末端側のN領域中の、gp160におけるアミノ酸配列の546〜581位）の3量体を包み込むようにして6量体を形成し、HIVの細胞膜と宿主細胞の細胞膜との融合が起こるというメカニズムが知られている（例えば、非特許文献1等参照、図2参照）。
【０００６】
最近、N36をターゲットにして上記６量体形成を防ぐための薬剤、例えばDP178等が開発されてきている。しかし、DP178（T-20）は臨床試験においてPhase IIIまで進んでいるが、耐性株の発生が懸念されている。
【０００７】
【非特許文献１】
レヴュー（Review）：ディー．エム．エッカート（D.M.Eckert）, ピー．エス．キム（P.S.Kim）, アニュアルレヴューオブバイオケミストリー（Annual Review of Biochemistry）, 2001年, 70, p.777-810
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、N36に強い親和性を有するポリペプチドを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
項１．下記のモジュール構造1〜3の少なくとも１種を含む、エイズウイルスのN36に結合性を有するポリペプチド。
（Y'）_m1−X_1aX_1b−A₁−X_1cX_1dX_1e−A₂−（X''）_n1 ：モジュール構造1（MS1）
（Y'）_m2−X_2a−A₁A₁−X_2bX_2c−A₂A₂−（X''）_n2 ：モジュール構造2（MS2）
（Y'）_m3−X_3a−A₁−X_3bX_3cX_3d−A₂−X' ：モジュール構造3（MS3）
｛モジュール構造中、
A₁は酸性アミノ酸を示し、
A₂は塩基性アミノ酸を示し、
X_1a〜X_3dは同一又は異なった任意のアミノ酸を示し、
X'は保護基を有していてもよい任意のアミノ酸、−OR¹又は−NR²R³ を示し、
X''は−OR⁴又は−NR⁵R⁶を示し、
（R¹〜R⁶は同一又は異なってH、アルキル基、アリール基又はアラルキル基を示す。）
Y'はH、R⁷CO−（R⁷はアルキル基、置換基を有していてもよいフェニル基又は置換基を有していてもよいベンジル基を示す。）、トルエンスルホニル基又はメタンスルホニル基を示し、
n1は、モジュール構造1がC末端の場合は1であり、C末端の場合以外は0である。
n2は、モジュール構造2がC末端の場合は1であり、C末端の場合以外は0である。
m1は、モジュール構造1がN末端の場合は1であり、N末端の場合以外は0である。
m2は、モジュール構造2がN末端の場合は1であり、N末端の場合以外は0である。
m3は、モジュール構造3がN末端の場合は1であり、N末端の場合以外は0である。
また、モジュール構造1〜3において、アミノ酸は−NH−CH（R'）−CO−（R'はアミノ酸の側鎖を示す。）を意味するものとする。｝
項２．3つの前記ポリペプチドと3つのN36が6量体を形成し得る上記項1に記載のポリペプチド。
【００１０】
項３．更に7つのアミノ酸からなる挿入配列を含む上記項1に記載のポリペプチド。
【００１１】
項４．モジュール構造1、モジュール構造2及びモジュール構造3からなる群から選ばれる少なくとも2種のモジュール構造を含み、任意に7つのアミノ酸からなる挿入配列を含む上記項1に記載のポリペプチド。
【００１２】
項５．モジュール構造1〜3と7つのアミノ酸からなる挿入配列の合計が2〜15個である上記項1に記載のポリペプチド。
【００１３】
項６．モジュール構造1〜3からなる群から選ばれる2〜15個のモジュール構造からなる上記項1に記載のポリペプチド。
【００１４】
項７．以下の式のいずれかで表される上記項1に記載のポリペプチド。
MS1−MS1−MS1−MS1−MS1、MS2−MS2−MS2−MS2−MS2、MS3−MS3−MS3−MS3−MS3、AA−MS1−MS1−MS1−MS1、MS1−AA−MS1−MS1−MS1、MS1−MS1−AA−MS1−MS1、MS1−MS1−MS1−AA−MS1、MS1−MS1−MS1−MS1−AA、AA−MS2−MS2−MS2−MS2、MS2−AA−MS2−MS2−MS2、MS2−MS2−AA−MS2−MS2、MS2−MS2−MS2−AA−MS2、MS2−MS2−MS2−MS2−AA、MS3−AA−MS3−MS3−MS3、MS3−MS3−AA−MS3−MS3、MS3−MS3−MS3−AA−MS3、MS3−MS3−MS3−MS3−AA、AA−MS3−MS3−MS3−MS3、MS1−MS2−AA−MS1−MS3、MS1−MS2−MS2−MS1−MS3、MS1−AA−MS2−MS1−MS3、MS1−MS2−MS1−AA−MS3、MS1−MS2−MS2−MS1−MS3、MS1−MS1−MS2−MS1−MS3、MS1−MS1−MS2−MS2−MS3、MS1−MS1−MS2−MS3−MS3、MS1−MS1−MS1−MS1−MS3、MS1−MS1−MS1−MS2−MS3、MS1−MS1−MS1−MS3−MS3、MS1−MS1−MS3−MS1−MS3、MS1−MS1−MS3−MS2−MS3、MS1−MS1−MS3−MS3−MS3、MS1−MS2−MS1−MS1−MS3、MS1−MS2−MS1−MS2−MS3、MS1−MS2−MS1−MS3−MS3、MS1−MS2−MS2−MS2−MS3、MS1−MS2−MS2−MS3−MS3、MS1−MS2−MS3−MS1−MS3、MS1−MS2−MS3−MS2−MS3、MS1−MS2−MS3−MS3−MS3、MS1−MS3−MS1−MS1−MS3、MS1−MS3−MS1−MS2−MS3、MS1−MS3−MS1−MS3−MS3、MS1−MS3−MS2−MS1−MS3、MS1−MS3−MS2−MS2−MS3、MS1−MS3−MS2−MS3−MS3、MS1−MS3−MS3−MS1−MS3、MS1−MS3−MS3−MS2−MS3、MS1−MS3−MS3−MS3−MS3
（MS1はモジュール構造1を示し、MS2はモジュール構造2を示す、MS3はモジュール構造3を示し、AAは7つのアミノ酸からなる挿入配列を示す。）
項８．上記項1に記載のポリペプチドに、逆転写酵素阻害剤、HIVプロテアーゼ阻害剤及びケモカインレセプター拮抗剤からなる群から選ばれる少なくとも1種が、スペーサー物質を介して又は介さずに結合していることを特徴とする複合体。
【００１５】
項９．上記項1〜7のいずれかに記載のポリペプチド及び／又は上記項8に記載の複合体、又はその薬学的に許容される塩を有効成分として、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有する抗HIV剤。
【００１６】
項１０．上記項1〜7のいずれかに記載のポリペプチド及び／又は上記項8に記載の複合体、又はその薬学的に許容される塩を有効成分として、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含有するAIDS発症予防剤又はAIDS治療剤。
【００１７】
項１１．上記項9に記載の抗HIV剤又は上記項10に記載のAIDS発症予防剤又はAIDS治療剤の有効量をAIDS患者又はHIVのキャリアに投与するAIDSの発症予防又は治療方法。
【００１８】
項１２．AIDSの多剤療法に上記項11に記載のAIDSの発症予防又は治療方法を併用するAIDSの発症予防又は治療方法。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本願発明におけるモジュール構造とは、6個又は7個のアミノ酸からなるポリペプチドであり、以下の3種類が例示される。
（Y'）_m1−X_1aX_1b−A₁−X_1cX_1dX_1e−A₂−（X''）_n1 ：モジュール構造1（MS1）
（Y'）_m2−X_2a−A₁A₁−X_2bX_2c−A₂A₂−（X''）_n2 ：モジュール構造2（MS2）
（Y'）_m3−X_3a−A₁−X_3bX_3cX_3d−A₂−X' ：モジュール構造3（MS3）
（X_1a〜X_3d、A₁、A₂、X'、X''、Y'、n及びmは前記に定義した通りである。）。
【００２１】
本発明のポリペプチド中の各モジュールにおいて、A₁は酸性アミノ酸を示し、好ましくはグルタミン酸、アスパラギン酸又はシステイン酸であり、より好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸である。A₂は塩基性アミノ酸を示し、好ましくはリジン、アルギニン、オルニチン又はヒスチジンであり、より好ましくはリジン、アルギニン又はオルニチンであり、更に好ましくはリジン又はオルニチンである。
【００２２】
A₁及びA₂は、各モジュールにおいてそれぞれi位、i+4位の関係になっている。このi位、i+4位のアミノ酸がそれぞれ酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸という組み合わせ（又はその逆の組み合わせでも良い）にすることにより、両者間にsalt bridgeが形成され、本発明ポリペプチドのα-へリックスが形成されやすくなる。また、このsalt bridgeの双極子の方向が、ペプチド主鎖によって形成される双極子の方向と逆を向くのでヘリックスを形成した場合の分子の熱力学的安定性が増大する。
【００２３】
上記酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸の組み合わせの中でも、グルタミン酸−リジンの組み合わせがより好ましい。
【００２４】
上記酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸組み合わせは、各モジュール中に1又は2個存在するのが好ましい。
【００２５】
また、本発明のポリペプチドは、モジュール内にのみに限られず、モジュール間（モジュール構造を超えた範囲）においても、上記のi位、i+4位の組み合わせを有していてもよい。本発明のポリペプチドは、モジュール間におけるこの組み合わせを有することにより、α−へリックスを更に安定化させることができる。
【００２６】
本発明のポリペプチド中におけるアミノ酸X_1a〜X_3d（X_1a、X_1b、X_1c、X_1d、X_1e、X_2a、X_2b、X_2c、X_3a、X_3b、X_3c及びX_3d）は、同一又は異なった任意のアミノ酸を示す。
【００２７】
上記任意のアミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、システイン酸、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、オルニチン、サルコシン、β−アラニン、ノルロイシン（Nle）、ナフチルアラニン（Nal）等が例示できる。
【００２８】
なお、プロリンは、使用によりα−へリックス構造を破壊する可能性がある場合には使用しないほうが良いが、アミノ末端（以下、「N末端」という。）又はカルボキシ末端（以下、「C末端」という。）に位置してα−へリックス構造を破壊する可能性がない場合には使用しても良い。
【００２９】
例えば、図2の「a」の位置のアミノ酸、即ち、X_1a、X_2a又はX_3aのアミノ酸としては、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン、セリン、スレオニン、アスパラギン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、グリシン、アラニン、ナフチルアラニン等が好ましい。
【００３０】
図2の「b」の位置のアミノ酸、即ちX_1b又は「c」の位置のアミノ酸、即ちX_3bのアミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、システイン酸、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、オルニチン、サルコシン、β−アラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン等が例示できる。
【００３１】
なお、プロリンは、使用によりα−へリックス構造を破壊する可能性がある場合には使用しないほうが良いが、N末端又はC末端に位置してα−へリックス構造を破壊する可能性がない場合には使用しても良い。
【００３２】
図2の「d」又は「e」の位置のアミノ酸、即ち、X_1c、X_2b、X_3c、X_1d、X_2c又はX_3dのアミノ酸としては、例えば、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、グリシン、アラニン等が好ましい。
【００３３】
図2の「f」の位置のアミノ酸、即ちX_1eのアミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、システイン酸、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、オルニチン、サルコシン、β−アラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン等が例示できる。
【００３４】
なお、プロリンは、使用によりα−へリックス構造を破壊する可能性がある場合には使用しないほうが良いが、N末端又はC末端に位置してα−へリックス構造を破壊する可能性がない場合には使用しても良い。
【００３５】
X'は保護基を有していてもよい任意のアミノ酸、−OR¹又は−NR²R³ を示し、X''は−OR⁴又は−NR⁵R⁶を示す。
【００３６】
アミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、システイン酸、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、オルニチン、サルコシン、β−アラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン等が例示できる。
【００３７】
なお、プロリンは、使用によりα−へリックス構造を破壊する可能性がある場合には使用しないほうが良いが、N末端又はC末端に位置してα−へリックス構造を破壊する可能性がない場合には使用しても良い。
【００３８】
本発明のポリペプチドが保護アミノ酸を有する場合、保護基としては以下のものが例示できる。エトキシカルボニル基、メトキシカルボニル基、9−フルオレニルメトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、4−メトキシベンジルオキシカルボニル基、2,2,2−トリクロロエチルオキシカルボニル基、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基等が例示できる。
【００３９】
R¹〜R⁶（R¹、R²、R³、R⁴、R⁵及びR⁶）は、同一又は異なってH、アルキル基、アリール基又はアラルキル基を示す。
【００４０】
アルキル基としては、例えば、C₁〜C₄の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル等が挙げられる。アリール基としては、例えばフェニル基、置換基を有するフェニル基が例示できる。置換基としては、上で例示したアルキル基、ハロゲン原子、シアノ、カルボン酸、ニトロ、アミノ、アセチルアミノ、アルコキシ基、水酸基等が例示できる。置換基の数は特に限定されず、1〜5、好ましくは1〜3である。
【００４１】
Y'はH、R⁷CO−、トルエンスルホニル基又はメタンスルホニル基を示す。R⁷はアルキル基、置換基を有していてもよいフェニル基又は置換基を有していてもよいベンジル基を示す。アルキル基は上述したものが使用できる。置換基の例示又は数も上で例示した通りである。
【００４２】
n1は、モジュール構造1がC末端の場合は1であり、C末端の場合以外は0である。n2は、モジュール構造2がC末端の場合は1であり、C末端の場合以外は0である。
【００４３】
m1は、モジュール構造1がN末端の場合は1であり、N末端の場合以外は0である。m2は、モジュール構造2がN末端の場合は1であり、N末端の場合以外は0である。m3は、モジュール構造3がN末端の場合は1であり、N末端の場合以外は0である。
【００４４】
また、モジュール構造1〜3において、アミノ酸は−NH−CH（R'）−CO−（R'はアミノ酸の側鎖を示す。）を意味するものとする。
【００４５】
本発明のポリペプチドは、上記モジュール構造1〜3の少なくとも1種、好ましくは、モジュール構造1〜3を少なくとも1種以上含むポリペプチドである。本発明のポリペプチドが、モジュール構造として同じモジュール構造のみからなっていても良い。
【００４６】
本発明のポリペプチドは、上記モジュール構造を例えば2〜15個、好ましくは3〜12個、更に好ましくは4〜10個含むことができ、特に5〜7が好ましい。各モジュール構造の結合順序は、本発明のポリペプチドがα−へリックス構造をとり、N36と結合する限り限定されない。
【００４７】
好ましい態様のうちの1つとして、モジュール構造1をアミノ末端（以下、「N末端」という。）に有するポリペプチドが挙げられ、その中でも、N末端に位置するモジュール構造1が「Trp-Z-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys」（「Z」は、ノルロイシン、メチオニン又はグルタミン酸を表す。）であることが特に好ましい。
【００４８】
また、もう1つの好ましい態様として、モジュール構造3がC末端に位置するポリペプチドも例示でき、その中でもX'が−NH₂のものがより好ましい。
【００４９】
本発明のポリペプチドにおいて、各モジュール間にモジュール構造を形成するアミノ酸以外のアミノ酸が存在しないことが特に好ましい。しかしながら、本発明のポリペプチドがα−へリックスを形成し、N36と結合することができる限り、各モジュール構造間に7個の任意のアミノ酸からなる7アミノ酸挿入配列が含まれていても良い。N末端又はC末端であれば、1〜6個の任意のアミノ酸を付加してもよい。
【００５０】
任意のアミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、システイン、システイン酸、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、オルニチン、サルコシン、β−アラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン等が例示できる。これらのアミノ酸は、上述した通り保護基を有していてもよい。
【００５１】
なお、プロリンは、使用によりα−へリックス構造を破壊する可能性がある場合には使用しないほうが良いが、N末端又はC末端に位置してα−へリックス構造を破壊する可能性がない場合には使用しても良い。
【００５２】
モジュール間に含まれてもよい7アミノ酸挿入配列としては、例えば「X_2a−A₂A₂−X_2bX_2c−A₁A₁」（X_2a、X_2b、X_2c、A₁及びA₂は前記で定義した通りである。）が好ましい態様として例示できる。
【００５３】
この7アミノ酸挿入配列は、例えば、モジュール構造間であれば1個、N末端又はC末端であれば1〜3個、本発明のポリペプチドに含むことができる。
【００５４】
更に、本発明のポリペプチドは、そのN末端及び／又はC末端に、N36に結合し得る化合物を有することもできる。
【００５５】
本発明のポリペプチドは、アミノ酸を、例えば13又は14〜104又は105個、好ましくは13又は14〜83又は84個、より好ましくは13又は14〜48又は49個、特に好ましくは34又は35個有することができる。
【００５６】
本発明のポリペプチドにおいて使用されるアミノ酸は、L体（Lアミノ酸）が好ましいが、D体を用いても良い。D体を用いる場合には、全ての光学活性アミノ酸をD体にする必要がある。
【００５７】
更には、本発明のポリペプチドにおけるペプチド結合（-NH-CO-⇔-N=C(OH)
-）を、それと生物学的に等価な結合、例えば、アルケン（-CH=CH-）又はフルオロアルケン（-CF=CH-）とすることも可能である。アルケンについては、例えば、S. Oishi, T. Kamano, A. Niida, Y. Odagaki, N. Hamanaka, M. Yamamoto, K. Ajito, H. Tamamura, A. Otaka, and N. Fujii. Diastereoselective Synthesis of New Ψ[(E)-CH=CMe]- and Ψ[(Z)-CH=CMe]-type Alkene Dipeptide Isosteres by Organocopper Reagents and Application to Conformationally Restricted Cyclic RGD Peptidomimetics. J. Org. Chem. 2002, 67, 6162-6173.等に記載されており、フルオロアルケンについては、例えば、A. Otaka, H. Watanabe,
A. Yukimasa, S. Oishi, H. Tamamura, and N. Fujii. New Access to a-Substituted (Z)-Fluoroalkene Dipeptide Isosteres Utilizing Organocopper Reagents under "Reduction-Oxidative Alkylation (R-OA)" Conditions. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 5443-5446.等に記載されている。
【００５８】
本発明のポリペプチドの好ましい態様として、例えば以下の式で表されるポリペプチドが例示できる（MS1はモジュール構造1を示し、MS2はモジュール構造2を示す、MS3はモジュール構造3を示し、AAは7つのアミノ酸からなる挿入配列を示す。）；
MS1−MS1−MS1−MS1−MS1、MS2−MS2−MS2−MS2−MS2、MS3−MS3−MS3−MS3−MS3、AA−MS1−MS1−MS1−MS1、MS1−AA−MS1−MS1−MS1、MS1−MS1−AA−MS1−MS1、MS1−MS1−MS1−AA−MS1、MS1−MS1−MS1−MS1−AA、AA−MS2−MS2−MS2−MS2、MS2−AA−MS2−MS2−MS2、MS2−MS2−AA−MS2−MS2、MS2−MS2−MS2−AA−MS2、MS2−MS2−MS2−MS2−AA、MS3−AA−MS3−MS3−MS3、MS3−MS3−AA−MS3−MS3、MS3−MS3−MS3−AA−MS3、MS3−MS3−MS3−MS3−AA、AA−MS3−MS3−MS3−MS3、MS1−MS2−AA−MS1−MS3、MS1−MS2−MS2−MS1−MS3、MS1−AA−MS2−MS1−MS3、MS1−MS2−MS1−AA−MS3、MS1−MS2−MS2−MS1−MS3、MS1−MS1−MS2−MS1−MS3、MS1−MS1−MS2−MS2−MS3、MS1−MS1−MS2−MS3−MS3、MS1−MS1−MS1−MS1−MS3、MS1−MS1−MS1−MS2−MS3、MS1−MS1−MS1−MS3−MS3、MS1−MS1−MS3−MS1−MS3、MS1−MS1−MS3−MS2−MS3、MS1−MS1−MS3−MS3−MS3、MS1−MS2−MS1−MS1−MS3、MS1−MS2−MS1−MS2−MS3、MS1−MS2−MS1−MS3−MS3、MS1−MS2−MS2−MS2−MS3、MS1−MS2−MS2−MS3−MS3、MS1−MS2−MS3−MS1−MS3、MS1−MS2−MS3−MS2−MS3、MS1−MS2−MS3−MS3−MS3、MS1−MS3−MS1−MS1−MS3、MS1−MS3−MS1−MS2−MS3、MS1−MS3−MS1−MS3−MS3、MS1−MS3−MS2−MS1−MS3、MS1−MS3−MS2−MS2−MS3、MS1−MS3−MS2−MS3−MS3、MS1−MS3−MS3−MS1−MS3、MS1−MS3−MS3−MS2−MS3、MS1−MS3−MS3−MS3−MS3。
【００５９】
本発明のポリペプチドの更に好ましい具体例としては、例えば、「Ac-Trp-Nle-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Lys-Lys-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Glu-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂」（SC34−a）、「Ac-Trp-Met-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Lys-Lys-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Glu-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂」（SC34−b）、「Ac-Trp-Nle-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Leu-Ile-Lys-Lys-Ser-Gln-Glu-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂」（SC34(EK)−a）、「Ac-Trp-Met-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Leu-Ile-Lys-Lys-Ser-Gln-Glu-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂」（SC34(EK)−b）、「Ac-Trp-Glu-Glu-Trp-Asp-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Leu-Ile-Lys-Lys-Ser-Glu-Glu-Gln-Gln-Lys-Lys-Asn-Glu-Glu-Glu-Leu-Lys-Lys-NH₂」（SC35(EK)）（「Ac」はアセチル基を示す。）等を例示することができる。
【００６０】
本発明のポリペプチドは、公知のポリペプチド合成法、特に液相合成法あるいは固相合成法によって製造することができる。また、本発明のポリペプチドをコードするDNAを遺伝子組換え技術により宿主細胞に導入し、発現させる方法によっても合成することができる。
【００６１】
例えば、固相合成法では、最もC末端に対応するアミノ酸のアミノ基を９-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)基などのウレタン型保護基で保護したN-保護アミノ酸のカルボキシル基を、アミノ基を有する不溶性樹脂に結合させた後、アミノ基の保護基を除去し、N末端方向に順次保護アミノ酸を縮合させ、次いで不溶性樹脂およびアミノ酸の保護基を脱保護させて、本発明のポリペプチドを得ることができる。
【００６２】
前記のアミノ基を有する不溶性樹脂としては、特に限定されないが、Fmoc-NH-SAL樹脂(4-(2',4'-ジメトキシフェニル-Fmoc-アミノエチル)フェノキシリンカー樹脂)が好ましく、開裂によって直接目的物を与えることができる。
【００６３】
本発明のポリペプチドの合成に用いる保護アミノ酸は、官能基を公知の方法により公知の保護基で保護することにより得ることができるし、市販の保護アミノ酸を使用することもできる。保護基としては公知のものが使用でき、例えば、上記に例示したを使用できる。
【００６４】
保護アミノ酸を調製する場合には、例えば、DIPCDI(ジイソプロピルカルボジイミド)-HOBt(1-ヒドロキシベンゾトリアゾール)法等のような公知の方法を用いることができる。本縮合反応は公知の溶媒中で行うことができ、例えば、ジメチルホルムアミド等の有機溶媒が例示される。アミノ基の保護基の脱離試薬としては限定されず、ピペリジン／ジメチルホルムアミド等の公知の試薬によって、Fmoc基等の保護基を切断することができる。
【００６５】
また、合成の各段階における縮合反応の進行の程度は、例えばニンヒドリン反応法のような公知の方法によって確認することができる。
【００６６】
上記のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護ポリペプチドを得ることができる。
【００６７】
不溶性樹脂としてFmoc-NH-SAL樹脂を用いた場合、TMSBr(トリメチルシリルブロミド)やTFA(トリフルオロ酢酸)等で処理することにより、樹脂及び保護基を同時に脱離させることができる。
【００６８】
このようにして得られた本発明のポリペプチドは、例えば、抽出、再結晶、各種クロマトグラフィー(ゲルろ過、イオン交換、分配、吸着)、電気泳動、向流分配等、公知の手段により単離精製することができ、逆相高速液体クロマトグラフィーによる方法が好ましい。
【００６９】
本発明のポリペプチドは、HIVが生体内の宿主細胞（例えば、T細胞等）に侵入（感染）することを防ぐことができ、または感染したHIVが宿主細胞内で増殖し更なる感染を引き起こすことを防ぐことができるので、HIVの感染予防、AIDSの発症予防、更にはAIDSの治療等にも使用することができる。
【００７０】
本発明ポリペプチドに、公知の方法で、抗HIV活性物質である逆転写酵素阻害剤、HIVプロテアーゼ阻害剤及びケモカインレセプター拮抗剤からなる群から選ばれる少なくとも1種を化学的に結合することが可能である。
【００７１】
逆転写酵素阻害剤は、HIVの逆転写酵素の活性を阻害する物質であって、ヌクレオシド系の阻害剤及び非ヌクレオシド系の阻害剤に分けられる。
【００７２】
ヌクレオシド系の阻害剤は、HIVがRNAから逆転写によってDNAを合成する際にRNA中に取り込まれ、その結果DNAの合成を阻害するために非天然型ヌクレオシド又はヌクレオシドアナログであることが好ましい。
【００７３】
上記ヌクレオシドアナログとは、ヌクレオシドと類似の立体構造をもつ非ヌクレオシド化合物を指す。また、これらの逆転写酵素阻害剤は、市販のものあるいは既知の合成法に従って調製したものを使用することが可能である。
【００７４】
ヌクレオシド系の逆転写酵素阻害剤としては、ピリミジン塩基、プリン塩基、イミダゾール塩基又はトリアゾール塩基のいずれかの塩基と、少なくとも一つの水酸基を有するフラノース又はそのアシクロ体とから構成されるヌクレオシド又はその類縁体が好ましい。
【００７５】
例えば、AZT（CAS REGISTRY NUMBERS: 30516-87-1：ジドブジン(zidovudine)）、ddI（CAS REGISTRY NUMBERS: 69655-05-6：ジダノシン(didanosine)）、ddC（CAS REGISTRY NUMBERS: 7481-89-2：ザルシタビン(zalcitabine)）、2',3'-ジデヒドロ-2',3'-ジデオキシチミジン（CAS REGISTRY NUMBERS: 3056-17-5：d4T：スタブジン(stavudine)）、3'-チア-2',3'-ジデオキシシチジン（CAS REGISTRY NUMBERS: 134678-17-4：3TC：ラミブジン(lamivudine)）、2'-β-フルオロ-ddC、3'-フルオロチミジン（CAS REGISTRY NUMBERS: 25526-93-6：FLT）、9-(2-ホスホニル-メトキシエチル)-アデニン（CAS REGISTRY NUMBERS: 106941-25-7：PMEA）、6-Cl-ddI、6-Cl-ddC等が挙げられる。
【００７６】
また、非ヌクレオシド系の逆転写酵素阻害剤としては、例えば、テトラヒドロ−イミダゾ−ベンゾ−ジアゼピン−オンもしくは−チオン（TIBO）誘導体（具体的には、(+)-S-4,5,6,7-テトラヒドロ-5-メチル-6-(3-メチル-2-ブテニル)イミダゾ[4,5,1-jk][1,4]ベンゾジアゼピン-2(1H)-チオン）(CAS REGISTRY NUMBERS: 167206-29-3：R82913)、ヒドロキシエトキシ−メチルフェニルチオチミン(HEPT)誘導体、ネビラピン(Nevirapine)(CAS REGISTRY NUMBERS: 129618-40-2)、ピリジノン誘導体等が挙げられる。
【００７７】
これらのうち、本発明のポリペプチドとの結合が容易であり、細胞内に取り込まれることによって効果的にDNA合成を阻害できるので、ヌクレオシド系の逆転写酵素阻害剤が好ましい。ヌクレオシド系のHIV転写酵素阻害剤の中でも、既に臨床においてヒトに投与されているAZT、ddI、ddC、d4T、3TC等が好ましい。
【００７８】
HIVプロテアーゼ阻害剤としては、HIVのプロテアーゼの活性を阻害する物質であって、該プロテアーゼの基質遷移状態ミミック化合物である阻害剤が好ましい。
【００７９】
基質遷移状態ミミックとは、酵素の基質結合部位に結合可能な物質で、酵素基質複合体における基質と類似の立体構造を有する物質を指す。
【００８０】
例えば、Nelfinavir, Ro 31-8959（CAS REGISTRY NUMBERS: 127779-20-8：サキナビル(saquinavir)）、A-77003（CAS REGISTRY NUMBERS: 134878-17-4）、A-80987（CAS REGISTRY NUMBERS: 144141-97-9）、KNI-93（CAS REGISTRY NUMBERS: 138258-64-7）、KNI-102（CAS REGISTRY NUMBERS: 139694-65-8）、KNI-174、KNI-227（CAS REGISTRY NUMBERS: 147384-69-8）、KNI-272（CAS REGISTRY NUMBERS: 147318-81-8）、L-735527（CAS REGISTRY NUMBERS: 150378-17-9 ：インジナビル(indinavir)）、SC-52151（CAS REGISTRY NUMBERS: 143224-34-4 ：テリナビル(Telinavir)）、VX-478、ABT-538（CAS REGISTRY NUMBERS: 155213-67-5：リトナビル(ritonavir)）、DMP-323（CAS REGISTRY NUMBERS: 151867-81-1）、U-96988（CAS REGISTRY NUMBERS: 149394-65-0）等が挙げられる。
【００８１】
その中でも高い抗ウイルス活性を有するRo 31-8959、L-735527、KNI-272等が好ましい。
【００８２】
これらHIVプロテアーゼ阻害剤としては、市販のもの又は公知の合成法に従って調製したものを使用することができる。Ro 31-8959については、例えば、J.Med.Chem.36,p2300-2310（1993）に記載の調製法が挙げられる。
【００８３】
ケモカインレセプター拮抗剤としては、TAK-779 (Takeda), SCH-351125 (Schering-Plough), E913 (Ono), AMD3100, KRH-1120 (Kureha), AMD8664, T-140（京大、藤井）等が挙げられる。これらの化合物は、HIVが感染する際に必要とされる第２受容体（ケモカインレセプター）をブロックすることによりHIVの宿主細胞への侵入を阻害する働きを有する。
【００８４】
本発明の複合体では、本発明のポリペプチドと上記抗HIV活性物質とが化学的に結合しているが、その結合様式は特に限定されず、例えば、エステル結合、アミド結合、エーテル結合、ジスルフィド結合等が挙げられる。
【００８５】
例えば、エステル結合の場合、本発明のポリペプチドに結合した抗HIV活性物質が生体内の標的細胞内に運搬された後、エステラーゼ等で該結合が切断され、抗HIV活性物質がその作用点近傍で遊離され得る。エステル結合は、運搬中に容易に切断されることがない程度の安定性を有する結合であるので好ましいが、これに限定されない。
【００８６】
本発明の複合体において、上記の抗HIV活性物質と結合する本発明のポリペプチドの部位は特に限定されないが、本発明のポリペプチド自体とHIV表面タンパク質gp41のN36との親和性を維持することができるように、N末端付近が好ましい。
【００８７】
具体的には、N末端のアミノ基のα-アミノ基又はω-アミノ基、或いはTamが抗体作成のために開発したMAPシステム（multiple antigenic peptide system) (J.P.Tam、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、85, 5409-5413 (1988); J.P.Tam、"Peptides:synthesis、structures,and applications" (B.Gutte、ed.)、pp.456-500、Academic Press,Inc.、New York (1995)）の放射状に分枝したリジンを用いた樹枝状の構造(dendrimer)を、上記Tamの方法によって上記ポリペプチド鎖のN末端部に作成し、その末端及び側鎖に存在する複数のアミノ基に複数の抗HIV活性物質を結合させ、本発明のポリペプチド鎖一分子あたり複数の抗HIV活性物質を結合させることも可能である。
【００８８】
当該樹枝状構造の形成に使用する物質は、アミノ基を2個以上含有する物質が挙げられ、その中でも、リジン、オルニチン等が好ましい。
【００８９】
本発明のポリペプチドのアミノ基に結合する抗HIV活性物質の結合部位は、結合する該活性物質の種類により適宜選択されるべきであるが、当該物質中にカルボキシル基または水酸基が存在する場合はこれらの官能基を介して形成される化学的結合が好ましく、特に水酸基を介した化学的結合が好ましい。
【００９０】
また、当該官能基の位置が、抗HIV活性の中心的役割を有する部位であったとしても、標的細胞付近又は細胞中で化学的結合が切断される為、結合する部位となる当該官能基の分子中での位置は特に限定はされない。
【００９１】
例えば、抗HIV活性物質のカルボキシル基を介して、抗HIV活性物質を本発明のポリペプチド鎖に結合させることにより本発明の複合体を得る場合は、公知の方法により前記保護ポリペプチド樹脂のN末端部アミノ基と抗HIV活性物質のカルボキシル基の間でアミド結合を形成させ、直接的に結合させることができる。また、本発明のポリペプチドと上記抗HIV活性物質とを、適切なスペーサー物質を介して生体内で切断が可能な化学的結合により結合することもできる。
【００９２】
また、抗HIV活性物質の水酸基を介して抗HIV活性物質をポリペプチド鎖に結合させて本発明の複合体を得る場合には、保護ポリペプチド樹脂のN末端部の官能基と抗HIV活性物質の水酸基の両方に対して化学的に結合可能な官能基を有するスペーサー物質を介して結合させることができる。
【００９３】
このようなスペーサー物質としては、使用するポリペプチド鎖のN末端部のアミノ基と結合が可能な一方のカルボキシル基を有し、さらに上記抗HIV活性物質中の水酸基ともエステル結合を形成することができる上記とは異なるカルボキシル基を有することが好ましく、具体的にはカルボキシル基を2個以上有する芳香族化合物又は脂肪族化合物等が挙げられるが、鎖状構造を形成していることから脂肪族化合物が好ましい。
【００９４】
スペーサー物質としてジカルボン酸を用いた場合、一方のカルボキシル基と本発明のポリペプチドのN末端部のアミノ基とでアミド結合を形成し、スペーサー物質の他方のカルボキシル基と前記抗HIV活性物質中の水酸基とでエステル結合を形成することにより、本発明のポリペプチドと前記抗HIV活性物質とを結合することができる。
【００９５】
スペーサー物質としては、特に限定されるものではないが、合成の簡便性、生体内での酵素による切断の容易性、本発明の複合体の標的部位との結合の容易性などを考慮すると、炭素数4〜12の脂肪族ジカルボン酸が好ましく、炭素数4〜8の脂肪族ジカルボン酸がより好ましい。
【００９６】
その中でも安定性や取り扱いの簡便性から、コハク酸、グルタル酸又はそれらの誘導体が特に好ましい。なお、該ジカルボン酸は、本発明のポリペプチドと抗HIV活性物質との結合を妨げない限り、他の官能基を有していても良い。
【００９７】
前記保護ポリペプチド樹脂とAZTとを、ジカルボン酸をスペーサー物質として結合する方法としては、特に限定はされないが、以下の方法が例示される。
【００９８】
まず、AZTと多官能スペーサーとを結合させることができる。例えば、ジメチルアミノピリジン存在下でAZTを無水コハク酸又は無水グルタル酸と反応させ、常法処理後、AZTにコハク酸又はグルタル酸がエステル結合したAZTとスペーサー物質の結合体（以下、「AZT−スペーサー物質」という。）を得る。
【００９９】
次いで、このAZT−スペーサー物質を、前記保護ポリペプチド樹脂のN末端部のアミノ酸のα−アミノ基、ω−アミノ基、又は該アミノ酸にデンドリマー状に結合した樹枝状構造の末端及び側鎖に存在する複数のアミノ基に、例えば、DIPCI-HOBt法等のような公知の方法で縮合させることにより結合することができる（この物質を「保護基保護化ポリペプチド樹脂−スペーサー物質−AZT複合体」とも記載する）。
【０１００】
このようにして得られた保護基保護化ポリペプチド樹脂−スペーサー物質−AZT複合体は、公知の方法により、不溶性樹脂及び保護基の離脱反応に付すことにより、本発明の複合体とすることができる。
【０１０１】
上記の保護基保護化ポリペプチド樹脂−スペーサー物質−AZT複合体を合成する方法において、AZTに代えて他の公知の抗HIV活性物質を使用することもできる。
【０１０２】
このようにして得られた本発明の複合体は、公知の方法により単離精製することができるが、逆相高速液体クロマトグラフィーにより行うのが好ましい。
【０１０３】
本発明の複合体によれば、本発明のポリペプチドによる効果だけでなく、抗HIV活性物質による効果も得ることができる。更に、本発明のポリペプチドがN36に結合することにより、その近傍に存在するHIVのすぐ近くで抗HIV活性物質を遊離することができるので、HIVの感染を防ぐだけでなく、高い効率の抗HIV活性も得ることができる。
【０１０４】
本発明の複合体はまた、HIVの感染予防、抗HIV、AIDSの発症予防、更にはAIDSの治療等にも使用することができる。
【０１０５】
本発明のポリペプチド及び／又は複合体には、その医薬的に許容される塩も包含される。かかる塩には、当業界で周知の方法により調製される、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウムなどの無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等が包含される。更に上記塩には、本発明ポリペプチドと適当な有機酸乃至無機酸との反応による無毒性酸付加塩も包含される。代表的酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、ラウリン酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、ベンゼンスルホン酸塩及びメタンスルホン酸塩などを例示できる。
【０１０６】
本発明治療剤には、より詳しくは、上記ポリペプチド及び／又は複合体の薬理学的有効量を活性成分とし、これを適当な医薬担体乃至希釈剤と共に含む医薬組成物乃至医薬製剤が含まれる。
【０１０７】
上記医薬組成物（医薬製剤）に利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。該製剤形態としては各種のものが治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤など）、噴霧剤、エアゾール剤、吸入剤、徐放性ミクロカプセル剤などを例示できる。
【０１０８】
特に好ましい本発明医薬製剤は、通常の蛋白製剤などに使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、リン脂質などを適宜使用して調製される。
【０１０９】
上記安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体などを例示でき、これらは単独で又は界面活性剤などと組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。
【０１１０】
上記Ｌ−アミノ酸としては、特に限定はなく例えばグリシン、システィン、グルタミン酸などのいずれでもよい。
【０１１１】
上記糖としても特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類など及びそれらの誘導体などを使用できる。
【０１１２】
界面活性剤としても特に限定はなく、イオン性及び非イオン性界面活性剤のいずれも使用でき、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などを使用できる。
【０１１３】
セルロース誘導体としても特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを使用できる。
【０１１４】
上記糖類の添加量は、有効成分1μg当り約0.0001mg程度以上、好ましくは約0.01〜10mg程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤の添加量は、有効成分1μｇ当り約0.00001mg程度以上、好ましくは約0.0001〜0.01mg程度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの添加量は、有効成分1μg当り約0.0001mg程度以上、好ましくは約0.001〜0.1mg程度の範囲とするのが適当である。アミノ酸は、有効成分1μg当り約0.001〜10mg程度とするのが適当である。また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分1μg当り約0.00001mg程度以上、好ましくは約0.001〜0.1mg程度の範囲とするのが適当である。
【０１１５】
本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約0.00001〜70重量%、好ましくは0.0001〜5重量%程度の範囲とするのが適当である。
【０１１６】
また本発明医薬製剤中には、各種添加剤、例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤などをも添加することができる。ここで緩衝剤としては、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸及び／又はそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）などを例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示できる。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸などを例示できる。
【０１１７】
本発明医薬製剤は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。
【０１１８】
また、本発明医薬製剤は、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態や、溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態に調製されてもよい。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製することができる。
【０１１９】
例えば、錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなどの賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの崩壊剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤などを使用できる。
【０１２０】
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠或は二重錠乃至多層錠とすることができる。
【０１２１】
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤、ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用できる。
【０１２２】
カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調整される。
【０１２３】
経口投与用液体投与形態は、慣用される不活性希釈剤、例えば水、を含む医薬的に許容される溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシルなどを包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤などの助剤を含ませることができ、これらは常法に従い調製される。
【０１２４】
非経口投与用の液体投与投与形態、例えば滅菌水性乃至非水性溶液、エマルジョン、懸濁液などへの調製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びオリーブ油などの植物油などを使用でき、また注入可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルなどを配合できる。これらには更に通常の溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、分散剤などを添加することもできる。滅菌は、例えばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理及び加熱処理などにより実施できる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製することもできる。
【０１２５】
坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン及び半合成グリセライドなどを使用できる。
【０１２６】
噴霧剤、エアゾール剤、吸入剤、経鼻又は舌下投与用組成物は、周知の標準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。
【０１２７】
尚、本発明医薬製剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品などを含有させることもできる。
【０１２８】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独で又はブドウ糖やアミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与される。
【０１２９】
上記医薬製剤の投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択されるが、一般的には、通常成人に対して有効成分量が、1日体重1kg当り、約0.01μg〜10mg程度、好ましくは約0.1μg〜1mg程度とするのがよく、該製剤は1日に1回又は数回に分けて投与することができる。
【０１３０】
また、本発明の治療方法において、本発明のポリペプチド及び／又は複合体、又はその薬学的に許容される塩は、例えば、現在臨床の現場で行われている多剤療法（HAART：Highly Active Anti-retroviral Therapy）等の公知の療法と併用することも可能である。
【０１３１】
【実施例】
実施例１本発明のポリペプチドSC34−aの製造
Ac-Trp-Nle-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Lys-Lys-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Glu-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂ (1) SC34保護ポリペプチド樹脂の合成
Fmoc-NH-SAL樹脂(0.51 mmol/g) 392 mg (0.2 mmol)のFmoc基を20% ピペリジン／DMF(ジメチルホルムアミド)で除去後、H₂N-SAL樹脂に対し、34位に相当するFmoc-Lys(Boc)-OH (2.5 eq)を加え、DMF中、DIPCDI-HOBt法により縮合反応を行った。縮合反応の進行の程度はニンヒドリン試験法により調べた。
【０１３２】
以下同様にして、順次、Nα-Fmoc化された以下のアミノ酸誘導体、Leu, Glu(Ot-Bu), Lys(Boc), Gln(Trt), Asn(Trt), Lys(Boc), Glu(Ot-Bu), Gln(Trt), Gln(Trt), Glu(Ot-Bu), Gln(Trt), Ser(t-Bu), Glu(Ot-Bu), Glu(Ot-Bu), Ile, Leu, Lys(Boc), Lys(Boc), Ile, Lys(Boc), Lys(Boc), Thr(t-Bu), Tyr(t-Bu), Glu(Ot-Bu), Glu(Ot-Bu), Ile, Lys(Boc), Arg(Pbf), Asp(Ot-Bu), Trp, Glu(Ot-Bu), Nle, Trpを縮合した。アミノ酸の縮合が完了した樹脂を20% ピペリジン／DMFで処理し、Fmoc基の切断を行った。次いで、本保護樹脂を無水酢酸／ピリジンで処理することによりN末端アミノ基をアセチル化し、SC34保護ペプチド樹脂を得た。
【０１３３】
(2) 脱保護、樹脂からのポリペプチドの分離および精製
保護ペプチド樹脂100 mg当たり、TFA (4.0 mL)-チオアニソール(0.5 mL)-m-クレゾール(0.5 mL)-エタンジチオール(0.5 mL)-H₂O(0.5 mL)で25°C, 3時間反応させた。反応混合物から樹脂を濾別し、樹脂をTFA 1 mLで２回洗浄し、濾液、洗液を合わせたものに氷冷乾燥エーテル100 mLを加え、生じた沈殿物を遠心分離し、残査をデカンテーションにより上澄みから分離した。得られた残査を冷エーテルで洗浄し、H₂O−アセトニトリル(CH₃CN) 1 : 1, 10 mLに溶解した。この溶液を、HPLC(コスモシール 5C18 ARIIカラム：アセトニトリル傾斜溶出)により精製し、単一ピークのポリペプチドを得た。純度はHPLCにより確認した。
[α]_D (c 0.38: 0.1 N AcOH): −50.0
イオンスプレーマススペクトル(IS-MS): (C₁₉₈H₃₁₈N₅₂O₆₂)
計算値：4419.1 実測値：4419.5
(トリプルステージ四重極型質量分析装置APIII (Perkin-Elmer ScieX))
実施例 2 本発明のポリペプチドSC34(EK)−aの製造
Ac-Trp-Nle-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Leu-Ile-Lys-Lys-Ser-Gln-Glu-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂一部のアミノ酸の配列を換えた以外は、上記（本発明のポリペプチドSC34）と同様にして、本発明のポリペプチドSC34(EK)を得た。
[α]_D (c 0.4: 0.1 N AcOH): −52.4
イオンスプレーマススペクトル(IS-MS): (C₁₉₈H₃₁₈N₅₂O₆₂)
計算値：4419.1 実測値：4419.5
(トリプルステージ四重極型質量分析装置APIII (Perkin-Elmer ScieX))。
【０１３４】
実施例1と同様にして、以下に示す本発明のポリペプチドを合成した；
SC34−b：Ac-Trp-Met-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Lys-Lys-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Glu-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂（IS-MS；C₁₉₇H₃₁₆N₅₂O₆₂S)、計算値：4437.1、実測値：4437.5） SC34(EK)−b：Ac-Trp-Met-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Leu-Ile-Lys-Lys-Ser-Gln-Glu-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂（IS-MS；C₁₉₇H₃₁₆N₅₂O₆₂S、計算値：4437.1、実測値：4437.5） SC35(EK)：Ac-Trp-Glu-Glu-Trp-Asp-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Leu-Ile-Lys-Lys-Ser-Glu-Glu-Gln-Gln-Lys-Lys-Asn-Glu-Glu-Glu-Leu-Lys-Lys-NH₂（IS-MS；C₂₀₃H₃₂₅N₅₁O₆₆、計算値：4536.2、実測値：4537.7）。
【０１３５】
実施例 3 本発明のAZT-SC34複合体の製造
AZT-CO-(CH₂)₃-CO-NH-(CH₂)₅-CO-Trp-Nle-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Lys-Lys-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Glu-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂
SC34の合成中間体であるN末端TrpのN^a-保護基が除去され、遊離のN末端アミノ基を有する保護ペプチド樹脂に対して、まずスペーサー物質としてFmoc-NH-(CH₂)₅-COOHをDIPCDI-HOBt法により縮合後、Fmoc基の切断を行い、次いでAZT-CO-(CH₂)₃-COOHをDIPCDI-HOBt法により縮合した。
【０１３６】
本AZT-保護ペプチド樹脂を100 mg当たり、TFA (4.0 mL)-チオアニソール(0.5 mL)-m-クレゾール(0.5 mL)-エタンジチオール(0.5 mL)-H₂O(0.5 mL)で25°C, 3時間反応させた。
【０１３７】
反応混合物から樹脂を濾別し、樹脂をTFA 1 mLで２回洗浄し、濾液、洗液を合わせたものに氷冷乾燥エーテル100 mLを加え、生じた沈殿物を遠心分離し、残査をデカンテーションにより上澄みから分離した。
【０１３８】
得られた残査を冷エーテルで洗浄し、H₂O-アセトニトリル(CH₃CN) 1 : 1, 10 mLに溶解した。この溶液を、HPLC(コスモシール 5C18 ARIIカラム：アセトニトリル傾斜溶出)により精製し、単一ピークのポリペプチドを得た。純度はHPLCにより確認した。
[α]D (c 0.4: 0.1 N AcOH): 41.7
イオンスプレーマススペクトル(IS-MS): (C₂₁₇H₃₄₄N₅₈O₆₈)
計算値：4853.51 実測値：4854.00
(トリプルステージ四重極型質量分析装置APIII (Perkin-Elmer ScieX))。
【０１３９】
試験例１本発明のポリペプチド又は複合体の抗HIV活性の評価
活性評価はgalactosidase indicator assay (MAGI assay)^1,2,3により行った。標的細胞(HeLa CD4-LTR/b-gal: 10⁴/well)を96-well培養プレートで１日培養した後、培地を除去後、HIV-1 clones (70 MAGI unit/well, which gave 70 blue cells after 48 h incubation)を加え、種々の濃度の本発明ポリペプチドが存在する培地で細胞培養を行う。48時間後、青色細胞（HIV-1が感染すると青色に発色する）の数を測定する。コントロールとしてDP178（T-20）を用いた。
【０１４０】
結果を表1に示す。
【０１４１】
1．Kimpton J, Emerman M. 1992. Detection of replication-competent and pseudotyped human immunodeficiency virus with a sensitive cell line on the basis of activation of an integrated beta-galactosidase gene. J Virol. 66:2232-9.
2．Kodama E, Kohgo S, Kitano K, Machida H, Gatanaga H, Shigeta S, Matsuoka M, Ohrui H, Mitsuya H. 2001. 4'-Ethynyl nucleoside analogs: Potent inhibitors active against multi-drug-resistant HIV variants in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. .
3．Maeda Y, Venzon D, Mitsuya H. 1998. Evolution and fitness of HIV-1 with the pol gene mutations conferring multi-dideoxynucleoside resistance. J. Infect. Dis. 177:1207-1213.。
【０１４２】
試験例 2 本発明のポリペプチドとN36との6量体の融点の測定
試験例1で用いた本発明のポリペプチドとN36を、PBS（pH7.0）中で等モル量混合し、37℃で1時間撹拌した後、その複合体（40μM）の融点（６量体の熱安定性を示し、50％の分子が6量体を形成していない温度と定義）をCDスペクトルにて測定した。結果は表1に併せて示す。
【０１４３】
【表１】

【０１４４】
表1から、本発明のポリペプチドは非常に高い抗HIV活性を有しており、また、N36との強固な結合を形成することがわかる。
【０１４５】
試験例３抗HIV剤に対する耐性を有するエイズウイルスを用いた本発明のポリペプチドの効果
試験例1と同様に、DP178に対して耐性を示すウイルスを用いて、本発明のポリペプチドの効果を確かめた。結果を表2に示す。
【０１４６】
【表２】

【０１４７】
表2から、本発明のポリペプチドは、現在治験のPhase IIIの段階に進んでいる抗HIV剤DP178より非常に強い抗HIV活性を示し、更に、DP178に耐性を示すウイルスに対しても、非常に高い抗HIV活性（耐性株よりも強い抗HIV活性）を示すことが分かった。
【０１４８】
試験例４ N36ポリペプチドとの親和性の評価
本発明ポリペプチドSC34及び公知のC34と公知のN36の等量混合物の各温度におけるCDスペクトルを測定し、222 nmにおける吸収の温度変化を追跡することによりSC34-N36複合体とC34-N36複合体の熱安定性について検討した。
【０１４９】
分子の50%が非会合状態になる温度はC34-N36が52°Cであったのに対し、SC34-N36は67°Cとなり、SC34がN36とより強固な複合体を形成していることを確認した。
【０１５０】
また、SC34-N36複合体を超遠心にかけ、実際に存在する分子量測定を行ったところ、６量体(3分子のSC34、3分子のN36)として存在することが確認された。結果を図3に示す。
【０１５１】
試験例５水溶性試験
C34およびSC34の逆相HPLCにおける溶出時間より、水溶性増大を確認した。分析条件としてはカラムとしてコスモシール5C18 AR-II (4.6 x 150 mm)を用い、0.1% TFA水溶液中、アセトニトリル濃度を30分で30%から50%まで増大させるグラジエント溶出法を採用した。
【０１５２】
その結果、C34は28分、SC34は21分で溶出されることから、SC34は公知のC34と比較して大幅に水溶性が向上していることが確認された。
【０１５３】
試験例６本発明とN36との6量体形成の確認
本発明のポリペプチド及びN36を等モル量ずつPBS（pH7.0）に中で混合し、37℃で1時間撹拌した。形成された複合体の濃度が40μMになるように調製し、BECKMAN XL-Iを用いて24000rpmで、20℃における見かけの分子量の測定を行った。試料溶液の部分比容v＝0.73cm³/g、試料溶液密度ρ＝1.00g/cm³とした。
【０１５４】
結果を図4に示す。この結果から、3つの本発明のポリペプチドと3つのN36が6量体を形成していることが確認できた。
【０１５５】
【発明の効果】
本願発明のポリペプチドは、N36への高い親和性を有しており、高い抗HIV活性を示す。更に、水溶性も高いので、医薬品として使用しやすいだけでなく、HIV及びHIV感染細胞への薬物輸送のためのベクター分子としても使用しやすくなる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 HIVウイルスのC34を示す模式図である。
【図２】 HIVが宿主細胞に感染するメカニズムの1つを示す図である。
【図３】本発明ポリペプチドSC34及びC34とN36との結合力を示す図である。
【図４】本発明ポリペプチド（SC34）とN36とが6量体を形成していることを示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel polypeptide and a complex thereof, and more particularly to its use as an anti-HIV agent, AIDS onset preventive agent or AIDS therapeutic agent.
[0002]
The present invention also relates to a pharmaceutical composition containing the polypeptide or a complex thereof as an active ingredient, and further to a method for preventing the onset of AIDS or a method for treating AIDS.
[0003]
[Prior art]
Currently, as a treatment method for AIDS (acquired immunodeficiency syndrome), multi-drug combination therapy combining reverse transcriptase inhibitor and protease inhibitor for HIV (human immunodeficiency virus) is generally performed. The problem of appearance of drug-resistant bacteria, side effects, and high cost has arisen.
[0004]
Therefore, an agent having a mechanism different from that of the inhibitor, for example, an agent that inhibits HIV entry into a host cell is desired.
[0005]
As one of the mechanisms by which HIV enters the host cell, C34 having an α-helical structure in HIV gp41 protein (positions 628 to 661 of the amino acid sequence of gp160 in the C region on the carboxy terminal side; see FIG. 1) (The amino acid at position 628 is represented as position 1 in FIG. 1) is a trimer of N36 having an α-helical structure (546 to 581 of the amino acid sequence of gp160 in the N region on the amino terminal side) A mechanism is known in which a hexamer is formed so as to envelop the trimer of the lysine and fusion of the cell membrane of HIV and the cell membrane of the host cell occurs (see, for example, Non-Patent Document 1 etc., FIG. 2). reference).
[0006]
Recently, drugs for preventing hexamer formation, such as DP178, have been developed targeting N36. However, DP178 (T-20) has progressed to Phase III in clinical trials, but there are concerns about the development of resistant strains.
[0007]
[Non-Patent Document 1]
Review: Dee. M. Eckert (D.M.Eckert), P. S. Kim, P.S.Kim, Annual Review of Biochemistry, 2001, 70, p.777-810
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a polypeptide having a strong affinity for N36.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
Item 1. A polypeptide having binding ability to N36 of AIDS virus, comprising at least one of the following module structures 1 to 3.
(Y ')_m1−X_1aX_1b−A₁−X_1cX_1dX_1e−A₂-(X '')_n1  : Module structure 1 (MS1)
(Y ')_m2−X_2a−A₁A₁−X_2bX_2c−A₂A₂-(X '')_n2    : Module structure 2 (MS2)
(Y ')_m3−X_3a−A₁−X_3bX_3cX_3d−A₂-X ': Module structure 3 (MS3)
{In the module structure,
A₁Indicates an acidic amino acid,
A₂Indicates a basic amino acid,
X_1a~ X_3dRepresents any amino acid that is the same or different,
X ′ is any amino acid optionally having a protecting group, —OR¹Or -NR²R^Three Indicate
X '' is -OR^FourOr -NR^FiveR⁶Indicate
(R¹~ R⁶Are the same or different and each represents H, an alkyl group, an aryl group or an aralkyl group. )
Y 'is H, R⁷CO- (R⁷Represents an alkyl group, an optionally substituted phenyl group, or an optionally substituted benzyl group. ), A toluenesulfonyl group or a methanesulfonyl group,
n1 is 1 when the module structure 1 is C-terminal, and is 0 when the module structure 1 is not C-terminal.
n2 is 1 when the module structure 2 is C-terminal, and is 0 when the module structure 2 is not C-terminal.
m1 is 1 when the module structure 1 is N-terminal, and is 0 except when the module structure 1 is N-terminal.
m2 is 1 when the module structure 2 is N-terminal, and is 0 except when the module structure 2 is N-terminal.
m3 is 1 when the module structure 3 is N-terminal, and is 0 except when the module structure 3 is N-terminal.
In the module structures 1 to 3, the amino acid means -NH-CH (R ')-CO- (R' represents a side chain of the amino acid). }
Item 2. The polypeptide according to Item 1, wherein three of the polypeptides and three N36s can form a hexamer.
[0010]
Item 3. Item 4. The polypeptide according to Item 1, further comprising an insertion sequence consisting of seven amino acids.
[0011]
Item 4. Item 2. The polypeptide according to Item 1, comprising at least two types of module structures selected from the group consisting of module structure 1, module structure 2 and module structure 3, and optionally including an insertion sequence consisting of 7 amino acids.
[0012]
Item 5. Item 2. The polypeptide according to Item 1, wherein the total number of insertion sequences consisting of module structures 1 to 3 and 7 amino acids is 2 to 15.
[0013]
Item 6. Item 2. The polypeptide according to Item 1, comprising 2 to 15 module structures selected from the group consisting of module structures 1 to 3.
[0014]
Item 7. Item 2. The polypeptide according to Item 1, represented by any one of the following formulae.
MS1-MS1-MS1-MS1-MS1, MS2-MS2-MS2-MS2-MS2, MS3-MS3-MS3-MS3-MS3, AA-MS1-MS1-MS1-MS1, MS1-AA-MS1-MS1-MS1, MS1-MS1-AA-MS1-MS1, MS1-MS1-MS1-AA-MS1, MS1-MS1-MS1-MS1-AA, AA-MS2-MS2-MS2-MS2, MS2-AA-MS2-MS2-MS2, MS2-MS2-AA-MS2-MS2, MS2-MS2-MS2-AA-MS2, MS2-MS2-MS2-MS2-AA, MS3-AA-MS3-MS3-MS3, MS3-MS3-AA-MS3-MS3, MS3-MS3-MS3-AA-MS3, MS3-MS3-MS3-MS3-AA, AA-MS3-MS3-MS3-MS3, MS1-MS2-AA-MS1-MS3, MS1-MS2-MS2-MS1-MS3, MS1-AA-MS2-MS1-MS3, MS1-MS2-MS1-AA-MS3, MS1-MS2-MS2-MS1-MS3, MS1-MS1-MS2-MS1-MS3, MS1-MS1-MS2-MS2-MS3, MS1-MS1-MS2-MS3-MS3, MS1-MS1-MS1-MS1-MS3, MS1-MS1-MS1-MS2-MS3, MS1-MS1-MS1-MS3-MS3, MS1-MS1-MS3-MS1-MS3, MS1-MS1-MS3-MS2-MS3, MS1-MS1-MS3-MS3-MS3, MS1-MS2-MS1-MS1-MS3, MS1-MS2-MS1-MS2-MS3 MS1-MS2-MS1-MS3-MS3, MS1-MS2-MS2-MS2-MS3, MS1-MS2-MS2-MS3-MS3, MS1-MS2-MS3-MS1-MS3, MS1-MS2-MS3-MS2-MS3, MS1-MS2-MS3-MS3-MS3, MS1-MS3-MS1-MS1-MS3, MS1-MS3-MS1-MS2-MS3, MS1-MS3-MS1-MS3-MS3, MS1-MS3-MS2-MS1-MS3, MS1-MS3-MS2-MS2-MS3, MS1-MS3-MS2-MS3-MS3, MS1-MS3-MS3-MS1-MS3, MS1-MS3-MS3-MS2-MS3, MS1-MS3-MS3-MS3-MS3
(MS1 indicates module structure 1, MS2 indicates module structure 2, MS3 indicates module structure 3, and AA indicates an insertion sequence consisting of seven amino acids.)
Item 8. At least one selected from the group consisting of a reverse transcriptase inhibitor, an HIV protease inhibitor, and a chemokine receptor antagonist is bound to the polypeptide of Item 1 above or without a spacer substance. A complex characterized by
[0015]
Item 9. The polypeptide according to any one of Items 1 to 7 and / or the complex according to Item 8, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Or an anti-HIV agent containing a diluent.
[0016]
Item 10. The polypeptide according to any one of Items 1 to 7 and / or the complex according to Item 8, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. Alternatively, an AIDS crisis-preventing agent or AIDS therapeutic agent containing a diluent.
[0017]
Item 11. A method for preventing or treating AIDS, comprising administering an effective amount of the anti-HIV agent according to Item 9 or the AIDS development preventing agent or AIDS therapeutic agent according to Item 10 to an AIDS patient or an HIV carrier.
[0018]
Item 12. A method for preventing or treating the development of AIDS, wherein the method for preventing or treating the development of AIDS according to Item 11 above is used in combination with a multi-drug therapy for AIDS.
[0019]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0020]
The module structure in the present invention is a polypeptide composed of 6 or 7 amino acids, and the following three types are exemplified.
(Y ')_m1−X_1aX_1b−A₁−X_1cX_1dX_1e−A₂-(X '')_n1  : Module structure 1 (MS1)
(Y ')_m2−X_2a−A₁A₁−X_2bX_2c−A₂A₂-(X '')_n2    : Module structure 2 (MS2)
(Y ')_m3−X_3a−A₁−X_3bX_3cX_3d−A₂-X ': Module structure 3 (MS3)
(X_1a~ X_3d, A₁, A₂, X ′, X ″, Y ′, n and m are as defined above. ).
[0021]
In each module in the polypeptide of the present invention, A₁Represents an acidic amino acid, preferably glutamic acid, aspartic acid or cysteic acid, more preferably glutamic acid or aspartic acid. A₂Represents a basic amino acid, preferably lysine, arginine, ornithine or histidine, more preferably lysine, arginine or ornithine, still more preferably lysine or ornithine.
[0022]
A₁And A₂Are in the i-th and i + 4th positions in each module. When the amino acids at i-position and i + 4-position are made into a combination of an acidic amino acid and a basic amino acid (or vice versa), a salt bridge is formed between them, and α- of the polypeptide of the present invention A helix is easily formed. In addition, since the dipole direction of the salt bridge is opposite to the dipole direction formed by the peptide main chain, the thermodynamic stability of the molecule when the helix is formed is increased.
[0023]
Among the combinations of acidic amino acids and basic amino acids, the glutamic acid-lysine combination is more preferable.
[0024]
One or two acidic amino acid and basic amino acid combinations are preferably present in each module.
[0025]
Moreover, the polypeptide of the present invention is not limited to only within a module, and may have a combination of the i-position and the i + 4-position between modules (in a range exceeding the module structure). The polypeptide of the present invention can further stabilize the α-helix by having this combination between modules.
[0026]
Amino acid X in the polypeptide of the present invention_1a~ X_3d(X_1a, X_1b, X_1c, X_1d, X_1e, X_2a, X_2b, X_2c, X_3a, X_3b, X_3cAnd X_3d) Represents any amino acid that is the same or different.
[0027]
Examples of the arbitrary amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, serine, threonine, cysteine, cysteic acid, methionine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, histidine. , Proline, ornithine, sarcosine, β-alanine, norleucine (Nle), naphthylalanine (Nal) and the like.
[0028]
Note that proline should not be used when there is a possibility of destroying the α-helix structure by use. May be used when there is no possibility of destroying the α-helix structure.
[0029]
For example, the amino acid at position `` a '' in FIG._1a, X_2aOr X_3aAs the amino acid, tryptophan, leucine, isoleucine, glutamine, serine, threonine, asparagine, valine, phenylalanine, tyrosine, methionine, glycine, alanine, naphthylalanine and the like are preferable.
[0030]
The amino acid at position `` b '' in FIG._1bOr the amino acid at position “c”, ie X_3bExamples of amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, serine, threonine, cysteine, cysteic acid, methionine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, histidine, proline. Ornithine, sarcosine, β-alanine, norleucine, naphthylalanine and the like.
[0031]
Proline should not be used when there is a possibility of destroying the α-helix structure by use, but it is not possible to destroy the α-helix structure at the N-terminal or C-terminal. May be used.
[0032]
The amino acid at position `` d '' or `` e '' in FIG._1c, X_2b, X_3c, X_1d, X_2cOr X_3dAs the amino acid, for example, tryptophan, leucine, isoleucine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid, serine, threonine, valine, phenylalanine, tyrosine, methionine, glycine, alanine and the like are preferable.
[0033]
The amino acid at position “f” in FIG._1eExamples of amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, serine, threonine, cysteine, cysteic acid, methionine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, histidine, proline. Ornithine, sarcosine, β-alanine, norleucine, naphthylalanine and the like.
[0034]
Proline should not be used when there is a possibility of destroying the α-helix structure by use, but it is not possible to destroy the α-helix structure at the N-terminal or C-terminal. May be used.
[0035]
X ′ is any amino acid optionally having a protecting group, —OR¹Or -NR²R^Three X '' is -OR^FourOr -NR^FiveR⁶Indicates.
[0036]
Examples of amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, serine, threonine, cysteine, cysteic acid, methionine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, histidine, proline, Examples include ornithine, sarcosine, β-alanine, norleucine, naphthylalanine and the like.
[0037]
Proline should not be used when there is a possibility of destroying the α-helix structure by use, but it is not possible to destroy the α-helix structure at the N-terminal or C-terminal. May be used.
[0038]
When the polypeptide of the present invention has a protected amino acid, examples of the protecting group include the following. Ethoxycarbonyl group, methoxycarbonyl group, 9-fluorenylmethoxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, 4-methoxybenzyloxycarbonyl group, 2,2,2-trichloroethyloxycarbonyl group, formyl group, acetyl group, propionyl group And a butyryl group.
[0039]
R¹~ R⁶(R¹, R², R^Three, R^Four, R^FiveAnd R⁶) Are the same or different and each represents H, an alkyl group, an aryl group or an aralkyl group.
[0040]
Examples of the alkyl group include C₁~ C_FourOr a straight chain or branched chain alkyl group, preferably methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl and the like. Examples of the aryl group include a phenyl group and a phenyl group having a substituent. Examples of the substituent include the alkyl group, halogen atom, cyano, carboxylic acid, nitro, amino, acetylamino, alkoxy group and hydroxyl group exemplified above. The number of substituents is not particularly limited, and is 1 to 5, preferably 1 to 3.
[0041]
Y 'is H, R⁷CO-, a toluenesulfonyl group or a methanesulfonyl group is shown. R⁷Represents an alkyl group, an optionally substituted phenyl group, or an optionally substituted benzyl group. As the alkyl group, those described above can be used. Examples and numbers of substituents are also as exemplified above.
[0042]
n1 is 1 when the module structure 1 is C-terminal, and is 0 when the module structure 1 is not C-terminal. n2 is 1 when the module structure 2 is C-terminal, and is 0 when the module structure 2 is not C-terminal.
[0043]
m1 is 1 when the module structure 1 is N-terminal, and is 0 except when the module structure 1 is N-terminal. m2 is 1 when the module structure 2 is N-terminal, and is 0 except when the module structure 2 is N-terminal. m3 is 1 when the module structure 3 is N-terminal, and is 0 except when the module structure 3 is N-terminal.
[0044]
In the module structures 1 to 3, the amino acid means -NH-CH (R ')-CO- (R' represents a side chain of the amino acid).
[0045]
The polypeptide of the present invention is a polypeptide comprising at least one of the module structures 1 to 3, preferably at least one of the module structures 1 to 3. The polypeptide of the present invention may consist only of the same module structure as the module structure.
[0046]
The polypeptide of the present invention can contain, for example, 2 to 15, preferably 3 to 12, more preferably 4 to 10, and particularly preferably 5 to 7, the above-mentioned module structure. The binding order of each module structure is not limited as long as the polypeptide of the present invention has an α-helix structure and binds to N36.
[0047]
One of preferred embodiments includes a polypeptide having a module structure 1 at the amino terminus (hereinafter referred to as “N-terminus”). Among them, the module structure 1 located at the N-terminus is “Trp-Z— Particularly preferred is “Glu-Trp-Asp-Arg-Lys” (“Z” represents norleucine, methionine or glutamic acid).
[0048]
Further, as another preferred embodiment, a polypeptide in which the module structure 3 is located at the C-terminus can be exemplified, among which X ′ is —NH₂Are more preferred.
[0049]
In the polypeptide of the present invention, it is particularly preferred that no amino acids other than amino acids forming a module structure exist between the modules. However, as long as the polypeptide of the present invention can form an α-helix and bind to N36, a 7 amino acid insertion sequence consisting of seven arbitrary amino acids may be included between each module structure. If it is N terminal or C terminal, you may add 1-6 arbitrary amino acids.
[0050]
As an optional amino acid, for example, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, serine, threonine, cysteine, cysteic acid, methionine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, histidine, Examples include proline, ornithine, sarcosine, β-alanine, norleucine, naphthylalanine and the like. These amino acids may have a protecting group as described above.
[0051]
Proline should not be used when there is a possibility of destroying the α-helix structure by use, but it is not possible to destroy the α-helix structure at the N-terminal or C-terminal. May be used.
[0052]
Examples of 7 amino acid insertion sequences that may be included between modules include `` X_2a−A₂A₂−X_2bX_2c−A₁A₁(X_2a, X_2b, X_2c, A₁And A₂Is as defined above. ) Can be illustrated as a preferred embodiment.
[0053]
This 7-amino acid insertion sequence can be included in the polypeptide of the present invention, for example, if it is between module structures, 1 to 3 if it is N-terminal or C-terminal.
[0054]
Furthermore, the polypeptide of the present invention may have a compound capable of binding to N36 at its N-terminus and / or C-terminus.
[0055]
The polypeptide of the present invention has, for example, 13 or 14 to 104 or 105 amino acids, preferably 13 or 14 to 83 or 84, more preferably 13 or 14 to 48 or 49, particularly preferably 34 or 35. Can have.
[0056]
The amino acid used in the polypeptide of the present invention is preferably L-form (L amino acid), but D-form may be used. When using D-form, it is necessary to make all optically active amino acids D-form.
[0057]
Furthermore, the peptide bond (—NH—CO—⇔—N═C (OH) in the polypeptide of the present invention is used.
-) Can also be a biologically equivalent bond such as an alkene (-CH = CH-) or a fluoroalkene (-CF = CH-). Regarding alkenes, for example, S. Oishi, T. Kamano, A. Niida, Y. Odagaki, N. Hamanaka, M. Yamamoto, K. Ajito, H. Tamamura, A. Otaka, and N. Fujii. Diastereoselective Synthesis of New Ψ [(E) -CH = CMe]-and Ψ [(Z) -CH = CMe] -type Alkene Dipeptide Isosteres by Organocopper Reagents and Application to Conformationally Restricted Cyclic RGD Peptidomimetics. J. Org. Chem. 2002, 67, For example, A. Otaka, H. Watanabe,
A. Yukimasa, S. Oishi, H. Tamamura, and N. Fujii.New Access to a-Substituted (Z) -Fluoroalkene Dipeptide Isosteres Utilizing Organocopper Reagents under "Reduction-Oxidative Alkylation (R-OA)" Conditions.Tetrahedron Lett. 2001, 42, 5443-5446.
[0058]
As a preferred embodiment of the polypeptide of the present invention, for example, a polypeptide represented by the following formula can be exemplified (MS1 represents module structure 1, MS2 represents module structure 2, MS3 represents module structure 3, and AA represents An insertion sequence consisting of 7 amino acids is shown.);
MS1-MS1-MS1-MS1-MS1, MS2-MS2-MS2-MS2-MS2, MS3-MS3-MS3-MS3-MS3, AA-MS1-MS1-MS1-MS1, MS1-AA-MS1-MS1-MS1, MS1-MS1-AA-MS1-MS1, MS1-MS1-MS1-AA-MS1, MS1-MS1-MS1-MS1-AA, AA-MS2-MS2-MS2-MS2, MS2-AA-MS2-MS2-MS2, MS2-MS2-AA-MS2-MS2, MS2-MS2-MS2-AA-MS2, MS2-MS2-MS2-MS2-AA, MS3-AA-MS3-MS3-MS3, MS3-MS3-AA-MS3-MS3, MS3-MS3-MS3-AA-MS3, MS3-MS3-MS3-MS3-AA, AA-MS3-MS3-MS3-MS3, MS1-MS2-AA-MS1-MS3, MS1-MS2-MS2-MS1-MS3, MS1-AA-MS2-MS1-MS3, MS1-MS2-MS1-AA-MS3, MS1-MS2-MS2-MS1-MS3, MS1-MS1-MS2-MS1-MS3, MS1-MS1-MS2-MS2-MS3, MS1-MS1-MS2-MS3-MS3, MS1-MS1-MS1-MS1-MS3, MS1-MS1-MS1-MS2-MS3, MS1-MS1-MS1-MS3-MS3, MS1-MS1-MS3-MS1-MS3, MS1-MS1-MS3-MS2-MS3, MS1-MS1-MS3-MS3-MS3, MS1-MS2-MS1-MS1-MS3, MS1-MS2-MS1-MS2-MS3 MS1-MS2-MS1-MS3-MS3, MS1-MS2-MS2-MS2-MS3, MS1-MS2-MS2-MS3-MS3, MS1-MS2-MS3-MS1-MS3, MS1-MS2-MS3-MS2-MS3, MS1-MS2-MS3-MS3-MS3, MS1-MS3-MS1-MS1-MS3, MS1-MS3-MS1-MS2-MS3, MS1-MS3-MS1-MS3-MS3, MS1-MS3-MS2-MS1-MS3, MS1-MS3-MS2-MS2-MS3, MS1-MS3-MS2-MS3-MS3, MS1-MS3-MS3-MS1-MS3, MS1-MS3-MS3-MS2-MS3, MS1-MS3-MS3-MS3-MS3.
[0059]
More preferred specific examples of the polypeptide of the present invention include, for example, “Ac-Trp-Nle-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Lys- Lys-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Glu-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂(SC34-a), "Ac-Trp-Met-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Lys-Lys-Leu-Ile-Glu- Glu-Ser-Gln-Glu-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂(SC34-b), "Ac-Trp-Nle-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Leu-Ile-Lys- Lys-Ser-Gln-Glu-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂(SC34 (EK) -a), "Ac-Trp-Met-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Leu-Ile -Lys-Lys-Ser-Gln-Glu-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂(SC34 (EK) -b), "Ac-Trp-Glu-Glu-Trp-Asp-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Leu-Ile -Lys-Lys-Ser-Glu-Glu-Gln-Gln-Lys-Lys-Asn-Glu-Glu-Glu-Leu-Lys-Lys-NH₂”(SC35 (EK)) (“ Ac ”represents an acetyl group) and the like.
[0060]
The polypeptide of the present invention can be produced by a known polypeptide synthesis method, particularly a liquid phase synthesis method or a solid phase synthesis method. It can also be synthesized by a method in which DNA encoding the polypeptide of the present invention is introduced into a host cell by a gene recombination technique and expressed.
[0061]
For example, in the solid phase synthesis method, the amino group of the amino acid corresponding to the most C-terminal is protected with a urethane-type protecting group such as a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group, and the carboxyl group of the N-protected amino acid is After binding to an insoluble resin having a group, the amino protecting group is removed, the protected amino acid is condensed sequentially in the N-terminal direction, and then the insoluble resin and the amino acid protecting group are deprotected. Can be obtained.
[0062]
The insoluble resin having an amino group is not particularly limited, but is preferably an Fmoc-NH-SAL resin (4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmoc-aminoethyl) phenoxy linker resin), and directly by cleavage. The object can be given.
[0063]
The protected amino acid used for the synthesis of the polypeptide of the present invention can be obtained by protecting the functional group with a known protecting group by a known method, or a commercially available protected amino acid can also be used. A well-known thing can be used as a protecting group, For example, what was illustrated above can be used.
[0064]
When preparing a protected amino acid, for example, a known method such as DIPCDI (diisopropylcarbodiimide) -HOBt (1-hydroxybenzotriazole) method can be used. This condensation reaction can be carried out in a known solvent, and examples thereof include organic solvents such as dimethylformamide. The amino group-protecting group elimination reagent is not limited, and the protecting group such as the Fmoc group can be cleaved by a known reagent such as piperidine / dimethylformamide.
[0065]
In addition, the degree of progress of the condensation reaction at each stage of the synthesis can be confirmed by a known method such as a ninhydrin reaction method.
[0066]
As described above, a protected polypeptide having a desired amino acid sequence can be obtained.
[0067]
When Fmoc-NH-SAL resin is used as the insoluble resin, the resin and the protecting group can be removed simultaneously by treatment with TMSBr (trimethylsilyl bromide), TFA (trifluoroacetic acid) or the like.
[0068]
The polypeptide of the present invention thus obtained is isolated by a known means such as extraction, recrystallization, various chromatography (gel filtration, ion exchange, distribution, adsorption), electrophoresis, countercurrent distribution, etc. A method using reverse phase high performance liquid chromatography is preferred.
[0069]
The polypeptide of the present invention can prevent HIV from invading (infecting) a host cell (eg, T cell) in vivo, or the infected HIV can grow in the host cell and cause further infection. This can be used to prevent HIV infection, prevent the onset of AIDS, and further treat AIDS.
[0070]
The polypeptide of the present invention can be chemically bound to at least one selected from the group consisting of a reverse transcriptase inhibitor, an HIV protease inhibitor and a chemokine receptor antagonist, which are anti-HIV active substances, by a known method. It is.
[0071]
The reverse transcriptase inhibitor is a substance that inhibits the activity of HIV reverse transcriptase, and is classified into a nucleoside inhibitor and a non-nucleoside inhibitor.
[0072]
The nucleoside inhibitor is preferably a non-natural nucleoside or a nucleoside analog so that HIV is incorporated into RNA when RNA is synthesized by reverse transcription from RNA, and as a result, inhibits DNA synthesis.
[0073]
The said nucleoside analog refers to the non-nucleoside compound which has a three-dimensional structure similar to a nucleoside. These reverse transcriptase inhibitors can be commercially available or prepared according to known synthesis methods.
[0074]
As a nucleoside reverse transcriptase inhibitor, a nucleoside or an analog thereof composed of a pyrimidine base, a purine base, an imidazole base or a triazole base and a furanose having at least one hydroxyl group or an acyclo form thereof Is preferred.
[0075]
For example, AZT (CAS REGISTRY NUMBERS: 30516-87-1: zidovudine), ddI (CAS REGISTRY NUMBERS: 69655-05-6: didanosine), ddC (CAS REGISTRY NUMBERS: 7481-89-2: Zalcitabine), 2 ', 3'-didehydro-2', 3'-dideoxythymidine (CAS REGISTRY NUMBERS: 3056-17-5: d4T: stavudine), 3'-thia-2 ', 3 '-Dideoxycytidine (CAS REGISTRY NUMBERS: 134678-17-4: 3TC: lamivudine), 2'-β-fluoro-ddC, 3'-fluorothymidine (CAS REGISTRY NUMBERS: 25526-93-6: FLT) 9- (2-phosphonyl-methoxyethyl) -adenine (CAS REGISTRY NUMBERS: 106941-25-7: PMEA), 6-Cl-ddI, 6-Cl-ddC, and the like.
[0076]
Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors include, for example, tetrahydro-imidazo-benzo-diazepin-one or -thione (TIBO) derivatives (specifically, (+)-S-4,5,6, 7-Tetrahydro-5-methyl-6- (3-methyl-2-butenyl) imidazo [4,5,1-jk] [1,4] benzodiazepine-2 (1H) -thione (CAS REGISTRY NUMBERS: 167206- 29-3: R82913), hydroxyethoxy-methylphenylthiothymine (HEPT) derivatives, nevirapine (CAS REGISTRY NUMBERS: 129618-40-2), pyridinone derivatives, and the like.
[0077]
Of these, nucleoside reverse transcriptase inhibitors are preferred because they can be easily combined with the polypeptide of the present invention and can be effectively inhibited by DNA incorporation. Among nucleoside HIV transcriptase inhibitors, AZT, ddI, ddC, d4T, 3TC, etc., which have already been clinically administered to humans, are preferable.
[0078]
The HIV protease inhibitor is preferably a substance that inhibits the activity of HIV protease and is a substrate transition state mimic compound of the protease.
[0079]
A substrate transition state mimic refers to a substance that can bind to a substrate binding site of an enzyme and has a three-dimensional structure similar to the substrate in the enzyme-substrate complex.
[0080]
For example, Nelfinavir, Ro 31-8959 (CAS REGISTRY NUMBERS: 127779-20-8: saquinavir), A-77003 (CAS REGISTRY NUMBERS: 134878-17-4), A-80987 (CAS REGISTRY NUMBERS: 144141- 97-9), KNI-93 (CAS REGISTRY NUMBERS: 138258-64-7), KNI-102 (CAS REGISTRY NUMBERS: 139694-65-8), KNI-174, KNI-227 (CAS REGISTRY NUMBERS: 147384-69) -8), KNI-272 (CAS REGISTRY NUMBERS: 147318-81-8), L-735527 (CAS REGISTRY NUMBERS: 150378-17-9: indinavir), SC-52151 (CAS REGISTRY NUMBERS: 143224-34) -4: Telinavir), VX-478, ABT-538 (CAS REGISTRY NUMBERS: 155213-67-5: Ritonavir), DMP-323 (CAS REGISTRY NUMBERS: 151867-81-1), U- 96988 (CAS REGISTRY NUMBERS: 149394-65-0).
[0081]
Of these, Ro 31-8959, L-735527, KNI-272 and the like having high antiviral activity are preferred.
[0082]
As these HIV protease inhibitors, commercially available products or those prepared according to known synthetic methods can be used. Examples of Ro 31-8959 include the preparation method described in J. Med. Chem. 36, p2300-2310 (1993).
[0083]
Chemokine receptor antagonists include TAK-779 (Takeda), SCH-351125 (Schering-Plough), E913 (Ono), AMD3100, KRH-1120 (Kureha), AMD8664, T-140 (Kyoto Univ., Fujii), etc. Can be mentioned. These compounds have a function of inhibiting the entry of HIV into a host cell by blocking a second receptor (chemokine receptor) required when HIV is infected.
[0084]
In the complex of the present invention, the polypeptide of the present invention and the anti-HIV active substance are chemically bound, but the binding mode is not particularly limited. For example, ester bond, amide bond, ether bond, disulfide Bonding etc. are mentioned.
[0085]
For example, in the case of an ester bond, after the anti-HIV active substance bound to the polypeptide of the present invention is transported into the target cell in the living body, the bond is cleaved by esterase or the like, and the anti-HIV active substance is in the vicinity of its action point. Can be liberated. The ester bond is preferable because it is a bond having such stability that it is not easily cleaved during transportation, but is not limited thereto.
[0086]
In the complex of the present invention, the site of the polypeptide of the present invention that binds to the above-mentioned anti-HIV active substance is not particularly limited, but it maintains the affinity between the polypeptide of the present invention itself and N36 of HIV surface protein gp41. The vicinity of the N-terminal is preferred so that
[0087]
Specifically, α-amino group or ω-amino group of N-terminal amino group, or MAP system (multiple antigenic peptide system) developed by Tam for antibody production (JPTam, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85, 5409-5413 (1988); JPTam, "Peptides: synthesis, structures, and applications" (B. Gutte, ed.), Pp. 456-500, Academic Press, Inc., New York (1995) )) A dendrimer structure using a radially branched lysine is prepared at the N-terminal part of the polypeptide chain by the Tam method, and a plurality of amino groups present at the terminal and side chains thereof. It is also possible to bind a plurality of anti-HIV active substances to a plurality of anti-HIV active substances per molecule of the polypeptide chain of the present invention.
[0088]
Examples of the substance used for forming the dendritic structure include substances containing two or more amino groups. Among them, lysine, ornithine and the like are preferable.
[0089]
The binding site of the anti-HIV active substance that binds to the amino group of the polypeptide of the present invention should be appropriately selected according to the type of the active substance to be bound, but when a carboxyl group or a hydroxyl group is present in the substance. A chemical bond formed via these functional groups is preferred, and a chemical bond via a hydroxyl group is particularly preferred.
[0090]
Even if the position of the functional group is a site having a central role of anti-HIV activity, the chemical bond is cleaved in the vicinity of the target cell or in the cell. The position in the molecule is not particularly limited.
[0091]
For example, when the complex of the present invention is obtained by binding the anti-HIV active substance to the polypeptide chain of the present invention via the carboxyl group of the anti-HIV active substance, the N of the protected polypeptide resin is obtained by a known method. An amide bond is formed between the terminal amino group and the carboxyl group of the anti-HIV active substance, and can be directly bonded. In addition, the polypeptide of the present invention and the above-mentioned anti-HIV active substance can be bound by a chemical bond capable of being cleaved in vivo via an appropriate spacer substance.
[0092]
When the anti-HIV active substance is bound to the polypeptide chain via the hydroxyl group of the anti-HIV active substance to obtain the complex of the present invention, the functional group at the N-terminal part of the protective polypeptide resin and the anti-HIV active substance It can be bonded via a spacer substance having a functional group that can be chemically bonded to both of the hydroxyl groups.
[0093]
Such a spacer substance has one carboxyl group capable of binding to the amino group at the N-terminal part of the polypeptide chain to be used, and can also form an ester bond with the hydroxyl group in the anti-HIV active substance. Preferably having a carboxyl group different from the above, specifically, an aromatic compound or an aliphatic compound having two or more carboxyl groups may be mentioned, but an aliphatic compound having a chain structure Is preferred.
[0094]
When a dicarboxylic acid is used as the spacer substance, an amide bond is formed between one carboxyl group and the amino group at the N-terminal part of the polypeptide of the present invention, and the other carboxyl group of the spacer substance and the anti-HIV active substance in the anti-HIV active substance By forming an ester bond with a hydroxyl group, the polypeptide of the present invention and the anti-HIV active substance can be bound.
[0095]
The spacer substance is not particularly limited. However, considering the ease of synthesis, the ease of cleavage by an enzyme in vivo, the ease of binding to the target site of the complex of the present invention, etc., carbon An aliphatic dicarboxylic acid having 4 to 12 carbon atoms is preferable, and an aliphatic dicarboxylic acid having 4 to 8 carbon atoms is more preferable.
[0096]
Among them, succinic acid, glutaric acid or derivatives thereof are particularly preferable from the viewpoint of stability and ease of handling. The dicarboxylic acid may have other functional groups as long as the binding between the polypeptide of the present invention and the anti-HIV active substance is not hindered.
[0097]
The method for bonding the protected polypeptide resin and AZT using dicarboxylic acid as a spacer substance is not particularly limited, but the following methods are exemplified.
[0098]
First, AZT and a multifunctional spacer can be combined. For example, AZT is reacted with succinic anhydride or glutaric anhydride in the presence of dimethylaminopyridine, and after a conventional treatment, a conjugate of AZT and a spacer substance (hereinafter referred to as “AZT−”) in which succinic acid or glutaric acid is ester-bonded to AZT. Spacer substance ") is obtained.
[0099]
Next, this AZT-spacer substance is present at the terminal and side chain of the dendritic structure bonded to the α-amino group, ω-amino group of the amino acid at the N-terminal portion of the protected polypeptide resin, or dendrimer to the amino acid. To a plurality of amino groups by, for example, condensing by a known method such as DIPCI-HOBt method (this substance can be bonded to a “protecting group-protected polypeptide resin-spacer substance-AZT complex”). Also described).
[0100]
The thus obtained protective group-protected polypeptide resin-spacer substance-AZT complex can be made into the complex of the present invention by subjecting it to a release reaction of the insoluble resin and the protective group by a known method. it can.
[0101]
In the method for synthesizing the above protecting group-protected polypeptide resin-spacer substance-AZT complex, other known anti-HIV active substances can be used instead of AZT.
[0102]
The complex of the present invention thus obtained can be isolated and purified by a known method, but is preferably performed by reversed-phase high performance liquid chromatography.
[0103]
According to the complex of the present invention, not only the effect of the polypeptide of the present invention but also the effect of an anti-HIV active substance can be obtained. Furthermore, since the polypeptide of the present invention binds to N36, an anti-HIV active substance can be released in the immediate vicinity of HIV present in the vicinity thereof, thus not only preventing HIV infection but also highly effective anti-HIV. HIV activity can also be obtained.
[0104]
The complex of the present invention can also be used for HIV infection prevention, anti-HIV, AIDS onset prevention, and further AIDS treatment.
[0105]
The polypeptides and / or complexes of the present invention also include pharmaceutically acceptable salts thereof. Such salts include non-toxic alkali metal salts such as sodium, potassium, lithium, calcium, magnesium, alkaline earth metal salts and the like prepared by methods well known in the art. Further, the above salts include nontoxic acid addition salts obtained by reacting the polypeptide of the present invention with a suitable organic acid or inorganic acid. Typical acid addition salts include, for example, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, acetate, valerate, laurate, lactate, phosphate, p-toluenesulfonate (tosylate), citric acid, Examples thereof include acid salts, maleates, fumarate, succinate, tartrate, glycolate, benzenesulfonate and methanesulfonate.
[0106]
More specifically, the therapeutic agent of the present invention includes a pharmaceutical composition or pharmaceutical preparation containing as an active ingredient a pharmacologically effective amount of the above-described polypeptide and / or complex, and an appropriate pharmaceutical carrier or diluent. .
[0107]
The pharmaceutical carrier that can be used in the above pharmaceutical composition (pharmaceutical preparation) includes a filler, a bulking agent, a binder, a moistening agent, a disintegrating agent, a surfactant, a lubricant, which are usually used according to the use form of the preparation. A diluent such as an agent or an excipient can be exemplified, and these are appropriately selected and used depending on the dosage unit form of the resulting preparation. Various preparation forms can be selected according to the purpose of treatment, and typical ones are tablets, pills, powders, solutions, suspensions, capsules, suppositories, injections (solutions, suspensions). And the like, sprays, aerosols, inhalants, sustained-release microcapsules and the like.
[0108]
Particularly preferred pharmaceutical preparations of the present invention include various components that can be used in normal protein preparations, such as stabilizers, bactericides, buffers, isotonic agents, chelating agents, pH adjusters, surfactants, phospholipids. Etc. are appropriately used.
[0109]
Examples of the stabilizer include human serum albumin, ordinary L-amino acids, saccharides, cellulose derivatives and the like, and these can be used alone or in combination with a surfactant. In particular, according to this combination, the stability of the active ingredient may be further improved.
[0110]
The L-amino acid is not particularly limited and may be any of glycine, cysteine, glutamic acid and the like.
[0111]
The sugar is not particularly limited. For example, monosaccharides such as glucose, mannose, galactose and fructose, sugar alcohols such as mannitol, inositol and xylitol, disaccharides such as sucrose, maltose and lactose, dextran, hydroxypropyl starch and chondroitin Polysaccharides such as sulfuric acid and hyaluronic acid, and derivatives thereof can be used.
[0112]
There is no particular limitation on the surfactant, and both ionic and nonionic surfactants can be used. For example, polyoxyethylene glycol sorbitan alkyl ester, polyoxyethylene alkyl ether, sorbitan monoacyl ester, A fatty acid glyceride system can be used.
[0113]
The cellulose derivative is not particularly limited, and methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, carboxymethyl cellulose sodium and the like can be used.
[0114]
The addition amount of the saccharide is suitably about 0.0001 mg or more, preferably about 0.01 to 10 mg per 1 μg of the active ingredient. The amount of the surfactant added is appropriately about 0.00001 mg or more, preferably about 0.0001 to 0.01 mg, per 1 μg of the active ingredient. The amount of human serum albumin added is suitably about 0.0001 mg or more, preferably about 0.001 to 0.1 mg, per μg of active ingredient. The amino acid is suitably about 0.001 to 10 mg per μg of active ingredient. The amount of the cellulose derivative added is appropriately about 0.00001 mg or more, preferably about 0.001 to 0.1 mg per 1 μg of the active ingredient.
[0115]
The amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical preparation of the present invention is appropriately selected from a wide range, but is usually about 0.00001 to 70% by weight, preferably about 0.0001 to 5% by weight.
[0116]
Various additives such as buffering agents, tonicity agents, chelating agents and the like can also be added to the pharmaceutical preparation of the present invention. Here, examples of the buffer include phosphoric acid, acetic acid, citric acid, ε-aminocaproic acid, glutamic acid and / or salts corresponding thereto (for example, alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, etc. Examples thereof include alkaline earth metal salts). Examples of isotonic agents include sodium chloride, potassium chloride, sugars, glycerin and the like. Examples of chelating agents include sodium edetate and citric acid.
[0117]
The pharmaceutical preparation of the present invention can be used as a solution preparation. In addition, the pharmaceutical preparation can be freeze-dried and stored, and then dissolved in a buffer solution containing water for use, saline, etc. It is also possible to use it after it has been prepared.
[0118]
The pharmaceutical preparation of the present invention is prepared in solid dosage forms such as tablets, pills, powders, powders, granules and capsules, and liquid dosage forms such as solutions, suspensions, emulsions, syrups and elixirs. Also good. These are further classified into oral preparations, parenteral preparations, nasal preparations, vaginal preparations, suppositories, sublingual preparations, ointments and the like according to the administration route, and can be prepared, molded or prepared according to usual methods. it can.
[0119]
For example, in the case of molding into a tablet form, lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystalline cellulose, silicic acid, potassium phosphate and other excipients, water, Ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose, polyvinylpyrrolidone and other binders, sodium carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, low substituted hydroxypropylcellulose, dry starch, Disintegrants such as sodium alginate, agar powder, laminaran powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, sodium lauryl sulfate Surfactants such as um, stearic acid monoglyceride, disintegration inhibitors such as sucrose, stearin, cocoa butter and hydrogenated oil, quaternary ammonium bases, absorption promoters such as sodium lauryl sulfate, humectants such as glycerin and starch, Adsorbents such as starch, lactose, kaolin, bentonite and colloidal silicic acid, lubricants such as purified talc, stearate, boric acid powder and polyethylene glycol can be used.
[0120]
Furthermore, the tablets can be made into tablets with ordinary coatings as required, for example, sugar-coated tablets, gelatin-encapsulated tablets, enteric-coated tablets, film-coated tablets, or double tablets or multilayer tablets.
[0121]
In shaping into a pill form, as a formulation carrier, for example, excipients such as glucose, lactose, starch, cacao butter, hydrogenated vegetable oil, kaolin, talc, binders such as gum arabic powder, tragacanth powder, gelatin, ethanol, Disintegrants such as laminaran and agar can be used.
[0122]
Capsules are usually prepared by mixing the active ingredients of the present invention with the various preparation carriers exemplified above and filling them into hard gelatin capsules, soft capsules and the like according to conventional methods.
[0123]
Liquid dosage forms for oral administration include pharmaceutically acceptable solutions, emulsions, suspensions, syrups, elixirs, etc., containing conventional inert diluents such as water, as well as wetting agents, emulsions, suspensions. Auxiliaries such as suspending agents can be included and these are prepared according to conventional methods.
[0124]
In preparing liquid dosage forms for parenteral administration, such as sterile aqueous or non-aqueous solutions, emulsions, suspensions, etc., diluents such as water, ethyl alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol Polyoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester and vegetable oils such as olive oil can be used, and injectable organic esters such as ethyl oleate can be blended. Furthermore, usual solubilizers, buffers, wetting agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, dispersing agents and the like can be added to these. Sterilization can be performed by, for example, filtration operation through a bacteria retaining filter, blending of a bactericide, irradiation treatment, and heat treatment. They can also be prepared in the form of sterile solid compositions that can be dissolved in sterile water or a suitable sterilizable medium immediately before use.
[0125]
In the case of forming into a suppository or a preparation for vaginal administration, for example, polyethylene glycol, cacao butter, higher alcohol, esters of higher alcohol, gelatin, semi-synthetic glyceride and the like can be used as a preparation carrier.
[0126]
The composition for spray, aerosol, inhalant, nasal or sublingual administration can be prepared according to a conventional method using a well-known standard excipient.
[0127]
In the pharmaceutical preparation of the present invention, a coloring agent, a preservative, a fragrance, a flavoring agent, a sweetening agent, and other medicines may be contained as necessary.
[0128]
The administration method of the pharmaceutical preparation is not particularly limited, and is determined according to various preparation forms, patient age, sex and other conditions, the degree of disease, and the like. For example, tablets, pills, solutions, suspensions, emulsions, granules, and capsules are administered orally, and injections are administered intravenously alone or mixed with normal fluids such as glucose and amino acids. Independently, intramuscular, intradermal, subcutaneous or intraperitoneal administration, suppositories are administered rectally, vaginal agents are administered intravaginally, nasal agents are administered intranasally, and sublingual agents are administered orally .
[0129]
The dosage of the above pharmaceutical preparation is not particularly limited, and is appropriately selected from a wide range depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, patient age, sex, and other conditions. The amount of active ingredient for adults should be about 0.01 μg to 10 mg, preferably about 0.1 μg to 1 mg per kg body weight per day, and the preparation can be divided into once or several times a day. Can be administered.
[0130]
Further, in the treatment method of the present invention, the polypeptide and / or complex of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is, for example, a multidrug therapy (HAART: Highly Active) currently performed in clinical practice. It can also be used in combination with known therapies such as anti-retroviral therapy.
[0131]
【Example】
Example 1  Production of the polypeptide SC34-a of the present invention
Ac-Trp-Nle-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Lys-Lys-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Glu- Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂  (1) Synthesis of SC34 protected polypeptide resin
Fmoc-NH-SAL resin (0.51 mmol / g) After removing 392 mg (0.2 mmol) of Fmoc group with 20% piperidine / DMF (dimethylformamide), H₂Fmoc-Lys (Boc) -OH (2.5 eq) corresponding to position 34 was added to the N-SAL resin, and a condensation reaction was performed in DMF by the DIPCDI-HOBt method. The degree of progress of the condensation reaction was examined by the ninhydrin test method.
[0132]
In the same manner, the following amino acid derivatives that were converted to Nα-Fmoc, sequentially, Leu, Glu (Ot-Bu), Lys (Boc), Gln (Trt), Asn (Trt), Lys (Boc), Glu (Ot -Bu), Gln (Trt), Gln (Trt), Glu (Ot-Bu), Gln (Trt), Ser (t-Bu), Glu (Ot-Bu), Glu (Ot-Bu), Ile, Leu , Lys (Boc), Lys (Boc), Ile, Lys (Boc), Lys (Boc), Thr (t-Bu), Tyr (t-Bu), Glu (Ot-Bu), Glu (Ot-Bu) , Ile, Lys (Boc), Arg (Pbf), Asp (Ot-Bu), Trp, Glu (Ot-Bu), Nle, Trp were condensed. The resin after completion of amino acid condensation was treated with 20% piperidine / DMF to cleave the Fmoc group. Next, the N-terminal amino group was acetylated by treating the protected resin with acetic anhydride / pyridine to obtain an SC34-protected peptide resin.
[0133]
(2) Deprotection, separation and purification of polypeptide from resin
TFA (4.0 mL) -thioanisole (0.5 mL) -m-cresol (0.5 mL) -ethanedithiol (0.5 mL) -H per 100 mg of protected peptide resin₂The mixture was reacted with O (0.5 mL) at 25 ° C for 3 hours. The resin was filtered off from the reaction mixture, the resin was washed twice with 1 mL of TFA, 100 mL of ice-cold dry ether was added to the combined filtrate and washings, and the resulting precipitate was centrifuged and the residue was removed. Separated from the supernatant by decantation. The resulting residue is washed with cold ether and washed with H₂O-acetonitrile (CH_ThreeCN) 1: dissolved in 1, 10 mL. This solution was purified by HPLC (Cosmo Seal 5C18 ARII column: acetonitrile gradient elution) to obtain a single peak polypeptide. Purity was confirmed by HPLC.
[α]_D (c 0.38: 0.1 N AcOH): −50.0
Ion spray mass spectrum (IS-MS): (C₁₉₈H₃₁₈N₅₂O₆₂)
Calculated value: 4419.1 Actual value: 4419.5
(Triple Stage Quadrupole Mass Spectrometer APIII (Perkin-Elmer ScieX))
Example 2  Production of the polypeptide SC34 (EK) -a of the invention
Ac-Trp-Nle-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Leu-Ile-Lys-Lys-Ser-Gln-Glu- Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂A polypeptide SC34 (EK) of the present invention was obtained in the same manner as above (polypeptide SC34 of the present invention) except that the sequence of some amino acids was changed.
[α]_D (c 0.4: 0.1 N AcOH): −52.4
Ion spray mass spectrum (IS-MS): (C₁₉₈H₃₁₈N₅₂O₆₂)
Calculated value: 4419.1 Actual value: 4419.5
(Triple stage quadrupole mass spectrometer APIII (Perkin-Elmer ScieX)).
[0134]
In the same manner as in Example 1, the following polypeptides of the present invention were synthesized;
SC34-b: Ac-Trp-Met-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Lys-Lys-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser- Gln-Glu-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂(IS-MS; C₁₉₇H₃₁₆N₅₂O₆₂S), calculated value: 4437.1, measured value: 4437.5) SC34 (EK) -b: Ac-Trp-Met-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys- Ile-Glu-Glu-Leu-Ile-Lys-Lys-Ser-Gln-Glu-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂(IS-MS; C₁₉₇H₃₁₆N₅₂O₆₂S, calculated value: 4437.1, measured value: 4437.5) SC35 (EK): Ac-Trp-Glu-Glu-Trp-Asp-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Glu -Glu-Leu-Ile-Lys-Lys-Ser-Glu-Glu-Gln-Gln-Lys-Lys-Asn-Glu-Glu-Glu-Leu-Lys-Lys-NH₂(IS-MS; C₂₀₃H₃₂₅N₅₁O₆₆Calculated value: 4536.2, measured value: 4537.7).
[0135]
Example Three  Production of AZT-SC34 composite of the present invention
AZT-CO- (CH₂)_Three-CO-NH- (CH₂)_Five-CO-Trp-Nle-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Lys-Lys-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Glu -Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH₂
N of N-terminal Trp, a synthetic intermediate of SC34^a-For protected peptide resins with protecting group removed and free N-terminal amino group, Fmoc-NH- (CH₂)_Five-COOH is condensed by DIPCDI-HOBt method, then the Fmoc group is cleaved, and then AZT-CO- (CH₂)_Three-COOH was condensed by DIPCDI-HOBt method.
[0136]
TFA (4.0 mL) -thioanisole (0.5 mL) -m-cresol (0.5 mL) -ethanedithiol (0.5 mL) -H per 100 mg of this AZT-protected peptide resin₂The mixture was reacted with O (0.5 mL) at 25 ° C for 3 hours.
[0137]
The resin was removed from the reaction mixture by filtration, the resin was washed twice with 1 mL of TFA, 100 mL of ice-cold dry ether was added to the combined filtrate and washings, and the resulting precipitate was centrifuged and the residue was removed. Separated from the supernatant by decantation.
[0138]
The resulting residue is washed with cold ether and washed with H₂O-acetonitrile (CH_ThreeCN) 1: dissolved in 1, 10 mL. This solution was purified by HPLC (Cosmo Seal 5C18 ARII column: acetonitrile gradient elution) to obtain a single peak polypeptide. Purity was confirmed by HPLC.
[α] D (c 0.4: 0.1 N AcOH): 41.7
Ion spray mass spectrum (IS-MS): (C₂₁₇H₃₄₄N₅₈O₆₈)
Calculated value: 4485.51 Actual value: 4485.00
(Triple stage quadrupole mass spectrometer APIII (Perkin-Elmer ScieX)).
[0139]
Test example 1  Evaluation of anti-HIV activity of the polypeptide or complex of the present invention
Activity evaluation is galactosidase indicator assay (MAGI assay)^1,2,3It went by. Target cells (HeLa CD4-LTR / b-gal: 10^Four/ well) in a 96-well culture plate for 1 day, remove the medium, add HIV-1 clones (70 MAGI unit / well, which gave 70 blue cells after 48 h incubation), Cell culture is performed in a medium containing the inventive polypeptide. After 48 hours, the number of blue cells (colored blue when HIV-1 is infected) is measured. DP178 (T-20) was used as a control.
[0140]
The results are shown in Table 1.
[0141]
1． Kimpton J, Emerman M. 1992. Detection of replication-competent and pseudotyped human immunodeficiency virus with a sensitive cell line on the basis of activation of an integrated beta-galactosidase gene.J Virol. 66: 2232-9.
2． Kodama E, Kohgo S, Kitano K, Machida H, Gatanaga H, Shigeta S, Matsuoka M, Ohrui H, Mitsuya H. 2001. 4'-Ethynyl nucleoside analogs: Potent inhibitors active against multi-drug-resistant HIV variants in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy.
3． Maeda Y, Venzon D, Mitsuya H. 1998. Evolution and fitness of HIV-1 with the pol gene mutations conferring multi-dideoxynucleoside resistance. J. Infect. Dis. 177: 1207-1213.
[0142]
Test example 2  Determination of melting point of hexamer of polypeptide of the present invention and N36
The polypeptide of the present invention used in Test Example 1 and N36 are mixed in an equimolar amount in PBS (pH 7.0), stirred at 37 ° C. for 1 hour, and then the melting point (hexamer) of the complex (40 μM). The temperature was defined as the temperature at which 50% of the molecules did not form a hexamer) and was measured by CD spectrum. The results are also shown in Table 1.
[0143]
[Table 1]

[0144]
From Table 1, it can be seen that the polypeptide of the present invention has very high anti-HIV activity and forms a strong bond with N36.
[0145]
Test example 3 Effect of polypeptide of the present invention using AIDS virus having resistance to anti-HIV agent
As in Test Example 1, the effect of the polypeptide of the present invention was confirmed using a virus exhibiting resistance to DP178. The results are shown in Table 2.
[0146]
[Table 2]

[0147]
From Table 2, the polypeptide of the present invention exhibits a much stronger anti-HIV activity than the anti-HIV agent DP178 currently proceeding to the phase III phase of the clinical trial, and is also highly resistant to viruses that are resistant to DP178. Were found to exhibit high anti-HIV activity (stronger anti-HIV activity than resistant strains).
[0148]
Test example 4  Evaluation of affinity with N36 polypeptide
The SC34-N36 complex and the C34-N36 complex were obtained by measuring the CD spectrum at each temperature of the polypeptide SC34 of the present invention and a known mixture of known C34 and known N36 at each temperature, and tracking the temperature change in absorption at 222 nm. The thermal stability of was investigated.
[0149]
The temperature at which 50% of the molecules are in an unassociated state was 52 ° C for C34-N36, but 67 ° C for SC34-N36, and SC34 formed a stronger complex with N36. It was confirmed.
[0150]
Further, the SC34-N36 complex was subjected to ultracentrifugation, and the molecular weight actually present was measured. As a result, it was confirmed to exist as a hexamer (3 molecules of SC34, 3 molecules of N36). The results are shown in Figure 3.
[0151]
Test Example 5  Water solubility test
The increase in water solubility was confirmed from the elution time in reverse phase HPLC of C34 and SC34. As analysis conditions, a gradient elution method was used in which Cosmo Seal 5C18 AR-II (4.6 × 150 mm) was used as a column and the acetonitrile concentration was increased from 30% to 50% in 30 minutes in a 0.1% TFA aqueous solution.
[0152]
As a result, C34 was eluted at 28 minutes and SC34 was eluted at 21 minutes. Thus, it was confirmed that SC34 was significantly improved in water solubility as compared with known C34.
[0153]
Test Example 6  Confirmation of hexamer formation between the present invention and N36
The polypeptide of the present invention and N36 were mixed in equimolar amounts in PBS (pH 7.0) and stirred at 37 ° C. for 1 hour. The concentration of the formed complex was adjusted to 40 μM, and the apparent molecular weight at 20 ° C. was measured at 24000 rpm using BECKMAN XL-I. Partial specific volume of sample solution v = 0.73cm^Three/ g, sample solution density ρ = 1.00 g / cm^ThreeIt was.
[0154]
The results are shown in FIG. From this result, it was confirmed that three polypeptides of the present invention and three N36s formed a hexamer.
[0155]
【The invention's effect】
The polypeptide of the present invention has high affinity for N36 and exhibits high anti-HIV activity. Furthermore, since it is highly water-soluble, it can be used not only as a pharmaceutical product but also as a vector molecule for drug transport to HIV and HIV-infected cells.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing HIV virus C34.
FIG. 2 shows one mechanism by which HIV infects host cells.
FIG. 3 is a view showing the binding force between the polypeptides SC34 and C34 of the present invention and N36.
FIG. 4 is a view showing that a polypeptide (SC34) of the present invention and N36 form a hexamer.

Claims

A polypeptide having any one of the following amino acid sequences.
Ac-Trp-Nle-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Lys-Lys-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Glu- Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH ₂₂ (SC34-a);
Ac-Trp-Nle-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Leu-Ile-Lys-Lys-Ser-Gln-Glu- Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH ₂₂ (SC34 (EK) -a);
(“Ac” represents an acetyl group.)

A complex having the following amino acid sequence.
AZT-CO- (CH ₂ ) ₃ -CO-NH- (CH ₂ ) ₅ -CO-Trp-Nle-Glu-Trp-Asp-Arg-Lys-Ile-Glu-Glu-Tyr-Thr-Lys-Lys- Ile-Lys-Lys-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Glu-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Lys-Glu-Leu-Lys-NH ₂
(“AZT” indicates zidovudine.)

A pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent containing the polypeptide according to claim 1 and / or the complex according to claim 2 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient Anti-HIV agent.

A pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent containing the polypeptide according to claim 1 and / or the complex according to claim 2 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient AIDS crisis prevention agent or AIDS treatment agent.