JP4330948B2

JP4330948B2 - Antibody enzyme against chemokine receptor CCR-5, gene encoding the same, transformant introduced with the gene, and anti-HIV drug using the same

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Publication number: JP4330948B2
Application number: JP2003198292A
Authority: JP
Inventors: 泰三宇田; 恵美一二三; 直樹山本
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-02-27
Filing date: 2003-07-17
Publication date: 2009-09-16
Anticipated expiration: 2023-07-17
Also published as: JP2004313166A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エイズウイルス（ＨＩＶ）のコレセプターであるケモカインレセプターＣＣＲ−５に対する抗体酵素、それをコードする遺伝子、その遺伝子が導入された形質転換体、及びそれらを利用した抗ＨＩＶ薬剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＡＩＤＳ（acquired immunodeficiency syndrome）は、その原因ウイルスであるヒト免疫不全ウイルスＩ型（human immunodeficiency virus：ＨＩＶ−１）の感染によって免疫機能が低下し、それに伴って日和見感染症や悪性腫瘍、神経症状、痴呆などを合併した病態である。ＨＩＶ−１に感染すると、急性期、無昇症候期、エイズ関連症候群を経てエイズへと進展する。ＨＩＶ関連の研究や治療法などの進歩によって、エイズは不治の病から治療可能な病気になりつつあるが、現段階では確実な抗ＨＩＶ薬剤はなく、薬物による治療法も確立できていないのが現状である。
【０００３】
ＨＩＶの感染機構に関する研究において、１９８４年にＨＩＶ−１のレセプターとしてＣＤ４が同定された。ＣＤ４はヒトの細胞表面に存在し、ＨＩＶ−１の外皮糖タンパクであるｇｐ１２０と結合することによって、細胞に感染することが知られている。
【０００４】
しかし、ＣＤ４のみではウイルスの外皮と宿主細胞の細胞膜との融合は起こらず、ＨＩＶ−１の感染は成立しないため、コレセプター（セカンドレセプター）の存在が示唆されていた。そして、ＣＤ４の発見から１０年以上経過した後に、ＨＩＶのコレセプターであるケモカインレセプターＣＣＲ−５が発見された。さらに、ケモカインレセプターＣＣＲ−５が正常でない場合は、ＨＩＶ−１の感染・発症に抵抗を示すことも報告されたため、現在、多くの研究者や企業が、このコレセプターを標的としてＨＩＶ−１の侵入を阻害する薬剤の開発に乗り出している。
【０００５】
このようなＨＩＶコレセプターを標的とした抗ＨＩＶ薬剤の研究・開発の現状に関しては、以下に示す非特許文献１に記載されている。
【０００６】
【非特許文献１】
村上務、山本直樹著：タンパク質核酸酵素、Vol.４３、677-685頁（1998年）、「新しい抗ＨＩＶ薬剤の開発−ＨＩＶのコレセプター（セカンドレセプター）に作用する薬剤」
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記非特許文献１の表１に示すように、世界中の製薬企業が大学などの基礎研究機関と共同で、ＨＩＶコレセプターを標的とした抗ＨＩＶ薬剤の研究・開発に乗り出している。ケモカインレセプターＣＣＲ−５を標的としてＨＩＶ−１の感染を予防できる抗ＨＩＶ薬剤の候補としては、そのアンタゴニストとして作用する化合物が報告されている。
【０００８】
しかしながら、現在のところ、上記ケモカインレセプターＣＣＲ−５を直接攻撃して、その機能を消失させることのできる有効な薬剤は全く提案されていない。
【０００９】
そこで本発明では、ケモカインレセプターＣＣＲ−５を分解して、その機能を消失させることができ、エイズウイルスの感染の予防やエイズの治療に利用できる抗体酵素を提供する。さらに本発明では、その抗体酵素をコードする遺伝子、その遺伝子が導入された形質転換体、及びそれらを利用した抗ＨＩＶ薬剤を提供する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、上記課題を解決するために、抗体でありながら酵素作用を有し、標的としたタンパク質を完全分解することのできる抗体酵素に着目し、ケモカインレセプターＣＣＲ−５に対する抗体酵素を得るために鋭意検討した。その結果、ケモカインレセプターＣＣＲ−５に対する抗体のうち、抗体酵素としての機能を発揮するものが存在することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
即ち、本発明に係る抗体酵素は、ヒト由来ケモカインレセプターＣＣＲ−５の抗体、またはその抗体断片であり、かつ、上記ケモカインレセプターＣＣＲ−５を分解することを特徴とするものである。ここで、上記「抗体断片」とは、ケモカインレセプターＣＣＲ−５を抗原とする抗体を構成する各ペプチド鎖、さらにはこの各ペプチド鎖内の一部の領域のペプチド断片を意味する。
【００１２】
また、上記「抗体酵素」とは、抗体でありながら酵素作用を有するものであり、その中でも特に、その抗原タンパク質を標的として高い分解活性を示すものは「スーパー抗体酵素」と呼ばれる。上記「スーパー抗体酵素」は、標的としたタンパク質を完全分解することができ、しかも天然型酵素に近い活性を有する（参考文献：Super Catalytic Antibody [I] : Decomposition of targeted protein by its antibody light chain. Hifumi, E., Okamoto, Y., Uda, T., J. Biosci. Bioeng., 88(3), 323-327 (1999)）。本発明の抗体酵素は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５を抗原とする抗体であり、当該ＣＣＲ−５を完全分解するため、「スーパー抗体酵素」に含まれる。
【００１３】
上記抗体酵素は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５の抗体としての性質を色濃く残した状態で、その抗原であるケモカインレセプターＣＣＲ−５を分解するという性質を持っている。そのため、上記抗体酵素は特異性が高く、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のみを狙って分解することができる。このケモカインレセプターＣＣＲ−５は、ＨＩＶの感染において重要な役割を示すコレセプターであることから、その機能を消失させることができる上記抗体酵素は、ＨＩＶ感染の予防や、エイズの治療に使用される抗ＨＩＶ薬剤として有効に利用することができる。
【００１４】
上記抗体酵素は、上記ケモカインレセプターＣＣＲ−５抗体の可変領域を含んでなることが好ましい。この「可変領域」とは、抗体を構成するＨ鎖及びＬ鎖のうち、Ｎ末端から約１１０残基のアミノ酸からなる部分のことである。この可変領域は、抗体の種類によって一次構造に多様性が見られ、抗体が酵素としての活性を有する場合にその活性中心が含まれている可能性が高い。それゆえ、上記抗体酵素が抗体の可変領域を含めば、酵素として高い活性を有することができる。
【００１５】
また、上記抗体酵素は触媒三つ組残基構造を有することが好ましい。なお、「触媒三つ組残基構造」とは、少なくともセリンを含む３つのアミノ酸残基が活性部位に含まれ活性中心を形成していると推定される構造のことを言う。この触媒三つ組残基構造を有するプロテアーゼは、活性部位にセリンが含まれることからセリンプロテアーゼと呼ばれる。従って、上記抗体酵素はセリンプロテアーゼの一種であると言うこともできる。この触媒三つ組残基と推定される構造を有していれば、プロテアーゼとして高い活性を有していると予測できる。
【００１６】
本発明に係る抗体酵素として、具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列おいて、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなるものを挙げることができる。
【００１７】
この配列番号１に示すアミノ酸配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域である。このＥＣＬ２Ｂ−２のＬ鎖の可変領域は、後述の実施例に示されるように、ＣＣＲ−５分解酵素としての高い活性が確認された。
【００１８】
本発明に係る抗体酵素の他の例として、配列番号５に示すアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなるものを挙げることができる。
【００１９】
この配列番号５に示すアミノ酸配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域である。このＥＣＬ２Ｂ−３のＬ鎖の可変領域も、後述の実施例に示されるように、ＣＣＲ−５分解酵素としての高い活性が確認された。
【００２０】
本発明に係る抗体酵素のさらに他の例として、配列番号９に示すアミノ酸配列、又は、配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなるものを挙げることができる。
【００２１】
この配列番号９に示すアミノ酸配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−４の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域である。このＥＣＬ２Ｂ−４のＬ鎖の可変領域も、後述の実施例に示されるように、ＣＣＲ−５分解酵素としての高い活性が確認された。
【００２２】
本発明に係る抗体酵素のさらに他の例として、配列番号１１に示すアミノ酸配列、又は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなるものを挙げることができる。
【００２３】
この配列番号１１に示すアミノ酸配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−４の重鎖（Ｈ鎖）の可変領域である。このＥＣＬ２Ｂ−４のＬ鎖の可変領域も、後述の実施例に示されるように、ＣＣＲ−５分解酵素としての高い活性が確認された。
【００２４】
また、上記「１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加」とは、例えば、遺伝子工学的手法を用いて部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されるものであればよい。このように、遺伝子工学的手法を用いた場合、配列番号１、５、９、１１の何れかに示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなる抗体酵素は、換言すれば、配列番号１、５、９、１１の何れかに示すアミノ酸配列からなる抗体酵素の変異体である。
【００２５】
本発明の抗体酵素は、ＨＩＶの感染において重要な役割を果たすケモカインレセプターＣＣＲ−５を分解して、その機能を消失させるため、ＨＩＶの感染を阻害する抗ＨＩＶ薬剤として使用することもできる。すなわち、本発明の抗ＨＩＶ薬剤は、上記抗体酵素を含み、エイズウイルスの感染を阻害することを特徴とするものである。
【００２６】
また、本発明の抗体酵素は、ＨＩＶ感染患者に対してエイズの発症を遅らせたり、病気の進行を阻止したりすることも可能である。すなわち、本発明の抗ＨＩＶ薬剤は、上記抗体酵素を含み、エイズウイルス感染患者に対する治療薬として作用するものであってもよい。
【００２７】
本発明の抗ＨＩＶ薬剤は、上記抗体酵素のみを含み、それを静脈注射などによって直接投与して使用することもできるが、上記抗体酵素に加えて、薬理学的に許容される担体がさらに含まれていてもよい。このような抗ＨＩＶ薬剤の製造は、従来公知の製造方法によって行うことができる。この抗ＨＩＶ薬剤は、ＣＣＲ−５分子のみを特異的に狙って分解するため、効果が顕著であるというだけでなく、副作用が少ないということも期待できる。
【００２８】
本発明には、上記抗体酵素をコードする遺伝子も含まれる。この遺伝子を適当な宿主（例えば細菌、酵母）に発現可能に導入すれば、本発明の抗体酵素をその宿主内で発現させることができる。
【００２９】
なお、上記「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「遺伝子」は、本発明の抗体酵素をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００３０】
本発明の遺伝子として、具体的には、配列番号２に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号２に示す塩基配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００３１】
本発明の遺伝子の他の例として、配列番号６に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号６に示す塩基配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００３２】
本発明の遺伝子のさらに他の例として、配列番号１０に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号１０に示す塩基配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−４の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００３３】
本発明の遺伝子のさらに他の例として、配列番号１２に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号１２に示す塩基配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−４の重鎖（Ｈ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００３４】
さらに本発明には、上記遺伝子が導入された形質転換体も含まれる。この形質転換体は、上記遺伝子が適当な宿主（例えば細菌、酵母）に発現可能に導入されたものであり、本発明の抗体酵素を自身の体内で発現させることができる。そのため、上記形質転換体もエイズウイルスの感染を予防する抗ＨＩＶ薬剤や、エイズ治療のための抗ＨＩＶ薬剤として利用することができる。
【００３５】
【発明の実施の形態】
本発明についてより具体的に以下に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００３６】
（１−１）本発明に係る抗体酵素、および遺伝子について
ここでは、本発明の抗体酵素の一例として、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３の抗体断片を例に挙げて説明する。上記ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３の抗体断片は、より具体的には、ＥＣＬ２Ｂ−２の軽鎖の可変領域（すなわち、ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌ）、および、ＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖の可変領域（すなわち、ＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌ）である。
【００３７】
この２つの抗体酵素は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５の細胞外領域を構成するペプチド（ＲＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱＴＬＫ（配列番号１３）、あるいは、ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴＣＳ（配列番号１４））を免疫原として用いて取得されるモノクローナル抗体から得られたものである。そして、上記抗体酵素は、上記モノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列を分子モデリングすることによってその立体構造を推定した結果、セリン、ヒスチジン（又はグルタミン酸）、アスパラギン酸からなる触媒三つ組残基を構成できるアミノ酸配列（抗体断片）として探し出されたものである。
【００３８】
本発明の抗体酵素ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌは、ケモカインレセプターＣＣＲ−５の分解酵素として作用する。このことは、後述の実施例にも示されるように、ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−３−ＬがケモカインレセプターＣＣＲ−５の細胞外領域ペプチド（配列番号１３または配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるペプチド）を完全に分解するという結果からも明らかである。
【００３９】
ここで、ケモカインレセプターＣＣＲ−５（以下、ＣＣＲ−５とする）について、簡単に説明する。
【００４０】
ＣＣＲ−５は、エイズウイルスＨＩＶ−１のコレセプターであり、ＨＩＶ−１エンベロープにコンフォメーション変化をもたらし、ウイルスと宿主細胞との膜融合を導くと考えられることから、ＨＩＶ−１がヒトに感染する際の重要な要素である。欠損変異型ＣＣＲ−５遺伝子を持つヒトは、ＨＩＶ−１の感染・発症に抵抗性を示す。
【００４１】
また、ＣＣＲ−５は、ヒトからヒトへの感染に関与するＨＩＶ−１のマクロファージ指向性株の感染においてコレセプターとして用いられる唯一のものである。このことから、ＣＣＲ−５の機能を抑制させることがＨＩＶ感染の予防、病気進行の阻止につながると期待されている。
【００４２】
上述の２つの抗体酵素は、このＣＣＲ−５を完全に分解し、その機能を消失させることができる。欠損変異型ＣＣＲ−５遺伝子を持つヒトには、明らかな免疫不全や組織病変はなく、健康上何ら問題は見られないことから、ＣＣＲ−５の機能を消失させる上記抗体酵素は、ＨＩＶ感染を予防したり、エイズの症状の進行を抑えたりする抗ＨＩＶ薬剤として有効に活用できると考えられる。
【００４３】
続いて、上記ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌの構造について、以下に詳細に説明する。ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌは、ＣＣＲ−５の細胞外領域ペプチドを免疫原とするモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２の軽鎖の可変領域であり、配列番号１に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。
【００４４】
図１には、軽鎖と重鎖からなるＥＣＬ２Ｂ−２の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行った結果、推定された立体構造を模式的に示す。図１においては、軽鎖をＬで示し、重鎖をＨで示している。図１に示すように、配列番号１に示すアミノ酸配列において、第１番目のアスパラギン酸（図１では、カバット（ＫＡＢＡＴ）の分類によって、Ａｓｐ１と記す）、第２８番目のセリン（図１では、カバットの分類によって、Ｓｅｒ２７ａと記す）、第９８番目のヒスチジン（図１では、カバットの分類によって、Ｈｉｓ９３と記す）、あるいは上記第９８番目のヒスチジンの代わりとして、第３１番目のヒスチジン（図１では、カバットの分類によって、Ｈｉｓ２７ｄと記す）が触媒三つ組残基を構成していると推測される。
【００４５】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、即ち、上記ＨＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌの変異体であり、ＣＣＲ−５の分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＣ末端側にＥＣＬ２Ｂ−２抗体Ｌ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよい。
【００４６】
なお、ＥＣＬ２Ｂ−２の重鎖の可変領域は、配列番号３に示すアミノ酸配列を一次構造として有しているが、このＥＣＬ２Ｂ−２の重鎖には、触媒三つ組残基と推測される構造は存在しなかった。また、このＥＣＬ２Ｂ−２の重鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号４として併せて記載する。
【００４７】
次に、上記ＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌの構造について、以下に詳細に説明する。ＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌは、ＣＣＲ−５の細胞外領域ペプチドを免疫原とするモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖の可変領域であり、配列番号５に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。
【００４８】
図２には、軽鎖と重鎖からなるＥＣＬ２Ｂ−３の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行った結果、推定された立体構造を模式的に示す。図２においては、軽鎖をＬで示し、重鎖をＨで示している。図２に示すように、配列番号５に示すアミノ酸配列において、第８６番目のアスパラギン酸（図２では、カバット（ＫＡＢＡＴ）の分類によって、Ａｓｐ８２と記す）、第１４番目のセリン（図２では、カバットの分類によって、Ｓｅｒ１４と記す）、あるいは上記第１４番目のセリンの代わりとして、第６７番目のセリン（図２では、カバットの分類によって、Ｓｅｒ６３と記す）、第８０番目のヒスチジン（図２では、カバットの分類によって、Ｈｉｓ７６と記す）が触媒三つ組残基を構成していると推測される。
【００４９】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号５に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、即ち、上記ＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌの変異体であり、ＣＣＲ−５の分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号５に示すアミノ酸配列のＣ末端側にＥＣＬ２Ｂ−３抗体Ｌ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよい。
【００５０】
なお、ＥＣＬ２Ｂ−３の重鎖の可変領域は、配列番号７に示すアミノ酸配列を一次構造として有しているが、このＥＣＬ２Ｂ−３の重鎖には、触媒三つ組残基と推測される構造は存在しなかった。また、このＥＣＬ２Ｂ−３の重鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号８として併せて記載する。
【００５１】
本発明に係る遺伝子は、上記抗体酵素をコードする遺伝子であり、より具体的には、配列番号２に示す塩基配列からなるもの、あるいは、配列番号６に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子は、ＥＣＬ２Ｂ−２のＬ鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列の一つであり、配列番号６に示す塩基配列からなる遺伝子は、ＥＣＬ２Ｂ−３のＬ鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列の一つである。
（１−２）本発明の抗体酵素の他の例
続いて、本発明の抗体酵素の他の例として、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−４の抗体断片を例に挙げて説明する。上記ＥＣＬ２Ｂ−４の抗体断片とは、より具体的には、ＥＣＬ２Ｂ−４の軽鎖の可変領域（すなわち、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌ）、および、ＥＣＬ２Ｂ−４の重鎖の可変領域（すなわち、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈ）である。
【００５２】
この２つの抗体酵素も、上述のＥＣＬ２−３−Ｌなどと同様に、ケモカインレセプターＣＣＲ−５の細胞外領域を構成するペプチドを免疫原として用いて取得されるモノクローナル抗体から得られたものである。そして、上記抗体酵素は、上記モノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列を分子モデリングすることによってその立体構造を推定した結果、セリン、ヒスチジン（又はグルタミン酸）、アスパラギン酸からなる触媒三つ組残基を構成できるアミノ酸配列（抗体断片）として探し出されたものである。
【００５３】
抗体酵素ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈも、後述の実施例に示すように、ケモカインレセプターＣＣＲ−５の細胞外領域ペプチド（配列番号１３示すアミノ酸配列からなるペプチド）を分解するため、ケモカインレセプターＣＣＲ−５の分解酵素として作用する。
【００５４】
つまり、上述の２つの抗体酵素も、このＣＣＲ−５を完全に分解し、その機能を消失させることができる。それゆえ、上記抗体酵素は、ＨＩＶ感染を予防したり、エイズの症状の進行を抑えたりする抗ＨＩＶ薬剤として有効に活用できると考えられる。
【００５５】
続いて、上記ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌの構造について、以下に詳細に説明する。ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌは、ＣＣＲ−５の細胞外領域ペプチドを免疫原とするモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２の軽鎖の可変領域であり、配列番号９に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。
【００５６】
図５には、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌの可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行った結果、推定された立体構造を模式的に示す。図５に示すように、配列番号９に示すアミノ酸配列において、第１番目のアスパラギン酸（図５では、カバット（ＫＡＢＡＴ）の分類によって、Ｄ１と記す）、第２８番目のセリン（図５では、カバットの分類によって、Ｓ２６と記す）、第３１番目のヒスチジン（図５では、カバットの分類によって、Ｈ２７ｄと記す）が触媒三つ組残基を構成していると推測される。なお、上記第３１番目のヒスチジンの代わりとして、第９８番目のヒスチジン（図５では、カバットの分類によって、Ｈ９３と記す）でもよい。また、上記第３１番目のセリンの代わりとして、第２８番目（図５では、Ｓ２７ａと記す）、第３２番目（図５では、Ｓ２７ｅと記す）、第９７番目（図５では、Ｓ９２と記す）の何れかであってもよい。
【００５７】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号９に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、即ち、上記ＨＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌの変異体であり、ＣＣＲ−５の分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号１０に示すアミノ酸配列のＣ末端側にＥＣＬ２Ｂ−４抗体Ｌ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよい。
【００５８】
次に、上記ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈの構造について、以下に詳細に説明する。ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈは、ＣＣＲ−５の細胞外領域ペプチドを免疫原とするモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−４の重鎖の可変領域であり、配列番号１１に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。
【００５９】
図６には、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈの可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行った結果、推定された立体構造を模式的に示す。図６に示すように、配列番号１１に示すアミノ酸配列において、第９２番目のアスパラギン酸（図６では、カバット（ＫＡＢＡＴ）の分類によって、Ｄ８６と記す）、第６５番目のセリン（図６では、カバットの分類によって、Ｓ６０と記す）、第４８番目のグルタミン酸（図６では、カバットの分類によって、Ｅ４６と記す）が触媒三つ組残基を構成していると推測される。なお、上記第９２番目のアスパラギン酸の代わりとして、第６４番目のアスパラギン酸（図６では、カバットの分類によって、Ｄ５９と記す）であってもよい。また、上記第６５番目のセリンの代わりとして、第９０番目のセリン（図６では、Ｓ８４と記す）であってもよい。また、上記第４８番目のグルタミン酸の代わりとして、第９１番目のグルタミン酸（図６では、Ｅ８５と記す）であってもよい。
【００６０】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、即ち、上記ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈの変異体であり、ＣＣＲ−５の分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号１１に示すアミノ酸配列のＣ末端側にＥＣＬ２Ｂ−４抗体Ｈ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよい。
【００６１】
本発明に係る遺伝子は、上記抗体酵素をコードする遺伝子であり、より具体的には、配列番号１０に示す塩基配列からなるもの、あるいは、配列番号１２に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号１０に示す塩基配列からなる遺伝子は、ＥＣＬ２Ｂ−４のＬ鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列の一つであり、配列番号１２に示す塩基配列からなる遺伝子は、ＥＣＬ２Ｂ−４のＨ鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列の一つである。
【００６２】
（２）本発明に係る抗体酵素の取得方法について
本発明に係る抗体酵素が、ＥＣＬ２Ｂ−３のＬ鎖全長や、ＥＣＬ２Ｂ−３のＬ鎖全長、あるいは、ＥＣＬ２Ｂ−４のＬ鎖全長や、ＥＣＬ２Ｂ−４のＨ鎖全長などのように、ＣＣＲ−５の抗体のＬ鎖の全長である場合には、従来公知の抗体取得方法を利用して、該当するＣＣＲ−５のモノクローナル抗体を取得し、Ｈ鎖とＬ鎖を分離すればよい。また、本発明に係る抗体酵素が、ＣＣＲ−５の抗体断片である場合には、先ず該当するモノクローナル抗体を取得し、その後、上記モノクローナル抗体を適当なプロテアーゼを用いて目的とする抗体断片が得られるように切断すればよい。
【００６３】
また、上述のＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈなどのようにそのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子配列が明らかとなっている抗体酵素については、従来公知の遺伝子組み換え技術などを用いて取得することができる。この場合、上記抗体酵素をコードする遺伝子をベクターなどに組み込んだ後、発現可能に宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されたペプチドを精製するという方法などを採用することができる。なお、大量発現させることができる適当なプロモーターとともに上記抗体酵素をコードする遺伝子を組み込めば、目的とする抗体酵素を効率よく取得できる可能性がある。
【００６４】
上記抗体酵素のアミノ酸配列が明らかでない場合には、先ずモノクローナル抗体産生細胞やそのハイブリドーマなどからｍＲＮＡを取得し、当該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成しその遺伝子配列を読み取る。その後、その遺伝子配列からアミノ酸配列を推定し、分子モデリングによって３次元構造を予測して触媒三つ組残基様構造が含まれているか否かを確認すればよい。そして、上記触媒三つ組残基様構造が含まれている抗体断片を抗体酵素として取得することができる。
【００６５】
また、本発明に係る抗体酵素をコードする遺伝子については、その塩基配列が明らかとなっているものの場合には、そのｃＤＮＡ（あるいはゲノムＤＮＡ）を取得した後、それを鋳型として適当なプライマーを用いてＰＣＲを行い、該当する領域を増幅させることで取得することができる。また、部位特異的突然変異誘発法を利用して、配列番号２、６、１０、または１２に示す塩基配列からなる遺伝子に適当な変異を導入すれば、それを導入した形質転換体においては、配列番号１、５、９、１１に示すアミノ酸配列からなる抗体酵素の変異体が翻訳産物としてそれぞれ得られる。
【００６６】
（３）本発明の抗体酵素の利用方法について
これまでに、ＣＣＲ−５の働きを抑制する作用をもつ抗ＨＩＶ薬剤は開発されてきたが、本発明の抗体酵素は、これらの抗ＨＩＶ薬剤とは全く異なる手法に基づいて、ＣＣＲ−５を直接攻撃して機能を消失させることができる。そのため、この抗体酵素は抗ＨＩＶ薬剤として利用することができる。
【００６７】
当該抗体酵素を含む抗ＨＩＶ薬剤は、ＣＣＲ−５を酵素的に完全に分解してその機能を消失させるという、新しい作用機構でＨＩＶの感染を阻害したり、エイズの発症を抑制したりすることができる。そして、このような抗ＨＩＶ薬剤は、ＣＣＲ−５分子だけを特異的に狙って分解するため、顕著な効果が期待できるととともに副作用も少ないと考えられる。また、当該抗体酵素の反応機構から考えると、現在使用されている他の抗ＨＩＶ薬剤と併用することによって、エイズに対する治療効果がより向上することが期待できる。
【００６８】
さらに、本発明の抗体酵素は、それをコードする遺伝子を適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することに利用できる。即ち、本発明に係る形質転換体は、上記抗体酵素をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、遺伝子が対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。この形質転換体は、自身の体内で上記抗体酵素を発現させることができる。
【００６９】
本発明に係る形質転換体としてより具体的には、配列番号２または配列番号６（配列番号１０または配列番号１２でもよい）に示す塩基配列からなる遺伝子が宿主細胞に導入されたものを挙げることができる。上記宿主細胞としては、大腸菌、酵母、バキュロウイルスなど、通常使用しているもの適宜用いることができる。
【００７０】
上記形質転換体は、自身の体内でＣＣＲ−５を特異的に認識して完全に分解し、その機能を消失させることができるため、抗ＨＩＶ薬剤として利用することができる。また、上記抗体酵素を大量発現できるような形質転換体であれば、ＨＩＶの感染の予防や、エイズの症状の治療を効率よく行うことができると考えられ、より有効な抗ＨＩＶ薬剤を得ることができる可能性がある。
【００７１】
なお、本実施の形態において説明した図４（ａ）、図４（ｂ）、図８（ａ）、図８（ｂ）、図１３、図１５、図１７、図２３、図２４、図４１、図４２、に示す各抗体酵素のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号は、カバットの分類による番号であるため、それに該当する各配列番号に示すアミノ酸の番号とは異なっている。
【００７２】
【実施例】
本発明の実施例について、実験１から実験９として以下に説明する。
【００７３】
〔実験１〕（ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３抗体の作製）
モノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２およびＥＣＬ２Ｂ−３が、ＣＣＲ−５の細胞外領域を構成する２０個のアミノ酸からなる部分ペプチド（ＲＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱＴＬＫ：配列番号１３）を免疫原に用いて作製された。
【００７４】
先ず、上記部分ペプチドのＣ末端にグリシンとシステイン残基が、Keyhole Limpet Hemocyanin（ＫＬＨ）と共役させるために導入された。なお、実際のＣＣＲ−５ペプチドにおいては、上記部分ペプチドのＮ末端はシステイン残基であるが、本実験に使用するペプチドはアルギニン残基に置き換えられている。上記ペプチドおよびそのペプチドのＫＬＨとの結合体は、タカラ酒造製のものを使用した。
【００７５】
ＫＬＨと結合したペプチドは、Balb/cマウスへ免疫された。第１および第２免疫は、Freundの完全免疫賦活剤を使用して、２週間間隔で実施された。第３免疫は、Freundの不完全免疫賦活剤を使用して第２免疫後４週間経過時に実施された。最終のブースター（追加免疫）は、第３免疫から６週間後に実施された。最終のブースターから３日後に、Balｂ/cマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞（SP/NSI/l-Ag4-1（NS-1）との細胞融合が実施され、その後ＨＡＴ選択とスクリーニングが行われた。クローニングが２度実施された後、モノクローナル抗体（ＥＣＬ２Ｂ−２およびＥＣＬ２Ｂ−３；IgG_l（ｋ））を分泌する細胞系が確立された。
【００７６】
〔実験２〕（抗体サブユニットの精製と分離）
ＥＣＬ２Ｂ−２およびＥＣＬ２Ｂ−３は、Bio-Rad Protein A MAPS-II kit（日本BIO-RAD製）の精製マニュアルに基づいて精製された。
【００７７】
先ず、ＥＣＬ２Ｂ−３およびＥＣＬ２Ｂ−３を含む腹水が、同体積の硫酸アンモニウム飽和水溶液と混合された。その沈殿は遠心分離によって回収され、その後沈殿には５ｍｌのＰＢＳが加えられた。この工程は２回繰り返され、その後、ＰＢＳに対する透析が２度実施された。ＥＣＬ２Ｂ−２あるいはＥＣＬ２Ｂ−３を含む一定分量のＰＢＳ溶液が、同体積の結合バッファーMAPS-IIと混合された後、混合物はAffi-Gel（プロテインＡ）が詰まった基盤上に置かれ、結合した抗体の溶出が行われた。溶出した抗体は、５０ｍＭ Tris/0.15ＭＮａＣｌ（ｐＨ＝８．０）緩衝液（４℃）で２回透析された。その結果得られた抗体は、Centriprep10（Amicon、MA、USA）を使用して、３回限外濾過された。５ｍｇの抗体は、５０ｍＭ Trisと０．１５ＭＮａＣｌとからなる緩衝液（ｐＨ８．０）２．７ｍｌに溶解され、０．３ｍｌの２Ｍ２−メルカプトエタノールが加えられて、１５℃で３時間還元された。
【００７８】
その溶液には３ｍｌの０．６Ｍヨードアセトアミドが加えられた。その後１Ｍ TrisによってｐＨ＝８に調製された。そして、その溶液は１５℃で１５分間インキュベートされた。その結果得られた溶液は、０．５ｍｌに限外濾過されたのち、サンプルの半量が、溶離液として６Ｍグアニジン塩酸塩（ｐＨ＝６．５）用いた流速０．２ｍｌ／minのＨＰＬＣ（カラム：Protein-Pak300、7.8×300ｍｍ、Nippon Waters製）にかけられた。軽鎖および重鎖のフラクションがそれぞれ集められ、その後６Ｍグアニジン塩酸塩で希釈された。これらは、３〜４日間に7回バッファー交換が行われながら、４℃のＰＢＳに対して透析された。
【００７９】
上記の実験で作製された抗体ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３は、以下の実験３、実験４によって同定・定量された。
【００８０】
〔実験３〕（ＥＬＩＳＡ法によるイムノアッセイ）
PBS溶液（５μｇ／ｍｌ）に溶解されたＣＣＲ−５の部分ペプチド（ＲＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱＴＬＫＧ（配列番号１５に示す）：前述の実験１において使用したＣＣＲ−５部分ペプチドのＣ末端のシステイン残基を欠いて合成されたもの。以下、このペプチドをECL2Bペプチドと呼ぶ）５０μｌは、免疫プレート（Nunc製）に固定された。ブロッキングが、２％ゼラチンを使用して室温で実施された。上記プレートを洗浄した後、ＥＣＬ２Ｂ−２あるいはＥＣＬ２Ｂ−３は免疫反応され、その後アルカリフォスファターゼと結合した抗マウスIg（G+A+M）との反応が実施された。基質反応後、免疫プレートリーダー（InterMed NJ-2001製）を使用して、４０５ｎｍの吸光度が測定された。
【００８１】
本実験におけるイムノアッセイの結果、得られたモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２およびＥＣＬ２Ｂ−３のクラスおよびサブクラスは、IgG₁（κ）であった。上記のモノクローナル抗体は、ＫＬＨ、ＨＡＳ、ＯＶＡ、ヒトヘモグロビンなどの他のタンパク質と交差反応をしなかった。さらに、上記のモノクローナル抗体は、HIV-1のgp120 V3環状ペプチド(CTRPNNNTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHC：配列番号１６)、gp41の保持領域のペプチドTP41-1(HIV-1/TPRGPDRPEGIEEEGGERDRD：配列番号１７)、RT-2 (KLLRGTKALTFVIPLTEEAE：配列番号１８)、41S-2mAb CDRL-1 (RSSKSLLYSNGNTYLY：配列番号１９)、1D3 mAb CDRH-2 (DKFNQNYSTAGNYPNIR：配列番号２０)、CA-2 (RSSKSLLYSNGNTYLYGPDKFNQNYSTAGNYPNIR：配列番号２１)などのペプチドとは反応しなかった。
【００８２】
〔実験４〕（ＨＰＬＣ解析および質量分析）
触媒反応をモニターするために、実験３で得られた反応液２０μｌが、温度４０℃、１３％アセトニトリル／０．０８％ＴＦＡの定組成条件下、流速０．５ｍｌ／minの逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ（カラム：Waters Puresil C₁₈カラム（4.6×150ｍｍ：Waters NY製、HPLC：Jasco製）に注入された。その結果、抗体ペプチドの純度は９０％以上であった。
【００８３】
抗体ペプチドは、MALDI-TOF-MASS（Bruker Ltd.製、AUTOFLEX）を使用して同定された。その結果、その質量は理論上のイオン分布と同じであった。同じ質量スペクトル条件は、ＥＣＬ２Ｂ−２およびＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖による触媒反応において見られる断片の同定に適用された。
【００８４】
〔実験５〕（ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３抗体の配列決定および分子モデリング）
ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３抗体のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ精製キット（Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.製）を使用して、ＥＣＬ２Ｂ−２あるいはＥＣＬ２Ｂ−３を有するハイブリドーマから単離された。その後、軽鎖および重鎖のｃＤＮＡは、一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Life Science Inc.製）によって合成された。
【００８５】
配列決定は、Auto Read Sequencing Kit（Amersham Pharmacia Biotech製）およびＤＮＡ自動シークエンサー（ＡＬＦ II、Amersham Pharmacia Biotech製）を使用して実施された。３次元分子構造の構築のためのコンピュータ解析（分子モデリング）は、ワークステーション（Silicon Graphics Inc.製）およびAbMのソフトウエア（Oxford Molecular Ltd.製）によって実施された。
【００８６】
結果として得られたPDBデータは、ソフトウエアDiscover II（Molecular Simulations Inc.製）を使用して、トータルエネルギーが最小となるようにして適用された。構造を図式化するために、Protein Adviser Ver. 3.5（ＦＱＳ Ltd.製）のソフトウエアが使用された。
【００８７】
以上のような方法で、モノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２およびＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖および重鎖の可変領域のアミノ酸配列、およびそれをコードするｃＤＮＡの配列が決定された。
【００８８】
配列番号１に示すアミノ酸配列が、ＥＣＬ２Ｂ−２軽鎖のアミノ酸配列であり、配列番号２に示す塩基配列が、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列である。配列番号３に示すアミノ酸配列が、ＥＣＬ２Ｂ−２重鎖のアミノ酸配列であり、配列番号４に示す塩基配列が、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列である。配列番号５に示すアミノ酸配列が、ＥＣＬ２Ｂ−３軽鎖のアミノ酸配列であり、配列番号６に示す塩基配列が、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列である。配列番号７に示すアミノ酸配列が、ＥＣＬ２Ｂ−３重鎖のアミノ酸配列であり、配列番号８に示す塩基配列が、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列である。
【００８９】
ＥＣＬ２Ｂ−２およびＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖の配列はともに、生殖系列ｂｄ２において最高のスコアを示した。
【００９０】
次に、配列決定された各アミノ酸配列を基にして、分子モデリングが行われた。図１には、分子モデリングによって推定されたＥＣＬ２Ｂ−２の可変領域の３次元構造を示す。また、図２には、分子モデリングによって推定されたＥＣＬ２Ｂ−３の可変領域の３次元構造を示す。
【００９１】
ＥＣＬ２Ｂ−２の軽鎖（ECL2B-2-L）において、Asp¹（あるいは、Asp^27d）、Ser^27a、His⁹³という３つのアミノ酸残基は、分子構造中で触媒三つ組残基を形成することができると推定された（図１参照）。
【００９２】
トリプシン、トロンビン、プラスミンなどの多くのセリンプロテアーゼは、ペプチド結合を切り離す活性部位にAsp、Ser、Hisからなる触媒三つ組残基構造を有する。抗原性の血管作用腸ペプチド（VIP）を分解することのできる天然の抗体酵素VIPaseの軽鎖（VIPase-L）は、その構造中に、Asp¹（FR-1内）、Ser^27a（CDR１内）、His⁹³（CDR3内）という３つのアミノ酸残基を有していると報告されている［参考文献１：S. Paul et. al., J. Biol. Chem. 269 （1994年）、32389頁］。また、本願発明者らは、モノクローナル抗体i41SL1-2の軽鎖であるi41SL1-2-Lが、同じAsp¹、Ser^27a、His⁹³からなる触媒三つ組残基を有し、その抗原であるCDRL-1ペプチドを分解する酵素活性を示すということをすでに報告している[参考文献２：Y. Zhou, E. Hifumi, H. Kondo, T. Uda, Biological Systems Engineering, ACS symposium Series 830, 200-208頁（2002年）、および、参考文献３：T. Uda and E. Hifumi, Proceedings of International Symposium on Nano-Intelligent Materials/System, pp47-52,（2002年、Tokyo）]。
【００９３】
図３には、i41SL1-2-L（図３ではi41S2-Lと記す）、VIPase-L（図３ではVIPと記す）、ECL2B-2-L（図３ではECL2B(L)と記す）におけるアミノ酸配列の比較を示す。図３では、各配列において触媒三つ組残基を構成しているアミノ酸を四角枠で囲んでいる。図３に示すように、ECL2B-2-Lは、VIPase-L、および、i41SL1-2-Lと同じ位置に３つのアミノ酸残基を有していることが確認された。これらは同じ生殖系列ｂｄ２に属しているため、これらの配列の相同性はとても高い。
【００９４】
なお、VIPase-Lは、部位特異的変異によって、Asp¹、Ser^27a、His⁹³からなる触媒三つ組残基が活性部位であることが報告されている［参考文献１］。このことからも、ECL2B-2-Lは抗原性ペプチドＣＣＲ−５を分解する触媒活性を有していることが予想される。
【００９５】
一方、ECL2B-3の軽鎖（ECL2B-3-L）は、Ser¹⁴（あるいは、Ser⁶³）、His⁷⁶、Asp⁸²、というやや異なるタイプの触媒三つ組残基を有しているように推定された（図２参照）。
【００９６】
続いて、触媒三つ組残基を構成する残基間の距離が確認された。分子モデリングでは、Ｘ線構造解析とは異なり、原子間の正確な距離を決定できないので、残基内のα炭素の距離が、触媒三つ組残基を構成する残基間のおおよその距離として見積もられた。そのデータを、他の天然の抗体酵素のデータとともに表１に示す。
【００９７】
【表１】

【００９８】
表１に示すように、His（Ｃα）とSer（Ｃα）との距離は、酵素（トリプシンやトロンビン）や天然の抗体酵素（41S-2-L、41S-2-H、i41SL1-2-L、i41-7-L）に匹敵するものであった。一方、41S-2-H、i41SL-2-H、i41-7-Hは、約４Å前後と小さかった。
【００９９】
HisとAspとのα炭素の距離に関しては、やや異なる特徴を示した。トリプシン、トロンビン、i41SL1-2-L、i41SL1-2-Hは、ほとんど同じ距離であり、それ以外のものについては２〜５Åよりも長い距離であった。41S-2-L、41S-2-H、i41SL1-2-H、i41-7-Hなどの抗体サブユニットは、セリンプロテアーゼのような触媒活性を示した。この事実から、ECL2B-2-L、ECL2B-3-Lは、セリンプロテアーゼのような触媒活性を有すると予想される。
【０１００】
続いて、ECL2B-L、ECL2B-3の酵素活性を確認するためのペプチド分解試験が以下のようにして行われた。
【０１０１】
〔実験６〕（ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３抗体の酵素活性試験）
モノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３による抗原性ペプチドECL2Bの分解反応実験を実施するに先立って、ほぼ全てのガラス器具およびプラスチック器具、緩衝溶液が、加熱（１８０℃、２時間）、オートクレーブ（１２１℃、２０分間）あるいは、０．２μｍの滅菌フィルターを通すことによって殺菌された。この実験における操作は、空気中の異物のコンタミネーションを防止するために、安全キャビネット内で実施された。分解反応は２５℃の７．５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５）中で実施された。反応をモニタリングするために、２０μｌの反応液がカラム温度４０℃、定組成条件下のＲＰ−ＨＰＬＣ（Jasco製）に注入された。
【０１０２】
先ず、モノクローナル抗体ECL2B-2およびECL2B-3の軽鎖（ECL2B-2-L、ECL2B-3-L）を用いて、抗原性ペプチド（ECL2Bペプチド：ＲＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱＴＬＫＧ（配列番号１５））の触媒分解試験が実施された。
【０１０３】
精製されたECL2B-2-L（０．８μＭ）、あるいはECL2B-3-L（０．８μＭ）を含む溶液５００μｌは、滅菌試験管内で、２５℃で、同体積の１２０μＭ ECL2Bペプチドを含む溶液と混合された。ECL2Bペプチドのタイムコースは、RP-HPLCを使用してモニタリングされた。なお、比較のために、ECL2B-ペプチドの代わりにペプチドＢを基質として用いたものについても同様に実験を行った。
【０１０４】
その結果を図４のグラフに示す。図４のグラフでは、横軸に反応時間（時間）を、縦軸に基質であるECL2Bペプチドの濃度（μＭ）を示す。
【０１０５】
ECL2B-2-Lを用いた場合（図４において、●で示す）、ECL2Bペプチドの分解は、ECL2B-2-LとECL2Bペプチドを混合した後、約８０時間の誘導時間を経た後に開始し、ECL2Bペプチドの濃度は急激に減少した。なお、この種の誘導時間は、多くの反応においてよく見られるものである。ECL2Bペプチドは、混合後約９０時間以内で完全に消失した。
【０１０６】
また、ECL2B-3-Lを使用し場合（図４において▲で示す）は、ECL2Bペプチドの分解は、ECL2B-3-LとECL2Bペプチドの混合した後、約１９０時間というより長い誘導時間を経て開始した。ECL2Bペプチドは、誘導時間経過後約２５０時間以内で、急激に分解された。なお、ペプチドＢについて同様の実験を行った場合（図４において■で示す）は、そのペプチドは分解されなかった。
続いて、酵素としてECL2B-2-Lを用いた場合の得られる分解生成物を、MALDI-TOF-MASSによって解析した。その結果、ECL2Bペプチド由来の多種のペプチド断片を確認した。分解の初期段階では、ＲＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱやＲＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷのような比較的長いペプチドが観察された。分解反応の最終段階（配列番号１５に示すペプチドが、反応系から消失する段階）においては、ＲＳＳＨＦＰＹＳ、ＲＳＳＨＦＰＹ、ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱ、ＳＳＨＦＰＹＳＱ、ＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮ、ＹＳＱＹＱＦＷＫＮ、ＹＳＱＹＱなどの多くの小さなペプチドが生成されたことが確認された。上記の多くのペプチド断片が生成されたことから、ECL2B-2-LあるいはECL2B-3-Lは、抗原性ペプチドＲＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱＴＬＫＧを連続的に分解することができたと言える。
【０１０７】
既に述べたように、ECL2B-2-Lにおいて触媒三つ組残基を形成する３つの残基は、VIPaseやi41SL1-2-Lの３つの触媒三つ組残基と同一の場所に位置する。この一貫性は、ECL2B-2の軽鎖（ECL2B-2-L）が、抗原性ペプチド（ECL2Bペプチド）を触媒的に分解する能力を有していることを示唆する。
【０１０８】
以上の結果から、ECL2B-2-LおよびECL2B-3-Lは、CCR-5の細胞外領域を構成するペプチドを完全に分解することのできる抗体酵素であることが確認された。
【０１０９】
なお、上述の実験と同じ条件の下で、モノクローナル抗体ECL2B-2、ECL2B-3の重鎖（ECL2B-2-HおよびECL2B-3-H）に対する実験が行われた。しかしながら、これらの重鎖はともに抗原性ペプチドECL2Bを分解しなかった。すなわち、質量分析において、どのようなペプチド断片も検出されなかった。
【０１１０】
また、可変領域以外の領域も含む完全なモノクローナル抗体ECL2B-2を用いた抗原性ペプチドの分解実験が、上述の実験と同じ条件下で実施された。しかしながら、この場合もCCR-5の部分ペプチドであるECL2Bペプチドは全く分解されなかった。
【０１１１】
〔実験７〕（ＥＣＬ２Ｂ−４抗体の作製および抗体サブユニットの精製）
実験１と同様の方法で、モノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−４が、ＣＣＲ−５の細胞外領域を構成する２０個のアミノ酸からなる部分ペプチド（配列番号１３参照）を免疫原に用いて作製された。
【０１１２】
続いて、実験２と同様の方法で、ＥＣＬ２Ｂ−４が精製された。本実験で精製された抗体ＥＣＬ２Ｂ−４は、実験３と同様の方法によって同定・定量された。
【０１１３】
〔実験８〕（ＥＣＬ２Ｂ−４抗体の配列決定および分子モデリング）
実験５と同様の方法で、ＥＣＬ２Ｂ−４の軽鎖および重鎖の可変領域のアミノ配列決定、および、それをコードするｃＤＮＡの配列決定が実施された。その後、決定されたアミノ酸配列に基づく分子モデリングが行われた。その結果を以下に示す。
【０１１４】
配列番号９に示すアミノ酸配列が、ＥＣＬ２Ｂ−４軽鎖のアミノ酸配列であり、配列番号１０に示す塩基配列が、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列である。配列番号１１に示すアミノ酸配列が、ＥＣＬ２Ｂ−４重鎖のアミノ酸配列であり、配列番号１２に示す塩基配列が、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列である。
【０１１５】
また、図７には、ＥＣＬ２Ｂ−４軽鎖のアミノ酸配列、および、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列を併記するとともに、可変領域（ＣＤＲ−１〜ＣＤＲ−３）を示す。図８には、ＥＣＬ２Ｂ−４重鎖のアミノ酸配列、および、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列を併記するとともに、可変領域（ＣＤＲ−１〜ＣＤＲ−３）を示す。
【０１１６】
次に、配列決定された各アミノ酸配列を基にして、分子モデリングが行われた。図５には、分子モデリングによって推定されたＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌの可変領域の３次元構造を示す。また、図６には、分子モデリングによって推定されたＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈの可変領域の３次元構造を示す。
【０１１７】
ＥＣＬ２Ｂ−４の軽鎖（ECL2B-4-L）において、Ｓ２６（あるいは、Ｓ２７ａ、Ｓ２７ｅ、Ｓ９２の何れか）、Ｈ２７ｄ（あるいは、Ｈ９３）、Ｄ１という３つのアミノ酸残基が、分子構造中で触媒三つ組残基を形成することができると推定された（図５参照）。
【０１１８】
また、ＥＣＬ２Ｂ−４の重鎖（ECL2B-4-H）においては、Ｓ６０（あるいは、Ｓ８４）、Ｅ４６（あるいは、Ｅ８５）、Ｄ５９（あるいは、Ｄ８６）という３つのアミノ酸残基が、分子構造中で触媒三つ組残基を形成することができると推定された（図６参照）。
【０１１９】
続いて、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈの酵素活性を確認するためのペプチド分解試験が以下のようにして行われた。
【０１２０】
〔実験９〕（ＥＣＬ２Ｂ−４抗体の酵素活性試験）
実験６と同様の方法で、ＥＣＬ２Ｂ−４−ＬおよびＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈについて酵素活性試験を実施した。
【０１２１】
先ず、ＥＣＬ２Ｂペプチド（配列番号１５）の分解反応が、２５℃の１５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５）中で実施された。反応をモニタリングするために、２０μｌの反応液がカラム温度４０℃、定組成条件下のＲＰ−ＨＰＬＣ（Jasco製）に注入された。
【０１２２】
この分解反応の反応液として、以下の▲１▼〜▲５▼が作製された。
▲１▼ECL2B-4(L)0.8μM+ECL2B ペプチド：50μM：800μl作製
▲２▼ECL2B-4(H)0.4μM+ ECL2B ペプチド：50μM：800μl作製
▲３▼ECL2B ペプチド：50μM：500μl作製
▲４▼ECL2B-4(L)：0.8μM：300μl作製
▲５▼ECL2B-4(H)：0.4μM：300μl作製
その結果を図９〜図１１に示す。図９のグラフでは、横軸に反応時間（時間）を、縦軸に基質であるECL2Bペプチドの濃度（μＭ）を示す。また、図１０（ａ）〜（ｃ）には、ＨＰＬＣを使用してモニタリングされた結果を示す。また、図１１には、この酵素分解実験における速度論的解析結果を示す。図１１（ａ）は、基質（ＥＣＬ２Ｂペプチド）濃度と分解速度との関係を示すグラフであり、図１１（ｂ）は、Hanes-Woolfプロットの結果を示すグラフである。
【０１２３】
そして、上記Hanes-Woolfプロットを用いて算出したＶmax、Ｋｍ、kcat、kcat/Km値（平均プロット）を以下の表２に示す。
【０１２４】
【表２】

【０１２５】
これらの結果から、ＥＣＬ２Ｂ−４−ＬおよびＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈは、ECL2Bペプチドの分解反応における酵素活性を有することが確認された。それゆえ、ECL2B-4-LおよびECL2B-4-Hは、CCR-5の細胞外領域を構成するペプチドを狙って、完全に分解することのできる抗体酵素であることが確認された。
【０１２６】
続いて、ＥＣＬ２Ｂ−４−ＬおよびＥＣＬ２Ｂ−４−ＨのTP41-1ペプチド（配列番号１７）に対する酵素活性試験を実施した。この分解反応は、２５℃の１５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５）中で実施された。反応をモニタリングするために、２０μｌの反応液がカラム温度４０℃、定組成条件下のＲＰ−ＨＰＬＣ（Jasco製）に注入された。
【０１２７】
この分解反応の反応液として、以下の▲１▼〜▲５▼が作製された。
▲１▼ECL2B-4(L)0.8μM+TP41-1 ペプチド：120μM：800μl作製
▲２▼ECL2B-4(H)0.4μM+TP41-1 ペプチド：120μM：800μl作製
▲３▼TP41-1 ペプチド：120μM：500μl作製
▲４▼ECL2B-4(L)：0.8μM：300μl作製
▲５▼ECL2B-4(H)：0.4μM：300μl作製
その結果を図１２〜図１４に示す。図１２のグラフでは、横軸に反応時間（時間）を、縦軸に基質であるECL2Bペプチドの濃度（μＭ）を示す。また、図１３（ａ）〜（ｃ）には、ＨＰＬＣを使用してモニタリングされた結果を示す。また、図１４には、この酵素分解実験における速度論的解析結果を示す。図１４（ａ）は、基質（TP41-1ペプチド）濃度と分解速度との関係を示すグラフであり、図１４（ｂ）は、Hanes-Woolfプロットの結果を示すグラフである。
【０１２８】
そして、上記Hanes-Woolfプロットを用いて算出したＶmax、Ｋｍ、kcat、kcat/Km値（平均プロット）を以下の表３に示す。
【０１２９】
【表３】

【０１３０】
これらの結果から、ＥＣＬ２Ｂ−４−ＬおよびＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈは、TP41-1ペプチドの分解反応においても低い酵素活性を有することが確認された。また、表２と表３とを比較すれば分かるように、ECL2B-4-Lは、本来の抗原であるECL2Bペプチドの方をTP41ペプチドよりも速く分解していることが実験によって示され、ECL2B-4-Lが確かにECL2Bに対する抗体酵素であることが証明された。
【０１３１】
【発明の効果】
エイズウイルスがヒトに感染する場合には、ウイルス側に存在するｇｐ１２０やｇｐ４１や、ヒトの細胞側に存在するＣＤ４およびケモカインレセプターＣＣＲ−５が重要な役割を果たす。ケモカインレセプターＣＣＲ−５が正常でない場合は、エイズウイルスの感染が成立しないことが判明している
本発明の抗体酵素は、上述のようにＣＣＲ−５に対して特異的に作用し、これを分解して機能を消失させることができるため、ＨＩＶの感染の予防やエイズの治療のための抗ＨＩＶ薬剤として有用である。本発明の抗体酵素は、ＣＣＲ−５の働きを抑制するという従来の抗ＨＩＶ薬剤とは全く異なる新しい作用機構でＣＣＲ−５を破壊するものであるため、現在有効な治療法が見出されていないエイズの治療に有効利用できることが期待される。
【０１３２】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＥＣＬ２Ｂ−２の可変領域の立体構造を示す模式図である。
【図２】ＥＣＬ２Ｂ−３の可変領域の立体構造を示す模式図である。
【図３】 i41SL1-2-L、VIPase-L、ECL2B-2-Lのアミノ酸配列を比較して示す図である。
【図４】 ECL2B-2-LおよびECL2B-3-Lについて酵素活性試験を行った結果を示すグラフである。
【図５】ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌの可変領域の立体構造を示す模式図である。
【図６】ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈの可変領域の立体構造を示す模式図である。
【図７】ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌの可変領域のアミノ酸配列（一次構造）とそれをコードする塩基配列を示す図である。
【図８】ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈの可変領域のアミノ酸配列（一次構造）とそれをコードする塩基配列を示す図である。
【図９】ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌ（図中では、Ｌと示す）およびＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈ（図中では、Ｈと示す）を用いてECL2Bペプチドの分解実験を行った結果を示す図である。
【図１０】（ａ）は、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌを用いたECL2Bペプチドの分解実験において、ＨＰＬＣを使用してECL2Bの濃度をモニタリングした結果を示す図である。（ｂ）は、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈを用いたECL2Bペプチドの分解実験において、ＨＰＬＣを使用してECL2Bの濃度をモニタリングした結果を示す図である。（ｃ）は、ECL2Bペプチドの分解実験のコントロールとして、ＨＰＬＣを使用してECL2Bの濃度をモニタリングした結果を示す図である。
【図１１】酵素分解実験における速度論的解析結果を示す図である。（ａ）は、基質（ＥＣＬ２Ｂペプチド）濃度と分解速度との関係を示す図であり、（ｂ）は、Hanes-Woolfプロットの結果を示す図である。
【図１２】ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌ（図中では、Ｌと示す）およびＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈ（図中では、Ｈと示す）を用いてTP41-1（図中では、ＴＰと示す）ペプチドの分解実験を行った結果を示す図である。
【図１３】（ａ）は、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌを用いたTP41-1ペプチドの分解実験において、ＨＰＬＣを使用してTP41-1の濃度をモニタリングした結果を示す図である。（ｂ）は、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈを用いたTP41-1ペプチドの分解実験において、ＨＰＬＣを使用してTP41-1の濃度をモニタリングした結果を示す図である。（ｃ）は、TP41-1ペプチドの分解実験のコントロールとして、ＨＰＬＣを使用してTP41-1の濃度をモニタリングした結果を示す図である。
【図１４】酵素分解実験における速度論的解析結果を示す図である。（ａ）は、基質（TP41-1ペプチド）濃度と分解速度との関係を示す図であり、（ｂ）は、Hanes-Woolfプロットの結果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an antibody enzyme against the chemokine receptor CCR-5, which is a co-receptor of AIDS virus (HIV), a gene encoding the same, a transformant into which the gene has been introduced, and an anti-HIV drug using them. is there.
[0002]
[Prior art]
AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) is caused by the infection of human immunodeficiency virus (HIV-1), which is the causative virus, resulting in a decrease in immune function and accompanying opportunistic infections, malignant tumors, neurological symptoms, It is a pathological condition combined with dementia. When infected with HIV-1, it progresses to AIDS through the acute phase, asymptomatic phase, and AIDS-related syndrome. Due to advances in HIV-related research and treatment methods, AIDS is becoming a treatable disease from an incurable disease, but at present, there is no reliable anti-HIV drug and no treatment with drugs has been established. is there.
[0003]
In 1984, CD4 was identified as a receptor for HIV-1 in a study on the mechanism of HIV infection. CD4 exists on the surface of human cells and is known to infect cells by binding to gp120, which is a coat protein of HIV-1.
[0004]
However, CD4 alone does not cause fusion between the viral envelope and the cell membrane of the host cell, and HIV-1 infection does not occur, suggesting the presence of a co-receptor (second receptor). After more than 10 years from the discovery of CD4, the chemokine receptor CCR-5, an HIV co-receptor, was discovered. Furthermore, it has been reported that when the chemokine receptor CCR-5 is not normal, it has been reported to be resistant to infection and development of HIV-1. Therefore, many researchers and companies now target HIV-1 We are embarking on the development of drugs that inhibit invasion.
[0005]
The current state of research and development of such anti-HIV drugs targeting HIV co-receptors is described in Non-Patent Document 1 shown below.
[0006]
[Non-Patent Document 1]
Tsutomu Murakami, Naoki Yamamoto: Protein Nucleic Acid Enzyme, Vol. 43, pp. 677-685 (1998), “Development of New Anti-HIV Drugs—Drugs that Act on HIV Co-receptors (Second Receptors)”
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
As shown in Table 1 of Non-Patent Document 1, pharmaceutical companies all over the world have started research and development of anti-HIV drugs targeting HIV co-receptors in collaboration with basic research institutions such as universities. As a candidate of an anti-HIV drug that can prevent HIV-1 infection by targeting the chemokine receptor CCR-5, a compound that acts as an antagonist has been reported.
[0008]
However, at present, no effective drug has been proposed that can directly attack the chemokine receptor CCR-5 to eliminate its function.
[0009]
Thus, the present invention provides an antibody enzyme that can degrade the chemokine receptor CCR-5 to eliminate its function and can be used for prevention of AIDS virus infection and treatment of AIDS. Furthermore, the present invention provides a gene encoding the antibody enzyme, a transformant introduced with the gene, and an anti-HIV drug using them.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the inventors of the present application focused on an antibody enzyme that has an enzyme action while being an antibody and can completely decompose the target protein, and has developed an antibody enzyme against the chemokine receptor CCR-5. We studied earnestly to obtain. As a result, the present inventors have found that among antibodies to the chemokine receptor CCR-5, those that function as an antibody enzyme exist, and the present invention has been completed.
[0011]
That is, the antibody enzyme according to the present invention is an antibody of human-derived chemokine receptor CCR-5 or an antibody fragment thereof, and is characterized by decomposing the chemokine receptor CCR-5. Here, the “antibody fragment” means each peptide chain constituting an antibody having the chemokine receptor CCR-5 as an antigen, and further, a peptide fragment in a partial region in each peptide chain.
[0012]
The above-mentioned “antibody enzyme” is an antibody that has an enzymatic action, and among them, a substance that exhibits high degradation activity targeting its antigen protein is called a “super antibody enzyme”. The above-mentioned “super antibody enzyme” can completely degrade the target protein and has an activity close to that of a natural enzyme (reference: Super Catalytic Antibody [I]: Decomposition of targeted protein by its antibody light chain. Hifumi, E., Okamoto, Y., Uda, T., J. Biosci. Bioeng., 88 (3), 323-327 (1999)). The antibody enzyme of the present invention is an antibody having the chemokine receptor CCR-5 as an antigen, and is included in the “super antibody enzyme” in order to completely decompose the CCR-5.
[0013]
The antibody enzyme has the property of degrading the chemokine receptor CCR-5, which is its antigen, in a state in which the properties of the chemokine receptor CCR-5 as an antibody remain dark. Therefore, the above-mentioned antibody enzyme has high specificity and can be decomposed targeting only the chemokine receptor CCR-5. Since the chemokine receptor CCR-5 is a co-receptor that plays an important role in HIV infection, the antibody enzyme capable of eliminating its function is used for the prevention of HIV infection and the treatment of AIDS. It can be effectively used as an anti-HIV drug.
[0014]
The antibody enzyme preferably comprises the variable region of the chemokine receptor CCR-5 antibody. This “variable region” is a portion consisting of about 110 amino acids from the N-terminus of the H and L chains constituting the antibody. The variable region has a variety of primary structures depending on the type of antibody, and when the antibody has activity as an enzyme, there is a high possibility that its active center is included. Therefore, if the antibody enzyme includes the variable region of an antibody, it can have high activity as an enzyme.
[0015]
The antibody enzyme preferably has a catalytic triad residue structure. The “catalytic triad residue structure” refers to a structure presumed that at least three amino acid residues including serine are included in the active site to form an active center. A protease having this catalytic triad residue structure is called serine protease because serine is contained in the active site. Therefore, it can be said that the antibody enzyme is a kind of serine protease. If it has a structure presumed to be a catalyst triad residue, it can be predicted that it has high activity as a protease.
[0016]
As the antibody enzyme according to the present invention, specifically, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or Or what comprises the added amino acid sequence can be mentioned.
[0017]
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the variable region of the light chain (L chain) of the monoclonal antibody ECL2B-2 of the chemokine receptor CCR-5. The variable region of the L chain of ECL2B-2 was confirmed to have high activity as a CCR-5 degrading enzyme, as shown in Examples described later.
[0018]
As another example of the antibody enzyme according to the present invention, one or more amino acid substitutions, deletions, insertions and / or additions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 And those comprising the amino acid sequence thus prepared.
[0019]
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is the variable region of the light chain (L chain) of the monoclonal antibody ECL2B-3 of the chemokine receptor CCR-5. The variable region of the L chain of ECL2B-3 was also confirmed to have high activity as a CCR-5 degrading enzyme, as shown in Examples described later.
[0020]
As still another example of the antibody enzyme according to the present invention, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, or in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or Mention may be made of those comprising an added amino acid sequence.
[0021]
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is the variable region of the light chain (L chain) of the monoclonal antibody ECL2B-4 of the chemokine receptor CCR-5. The variable region of the L chain of ECL2B-4 was also confirmed to have high activity as a CCR-5 degrading enzyme, as shown in Examples described later.
[0022]
As still another example of the antibody enzyme according to the present invention, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, or in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or Mention may be made of those comprising an added amino acid sequence.
[0023]
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is the variable region of the heavy chain (H chain) of the monoclonal antibody ECL2B-4 of the chemokine receptor CCR-5. The variable region of the L chain of ECL2B-4 was also confirmed to have high activity as a CCR-5 degrading enzyme, as shown in Examples described later.
[0024]
In addition, the above “one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added” means, for example, known mutant protein production methods such as site-directed mutagenesis using genetic engineering techniques. Any number of amino acids can be substituted, deleted, inserted and / or added by substitution, deletion, insertion and / or addition. Thus, when genetic engineering techniques are used, one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1, 5, 9, and 11. In other words, the antibody enzyme consisting of the amino acid sequence is a variant of the antibody enzyme consisting of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1, 5, 9, and 11.
[0025]
Since the antibody enzyme of the present invention degrades the chemokine receptor CCR-5, which plays an important role in HIV infection, and loses its function, it can also be used as an anti-HIV drug that inhibits HIV infection. That is, the anti-HIV drug of the present invention contains the above antibody enzyme and is characterized by inhibiting AIDS virus infection.
[0026]
In addition, the antibody enzyme of the present invention can delay the onset of AIDS and prevent the progression of disease in HIV-infected patients. That is, the anti-HIV drug of the present invention may contain the above antibody enzyme and act as a therapeutic agent for AIDS virus-infected patients.
[0027]
The anti-HIV drug of the present invention contains only the above antibody enzyme and can be directly administered by intravenous injection or the like, but further contains a pharmacologically acceptable carrier in addition to the above antibody enzyme. It may be. Such an anti-HIV drug can be produced by a conventionally known production method. Since this anti-HIV drug specifically degrades only the CCR-5 molecule, it can be expected not only to have a remarkable effect but also to have few side effects.
[0028]
The present invention also includes a gene encoding the above antibody enzyme. If this gene is introduced so that it can be expressed in a suitable host (eg, bacteria, yeast), the antibody enzyme of the present invention can be expressed in that host.
[0029]
The “gene” includes not only double-stranded DNA but also single-stranded DNA and RNA such as sense strand and antisense strand constituting the DNA. Furthermore, the “gene” may include sequences such as untranslated region (UTR) sequences and vector sequences (including expression vector sequences) in addition to the sequence encoding the antibody enzyme of the present invention.
[0030]
Specific examples of the gene of the present invention include those consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. The base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the base sequence of the gene encoding the variable region of the light chain (L chain) of the monoclonal antibody ECL2B-2 of the chemokine receptor CCR-5.
[0031]
As another example of the gene of the present invention, a gene comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 can be mentioned. The base sequence shown in SEQ ID NO: 6 is the base sequence of the gene encoding the variable region of the light chain (L chain) of the monoclonal antibody ECL2B-3 of the chemokine receptor CCR-5.
[0032]
Still another example of the gene of the present invention is one consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10. The base sequence shown in SEQ ID NO: 10 is the base sequence of the gene encoding the variable region of the light chain (L chain) of the monoclonal antibody ECL2B-4 of the chemokine receptor CCR-5.
[0033]
Still another example of the gene of the present invention is a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12. The base sequence shown in SEQ ID NO: 12 is the base sequence of the gene encoding the variable region of the heavy chain (H chain) of the monoclonal antibody ECL2B-4 of the chemokine receptor CCR-5.
[0034]
Furthermore, the present invention includes a transformant introduced with the above gene. In this transformant, the above gene is introduced into an appropriate host (for example, bacteria or yeast) so that it can be expressed, and the antibody enzyme of the present invention can be expressed in its own body. Therefore, the transformant can also be used as an anti-HIV drug for preventing AIDS virus infection or an anti-HIV drug for AIDS treatment.
[0035]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention will be described more specifically below, but the present invention is not limited to this description.
[0036]
(1-1) About the antibody enzyme and gene according to the present invention
Here, as an example of the antibody enzyme of the present invention, the antibody fragments of the chemokine receptor CCR-5 monoclonal antibodies ECL2B-2 and ECL2B-3 will be described as examples. More specifically, the antibody fragments of ECL2B-2 and ECL2B-3 include the ECL2B-2 light chain variable region (ie, ECL2B-2-L) and the ECL2B-3 light chain variable region ( That is, ECL2B-3-L).
[0037]
These two antibody enzymes are obtained from a monoclonal antibody obtained using a peptide (RSSHFPYSQYQFWKNFQTLK (SEQ ID NO: 13) or RSQKEGLHYTCS (SEQ ID NO: 14)) constituting the extracellular region of the chemokine receptor CCR-5 as an immunogen. It is what was done. As a result of estimating the three-dimensional structure of the antibody enzyme by molecular modeling of the amino acid sequence of the variable region of the monoclonal antibody, an amino acid capable of constituting a catalytic triad residue consisting of serine, histidine (or glutamic acid), and aspartic acid. It was found as a sequence (antibody fragment).
[0038]
The antibody enzymes ECL2B-2-L and ECL2B-3-L of the present invention act as decomposing enzymes of the chemokine receptor CCR-5. As shown in the examples described later, this is because ECL2B-2-L and ECL2B-3-L are derived from the extracellular region peptide of chemokine receptor CCR-5 (SEQ ID NO: 13 or amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14). It is clear from the result that the peptide is completely degraded.
[0039]
Here, the chemokine receptor CCR-5 (hereinafter referred to as CCR-5) will be briefly described.
[0040]
CCR-5 is a co-receptor for the AIDS virus HIV-1 and is thought to bring about conformational changes in the HIV-1 envelope and lead to membrane fusion between the virus and the host cell. It is an important factor when doing. A human having a deficient mutant CCR-5 gene is resistant to infection and development of HIV-1.
[0041]
CCR-5 is the only one used as a co-receptor in the infection of HIV-1 macrophage-directed strains involved in human-to-human infection. Therefore, it is expected that suppressing the function of CCR-5 will lead to prevention of HIV infection and prevention of disease progression.
[0042]
The two antibody enzymes described above can completely degrade this CCR-5 and lose its function. In humans having a deficient mutant CCR-5 gene, there is no apparent immune deficiency or tissue lesion, and no health problems are observed. Therefore, the above-mentioned antibody enzyme that eliminates the function of CCR-5 is responsible for HIV infection. It can be effectively used as an anti-HIV drug that prevents or suppresses the progression of AIDS symptoms.
[0043]
Next, the structure of the ECL2B-2-L will be described in detail below. ECL2B-2-L is the variable region of the light chain of monoclonal antibody ECL2B-2 that uses the extracellular region peptide of CCR-5 as an immunogen, and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 as the primary structure.
[0044]
FIG. 1 schematically shows a three-dimensional structure estimated as a result of three-dimensional structure modeling (molecular modeling) of the variable region of ECL2B-2 composed of a light chain and a heavy chain. In FIG. 1, the light chain is indicated by L and the heavy chain is indicated by H. As shown in FIG. 1, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the first aspartic acid (in FIG. 1, it is written as Asp1 according to the classification of Kabat (KABAT)), the 28th serine (in FIG. 1, According to the classification of Kabat, it is referred to as Ser27a), the 98th histidine (referred to as Hi93 according to the classification of Kabat in FIG. 1), or the 31st histidine (in FIG. 1, as replaced with the 98th histidine). , According to Kabat's classification, it is assumed that His27d) constitutes a catalytic triad residue.
[0045]
The antibody enzyme of the present invention comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, that is, the HECL2B-2. It may be a mutant of -L and act as a CCR-5 degrading enzyme. Further, the above antibody enzyme may be one in which the remaining amino sequence of the ECL2B-2 antibody L chain is appropriately added to the C-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
[0046]
Note that the variable region of the heavy chain of ECL2B-2 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 as a primary structure. The heavy chain of ECL2B-2 has a structure presumed to be a catalytic triad residue. Did not exist. The base sequence of the gene encoding the variable region of the heavy chain of ECL2B-2 is also described as SEQ ID NO: 4.
[0047]
Next, the structure of the ECL2B-3-L will be described in detail below. ECL2B-3-L is a variable region of the light chain of monoclonal antibody ECL2B-3 that uses the extracellular region peptide of CCR-5 as an immunogen, and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 as a primary structure.
[0048]
FIG. 2 schematically shows a three-dimensional structure estimated as a result of three-dimensional structure modeling (molecular modeling) of the variable region of ECL2B-3 composed of a light chain and a heavy chain. In FIG. 2, the light chain is indicated by L and the heavy chain is indicated by H. As shown in FIG. 2, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, the 86th aspartic acid (in FIG. 2, represented as Asp82 by the classification of Kabat (KABAT)), the 14th serine (in FIG. 2, Instead of the 14th serine, the 67th serine (referred to as Ser63 according to the Kabat classification) and the 80th histidine (referred to as FIG. 2). , According to Kabat's classification, it is assumed that His76) constitutes a catalytic triad residue.
[0049]
The antibody enzyme of the present invention comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, that is, the above ECL2B-3 It may be a mutant of -L and act as a CCR-5 degrading enzyme. Furthermore, the above antibody enzyme may be one in which the remaining amino sequence of the ECL2B-3 antibody L chain is appropriately added to the C-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
[0050]
Note that the variable region of the heavy chain of ECL2B-3 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 as a primary structure, but the heavy chain of ECL2B-3 has a structure presumed to be a catalytic triad residue. Did not exist. The base sequence of the gene encoding the variable region of the heavy chain of ECL2B-3 is also described as SEQ ID NO: 8.
[0051]
The gene according to the present invention is a gene encoding the above antibody enzyme, and more specifically, a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 can be mentioned. it can. The gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is one of the base sequences of the gene encoding the variable region of the L chain of ECL2B-2, and the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 is ECL2B-3 It is one of the base sequences of genes that encode the variable region of the L chain.
(1-2) Other examples of the antibody enzyme of the present invention
Subsequently, as another example of the antibody enzyme of the present invention, an antibody fragment of the monoclonal antibody ECL2B-4 of the chemokine receptor CCR-5 will be described as an example. More specifically, the antibody fragment of ECL2B-4 includes a light chain variable region of ECL2B-4 (ie, ECL2B-4-L) and a heavy chain variable region of ECL2B-4 (ie, ECL2B). -4-H).
[0052]
These two antibody enzymes are also obtained from a monoclonal antibody obtained using a peptide constituting the extracellular region of the chemokine receptor CCR-5 as an immunogen, like the above-mentioned ECL2-3-L. . As a result of estimating the three-dimensional structure of the antibody enzyme by molecular modeling of the amino acid sequence of the variable region of the monoclonal antibody, an amino acid capable of constituting a catalytic triad residue consisting of serine, histidine (or glutamic acid), and aspartic acid. It was found as a sequence (antibody fragment).
[0053]
The antibody enzymes ECL2B-4-L and ECL2B-4-H also degrade the extracellular region peptide of the chemokine receptor CCR-5 (peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13) as shown in the Examples below. It acts as a degrading enzyme for the chemokine receptor CCR-5.
[0054]
That is, the above-mentioned two antibody enzymes can completely degrade this CCR-5 and lose its function. Therefore, it is considered that the above antibody enzyme can be effectively used as an anti-HIV drug that prevents HIV infection or suppresses the progression of AIDS symptoms.
[0055]
Next, the structure of the ECL2B-4-L will be described in detail below. ECL2B-4-L is the variable region of the light chain of monoclonal antibody ECL2B-2 that uses the extracellular region peptide of CCR-5 as an immunogen, and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 as the primary structure.
[0056]
FIG. 5 schematically shows a three-dimensional structure estimated as a result of three-dimensional structure modeling (molecular modeling) of the variable region of ECL2B-4-L. As shown in FIG. 5, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, the first aspartic acid (referred to as D1 in FIG. 5 by the classification of Kabat (KABAT)), the 28th serine (in FIG. 5, It is presumed that the 31st histidine (indicated as H27d in FIG. 5 according to the Kabat classification) constitutes a catalytic triad residue according to the Kabat classification. Instead of the 31st histidine, the 98th histidine (referred to as H93 in FIG. 5 by Kabat classification) may be used. In place of the 31st serine, the 28th (referred to as S27a in FIG. 5), 32nd (referred to as S27e in FIG. 5), and 97th (referred to as S92 in FIG. 5). Either of them may be used.
[0057]
The antibody enzyme of the present invention comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, that is, the above HECL2B-4 It may be a mutant of -L and act as a CCR-5 degrading enzyme. Further, the above antibody enzyme may be one in which the remaining amino sequence of the ECL2B-4 antibody L chain is appropriately added to the C-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10.
[0058]
Next, the structure of the ECL2B-4-H will be described in detail below. ECL2B-4-H is the variable region of the heavy chain of monoclonal antibody ECL2B-4 that uses the extracellular region peptide of CCR-5 as an immunogen, and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 as the primary structure.
[0059]
FIG. 6 schematically shows a three-dimensional structure estimated as a result of three-dimensional structure modeling (molecular modeling) of the variable region of ECL2B-4-H. As shown in FIG. 6, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, the 92nd aspartic acid (referred to as D86 according to the classification of Kabat (KABAT) in FIG. 6), the 65th serine (in FIG. 6, It is presumed that the 48th glutamic acid (referred to as E46 in FIG. 6 according to the Kabat classification) constitutes a catalytic triad residue according to the classification of Kabat. Instead of the 92nd aspartic acid, it may be the 64th aspartic acid (in FIG. 6, indicated as D59 by Kabat classification). Further, instead of the 65th serine, the 90th serine (referred to as S84 in FIG. 6) may be used. In addition, the 91st glutamic acid (indicated as E85 in FIG. 6) may be used instead of the 48th glutamic acid.
[0060]
The antibody enzyme of the present invention comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, that is, the above ECL2B-4 It may be a mutant of -H and act as a CCR-5 degrading enzyme. Further, the antibody enzyme may be one in which the remaining amino sequence of the ECL2B-4 antibody H chain is appropriately added to the C-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11.
[0061]
The gene according to the present invention is a gene encoding the above antibody enzyme. More specifically, a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 or a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 can be mentioned. it can. The gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 is one of the base sequences of the gene encoding the variable region of the L chain of ECL2B-4, and the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 is that of ECL2B-4 It is one of the base sequences of genes encoding the variable region of the H chain.
[0062]
(2) Method for obtaining antibody enzyme according to the present invention
The antibody enzyme according to the present invention may be a CCR-like protein such as ECL2B-3 L chain full length, ECL2B-3 L chain full length, ECL2B-4 L chain full length, ECL2B-4 H chain full length or the like. In the case of the full length of the L chain of the antibody No. 5, the relevant CCR-5 monoclonal antibody may be obtained using a conventionally known antibody obtaining method, and the H chain and L chain may be separated. In addition, when the antibody enzyme according to the present invention is a CCR-5 antibody fragment, the relevant monoclonal antibody is first obtained, and then the desired antibody fragment is obtained from the monoclonal antibody using an appropriate protease. Cut as long as possible.
[0063]
In addition, antibody enzymes whose amino acid sequences and gene sequences encoding the same are clarified such as the above-mentioned ECL2B-2-L, ECL2B-3-L, ECL2B-4-L, ECL2B-4-H, etc. Can be obtained using a conventionally known genetic recombination technique or the like. In this case, a method in which a gene encoding the antibody enzyme is incorporated into a vector or the like, then introduced into a host cell so that it can be expressed, and a peptide translated in the cell is purified can be employed. If a gene encoding the above antibody enzyme is incorporated together with an appropriate promoter that can be expressed in a large amount, the target antibody enzyme may be efficiently obtained.
[0064]
If the amino acid sequence of the antibody enzyme is not clear, mRNA is first obtained from a monoclonal antibody-producing cell or a hybridoma thereof, cDNA is synthesized from the mRNA, and the gene sequence is read. Thereafter, an amino acid sequence is estimated from the gene sequence, and a three-dimensional structure is predicted by molecular modeling to confirm whether or not a catalytic triad residue-like structure is included. Then, an antibody fragment containing the catalytic triad residue-like structure can be obtained as an antibody enzyme.
[0065]
In the case of the gene encoding the antibody enzyme according to the present invention, if its base sequence is known, after obtaining its cDNA (or genomic DNA), using it as a template, an appropriate primer is used. It can be obtained by performing PCR and amplifying the corresponding region. In addition, if a suitable mutation is introduced into the gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, 6, 10, or 12 using site-directed mutagenesis, Mutants of the antibody enzyme consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 5, 9, and 11 are obtained as translation products.
[0066]
(3) About the utilization method of the antibody enzyme of the present invention
So far, anti-HIV drugs having an action of suppressing the action of CCR-5 have been developed. However, the antibody enzyme of the present invention is based on a method completely different from these anti-HIV drugs. Can attack directly and lose function. Therefore, this antibody enzyme can be used as an anti-HIV drug.
[0067]
An anti-HIV drug containing the antibody enzyme inhibits HIV infection or suppresses the onset of AIDS by a new mechanism of action that completely degrades CCR-5 and loses its function. Can do. And since such an anti- HIV drug specifically decomposes | disassembles only CCR-5 molecule | numerator, it is thought that a remarkable effect can be expected and there are few side effects. Considering the reaction mechanism of the antibody enzyme, it can be expected that the therapeutic effect on AIDS is further improved by using it together with other anti-HIV drugs currently used.
[0068]
Furthermore, the antibody enzyme of the present invention can be used for preparing a transformant by introducing a gene encoding it into an appropriate host. That is, the transformant according to the present invention is a transformant into which a gene encoding the antibody enzyme is introduced. Here, “gene introduced” means that the gene is introduced into a target cell (host cell) so as to be expressed by a known genetic engineering technique (gene manipulation technique). This transformant can express the antibody enzyme in its own body.
[0069]
More specifically, examples of the transformant according to the present invention include those obtained by introducing a gene comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6 (which may be SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12) into a host cell. Can do. As said host cell, what is normally used, such as colon_bacillus | E._coli, yeast, baculovirus, can be used suitably.
[0070]
Since the above transformant specifically recognizes CCR-5 in its own body and can completely degrade it and lose its function, it can be used as an anti-HIV drug. In addition, it is considered that a transformant capable of expressing a large amount of the above-mentioned antibody enzyme can efficiently prevent HIV infection and treat AIDS symptoms, and obtain a more effective anti-HIV drug. May be possible.
[0071]
4A, FIG. 4B, FIG. 8A, FIG. 8B, FIG. 13, FIG. 15, FIG. 17, FIG. 23, FIG. 24, and FIG. The amino acid numbers in the amino acid sequences of the antibody enzymes shown in FIG. 42 are numbers according to Kabat's classification and are different from the amino acid numbers shown in the corresponding sequence numbers.
[0072]
【Example】
Examples of the present invention will be described below as Experiment 1 to Experiment 9.
[0073]
[Experiment 1] (Production of ECL2B-2 and ECL2B-3 antibodies)
Monoclonal antibodies ECL2B-2 and ECL2B-3 were produced using a partial peptide consisting of 20 amino acids (RSSHFPYSQYQFWKNFQTLK: SEQ ID NO: 13) constituting the extracellular region of CCR-5 as an immunogen.
[0074]
First, glycine and cysteine residues were introduced at the C-terminus of the partial peptide in order to conjugate with Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH). In the actual CCR-5 peptide, the N-terminus of the partial peptide is a cysteine residue, but the peptide used in this experiment is replaced with an arginine residue. The above-mentioned peptide and its conjugate with KLH were those manufactured by Takara Shuzo.
[0075]
Peptides bound to KLH were immunized to Balb / c mice. Primary and secondary immunizations were performed at 2 week intervals using Freund's complete immunostimulator. The third immunization was performed at 4 weeks after the second immunization using Freund's incomplete immunostimulator. The final booster (boost immunization) was performed 6 weeks after the third immunization. Three days after the final booster, Balb / c mouse spleen cells and myeloma cells (SP / NSI / l-Ag4-1 (NS-1) were fused, followed by HAT selection and screening. After cloning was performed twice, monoclonal antibodies (ECL2B-2 and ECL2B-3; IgG _l A cell line secreting (k)) was established.
[0076]
[Experiment 2] (Purification and separation of antibody subunits)
ECL2B-2 and ECL2B-3 were purified based on the purification manual of Bio-Rad Protein A MAPS-II kit (manufactured by BIO-RAD, Japan).
[0077]
First, ascites containing ECL2B-3 and ECL2B-3 was mixed with the same volume of saturated aqueous ammonium sulfate solution. The precipitate was collected by centrifugation, after which 5 ml of PBS was added to the precipitate. This process was repeated twice, after which dialysis against PBS was performed twice. After an aliquot of PBS solution containing ECL2B-2 or ECL2B-3 was mixed with the same volume of binding buffer MAPS-II, the mixture was placed on a substrate packed with Affi-Gel (protein A) and bound. Antibody elution was performed. The eluted antibody was dialyzed twice against 50 mM Tris / 0.15 M NaCl (pH = 8.0) buffer (4 ° C.). The resulting antibody was ultrafiltered 3 times using Centriprep10 (Amicon, MA, USA). 5 mg of antibody was dissolved in 2.7 ml of a buffer solution (pH 8.0) composed of 50 mM Tris and 0.15 M NaCl, 0.3 ml of 2M 2-mercaptoethanol was added, and the mixture was reduced at 15 ° C. for 3 hours. It was.
[0078]
To the solution was added 3 ml of 0.6M iodoacetamide. Thereafter, the pH was adjusted to 8 with 1M Tris. The solution was then incubated at 15 ° C. for 15 minutes. The resulting solution was ultrafiltered to 0.5 ml, and then half of the sample was HPLC (column with a flow rate of 0.2 ml / min using 6M guanidine hydrochloride (pH = 6.5) as the eluent. : Protein-Pak300, 7.8 × 300 mm, manufactured by Nippon Waters). Light and heavy chain fractions were collected respectively and then diluted with 6M guanidine hydrochloride. These were dialyzed against PBS at 4 ° C. with 7 buffer changes every 3-4 days.
[0079]
The antibodies ECL2B-2 and ECL2B-3 prepared in the above experiments were identified and quantified by the following

experiments

3 and 4.
[0080]
[Experiment 3] (Immunoassay by ELISA method)
Partial peptide of CCR-5 (RSSHFPYSQYQFWKNFQTLKG (shown in SEQ ID NO: 15)) dissolved in PBS solution (5 μg / ml): synthesized without the C-terminal cysteine residue of the CCR-5 partial peptide used in Experiment 1 above (Hereinafter, this peptide is referred to as ECL2B peptide) 50 μl was immobilized on an immunoplate (Nunc). Blocking was performed at room temperature using 2% gelatin. After the plate was washed, ECL2B-2 or ECL2B-3 was immunoreacted and then reacted with anti-mouse Ig (G + A + M) conjugated with alkaline phosphatase. After the substrate reaction, absorbance at 405 nm was measured using an immunoplate reader (InterMed NJ-2001).
[0081]
As a result of the immunoassay in this experiment, the classes and subclasses of the monoclonal antibodies ECL2B-2 and ECL2B-3 obtained were IgG ₁ (Κ). The above monoclonal antibodies did not cross-react with other proteins such as KLH, HAS, OVA, and human hemoglobin. Furthermore, the above monoclonal antibodies include HIV-1 gp120 V3 cyclic peptide (CTRPNNNTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHC: SEQ ID NO: 16), gp41 retention region peptide TP41-1 (HIV-1 / TPRGPDRPEGIEEEGGERDRD: SEQ ID NO: 17), RT-2 (KLLRGTKALTFVIPLTEEAE). : SEQ ID NO: 18), 41S-2mAb CDRL-1 (RSSKSLLYSNGNTYLY: SEQ ID NO: 19), 1D3 mAb CDRH-2 (DKFNQNYSTAGNYPNIR: SEQ ID NO: 20), CA-2 (RSSKSLLYSNGNTYLYGPDKFNQNYSTAGNYPNIR: SEQ ID NO: 21), etc. There wasn't.
[0082]
[Experiment 4] (HPLC analysis and mass spectrometry)
In order to monitor the catalytic reaction, 20 μl of the reaction solution obtained in Experiment 3 was subjected to a reverse phase (RP) at a flow rate of 0.5 ml / min under a constant composition condition of a temperature of 40 ° C. and 13% acetonitrile / 0.08% TFA. -HPLC (column: Waters Puresil C ₁₈ It was injected into a column (4.6 × 150 mm: manufactured by Waters NY, HPLC: manufactured by Jasco). As a result, the purity of the antibody peptide was 90% or more.
[0083]
The antibody peptide was identified using MALDI-TOF-MASS (Bruker Ltd., AUTOFLEX). As a result, the mass was the same as the theoretical ion distribution. The same mass spectral conditions were applied to the identification of fragments found in catalysis by the light chains of ECL2B-2 and ECL2B-3.
[0084]
[Experiment 5] (Sequencing and molecular modeling of ECL2B-2 and ECL2B-3 antibodies)
The mRNAs of ECL2B-2 and ECL2B-3 antibodies were isolated from hybridomas having ECL2B-2 or ECL2B-3 using an mRNA purification kit (Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.). Thereafter, light chain and heavy chain cDNAs were synthesized by a single-stranded cDNA synthesis kit (manufactured by Life Science Inc.).
[0085]
Sequencing was performed using an Auto Read Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech) and an automated DNA sequencer (ALF II, Amersham Pharmacia Biotech). Computer analysis (molecular modeling) for the construction of a three-dimensional molecular structure was performed by a workstation (Silicon Graphics Inc.) and AbM software (Oxford Molecular Ltd.).
[0086]
The resulting PDB data was applied using software Discover II (Molecular Simulations Inc.) to minimize the total energy. Software for Protein Adviser Ver. 3.5 (FQS Ltd.) was used to diagram the structure.
[0087]
By the method as described above, the amino acid sequences of the variable regions of the light and heavy chains of the monoclonal antibodies ECL2B-2 and ECL2B-3 and the sequence of the cDNA encoding them were determined.
[0088]
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the ECL2B-2 light chain, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the base sequence of the cDNA that encodes it. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of the ECL2B-2 heavy chain, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 is the base sequence of the cDNA that encodes it. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is the amino acid sequence of the ECL2B-3 light chain, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 is the base sequence of the cDNA that encodes it. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence of the ECL2B-3 heavy chain, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 is the base sequence of the cDNA that encodes it.
[0089]
Both ECL2B-2 and ECL2B-3 light chain sequences showed the highest scores in germline bd2.
[0090]
Next, molecular modeling was performed based on each amino acid sequence determined. FIG. 1 shows the three-dimensional structure of the variable region of ECL2B-2 estimated by molecular modeling. FIG. 2 shows the three-dimensional structure of the variable region of ECL2B-3 estimated by molecular modeling.
[0091]
In the light chain of ECL2B-2 (ECL2B-2-L), Asp ¹ (Or Asp ^27d ), Ser ^27a , His ⁹³ These three amino acid residues were presumed to be able to form catalytic triad residues in the molecular structure (see FIG. 1).
[0092]
Many serine proteases such as trypsin, thrombin, and plasmin have a catalytic triad structure consisting of Asp, Ser, and His at the active site that cleaves the peptide bond. The light chain of the natural antibody enzyme VIPase (VIPase-L), which can degrade antigenic vasoactive intestinal peptide (VIP), contains Asp ¹ (Within FR-1), Ser ^27a (In CDR1), His ⁹³ It is reported to have three amino acid residues (within CDR3) [Reference 1: S. Paul et. Al., J. Biol. Chem. 269 (1994), p. 32389]. In addition, the inventors of the present application have identified the same Asp as i41SL1-2-L, which is the light chain of monoclonal antibody i41SL1-2. ¹ , Ser ^27a , His ⁹³ It has already been reported that it has a catalytic triad residue consisting of and exhibits enzymatic activity to degrade its antigen CDRL-1 peptide [Reference 2: Y. Zhou, E. Hifumi, H. Kondo, T. Uda, Biological Systems Engineering, ACS symposium Series 830, 200-208 (2002), and Reference 3: T. Uda and E. Hifumi, Proceedings of International Symposium on Nano-Intelligent Materials / System, pp47- 52, (2002, Tokyo)].
[0093]
In FIG. 3, in i41SL1-2-L (indicated as i41S2-L in FIG. 3), VIPase-L (indicated in FIG. 3 as VIP), and ECL2B-2-L (indicated as ECL2B (L) in FIG. 3) A comparison of amino acid sequences is shown. In FIG. 3, the amino acids constituting the catalytic triad residues in each sequence are surrounded by a square frame. As shown in FIG. 3, it was confirmed that ECL2B-2-L has three amino acid residues at the same positions as VIPase-L and i41SL1-2-L. Since they belong to the same germline bd2, the homology of these sequences is very high.
[0094]
VIPase-L is a site-specific mutation that causes Asp ¹ , Ser ^27a , His ⁹³ It has been reported that a catalytic triad residue consisting of is an active site [Reference 1]. From this, it is expected that ECL2B-2-L has a catalytic activity for degrading the antigenic peptide CCR-5.
[0095]
On the other hand, the light chain of ECL2B-3 (ECL2B-3-L) is Ser ¹⁴ (Or Ser ⁶³ ), His ⁷⁶ , Asp ⁸² , Was presumed to have slightly different types of catalytic triad residues (see FIG. 2).
[0096]
Subsequently, the distance between the residues constituting the catalyst triad residue was confirmed. In molecular modeling, unlike the X-ray structural analysis, the exact distance between atoms cannot be determined, so the α-carbon distance within the residue is estimated as the approximate distance between the residues that make up the catalytic triad residue. It was. The data is shown in Table 1 along with other natural antibody enzyme data.
[0097]
[Table 1]

[0098]
As shown in Table 1, the distance between His (Cα) and Ser (Cα) depends on the enzyme (trypsin or thrombin) or natural antibody enzyme (41S-2-L, 41S-2-H, i41SL1-2-L). , I41-7-L). On the other hand, 41S-2-H, i41SL-2-H, and i41-7-H were as small as about 4 mm.
[0099]
The α-carbon distance between His and Asp showed slightly different characteristics. Trypsin, thrombin, i41SL1-2-L, and i41SL1-2-H were almost the same distance, and the others were longer than 2 to 5 mm. Antibody subunits such as 41S-2-L, 41S-2-H, i41SL1-2-H, and i41-7-H showed catalytic activity like serine protease. From this fact, ECL2B-2-L and ECL2B-3-L are expected to have a catalytic activity like serine protease.
[0100]
Subsequently, a peptide degradation test for confirming the enzyme activities of ECL2B-L and ECL2B-3 was performed as follows.
[0101]
[Experiment 6] (Enzyme activity test of ECL2B-2 and ECL2B-3 antibodies)
Prior to carrying out the degradation reaction experiment of the antigenic peptide ECL2B with the monoclonal antibodies ECL2B-2 and ECL2B-3, almost all glass and plastic instruments and buffer solutions were heated (180 ° C., 2 hours), autoclaved (121 C., 20 minutes) or sterilized by passing through a 0.2 μm sterilizing filter. The operation in this experiment was performed in a safety cabinet to prevent contamination of foreign matter in the air. The degradation reaction was carried out in 7.5 mM phosphate buffer (pH 6.5) at 25 ° C. In order to monitor the reaction, 20 μl of the reaction solution was injected into RP-HPLC (manufactured by Jasco) under a constant temperature condition at a column temperature of 40 ° C.
[0102]
First, using the light chains (ECL2B-2-L and ECL2B-3-L) of monoclonal antibodies ECL2B-2 and ECL2B-3, a catalytic degradation test of an antigenic peptide (ECL2B peptide: RSSHFFPYSQYQFWKNFQTLKG (SEQ ID NO: 15)) It was implemented.
[0103]
500 μl of purified ECL2B-2-L (0.8 μM) or a solution containing ECL2B-3-L (0.8 μM) is mixed with a solution containing the same volume of 120 μM ECL2B peptide at 25 ° C. in a sterile test tube. Mixed. The time course of ECL2B peptide was monitored using RP-HPLC. For comparison, the same experiment was performed using peptide B instead of ECL2B-peptide as a substrate.
[0104]
The result is shown in the graph of FIG. In the graph of FIG. 4, the horizontal axis represents the reaction time (hours), and the vertical axis represents the concentration (μM) of the substrate ECL2B peptide.
[0105]
When ECL2B-2-L is used (indicated by a circle in FIG. 4), the degradation of the ECL2B peptide starts after mixing the ECL2B-2-L and the ECL2B peptide, and after an induction time of about 80 hours, The concentration of ECL2B peptide decreased rapidly. It should be noted that this type of induction time is common in many reactions. The ECL2B peptide disappeared completely within about 90 hours after mixing.
[0106]
When ECL2B-3-L is used (indicated by a triangle in FIG. 4), the ECL2B peptide is degraded after a longer induction time of about 190 hours after mixing ECL2B-3-L and ECL2B peptide. Started. The ECL2B peptide was rapidly degraded within about 250 hours after the induction time. When the same experiment was performed on peptide B (indicated by ▪ in FIG. 4), the peptide was not decomposed.
Subsequently, the degradation products obtained when ECL2B-2-L was used as an enzyme were analyzed by MALDI-TOF-MASS. As a result, various peptide fragments derived from the ECL2B peptide were confirmed. In the early stages of degradation, relatively long peptides such as RSSHFPYSQYQFWKNFQ and RSSHFFPYSQYQFW were observed. In the final stage of the degradation reaction (the stage where the peptide shown in SEQ ID NO: 15 disappears from the reaction system), many small peptides such as RSSHFPYS, RSSHFPY, SSHFPYSQYQ, SSHFPYSQ, HFPYSQYQFWKN, YSQYQFWKN, and YSQYQ were generated. It was done. Since many of the above peptide fragments were produced, it can be said that ECL2B-2-L or ECL2B-3-L was able to continuously degrade the antigenic peptide RSSHFPYSQYQFWKNFQTLKG.
[0107]
As already mentioned, the three residues forming the catalytic triad residue in ECL2B-2-L are located at the same location as the three catalytic triad residues of VIPase and i41SL1-2-L. This consistency suggests that the light chain of ECL2B-2 (ECL2B-2-L) has the ability to catalytically degrade the antigenic peptide (ECL2B peptide).
[0108]
From the above results, it was confirmed that ECL2B-2-L and ECL2B-3-L are antibody enzymes capable of completely degrading the peptide constituting the extracellular region of CCR-5.
[0109]
Note that experiments were performed on the heavy chains (ECL2B-2-H and ECL2B-3-H) of the monoclonal antibodies ECL2B-2 and ECL2B-3 under the same conditions as those described above. However, neither of these heavy chains degraded the antigenic peptide ECL2B. That is, no peptide fragment was detected by mass spectrometry.
[0110]
In addition, an antigenic peptide degradation experiment using a complete monoclonal antibody ECL2B-2 including a region other than the variable region was performed under the same conditions as those described above. However, also in this case, the ECL2B peptide, which is a partial peptide of CCR-5, was not degraded at all.
[0111]
[Experiment 7] (Preparation of ECL2B-4 antibody and purification of antibody subunit)
In the same manner as in Experiment 1, monoclonal antibody ECL2B-4 was prepared using a partial peptide consisting of 20 amino acids (see SEQ ID NO: 13) constituting the extracellular region of CCR-5 as an immunogen.
[0112]
Subsequently, ECL2B-4 was purified by the same method as in Experiment 2. Antibody ECL2B-4 purified in this experiment was identified and quantified by the same method as in Experiment 3.
[0113]
[Experiment 8] (Sequencing and molecular modeling of ECL2B-4 antibody)
In the same manner as in Experiment 5, amino acid sequencing of the light and heavy chain variable regions of ECL2B-4 and sequencing of the cDNA encoding it were performed. Subsequently, molecular modeling based on the determined amino acid sequence was performed. The results are shown below.
[0114]
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is the amino acid sequence of ECL2B-4 light chain, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 is the base sequence of the cDNA encoding it. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is the amino acid sequence of ECL2B-4 heavy chain, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 is the base sequence of the cDNA encoding it.
[0115]
FIG. 7 also shows the amino acid sequence of the ECL2B-4 light chain and the base sequence of the cDNA encoding it, together with the variable regions (CDR-1 to CDR-3). FIG. 8 shows the amino acid sequence of the ECL2B-4 heavy chain and the base sequence of the cDNA encoding it, together with the variable regions (CDR-1 to CDR-3).
[0116]
Next, molecular modeling was performed based on each amino acid sequence determined. FIG. 5 shows the three-dimensional structure of the variable region of ECL2B-4-L estimated by molecular modeling. FIG. 6 shows the three-dimensional structure of the variable region of ECL2B-4-H estimated by molecular modeling.
[0117]
In the light chain of ECL2B-4 (ECL2B-4-L), three amino acid residues S26 (or any of S27a, S27e, and S92), H27d (or H93), and D1 are catalyzed in the molecular structure. It was presumed that triplet residues could be formed (see FIG. 5).
[0118]
In the ECL2B-4 heavy chain (ECL2B-4-H), three amino acid residues S60 (or S84), E46 (or E85), and D59 (or D86) are present in the molecular structure. It was presumed that catalytic triad residues could be formed (see FIG. 6).
[0119]
Subsequently, a peptide degradation test for confirming the enzyme activities of ECL2B-4-L and ECL2B-4-H was performed as follows.
[0120]
[Experiment 9] (Enzyme activity test of ECL2B-4 antibody)
Enzyme activity tests were performed on ECL2B-4-L and ECL2B-4-H in the same manner as in Experiment 6.
[0121]
First, the degradation reaction of the ECL2B peptide (SEQ ID NO: 15) was carried out in 15 mM phosphate buffer (pH 6.5) at 25 ° C. In order to monitor the reaction, 20 μl of the reaction solution was injected into RP-HPLC (manufactured by Jasco) under a constant temperature condition at a column temperature of 40 ° C.
[0122]
The following (1) to (5) were prepared as reaction solutions for this decomposition reaction.
(1) ECL2B-4 (L) 0.8μM + ECL2B Peptide: 50μM: 800μl
(2) ECL2B-4 (H) 0.4μM + ECL2B peptide: 50μM: 800μl
(3) Preparation of ECL2B peptide: 50 μM: 500 μl
(4) ECL2B-4 (L): 0.8μM: 300μl
(5) ECL2B-4 (H): 0.4 μM: 300 μl produced
The results are shown in FIGS. In the graph of FIG. 9, the horizontal axis represents the reaction time (hours), and the vertical axis represents the concentration (μM) of the substrate ECL2B peptide. 10A to 10C show the results of monitoring using HPLC. FIG. 11 shows the kinetic analysis results in this enzymatic degradation experiment. FIG. 11A is a graph showing the relationship between the substrate (ECL2B peptide) concentration and the degradation rate, and FIG. 11B is a graph showing the results of the Hanes-Woolf plot.
[0123]
The Vmax, Km, kcat, and kcat / Km values (average plot) calculated using the Hanes-Woolf plot are shown in Table 2 below.
[0124]
[Table 2]

[0125]
From these results, it was confirmed that ECL2B-4-L and ECL2B-4-H have enzyme activity in the degradation reaction of ECL2B peptide. Therefore, it was confirmed that ECL2B-4-L and ECL2B-4-H are antibody enzymes that can be completely degraded by targeting peptides constituting the extracellular region of CCR-5.
[0126]
Then, the enzyme activity test with respect to TP41-1 peptide (sequence number 17) of ECL2B-4-L and ECL2B-4-H was implemented. This degradation reaction was carried out in 15 mM phosphate buffer (pH 6.5) at 25 ° C. In order to monitor the reaction, 20 μl of the reaction solution was injected into RP-HPLC (manufactured by Jasco) under a constant temperature condition at a column temperature of 40 ° C.
[0127]
The following (1) to (5) were prepared as reaction solutions for this decomposition reaction.
(1) ECL2B-4 (L) 0.8μM + TP41-1 Peptide: 120μM: 800μl
(2) ECL2B-4 (H) 0.4μM + TP41-1 Peptide: 120μM: 800μl
(3) TP41-1 peptide: 120 μM: 500 μl
(4) ECL2B-4 (L): 0.8μM: 300μl
(5) ECL2B-4 (H): 0.4 μM: 300 μl produced
The results are shown in FIGS. In the graph of FIG. 12, the horizontal axis represents the reaction time (hours), and the vertical axis represents the concentration (μM) of the substrate ECL2B peptide. Moreover, the result monitored using HPLC in FIG. 13 (a)-(c) is shown. FIG. 14 shows the kinetic analysis results in this enzymatic degradation experiment. FIG. 14A is a graph showing the relationship between the substrate (TP41-1 peptide) concentration and the degradation rate, and FIG. 14B is a graph showing the results of the Hanes-Woolf plot.
[0128]
Table 3 below shows Vmax, Km, kcat, and kcat / Km values (average plots) calculated using the Hanes-Woolf plot.
[0129]
[Table 3]

[0130]
From these results, it was confirmed that ECL2B-4-L and ECL2B-4-H have low enzyme activity even in the degradation reaction of TP41-1 peptide. In addition, as can be seen from a comparison between Table 2 and Table 3, experiments have shown that ECL2B-4-L degrades the original antigen ECL2B peptide faster than the TP41 peptide, and ECL2B It was proved that -4-L is indeed an antibody enzyme against ECL2B.
[0131]
【The invention's effect】
When the AIDS virus infects humans, gp120 and gp41 present on the virus side, CD4 and chemokine receptor CCR-5 present on the human cell side play an important role. It has been found that if the chemokine receptor CCR-5 is not normal, AIDS virus infection is not established.
Since the antibody enzyme of the present invention specifically acts on CCR-5 as described above and can be decomposed to lose its function, it can prevent HIV infection and treat AIDS. Useful as an HIV drug. Since the antibody enzyme of the present invention destroys CCR-5 by a completely different mechanism of action from conventional anti-HIV drugs that suppresses the action of CCR-5, an effective therapeutic method has been found at present. It is expected that it can be effectively used for the treatment of no AIDS.
[0132]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing a three-dimensional structure of a variable region of ECL2B-2.
FIG. 2 is a schematic diagram showing a three-dimensional structure of a variable region of ECL2B-3.
FIG. 3 shows a comparison of the amino acid sequences of i41SL1-2-L, VIPase-L, and ECL2B-2-L.
FIG. 4 is a graph showing the results of enzyme activity tests for ECL2B-2-L and ECL2B-3-L.
FIG. 5 is a schematic diagram showing a three-dimensional structure of a variable region of ECL2B-4-L.
FIG. 6 is a schematic diagram showing a three-dimensional structure of a variable region of ECL2B-4-H.
FIG. 7 shows the amino acid sequence (primary structure) of the variable region of ECL2B-4-L and the base sequence encoding it.
FIG. 8 shows the amino acid sequence (primary structure) of the variable region of ECL2B-4-H and the base sequence encoding it.
FIG. 9 is a diagram showing the results of an ECL2B peptide degradation experiment using ECL2B-4-L (shown as L in the figure) and ECL2B-4-H (shown as H in the figure). .
FIG. 10 (a) is a diagram showing the results of monitoring the concentration of ECL2B using HPLC in the ECL2B peptide degradation experiment using ECL2B-4-L. (B) is a figure which shows the result of having monitored the density | concentration of ECL2B using HPLC in the degradation experiment of ECL2B peptide using ECL2B-4-H. (C) is a figure which shows the result of having monitored the density | concentration of ECL2B using HPLC as control of the decomposition | disassembly experiment of ECL2B peptide.
FIG. 11 is a diagram showing a kinetic analysis result in an enzyme degradation experiment. (A) is a figure which shows the relationship between a substrate (ECL2B peptide) density | concentration and a decomposition rate, (b) is a figure which shows the result of a Hanes-Woolf plot.
FIG. 12 shows the peptide of TP41-1 (shown as TP in the figure) using ECL2B-4-L (shown as L in the figure) and ECL2B-4-H (shown as H in the figure). It is a figure which shows the result of having conducted decomposition | disassembly experiment.
FIG. 13 (a) shows the results of monitoring the concentration of TP41-1 using HPLC in the TP41-1 peptide degradation experiment using ECL2B-4-L. (B) is a figure which shows the result of having monitored the density | concentration of TP41-1 using HPLC in the decomposition | disassembly experiment of TP41-1 peptide using ECL2B-4-H. (C) is a figure which shows the result of having monitored the density | concentration of TP41-1 using HPLC as control of the decomposition experiment of TP41-1 peptide.
FIG. 14 is a diagram showing a kinetic analysis result in an enzyme degradation experiment. (A) is a figure which shows the relationship between a substrate (TP41-1 peptide) density | concentration and a decomposition rate, (b) is a figure which shows the result of a Hanes-Woolf plot.

Claims

An antibody fragment against human chemokine receptor CCR-5, and an antibody enzyme that degrades the chemokine receptor CCR-5,
Abzyme characterized in that it comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11.

A gene encoding the antibody enzyme according to claim 1.

The gene according to claim 2, comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.

A transformant into which the gene according to claim 2 or 3 has been introduced.