JP4329816B2 - サンプリング方法、サンプリング装置、ｌｏｇＤ測定方法及びｌｏｇＤ測定システム - Google Patents

Description

本発明は、液体をサンプリングするサンプリング方法、サンプリング装置、並びに当該サンプリング方法に基づくｌｏｇＤ測定方法及びｌｏｇＤ測定システムに関する。

多くの医薬品に関して、薬物の吸収性、代謝性及び溶解性等と薬物として用いられる化合物の疎水性との間には相関がある。従来から化合物の疎水性を示す指標としてｌｏｇＤ（水とオクタノールとの分配係数）が求められている（例えば、以下特許文献１〜３参照）。
特開２００１−１２４７５６号公報 特許第３４４４８７２号公報 特許第３５２３２０７号公報

ｌｏｇＤを求める方法として、上記特許文献１〜３に記載されているように、ＨＰＬＣ（High Performance Liquid Chromatography：高速液体クロマトグラフィー）における保持時間に基づきｌｏｇＤを算出するものがある。しかしながら、この方法は算出されるｌｏｇＤが推定値であるため、以下に述べるような実測値を用いる方法に比べて誤差が生じやすいという問題がある。

また、ｌｏｇＤを求める別の方法として、攪拌フラスコ法がある。攪拌フラスコ法は、フラスコに測定対象の化合物、水及びオクタノールを入れて振とうし、化合物の水における濃度とオクタノールにおける濃度とをそれぞれ実測してその測定値に基づいてｌｏｇＤを求める。

攪拌フラスコ法において、それぞれの溶液の濃度を測定する方法として、水とオクタノールとを分液して測定する方法があるが、この分液操作は煩雑であり多検体を一括で処理するには向いていない。また、そもそも分液操作では容器等に吸着を生じるため誤差が生じるおそれがある。

また、リキッドハンドラー等により水溶液とオクタノールとをそれぞれサンプリングする方法がある。しかしながら、水層がオクタノール層の下側に位置しているため、通常この方法では、水溶液をサンプリングする際にオクタノールが混入してしまいコンタミネーションが発生する問題がある。特に、ｌｏｇＤが４〜６程度の大きい値の場合、水溶液における濃度はオクタノールにおける濃度の１／１０^４〜１／１０^６となるので、オクタノールのわずかな混入がｌｏｇＤ算出の際には、致命的な問題となる。

本発明は上記のような問題を解決するためになされたものであり、２種類の液体が２層に分かれている液体から混入を生じさせず、かつ簡易に下層の液体をサンプリングすることができるサンプリング方法、サンプリング装置、並びに当該サンプリング方法に基づくｌｏｇＤ測定方法及びｌｏｇＤ測定システムを提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明に係るサンプリング方法は、管状の先端部を備え当該先端部を上方から液体に挿入して当該先端部から当該液体を抽出する抽出手段を用いて、上層の液体と下層の液体との２層に分かれた液体を含んで構成される液体から当該下層の液体をサンプリングするサンプリング方法であって、上層の液体と互いに混合しないプラグ用液体を抽出手段の先端部に注入するプラグ注入ステップと、プラグ注入ステップにおいてプラグ用液体が注入された抽出手段により、下層の液体を抽出する抽出ステップと、を含むことを特徴とする。

このサンプリング方法では、プラグ注入ステップにおいてプラグ用液体を注入手段の先端部に注入する。続く抽出ステップにおいて、下層の液体を抽出するために抽出手段を液体に挿入して抽出手段の先端部が上層の液体を通過する際、プラグ用液体が上層の液体を撥ねて注入手段に混入することを防ぐ。即ち、下層の液体を抽出する際の上層の液体によるコンタミネーションが発生することを防ぐ。また、プラグ用液体の注入も簡易に行えることから簡易なサンプリングが可能である。

また、上層の液体は、所定の化学物質が溶解したオクタノールであり、下層の液体は、当該所定の化学物質が溶解したバッファー液であり、プラグ用液体は、バッファー液である、ことが望ましい。この構成によれば、ｌｏｇＤを算出するため等の溶液のサンプリングを、オクタノールの混入を生じさせずに容易に行うことができる。

本発明に係るｌｏｇＤ測定方法は、管状の先端部を備え当該先端部を上方から液体に挿入して当該先端部から当該液体を抽出する抽出手段を用いて、上層である所定の化学物質が溶解したオクタノールと下層である当該所定の化学物質が溶解したバッファー液との２層に分かれた液体を含んで構成される液体から当該バッファー液をサンプリングして当該化学物質のｌｏｇＤを測定するｌｏｇＤ測定方法であって、オクタノールと互いに混合しないプラグ用液体を抽出手段の先端部に注入するプラグ注入ステップと、プラグ注入ステップにおいてプラグ用液体が注入された抽出手段により、バッファー液を抽出する抽出ステップと、抽出ステップにおいて抽出されたバッファー液における化学物質の濃度を測定するバッファー液中濃度測定ステップと、バッファー液中濃度測定ステップにおいて測定された濃度に基づいてｌｏｇＤを算出するｌｏｇＤ算出ステップと、を含むことを特徴とする。

このｌｏｇＤ算出方法では、上記のサンプリング方法によりサンプリングしたバッファー液における化学物質の濃度を測定して当該測定した濃度に基づきｌｏｇＤを算出する。この方法によれば、上述したようにコンタミネーションを発生させずかつ容易にバッファー液をサンプリングすることができるので、バッファー液における化学物質の濃度を正確に測定することができる。従って、容易かつ正確にｌｏｇＤを算出することができる。なお、ここでバッファー液とは、ｌｏｇＤを測定する際に化学物質を溶解させる一方の媒質であり、例えば、水やリン酸水溶液等が相当する。

また、バッファー液中濃度測定ステップにおける濃度の測定は質量分析計を用いて行われることが望ましい。この構成によれば、バッファー液における化学物質の濃度が低い場合でも正確に濃度が測定でき、特にｌｏｇＤが４〜６程度の大きい値をとる場合でも、正確なｌｏｇＤを算出することができる。

また、オクタノールにおける化学物質の濃度を測定するオクタノール中濃度測定ステップを更に含み、ｌｏｇＤ算出ステップにおいて、バッファー液中濃度測定ステップ及びオクタノール中濃度測定ステップにおいて測定された濃度に基づいてｌｏｇＤを算出する、ことが望ましい。この構成によれば、オクタノールにおける濃度の実測値に基づいたより正確なｌｏｇＤを算出することができる。

また、オクタノール中濃度測定ステップは、オクタノールを抽出して希釈し、当該希釈したオクタノールにおける化学物質の濃度を、質量分析計を用いて測定することにより化学物質の濃度を測定する、ことが望ましい。この構成によれば、オクタノールにおける濃度がバッファー液における濃度に比べて高い場合等でも正確にｌｏｇＤを算出することができる。

本発明は、上記の方法の発明を提供する他に、以下のようにサンプリング装置及びｌｏｇＤ測定システムの発明を提供することができる。

本発明に係るサンプリング装置は、管状の先端部を備え当該先端部を上方から液体に挿入して当該先端部から当該液体を抽出する抽出手段と、上層の液体と互いに混合しないプラグ用液体を抽出手段の先端部に注入するプラグ注入手段と、プラグ注入手段によりプラグ用液体が注入された抽出手段を下層の液体を抽出するように制御する抽出制御手段と、を備えることを特徴とする。

本発明に係るｌｏｇＤ測定システムは、上層である所定の化学物質が溶解したオクタノールと下層である当該所定の化学物質が溶解したバッファー液との２層に分かれた液体を含んで構成される液体から当該バッファー液をサンプリングして当該化学物質のｌｏｇＤを測定するｌｏｇＤ測定システムであって、管状の先端部を備え当該先端部を上方から液体に挿入して当該先端部から当該液体を抽出する抽出手段と、オクタノールと互いに混合しないプラグ用液体を抽出手段の先端部に注入するプラグ注入手段と、プラグ注入手段によりプラグ用液体が注入された抽出手段を、バッファー液を抽出するように制御する抽出制御手段と、抽出制御手段による制御において抽出されたバッファー液における化学物質の濃度を測定するバッファー液中濃度測定手段と、バッファー液中濃度測定手段により測定された濃度に基づいてｌｏｇＤを算出するｌｏｇＤ算出手段と、を備えることを特徴とする。

本発明によれば、プラグ用液体が上層の液体を撥ねて注入手段に混入することを防ぐので、下層の液体を抽出する際の上層の液体によるコンタミネーションが発生することを防ぐ。また、プラグ用液体の注入も簡易に行えることから簡易なサンプリングが可能である。

本発明の実施形態におけるｌｏｇＤ測定システムの構成を模式的に示した図である。 本発明の実施形態におけるサンプリング方法及びｌｏｇＤ測定方法における処理のフローを示したである。 サンプリングの各フェーズを模式的に示した図である。 プラグ用液体を用いていない場合の試料をＨＰＬＣで分離して質量分析計にかけたときのピークのグラフである。 プラグ用液体を用いた場合の試料をＨＰＬＣで分離し質量分析計にかけたときのピークのグラフである。 本実施形態により質量分析計で濃度を測定したｌｏｇＤの測定値とＵＶを用いた方法で濃度を測定したｌｏｇＤの測定値との散布図である。 本実施形態により測定したｌｏｇＤの実測値と文献値との散布図である。

符号の説明

１０…測定システム、１１…シリンジ、１１ａ…ニードル、１２…ウェルプレート、１２ａ…ウェル、１３…オートサンプラー、１４…ＨＰＬＣ、１５…質量分析計、１６…制御分析用ＰＣ、５０ａ…オクタノール、５０ｂ…バッファー液、５１…プラグ用液体。

以下、図面とともに本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。

図１は、本発明に係るｌｏｇＤ測定システム１０の実施形態の構成を模式的に示した図である。ｌｏｇＤ測定システム１０は、化合物等の化学物質のｌｏｇＤをバッファー液及びオクタノールに溶解した当該化合物の濃度を実測することにより測定するものである。濃度を実測する際には、化合物が溶解したバッファー液及びオクタノールを抽出して行う。ここで、バッファー液はｌｏｇＤを測定する際に化合物を溶解させる一方の媒質であり、例えば、水やリン酸水溶液等が相当する。なお、ｌｏｇＤはｐＨ毎に異なる値を取るので、例えば製薬の目的でｌｏｇＤを測定する場合は、バッファー液として人体の体液と同じｐＨ７．４の液体を用いることが好ましい。例えばｐＨ７．４のリン酸水溶液は、例えばＮａＨ_２ＰＯ_４水溶液とＮａ_２ＨＰＯ_４水溶液とを用いて調整することができる。バッファー液として用いるリン酸水溶液の濃度は、１０〜２００ｍＭ程度であるのが好ましい。

ところで、上述したようにｌｏｇＤが４〜６程度の大きい値をとる場合、バッファー液における濃度はオクタノールにおける濃度の１／１０^４〜１／１０^６となるので、バッファー液の抽出の際のオクタノールのわずかな混入がｌｏｇＤ算出の際には、致命的な問題となる。例えば、後述するようにバッファー液を２．５μｌ抽出するとし、１０％のコンタミネーションを許したとする。化合物のｌｏｇＤが４だとすると、バッファー液における濃度はオクタノールにおける濃度の１／１０^４である。この場合のオクタノールの混入の許容量は、抽出量（２．５μｌ）×濃度比（１／１０^４）×許容率（１０％）でわずか２５ｐｌとなる。従って、本システム１０においては、バッファー液の抽出の際のオクタノールの混入を十分に防止することが必要となる。

以下、ｌｏｇＤ測定システム１０の構成を説明する。図１に示すように、ｌｏｇＤ測定システム１０は、ウェルプレート１２と、オートサンプラー１３と、ＨＰＬＣ１４と、質量分析計１５と、制御分析用ＰＣ（Personal Computer）１６とを含んで構成されている。

ウェルプレート１２は、液体を保持できるように複数のウェル１２ａが設けられており、当該ウェル１２ａにおいてオクタノール層とバッファー液層の２層からなる、ｌｏｇＤを測定するためのサンプルを調整及び保持するためのものである。ウェル１２ａは、多検体のサンプルを同時に調整及び保持できるように、例えば９６個設けられていることが好ましい。

オートサンプラー１３は、所定位置に置かれたウェルプレート１２のウェル１２ａに保持された液体を抽出する抽出手段である。抽出された液体（サンプル）は、ＨＰＬＣ１４及び質量分析計１５で分析されるために、自動的にＨＰＬＣ１４に送られる。オートサンプラー１３にはシリンジ１１が備えられており、図３に示すように、シリンジ１１には液体を抽出する管状の先端部であるニードル１１ａを備えて構成されている。シリンジ１１は、ニードル１１ａを上方から液体に挿入してニードル１１ａから液体を抽出する。ここでニードル１１ａは、その内径がコンマ数ｍｍ単位、長さが数十ｍｍ単位のものを用いることが好ましい。シリンジ１１は、制御分析用ＰＣ１６からの制御を受け、μｌ単位での正確な液体の抽出が可能である。なお、オートサンプラー１３として、具体的には例えばＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ社のＨＴＳ ＰＡＬを用いることができる。

ＨＰＬＣ１４は、オートサンプラー１３から送られたサンプルを分離して質量分析計１５に送る。ＨＰＬＣ１４として、具体的には例えばＷａｔｅｒｓ社のａｌｌｌｉａｎｃｅ ２６９０を用いることができる。

質量分析計１５は、サンプルに含まれる化合物の量の定量値を測定する。具体的には、当該化合物の質量に対応するピークの値に基づいて定量値を測定する。測定されたデータは制御分析用ＰＣに送信される。なお、質量分析計１５におけるイオン化電圧は、測定対象の化合物のアセトニトリル溶液等の調整用サンプルを用いて、ｌｏｇＤの測定の前に予め適切な値に設定されていることが好ましい。質量分析計１５として、具体的には例えばＷａｔｅｒｓ社のＺＱ２０００を用いることができる。

制御分析用ＰＣ１６は、オートサンプラー１３、ＨＰＬＣ１４及び質量分析計１５を制御する。各装置がどのように動作するように制御するのかは後述する。これらの制御は、制御用のプログラム及びソフトウェアを用いて行うのが好ましい。また、制御分析用ＰＣ１６は、質量分析計１５により取得された化合物の量の定量値から濃度を算出し、その濃度からｌｏｇＤを算出する。具体的算出方法については、後述する。ＨＰＬＣ１４、質量分析計１５及び制御分析用ＰＣ１６は、バッファー液及びオクタノールにおける化合物の濃度を測定する各濃度測定手段に相当する。また、制御分析用ＰＣ１６は測定された濃度からｌｏｇＤを算出するｌｏｇＤ算出手段に相当する。

次に、ｌｏｇＤ測定システム１０を用いた本発明に係るサンプリング方法及びｌｏｇＤ測定方法の実施形態について、図２に示すフローチャートを参照しつつ説明する。

まず、ｌｏｇＤを測定するためのサンプルを以下のように調整する（Ｓ０１）。このサンプルは、ｌｏｇＤの測定対象となる化合物をバッファー液及びオクタノールに溶解させて２層に分離したものである。測定対象の化合物は、サンプル調整の前に予めＤＭＳＯ（Dimethyl Sulfoxide）に１ｍＭあるいは１０ｍＭ等の所定の濃度で溶解させておくことが好ましい。オクタノール及びバッファー液に化合物を溶解させやすくするためである。

サンプル調整のために、まず、化合物を溶解させたＤＭＳＯを、１０μｌ等の所定の分量ずつウェルプレート１２の各ウェル１２ａにピペットを用いて分注する。なお、ピペットは、ピペットに備えられるマイクロプロセッサの制御を受け、μｌ単位での正確な液体の抽出及び添加が可能であるものを用いることが好ましい。また、多検体のサンプルを同時に抽出できるようにピペットには複数のチャンネルが設けられていることが好ましい。

続いて、３００μｌ等の所定の分量のオクタノールをウェルプレート１２の各ウェル１２ａにピペットを用いて添加する。その後、各ウェル１２ａにウェルキャップ等で蓋をし、ウェルプレート１２に対して攪拌処理及び遠心処理を行うことが好ましい。ＤＭＳＯはオクタノールよりバッファー液に溶解しやすいので、予めオクタノールに溶解させておく。正確なｌｏｇＤを測定できるようにするためである。攪拌処理は、例えば振とう機により室温で５分間激しく行う。また遠心処理は、例えば攪拌処理後に遠心分離機にて２０００ｒｐｍで５分間行う。

続いて、ウェルプレート１２にした蓋を外して、６００μｌ等の所定の分量のバッファー液を各ウェル１２ａにピペットを用いて添加する。その後、各ウェル１２ａに再度蓋をし、ウェルプレート１２に対して攪拌処理及び遠心処理を行う。攪拌処理は、例えば振とう機により室温で１時間激しく行う。また遠心処理は、例えば攪拌処理後に遠心分離機にて２０００ｒｐｍで５分間行う。以上の処理がなされると、各ウェル１２ａには、図３（ｂ）に示すように、上層のオクタノール層５０ａと下層のバッファー液層５０ｂとが分離したｌｏｇＤを測定するためのサンプルが生成される。

引き続いて、濃度を測定するためにオクタノール５０ａ及びバッファー液５０ｂのサンプリングを行う（Ｓ０２〜Ｓ０４）。まず、バッファー液５０ｂのサンプリングについて、図３を用いて説明する。上記調整されたサンプルがウェル１２ａに含まれるウェルプレート１２をオートサンプラー１３の所定位置に蓋を外した状態で置く。制御分析用ＰＣ１６から制御を受けたオートサンプラー１３は図３（ａ）に示すように、ウェルプレート１２とは別の位置に設けられた、容器でもあるウォッシュポート２０からシリンジ１１に所定量のプラグ用液体５１を注入する（Ｓ０２、プラグ注入ステップ）。この注入により、図３（ａ）に示すように、シリンジ１１のニードル１１ａは、プラグ用液体５１が含まれている状態となる。上記所定量は、例えば２．５μｌ等の適当な量である。なお、図３に示すように、上記のウォッシュポート２０の底部には、管２１が接続されている。また、管２１には電磁弁２２が設けられており、この電磁弁２２を開閉することにより下記の洗浄前後でウォッシュポート２０内の液を管２１から交換することができる。

プラグ用液体５１は、下層のバッファー液５０ｂを抽出する際に上層のオクタノール５０ａがシリンジ１１に混入することを防止するものである。プラグ用液体５１としては、上層のオクタノール５０ａと互いに混合しないものを用いる。具体的には例えば、水やリン酸水溶液を用いることが好ましい。即ちバッファー液５０ｂと同じもの（化合物が溶解していないもの）を用いることが好ましい。なお、このステップにおける制御分析用ＰＣ１６は、抽出手段の先端部であるニードル１１ａにプラグ用液体を注入するように制御するプラグ注入（制御）手段の役割を果たす。

続いて、プラグ用液体がニードル１１ａに注入されたシリンジ１１により、下層のバッファー液を抽出する（Ｓ０３、抽出ステップ）。この抽出は、制御分析用ＰＣ１６から制御を受けたオートサンプラー１３が図３（ｂ）〜（ｅ）に示すように、サンプルが入ったウェル１２ａにシリンジ１１のニードル１１ａを挿入することにより行われる。図３（ｂ）に示すように、ニードル１１ａがオクタノール層５０ａを通過する際、ニードル１１ａにはプラグ用液体５１が含まれた状態になっているので、当該プラグ用液体５１が、オクタノール５０ａを撥ねオクタノール５０ａのシリンジ１１内への混入を防止する。図３（ｃ）に示すように、ニードル１１ａがバッファー液層５０ｂに挿入されると、ニードル１１ａから所定量のバッファー液５０ｂを抽出する。この抽出がされると、ニードル１１ａには、バッファー液５０ｂが含まれている状態となる。上記所定量は、例えば２．５μｌ等の適当な量である。

続いて、図３（ｄ）に示すように、ニードル１１ａを引き抜くときにオクタノール層５０ａを通過する際、ニードル１１ａにはバッファー液５０ｂが含まれた状態になっているので、当該バッファー液５０ｂが、オクタノール５０ａを撥ねオクタノール５０ａのシリンジ１１内への混入を防止する。なお、オクタノール５０ａとバッファー液５０ｂとは、２層に分かれる性質を有しているので、上記のようにバッファー液５０ｂはオクタノール５０ａを撥ねることができる。続いて、図３（ｅ）に示すようにニードル１１ａは、サンプルから引き抜かれる。サンプルから引き抜かれた後、ウォッシュポート２０で水やエタノール等を用いてニードル１１ａの周囲を洗浄し、ニードル１１ａの周囲に付着したオクタノール５０ａによりコンタミネーションが発生することを防止する。サンプリングされたバッファー液５０ｂは、ＨＰＬＣ１４に自動的に送られる。なお、このステップにおける制御分析用ＰＣ１６は、抽出手段に対しバッファー液５０ｂを抽出するように制御する抽出制御手段の役割を果たす。

また、プラグ用液体５１とバッファー液５０ｂとは通常、図３に示すように２層に別れず混合するが（図３では説明を分かりやすくするため２層に分けている）、抽出したバッファー液層５０ｂに含まれる化合物の量は変わらないので、バッファー層中の濃度の測定を行うことができる。

次に、オクタノール５０ａのサンプリングについて、説明する。オクタノール層５０ａは上層であるので、抽出の際のコンタミネーションのおそれはないので、ピペット等により抽出を行う（Ｓ０４）。ところで、オクタノール５０ａにおける化合物の濃度は、バッファー液５０ｂにおける化合物の濃度に比べて高い。上述したように例えばｌｏｇＤが４のとき、オクタノールにおける化合物の濃度はバッファー液５０ｂにおける化合物の濃度の１０００倍である。従って、質量分析計１５におけるイオン飽和を避けるため、抽出したオクタノール５０ａをエタノール等の希釈用の溶媒で希釈することが好ましい。ｌｏｇＤが４〜６の高い値をとる場合でも正確に測定できるように、希釈は例えば数千倍のオーダで行われることが望ましい。希釈されたオクタノール５０ａは、別のウェルプレートに入れ、バッファー液の抽出と同様にオートサンプラー１３により抽出されＨＰＬＣ１４に自動的に送られる。なお、バッファー液５０ｂのサンプリングが先に行われる必要はなく、オクタノール５０ａのサンプリングが先に行われてもよい。

引き続いて、ウェル１２ａから抽出されＨＰＬＣ１４に送られたオクタノール５０ａ及びバッファー液５０ｂにおけるｌｏｇＤ測定対象の化合物の濃度が、ＨＰＬＣ１４及び質量分析計１５を用いてそれぞれ測定される（Ｓ０５、バッファー液中濃度測定ステップ、オクタノール中濃度測定ステップ）。濃度の測定は具体的には、質量分析計１５により取得されたスペクトルデータにおける当該化合物に対応するピーク値から、各溶液に含まれる化合物の量の定量値を算出することにより行われる。なお、定量値の算出等の情報処理は制御分析用ＰＣ１６において行われる。なお、オクタノール５０ａ及びバッファー液５０ｂにおける濃度の測定は、それぞれ別々のタイミングで行われる。

なお、Ｓ０５での各溶液中における濃度の測定は、例えば上記のような質量分析計１５を用いた方法でなく、ＵＶ（Ultra Violet：紫外線）の吸光率に基づいた測定法を用いて行うこととしてもよい。

引き続いて、制御分析用ＰＣ１６が、測定された濃度から次の式を用いてｌｏｇＤを算出する（Ｓ０６、ｌｏｇＤ算出ステップ）。
ｌｏｇＤ＝ｌｏｇ（［オクタノール層濃度］／［バッファー液層濃度］）
＝ｌｏｇ（［希釈オクタノール濃度×希釈倍率］／［バッファー液層濃度］）

上記のように、本実施形態によれば、プラグ用液体５１を用いることにより、下層のバッファー液５０ｂ抽出の際の、上層のオクタノール５０ａによるコンタミネーションの発生を防ぐ。また、本実施形態におけるサンプリング方法は、プラグ用液体の注入も簡易に行えることから簡易なサンプリングが可能である。また、コンタミネーションを防止できていることから、正確な濃度の測定が可能となる。従って、容易かつ正確にｌｏｇＤを算出することができる。また、上記のように本実施形態は容易に実施でき、またサンプリングからｌｏｇＤの測定までを自動化することができるので、従来の方法に比べて、多検体を短期間に分析することに適している。

なお、サンプリングに用いる２層の液体は、必ずしも上述したものでなくてもよい。上層の液体は、ｌｏｇＤ測定対象の化学物質等の所定の化学物質が非水系溶媒に溶解した非水系溶液であればよい。非水系溶媒は、具体的には例えば、炭素数が４以上のアルカノールが相当する。また、下層の液体は、上記の所定の化学物質が、水系溶媒に溶解した水系溶液であればよい。水系溶媒は、上記の非水系溶媒に不溶な液体であり、具体的には例えば、水又は所定の塩が溶解した水溶液が相当する。また、プラグ用液体も、上記の水系溶媒であればよい。

本サンプリング方法が従来の方法と比べてコンタミネーションを防止できていることを、図４及び図５を用いて説明する。図４及び図５は試料をＨＰＬＣ１４で分離したときのクロマトグラムであり、各クロマトグラムにおいて横軸は時間、縦軸は測定されたピーク強度を示している。図４及び図５において（ａ）は、何も試料をＨＰＬＣ１４に送らなかった場合（ブランク）のクロマトグラムである。（ｂ）は、ｌｏｇＤ測定用に調整しておいたオクタノール層５０ａとバッファー液層５０ｂと２層になっているものから予めオクタノール層５０ａのみを除いたバッファー液５０ｂを抽出したものを測定した場合（オクタノールによるコンタミネーションが発生しえない場合）のクロマトグラムである。（ｃ）は上述したようにオクタノール層５０ａとバッファー液層５０ｂと２層になっているものからバッファー液５０ｂを抽出したものを測定した場合のクロマトグラムである。（ｄ）は（ａ）と同様にブランクの場合のグラフである。なお、（ａ）から（ｄ）まで、同一の装置を用いて連続的に測定を行っている。

図４は、オクタノール層５０ａとバッファー液層５０ｂと２層になっているものからのバッファー液５０ｂを抽出の際（（ｃ）に対応）に、プラグ用液体を用いなかった場合のクロマトグラム、図５は用いた場合（本実施形態のようにサンプリングした場合）のクロマトグラムである。図４（ａ）及び図５（ａ）と図４（ｂ）及び図５（ｂ）との比較等から分かるように、２．３２〜２．３５の範囲の時間のピークが測定対象の化合物に対応するものである。図４（ｃ）では、その２．３２〜２．３５の範囲の時間のピークが幅をもってしまっているのに対して、図５（ｃ）では、２．３２〜２．３５の範囲の時間のピークが図４（ｂ）及び図５（ｂ）と同様の形状になっている。これは、プラグ用液体を用いなかった場合（図４）、オクタノール５０ａによるコンタミネーションが発生し、オクタノール５０ａに含まれる化合物まで検出されてしまっていることを示している。一方、プラグ用液体を用いた場合（図５、本実施形態の場合）、オクタノール５０ａによるコンタミネーションが発生せず、バッファー液５０ｂに含まれる化合物のみが検出されたことを示している。

また、本実施形態のように抽出手段としてニードル１１ａを備えて構成されるシリンジ１１を用いることとすれば、プラグ用液体５１の注入等の扱いが容易である。また、ニードル１１ａは、コンマ数ｍｍ単位の内径及び数十ｍｍ単位の長さを有しているのでプラグ用液体を保持しやすく、より確実なコンタミネーションの防止が可能となる。

また、本実施形態のように質量分析計１５を用いることとすれば、バッファー液における化合物の濃度が低い場合等、即ちバッファー液から抽出したものに含まれる化合物の量が微小な場合等でも、化合物の量の定量化を行うことができ正確にｌｏｇＤを算出することができる。

特にｌｏｇＤが４〜６程度の高い値をとる場合には、より正確に測定することが可能である。質量分析計１５を用いて測定したｌｏｇＤとＵＶを用いて測定したｌｏｇＤとを化合物毎にプロットしたものが図６である。図６に示すように、ＵＶを用いた方法で十分精度よく測定できなかったもの（グラフ中で“ＵＶ＞４”と表示してある点、便宜的にｌｏｇＤ＝５としてプロットしてある）や、ＵＶを用いた方法で測定できなかったもの（グラフ中で“ＵＶ Ｎ．Ｄ．”（Not Detected）と表示してある点、便宜的にｌｏｇＤ＝６としてプロットしてある）も測定することが可能となっている。

また、本実施形態のようにオクタノール５０ａにおける濃度も求めることとすれば、より正確なｌｏｇＤの算出が可能となる。また、本実施形態のようにｌｏｇＤの値を考慮してオクタノール５０ａを希釈して濃度を測定することとすれば、オクタノール５０ａにおける濃度がバッファー液５０ｂにおける濃度に比べて高い場合でも正確にｌｏｇＤを算出することができる。

また、本実施形態ではバッファー液５０ｂが特定のｐＨをとる場合についてのｌｏｇＤの測定を行うこととしたが、本発明の方法を用いて、例えば、バッファー液５０ｂのｐＨを複数回変更してｌｏｇＤを測定してｌｏｇＰを算出することもできる。

上記の実施形態における実施例を以下に示す。本実施例においては次の器具及び試薬等を用いた。
ウェルプレート１２：96 deep well plate（Agilent）（また、ウェルプレート１２の蓋として、96 well Cap（Agilent）を用いた）
オクタノール５０ａ：Wako特級1-Octanol
ＤＭＳＯ：ＤＳＭＯ紫外線吸収スペクトル用純溶媒（Dojindo）
エタノール：Wako HPLC用EtOH
また、ｌｏｇＤの測定対象の化合物としては、以下の表１に示すものを用いた。

これらの化合物は、市販薬の成分であり、ｌｏｇＤが既知なものである。

上記した本実施形態に係る方法により各化合物についてｌｏｇＤを測定した値を以下の表２及び図７のグラフに示す。表２及び図７のグラフに示す実測値は、アミノダロンを除き１つの化合物につき本実施形態による方法での３回の測定を行い（アミノダロンは１回測定）、それらの測定値の平均をとった値である。

表２及び図７のグラフに示す文献値はJ.Med.Chem.2001,44,2490-2497（ElogDoct：A Tool for Lipophilicity Determination in Drug Discovery.2. Basic and Neutral Compounds、Franco Lombardo，Marina Y.Shalaeva，Karl A.Tupper，and Feng Gao）に記載されたものである。

表２及び図７のグラフに示すように、文献値に近い実測値が得られており、本実施形態に係る方法で正確なｌｏｇＤが得られることを示している。

Claims (8)

1. 管状の先端部を備え当該先端部を上方から液体に挿入して当該先端部から当該液体を抽出する抽出手段を用いて、上層の液体と下層の液体との２層に分かれた液体を含んで構成される液体から当該下層の液体をサンプリングするサンプリング方法であって、
   前記上層の液体と互いに混合しないプラグ用液体を前記抽出手段の先端部に注入するプラグ注入ステップと、
   前記プラグ注入ステップにおいて前記プラグ用液体が注入された抽出手段により、前記下層の液体を抽出する抽出ステップと、
   を含むサンプリング方法。
2. 前記上層の液体は、所定の化学物質が溶解したオクタノールであり、
   前記下層の液体は、当該所定の化学物質が溶解したバッファー液であり、
   前記プラグ用液体は、バッファー液である、
   ことを特徴とする請求項１に記載のサンプリング方法。
3. 管状の先端部を備え当該先端部を上方から液体に挿入して当該先端部から当該液体を抽出する抽出手段を用いて、上層である所定の化学物質が溶解したオクタノールと下層である当該所定の化学物質が溶解したバッファー液との２層に分かれた液体を含んで構成される液体から当該バッファー液をサンプリングして当該化学物質のｌｏｇＤを測定するｌｏｇＤ測定方法であって、
   前記オクタノールと互いに混合しないプラグ用液体を前記抽出手段の先端部に注入するプラグ注入ステップと、
   前記プラグ注入ステップにおいて前記プラグ用液体が注入された抽出手段により、前記バッファー液を抽出する抽出ステップと、
   前記抽出ステップにおいて抽出されたバッファー液における前記化学物質の濃度を測定するバッファー液中濃度測定ステップと、
   前記バッファー液中濃度測定ステップにおいて測定された濃度に基づいて前記ｌｏｇＤを算出するｌｏｇＤ算出ステップと、
   を含むｌｏｇＤ測定方法。
4. 前記バッファー液中濃度測定ステップにおける濃度の測定は質量分析計を用いて行われることを特徴とする請求項３に記載のｌｏｇＤ測定方法。
5. 前記オクタノールにおける前記化学物質の濃度を測定するオクタノール中濃度測定ステップを更に含み、
   前記ｌｏｇＤ算出ステップにおいて、前記バッファー液中濃度測定ステップ及び前記オクタノール中濃度測定ステップにおいて測定された濃度に基づいて前記ｌｏｇＤを算出する、
   ことを特徴とする請求項３又は４に記載のｌｏｇＤ測定方法。
6. 前記オクタノール中濃度測定ステップは、前記オクタノールを抽出して希釈し、当該希釈したオクタノールにおける前記化学物質の濃度を、質量分析計を用いて測定することにより前記化学物質の濃度を測定する、
   ことを特徴とする請求項５に記載のｌｏｇＤ測定方法。
7. 上層の液体と下層の液体との２層に分かれた液体を含んで構成される液体から当該下層の液体をサンプリングするサンプリング装置であって、
   管状の先端部を備え当該先端部を上方から液体に挿入して当該先端部から当該液体を抽出する抽出手段と、
   前記上層の液体と互いに混合しないプラグ用液体を前記抽出手段の先端部に注入するプラグ注入手段と、
   前記プラグ注入手段により前記プラグ用液体が注入された抽出手段を前記下層の液体を抽出するように制御する抽出制御手段と、
   を備えるサンプリング装置。
8. 上層である所定の化学物質が溶解したオクタノールと下層である当該所定の化学物質が溶解したバッファー液との２層に分かれた液体を含んで構成される液体から当該バッファー液をサンプリングして当該化学物質のｌｏｇＤを測定するｌｏｇＤ測定システムであって、
   管状の先端部を備え当該先端部を上方から液体に挿入して当該先端部から当該液体を抽出する抽出手段と、
   前記オクタノールと互いに混合しないプラグ用液体を前記抽出手段の先端部に注入するプラグ注入手段と、
   前記プラグ注入手段により前記プラグ用液体が注入された抽出手段を、前記バッファー液を抽出するように制御する抽出制御手段と、
   前記抽出制御手段による制御において抽出されたバッファー液における前記化学物質の濃度を測定するバッファー液中濃度測定手段と、
   前記バッファー液中濃度測定手段により測定された濃度に基づいて前記ｌｏｇＤを算出するｌｏｇＤ算出手段と、
   を備えるｌｏｇＤ測定システム。

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