JP4316185B2 - Method for separating tocopherols and tocotrienols - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は順相液体クロマトグラフィーを用いてトコフェロール類とトコトリエノール類を分離する方法に関するものである。詳しくは、順相液体クロマトグラフィーにより、トコフェロール類とトコトリエノール類を含有する溶液から、トコフェロール同族体を相互に分離すると同時にトコフェロール類とトコトリエノール類をも分離する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
トコフェロール類およびトコトリエノール類は大豆油、菜種油、綿実油、サフラワー油、米ぬか油、トウモロコシ油、ひまわり油等の脱臭工程で副生する脱臭留出物中に含有されており、ｄ−α，ｄ−β，ｄ−γ，ｄ−δ−トコフェロールおよびｄ−α，ｄ−β，ｄ−γ，ｄ−δ−トコトリエノールの同族体が存在する。なお、天然由来のトコフェロールおよびトコトリエノールは全てｄ体であるが、合成由来のトコフェロールおよびトコトリエノールは通常はｄｌ体である（本明細書において特に記載しない限り、トコフェロールおよびトコトリエノールはｄ体、ｌ体およびｄ体とｌ体の混合物の何れも含むものとする）。
【０００３】
トコフェロール類およびトコトリエノール類はビタミンＥ群としての生理活性があり、また抗酸化作用があることから薬品，化粧品，食品等において利用されている。近年になって、ビタミンＥ生理活性ではα−トコフェロールに比べて劣るが、酸化防止作用を有するβ，γ，δ−トコフェロールについて、その酸化防止効果はδ−トコフェロールが優れており、またγ−トコフェロールには排尿や肌の健康に効果があるなど、個々のトコフェロール同族体についての機能性が注目されており、これらを効率的に単離する方法が求められるようになっている。
また、トコトリエノール類についても高脂血症改善作用，アテローム性動脈硬化改善作用，抗癌作用などの機能性が見いだされており、トコフェロール類からの効率的な分離方法が求められるようになっている。
【０００４】
しかしながら、従来はトコフェロール類を精製濃縮するために分子蒸留法、イオン交換樹脂処理等の方法が用いられていたが、分子蒸留法では分離操作が困難なうえに高濃度の濃縮物を収率よく得ることは非常に難しく、またイオン交換樹脂処理法では樹脂の再生が必要で溶剤置換を行う場合に生ずる溶出薬剤の除去処理等繁雑な工程を要する欠点があり、更にこれらの方法ではトコフェロール類の各同族体の単離およびトコトリエノール類との効率的な分離が困難であった。
これらの問題点を解決するために各種方法が提案されている。その一方法は、イオン交換樹脂ではない有機高分子を用いる方法であり、例えば、特公昭６０−３７１１０号公報には粗製トコフェロールをスチレンジビニルベンゼン共重合体ポーラスポリマーを充填したカラムに供し、アルコール溶媒系にて展開溶出し精製トコフェロールを得る方法が開示されている。本方法はスチレンジビニルベンゼン共重合体ポーラスポリマーに対してアルコール溶媒系の極性が高いことから逆相クロマトグラフィー分離であるが、この方法ではα−トコフェロール，（β−トコフェロール＋γ−トコフェロール），δ−トコフェロールの各同族体間の分離が出来ておらず、またトコトリエノール類の分離可能性については何等言及されていない。
【０００５】
また、特許第２７５７３７２号公報には、水と相溶せず原料の重合性単量体と相溶する有機溶剤からなる希釈剤の存在下、水系懸濁重合で得られる６０重量％以上の１分子内に複数のビニル基を有する架橋性単量体を結合含有する多孔性重合体からなり、該重合体の粒子径が１０μ以上で、かつゲル水分率が３０％以上であるトコフェロール類の分離濃縮用ビーズを充填したカラムに脱臭留出物を注入した後展開溶媒を通液し、液体クロマトグラフィーによりトコフェロール類を分離濃縮する方法が開示されている。本方法では、展開溶媒として推奨され、且つ具体的に用いられたメタノールが該多孔性重合体に対して極性が高いことから逆相クロマトグラフィー分離であり、トコフェロール同族体の相互分離、即ちα−トコフェロール，（β−トコフェロール＋γ−トコフェロール），δ−トコフェロールの分離が出来ておらず、またトコトリエノール類の分離可能性については言及されていない。
【０００６】
一方、シリカゲル系充填剤を用いる方法も検討されており、例えば、特開平８−５９６４７号公報ではシリカゲル系充填剤を充填した擬似移動層を用いて、トコフェロール成分を分離精製する方法が開示されているが、本方法でもトコフェロールとトコトリエノールの分離可能性については言及されていない。
また、特開２００１−１２２８６９号公報においてはトコトリエノール類、トコフェロール類及びそれらの異性体類を粗初期原料から逆相液体クロマトグラフィーを用いて単離する方法が開示されているが、本方法での移動相はアルコールおよび所定量以下の水を含む溶媒が使用されており、移動相に水が入ると一般的にはトコフェロール類およびトコトリエノール類の溶解度が低下することから高濃度負荷が出来ず工業的には不利である。
【０００７】
更に、特開２００１−２６１６７１号公報にはシリカゲル、逆相Ｃ１８シリカゲルを用いて超臨界流体環境下でビタミンＥを含んでなる化合物からのビタミンＥ異性体をクロマトグラフィー単離する方法が開示されているが、本方法では超臨界流体を用いるため設備費用が高いという工業的欠点を有する。
加えて、シリカゲル系充填剤についてはシリカゲルの製造において各種金属の混入程度を制御することが難しく、これらの混入金属イオン等の影響による分離挙動の再現性の問題があり、また水分の影響による保持挙動の変動も大きく運転上の安定性にも問題がある。更にＣ１８基のごときアルキル基を導入したシリカゲル系充填剤を用いる場合にも、この導入率の制御、またアルキル基未導入部分のエンドキャップの制御が難しく分離挙動の再現性に問題がある。
以上のように、従来技術においては工業的に効率的かつ安定的な方法にてトコフェロール類とトコトリエノール類を分離することは困難であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記実情に鑑みてなされたものであり、その目的は、工業的に効率的かつ安定的なトコフェロール類、トコトリエノール類の分離方法、更にはトコフェロール類の各同族体とトコトリエノール類との分離方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、固定相として製造再現性に優れ、また酸・アルカリ等の化学的耐性に優れる特徴を持つ多孔質有機高分子粒子を用いた順相液体クロマトグラフィーを適用することによりトコフェロール類とトコトリエノール類の分離は勿論、トコフェロール類の各同族体間の単離も同時に効率的かつ安定的に出来ることを見いだし、本発明を完成した。
即ち、本発明の要旨は、トコフェロール類およびトコトリエノール類を含む溶液から順相液体クロマトグラフィーにより、所望のトコフェロール類、又はトコトリエノール類を分離する方法、更にはトコフェロール類の各同族体とトコトリエノール類とを分離する方法において、順相液体クロマトグラフィーの固定相として多孔質有機高分子粒子を用いることを特徴とする分離方法に存するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、順相クロマトグラフィーによりトコフェロール類およびトコトリエノール類を分離する方法に係わり、この順相クロマトグラフィーに固定相として多孔質有機高分子粒子を用いることが必須である。
本発明で用いられる多孔質有機高分子粒子としては、液相クロマトグラフィーに使用されるものから選定することが出来るが、代表的なものとしては多孔質のポリビニルベンゼン系架橋（共）重合体および（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体等があげられる。
ポリビニルベンゼン系架橋（共）重合体としては、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、α−メチルスチレン、クロロスチレン、クロロメチルスチレン、ｐ−ヒドロキシスチレン、ｐ−ｔ−ブトキシスチレン等のスチレン系単量体と架橋剤としてのジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン等のポリビニルベンゼン系単量体との架橋共重合体、或いはジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン等のポリビニルベンゼン系単量体の単独重合体又は２種以上からなる共重合体があげられるが、これらの中、特にスチレン−ジビニルベンゼン系架橋共重合体が好ましい。これらの架橋（共）重合体は公知の方法により製造することができる。
【００１１】
（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体としては、（メタ）アクリル酸エステル及びその誘導体、並びに（メタ）アクリル酸ポリオールエステル等の単量体の（共）重合体であり、例えば（メタ）アクリル酸エステル及びその誘導体と（メタ）アクリル酸ポリオールエステルとの共重合体、或いは（メタ）アクリル酸ポリオールエステルの単独重合体又は少なくとも２種の共重合体が挙げられ、これらの架橋（共）重合体は公知の方法により製造される。
（メタ）アクリル酸エステル及びその誘導体としては、具体的に（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル等の（メタ）アクリル酸アルキルエステル類；（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸２−クロロエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸ジエチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸テトラヒドロフルフリル、（メタ）アクリル酸２，３−ジヒドロキシプロピル等の（メタ）アクリル酸エステル誘導体類が挙げられる。
【００１２】
また、（メタ）アクリル酸ポリオールエステルとしては、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、グリセリントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラヒドロキシブタンジ（メタ）アクリレート、ブタンジオールジ（メタ）アクリレート，ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの架橋（共）重合体等はそのままで用いることができるが、また必要に応じて更に官能基を導入して用いてもよい。導入する官能基としては、例えば、水酸基、エステル基、エーテル基、カルボニル基等の含酸素官能基、アミノ基、アミド基、ニトロ基、ニトリル基等の含窒素官能基、チオール基、スルホン基等の含硫黄官能基等が挙げられるが、中でも水酸基、エステル基、アミノ基、アミド基、ニトリル基が好ましく、水酸基、エステル基が更に好ましい。
架橋共重合体の中で好ましい具体例としては、（メタ）アクリル酸エステルと（メタ）アクリル酸ポリオールエステルとの架橋共重合体である（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体、ｐ−ｔ−ブトキシスチレンとジビニルベンゼンとの架橋共重合体の加水分解物等があげられ、特に好ましくは（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体があげられる。
【００１３】
多孔質有機高分子粒子が多孔性であることは順相クロマトグラフィーによる分離時の処理量を高めるために有効であり、具体的には窒素吸着法にて求められる比表面積として１ｍ2／ｇ以上、好ましくは５０ｍ2／ｇ以上、更に好ましくは１００ｍ2／ｇ以上であり、２０００ｍ2／ｇ以下である。また、細孔容積としては０．０１ｍｌ／ｇ以上、好ましくは０．１ｍｌ／ｇ以上、更に好ましくは０．２ｍｌ／ｇ以上であり、３．０ｍｌ／ｇ以下である。
多孔質有機高分子粒子の平均粒子径については１μｍから２ｍｍの範囲、好ましくは３μｍから２ｍｍの範囲、工業的に更に好ましくは４μｍから１ｍｍの範囲であり、また粒子形状は真球状であり、粒子径分布は狭いことが好ましい。
【００１４】
これら多孔質有機高分子粒子は上記の多孔質特性を満たす限り市販品から適宜選定することができる。スチレン−ジビニルベンゼン系架橋共重合体の具体的製品例としては、ダイヤイオン ＨＰ２０、ＨＰ２０Ｓ、ＨＰ２０ＳＳ、ＨＰ２１、セパビーズ ＳＰ２０ＳＳ、ＳＰ２０ＤＦ、ＳＰ２０７、ＳＰ７０、ＳＰ７００、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＨＰ１０Ｍ、ＣＨＰ５Ｃ、ＣＨＰ２０Ｐ、ＣＨＰ２０Ａ、ＣＨＰ２０Ｙ、ＣＨＰ５５Ａ、ＣＨＰ５５Ｙ等（以上、三菱化学(株)製；商品名）；アンバーライト ＸＡＤ２（スペルコ社製；商品名）、アンバーライト ＸＡＤ４、ＸＡＤ８、ＸＡＤ１６、ＸＡＤ１１８０、ＸＡＤ１６００、ＸＡＤ２０００、ＸＡＤ２０１０、アンバークロム ＣＧ−１６１、ＣＧ−３００、ＣＧ−１０００等（以上、ローム・アンド・ハース社製；商品名）、ダウエックス Ｌ２８５、Ｌ３２３、Ｌ４９３、Ｖ４９３、Ｖ５０２等（以上、ダウ・ケミカル社製；商品名）、ＰＬＲＰ−Ｓ等（ポリマーラボラトリー社製；商品名）、ＰＲＰ−１、ＰＲＰ−３等（ハミルトン社製；商品名）、ＳＯＵＲＣＥ ＲＰＣ、ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＲＰＣ等（アマシャムファルマシアバイオテク社製；商品名）等が挙げられる。
【００１５】
（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体としては、ダイヤイオン ＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ等、ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＨＰ２ＭＧＭ、ＣＨＰ２ＭＧ、ＣＨＰ２ＭＧＦ、ＣＨＰ２ＭＧＡ、ＣＨＰ２ＭＧＹ等、セパビーズ ＦＰ−ＨＧ等（以上三菱化学社製；商品名）、アンバーライト ＸＡＤ７、ＸＡＤ７ＨＰ、アンバークロム ＣＧ−７１等（以上、ローム・アンド・ハース社製；商品名）等があげられる。
【００１６】
本発明において用いられる順相液体クロマトグラフィーとは、固定相に対して極性の低い移動相を通液し、試料を負荷、分離する方法である。移動相としては、固定相より低極性の有機溶媒が使用され、通常比誘電率が2.5〜1.5の有機溶媒から選ばれる。具体的には、ｎ−ペンタン（比誘電率1.844）、ｎ−ヘキサン（比誘電率1.890）、ｎ−ヘプタン（比誘電率1.924）、ｎ−オクタン（比誘電率1.948）、イソオクタン（比誘電率1.943）、シクロヘキサン（比誘電率2.052）等の飽和脂肪族系炭化水素、およびトルエン（比誘電率2.24）、キシレン（比誘電率2.266）等の芳香族系炭化水素からなる群より選択される一種または二種以上の炭化水素系有機溶媒が挙げられる。これらの有機溶媒は必要に応じて、少量の極性有機溶媒を含んでいても良い。
【００１７】
添加し得る極性有機溶媒としては、通常比誘電率が4〜38の有機溶媒から選ばれ、具体的にはメタノール（比誘電率33.1）、エタノール（比誘電率23.8）、ｎ−プロパノール（比誘電率22.2）、２−プロパノール（比誘電率18.3）等の炭素数１から６の脂肪族アルコール類；酢酸エチル（比誘電率6.02）、酢酸プロピル（比誘電率6.002）等のアルキル鎖の炭素数が１から６の酢酸アルキルエステル類；クロロホルム（比誘電率4.9）、ジクロロメタン（比誘電率9.1）等の塩素系有機化合物類；アセトン（比誘電率20.7）、メチルエチルケトン（比誘電率18.51）等のアルキルケトン類；ジエチルエーテル（比誘電率4.197）、ジイソプロピルエーテル（比誘電率4.49）、テトラヒドロフラン（比誘電率7.58）等のアルキルエーテル類およびアセトニトリル（比誘電率37.5）等からなる群から任意に選択された一種又は二種以上の有機溶媒が挙げられる。炭化水素系有機溶媒とこれらの極性有機溶媒との混合溶媒を用いると溶離位置の調整が容易になり好適である。これらの中でも食品用途を考慮すると食品添加物として使用可能であるヘキサン、又はヘキサン−エタノール混合溶媒が好ましい。
炭化水素系有機溶媒が含有し得る極性有機溶媒の量は、固定相の極性度、有機溶媒の種類、比誘電率等によっても異なり画一的決められないが、通常５０％（体積比）未満、好ましくは４０％（体積比）以下、更に好ましくは２０％（体積比）以下である。
【００１８】
本発明の特徴は、トコフェロール類とトコトリエノール類を効率的に分離することが可能であるということに在る。通常、使用されているシリカゲルを固定相とする順相液体クロマトグラフィーによってトコフェロール類とトコトリエノール類を含有する溶液の分離を行った場合、α−トコフェロールとα−トコトリエノール；（β−トコフェロール＋γ−トコフェロール）と（β−トコトリエノール＋γ−トコトリエノール）；δ−トコフェロールとδ−トコトリエノールそれぞれの保持が近接しているため、例えばα−トコフェロールとβ−トコフェロールの間にα−トコトリエノールが溶離する、また（β−トコフェロール＋γ−トコフェロール）とδ−トコフェロールの間に（β−トコトリエノール＋γ−トコトリエノール）が溶離する場合がある。その為、このような保持挙動を示すシリカゲル系充填剤を用いる場合には、トコフェロール類とトコトリエノール類を分離するためには各成分を細かく分取する必要があり工業的に効率的ではない。一方、本発明においてはトコフェロール類の保持に対してトコトリエノール類の保持が大きく離れていることからトコフェロール類とトコトリエノール類との分離が容易であり、工業的に極めて有利といえる。
【００１９】
更に、固定相として（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体からなる多孔質有機高分子粒子を用い、ヘキサン−エタノール混合溶媒等を移動相とした場合には、トコフェロール同族体の相互分離、即ちα−トコフェロール，（β−トコフェロール＋γ−トコフェロール）およびδ−トコフェロールを分離し、かつトコトリエノール類をも分離することが可能であり好ましい。
【００２０】
本発明において行われる順相液体クロマトグラフィー分離を実施する装置については、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置、中圧液体クロマトグラフィー装置、低圧液体クロマトグラフィー装置等、公知の装置が使用できる。
また、本発明において行われる順相液体クロマトグラフィー分離においては、単カラム法、多段カラム法および複数のカラムを循環接続させ、移動相通液、試料添加および分離成分抜き出しを各カラム間に設けたバルブを介して行ういわゆる擬似移動床（擬似移動層，Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ ＢｅｄまたはＳＭＢ）法および改良型擬似移動床（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ ＢｅｄまたはＩＳＭＢ）法等が可能である。
【００２１】
【実施例】
以下に、本発明の具体的態様を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例によって限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
送液ポンプ、オートサンプルインジェクタ、カラムオーブン、紫外吸収検出器、データ処理装置を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置を用い、固定相として（メタ）アクリル酸エステル系架橋（共）重合体であるＭＣＩ ＧＥＬ ＣＨＰ２ＭＧ（三菱化学社製）を多孔質有機高分子粒子として用いた。この粒子を内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレス製カラムに充填したカラムを使用し、移動相として固定相より極性が低いｎ−ヘキサン／エタノール＝９８／２（体積比）を用いた順相液体クロマトグラフィー条件で、送液ポンプにて流速１．０ｍｌ／分で通液した。カラムオーブンの温度は２５℃であった。
【００２３】
試料としてｄｌ−α−トコフェロール、ｄｌ−β−トコフェロール、ｄｌ−γ−トコフェロール、ｄｌ−δ−トコフェロール、ｄｌ−α−トコトリエノール、ｄｌ−β−トコトリエノール、ｄｌ−γ−トコトリエノール、及びｄｌ−δ−トコトリエノール（以上、カルビオケム社製）の各１ｍｇをそれぞれ１ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解したものを用い、オートサンプルインジェクタにて各１０μｌをカラムに注入した。紫外吸収検出器の波長を２９５ｎｍとして得られたクロマトグラムをデータ処理装置にて記録した。
また、間隙容量算出用の試料としては四塩化炭素２μｌを１ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解したものを用い、オートサンプルインジェクタにて２０μｌを注入、紫外吸収検出器の波長を２３０ｎｍとして得られたクロマトグラムをデータ処理装置にて記録した。
【００２４】
各試料についての保持比（ｋ’）は以下の式により算出した。
【数１】
ｋ’＝[(各試料の溶離容量)−(四塩化炭素の溶離容量)]／［（四塩化炭素の溶離容量）］
各試料の保持時間、各種試料の保持比（ｋ’）を表１に示す。表１より本実施例ではトコフェロール類の保持に対してトコトリエノール類の保持が離れていることからトコフェロール類およびトコトリエノール類を含む溶液からのトコフェロール類とトコトリエノール類との分離が容易であることが分かる。
【００２５】
【表１】
実施例２
試料としてオリザトコトリエノール−３０Ｇ（オリザ油化製）を用いた以外は、実施例１と同一条件にて順相クロマトグラフィー分離を行った。オリザトコトリエノール−３０Ｇはイネ種子由来であり、ｄ−α−トコフェロール，ｄ−γ−トコフェロールおよびｄ−α−トコトリエノール，ｄ−γ−トコトリエノールを主成分として含む。試料としては、５０ｍｇのオリザトコトリエノール−３０Ｇを１ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解したものを用い、オートサンプルインジェクタにて５μｌをカラムに注入した。紫外吸収検出器の波長を２９５ｎｍとして得られたクロマトグラムの溶出曲線を図１に示す。
図１中、ピーク１はｄ−α−トコフェロール、ピーク２は（ｄ−β−トコフェロール＋ｄ−γ−トコフェロール）、ピーク３はｄ−δ−トコフェロール、ピーク４はｄ−トコトリエノール類を表す。
実施例１の結果との対比によりｄ−α−トコフェロール，（ｄ−β−トコフェロール＋ｄ−γ−トコフェロール）およびｄ−δ−トコフェロールを分離し、かつｄ−トコトリエノール類を分離していることが分かる。
【００２７】
実施例３
送液ポンプ、オートサンプルインジェクタ、カラムオーブン、紫外吸収検出器、データ処理装置を備えたＨＰＬＣ装置を用い、スチレン−ジビニルベンゼン系架橋共重合体であるｐ−ｔ−ブトキシスチレン／ジビニルベンゼン＝１５／８５（重量比）架橋共重合体（粒子径：５０〜１５０μｍ、比表面積（窒素吸着法による）：６１６ｍ2／ｇ、細孔容積：１．２２ｍｌ／ｇ、最頻度半径：８１オングストローム）のｔ−ブトキシ基を常法にてアルカリ加水分解することにより水酸基に変換した多孔質有機高分子粒子を固定相として用いた。この粒子を内径１０ｍｍ、長さ２５０ｍｍのステンレス製カラムに充填したカラムを使用し、移動相として固定相より極性が低いｎ−ヘキサン／エタノール＝９９／１（体積比）を用いた順相液体クロマトグラフィー条件で、送液ポンプにて流速２．４ｍｌ／分で通液した。カラムオーブンの温度は２５℃であった。
【００２８】
試料として、ｄｌ−α−トコフェロール、ｄｌ−β−トコフェロール、ｄｌ−γ−トコフェロール、ｄｌ−δ−トコフェロール、ｄｌ−α−トコトリエノール、ｄｌ−β−トコトリエノール、ｄｌ−γ−トコトリエノール、ｄｌ−δ−トコトリエノール（以上、カルビオケム社製）各１ｍｇをそれぞれ１ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解したものを用い、オートサンプルインジェクタにて各８０μｌをカラムに注入した。紫外吸収検出器の波長を２９５ｎｍとして得られたクロマトグラムをデータ処理装置にて記録した。
また、間隙容量算出用の試料としては四塩化炭素２μｌを１ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解したものを用い、オートサンプルインジェクタにて１００μｌを注入、紫外吸収検出器の波長を２３０ｎｍとして得られたクロマトグラムをデータ処理装置にて記録した。
【００２９】
各試料の保持時間、各種試料の保持比（ｋ’）を表２に示す。表２より本実施例でもトコフェロール類の保持に対してトコトリエノール類の保持が離れていることが分かる。本実施例では実施例１に比べて各試料の保持比が小さいが、このような場合でも擬似移動床および改良型擬似移動床法等を採用することによりトコトリエノール類およびトコフェロール類を含む原料からの工業的に効率的なトコフェロール類とトコトリエノール類の分離が可能である。
【００３０】
【表２】
比較例１
実施例１と同一のＨＰＬＣ装置および同一の固定相を充填した同一サイズのカラムを用い、移動相として固定相より極性の高いイソプロパノールを用いた逆相液体クロマトグラフィー条件で、送液ポンプにて流速０．５ｍｌ／分で通液した。カラムオーブンの温度は２５℃であった。試料として５０ｍｇのオリザトコトリエノール−３０Ｇを１ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解したものを用い、オートサンプルインジェクタにて１０μｌを注入した。紫外吸収検出器の波長を２９５ｎｍとして得られたクロマトグラムの溶出曲線を図２に示す。実施例１と比較すると、クロマトグラムは２つのブロードなピークが重なっており、ｄ−トコフェロール類とｄ−トコトリエノール類の分離が不充分であることが分かる。
【００３２】
比較例２
実施例１と同一のＨＰＬＣ装置を用い、固定相としてシリカゲル充填カラムであるＵＬＴＲＡＳＰＨＥＲＥ−Ｓｉ（粒子径５μｍ；カラム：内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、ＡＬＴＥＸ社製）を用い、移動相として固定相より極性が低いｎ−ヘキサン／エタノール＝９９／１（体積比）を用いた順相液体クロマトグラフィー条件で、送液ポンプにて流速１．０ｍｌ／分で通液した。カラムオーブンの温度は２５℃であった。試料としてｄｌ−α−トコフェロール、ｄｌ−β−トコフェロール、ｄｌ−γ−トコフェロール、ｄｌ−δ−トコフェロール、ｄｌ−α−トコトリエノール、ｄｌ−β−トコトリエノール、ｄｌ−γ−トコトリエノール、およびｄｌ−δ−トコトリエノール（以上、カルビオケム社製）の各１ｍｇをそれぞれ１ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解したものを用い、オートサンプルインジェクタにて各５μｌを注入した。紫外吸収検出器の波長を２９５ｎｍとして得られたクロマトグラムをデータ処理装置にて記録した。
【００３３】
また、間隙容量算出用の試料としては四塩化炭素２μｌを１ｍｌのｎ−ヘキサンに溶解したものを用い、オートサンプルインジェクタにて１０μｌを注入、紫外吸収検出器の波長を２３０ｎｍとして得られたクロマトグラムをデータ処理装置にて記録した。
各試料の保持時間、各種試料の保持比（ｋ’）を表３に示す。表３より明らかなように、各試料の保持比はｄｌ−α−トコフェロール→ｄｌ−α−トコトリエノール→ｄｌ−β−トコフェロール→ｄｌ−γ−トコフェロール→ｄｌ−β−トコトリエノール→ｄｌ−γ−トコトリエノール→ｄｌ−δ−トコフェロール→ｄｌ−δ−トコトリエノールの順で大きくなることから、トコトリエノール類およびトコフェロール類を含む原料からトコフェロール類とトコトリエノール類を分離するためには各成分を細かく分取する必要が生じ、工業的には効率的でないことが判る。
【００３４】
【表３】
【発明の効果】
従来技術ではトコフェロール類とトコトリエノール類を工業的に分離することが困難であったが、本発明方法にれば、工業的に効率的かつ安定的な方法にてトコフェロール類の各同族体の分離はもとより、トコトリエノール類との分離をも可能にするので、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例２におけるオリザトコトリエノール−３０Ｇの順相クロマトグラフィーによる溶出曲線を示す。
【図２】 比較例１におけるオリザトコトリエノール−３０Ｇの逆相クロマトグラフィーによる溶出曲線を示す。
【符号の説明】
１ ｄ−α−トコフェロールのピーク
２ ｄ−β−トコフェロール＋ｄ−γ−トコフェロールのピーク
３ ｄ−δ−トコフェロールのピーク
４ ｄ−トコトリエノール類のピーク[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for separating tocopherols and tocotrienols using normal phase liquid chromatography. More specifically, the present invention relates to a method for separating tocopherols and tocotrienols from a solution containing tocopherols and tocotrienols by using normal phase liquid chromatography.
[0002]
[Prior art]
Tocopherols and tocotrienols are contained in deodorized distillates by-produced in the deodorizing process of soybean oil, rapeseed oil, cottonseed oil, safflower oil, rice bran oil, corn oil, sunflower oil, etc., and d-α, d- There are homologues of β, d-γ, d-δ-tocopherol and d-α, d-β, d-γ, d-δ-tocotrienol. Naturally derived tocopherol and tocotrienol are all d-form, but synthetic-derived tocopherol and tocotrienol are usually dl-form (unless otherwise specified in this specification, tocopherol and tocotrienol are d-form, l-form and d-form). Any mixture of body and l).
[0003]
Tocopherols and tocotrienols have physiological activity as vitamin E group and have antioxidative action, and thus are used in medicines, cosmetics, foods and the like. In recent years, vitamin E bioactivity is inferior to α-tocopherol compared to α-tocopherol, but β, γ, δ-tocopherol having an antioxidant action is superior in δ-tocopherol, and γ-tocopherol. Has attracted attention for the functionality of individual tocopherol homologues, such as urination and skin health, and a method for efficiently isolating them has been demanded.
In addition, functionalities such as hyperlipidemia improving action, atherosclerosis improving action, and anticancer action have been found for tocotrienols, and an efficient separation method from tocopherols has been demanded. .
[0004]
However, in the past, methods such as molecular distillation and ion exchange resin treatment have been used to purify and concentrate tocopherols. However, separation operations are difficult with molecular distillation, and high-concentration concentrates can be obtained in high yields. It is very difficult to obtain, and the ion exchange resin treatment method has a disadvantage that it requires regeneration of the resin and requires complicated steps such as removal of the eluted drug that occurs when solvent replacement is performed. Isolation of each homologue and efficient separation from tocotrienols was difficult.
Various methods have been proposed to solve these problems. One of the methods is a method using an organic polymer that is not an ion exchange resin. For example, Japanese Patent Publication No. 60-37110 discloses that a crude tocopherol is applied to a column packed with a styrene divinylbenzene copolymer porous polymer, and an alcohol solvent. A method of developing and elution in a system to obtain purified tocopherol is disclosed. This method is reverse phase chromatographic separation because of the high polarity of the alcohol solvent system with respect to the styrene divinylbenzene copolymer porous polymer. In this method, α-tocopherol, (β-tocopherol + γ-tocopherol), δ- Separation between homologues of tocopherol has not been achieved, and no mention is made of the separability of tocotrienols.
[0005]
Japanese Patent No. 2757372 discloses 1% of 60% by weight or more obtained by aqueous suspension polymerization in the presence of a diluent composed of an organic solvent that is not compatible with water and is compatible with the raw material polymerizable monomer. Separation of tocopherols composed of a porous polymer containing a crosslinkable monomer having a plurality of vinyl groups in the molecule, the polymer having a particle size of 10 μm or more and a gel moisture content of 30% or more A method is disclosed in which a deodorized distillate is injected into a column packed with concentrating beads, a developing solvent is passed therethrough, and tocopherols are separated and concentrated by liquid chromatography. In this method, methanol which is recommended as a developing solvent and specifically used has high polarity with respect to the porous polymer, and thus is reverse-phase chromatography separation, and mutual separation of tocopherol homologues, that is, α- Tocopherol, (β-tocopherol + γ-tocopherol), and δ-tocopherol have not been separated, and no mention is made of the possibility of separation of tocotrienols.
[0006]
On the other hand, a method using a silica gel-based filler has also been studied. For example, JP-A-8-59647 discloses a method for separating and purifying a tocopherol component using a pseudo moving bed filled with a silica gel-based filler. However, this method does not mention the separability of tocopherol and tocotrienol.
Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-122869 discloses a method for isolating tocotrienols, tocopherols and isomers thereof from a crude initial raw material using reverse phase liquid chromatography. As the mobile phase, a solvent containing alcohol and a predetermined amount or less of water is used, and when water enters the mobile phase, the solubility of tocopherols and tocotrienols generally decreases, so a high concentration load cannot be applied. Is disadvantageous.
[0007]
Furthermore, JP-A No. 2001-261671 discloses a method for chromatographic isolation of vitamin E isomers from a compound comprising vitamin E in a supercritical fluid environment using silica gel and reverse phase C18 silica gel. However, since this method uses a supercritical fluid, it has an industrial disadvantage of high equipment costs.
In addition, it is difficult to control the degree of contamination of various types of silica gel filler in the production of silica gel, there is a problem of reproducibility of separation behavior due to the influence of these mixed metal ions, etc., and retention due to the influence of moisture There is also a problem in operational stability due to large fluctuations in behavior. In addition, when using a silica gel filler having an alkyl group such as a C18 group, it is difficult to control the introduction rate and the end cap of the alkyl group non-introduced part, and there is a problem in the reproducibility of the separation behavior.
As described above, in the prior art, it was difficult to separate tocopherols and tocotrienols by an industrially efficient and stable method.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and its purpose is to provide industrially efficient and stable tocopherols, a method for separating tocotrienols, and the separation of each homologue of tocopherols from tocotrienols. It is to provide a method.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies in order to solve the above problems, the present inventor has obtained porous organic polymer particles having characteristics that are excellent in production reproducibility as a stationary phase and excellent in chemical resistance such as acid and alkali. It was found that by applying normal phase liquid chromatography, separation of tocopherols and tocotrienols as well as isolation between homologues of tocopherols could be performed efficiently and stably at the same time, and the present invention was completed. .
That is, the gist of the present invention is to provide a method for separating desired tocopherols or tocotrienols from a solution containing tocopherols and tocotrienols by using normal phase liquid chromatography, and further, tocotrienols and their respective homologues. In the separation method, a porous organic polymer particle is used as a stationary phase of normal phase liquid chromatography.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for separating tocopherols and tocotrienols by normal phase chromatography, and it is essential to use porous organic polymer particles as a stationary phase in this normal phase chromatography.
The porous organic polymer particles used in the present invention can be selected from those used in liquid phase chromatography, but representative examples include porous polyvinylbenzene-based crosslinked (co) polymers and Examples thereof include (meth) acrylic acid ester-based crosslinked (co) polymers.
Examples of the polyvinylbenzene crosslinked (co) polymer include styrene monomers such as styrene, methylstyrene, ethylstyrene, α-methylstyrene, chlorostyrene, chloromethylstyrene, p-hydroxystyrene, and pt-butoxystyrene. And a cross-linking copolymer of divinylbenzene, trivinylbenzene and other polyvinylbenzene monomers as a cross-linking agent, or a homopolymer of polyvinylbenzene monomers such as divinylbenzene and trivinylbenzene, or two or more types Among these, a styrene-divinylbenzene-based crosslinked copolymer is particularly preferable. These crosslinked (co) polymers can be produced by a known method.
[0011]
Examples of (meth) acrylic acid ester-based crosslinked (co) polymers include (meth) acrylic acid esters and derivatives thereof, and (co) polymers of monomers such as (meth) acrylic acid polyol esters, A copolymer of (meth) acrylic acid ester and a derivative thereof and (meth) acrylic acid polyol ester, a homopolymer of (meth) acrylic acid polyol ester, or at least two types of copolymers may be mentioned. The (co) polymer is produced by a known method.
Specific examples of (meth) acrylic acid esters and derivatives thereof include (meth) acrylic acid alkyl esters such as methyl (meth) acrylate and ethyl (meth) acrylate; hydroxyethyl (meth) acrylate, (meth) Hydroxypropyl acrylate, 3-chloro-2-hydroxypropyl (meth) acrylate, 2-chloroethyl (meth) acrylate, glycidyl (meth) acrylate, dimethylaminoethyl (meth) acrylate, diethylamino (meth) acrylate And (meth) acrylic acid ester derivatives such as ethyl, tetrahydrofurfuryl (meth) acrylate, and 2,3-dihydroxypropyl (meth) acrylate.
[0012]
(Meth) acrylic acid polyol ester includes (poly) ethylene glycol di (meth) acrylate, (poly) propylene glycol di (meth) acrylate, glycerin di (meth) acrylate, glycerin tri (meth) acrylate, and trimethylol. Propane tri (meth) acrylate, tetrahydroxybutane di (meth) acrylate, butanediol di (meth) acrylate, neopentyl glycol di (meth) acrylate, hexanediol di (meth) acrylate, pentaerythritol di (meth) acrylate, di Examples include pentaerythritol tetra (meth) acrylate.
These crosslinked (co) polymers and the like can be used as they are, but they may be further introduced with a functional group if necessary. Examples of functional groups to be introduced include oxygen-containing functional groups such as hydroxyl groups, ester groups, ether groups, and carbonyl groups, nitrogen-containing functional groups such as amino groups, amide groups, nitro groups, and nitrile groups, thiol groups, and sulfone groups. Among them, a hydroxyl group, an ester group, an amino group, an amide group, and a nitrile group are preferable, and a hydroxyl group and an ester group are more preferable.
Preferable specific examples among the crosslinked copolymers include (meth) acrylic ester-based crosslinked (co) polymers that are crosslinked copolymers of (meth) acrylic acid esters and (meth) acrylic acid polyol esters, p Examples include hydrolysates of cross-linked copolymers of -t-butoxystyrene and divinylbenzene, and (meth) acrylic ester-based cross-linked (co) polymers are particularly preferable.
[0013]
The porosity of the porous organic polymer particles is effective for increasing the throughput during separation by normal phase chromatography. Specifically, the specific surface area required by the nitrogen adsorption method is 1 m. 2 / G or more, preferably 50 m 2 / G or more, more preferably 100 m 2 / G or more, 2000m 2 / G or less. The pore volume is 0.01 ml / g or more, preferably 0.1 ml / g or more, more preferably 0.2 ml / g or more, and 3.0 ml / g or less.
The average particle diameter of the porous organic polymer particles is in the range of 1 μm to 2 mm, preferably in the range of 3 μm to 2 mm, more preferably in the range of 4 μm to 1 mm, and the particle shape is a true sphere. The diameter distribution is preferably narrow.
[0014]
These porous organic polymer particles can be appropriately selected from commercially available products as long as the above porous characteristics are satisfied. Specific examples of styrene-divinylbenzene-based crosslinked copolymers include Diaion HP20, HP20S, HP20SS, HP21, Sepabead SP20SS, SP20DF, SP207, SP70, SP700, SP825, SP850, MCI GEL CHP10M, CHP5C, CHP20P, CHP20A, CHP20Y, CHP55A, CHP55Y, etc. (above, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation; trade name); Amberlite XAD2 (manufactured by Spelco; trade name), Amberlite XAD4, XAD8, XAD16, XAD1180, XAD1600, XAD2000, XAD2010, Amber Chrome CG-161, CG-300, CG-1000, etc. (above, manufactured by Rohm and Haas; trade name), Dowex L285, L323, L493 , V493, V502, etc. (above, manufactured by Dow Chemical Company; trade name), PLRP-S, etc. (manufactured by Polymer Laboratories; trade name), PRP-1, PRP-3, etc. (manufactured by Hamilton Corporation; trade name), SOURCE RPC, RESOURCE RPC, etc. (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech; trade name) and the like can be mentioned.
[0015]
Examples of (meth) acrylic acid ester-based crosslinked (co) polymers include Diaion HP1MG, HP2MG, MCI GEL CHP2MGM, CHP2MG, CHP2MGF, CHP2MGA, CHP2MGY, Sepabeads FP-HG, etc. ), Amberlite XAD7, XAD7HP, Amberchrome CG-71, etc. (above, manufactured by Rohm &Haas; trade name).
[0016]
Normal phase liquid chromatography used in the present invention is a method of loading and separating a sample by passing a mobile phase having a low polarity with respect to a stationary phase. As the mobile phase, an organic solvent having a lower polarity than that of the stationary phase is used, and usually selected from organic solvents having a relative dielectric constant of 2.5 to 1.5. Specifically, n-pentane (relative permittivity 1.844), n-hexane (relative permittivity 1.890), n-heptane (relative permittivity 1.924), n-octane (relative permittivity 1.948), isooctane (relative permittivity) 1.943), a saturated aliphatic hydrocarbon such as cyclohexane (dielectric constant 2.052), and a kind selected from the group consisting of aromatic hydrocarbons such as toluene (dielectric constant 2.24) and xylene (dielectric constant 2.266) Or 2 or more types of hydrocarbon organic solvents are mentioned. These organic solvents may contain a small amount of a polar organic solvent as required.
[0017]
The polar organic solvent that can be added is usually selected from organic solvents having a relative dielectric constant of 4 to 38, specifically, methanol (relative dielectric constant 33.1), ethanol (relative dielectric constant 23.8), n-propanol (relative dielectric constant). 22.2), C1-C6 aliphatic alcohols such as 2-propanol (dielectric constant 18.3), etc .; carbon numbers of alkyl chains such as ethyl acetate (dielectric constant 6.02) and propyl acetate (dielectric constant 6.002) Acetic acid alkyl esters having 1 to 6; Chlorinated organic compounds such as chloroform (dielectric constant 4.9) and dichloromethane (dielectric constant 9.1); acetone (dielectric constant 20.7), methyl ethyl ketone (dielectric constant 18.51), etc. Alkyl ketones; alkyl ethers such as diethyl ether (dielectric constant 4.197), diisopropyl ether (dielectric constant 4.49), tetrahydrofuran (dielectric constant 7.58), and acetonitrile (dielectric constant) 37.5) Any one or two or more organic solvent selected may be mentioned from the group consisting like. Use of a mixed solvent of a hydrocarbon-based organic solvent and these polar organic solvents facilitates adjustment of the elution position, which is preferable. Among these, hexane or a hexane-ethanol mixed solvent that can be used as a food additive is preferable in consideration of food applications.
The amount of the polar organic solvent that can be contained in the hydrocarbon-based organic solvent varies depending on the polarity of the stationary phase, the type of the organic solvent, the relative dielectric constant, etc., and is not uniformly determined, but is usually less than 50% (volume ratio) , Preferably 40% (volume ratio) or less, more preferably 20% (volume ratio) or less.
[0018]
The feature of the present invention is that it is possible to efficiently separate tocopherols and tocotrienols. Usually, when the solution containing tocopherols and tocotrienols is separated by normal phase liquid chromatography using silica gel as a stationary phase, α-tocopherol and α-tocotrienol; (β-tocopherol + γ-tocopherol) And (β-tocotrienol + γ-tocotrienol); since the retention of δ-tocopherol and δ-tocotrienol is close, for example, α-tocotrienol elutes between α-tocopherol and β-tocopherol, and (β-tocopherol) (Β-tocotrienol + γ-tocotrienol) may elute between + γ-tocopherol) and δ-tocopherol. Therefore, when using a silica gel type filler exhibiting such a retention behavior, it is necessary to separate each component finely in order to separate tocopherols and tocotrienols, which is not industrially efficient. On the other hand, in the present invention, since the retention of tocotrienols is far away from the retention of tocopherols, it is easy to separate the tocopherols from the tocotrienols, which is extremely advantageous industrially.
[0019]
Furthermore, when porous organic polymer particles made of a (meth) acrylic acid ester-based crosslinked (co) polymer are used as the stationary phase and a hexane-ethanol mixed solvent or the like is used as the mobile phase, the tocopherol homologues are separated from each other. That is, α-tocopherol, (β-tocopherol + γ-tocopherol) and δ-tocopherol can be separated and tocotrienols can also be separated.
[0020]
As an apparatus for performing normal phase liquid chromatography separation performed in the present invention, known apparatuses such as a high performance liquid chromatography (HPLC) apparatus, an intermediate pressure liquid chromatography apparatus, and a low pressure liquid chromatography apparatus can be used.
Further, in the normal phase liquid chromatography separation performed in the present invention, a single column method, a multistage column method and a plurality of columns are connected in circulation, and a mobile phase flow, sample addition, and separation component extraction are provided between the columns. The so-called simulated moving bed (simulated moving bed, Simulated Moving Bed or SMB) method and the improved simulated moving bed (ISMB) method, etc. that are performed through the above-described method are possible.
[0021]
【Example】
Specific embodiments of the present invention will be described below in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples unless it exceeds the gist.
[0022]
Example 1
Using a high-performance liquid chromatography (HPLC) device equipped with a liquid feed pump, auto sample injector, column oven, ultraviolet absorption detector, and data processing device, with (meth) acrylic acid ester-based crosslinked (co) polymer as the stationary phase A certain MCI GEL CHP2MG (Mitsubishi Chemical Corporation) was used as the porous organic polymer particles. A normal phase using n-hexane / ethanol = 98/2 (volume ratio), which is less polar than the stationary phase, as a mobile phase, using a column packed with stainless steel columns having an inner diameter of 4.6 mm and a length of 150 mm. Under liquid chromatography conditions, the solution was pumped at a flow rate of 1.0 ml / min. The temperature of the column oven was 25 ° C.
[0023]
Dl-α-tocopherol, dl-β-tocopherol, dl-γ-tocopherol, dl-δ-tocopherol, dl-α-tocotrienol, dl-β-tocotrienol, dl-γ-tocotrienol, and dl-δ-tocotrienol as samples Using 1 mg of each of the above (manufactured by Calbiochem) dissolved in 1 ml of n-hexane, 10 μl of each was injected into the column with an autosample injector. The chromatogram obtained by setting the wavelength of the ultraviolet absorption detector to 295 nm was recorded with a data processor.
In addition, as a sample for calculating the void volume, a solution obtained by dissolving 2 μl of carbon tetrachloride in 1 ml of n-hexane, injecting 20 μl with an auto sample injector, and setting the wavelength of the ultraviolet absorption detector to 230 nm was obtained. Was recorded with a data processor.
[0024]
The retention ratio (k ′) for each sample was calculated by the following formula.
[Expression 1]
k ′ = [(elution volume of each sample) − (elution volume of carbon tetrachloride)] / [(elution volume of carbon tetrachloride)]
Table 1 shows the retention time of each sample and the retention ratio (k ′) of each sample. From Table 1, it can be seen that in this example, since the retention of tocotrienols is far from the retention of tocopherols, it is easy to separate the tocopherols and tocotrienols from the solution containing tocopherols and tocotrienols.
[0025]
[Table 1]
Example 2
Normal phase chromatographic separation was performed under the same conditions as in Example 1 except that Orizatocotrienol-30G (manufactured by Oriza Yuka) was used as a sample. Oryzatocotrienol-30G is derived from rice seeds, and contains d-α-tocopherol, d-γ-tocopherol, d-α-tocotrienol, and d-γ-tocotrienol as main components. As a sample, 50 mg of oryzatocotrienol-30G dissolved in 1 ml of n-hexane was used, and 5 μl was injected into the column with an auto sample injector. The elution curve of the chromatogram obtained by setting the wavelength of the ultraviolet absorption detector to 295 nm is shown in FIG.
In FIG. 1,
Comparison with the results of Example 1 shows that d-α-tocopherol, (d-β-tocopherol + d-γ-tocopherol) and d-δ-tocopherol are separated, and d-tocotrienols are separated. .
[0027]
Example 3
Using a HPLC device equipped with a liquid feed pump, an auto sample injector, a column oven, an ultraviolet absorption detector, and a data processing device, pt-butoxystyrene / divinylbenzene = 15 / which is a styrene-divinylbenzene cross-linked copolymer 85 (weight ratio) cross-linked copolymer (particle diameter: 50 to 150 μm, specific surface area (by nitrogen adsorption method): 616 m 2 / G, pore volume: 1.22 ml / g, most frequent radius: 81 angstroms) as a stationary phase porous organic polymer particles converted into hydroxyl groups by alkaline hydrolysis of t-butoxy groups by a conventional method Using. A normal phase liquid chromatograph using a column packed with a stainless steel column having an inner diameter of 10 mm and a length of 250 mm and using n-hexane / ethanol = 99/1 (volume ratio), which is lower in polarity than the stationary phase, as the mobile phase. The liquid was pumped at a flow rate of 2.4 ml / min. The temperature of the column oven was 25 ° C.
[0028]
As samples, dl-α-tocopherol, dl-β-tocopherol, dl-γ-tocopherol, dl-δ-tocopherol, dl-α-tocotrienol, dl-β-tocotrienol, dl-γ-tocotrienol, dl-δ-tocotrienol (Above, manufactured by Calbiochem) 1 mg of each was dissolved in 1 ml of n-hexane, and 80 μl of each was injected into the column with an autosample injector. The chromatogram obtained by setting the wavelength of the ultraviolet absorption detector to 295 nm was recorded with a data processor.
In addition, as a sample for calculating the void volume, a solution obtained by dissolving 2 μl of carbon tetrachloride in 1 ml of n-hexane, injecting 100 μl with an auto sample injector, and setting the wavelength of the ultraviolet absorption detector to 230 nm was obtained. Was recorded with a data processor.
[0029]
Table 2 shows the retention time of each sample and the retention ratio (k ′) of each sample. From Table 2, it can be seen that also in this example, the retention of tocotrienols is far from the retention of tocopherols. In this example, the retention ratio of each sample is smaller than in Example 1, but even in such a case, by adopting a simulated moving bed and an improved simulated moving bed method, etc., from the raw materials containing tocotrienols and tocopherols Industrially efficient separation of tocopherols and tocotrienols is possible.
[0030]
[Table 2]
Comparative Example 1
Using the same HPLC apparatus as in Example 1 and the same column packed with the same stationary phase, the flow rate was measured with a liquid feed pump under reverse phase liquid chromatography conditions using isopropanol having a higher polarity than the stationary phase as the mobile phase. The liquid was passed at 0.5 ml / min. The temperature of the column oven was 25 ° C. As a sample, 50 mg of oryzatocotrienol-30G dissolved in 1 ml of n-hexane was used, and 10 μl was injected with an auto sample injector. The elution curve of the chromatogram obtained by setting the wavelength of the ultraviolet absorption detector to 295 nm is shown in FIG. Compared with Example 1, the chromatogram shows that two broad peaks overlap, indicating that d-tocopherols and d-tocotrienols are not sufficiently separated.
[0032]
Comparative Example 2
Using the same HPLC apparatus as in Example 1, ULTRASPHERE-Si (
[0033]
In addition, as a sample for calculating the void volume, a solution obtained by dissolving 2 μl of carbon tetrachloride in 1 ml of n-hexane, injecting 10 μl with an autosample injector, and setting the wavelength of the ultraviolet absorption detector to 230 nm was obtained. Was recorded with a data processor.
Table 3 shows the retention time of each sample and the retention ratio (k ′) of each sample. As is apparent from Table 3, the retention ratio of each sample was dl-α-tocopherol → dl-α-tocotrienol → dl-β-tocopherol → dl-γ-tocopherol → dl-β-tocotrienol → dl-γ-tocotrienol → Since it increases in the order of dl-δ-tocopherol → dl-δ-tocotrienol, in order to separate the tocopherols and tocotrienols from the raw material containing tocotrienols and tocopherols, it is necessary to separate each component finely, It turns out that it is not industrially efficient.
[0034]
[Table 3]
【The invention's effect】
In the prior art, it was difficult to industrially separate tocopherols and tocotrienols, but according to the method of the present invention, separation of each homologue of tocopherols in an industrially efficient and stable manner is possible. Of course, separation from tocotrienols is also possible, which is extremely useful.
[Brief description of the drawings]
1 shows an elution curve of oryzatocotrienol-30G in Example 2 by normal phase chromatography. FIG.
2 shows an elution curve obtained by reverse phase chromatography of oryzatocotrienol-30G in Comparative Example 1. FIG.
[Explanation of symbols]
1 d-α-tocopherol peak
2 d-β-tocopherol + d-γ-tocopherol peak
3 d-δ-tocopherol peak
4 d-Tocotrienol peaks
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