JP4313049B2 - Pharmaceutical composition for prevention or treatment of angiogenesis related diseases - Google Patents

Description

〔式中、
Ｘは、−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ₃）₂Ｚであり、
Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ若しくは−ＯＨであるか、又は一緒になって単結合を形成し、
ｍは、１又は２であり、
ｍが１であるとき、点線（……）は結合を示さず、
Ｒ^１は、
（１）天然アミノ酸、
（２）天然アミノ酸のＤ体、及び
（３）天然アミノ酸又は天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物
からなる群より選択されるアミノ化合物から、１個のアミノ基を除いた残基であり、
ｍが２であるとき、点線（……）は結合を示し、
Ｒ^２は、二価の結合基となり、
（１）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸、
（２）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体、
（３）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸又は２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物、及び
（４）Ｈ₂Ｎ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ₂）_ｎ−ＮＨ₂（ｎは０〜９の整数である）で示される化合物
からなる群より選択されるアミノ化合物から、２個のアミノ基を除いた残基である〕
で示される、少なくとも一つの化合物又はその薬学的に許容され得る塩、エステル若しくは溶媒和物を含む、血管新生関連疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。
【００１２】
上記の式Ｉの化合物において、ｍが１であるとき、式Ｉの化合物は、式II：
【００１３】
【化３】

【００１４】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＲ¹は上記で定義されたのと同じ意味である）
で表すこともでき、また、ｍが２であるとき、式Ｉの化合物は、式III：
【００１５】
【化４】

【００１６】
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＲ²は上記で定義されたのと同じ意味である）
で表すこともできる。
【００１７】
また、本発明は、式Ｉ、II又IIIで示される、少なくとも一つの化合物を含む、血管新生関連疾患の予防又は治療用医薬組成物にも関する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
【００１９】
前記の式中の置換基Ｘは、好ましくは、Ｙ及びＺがそれぞれ−ＯＨであるか、又は一緒になって単結合を形成した、−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ₃）₂Ｚであり、特に好ましくは、Ｙ及びＺが一緒になって単結合を形成した、−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ₃）₂Ｚである。
【００２０】
上記の式において、ｍが１であるとき、置換基Ｒ^１は、
（１）天然アミノ酸、
（２）天然アミノ酸のＤ体、及び
（３）天然アミノ酸又は天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物
からなる群より選択されるアミノ化合物から、１個のアミノ基を除いた残基である。
上記の、ｍが１であるときの（１）〜（３）の天然アミノ酸は、天然に存在し得るアミノ酸であれば、特に制限されず、例えば、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸及びδ−アミノ酸などがある。このようなアミノ酸は、天然物から得られるものであってもよく、又は人為的に有機合成などの手法により得られるものでもよい。
【００２１】
上記の、ｍが１であるときの（１）〜（３）のアミノ酸として、例えば、α−アミノ酸として、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、システイン、シスチン、メチオニン、トリプトファン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒドロキシリジン、オルニチン、シトルリン、ホモシステイン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、ホモシスチン、ジアミノピメリン酸及びジアミノプロピオン酸などが挙げられ、β−アミノ酸として、β−アラニンなどが挙げられ、γ−アミノ酸として、γ−アミノ酪酸及びカルニチンなどが挙げられ、δ−アミノ酸として、５−アミノレブリン酸及び５−アミノ吉草酸などが挙げられる。
【００２２】
上記のｍが１であるときの（３）の天然アミノ酸若しくは天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基若しくはヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物として、例えばアミノアルコール及びアミンが挙げられる。このようなアミノアルコールとして、例えば２−アミノエタノール及びイソプロピルアルコールなどが挙げられる。
【００２３】
Ｒ^１は、疎水性であることが好ましく、ｍが１であるときの（１）〜（３）の天然アミノ酸として、例えば、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン及びロイシンなどが好ましい。
【００２４】
上記の式において、ｍが２であるとき、置換基Ｒ^２は、二価の結合基であり、
（１）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸、
（２）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体、
（３）２個のアミノ基を有する天然アミノ酸又は２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物、及び
（４）Ｈ₂Ｎ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ₂）_ｎ−ＮＨ₂（ｎは０〜９の整数である）で示される化合物
からなる群より選択されるアミノ化合物から、２個のアミノ基を除いた残基である。
上記の、ｍが２であるときの（１）〜（３）の２個のアミノ基を有する天然アミノ酸は、天然に存在し得るアミノ酸で、２個のアミノ基を有していれば、特に制限されず、例えば、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸及びδ−アミノ酸などがある。このようなアミノ酸は、天然物から得られるものであってもよく、又は人為的に有機合成などの手法により得られるものでもよい。
【００２５】
上記の、ｍが２であるときの（１）〜（３）の２個のアミノ基を有する天然アミノ酸として、例えば、α−アミノ酸として、リジン、ヒドロキシリジン、オルニチン、シトルリン、シスチン、ホモシスチン、ジアミノピメリン酸及びジアミノプロピオン酸などが挙げられる。
【００２６】
上記の、ｍが２であるときの（３）の２個のアミノ基を有する天然アミノ酸若しくは２個のアミノ基を有する天然アミノ酸のＤ体において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基若しくはヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物として、Ｈ₂Ｎ−（ＣＨ₂）_ｌ−ＮＨ₂（ｌは１〜１０、好ましくは２〜６、より好ましくは３又は４の整数である）が挙げられる。
【００２７】
上記のｎが２であるときの（４）の化合物は、ｎは０〜９、好ましくは１〜５、より好ましくは２又は３の整数である。
【００２８】
又、Ｒ²は上記のｎが２であるときの（４）の化合物において、カルボキシル基を、水素、ヒドロキシル基又はヒドロキシルメチル基に置き換えた化合物から２個のアミノ基を除いた残基であってもよい。
【００２９】
本発明の化合物には、式Ｉ〜IIIで示される化合物の鏡像異性体又はこれらの鏡像異性体が混在してなるラセミ混合物も含まれる。好ましい鏡像異性体として、式IV：
【００３０】
【化５】

で示される、本発明の化合物が挙げられる。
【００３１】
本発明の化合物として、好ましくは、図５〜７に示すように、ＳＭＴＰ−１、ＳＭＴＰ−２、ＳＭＴＰ−３、ＳＭＴＰ−４、ＳＭＴＰ−５、ＳＭＴＰ−６、ＳＭＴＰ−７、ＳＭＴＰ−８、ＳＭＴＰ−９、ＳＭＴＰ−１０及びＳＭＴＰ−１１が挙げられる。また、これら化合物の鏡像異性体及びこれらの鏡像異性体が混在してなるラセミ混合物も本発明の化合物として使用できる。
【００３２】
本明細書において、本発明の化合物の鏡像異性体は以下の表現を用いる。すなわち、上記の鏡像異性体として、上記のＳＭＴＰ−３〜ＳＭＴＰ−１１の、化学式中２７位の炭素原子を不斉中心としたＲ配置をとるものをそれぞれＳＭＴＰ−３Ｄ〜ＳＭＴＰ−１１Ｄと表現する。また、上記のＳＭＴＰ−３〜ＳＭＴＰ−１１の、化学式中２７位の炭素原子を不斉中心としたＳ配置をとるものをＳＭＴＰ−３Ｌ〜ＳＭＴＰ−１１Ｌと表現する。また、化学式中２７位の炭素原子を不斉中心としたＲ配置をとるＳＭＴＰをＳＭＴＰ−Ｄと、化学式中２７位の炭素原子を不斉中心としたＳ配置をとるＳＭＴＰをＳＭＴＰ−Ｌと表現する。
【００３３】
本発明の化合物は、有機化学的合成手法により得てもよいが、好ましくは特許文献１に記載されたように、真菌を培養し、その代謝物より得ることができる。詳細には、生産菌としては、スタキボトリス属の糸状菌が選択される。特に好ましい生産菌はスタキボトリス・ミクロスポラ（Stachybotrys microspora）ＩＦＯ３００１８株であるが、本発明は、この菌に限定されるものではない。基本培地は、以下組成を示すＡ培地が好ましいが、本発明はこの組成の培地に限定されるものではない。Ａ培地：グルコース２０ｇ、ペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸二カリウム３ｇ、硫酸マグネシウム７水和物１ｇを１リットルの精製水に溶解し、塩酸あるいは水酸化ナトリウムでpHを５．５に調整する。培地組成で最も重要な点は、目的とする本発明の化合物に応じて、適切なアミノ酸、アミノアルコールまたはアミンを培地に添加することである。
例えば、ＳＭＴＰ−１およびＳＭＴＰ−２は２−アミノエタノールを、ＳＭＴＰ−３はセリンを、ＳＭＴＰ−４はフェニルアラニンを、ＳＭＴＰ−５はロイシンを、ＳＭＴＰ−６はトリプトファンを、ＳＭＴＰ−７はオルニチンを、ＳＭＴＰ−８はリジンを、ＳＭＴＰ−９はシスチンを、ＳＭＴＰ−１０はイソロイシンを、ＳＭＴＰ−１１はバリンを、それぞれ培地に添加することにより選択的に生産することができる。
また、本発明の化合物の鏡像異性体を得るには、ＳＭＴＰ−３Ｄ〜１１Ｄは、上記アミノ酸としてＤ−アミノ酸を使用すれば得られ、ＳＭＴＰ−３Ｌ〜１１Ｌは、上記アミノ酸としてＬ−アミノ酸を使用すれば得られる。
アミノ酸あるいはアミノアルコールの添加濃度は、０．５から２mg／mlが望ましいが、本発明はこの濃度に限定されるものではない。アミノ酸あるいはアミノアルコールの添加時期は、培養直後から培養３日目までが望ましい。培養温度は２５℃が最適であるが、この温度に限定されるものではない。培養時間は、アミノ酸あるいはアミノアルコール添加後３から６日で充分な生産量が得られる。通気攪拌条件は、５００ml容の三角フラスコに１００mlのＡ培地を入れ、適当な通気栓をした場合、１８０rpmの旋回培養で得られる条件が適当である。ジャーファーメンターを用いる場合、これに相当する条件が望ましい。本発明の方法により、極めて多様なトリプレニルフェノール化合物の一群を生産できる。
【００３４】
本発明において、前記の式中の置換基Ｘが、−ＣＨ₂−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、−ＣＨ₂−Ｃ（ＣＨ₃）₂ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ（ＣＨ₃）₂又は−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（ＣＨ₃）₂ＯＨである本発明の化合物は、Ｘが−ＣＨ＝（ＣＨ₃）₂である本発明の化合物から、慣用の方法に従い、例えば、接触還元、酸触媒、オキシ水銀化−脱水銀法、ヒドロボレーション−酸化法、又は冷アルカリ性ＫＭｎＯ₄若しくは過ギ酸ＨＣＯ₂ＯＨによる処理法などから、当業者が適宜選択される方法で、得ることもできる。
【００３５】
本発明の化合物は、遊離形態、薬学的に許容され得る塩若しくはエステルの形態、又は溶媒和物の形態で用いることができる。塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、またはクエン酸、ギ酸、フマール酸、リンゴ酸、酢酸、コハク酸、酒石酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の無機酸または有機酸が、本発明の化合物の薬学的に許容され得る塩の形成に好適である。また、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ金属またはアルカリ土類金属を含む化合物、塩基性アミン、または塩基性アミノ酸も、本発明の化合物の薬学的に許容され得る塩の形成に好適である。
【００３６】
また、炭素数１〜１０個のアルコールまたはカルボン酸など、好ましくは、メチルアルコール、エチルアルコール、酢酸、又はプロピオン酸などが、本発明の化合物の薬学的に許容され得るエステルの形成に好適である。
【００３７】
また、水などが、本発明の化合物の薬学的に許容され得る溶媒和の形成に好適である。
【００３８】
本発明の化合物は、強い血管新生阻害作用を有するので、血管新生阻害剤として使用できる。血管新生阻害剤として、血管新生関連疾患、例えば、血管新生が病因あるいは病態の悪化に関与している疾患の予防及び治療に有用である。このような疾患として、例えば、悪性腫瘍、糖尿病性網膜症、リウマチなどが挙げられる。
【００３９】
本発明の化合物を血管新生関連疾患の予防及び治療用医薬組成物として用いることができる。これら化合物を成分とする医薬組成物の投与形態は経口的あるいは非経口的に投与でき、経口投与に適する製剤の例としては、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤又はシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する製剤の例としては、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、貼付剤等を挙げることができる。これら化合物を成分とする薬剤の投与量は特に制限されないが、投与形態、年齢、体重、症状に応じて適宜選択すればよい。例えば静脈内投与の場合には、成人１日当り有効成分量として１から２５mg/kgの投与、経口投与の場合には、成人１日当り有効成分量として２から２００mg/kgの投与が望ましい。投与期間は、年齢、症状に応じて任意に定めることができる。
【００４０】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００４１】
【実施例】
実験材料
ヒトウロキナーゼは日本ケミカルリサーチ（日本）から、Ｈ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド（ＶＬＫ−ｐＮＡ）はバッケム（スイス）から得た。ヒトプラスミノゲンは、ヒト血漿からアフィニティー精製した。インビトロ実験で使用する場合は、本発明の化合物を緩衝液（ＴＢＳ／Ｔ；５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００mM ＮａＣｌ、及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、pH７．４）に直接溶解した。動物実験では、希ＮａＯＨで約pH７に調整した、本発明の化合物を、生理食塩水に溶解した。日本チャールスリバー（横浜）からＣ５７ＢＬ／６マウス（６週齢）を得て、１週間維持した後実験に使用した。
【００４２】
本発明の化合物の産生方法
S. microspora IFO 30018の斜面培養のループフル（loopful）を、３％グルコース、１％大豆粉、０．３％ペプトン、０．３％肉エキス、０．３％酵母エキス、０．０５％ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、及び０．０１％ＣＢ４４２（消泡剤、日本油脂（日本））からなる培地１００mlを含む５００ml三角フラスコに播種した。そのフラスコを、１８０rpmのロータリーシェーカーで２５℃で３日間インキュベートした。種培養物のうちの１mlを、２％グルコース、０．５％ペプトン、０．３％酵母エキス、０．３％ＫＨ₂ＰＯ₄、０．１％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、アミノ酸１００mg、及び０．０１％ＣＢ４４２（pH５．５）からなる培地１００mlを含む５００ml三角フラスコに播種し、そのフラスコを４〜６日間上記のようにインキュベートした。
【００４３】
プラスミノゲン活性化の測定方法
ＶＬＫ−ｐＮＡ加水分解及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を測定することにより、ウロキナーゼ触媒によるプラスミノゲン活性化を測定した。プラスミノゲン（１００nM）をＴＢＳ／Ｔ〔５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００mM ＮａＣｌ、及び０．０１％（w/v）Ｔｗｅｅｎ８０、pH７．４〕中の５０Ｕ／mlウロキナーゼと３７℃で最長６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、その混合物にＴＢＳ／Ｔ中の１mM ＶＬＫ−ｐＮＡを１／９量添加して、更に３７℃でインキュベートし、４０５nmの吸光度を２分間隔で測定した。ｐＮＡ放出の初速度から、プラスミン濃度を決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用した分子種の決定のために、上述の反応混合物（０〜６０分間インキュベートしたもの）を１０％トリクロロ酢酸で処理し、得られた沈殿をアセトンで洗浄して、５％（ｖ／ｖ） ２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ試料緩衝液〔２％（w/v）ＳＤＳ、６２．５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH６．８、１０％（w/v）スクロース、及び０．０２％（w/v）ブロモフェノールブルー〕１１μlに溶解した。混合物の一部（１０μl）を１０％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供試し、そのゲルをクーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色した。
【００４４】
動物実験
最初の実験では、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で継代したルイス肺がん細胞を、使用前に２mM ＥＤＴＡ含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に分散させた。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＰＢＳに１ｘ１０⁷個／mlになるよう懸濁させ、その懸濁液０．１mlをＣ５７ＢＬ／６マウスの背部に皮下注射した。ＳＭＴＰ−７は、移植日以降、連日腹腔内投与した。その他の実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウス内でインビボで継代したルイス肺がん細胞を用いた。腫瘍を注入するために、マウスから切除し、０．２５％トリプシンを含むハンクス液に分散させた。細胞を図の凡例に示した密度になるようＰＢＳに懸濁させて、その懸濁液０．２mlをＣ５７ＢＬ／６マウスのそけい部に皮下注射した。マウスは、どの実験でも２２℃、湿度５０％、１２時間の明暗周期で維持し、標準食及び飲水を自由に摂取させた。腫瘍サイズは、以下の式：幅²ｘ長さｘ０．５２を用いて計算した容積（mm³）として表した。
【００４５】
実施例１ ＳＭＴＰ−７Ｄの合成
アミノ酸としてＤ−オルニチンを使用して、前記のようにして培養物を得た。培養物の上清（０．９リットル）を２−ブタノンで抽出し（等量で１回と半量で２回）、ひとまとめにした有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固した。得られた油状残渣（１６５mg）を、ＭｅＯＨで約１００mg／mlに溶解して、LiChrolut（登録商標）ＲＰ−１８固相抽出カラムに通して、Inertsil PREP-ODSカラム（３０ｘ２５０mm；ＧＬサイエンス（日本、東京））での分取ＨＰＬＣに供試した。８０％の水性ＭｅＯＨ中の５０mM酢酸アンモニウムを用いて、そのカラムを４０℃で２５ml／分の速度で展開した。保持時間３４〜３９分で溶出された分画を蒸発させてＭｅＯＨを除去し、酢酸エチルで抽出して、精製ＳＭＴＰ−７Ｄを１７．９mg得た。
【００４６】
実施例２ ＳＭＴＰ−７Ｌの合成
アミノ酸としてＬ−オルニチンを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。
【００４７】
実施例３ ＳＭＴＰ−８Ｄの合成
アミノ酸としてＤ−リジンを使用して、前記のようにして培養物を得た。培養物の上清（１．８リットル）を２−ブタノンで抽出し（等量で１回と半量で２回）、ひとまとめにした有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固した。得られた油状残渣（７５２mg）を、シリカゲルカラム（３０ｘ２４０mm）に負荷し、そのカラムをヘキサン２００ml、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（６０：４０及び２０：８０）３００ml、及び酢酸エチル−ＭｅＯＨ（１００：０、９８：２、９５：５、９０：１０）３００mlで逐次展開した。酢酸エチル−ＭｅＯＨ（９５：５及び９０：１０）分画を濃縮して残渣１６３mgを得た。その残渣をシリカゲルカラム（３０ｘ２４０mm）のクロマトグラフィーに再度供試し、ヘキサン１００ml、酢酸エチル２００ml、及び酢酸エチル−ＭｅＯＨ（９８：２及び９５：５）で逐次展開した。酢酸エチル−ＭｅＯＨ （９５：５）分画を濃縮して、残渣１４３mgを得た。Inertsil PREP-ODSカラム（３０ｘ２５０mm）による分取ＨＰＬＣでは、８０％水性ＭｅＯＨ中の５０mM酢酸アンモニウムを用いて、４０℃で２５ml／分の速度で展開し、その残渣を更に精製した。ＳＭＴＰ−８Ｄを含む分画（保持時間４２〜５０分）を蒸発させてＭｅＯＨを除去し、酢酸エチルで抽出して精製ＳＭＴＰ−８Ｄを３３．７mg得た。
【００４８】
実施例４ ＳＭＴＰ−８Ｌの合成
アミノ酸としてＬ−リジンを使用した以外は、実施例３と同様な方法で行なった。
【００４９】
実施例５ ＳＭＴＰ−４Ｄの合成
アミノ酸としてＤ−フェニルアラニンを使用し、７０％の水性ＭｅＯＨ中の５０mM酢酸アンモニウムを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。０．９リットルの培養液から得られた油状残渣（３７９mg）を分取ＨＰＬＣに供試し、保持時間４６．５〜５０分で溶出された分画からＳＭＴＰ−４Ｄを４２．４mg得た。
【００５０】
実施例６ ＳＭＴＰ−５Ｄの合成
アミノ酸としてＤ−ロイシンを使用し、７０％の水性ＭｅＯＨ中の５０mM酢酸アンモニウムを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。０．６リットルの培養液から得られた油状残渣（２３６mg）を分取ＨＰＬＣに供試し、保持時間５９〜６２分で溶出された分画からＳＭＴＰ−５Ｄを１５．７mg得た。
【００５１】
実施例７ ＳＭＴＰ−６Ｄの合成
アミノ酸としてＤ−トリプトファンを使用して、前記のようにして培養物を得た。培養物の上清（１．６リットル）を２−ブタノンで抽出し（等量で１回と半量で２回）、ひとまとめにした有機抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固した。得られた油状残渣（７８９mg）を、シリカゲルカラム（３０ｘ２４０mm）に負荷し、そのカラムをヘキサン２００ml、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（６０：４０及び２０：８０）３００ml、及び酢酸エチル−ＭｅＯＨ（１００：０、９８：２、９５：５、９０：１０）３００mlで逐次展開した。ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（２０：８０）分画を濃縮して精製ＳＭＴＰ−６Ｄを７９．５mg得た。
【００５２】
実施例８ ＳＭＴＰ−９Ｌの合成
アミノ酸としてＬ−シスチンを使用し、７０％の水性ＭｅＯＨ中の５０mM酢酸アンモニウムを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。０．９リットルの培養液から得られた油状残渣（３５８mg）を分取ＨＰＬＣに供試し、保持時間４９．５〜５１．３分で溶出された分画からＳＭＴＰ−９Ｌを２３．４mg得た。
【００５３】
実施例１０ ＳＭＴＰ−１０Ｌの合成
アミノ酸としてＬ−イソロイシンを使用し、６０％の水性ＭｅＯＨ中の５０mM酢酸アンモニウムを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。０．６リットルの培養液から得られた油状残渣（１６０mg）を分取ＨＰＬＣに供試し、保持時間４１〜４５分で溶出された分画からＳＭＴＰ−１０Ｌを１９．０mg得た。
【００５４】
実施例１１ ＳＭＴＰ−１１Ｌの合成
アミノ酸としてＬ−バリンを使用し、７０％の水性ＭｅＯＨ中の５０mM酢酸アンモニウムを使用した以外は、実施例１と同様な方法で行なった。０．６リットルの培養液から得られた油状残渣（１９３mg）を分取ＨＰＬＣに供試し、保持時間２８〜３２分で溶出された分画からＳＭＴＰ−１１Ｌを４．４mg得た。
【００５５】
プラスミノゲンフラグメント生成に対する影響
実施例１〜４の化合物（図１）の、プラスミン（プラスミノゲン）フラグメント生成の能力についてテストした。ＳＭＴＰ−７Ｌの存在下でウロキナーゼ触媒によりプラスミノゲンを活性化したところ、５分以内にプラスミンのＢ鎖に対応する２７kDaのバンドが出現し、その後そのバンド強度が急速に低下するのが、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察された。その一方で、Ａ鎖に対応する６８／７０kDaの二重バンドの強度は、経時的に増大した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、６８〜７７kDaの広いバンドがインキュベーションの１０分後に現われ、その強度は最長で５０分間増大した。対照実験では、Ａ鎖及びＢ鎖の緩やかで着実な増加が還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察され、６８〜７７kDaのバンドの出現は非還元ゲルでは検出されなかった。これらの結果から、ＳＭＴＰ−７Ｌが、プラスミンの急速な生成と、主にＢ鎖内のプラスミン分解の両者を誘導して、６８〜７７kDaのプラスミンフラグメント（ＰＭＤ）を生成することが示された。図２Ｃに示すように、Ｂ鎖の急速な分解は、プラスミン活性の低下を伴ったが、ウロキナーゼ触媒によるプラスミン形成は、直線的に増加した。
【００５６】
次に、ＰＭＤ生成を促進する複数のＳＭＴＰの活性を、奏効に必要な濃度に関して比較した。テスト化合物は、これまでに２５０μMの濃度でＰＭＤ生成の促進を示したＳＭＴＰ−６Ｌと比較すると、プラスミノゲン活性化を増強する活性が高かった。図３に示すように、テストした実施例の化合物は全て、ＳＭＴＰ−６Ｌの奏効に必要な濃度よりも低濃度でＰＭＤ生成の活性を有した。活性を発揮するのに必要な濃度は、プラスミノゲン活性化を増強する濃度と同一であった。このように、４種のテスト化合物のうちではＳＭＴＰ−７Ｌが最も強力で、９０μMという低濃度で効果が示された。ＳＭＴＰ−８ＬとＳＭＴＰ−７Ｌの活性は同じく９０μMで認められたが、ＰＭＤ生成の規模は、ＳＭＴＰ−７Ｌよりも小さかった。ＳＭＴＰ−８Ｄは、３種の化合物よりも活性が有意に低く、１２０μMで活性を示した。
【００５７】
これらの結果から、実施例の化合物がＰＭＤ生成を促進する活性を有することが実証される。プラスミノゲンを増強する活性が高い化合物ほど、ＰＭＤ生成が強力であり、ＰＭＤ生成に必要なＳＭＴＰ濃度は、プラスミノゲン活性化の増大に必要な各濃度に類似していた。そのため、おそらくプラスミノゲンコンホメーションの調整は、プラスミノゲン活性化を増強する根本的なメカニズムであり、ＳＭＴＰによるＰＭＤ生成の促進でも役割を演じていると思われた。
【００５８】
ＳＭＴＰ−７Ｌによる腫瘍成長の阻害
プラスミノゲンフラグメントであるアンジオスタチンの高用量を担腫瘍マウスに全身処理したところ（４０〜５０mg/kgを１日２回）、原発性腫瘍の成長阻害が示されたため、次にルイス肺がん細胞を移植されたマウスモデルを用いて、インビボで腫瘍成長を抑制するＳＭＴＰ−７Ｌの能力についてテストした。最初の実験では、インビトロ培養したルイス肺がん細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射して、ＳＭＴＰ−７Ｌを移植の翌日から連日腹腔内投与した。その結果から、ＳＭＴＰ−７Ｌの投与が移植腫瘍の有意な阻害を引き起こすことが実証された。阻害は、１３日後に明確になり、それぞれ５及び５０mg/kgの日用量で処理した２０日後に、腫瘍容積の６５％及び７５％減少が観察された（図４Ａ）。処理したマウスの体重変化を図４Ｂに示しているが、その図から、５０mg/kgのＳＭＴＰ−７Ｌ投与が体重減少を引き起こさず、腫瘍による体重増加分の減少さえも防止することが示された。
【００５９】
２番目に行った１組の実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウス内でインビボで保持したルイスラットの癌の分散細胞を、０日目にマウスに皮下注入し、移植した腫瘍が認識できるサイズに成長した７又は８日目に、体重及び腫瘍サイズが群間で均等に分配されるようにマウスを群分けした。群分けの日とその後３日毎に、ＳＭＴＰ−７Ｌを腹腔内投与した。図４Ｃに示すように、腫瘍成長の阻害は、１０日目より後（ＳＭＴＰ−７Ｌで処置した後３日間）に観察され、その阻害は、それぞれ１．５及び２０mg/kgの用量で５６％及び６２％であった。腫瘍の重量も、ＳＭＴＰ−７Ｌ処置により有意に減少した（図４Ｄ）。１．５mg/kg及び２０mg/kgの用量で有効性は同様であったことから、次に、その薬物をより低用量でテストした。その結果（図４Ｅ）から、０．０１５及び０．１５mg/kg用量の有効性は統計学的に有意でなかったが、１．５mg/kgの有効性は１０日目から１６日目まで有意であることが示された。しかし、対照と１．５mg/kg群の間の腫瘍容積の差は、１９日目には有意でなくなった。
【００６０】
３番目の実験では、移植後４日目に行ったＳＭＴＰ−７Ｌ単回投与の有効性をテストした。図４Ｄに示すように、１．５mg/kg群の腫瘍容積の減少は穏やかで、対照群と比較して統計学的に有意でなかった。
【００６１】
一連の動物実験から、ＳＭＴＰ−７Ｌが腫瘍成長を遅延させる活性があることが実証された。その効果は、１．５mg/kgの腹腔内投与で認められたが、その用量は、成長初期の腫瘍を抑制するために用いられる蛋白質様の薬剤アンジオスタチンの用量（４０〜５０mg/kgを１日２回）よりもはるかに低かった。こうして、アンジオスタチン様プラスミン（プラスミノゲン）フラグメントの内因的生成をＳＭＴＰにより薬理学的に促進することは、有利な腫瘍治療となる可能性がある。プラスミノゲン活性化因子の供給が多ければ、そのような低分子量化合物を用いた宿主媒介反応を活用することにより、ＰＭＤが腫瘍内で現場生成させることになり、それゆえ有効性及び選択性だけでなく、高レベルの蛋白質様薬剤の投与で問題となる耐容性に関しても有利になる。ＳＭＴＰ−７Ｌは、有効用量より３０倍高い日用量５０mg/kgの腹腔内投与では毒性を示さなかったため、その薬剤が抗腫瘍薬として有望である。
【００６２】
【発明の効果】
本発明の化合物は、血管新生阻害作用を有し、血管新生関連疾患の治療と予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＭＴＰ−７Ｄ、−８Ｄ、−７Ｌ、及び−８Ｌの構造を表す図である。
ジヒドロピラン部分の立体配置は相対的なものである。
【図２】ＳＭＴＰ−７ＬによるＰＭＤ生成の促進を表す図である。
（Ａ〜Ｄ）プラスミノゲン（１００nM）を、１２０μMＳＭＴＰ−７Ｌの非存在下（Ａ及びＣ；対照）又は存在下（Ｂ及びＤ）でウロキナーゼ（５０Ｕ／ml）とインキュベートした。記載した時間インキュベートした後、インキュベーションの一部（２μg蛋白質）を非還元（Ａ及びＢ）又は還元（Ｃ及びＤ）条件下で１０％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供試した。分子量マーカ（左）に加えプラスミン及びＰＭＤのＡ鎖及びＢ鎖（右）の位置を示している。（Ｅ）プラスミノゲンとウロキナーゼをＡ〜Ｄと同様にインキュベートし、記載した時間にＶＬＫ−ｐＮＡを添加して、プラスミン活性を測定した。各値は、三重測定の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。
【図３】ＳＭＴＰ−７Ｄ、−８Ｄ、−７Ｌ、及び−８Ｌの活性の比較を表す図である。
記載した濃度のＳＭＴＰ−７Ｄ、−８Ｄ、−７Ｌ、及び−８Ｌの存在下で、プラスミノゲン（１００nM）をウロキナーゼ（５０Ｕ／ml）と３０分間インキュベートした。インキュベーションの一部（２μg蛋白質）を非還元条件下で１０％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供試した。分子量マーカの位置を示している。
【図４】ＳＭＴＰ−７Ｌによるインビボでの腫瘍成長の阻害を表す図である。
（Ａ及びＢ）０日目に、インビトロ培養したルイスラットの肺癌の懸濁液（１００μl；１ｘ１０⁷細胞／ml）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部に皮下注射した。生理食塩水中のＳＳＭＴＰ−７Ｌ又は生理食塩水のみを、移植の翌日から連日腹腔内投与し、腫瘍容積及び体重を測定した（各群ｎ＝３〜４）。
（Ｃ及びＤ）インビボで保持したルイスラットの肺癌の分散細胞を、２ｘ１０⁶細胞／mlに懸濁させ、その懸濁液２００μlを０日目にＣ５７ＢＬ／６マウスのそけい部に皮下注射した。７日目に、体重と腫瘍サイズが群間で均等に分配されるように、マウスを群分けした（ｎ＝３〜４）。７日目及びその後３日毎に、生理食塩水又はＳＭＴＰ−７Ｌを腹腔内投与した。１５日目に腫瘍を切除して、重量（Ｄ）を測定した。
（Ｅ）インビボ培養したルイス肺がん細胞の懸濁液（２００μl；１．１４ｘ１０⁶細胞／ml）を、０日目にＣ５７ＢＬ／６マウスのそけい部に皮下注射した。６日目に、体重と腫瘍サイズが群間で均等に分配されるように、マウスを群分けした（ｎ＝５〜６）。６日目及びその後３日毎に、生理食塩水又はＳＭＴＰ−７Ｌを腹腔内投与した。
（Ｆ）インビボ培養したルイス肺がん細胞の懸濁液（２００μl；２ｘ１０⁶細胞／ml）を、０日目にＣ５７ＢＬ／６マウスのそけい部に皮下注射した。４日目にマウスを群分けして（ｎ＝４）、４日目だけ生理食塩水又はＳＭＴＰ−７Ｌを腹腔内投与した。記載したＰ値は、正規分布した変数を用いるスチューデントｔ検定の両側Ｐ値である。
【図５】ＳＭＴＰ−４Ｄ、−５Ｄ、−６Ｄ、−７Ｄ、及び−８Ｄ構造を表す図である。
【図６】ＳＭＴＰ−９、−１０、及び−１１の構造を表す図である。
【図７】ＳＭＴＰ−１、−２、及び−３の構造を表す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention also relates to a pharmaceutical composition for prevention and treatment of a novel angiogenesis-related disease.
[0002]
[Prior art]
Today, it is known that angiogenesis is involved in worsening the etiology or pathology of diseases such as malignant tumors, diabetic retinopathy or rheumatism. Inhibiting angiogenesis is important for the prevention and treatment of these diseases.
[0003]
The plasminogen / plasmin system plays a pivotal role not only in thrombolysis but also in various physiological and pathological events that require localized proteolysis such as inflammation, tissue remodeling, tumor metastasis, and angiogenesis Play. Plasminogen consists of an N-terminal peptide, five kringle domains, and a serine protease domain. Two serine proteases, tissue-type plasminogen activator and urokinase-type plasminogen activator (urokinase), are Arg⁵⁶¹-Val⁵⁶²By cleaving the bond, it catalyzes the activation of plasminogen. The resulting plasmin is Lys⁷⁷-Lys⁷⁸And / or Lys⁷⁸-Val⁷⁹To produce mature plasmin consisting of two polypeptide chains joined by a disulfide bridge. This heavy chain (A chain; Lys⁷⁸-Or Val⁷⁹-Asp⁵⁶¹) Contains 5 kringle domains and contains a light chain (B chain; Val⁵⁶²-Asn⁷⁹¹) Has a serine protease domain. For circulating plasminogen, Lys in the N-terminal peptide⁵⁰ And / or Lys⁶²Is difficult to activate because it maintains a tight helical conformation by intramolecularly binding to the lysine binding site (aminohexyl site) of the fifth kringle domain (K5). Fibrin and cell receptors can bind to plasminogen and relax and highly activate plasminogen conformation, thus facilitating efficient localized proteolysis. Similarly, lysine analogs bind to plasminogen kringle, relax its conformation and enhance activation to plasmin. Thus, the conformational adjustment of plasminogen is important for plasminogen activation.
[0004]
Under certain circumstances, such as tumor progression and inflammation, plasmin (plasminogen) undergoes proteolysis to form various kringle-containing A chain fragments (collectively called angiostatin). Physiological plasmin (plasminogen) cleavage that occurs before or after partial disulfide reduction is mediated by plasmin itself, matrix metalloproteinases, metalloelastases, and / or cathepsin D produced by tumor cells or inflammatory macrophages. It is assumed. A typical angiostatin consists of the first four kringle domains (K1-4) of plasmin. Angiostatin and its analogs (K1, K2, K3, K5, K1-3, K1-4_1/2And A₆₁Etc.) affect vascular endothelial cells and inhibit endothelial cell proliferation, migration, and tube formation, which are the basic processes of angiogenesis. Angiostatin suppresses both the growth of both primary and metastatic tumors in animal models by inhibiting angiogenesis.
[0005]
Recently, novel non-lysine-analog modulators of plasminogen activation have been discovered. For example, in Patent Document 1, Stachybotrys microspora, when cultured in a medium supplemented with tryptophan and lysine, selectively uses a triprenylphenol compound (hereinafter referred to as “SMTP”) having these amino acid moieties as structural components. Is disclosed.
Non-lysine-like modulators such as stapravine and SMTP, as well as thioplabins, enhance both plasminogen activation and plasminogen-fibrin binding and increase fibrinolysis.
[0006]
However, it has not been known that these SMTPs have an angiogenesis inhibitory action.
[0007]
[Patent Document 1]
JP 2002-65288 A
[Problems to be solved by the invention]
[0008]
The present invention is to provide a novel pharmaceutical composition for preventing or treating angiogenesis-related diseases.
[0009]
The effect of non-lysine-like modulators to enhance both plasminogen activation and plasminogen-fibrin binding and increase fibrinolysis is that lysine-like modulators inhibit plasminogen-fibrin binding and fibrinolysis even though plasminogen activity is increased. Conformational changes are so different that the conformational changes induced by such non-lysine-like modulators can be distinguished from changes induced by lysine analogues. The inventor has found that adjusting the conformation of plasminogen with a non-lysine-like modulator not only enhances plasminogen activation, but also imparts extraordinary proteolytic sensitivity to plasmin (plasminogen). In addition, the present inventor has shown that three of such compounds (SMTP-6, thioplabine B, and complestatin) have plasmin (B chain) due to the catalytic domain (B chain) that has undergone extensive fragmentation. It has also been found to promote autocatalytic production of plasminogen) derivatives (called PMDs) and inhibit vascular endothelial cell proliferation, migration, and tube formation.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
As a result of extensive research, the inventor has found that a triprenylphenol compound has angiogenesis inhibitory activity, and also found that the compound is effective for inhibiting tumor growth, thereby completing the present invention. It was.
[0011]
That is, the present invention provides compounds of formula I:
[Chemical formula 2]

[Where,
X represents —CHY—C (CH_Three)₂Z,
Y and Z are each -H or -OH, or together form a single bond;
m is 1 or 2,
When m is 1, the dotted line (...) shows no bond,
R¹Is
(1) natural amino acids,
(2) natural amino acid D-form, and
(3) A compound in which a carboxyl group is replaced with hydrogen, hydroxyl group or hydroxylmethyl group in natural amino acid or natural amino acid D-form
A residue obtained by removing one amino group from an amino compound selected from the group consisting of:
When m is 2, the dotted line (...) indicates a bond,
R²Becomes a divalent linking group,
(1) a natural amino acid having two amino groups,
(2) D-form of a natural amino acid having two amino groups,
(3) a compound in which a carboxyl group is replaced with hydrogen, a hydroxyl group or a hydroxylmethyl group in the D-form of a natural amino acid having two amino groups or a natural amino acid having two amino groups, and
(4) H₂N-CH (COOH)-(CH₂)_n-NH₂(N is an integer of 0 to 9)
A residue obtained by removing two amino groups from an amino compound selected from the group consisting of
Or a pharmaceutically acceptable salt, ester or solvate thereof, wherein the composition is for preventing or treating angiogenesis-related diseases.
[0012]
In the compound of formula I above, when m is 1, the compound of formula I is of formula II:
[0013]
[Chemical 3]

[0014]
(Where X, Y, Z and R¹Is the same as defined above)
And when m is 2, the compound of formula I can be represented by formula III:
[0015]
[Formula 4]

[0016]
(Where X, Y, Z and R²Is the same as defined above)
It can also be expressed as
[0017]
The present invention also relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating angiogenesis-related diseases, comprising at least one compound represented by formula I, II or III.
[0018]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
[0019]
The substituent X in the above formula is preferably —CHY—C (CH, wherein Y and Z are each —OH or together form a single bond._Three)₂Z, particularly preferably —CHY—C (CH, wherein Y and Z together form a single bond._Three)₂Z.
[0020]
In the above formula, when m is 1, the substituent R¹Is
(1) natural amino acids,
(2) natural amino acid D-form, and
(3) A compound in which a carboxyl group is replaced with hydrogen, hydroxyl group or hydroxylmethyl group in natural amino acid or natural amino acid D-form
A residue obtained by removing one amino group from an amino compound selected from the group consisting of
The natural amino acids (1) to (3) when m is 1 are not particularly limited as long as they are naturally occurring amino acids. For example, α-amino acids, β-amino acids, γ-amino acids And δ-amino acids. Such amino acids may be obtained from natural products or artificially obtained by techniques such as organic synthesis.
[0021]
As the amino acids (1) to (3) when m is 1, for example, α-amino acid may be glycine, alanine, serine, threonine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, cysteine, cystine, Methionine, tryptophan, histidine, aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine, arginine, lysine, hydroxylysine, ornithine, citrulline, homocysteine, 3,4-dihydroxyphenylalanine, homocystine, diaminopimelic acid and diaminopropionic acid, etc. -Amino acids include β-alanine, γ-amino acids include γ-aminobutyric acid and carnitine, and δ-amino acids include 5-aminolevulinic acid and 5-aminovaleric acid. It is below.
[0022]
In the natural amino acid of (3) or natural amino acid D-form when m is 1 above, examples of the compound in which the carboxyl group is replaced with hydrogen, hydroxyl group or hydroxylmethyl group include amino alcohol and amine. Examples of such amino alcohol include 2-aminoethanol and isopropyl alcohol.
[0023]
R¹Is preferably hydrophobic, and as natural amino acids (1) to (3) when m is 1, for example, isoleucine, valine, tryptophan, phenylalanine, leucine and the like are preferable.
[0024]
In the above formula, when m is 2, the substituent R²Is a divalent linking group;
(1) a natural amino acid having two amino groups,
(2) D-form of a natural amino acid having two amino groups,
(3) a compound in which a carboxyl group is replaced with hydrogen, a hydroxyl group or a hydroxylmethyl group in the D-form of a natural amino acid having two amino groups or a natural amino acid having two amino groups, and
(4) H₂N-CH (COOH)-(CH₂)_n-NH₂(N is an integer of 0 to 9)
A residue obtained by removing two amino groups from an amino compound selected from the group consisting of:
The above-mentioned natural amino acid having two amino groups (1) to (3) when m is 2 is an amino acid that can exist naturally, and if it has two amino groups, There is no limitation, and examples include α-amino acids, β-amino acids, γ-amino acids, and δ-amino acids. Such amino acids may be obtained from natural products or artificially obtained by techniques such as organic synthesis.
[0025]
Examples of the natural amino acid having two amino groups (1) to (3) when m is 2, for example, α-amino acid, lysine, hydroxylysine, ornithine, citrulline, cystine, homocystine, diaminopimerin Examples include acid and diaminopropionic acid.
[0026]
In the D-form of the natural amino acid having two amino groups or the natural amino acid having two amino groups of (3) when m is 2, the carboxyl group is hydrogen, hydroxyl group or hydroxylmethyl group As a compound replaced with H₂N- (CH₂)_l-NH₂(L is an integer of 1 to 10, preferably 2 to 6, more preferably 3 or 4.).
[0027]
In the compound (4) when n is 2, n is an integer of 0 to 9, preferably 1 to 5, more preferably 2 or 3.
[0028]
Also, R²May be a residue obtained by removing two amino groups from a compound in which the carboxyl group is replaced with hydrogen, hydroxyl group or hydroxylmethyl group in the compound of (4) when n is 2 above.
[0029]
The compounds of the present invention also include enantiomers of the compounds represented by Formulas I to III or racemic mixtures in which these enantiomers are mixed. Preferred enantiomers are those of formula IV:
[0030]
[Chemical formula 5]

The compound of this invention shown by these is mentioned.
[0031]
As the compound of the present invention, preferably, as shown in FIGS. 5 to 7, SMTP-1, SMTP-2, SMTP-3, SMTP-4, SMTP-5, SMTP-6, SMTP-7, SMTP-8, SMTP-9, SMTP-10 and SMTP-11. Also, enantiomers of these compounds and racemic mixtures formed by mixing these enantiomers can be used as the compounds of the present invention.
[0032]
In this specification, the following expressions are used for the enantiomers of the compounds of the present invention. That is, as the enantiomers, those having the R configuration with the asymmetric center at the 27th carbon atom in the chemical formula of the above SMTP-3 to SMTP-11 are expressed as SMTP-3D to SMTP-11D, respectively. . Further, among the above SMTP-3 to SMTP-11, those having an S configuration with the 27th carbon atom in the chemical formula as an asymmetric center are expressed as SMTP-3L to SMTP-11L. In addition, SMTP having an R configuration with a 27-position carbon atom as an asymmetric center in the chemical formula is expressed as SMTP-D, and SMTP having an S configuration with a 27-position carbon atom as an asymmetric center in the chemical formula as SMTP-L. To do.
[0033]
The compound of the present invention may be obtained by an organic chemical synthesis method. Preferably, as described in Patent Document 1, a fungus is cultured and obtained from its metabolite. Specifically, filamentous fungi belonging to the genus Stachybotrys are selected as the producing bacteria. A particularly preferred production strain is Stachybotrys microspora IFO30018 strain, but the present invention is not limited to this strain. The basic medium is preferably A medium having the following composition, but the present invention is not limited to the medium having this composition. A medium: Glucose 20 g, peptone 5 g, yeast extract 3 g, dipotassium phosphate 3 g, magnesium sulfate heptahydrate 1 g are dissolved in 1 liter of purified water, and the pH is adjusted to 5.5 with hydrochloric acid or sodium hydroxide. . The most important point in the medium composition is that an appropriate amino acid, amino alcohol or amine is added to the medium depending on the intended compound of the present invention.
For example, SMTP-1 and SMTP-2 are 2-aminoethanol, SMTP-3 is serine, SMTP-4 is phenylalanine, SMTP-5 is leucine, SMTP-6 is tryptophan, and SMTP-7 is ornithine. SMTP-8 can be selectively produced by adding lysine, SMTP-9 by cystine, SMTP-10 by isoleucine, and SMTP-11 by adding valine to the medium.
In order to obtain an enantiomer of the compound of the present invention, SMTP-3D to 11D can be obtained by using D-amino acid as the amino acid, and SMTP-3L to 11L can use L-amino acid as the amino acid. You can get it.
The concentration of amino acid or amino alcohol added is preferably 0.5 to 2 mg / ml, but the present invention is not limited to this concentration. The addition time of amino acid or amino alcohol is preferably from immediately after culturing to the third day of culturing. The culture temperature is optimally 25 ° C, but is not limited to this temperature. The culture time is 3 to 6 days after addition of amino acid or amino alcohol, and a sufficient production amount can be obtained. The conditions for aeration and agitation are those obtained by swirling culture at 180 rpm when 100 ml of A medium is put in a 500 ml Erlenmeyer flask and a suitable aeration stopper is attached. When using a jar fermenter, the conditions corresponding to this are desirable. By the process of the present invention, a very diverse group of triprenylphenol compounds can be produced.
[0034]
In the present invention, the substituent X in the above formula is —CH₂-CH (CH_Three)₂, -CH₂-C (CH_Three)₂OH, -CH (OH) -CH (CH_Three)₂Or -CH (OH) -C (CH_Three)₂A compound of the invention in which OH is X is —CH═ (CH_Three)₂From the compounds of the present invention according to conventional methods, for example catalytic reduction, acid catalysis, oxymercuration-demercuration method, hydroboration-oxidation method, or cold alkaline KMnO_FourOr performic acid HCO₂It can also be obtained by a method appropriately selected by those skilled in the art from a treatment method with OH or the like.
[0035]
The compounds of the present invention can be used in free form, in the form of a pharmaceutically acceptable salt or ester, or in the form of a solvate. Inorganic or organic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, or citric acid, formic acid, fumaric acid, malic acid, acetic acid, succinic acid, tartaric acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid Suitable for the formation of pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the present invention. In addition, compounds containing alkali metals or alkaline earth metals such as sodium, potassium, calcium, magnesium, basic amines, or basic amino acids are also suitable for the formation of pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the present invention. is there.
[0036]
Also, alcohols or carboxylic acids having 1 to 10 carbon atoms, preferably methyl alcohol, ethyl alcohol, acetic acid, or propionic acid are suitable for forming a pharmaceutically acceptable ester of the compound of the present invention. .
[0037]
Water and the like are also suitable for forming a pharmaceutically acceptable solvate of the compounds of the present invention.
[0038]
Since the compound of the present invention has a strong angiogenesis inhibitory action, it can be used as an angiogenesis inhibitor. As an angiogenesis inhibitor, it is useful for the prevention and treatment of angiogenesis-related diseases, for example, diseases in which angiogenesis is involved in the pathogenesis or pathological deterioration. Examples of such diseases include malignant tumors, diabetic retinopathy, rheumatism and the like.
[0039]
The compound of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of angiogenesis-related diseases. Administration forms of pharmaceutical compositions containing these compounds can be administered orally or parenterally. Examples of preparations suitable for oral administration include tablets, capsules, powders, fine granules, granules, solutions or syrups. Examples of preparations suitable for parenteral administration include injections, instillations, suppositories, inhalants, patches and the like. The dose of the drug containing these compounds as a component is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the administration form, age, weight, and symptoms. For example, in the case of intravenous administration, it is desirable to administer 1 to 25 mg / kg as the amount of active ingredient per day for adults, and in the case of oral administration, it is desirable to administer 2 to 200 mg / kg as the amount of active ingredient per day for adults. The administration period can be arbitrarily determined according to age and symptoms.
[0040]
Examples of the present invention are shown below, but the present invention is not limited to these examples.
[0041]
【Example】
Experimental material
Human urokinase was obtained from Nippon Chemical Research (Japan), and H-Val-Leu-Lys-p-nitroanilide (VLK-pNA) was obtained from Bacchem (Switzerland). Human plasminogen was affinity purified from human plasma. When used in in vitro experiments, the compounds of the invention were dissolved directly in buffer (TBS / T; 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, and 0.01% Tween 80, pH 7.4). In animal experiments, the compounds of the present invention, adjusted to about pH 7 with dilute NaOH, were dissolved in physiological saline. C57BL / 6 mice (6 weeks old) were obtained from Japan Charles River (Yokohama) and maintained for 1 week before use in the experiment.
[0042]
Method for producing the compound of the present invention
Slope culture of S. microspora IFO 30018 is 3% glucose, 1% soy flour, 0.3% peptone, 0.3% meat extract, 0.3% yeast extract, 0.05% KH.₂PO_Four0.05% MgSO_Four・ 7H₂A 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of a medium consisting of O and 0.01% CB442 (antifoaming agent, Japanese fat (Japan)) was seeded. The flask was incubated for 3 days at 25 ° C. on a rotary shaker at 180 rpm. 1 ml of seed culture is 2% glucose, 0.5% peptone, 0.3% yeast extract, 0.3% KH₂PO_Four0.1% MgSO_Four・ 7H₂A 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of medium consisting of O, 100 mg of amino acid and 0.01% CB442 (pH 5.5) was seeded and the flask was incubated as above for 4-6 days.
[0043]
Method for measuring plasminogen activation
Urokinase-catalyzed plasminogen activation was measured by measuring VLK-pNA hydrolysis and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Plasminogen (100 nM) was incubated with 50 U / ml urokinase in TBS / T [50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, and 0.01% (w / v) Tween 80, pH 7.4] at 37 ° C. for up to 60 minutes. After the incubation, 1/9 volume of 1 mM VLK-pNA in TBS / T was added to the mixture, further incubated at 37 ° C., and absorbance at 405 nm was measured at intervals of 2 minutes. The plasmin concentration was determined from the initial rate of pNA release. For the determination of molecular species using SDS-PAGE, the above reaction mixture (incubated for 0 to 60 minutes) was treated with 10% trichloroacetic acid, and the resulting precipitate was washed with acetone to give 5% ( v / v) SDS sample buffer with 2-mercaptoethanol [2% (w / v) SDS, 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% (w / v) sucrose, and 0.02% ( w / v) Bromophenol blue] was dissolved in 11 μl. A portion (10 μl) of the mixture was subjected to SDS-PAGE of a 10% gel and the gel was stained with Coomassie Brilliant Blue R250.
[0044]
Animal experimentation
In the first experiment, Lewis lung cancer cells passaged in RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum were dispersed in phosphate buffered saline (PBS) containing 2 mM EDTA prior to use. After washing with PBS, cells were washed 1x10 in PBS.⁷The suspension was suspended at a dose of 0.1 ml / ml, and 0.1 ml of the suspension was subcutaneously injected into the back of C57BL / 6 mice. SMTP-7 was intraperitoneally administered every day after the transplantation day. In other experiments, Lewis lung cancer cells passaged in vivo in C57BL / 6 mice were used. To inject tumors, they were excised from mice and dispersed in Hank's solution containing 0.25% trypsin. The cells were suspended in PBS to the density shown in the figure legend, and 0.2 ml of the suspension was injected subcutaneously into the throat of C57BL / 6 mice. Mice were maintained at 22 ° C., 50% humidity, 12 hours light-dark cycle in all experiments, and were allowed free access to standard food and drinking water. Tumor size is the following formula: width²Volume calculated using x length x 0.52 (mm^Three).
[0045]
Example 1Synthesis of SMTP-7D
Cultures were obtained as described above using D-ornithine as the amino acid. The culture supernatant (0.9 liter) was extracted with 2-butanone (equal volume once and half volume twice) and the combined organic extracts were dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated to dryness. The resulting oily residue (165 mg) was dissolved in MeOH to about 100 mg / ml, passed through a LiChrolut® RP-18 solid phase extraction column and passed through an Inertsil PREP-ODS column (30 × 250 mm; GL Science (Japan, In Tokyo))). The column was developed at a rate of 25 ml / min at 40 ° C. with 50 mM ammonium acetate in 80% aqueous MeOH. The fraction eluted with a retention time of 34-39 minutes was evaporated to remove MeOH and extracted with ethyl acetate to give 17.9 mg of purified SMTP-7D.
[0046]
Example 2Synthesis of SMTP-7L
The same procedure as in Example 1 was performed except that L-ornithine was used as the amino acid.
[0047]
Example 3Synthesis of SMTP-8D
Cultures were obtained as described above using D-lysine as the amino acid. The culture supernatant (1.8 liters) was extracted with 2-butanone (equal volume once and half volume twice) and the combined organic extracts were dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated to dryness. The resulting oily residue (752 mg) was loaded onto a silica gel column (30 × 240 mm) and the column was loaded with 200 ml hexane, 300 ml n-hexane-ethyl acetate (60:40 and 20:80), and ethyl acetate-MeOH (100: 0, 98: 2, 95: 5, 90:10) 300 ml was successively developed. The ethyl acetate-MeOH (95: 5 and 90:10) fractions were concentrated to give 163 mg of residue. The residue was re-subjected to chromatography on a silica gel column (30 × 240 mm) and successively developed with 100 ml of hexane, 200 ml of ethyl acetate, and ethyl acetate-MeOH (98: 2 and 95: 5). The ethyl acetate-MeOH (95: 5) fraction was concentrated to give 143 mg of residue. Preparative HPLC on an Inertsil PREP-ODS column (30 × 250 mm) was developed with 50 mM ammonium acetate in 80% aqueous MeOH at 40 ° C. at a rate of 25 ml / min and the residue was further purified. The fraction containing SMTP-8D (retention time 42-50 minutes) was evaporated to remove MeOH and extracted with ethyl acetate to give 33.7 mg of purified SMTP-8D.
[0048]
Example 4Synthesis of SMTP-8L
The same procedure as in Example 3 was performed except that L-lysine was used as the amino acid.
[0049]
Example 5Synthesis of SMTP-4D
The procedure was as in Example 1, except that D-phenylalanine was used as the amino acid and 50 mM ammonium acetate in 70% aqueous MeOH was used. An oily residue (379 mg) obtained from 0.9 liter of the culture solution was subjected to preparative HPLC, and 42.4 mg of SMTP-4D was obtained from the fraction eluted with a retention time of 46.5 to 50 minutes.
[0050]
Example 6Synthesis of SMTP-5D
The procedure was as in Example 1, except that D-leucine was used as the amino acid and 50 mM ammonium acetate in 70% aqueous MeOH was used. The oily residue (236 mg) obtained from 0.6 liter of the culture solution was subjected to preparative HPLC, and 15.7 mg of SMTP-5D was obtained from the fraction eluted with a retention time of 59 to 62 minutes.
[0051]
Example 7Synthesis of SMTP-6D
Cultures were obtained as described above using D-tryptophan as the amino acid. The culture supernatant (1.6 liters) was extracted with 2-butanone (equal volume once and half volume twice) and the combined organic extracts were dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated to dryness. The resulting oily residue (789 mg) was loaded onto a silica gel column (30 × 240 mm) and the column was loaded with 200 ml hexane, 300 ml n-hexane-ethyl acetate (60:40 and 20:80), and ethyl acetate-MeOH (100: 0, 98: 2, 95: 5, 90:10) 300 ml was successively developed. The n-hexane-ethyl acetate (20:80) fraction was concentrated to obtain 79.5 mg of purified SMTP-6D.
[0052]
Example 8Synthesis of SMTP-9L
The procedure was as in Example 1, except that L-cystine was used as the amino acid and 50 mM ammonium acetate in 70% aqueous MeOH was used. An oily residue (358 mg) obtained from 0.9 liter of the culture solution was subjected to preparative HPLC, and 23.4 mg of SMTP-9L was obtained from the fraction eluted with a retention time of 49.5 to 51.3 minutes. .
[0053]
Example 10Synthesis of SMTP-10L
The procedure was as in Example 1, except that L-isoleucine was used as the amino acid and 50 mM ammonium acetate in 60% aqueous MeOH was used. The oily residue (160 mg) obtained from 0.6 liter of the culture solution was subjected to preparative HPLC, and 19.0 mg of SMTP-10L was obtained from the fraction eluted with a retention time of 41 to 45 minutes.
[0054]
Example 11Synthesis of SMTP-11L
The procedure was as in Example 1, except that L-valine was used as the amino acid and 50 mM ammonium acetate in 70% aqueous MeOH was used. The oily residue (193 mg) obtained from 0.6 liter of the culture solution was subjected to preparative HPLC, and 4.4 mg of SMTP-11L was obtained from the fraction eluted with a retention time of 28 to 32 minutes.
[0055]
Effect on plasminogen fragment formation
The compounds of Examples 1-4 (FIG. 1) were tested for their ability to produce plasmin (plasminogen) fragments. When plasminogen was activated by urokinase catalyst in the presence of SMTP-7L, a 27 kDa band corresponding to the B chain of plasmin appeared within 5 minutes, and then the intensity of the band rapidly decreased. Observed by PAGE. On the other hand, the intensity of the 68/70 kDa double band corresponding to the A chain increased with time. In non-reducing SDS-PAGE, a broad band of 68-77 kDa appeared after 10 minutes of incubation and its intensity increased up to 50 minutes. In control experiments, a slow and steady increase in A and B chains was observed with reduced SDS-PAGE, and the appearance of a 68-77 kDa band was not detected on the non-reducing gel. These results indicated that SMTP-7L produced a 68-77 kDa plasmin fragment (PMD), inducing both rapid plasmin production and mainly plasmin degradation within the B chain. As shown in FIG. 2C, rapid degradation of the B chain was accompanied by a decrease in plasmin activity, whereas urokinase-catalyzed plasmin formation increased linearly.
[0056]
Next, the activities of multiple SMTPs that promote PMD production were compared with respect to the concentration required for response. The test compound was more active in enhancing plasminogen activation when compared to SMTP-6L, which has previously shown enhanced PMD production at a concentration of 250 μM. As shown in FIG. 3, all of the tested compounds of the Examples had PMD producing activity at concentrations lower than those required for the response of SMTP-6L. The concentration required to exert activity was identical to the concentration that enhanced plasminogen activation. Thus, among the four test compounds, SMTP-7L was the most powerful and showed an effect at a low concentration of 90 μM. The activities of SMTP-8L and SMTP-7L were also observed at 90 μM, but the magnitude of PMD production was smaller than SMTP-7L. SMTP-8D was significantly less active than the three compounds and showed activity at 120 μM.
[0057]
These results demonstrate that the example compounds have activity to promote PMD production. Compounds with higher activity to enhance plasminogen have stronger PMD production, and the SMTP concentration required for PMD production was similar to each concentration required for increased plasminogen activation. Therefore, the regulation of plasminogen conformation is probably the underlying mechanism that enhances plasminogen activation and appears to play a role in promoting PMD production by SMTP.
[0058]
Inhibition of tumor growth by SMTP-7L
When a tumor-bearing mouse was systemically treated with a high dose of angiostatin, a plasminogen fragment (40-50 mg / kg twice a day), it showed inhibition of the growth of the primary tumor. A mouse model was used to test for the ability of SMTP-7L to inhibit tumor growth in vivo. In the first experiment, Lewis lung cancer cells cultured in vitro were injected subcutaneously into C57BL / 6 mice, and SMTP-7L was intraperitoneally administered daily from the next day of transplantation. The results demonstrated that administration of SMTP-7L caused significant inhibition of transplanted tumors. Inhibition became apparent after 13 days, and a 65% and 75% reduction in tumor volume was observed after 20 days of treatment with daily doses of 5 and 50 mg / kg, respectively (FIG. 4A). The change in body weight of treated mice is shown in FIG. 4B, which showed that administration of 50 mg / kg SMTP-7L did not cause weight loss and even prevented the decrease in weight gain due to the tumor. .
[0059]
In a second set of experiments, dispersed cells of Lewis rat cancer maintained in vivo in C57BL / 6 mice were injected subcutaneously into mice on day 0 and grew to a size that allowed the transplanted tumor to be recognized. On day 7 or 8, mice were grouped so that body weight and tumor size were evenly distributed among the groups. SMTP-7L was administered intraperitoneally on the day of grouping and every 3 days thereafter. As shown in FIG. 4C, inhibition of tumor growth was observed after day 10 (3 days after treatment with SMTP-7L), which was 56% at doses of 1.5 and 20 mg / kg, respectively. And 62%. Tumor weight was also significantly reduced by SMTP-7L treatment (FIG. 4D). Since the efficacy was similar at the 1.5 mg / kg and 20 mg / kg doses, the drug was then tested at a lower dose. From the results (FIG. 4E), the efficacy of the 0.015 and 0.15 mg / kg doses was not statistically significant, but the efficacy of 1.5 mg / kg was significant from day 10 to day 16. It was shown that. However, the difference in tumor volume between the control and 1.5 mg / kg groups was not significant on day 19.
[0060]
In a third experiment, the effectiveness of a single administration of SMTP-7L performed 4 days after transplantation was tested. As shown in FIG. 4D, the decrease in tumor volume in the 1.5 mg / kg group was mild and not statistically significant compared to the control group.
[0061]
A series of animal experiments demonstrated that SMTP-7L is active in retarding tumor growth. The effect was observed with intraperitoneal administration of 1.5 mg / kg, but the dose was a dose of the protein-like drug Angiostatin used to suppress early growth tumors (40-50 mg / kg 1 Much lower than twice a day). Thus, pharmacologically promoting endogenous production of angiostatin-like plasmin (plasminogen) fragments by SMTP may be an advantageous tumor therapy. With a high supply of plasminogen activator, by utilizing host-mediated reactions with such low molecular weight compounds, PMD can be generated in situ within the tumor, thus not only being effective and selective. It is also advantageous with regard to tolerance, which is a problem with the administration of high levels of proteinaceous drugs. SMTP-7L is promising as an anti-tumor agent because it did not show toxicity when administered intraperitoneally at a daily dose of 50 mg / kg, which is 30 times higher than the effective dose.
[0062]
【The invention's effect】
The compound of the present invention has an angiogenesis inhibitory action and is useful for the treatment and prevention of angiogenesis-related diseases.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram illustrating the structures of SMTP-7D, -8D, -7L, and -8L.
The configuration of the dihydropyran moiety is relative.
FIG. 2 is a diagram showing promotion of PMD generation by SMTP-7L.
(AD) Plasminogen (100 nM) was incubated with urokinase (50 U / ml) in the absence (A and C; control) or presence (B and D) of 120 μM SMTP-7L. After incubation for the indicated times, a portion of the incubation (2 μg protein) was subjected to SDS-PAGE on a 10% gel under non-reducing (A and B) or reducing (C and D) conditions. In addition to the molecular weight marker (left), the positions of the A chain and B chain (right) of plasmin and PMD are shown. (E) Plasminogen and urokinase were incubated in the same manner as AD, VLK-pNA was added at the times indicated, and plasmin activity was measured. Each value is the mean ± SEM of triplicate measurements. D. Represents.
FIG. 3 represents a comparison of SMTP-7D, -8D, -7L, and -8L activities.
Plasminogen (100 nM) was incubated with urokinase (50 U / ml) for 30 minutes in the presence of the stated concentrations of SMTP-7D, -8D, -7L, and -8L. Part of the incubation (2 μg protein) was subjected to 10% gel SDS-PAGE under non-reducing conditions. The position of the molecular weight marker is shown.
FIG. 4 depicts inhibition of tumor growth in vivo by SMTP-7L.
(A and B) On day 0, a suspension of in vitro cultured Lewis rat lung cancer (100 μl; 1 × 10 6⁷Cells / ml) was injected subcutaneously into the back of C57BL / 6 mice. Only SSMTP-7L in physiological saline or physiological saline was intraperitoneally administered every day from the next day of transplantation, and the tumor volume and body weight were measured (each group n = 3 to 4).
(C and D) 2 × 10 2 Lewis cell lung cancer dispersed cells retained in vivo⁶Suspended in cells / ml, 200 μl of the suspension was injected subcutaneously on day 0 into the groin of C57BL / 6 mice. On day 7, mice were grouped so that body weight and tumor size were evenly distributed between groups (n = 3-4). Saline or SMTP-7L was administered intraperitoneally on the seventh day and every three days thereafter. On day 15, the tumor was excised and the weight (D) was measured.
(E) Suspension of Lewis lung cancer cells cultured in vivo (200 μl; 1.14 × 10⁶Cells / ml) were injected subcutaneously on day 0 into the groin of C57BL / 6 mice. On day 6, mice were grouped (n = 5-6) so that body weight and tumor size were evenly distributed among the groups. On the 6th day and every 3 days thereafter, physiological saline or SMTP-7L was intraperitoneally administered.
(F) A suspension of Lewis lung cancer cells cultured in vivo (200 μl; 2 × 10⁶Cells / ml) were injected subcutaneously on day 0 into the groin of C57BL / 6 mice. On day 4, mice were divided into groups (n = 4), and physiological saline or SMTP-7L was administered intraperitoneally only on day 4. The listed P values are two-sided P values for Student's t-test using normally distributed variables.
FIG. 5 is a diagram illustrating SMTP-4D, -5D, -6D, -7D, and -8D structures.
FIG. 6 is a diagram illustrating the structures of SMTP-9, −10, and −11.
FIG. 7 is a diagram illustrating the structures of SMTP-1, -2, and -3.

Claims (2)

Formula III:

[Where,
X is —CHY—C (CH ₃ ) ₂ Z;
Y and Z are each -H or -OH, or together form a single bond;
R ² is a residue represented by —CH (COOH) — (CH ₂ ) _n — (n is an integer of 0 to 9) ]
A pharmaceutical composition for preventing or treating tumor , comprising at least one compound represented by the formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt, ester or solvate thereof: X is _{-CH = C (CH 3) 2} , n is 3 or 4, The pharmaceutical composition of claim 1.

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