JP4308545B2

JP4308545B2 - Hydrogen peroxide-resistant adduct catalase agent and method for producing the same

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Publication number: JP4308545B2
Application number: JP2003037969A
Authority: JP
Inventors: 公彦佐藤; 隆司藤吉; 信正横井
Original assignee: Amano Enzyme Inc; Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Amano Enzyme Inc; Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 2003-02-17
Filing date: 2003-02-17
Publication date: 2009-08-05
Anticipated expiration: 2023-02-17
Also published as: JP2004242618A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、過酸化水素付加物の共存下でも酵素活性を維持できるカタラーゼ剤及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、産業上、酵素の果たす役割は大きくなっており、過酸化水素を水と酸素に分解する反応を触媒するカタラーゼ剤も食品用・工業用として幅広く利用されている。一般に産業上利用される酵素剤は、実用化に耐え得る安定性を有することが望まれる。粉末あるいは顆粒状のカタラーゼ剤の安定化に関しては、蔗糖、乳糖、マルトースを添加し、凍結乾燥により保存安定性の向上したカタラーゼ剤を得る方法（特許文献１参照）、蔗糖（Ａ）と乳糖、イノシトール、ソルボース、アスパラギン、トレオニンよりなる群から選択される化合物（Ｂ）との２種以上を含む酵素の安定化剤及び該安定化剤と酵素とからなる組成物を凍結乾燥する酵素の保存方法（特許文献２参照）等が提案されている。
【０００３】
ところで、粉末状あるいは顆粒状のカタラーゼ剤は、過酸化水素付加物と共存させ酸素を発生させて用いることは産業上有用であり、このような利用法として、既にカタラーゼ剤と過酸化水素付加物より構成される風呂釜洗浄剤（特許文献３参照）が提案されており、これ以外にも様々な利用法がある。
【０００４】
【特許文献１】
米国特許３１３３００１号明細書
【特許文献２】
特公平２−３１９５４号公報
【特許文献３】
特開平８−２８３７８８号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の粉末あるいは顆粒状のカタラーゼ剤の安定化方法は、大量生産に不向きな凍結乾燥によって得られたカタラーゼ剤の安定化方法に関するものであり、大量生産が必要な食品用・工業用酵素剤を製造する手段としては実用性に乏しいばかりか、酵素単独での保存安定性は確保されているものの、過酸化水素付加物の共存下での安定性については検討されていない。特に、過酸化水素付加物を共存させる場合、カタラーゼ剤は酸化等の影響を受け、保存中に活性が低下していくという問題点があった。そのため、カタラーゼ剤はその共存物である過酸化水素付加物による影響を受けても酵素活性が低下しないほどの安定性が望まれていたが、これまでにかかる問題点を解決する提案はない。
【０００６】
つまり、本発明は、過酸化水素付加物の共存下においても長期間に亘って高い活性を維持できる保存安定性に優れたカタラーゼ剤及びその製造方法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ね、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、カタラーゼ溶液の容量に対して３〜５ｖ／ｖ％のエタノールとカタラーゼ溶液の固形分重量に対して５０〜１００ｗ／ｗ％のグルタミン酸ナトリウムを安定化剤として添加したカタラーゼ溶液を固形状に処理したカタラーゼ１００重量部に、コーティング剤のトレハロース５重量部以上を被覆してなる耐過酸化水素付加物カタラーゼ剤を要旨とする。ここに、耐過酸化水素付加物カタラーゼ剤とは、過酸化水素付加物を共存させても保存中のカタラーゼの活性が低下し難い安定なカタラーゼ剤をいい、過酸化水素付加物は水溶液中で過酸化水素を遊離する物質をいう。また、安定化剤とは、少なくとも過酸化水素付加物の非共存下でカタラーゼの保存安定化に効果のある物質をいう。この発明において、トレハロース量を５重量部〜５０重量部としてもよい。
【０００８】
また、本発明は、カタラーゼ溶液の容量に対して３〜５ｖ／ｖ％のエタノールとカタラーゼ溶液の固形分重量に対して５０〜１００ｗ／ｗ％のグルタミン酸ナトリウムを安定化剤として前記カタラーゼ溶液に添加し、該カタラーゼ溶液を固形状に処理した後、該固形状カタラーゼ１００重量部に、コーティング剤のトレハロース５重量部以上を噴霧・乾燥せしめて被覆する耐過酸化水素付加物カタラーゼ剤の製造方法を要旨とする。この発明において、トレハロース量を５重量部〜５０重量部としてもよい。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明に用いるカタラーゼは、その起源を問わず用いることができ、また、市販されているカタラーゼを広く用いることもできる。
【００１４】
コーティング剤で被覆されるカタラーゼは、カタラーゼが顆粒状、小塊状等固形状に処理されたものであれば良く、均一性と操作性の良いことから顆粒状に処理することが好ましい。また、カタラーゼは安定化剤が添加され固形状に処理されたものでも良い。カタラーゼを顆粒状に処理する方法は、カタラーゼ溶液を流動造粒機、ハイスピードミキサー、スプレードライヤー、押し出し造粒機等を用いて行うことができ、カタラーゼ溶液を核剤に噴霧したり、カタラーゼ溶液を乾燥して得られた粉末を核剤に結合させたり、さらにはカタラーゼ溶液から直接カタラーゼの顆粒品を得ることもできる。核剤は、カタラーゼの活性発現を阻害しない物質であればどんなものでも良く、好ましくは一般的に使用される澱粉、デキストリン、ショ糖、塩等が用いられる。また、カタラーゼの顆粒化の工程は、カタラーゼの凍結乾燥という操作を経ることなくでき、耐過酸化水素付加物カタラーゼ剤は量産化に適する。
【００１５】
安定化剤は、少なくとも過酸化水素付加物の非共存下でカタラーゼを保存安定化させるものであれば特に限定されないが、エタノールあるいはエタノールとグルタミン酸ナトリウムからなるものが好ましい。カタラーゼに安定化剤を添加するのみでは過酸化水素付加物の共存下で十分な保存安定性を維持できないが、安定化剤を添加したカタラーゼをコーティング剤で被覆することにより、過酸化水素付加物の共存下でのカタラーゼの保存安定化効果を高めることができる。カタラーゼに添加されるエタノールの割合は、脱塩処理等が施され顆粒状に処理される前のカタラーゼ溶液の容量に対して3v/v%以上が好ましく、5v/v%以上がより好ましい。また、エタノールと共に添加されるグルタミン酸ナトリウムの割合は、脱塩処理等が施され顆粒状に処理される前のカタラーゼ溶液の固形分重量に対して50w/w%以上が好ましい。カタラーゼ溶液の固形分重量は、カタラーゼ溶液の糖度を測定し、測定された数値（Brix値（%））と全液量の積で求められる（溶液の固形分量＝Brix値×0.01×全液量）。なお、カタラーゼには安定化剤の他、カタラーゼ活性発現を阻害しない物質を適宜添加しても良い。
【００１６】
また、耐過酸化水素付加物カタラーゼ剤は、用時までは水分を回避させることが不可欠である。なぜならば、水分（水）が存在した場合、カタラーゼは水分を介し過酸化水素付加物を分解させてしまうこと、さらには分解によって生じた酸素および水がカタラーゼ剤の保存安定性に悪影響を与えるからである。よって、過酸化水素付加物による酸化を防ぐ他、カタラーゼと過酸化水素付加物が水を介した反応を防ぐために、被覆されるコーティング剤は、被膜性があり吸湿性が低く、作業性つまり乾燥性の良いものが好ましい。特に、吸湿性の低いものとしては、被膜性もあり乾燥性も良いトレハロース、乳糖、マルトース等の等類が好ましい。また、これらの中でも、40℃、湿度75％にて10日間保存条件下でも吸湿率が10％以下であるトレハロースがより好ましい。糖類以外では被膜性のあるポリエチレングリコール、パラフィン等が好ましい。また、これらのコーティング剤を併用しても良い。コーティング剤による被覆は、固形状に処理されたカタラーゼにコーティング剤を噴霧・乾燥するという簡単な操作で行うことができる。被覆されるコーティング剤の割合は、安定化剤を添加しない場合、顆粒状カタラーゼ100重量部に対して、25重量部以上が好ましく、30重量部以上がより好ましい。また、安定化剤を添加する場合、顆粒状カタラーゼ100重量部に対して5重量部以上が好ましい。コーティング剤の上限は、安定化剤の添加の有無を問わず、費用対効果を考量して50重量部が好ましい。
【００１７】
カタラーゼと共存させる過酸化水素付加物は、過炭酸ナトリウム等の過炭酸塩、過硼酸ナトリウム等の過硼酸塩等、水溶液中で過酸化水素を遊離し得る物質であれば特に限定されない。耐過酸化水素付加物カタラーゼ剤は、過酸化水素付加物と共存させて製品化され、用時に水を加えて酸素を発生させる。
【００１８】
【実施例】
次いで、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１９】
〔被覆カタラーゼ剤の製造１〕
被覆カタラーゼ剤を製造するため、予めコーティング剤のトレハロースが被覆される顆粒状カタラーゼを以下のように調製した。
【００２０】
6,000mLのカタラーゼ溶液（アスクスーパー：三菱瓦斯化学株式会社製）を限外濾過モジュール（マイクローザUFラボモジュール ACP-1010：旭化成工業株式会社製）を用いて6倍濃縮した後、濃縮液に等量の水を加えて濃縮液を脱塩する操作を３回繰り返した。得られた溶液1,000ｍLを流動造粒機フローコーターFLO-5(フロイント産業株式会社製)にて流動させた核剤のノンパレル101（フロイント産業株式会社製、グラニュー糖の周りを澱粉で固めた顆粒）4,000gへ噴霧し、乾燥させて顆粒状カタラーゼを得た。
【００２１】
実施例１
上記で得られた顆粒状カタラーゼ4,000gにトレハロース（株式会社林原製）1,200gを噴霧・乾燥し被覆カタラーゼ剤を製造した。
【００２２】
実施例２
上記で得られた顆粒状カタラーゼ4,000gにトレハロース（株式会社林原製）1,600gを噴霧・乾燥し被覆カタラーゼ剤を製造した。
【００２３】
実施例３
上記で得られた顆粒状カタラーゼ4,000gにトレハロース（株式会社林原製）2,000gを噴霧・乾燥し被覆カタラーゼ剤を製造した。
【００２４】
参考例１
上記で得られた顆粒状カタラーゼ4,000gにトレハロース（株式会社林原製）600gを噴霧・乾燥し被覆カタラーゼ剤を製造した。
【００２５】
参考例２
上記で得られた顆粒状カタラーゼ4,000gにトレハロース（株式会社林原製）800gを噴霧・乾燥し被覆カタラーゼ剤を製造した。
【００２６】
〔被覆カタラーゼ剤の安定性評価試験１〕
１．酵素活性の測定
カタラーゼ活性は、以下のようにして求めた。なお、カタラーゼ活性１単位は、下記の反応条件下、１分間に１μmolの過酸化水素を分解する力と定義した。
１）酵素反応
過酸化水素液（pH7.0、31%過酸化水素（三菱瓦斯化学株式会社製）0.240mLを0.05mol/Lリン酸塩緩衝液（pH7.0）に溶解して200mLとした液）5mLを平底試験管（30×120mm）にとり、30±0.5℃の恒温水槽に入れ、正確に20分間放置した。これに試料溶液1mLを加え、よく振り混ぜ、直ちに前記の恒温水槽に入れ、正確に5分間放置した。
２）滴定
上記のようにして正確に５分間放置した後に0.5mol/L硫酸試液2mLを加え、よく振り混ぜた後、10g/dLヨウ化カリウム試液1mL、モリブデン酸アンモニウム試液1滴及び指示薬としてデンプン試液5滴を加えた。この液をスターラーで撹拌しつつ0.005mol/Lチオ硫酸ナトリウム液（定量用）で滴定し、その滴定値をT_５とした。滴定の終点は、液の青色が消失した後、引き続き30秒間無色が持続する時とした。別にブランクとして試料溶液の代わりに水1mLを用いて同様に操作して得られた滴定値をT_０とした。
３）酵素活性の算出
5分間に分解した過酸化水素の量A（μmol）を（１）式にて算出し、表１の対応表よりカタラーゼ力B（u）を求め、読み取ったBに試料希釈倍数を乗じ、カタラーゼ活性（u/g）を求めた。
（１）式 A＝（T₀-T_５）×（24.40/T_０）×2.5×f
A：5分間に分解した過酸化水素の量（μmol）
T_０：ブランク滴定値（mL）
T_５：検体滴定値（mL）
24.40：適正ブランク滴定値
2.5：単位換算係数（1mLの0.005mol/Lチオ硫酸ナトリウム溶液＝ 1mLの2.5μmol/Lの過酸化水素）
f：0.005mol/Lチオ硫酸ナトリウム液（定量用）のファクター
（２）カタラーゼ力（μ/g）＝B×n
B：試料溶液1mLが5分間に分解した過酸化水素の量A（μmol）に対応するカタラーゼ力（u）
n：試料1g当たりの希釈倍数
【００２７】
【表１】

【００２８】
過酸化水素付加物を共存させた場合の被覆カタラーゼ剤の安定性評価試験を以下のように行った。過酸化水素付加物として過炭酸ナトリウム12gに対し、カタラーゼ活性1200単位の酵素剤を添加し、良く混合させた後37℃で保存し、所定期間経過ごとにサンプリングを行い残存活性率を測定した。以下に詳細な試験方法を示した。
【００２９】
２．安定性評価試験
１）各酵素剤の保存条件
過炭酸ナトリウム(SPC-G、三菱瓦斯化学株式会社製)12.00gを30mL容ポリエチレン容器に取り、これに酵素剤サンプルを、添加量が1200 u/SPC-G 12.00gになるように添加し、よく振り混ぜ37℃で保存した。但し、保存開始時点の0週目については、下記の過酸化水素分解性試験を行う直前に酵素剤を過炭酸ナトリウムに添加しサンプルとした。
２）過酸化水素分解試験
300mL容の三角フラスコに精製水200mLを加え30℃で20分間予熱したものに、マグネティックスターラーで撹拌しつつ保存検体（過炭酸ナトリウム＋酵素剤）全量を加え、30℃で放置した。10分後にこの溶液から2mL分取し、その中に含まれている過酸化水素量を測定した。対照として酵素無添加のもの（過炭酸ナトリウムのみ）について同様の操作を行った。各検体の分解率は対照の10分後の過酸化水素量を100とした場合に対する比率から求めた。
３）滴定
100mL容三角フラスコに精製水48mL、10%(v/v)硫酸20mLを入れ、２）でサンプリングした試料2mLを加え、0.01mol/L過マンガン酸カリウムで着色点まで滴定した。
４）活性残存率
保存前検体（過炭酸ナトリウム＋酵素剤、0週保存）の反応10分後の分解率を100とした場合に対する各保存検体の反応10分後の分解率の相対値として求めた。
【００３０】
３．安定性評価試験の結果
実施例１〜実施例３、参考例１、参考例２について上記の安定性評価試験を行い被覆カタラーゼ剤の保存安定性を評価した。結果は表２に示した。また、コーティング剤のトレハロースを被覆しないカタラーゼとして上記で調製した顆粒状カタラーゼについても同様に保存安定性を評価し、比較例１とした。なお、表２中のトレハロース量の括弧内は顆粒状カタラーゼ１００重量部に対する重量部を示した。
【００３１】
【表２】

【００３２】
表２より、顆粒状カタラーゼをトレハロースで被覆しないと、保存１週目で既に残存活性が著しく低下するが（比較例１参照）、トレハロースで被覆すると、過酸化水素付加物の共存下でも酵素の保存安定性が持続的に維持されることが明らかとなった。酵素の保存安定性は、トレハロースの被覆量に比例して高まり、顆粒状カタラーゼ１００重量部に対して３０重量部以上で高い酵素の保存安定性が維持された。以上より、実施例１〜実施例３の被覆カタラーゼ剤は、耐過酸化水素付加物カタラーゼ剤として有用である。
【００３３】
〔カタラーゼの安定化剤の検討〕
上記の〔被覆カタラーゼの安定性評価試験１〕では、カタラーゼのみからなる顆粒状カタラーゼをコーティング剤で被覆し、過酸化水素付加物の共存下での被覆効果を評価した。以下では、少なくとも過酸化水素付加物が共存しない条件下で効果のある安定化剤をカタラーゼに添加して調製する顆粒状カタラーゼを、コーティング剤で被覆し、過酸化水素付加物の共存下での被覆効果を評価することとした。安定化剤は、保存安定化効果の期待できそうな化合物を添加した顆粒状カタラーゼを以下のように予め調製し、各々について過酸化水素付加物の共存しない条件下での保存安定性効果を評価した。
【００３４】
調製例１
上記のカタラーゼのみからなる顆粒状カタラーゼを調製例１とした。
【００３５】
調製例２
6,000mLのカタラーゼ溶液（アスクスーパー：三菱瓦斯化学株式会社製）を限外濾過モジュール（マイクローザUFラボモジュール ACP-1010：旭化成工業株式会社製）を用いて6倍濃縮した後、濃縮液に等量の水を加えて濃縮液を脱塩する操作を３回繰り返した。得られた溶液1,000mLについて、その液の固形分の重量に対して50w/w%に当たる量のグルタミン酸ナトリウムを添加した溶液を調製後、その溶液全量を流動造粒機フローコーターFLO-5(フロイント産業株式会社製)にて流動させた核剤のノンパレル101（フロイント産業株式会社製）4,000gへ噴霧し、乾燥させて顆粒状カタラーゼを得た。なお、カタラーゼ溶液の固形分は、デジタル糖度計（株式会社アタゴ製）を用い、その液の糖度を測定し、測定された数値（Brix値（%））と全液量の積で求めた（溶液の固形分量＝Brix値×0.01×全液量）。以下の調製例においても同様である。
【００３６】
調製例３
6,000mLのカタラーゼ溶液（アスクスーパー：三菱瓦斯化学株式会社製）を限外濾過モジュール（マイクローザUFラボモジュール ACP-1010：旭化成工業株式会社製）を用いて6倍濃縮した後、濃縮液に等量の水を加えて濃縮液を脱塩する操作を３回繰り返した。得られた溶液1,000mLについて、その液の固形分の重量に対して100w/w%に当たる量のグルタミン酸ナトリウムを添加した溶液を調製後、その溶液全量を流動造粒機フローコーターFLO-5(フロイント産業株式会社製)にて流動させた核剤のノンパレル101（フロイント産業株式会社製）4,000gへ噴霧し、乾燥させて顆粒状カタラーゼを得た。
【００３７】
調製例４
6,000mLのカタラーゼ溶液（アスクスーパー：三菱瓦斯化学株式会社製）を限外濾過モジュール（マイクローザUFラボモジュール ACP-1010：旭化成工業株式会社製）を用いて6倍濃縮した後、濃縮液に等量の水を加えて濃縮液を脱塩する操作を３回繰り返した。得られた溶液1,000mLに対してエタノールを1.0v/v%量添加した溶液を調製後、その溶液全量を流動造粒機フローコーターFLO-5(フロイント産業株式会社製)にて流動させた核剤のノンパレル101（フロイント産業株式会社製）4,000gへ噴霧し、乾燥させて顆粒状カタラーゼを得た。
【００３８】
調製例５
6,000mLのカタラーゼ溶液（アスクスーパー：三菱瓦斯化学株式会社製）を限外濾過モジュール（マイクローザUFラボモジュール ACP-1010：旭化成工業株式会社製）を用いて6倍濃縮した後、濃縮液に等量の水を加えて濃縮液を脱塩する操作を３回繰り返した。得られた溶液1,000mLに対してエタノールを3.0v/v%量添加した溶液を調製後、その溶液全量を流動造粒機フローコーターFLO-5(フロイント産業株式会社製)にて流動させた核剤のノンパレル101（フロイント産業株式会社製）4,000gへ噴霧し、乾燥させて顆粒状カタラーゼを得た。
【００３９】
調製例６
6,000mLのカタラーゼ溶液（アスクスーパー：三菱瓦斯化学株式会社製）を限外濾過モジュール（マイクローザUFラボモジュール ACP-1010：旭化成工業株式会社製）を用いて6倍濃縮した後、濃縮液に等量の水を加えて濃縮液を脱塩する操作を３回繰り返した。得られた溶液1,000mLに対してエタノールを5.0v/v%量添加した溶液を調製後、その溶液全量を流動造粒機フローコーターFLO-5(フロイント産業株式会社製)にて流動させた核剤のノンパレル101（フロイント産業株式会社製）4,000gへ噴霧し、乾燥させて顆粒状カタラーゼを得た。
【００４０】
調製例７
6,000mLのカタラーゼ溶液（アスクスーパー：三菱瓦斯化学株式会社製）を限外濾過モジュール（マイクローザUFラボモジュール ACP-1010：旭化成工業株式会社製）を用いて6倍濃縮した後、濃縮液に等量の水を加えて濃縮液を脱塩する操作を３回繰り返した。得られた溶液1,000mLについて、その液の固形分の重量に対して50w/w%に当たる量のグルタミン酸ナトリウムを添加し、さらにエタノールを3.0v/v%量添加した溶液を調製後、その溶液全量を流動造粒機フローコーターFLO-5(フロイント産業株式会社製)にて流動させた核剤のノンパレル101（フロイント産業株式会社製）4,000gへ噴霧し、乾燥させて顆粒状カタラーゼを得た。
【００４１】
調製例８
6,000mLのカタラーゼ溶液（アスクスーパー：三菱瓦斯化学株式会社製）を限外濾過モジュール（マイクローザUFラボモジュール ACP-1010：旭化成工業株式会社製）を用いて6倍濃縮した後、濃縮液に等量の水を加えて濃縮液を脱塩する操作を３回繰り返した。得られた溶液1,000mLについて、その液の固形分の重量に対して100w/w%に当たる量のグルタミン酸ナトリウムを添加し、さらにエタノールを3.0v/v%量添加した溶液を調製後、その溶液全量を流動造粒機フローコーターFLO-5(フロイント産業株式会社製)にて流動させた核剤のノンパレル101（フロイント産業株式会社製）4,000gへ噴霧し、乾燥させて顆粒状カタラーゼを得た。
【００４２】
調製例９
6,000mLのカタラーゼ溶液（アスクスーパー：三菱瓦斯化学株式会社製）を限外濾過モジュール（マイクローザUFラボモジュール ACP-1010：旭化成工業株式会社製）を用いて6倍濃縮した後、濃縮液に等量の水を加えて濃縮液を脱塩する操作を３回繰り返した。得られた溶液1,000mLについて、その液の固形分の重量に対して50w/w%に当たる量のグルタミン酸ナトリウムを添加し、さらにエタノールを5.0v/v%量添加した溶液を調製後、その溶液全量を流動造粒機フローコーターFLO-5(フロイント産業株式会社製)にて流動させた核剤のノンパレル101（フロイント産業株式会社製）4,000gへ噴霧し、乾燥させて顆粒状カタラーゼを得た。
【００４３】
調製例１０
6,000mLのカタラーゼ溶液（アスクスーパー：三菱瓦斯化学株式会社製）を限外濾過モジュール（マイクローザUFラボモジュール ACP-1010：旭化成工業株式会社製）を用いて6倍濃縮した後、濃縮液に等量の水を加えて濃縮液を脱塩する操作を３回繰り返した。得られた溶液1,000mLについて、その液の固形分の重量に対して100w/w%に当たる量のグルタミン酸ナトリウムを添加し、さらにエタノールを5.0v/v%量添加した溶液を調製後、その溶液全量を流動造粒機フローコーターFLO-5(フロイント産業株式会社製)にて流動させた核剤のノンパレル101（フロイント産業株式会社製）4,000gへ噴霧し、乾燥させて顆粒状カタラーゼを得た。
【００４４】
〔カタラーゼの保存安定化効果の評価〕
上記で得られた調製例１〜調製例１０の顆粒状カタラーゼについて過酸化水素付加物の非共存下での保存安定化効果について評価を行った。すなわち、上記で得られた各調製例のカタラーゼを10gずつガラス製のサンプル瓶へ入れ、70℃にて8時間保存し、保存前の各カタラーゼ活性値を100%として保存後の残存活性率を求めた。結果は、表３に示した。なお、表３中、グルタミン酸ナトリウムは、カタラーゼ溶液の固形分重量に対するw/w%、エタノールはカタラーゼ溶液に対するv/v%を示し、以下の実施例、比較例についても同様である。
【００４５】
【表３】

【００４６】
表３から明らかなように、調製例２〜４は、何も添加されない調製例１よりは残存活性が高いものの５０％以下と大きく低下したが、調製例５〜１０は残存活性が良く維持されていた。また、カタラーゼにグルタミン酸ナトリウムを単独で添加しても、保存安定化効果は十分ではなかったが（調製例２、３参照）、3v/v%エタノールとの併用で十分な保存安定化効果が得られた（調製例５と調製例７、８参照）。エタノールを単独で添加する場合、エタノールの添加量に依存して残存活性が高くなり、5v/v%で十分な保存安定化効果が得られた。
【００４７】
〔被覆カタラーゼ剤の製造２〕
上記で効果のあった安定化剤を添加した顆粒状カタラーゼをコーティング剤のトレハロースで被覆した被覆カタラーゼ剤を製造した。
【００４８】
実施例４
調製例７の顆粒状のカタラーゼ4,000gにトレハロース（株式会社林原製）200gを噴霧・乾燥し被覆カタラーゼ剤を得た。
【００４９】
実施例５
調製例７の顆粒状のカタラーゼ4,000gにトレハロース（株式会社林原製）400gを噴霧・乾燥し被覆カタラーゼ剤を得た。
【００５０】
実施例６
調製例７の顆粒状のカタラーゼ4,000gにトレハロース（株式会社林原製）800gを噴霧・乾燥し被覆カタラーゼ剤を得た。
【００５１】
比較例２
調製例６で得られた顆粒状カタラーゼである。
【００５２】
比較例３
調製例７で得られた顆粒状カタラーゼである。
【００５３】
比較例４
6,000mLのカタラーゼ溶液（アスクスーパー：三菱瓦斯化学株式会社製）を限外濾過モジュール（マイクローザUFラボモジュール ACP-1010：旭化成工業株式会社製）を用いて6倍濃縮した後、濃縮液に等量の水を加えて濃縮液を脱塩する操作を３回繰り返した。得られた溶液1,000 mLについて、その液の固形分の重量に対して50w/w%に当たる量のグルタミン酸ナトリウムを添加し、さらにエタノールを3.0v/v%量、トレハロース（株式会社林原製）を800g（20w/w%）添加した溶液を調製後、その溶液全量を流動造粒機フローコーターFLO-5(フロイント産業株式会社製)にて流動させた核剤のノンパレル101（フロイント産業株式会社製）4,000gへ噴霧し、乾燥させて比較例４の顆粒状カタラーゼを得た。
【００５４】
〔被覆カタラーゼ剤の安定性評価試験２〕
既述の〔被覆カタラーゼ剤の安定性評価試験１〕と同様に実施例４〜実施例６について過酸化水素付加物の共存下での被覆カタラーゼ剤の保存安定性を評価した。また、比較例２〜比較例４についても同様に評価した。結果は表４に示した。なお、表４には、比較のため表２の参考例１及び参考例２も記載した。また、表４中の被覆トレハロース量における括弧内は顆粒状カタラーゼ１００重量部に対する重量部を示した。
【００５５】
【表４】

【００５６】
比較例２〜比較例４はカタラーゼの残存活性が経時的に著しく低下し、過酸化水素付加物の非共存下で保存安定性に優れる安定化剤であっても、過酸化水素付加物の共存下では実施例のようにコーティング剤の被覆なしにはカタラーゼ活性を維持できないことが表４より明らかとなった。また、比較例４から、トレハロースをコーティング剤として用いないで添加するだけでは、過酸化水素付加物の共存下で保存安定化効果がないことも明らかとなった。実施例４〜実施例６と参考例１、参考例２を比較すると（特に、実施例６と参考例２）、安定化剤を添加した顆粒状カタラーゼをコーティング剤で被覆することで安定化剤を添加しないで被覆する場合より過酸化水素付加物の共存下での保存安定化効果が高められることが明らかとなり、安定化剤を添加すればコーティング剤の被覆量を抑制しても高い保存安定性のある被覆カタラーゼが得られることが明らかとなった。以上より、実施例４は活性が低いものの比較例より保存安定性が顕著に高く、実施例４〜実施例６の被覆カタラーゼ剤は耐過酸化水素付加物カタラーゼ剤として有用である。
【００５７】
【発明の効果】
本発明は、上記のように構成されるため、以下の効果を奏する。
本発明の耐過酸化水素付加物カタラーゼ剤によれば、カタラーゼを過炭酸ナトリウムや過硼酸ナトリウム等の過酸化水素付加物と共存させて保存してもカタラーゼ活性を安定して維持できるので、カタラーゼと過酸化水素付加物を別体とすることなく併存させて製品化できる。そして、用時に水を加えるだけで簡単に酸素を発生させることができるので、様々な利用性があり有用である。
また、本発明の耐過酸化水素付加物カタラーゼ剤の製造方法によれば、耐過酸化水素付加物カタラーゼ剤を凍結乾燥の操作を経ることなく簡便に製造できるので、量産化して耐過酸化水素付加物カタラーゼ剤のコスト低減化に資することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a catalase agent capable of maintaining enzyme activity even in the presence of a hydrogen peroxide adduct and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
In recent years, the role played by enzymes has increased in industry, and catalase agents that catalyze the reaction of decomposing hydrogen peroxide into water and oxygen are widely used for food and industrial purposes. In general, an enzyme agent used industrially is desired to have stability enough to withstand practical use. Regarding stabilization of a powdered or granular catalase agent, a method of adding sucrose, lactose, maltose and obtaining a catalase agent having improved storage stability by freeze-drying (see Patent Document 1), sucrose (A) and lactose, Stabilizer for enzyme comprising two or more compounds (B) selected from the group consisting of inositol, sorbose, asparagine and threonine, and a method for storing the enzyme by freeze-drying a composition comprising the stabilizer and the enzyme (See Patent Document 2) and the like have been proposed.
[0003]
By the way, it is industrially useful to use a catalase agent in the form of a powder or granules in the presence of a hydrogen peroxide adduct to generate oxygen. As such a method of use, a catalase agent and a hydrogen peroxide adduct have already been used. A bath tub cleaning agent (see Patent Document 3) is proposed, and there are various other uses.
[0004]
[Patent Document 1]
US Pat. No. 3,133,001
[Patent Document 2]
Japanese Patent Publication No. 2-31954
[Patent Document 3]
JP-A-8-283788
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
However, the above-described method for stabilizing a powdered or granular catalase agent relates to a method for stabilizing a catalase agent obtained by lyophilization unsuitable for mass production, and is a food / industrial enzyme that requires mass production. As a means for producing the agent, it is not practical, and the stability in the presence of the hydrogen peroxide adduct has not been studied, although the storage stability of the enzyme alone is ensured. In particular, when a hydrogen peroxide adduct is present, the catalase agent is affected by oxidation and the like, and there is a problem that the activity decreases during storage. For this reason, the catalase agent has been desired to have such a stability that the enzyme activity does not decrease even when it is affected by the hydrogen peroxide adduct, which is a coexisting product. However, there is no proposal to solve the problems so far.
[0006]
That is, an object of the present invention is to provide a catalase agent excellent in storage stability that can maintain high activity over a long period of time even in the presence of a hydrogen peroxide adduct and a method for producing the same.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
  In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have made extensive studies and have completed the present invention.
  That is, the present invention provides a catalase solution in which 3 to 5 v / v% ethanol with respect to the volume of the catalase solution and 50 to 100 w / w% sodium glutamate with respect to the solid content weight of the catalase solution are added as stabilizers. The gist is a hydrogen peroxide-resistant adduct catalase agent obtained by coating 100 parts by weight of a solid-treated catalase with at least 5 parts by weight of trehalose as a coating agent. Here, the hydrogen peroxide-resistant adduct catalase agent refers to a stable catalase agent in which the activity of catalase during storage is difficult to decrease even in the presence of a hydrogen peroxide adduct. A substance that liberates hydrogen peroxide. The stabilizer refers to a substance that is effective for the preservation and stabilization of catalase in the absence of hydrogen peroxide adduct. In this invention, the amount of trehalose may be 5 to 50 parts by weight.
[0008]
  In addition, the present invention adds 3 to 5 v / v% ethanol with respect to the volume of the catalase solution and 50 to 100 w / w% sodium glutamate with respect to the solid content weight of the catalase solution as a stabilizer to the catalase solution. Then, after the catalase solution is treated in a solid state, a hydrogen peroxide-resistant adduct catalase agent is produced by spraying and drying 5 parts by weight or more of the coating agent trehalose on 100 parts by weight of the solid catalase. The gist. In this invention, the amount of trehalose may be 5 to 50 parts by weight.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The catalase used in the present invention can be used regardless of its origin, and commercially available catalase can also be widely used.
[0014]
The catalase to be coated with the coating agent is not particularly limited as long as the catalase is processed into a solid form such as a granular form or a small lump form, and is preferably processed into a granular form from the viewpoint of good uniformity and operability. Catalase may be processed into a solid form with a stabilizer added. Catalase can be processed in the form of granules by catalase solution using a fluid granulator, high-speed mixer, spray dryer, extrusion granulator, etc. The powder obtained by drying can be bound to a nucleating agent, or a granule of catalase can be obtained directly from a catalase solution. The nucleating agent may be any substance as long as it does not inhibit the activity expression of catalase, and generally used starch, dextrin, sucrose, salt and the like are used. Further, the catalase granulation step can be performed without the operation of lyophilization of catalase, and the hydrogen peroxide-resistant adduct catalase agent is suitable for mass production.
[0015]
The stabilizer is not particularly limited as long as it can preserve and stabilize catalase in the absence of hydrogen peroxide adduct, but ethanol or ethanol and sodium glutamate are preferable. Although it is not possible to maintain sufficient storage stability in the presence of a hydrogen peroxide adduct only by adding a stabilizer to catalase, by covering the catalase with a stabilizer added with a coating agent, the hydrogen peroxide adduct Can enhance the storage stability of catalase in the presence of. The proportion of ethanol added to catalase is preferably 3 v / v% or more, more preferably 5 v / v% or more with respect to the volume of the catalase solution before being subjected to desalination treatment or the like and processed into granules. Further, the ratio of sodium glutamate added together with ethanol is preferably 50 w / w% or more with respect to the solid content weight of the catalase solution before it is desalted and processed into granules. The solid content weight of the catalase solution is determined by measuring the sugar content of the catalase solution and calculating the product of the measured value (Brix value (%)) and the total liquid volume (solid content of the solution = Brix value × 0.01 × total liquid volume). ). In addition to a stabilizer, a substance that does not inhibit the expression of catalase activity may be added as appropriate to catalase.
[0016]
In addition, it is indispensable for the hydrogen peroxide-resistant adduct catalase agent to avoid moisture until use. This is because if water (water) is present, catalase will decompose the hydrogen peroxide adduct through the water, and oxygen and water produced by the decomposition will adversely affect the storage stability of the catalase agent. It is. Therefore, in order to prevent oxidation by hydrogen peroxide adducts and to prevent catalase and hydrogen peroxide adducts from reacting via water, the coating agent to be coated has a film property and low hygroscopicity, so that workability, that is, drying Good quality is preferable. In particular, those having low hygroscopicity such as trehalose, lactose, maltose and the like that are both coatable and dry are preferred. Among these, trehalose having a moisture absorption rate of 10% or less even under storage conditions at 40 ° C. and 75% humidity for 10 days is more preferable. Other than saccharides, polyethylene glycol, paraffin and the like having coating properties are preferable. These coating agents may be used in combination. Coating with the coating agent can be performed by a simple operation of spraying and drying the coating agent on the catalase treated in a solid state. When the stabilizer is not added, the ratio of the coating agent to be coated is preferably 25 parts by weight or more, more preferably 30 parts by weight or more with respect to 100 parts by weight of granular catalase. When a stabilizer is added, the amount is preferably 5 parts by weight or more with respect to 100 parts by weight of granular catalase. The upper limit of the coating agent is preferably 50 parts by weight in consideration of cost-effectiveness regardless of the presence or absence of a stabilizer.
[0017]
The hydrogen peroxide adduct that coexists with catalase is not particularly limited as long as it is a substance that can liberate hydrogen peroxide in an aqueous solution, such as a percarbonate such as sodium percarbonate or a perborate such as sodium perborate. The hydrogen peroxide-resistant adduct catalase agent is produced in the presence of a hydrogen peroxide adduct, and water is added during use to generate oxygen.
[0018]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated, this invention is not limited to a following example.
[0019]
[Manufacture of coated catalase 1]
In order to produce a coated catalase agent, a granular catalase coated with trehalose as a coating agent in advance was prepared as follows.
[0020]
6,000 mL of catalase solution (Ask Super: manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) was concentrated 6 times using an ultrafiltration module (Microza UF Lab Module ACP-1010: manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.), and then concentrated into a concentrated solution. The operation of adding an amount of water and desalting the concentrated solution was repeated three times. Nonparel 101 of the nucleating agent (Freund Sangyo Co., Ltd., granulated sugar solidified with starch) obtained by flowing 1,000 mL of the resulting solution using a fluid granulator flow coater FLO-5 (Freund Sangyo Co., Ltd.) ) Sprayed to 4,000 g and dried to obtain granular catalase.
[0021]
Example 1
To 4,000 g of the granular catalase obtained above, 1,200 g of trehalose (manufactured by Hayashibara Co., Ltd.) was sprayed and dried to produce a coated catalase agent.
[0022]
Example 2
To 4,000 g of the granular catalase obtained above, 1,600 g of trehalose (produced by Hayashibara Co., Ltd.) was sprayed and dried to produce a coated catalase agent.
[0023]
Example 3
To 4,000 g of the granular catalase obtained above, 2,000 g of trehalose (manufactured by Hayashibara Co., Ltd.) was sprayed and dried to produce a coated catalase agent.
[0024]
Reference example 1
To 4,000 g of the granular catalase obtained above, 600 g of trehalose (produced by Hayashibara Co., Ltd.) was sprayed and dried to produce a coated catalase agent.
[0025]
Reference example 2
To 4,000 g of the granular catalase obtained above, 800 g of trehalose (produced by Hayashibara Co., Ltd.) was sprayed and dried to produce a coated catalase agent.
[0026]
[Stability evaluation test 1 of coated catalase agent]
1. Measurement of enzyme activity
Catalase activity was determined as follows. One unit of catalase activity was defined as the ability to decompose 1 μmol of hydrogen peroxide per minute under the following reaction conditions.
1) Enzymatic reaction
5 mL of hydrogen peroxide solution (pH 7.0, 31% hydrogen peroxide (Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) 0.240 mL dissolved in 0.05 mol / L phosphate buffer solution (pH 7.0) to 200 mL) The sample was taken in a flat bottom test tube (30 x 120 mm), placed in a constant temperature water bath at 30 ± 0.5 ° C, and allowed to stand exactly for 20 minutes. To this was added 1 mL of the sample solution, shaken well, immediately placed in the above-mentioned constant temperature water bath, and allowed to stand for exactly 5 minutes.
2) Titration
After exactly 5 minutes as described above, add 2 mL of 0.5 mol / L sulfuric acid test solution, shake well, and then add 1 mL of 10 g / dL potassium iodide test solution, 1 drop of ammonium molybdate test solution and 5 drops of starch test solution as an indicator. Was added. While stirring this solution with a stirrer, titrate with 0.005 mol / L sodium thiosulfate solution (for quantitative determination).₅It was. The end point of the titration was when the colorless color continued for 30 seconds after the blue color of the liquid disappeared. Separately, the titration value obtained by the same operation using 1 mL of water instead of the sample solution as a blank₀It was.
3) Calculation of enzyme activity
The amount A (μmol) of hydrogen peroxide decomposed in 5 minutes is calculated by equation (1), the catalase force B (u) is obtained from the correspondence table in Table 1, and the read B is multiplied by the sample dilution multiple. Activity (u / g) was determined.
(1) Formula A = (T₀-T₅) X (24.40 / T₀) × 2.5 × f
A: Amount of hydrogen peroxide decomposed in 5 minutes (μmol)
T₀: Blank titration value (mL)
T₅: Specimen titration value (mL)
24.40: Appropriate blank titration value
2.5: Unit conversion factor (1 mL of 0.005 mol / L sodium thiosulfate solution = 1 mL of 2.5 μmol / L hydrogen peroxide)
f: Factor of 0.005mol / L sodium thiosulfate solution (for quantitative determination)
(2) Catalase force (μ / g) = B × n
B: Catalase force (u) corresponding to the amount of hydrogen peroxide A (μmol) decomposed in 1 mL of the sample solution in 5 minutes
n: Dilution factor per gram of sample
[0027]
[Table 1]

[0028]
The stability evaluation test of the coated catalase agent in the presence of a hydrogen peroxide adduct was performed as follows. An enzyme agent having a catalase activity of 1200 units was added to 12 g of sodium percarbonate as a hydrogen peroxide adduct, mixed well, stored at 37 ° C., and sampled at predetermined intervals to measure the residual activity rate. Detailed test methods are shown below.
[0029]
2. Stability evaluation test
1) Storage conditions for each enzyme agent
Take 12.00 g of sodium percarbonate (SPC-G, manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) in a 30 mL polyethylene container, add an enzyme sample to this so that the addition amount is 1200 u / SPC-G 12.00 g, Shake well and store at 37 ° C. However, for week 0 at the start of storage, an enzyme agent was added to sodium percarbonate immediately before the following hydrogen peroxide decomposability test to prepare a sample.
2) Hydrogen peroxide decomposition test
Purified water (200 mL) was added to a 300 mL Erlenmeyer flask and preheated at 30 ° C. for 20 minutes. The whole sample (sodium percarbonate + enzyme) was added while stirring with a magnetic stirrer, and the mixture was allowed to stand at 30 ° C. Ten minutes later, 2 mL was taken from this solution, and the amount of hydrogen peroxide contained therein was measured. As a control, the same operation was carried out for those without any enzyme (only sodium percarbonate). The decomposition rate of each specimen was determined from the ratio when the amount of hydrogen peroxide 10 minutes after the control was 100.
3) Titration
Purified water (48 mL) and 10% (v / v) sulfuric acid (20 mL) were added to a 100 mL Erlenmeyer flask, and 2 mL of the sample sampled in 2) was added, and titrated to 0.01 m / L potassium permanganate to the coloring point.
4) Activity remaining rate
It was determined as a relative value of the degradation rate after 10 minutes of reaction of each preserved sample with respect to 100 as the degradation rate after 10 minutes of reaction of the sample before storage (sodium carbonate + enzyme, stored for 0 weeks).
[0030]
3. Results of stability evaluation test
The stability evaluation test described above was performed on Examples 1 to 3, Reference Example 1, and Reference Example 2 to evaluate the storage stability of the coated catalase agent. The results are shown in Table 2. Further, the storage stability of the granular catalase prepared above as a catalase not coated with the coating agent trehalose was also evaluated as Comparative Example 1. In Table 2, the amount of trehalose in parentheses indicates parts by weight relative to 100 parts by weight of granular catalase.
[0031]
[Table 2]

[0032]
From Table 2, if the granular catalase is not coated with trehalose, the residual activity is already significantly reduced in the first week of storage (see Comparative Example 1). However, when coated with trehalose, the enzyme activity is increased even in the presence of hydrogen peroxide adduct. It was revealed that the storage stability was maintained continuously. The storage stability of the enzyme increased in proportion to the coating amount of trehalose, and the storage stability of the enzyme was maintained at 30 parts by weight or more with respect to 100 parts by weight of granular catalase. From the above, the coated catalase agents of Examples 1 to 3 are useful as hydrogen peroxide-resistant adduct catalase agents.
[0033]
[Study of Catalase Stabilizer]
In the above [Coating Catalase Stability Evaluation Test 1], granular catalase consisting only of catalase was coated with a coating agent, and the coating effect in the presence of a hydrogen peroxide adduct was evaluated. In the following, a granular catalase prepared by adding a stabilizer effective to at least a catalase under the condition that no hydrogen peroxide adduct coexists is coated with a coating agent, and in the presence of the hydrogen peroxide adduct. The coating effect was evaluated. As stabilizers, granular catalase to which a compound that is expected to have a storage stabilizing effect is added is prepared in advance as follows, and the storage stability effect under the condition in which no hydrogen peroxide adduct is present is evaluated for each. did.
[0034]
Preparation Example 1
A granular catalase consisting only of the above catalase was designated as Preparation Example 1.
[0035]
Preparation Example 2
6,000 mL of catalase solution (Ask Super: manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) was concentrated 6 times using an ultrafiltration module (Microza UF Lab Module ACP-1010: manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.), and then the concentrated solution, etc. The operation of adding an amount of water and desalting the concentrated solution was repeated three times. About 1,000 mL of the obtained solution, after preparing a solution to which sodium glutamate was added in an amount equivalent to 50 w / w% with respect to the weight of the solid content of the solution, the entire amount of the solution was added to a fluid granulator Flow coater FLO-5 (Freund Sprayed onto 4,000 g of nucleating agent Nonparel 101 (Freund Sangyo Co., Ltd.) fluidized by Sangyo Co., Ltd. and dried to obtain granular catalase. The solid content of the catalase solution was obtained by measuring the sugar content of the liquid using a digital saccharimeter (manufactured by Atago Co., Ltd.) and calculating the product of the measured numerical value (Brix value (%)) and the total liquid volume ( Solid content of solution = Brix value × 0.01 × total liquid amount). The same applies to the following preparation examples.
[0036]
Preparation Example 3
6,000 mL of catalase solution (Ask Super: manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) was concentrated 6 times using an ultrafiltration module (Microza UF Lab Module ACP-1010: manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.), and then the concentrated solution, etc. The operation of adding an amount of water and desalting the concentrated solution was repeated three times. About 1,000 mL of the obtained solution, after preparing a solution to which sodium glutamate was added in an amount equivalent to 100 w / w% with respect to the weight of the solid content of the solution, the entire amount of the solution was added to a fluid granulator Flow coater FLO-5 (Freund Sprayed onto 4,000 g of nucleating agent Nonparel 101 (Freund Sangyo Co., Ltd.) fluidized by Sangyo Co., Ltd. and dried to obtain granular catalase.
[0037]
Preparation Example 4
6,000 mL of catalase solution (Ask Super: manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) was concentrated 6 times using an ultrafiltration module (Microza UF Lab Module ACP-1010: manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.), and then the concentrated solution, etc. The operation of adding an amount of water and desalting the concentrated solution was repeated three times. After preparing a solution obtained by adding 1.0 v / v% of ethanol to 1,000 mL of the obtained solution, the whole amount of the solution was flowed with a fluid granulator flow coater FLO-5 (manufactured by Freund Sangyo Co., Ltd.). Sprayed onto 4,000 g of non-parrel 101 (Freund Sangyo Co., Ltd.) and dried to obtain granular catalase.
[0038]
Preparation Example 5
6,000 mL of catalase solution (Ask Super: manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) was concentrated 6 times using an ultrafiltration module (Microza UF Lab Module ACP-1010: manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.), and then the concentrated solution, etc. The operation of adding an amount of water and desalting the concentrated solution was repeated three times. After preparing a solution in which 3.0 v / v% of ethanol was added to 1,000 mL of the obtained solution, the whole volume of the solution was flowed with a fluid granulator flow coater FLO-5 (manufactured by Freund Sangyo Co., Ltd.). Sprayed onto 4,000 g of non-parrel 101 (Freund Sangyo Co., Ltd.) and dried to obtain granular catalase.
[0039]
Preparation Example 6
6,000 mL of catalase solution (Ask Super: manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) was concentrated 6 times using an ultrafiltration module (Microza UF Lab Module ACP-1010: manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.), and then the concentrated solution, etc. The operation of adding an amount of water and desalting the concentrated solution was repeated three times. After preparing a solution in which ethanol was added in an amount of 5.0 v / v% to 1,000 mL of the obtained solution, the whole amount of the solution was flowed with a fluid granulator flow coater FLO-5 (manufactured by Freund Sangyo Co., Ltd.). Sprayed onto 4,000 g of non-parrel 101 (Freund Sangyo Co., Ltd.) and dried to obtain granular catalase.
[0040]
Preparation Example 7
6,000 mL of catalase solution (Ask Super: manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) was concentrated 6 times using an ultrafiltration module (Microza UF Lab Module ACP-1010: manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.), and then the concentrated solution, etc. The operation of adding an amount of water and desalting the concentrated solution was repeated three times. For 1,000 mL of the resulting solution, add sodium glutamate in an amount equivalent to 50 w / w% with respect to the weight of the solid content of the solution, and then add 3.0 v / v% ethanol, and then add the total amount of the solution. Was sprayed onto 4,000 g of nucleating agent Nonparel 101 (Freund Sangyo Co., Ltd.) which was fluidized with a flow granulator FLO-5 (Freund Sangyo Co., Ltd.) and dried to obtain granular catalase.
[0041]
Preparation Example 8
6,000 mL of catalase solution (Ask Super: manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) was concentrated 6 times using an ultrafiltration module (Microza UF Lab Module ACP-1010: manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.), and then the concentrated solution, etc. The operation of adding an amount of water and desalting the concentrated solution was repeated three times. About 1,000 mL of the resulting solution, add sodium glutamate in an amount equivalent to 100 w / w% based on the weight of the solid content of the solution, and then add 3.0 v / v% ethanol, and then add the total amount of the solution. Was sprayed onto 4,000 g of nucleating agent Nonparel 101 (Freund Sangyo Co., Ltd.) which was fluidized with a flow granulator FLO-5 (Freund Sangyo Co., Ltd.) and dried to obtain granular catalase.
[0042]
Preparation Example 9
6,000 mL of catalase solution (Ask Super: manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) was concentrated 6 times using an ultrafiltration module (Microza UF Lab Module ACP-1010: manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.), and then the concentrated solution, etc. The operation of adding an amount of water and desalting the concentrated solution was repeated three times. For 1,000 mL of the resulting solution, add sodium glutamate in an amount equivalent to 50 w / w% based on the weight of the solid content of the solution, and then add 5.0 v / v% ethanol to the solution, and then add the total amount of the solution. Was sprayed onto 4,000 g of nucleating agent Nonparel 101 (Freund Sangyo Co., Ltd.) which was fluidized with a flow granulator FLO-5 (Freund Sangyo Co., Ltd.) and dried to obtain granular catalase.
[0043]
Preparation Example 10
6,000 mL of catalase solution (Ask Super: manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) was concentrated 6 times using an ultrafiltration module (Microza UF Lab Module ACP-1010: manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.), and then the concentrated solution, etc. The operation of adding an amount of water and desalting the concentrated solution was repeated three times. For 1,000 mL of the resulting solution, add sodium glutamate in an amount equivalent to 100 w / w% with respect to the weight of the solid content of the solution, and then add 5.0 v / v% ethanol, and then add the total amount of the solution. Was sprayed onto 4,000 g of nucleating agent Nonparel 101 (Freund Sangyo Co., Ltd.) which was fluidized with a flow granulator FLO-5 (Freund Sangyo Co., Ltd.) and dried to obtain granular catalase.
[0044]
[Evaluation of preservation effect of catalase]
The granular catalase of Preparation Example 1 to Preparation Example 10 obtained above was evaluated for the storage stabilization effect in the absence of hydrogen peroxide adduct. That is, 10 g of the catalase of each of the preparation examples obtained above was put into a glass sample bottle and stored at 70 ° C. for 8 hours, and the remaining activity rate after storage was determined with each catalase activity value before storage as 100%. Asked. The results are shown in Table 3. In Table 3, sodium glutamate indicates w / w% relative to the solid content weight of the catalase solution, and ethanol indicates v / v% relative to the catalase solution. The same applies to the following examples and comparative examples.
[0045]
[Table 3]

[0046]
As is apparent from Table 3, Preparation Examples 2 to 4 have a residual activity higher than that of Preparation Example 1 to which nothing is added, but it is greatly reduced to 50% or less. However, Preparation Examples 5 to 10 maintain the residual activity well. It was. Moreover, even when sodium glutamate alone was added to catalase, the storage stabilization effect was not sufficient (see Preparation Examples 2 and 3), but sufficient storage stabilization effect was obtained when used in combination with 3v / v% ethanol. (See Preparation Example 5 and Preparation Examples 7 and 8). When ethanol was added alone, the residual activity increased depending on the amount of ethanol added, and a sufficient storage stabilization effect was obtained at 5 v / v%.
[0047]
[Manufacture of coated catalase agent 2]
A coated catalase agent was prepared by coating granular catalase to which the stabilizer effective as described above was added with the coating agent trehalose.
[0048]
Example 4
200 g of trehalose (manufactured by Hayashibara Co., Ltd.) was sprayed and dried on 4,000 g of granular catalase of Preparation Example 7 to obtain a coated catalase agent.
[0049]
Example 5
400 g of trehalose (manufactured by Hayashibara Co., Ltd.) was sprayed and dried to 4,000 g of granular catalase of Preparation Example 7 to obtain a coated catalase agent.
[0050]
Example 6
To 4,000 g of granular catalase of Preparation Example 7, 800 g of trehalose (manufactured by Hayashibara Co., Ltd.) was sprayed and dried to obtain a coated catalase agent.
[0051]
Comparative Example 2
It is the granular catalase obtained in Preparation Example 6.
[0052]
Comparative Example 3
It is a granular catalase obtained in Preparation Example 7.
[0053]
Comparative Example 4
6,000 mL of catalase solution (Ask Super: manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) was concentrated 6 times using an ultrafiltration module (Microza UF Lab Module ACP-1010: manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.), and then the concentrated solution, etc. The operation of adding an amount of water and desalting the concentrated solution was repeated three times. About 1,000 mL of the obtained solution, sodium glutamate was added in an amount equivalent to 50 w / w% with respect to the weight of the solid content of the solution, and ethanol 3.0 v / v%, trehalose (produced by Hayashibara Co., Ltd.) 800 g (20w / w%) After preparing the added solution, the whole amount of the solution was flowed with a fluid granulator flow coater FLO-5 (manufactured by Freund Sangyo Co., Ltd.). After spraying to 4,000 g and drying, granular catalase of Comparative Example 4 was obtained.
[0054]
[Stability evaluation test of coated catalase agent 2]
The storage stability of the coated catalase agent in the coexistence of the hydrogen peroxide adduct was evaluated for Examples 4 to 6 in the same manner as in [Coating catalase agent stability evaluation test 1] described above. Further, Comparative Examples 2 to 4 were similarly evaluated. The results are shown in Table 4. In Table 4, Reference Example 1 and Reference Example 2 in Table 2 are also shown for comparison. The parentheses in the amount of coated trehalose in Table 4 indicate parts by weight relative to 100 parts by weight of granular catalase.
[0055]
[Table 4]

[0056]
In Comparative Examples 2 to 4, the residual activity of catalase is remarkably decreased with time, and even if it is a stabilizer excellent in storage stability in the absence of hydrogen peroxide adduct, Table 4 below shows that catalase activity cannot be maintained without coating with a coating agent as in Examples. Moreover, it became clear from Comparative Example 4 that there is no storage stabilization effect in the coexistence of the hydrogen peroxide adduct only by adding trehalose without using it as a coating agent. When Example 4 to Example 6 are compared with Reference Example 1 and Reference Example 2 (especially Example 6 and Reference Example 2), the granular catalase to which the stabilizer is added is coated with the coating agent, thereby stabilizing the stabilizer. It became clear that the storage stabilization effect in the coexistence of hydrogen peroxide adduct was enhanced compared to the case without coating, and the addition of a stabilizer would increase the storage stability even if the coating amount of the coating agent was suppressed. It was revealed that a characteristic coated catalase can be obtained. As mentioned above, although Example 4 has low activity, the storage stability is remarkably higher than that of the comparative example, and the coated catalase agents of Examples 4 to 6 are useful as hydrogen peroxide-resistant adduct catalase agents.
[0057]
【The invention's effect】
Since this invention is comprised as mentioned above, there exist the following effects.
According to the hydrogen peroxide-resistant adduct catalase agent of the present invention, the catalase activity can be stably maintained even if the catalase is stored in the presence of a hydrogen peroxide adduct such as sodium percarbonate or sodium perborate. And hydrogen peroxide adducts can be combined to produce a product without separate products. And since oxygen can be easily generated just by adding water at the time of use, it has various utility and is useful.
Further, according to the method for producing a hydrogen peroxide-resistant adduct catalase agent of the present invention, the hydrogen peroxide-resistant adduct catalase agent can be easily produced without undergoing a freeze-drying operation. This can contribute to cost reduction of the adduct catalase agent.

Claims

Catalase obtained by solidifying a catalase solution in which 3 to 5 v / v% ethanol with respect to the volume of the catalase solution and 50 to 100 w / w% sodium glutamate with respect to the solid content weight of the catalase solution were added as stabilizers A hydrogen peroxide-resistant adduct catalase agent obtained by coating 100 parts by weight with 5 parts by weight or more of trehalose as a coating agent.

The hydrogen peroxide-resistant adduct catalase agent according to claim 1, wherein the amount of trehalose is 5 to 50 parts by weight.

3-5 v / v% ethanol with respect to the volume of the catalase solution and 50-100 w / w% sodium glutamate with respect to the solid content weight of the catalase solution as stabilizers are added to the catalase solution. A method for producing a hydrogen peroxide-resistant adduct catalase agent, which is coated with 100 parts by weight of the solid catalase after spraying and drying 5 parts by weight or more of the coating agent trehalose.

The method for producing a hydrogen peroxide-resistant adduct catalase agent according to claim 3, wherein the amount of trehalose is 5 to 50 parts by weight.