JP4292043B2 - Measuring chip used for surface plasmon resonance measuring device - Google Patents
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Description
本発明は、表面プラズモン共鳴測定装置に用いられる測定チップ、及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。 The present invention relates to a measuring chip used in a surface plasmon resonance measuring apparatus and a method for analyzing an interaction between biomolecules using the measuring chip.
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。 Currently, many measurements using intermolecular interactions such as immune reactions are performed in clinical examinations, etc., but conventional methods require complicated operations and labeling substances, so measurement without the need for labeling substances Several techniques that can detect a change in the amount of a substance bound with high sensitivity are used. For example, surface plasmon resonance (SPR) measurement technology, quartz crystal microbalance (QCM) measurement technology, and measurement technology using functionalized surfaces from gold colloidal particles to ultrafine particles. SPR measurement technology detects adsorption and desorption near the surface by measuring the refractive index change in the vicinity of the organic functional film in contact with the metal film of the chip by measuring the peak shift of the reflected light wavelength or the change in the amount of reflected light at a fixed wavelength. It is a method to do. The QCM measurement technique is a technique capable of detecting the adsorption / desorption mass at the ng level from the change in the oscillation frequency of the oscillator due to the adsorption / desorption of a substance on the gold electrode (device) of the crystal oscillator. In addition, by functionalizing the surface of gold ultrafine particles (nm level), immobilizing a physiologically active substance on the surface, and performing a specific recognition reaction between the physiologically active substances, it is possible to obtain a living body from the sedimentation and arrangement of gold fine particles. Related substances can be detected.
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。 In any of the above techniques, the surface on which the physiologically active substance is immobilized is important. Hereinafter, the surface plasmon resonance (SPR) most used in this technical field will be described as an example.
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。 A commonly used measurement chip is composed of a transparent substrate (eg, glass), a deposited metal film, and a thin film having a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance thereon, and the metal chip is formed on the metal surface via the functional group. Immobilize physiologically active substances. The interaction between biomolecules is analyzed by measuring a specific binding reaction between the physiologically active substance and the analyte substance.
生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。 As a thin film having a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance, a functional group capable of binding to a metal, a linker having a chain length of 10 or more atoms, and a compound having a functional group capable of binding to a physiologically active substance, A measurement chip in which an active substance is immobilized has been reported (see Patent Document 1).
また、表面プラズモンの発生を利用して試料中の物質を定量分析する表面プラズモン共鳴測定装置として、全反射減衰を利用した、プリズム一体型カップ型の測定装置が報告されている（特許文献２を参照）。 In addition, as a surface plasmon resonance measuring device that quantitatively analyzes a substance in a sample using generation of surface plasmons, a prism-integrated cup type measuring device using total reflection attenuation has been reported (see Patent Document 2). reference).
本発明は、リガンド物質を再現よく多量に固定化できることができ、さらに検体の結合に対応する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）信号の再現性に優れた、表面プラズモン共鳴測定装置用の測定チップを提供することを解決すべき課題とした。 The present invention provides a measuring chip for a surface plasmon resonance measuring apparatus that can immobilize a ligand substance in a large amount with good reproducibility and is excellent in surface plasmon resonance (SPR) signal reproducibility corresponding to binding of an analyte. This was a problem to be solved.
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、誘電体ブロックと金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化され、かつ前記金属膜が、ヒドロゲルまたは有機分子Ｘ−Ｒ−Ｙ’（式中、Ｘは金属膜に対する結合性を有する基、Ｒは二価の連結基、Ｙ’は生理活性物質を結合させるための基である。）で被覆されている測定チップを、誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜、光源、光学系、および光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置において用いることにより、リガンド物質を再現よく多量に固定化できることができ、さらに検体の結合に対応する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）信号を再現よく取得できることができることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies in order to solve the above problems, the present inventors are composed of a dielectric block and a metal film, and the dielectric block includes the light beam entrance surface, the light exit surface, and the metal film. Formed as one block including all of the formed surface, the metal film is integrated with the dielectric block, and the metal film is a hydrogel or an organic molecule X—R—Y ′ (where X is A measurement chip coated with a group having a binding property to a metal film, R is a divalent linking group, Y ′ is a group for binding a physiologically active substance), a dielectric block, and this dielectric block When used in a surface plasmon resonance measuring apparatus comprising a metal film formed on one surface, a light source, an optical system, and a light detection means, a large amount of ligand substance can be reproducibly immobilized, It found that it is possible to surface plasmon resonance corresponding to binding of the analyte to et the (SPR) signal can be reproduced well acquired, and have completed the present invention.
即ち、本発明によれば、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、上記誘電体ブロックと上記金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化され、かつ前記金属膜がヒドロゲルで被覆されている上記の測定チップが提供される。 That is, according to the present invention, a dielectric block, a metal film formed on one surface of the dielectric block, a light source that generates a light beam, and the light beam with respect to the dielectric block. Surface plasmon resonance by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface, and an optical system that allows the total reflection condition to be obtained at the interface between the block and the metal film and including various incident angle components. A measurement chip for use in a surface plasmon resonance measurement apparatus comprising a light detection means for detecting the state of the light, comprising the dielectric block and the metal film, wherein the dielectric block is the light block. Formed as one block including all of the incident surface, the exit surface of the beam, and one surface on which the metal film is formed, the metal film is integrated with the dielectric block, and the gold film Film above measurement chip is provided which is coated with a hydrogel.
好ましくは、金属膜に有機分子Ｘ−Ｒ−Ｙ（式中、Ｘは金属膜に対する結合性を有する基、Ｒは二価の連結基、Ｙはヒドロゲルを結合させるための基である。）が結合しており、該有機分子Ｘ−Ｒ−Ｙ中の基Ｙにヒドロゲルが結合している。好ましくは、金属膜が疎水性高分子化合物でコーティングされており、さらにその表面がヒドロゲルで被覆されている。好ましくは、金属膜にコーティングされた疎水性高分子化合物は、ヒドロゲルを固定化することができる官能基を有する。好ましくは、ヒドロゲルは、生理活性物質を固定化することができる官能基を有する。 Preferably, an organic molecule X—R—Y (wherein X is a group having a bonding property to the metal film, R is a divalent linking group, and Y is a group for bonding the hydrogel) to the metal film. The hydrogel is bonded to the group Y in the organic molecule XR-Y. Preferably, the metal film is coated with a hydrophobic polymer compound, and the surface thereof is further coated with a hydrogel. Preferably, the hydrophobic polymer compound coated on the metal film has a functional group capable of immobilizing the hydrogel. Preferably, the hydrogel has a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance.
本発明の別の側面によれば、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、上記誘電体ブロックと上記金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化され、かつ前記金属膜が有機分子Ｘ−Ｒ−Ｙ’（式中、Ｘは金属膜に対する結合性を有する基、Ｒは二価の連結基、Ｙ’は生理活性物質を結合させるための基である。）で被覆されている上記の測定チップが提供される。 According to another aspect of the present invention, a dielectric block, a metal film formed on one surface of the dielectric block, a light source that generates a light beam, and the light beam with respect to the dielectric block, An optical system that allows the total reflection condition to be obtained at the interface between the dielectric block and the metal film and that includes various incident angle components, and the intensity of the light beam that is totally reflected at the interface to measure the surface A measurement chip for use in a surface plasmon resonance measurement apparatus comprising a light detection means for detecting a state of plasmon resonance, comprising the dielectric block and the metal film, wherein the dielectric block is It is formed as one block including all of the light beam incident surface, the light exit surface, and the one surface on which the metal film is formed, and the dielectric film is integrated with the metal film, and The metal film is an organic molecule X—R—Y ′ (wherein X is a group having a binding property to the metal film, R is a divalent linking group, and Y ′ is a group for binding a physiologically active substance). A measuring chip as described above is provided.
本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している、上記の何れかの測定チップが提供される。 According to still another aspect of the present invention, there is provided any one of the measurement chips described above, wherein a physiologically active substance is bound to the surface by a covalent bond.
本発明のさらに別の側面によれば、上記の何れかの測定チップと生理活性物質とを接触させて、該測定チップの表面に該生理活性物質を共有結合により結合させる工程を含む、測定チップに生理活性物質を固定化する方法が提供される。 According to still another aspect of the present invention, the measurement chip includes a step of bringing any of the measurement chips and the physiologically active substance into contact with each other and bonding the physiologically active substance to the surface of the measurement chip by a covalent bond. A method for immobilizing a physiologically active substance is provided.
本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している上記の何れかの測定チップと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。 According to still another aspect of the present invention, the physiologically active substance interacts with the physiologically active substance, comprising the step of bringing any of the measurement chips having the physiologically active substance bound to the surface by covalent bonding into contact with the test substance. A method for detecting or measuring a substance is provided.
本発明のさらに別の側面によれば、上記の何れかの測定チップを有する表面プラズモン共鳴測定装置が提供される。 According to still another aspect of the present invention, there is provided a surface plasmon resonance measuring apparatus having any one of the above measuring chips.
本発明により、リガンド蛋白質の固定化量、および検体との結合量の再現性に優れた表面プラズモン共鳴測定装置用の測定チップを提供することが可能になった。 According to the present invention, it has become possible to provide a measurement chip for a surface plasmon resonance measuring apparatus that is excellent in reproducibility of the amount of ligand protein immobilized and the amount bound to a specimen.
以下、本発明の実施の形態について説明する。本発明の測定チップは、本明細書中に記載した構成を有する表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、誘電体ブロックとこの誘電体ブロックの一面に形成された金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化され、かつ前記金属膜がヒドロゲルまたは有機分子Ｘ−Ｒ−Ｙ’（式中、Ｘは金属膜に対する結合性を有する基、Ｒは二価の連結基、Ｙ’は生理活性物質を結合させるための基である。）で被覆されていることを特徴とする。 Embodiments of the present invention will be described below. A measurement chip of the present invention is a measurement chip for use in a surface plasmon resonance measurement apparatus having the configuration described in the present specification, and includes a dielectric block and a metal film formed on one surface of the dielectric block. The dielectric block is formed as one block including all of the light beam incident surface, the light exit surface, and one surface on which the metal film is formed, and the metal film is integrated with the dielectric block. And the metal film is a hydrogel or an organic molecule X—R—Y ′ (wherein X is a group having a binding property to the metal film, R is a divalent linking group, and Y ′ is for binding a physiologically active substance) It is characterized by being coated with a base of
本発明で用いるヒドロゲルとしては、Merrill等（1986年）、Hydrogels in Medicine and Pharmacy,III巻、Peppas NA編集、１章、CRCにより定義されているヒドロゲルを使用することができる。ヒドロゲルとしては、例えば多糖類、例えばアガロース、デキストラン、カラゲナン、アルギン酸、澱粉、セルロース、又はこれらの誘導体、例えばカルボキシメチル誘導体、又は水膨潤性有機ポリマー例えばポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールなどを使用することができる。特にデキストラン型の多糖類は、セルロースとは対称的に性質が非結晶性であり、好ましく用いられる。 As the hydrogel used in the present invention, a hydrogel defined by Merrill et al. (1986), Hydrogels in Medicine and Pharmacy, Volume III, edited by Peppas NA, Chapter 1, CRC can be used. Hydrogels include, for example, polysaccharides such as agarose, dextran, carrageenan, alginic acid, starch, cellulose, or derivatives thereof such as carboxymethyl derivatives, or water-swellable organic polymers such as polyvinyl alcohol, polyacrylic acid, polyacrylamide, polyethylene glycol. Etc. can be used. In particular, dextran-type polysaccharides are preferably used because they are non-crystalline in nature in contrast to cellulose.
ヒドロゲルは有機分子Ｘ−Ｒ−Ｙを介して金属膜に付着させることができる。有機分子Ｘ−Ｒ−Ｙについて詳細に説明する。 The hydrogel can be attached to the metal film via the organic molecule X—R—Y. The organic molecule X—R—Y will be described in detail.
Ｘは金属膜に対する結合性を有する基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド（−SSR'Ｙ"、−SSRY）、スルフィド（−SR'Ｙ"、−SRY）、ジセレニド（−SeSeR'Ｙ"、−SeSeRY）、セレニド（SeR'Ｙ"、−SeRY）、チオール（−SH）、ニトリル（−CN）、イソニトリル、ニトロ（−NO2）、セレノール（−SeH）、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸（−COSH、−CSSH）が好ましく用いられる。 X is a group having a binding property to the metal film. Specifically, asymmetric or symmetric sulfide (-SSR'Y ", -SSRY), sulfide (-SR'Y", -SRY), diselenide (-SeSeR'Y ", -SeSeRY), selenide (SeR'Y" , -SeRY), thiol (-SH), nitrile (-CN), isonitrile, nitro (-NO 2), selenol (-SeH), 3-valent phosphorous compounds, isothiocyanate, xanthate, thiocarbamate, phosphine, or thioacid Dithioic acid (-COSH, -CSSH) is preferably used.
Ｒ（とＲ’）は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖である。鎖の長さは10原子を越えることが好ましい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。 R (and R ') are optionally interrupted by heteroatoms, preferably straight-chain (unbranched) for adequate packing, optionally containing double and / or triple bonds Is a chain. The chain length is preferably greater than 10 atoms. The carbon chain can optionally be perfluorinated.
ＹとＹ”はヒドロゲルを結合させるための基である。ＹとＹ”は好ましくは同一であり、ヒドロゲルに直接又は活性化後結合できるような性質を持つ。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。 Y and Y ″ are groups for bonding the hydrogel. Y and Y ″ are preferably the same and have the property that they can be bonded directly or after activation to the hydrogel. Specifically, hydroxyl, carboxyl, amino, aldehyde, hydrazide, carbonyl, epoxy, vinyl group, or the like can be used.
有機分子Ｘ−Ｒ−Ｙの具体例としては、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどが挙げられる。 Specific examples of the organic molecule X—R—Y include 10-carboxy-1-decanethiol, 4,4′-dithiodibutyric acid, 11-hydroxy-1-undecanethiol, 11-amino-1-undecanethiol, etc. Is mentioned.
有機分子Ｘ−Ｒ−Ｙ’を金属膜に付着させた状態で、ヒドロゲルを介さずに生理活性物質を結合させる態様も好ましく用いることができる。このときＹ’は生理活性物質を結合させる基であるが、前述のＹと同じ官能基を使用することができる。 An embodiment in which a physiologically active substance is bound without using a hydrogel in a state where the organic molecule X—R—Y ′ is attached to the metal film can also be preferably used. At this time, Y 'is a group that binds a physiologically active substance, and the same functional group as Y described above can be used.
また本発明の好ましい態様では、金属膜を疎水性高分子化合物でコーティングし、さらにその表面をヒドロゲルで被覆することができる。 In a preferred embodiment of the present invention, the metal film can be coated with a hydrophobic polymer compound, and the surface thereof can be further coated with a hydrogel.
本発明で用いる疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。 The hydrophobic polymer compound used in the present invention is a polymer compound having no water absorption, and its solubility in water (25 ° C.) is 10% or less, more preferably 1% or less, most preferably 0.1% or less. It is.
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。 Hydrophobic monomers that form hydrophobic polymer compounds include vinyl esters, acrylic acid esters, methacrylic acid esters, olefins, styrenes, crotonic acid esters, itaconic acid diesters, and maleic acid diesters. , Fumaric acid diesters, allyl compounds, vinyl ethers, vinyl ketones and the like. The hydrophobic polymer compound may be a homopolymer composed of one type of monomer or a copolymer composed of two or more types of monomers.
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。 Examples of the hydrophobic polymer compound preferably used in the present invention include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, polyvinyl chloride, polymethyl methacrylate, polyester, and nylon.
疎水性高分子化合物の金属膜へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。 The coating of the hydrophobic polymer compound on the metal film can be performed by a conventional method, for example, spin coating, air knife coating, bar coating, blade coating, slide coating, curtain coating, spray method, vapor deposition method, casting method. It can be performed by a dipping method or the like.
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは１オングストローム以上５０００オングストローム以下であり、特に好ましくは１０オングストローム以上３０００オングストローム以下である。 The coating thickness of the hydrophobic polymer compound is not particularly limited, but is preferably 1 angstrom or more and 5000 angstrom or less, and particularly preferably 10 angstrom or more and 3000 angstrom or less.
コーティングした疎水性高分子化合物膜表面には、ヒドロゲルを固定化することができる官能基を有することが好ましい。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。 The surface of the coated hydrophobic polymer compound film preferably has a functional group capable of immobilizing the hydrogel. Specifically, hydroxyl, carboxyl, amino, aldehyde, hydrazide, carbonyl, epoxy, vinyl group, or the like can be used.
ヒドロゲル層の厚さは特に限定されないが、水で膨潤させた状態において、好ましくは１オングストローム以上５０００オングストローム以下であり、特に好ましくは１０オングストローム以上３０００オングストローム以下である。 The thickness of the hydrogel layer is not particularly limited, but is preferably 1 angstrom or more and 5000 angstrom or less, particularly preferably 10 angstrom or more and 3000 angstrom or less, in a state swollen with water.
金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記金属膜への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。 The metal constituting the metal film is not particularly limited as long as surface plasmon resonance can occur. Preferred examples include free electron metals such as gold, silver, copper, aluminum, and platinum, with gold being particularly preferred. These metals can be used alone or in combination. In consideration of adhesion to the metal film, an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the layer made of metal.
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。 Although the thickness of the metal film is arbitrary, for example, when considering use for a surface plasmon resonance measuring apparatus, it is preferably 1 angstrom or more and 5000 angstrom or less, and particularly preferably 10 angstrom or more and 2000 angstrom or less. If it exceeds 5000 angstroms, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected. When an intervening layer made of chromium or the like is provided, the thickness of the intervening layer is preferably 1 angstrom or more and 100 angstrom or less.
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。 The metal film may be formed by a conventional method, for example, sputtering, vapor deposition, ion plating, electroplating, electroless plating, or the like.
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴測定装置用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。 The metal film is preferably disposed on the substrate. Here, “arranged on the substrate” means that the metal film is arranged so as to be in direct contact with the substrate, and that the metal film is not directly in contact with the substrate, but through other layers. This also includes the case where they are arranged. As a substrate that can be used in the present invention, for example, when considering use for a surface plasmon resonance measuring apparatus, generally, an optical glass such as BK7 or a synthetic resin, specifically, polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, polycarbonate A material made of a material transparent to laser light such as a cycloolefin polymer can be used. Such a substrate is preferably made of a material that does not exhibit anisotropy with respect to polarized light and has excellent processability.
ヒドロゲルで被覆された金属膜においては、最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「最表面」とは、「金属膜から最も遠い側」という意味である。 The metal film coated with hydrogel preferably has a functional group capable of immobilizing a physiologically active substance on the outermost surface. Here, the “outermost surface” means “the side farthest from the metal film”.
生理活性物質を固定化することができる官能基として好ましい官能基は−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ3ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。 Preferred functional groups that can immobilize the physiologically active substance are —OH, —SH, —COOH, —NR 1 R 2 (wherein R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom or a lower alkyl group. -CHO, -NR 3 NR 1 R 2 (wherein R 1 , R 2 and R 3 independently represent a hydrogen atom or a lower alkyl group), -NCO, -NCS, an epoxy group, or A vinyl group etc. are mentioned. Here, the number of carbon atoms in the lower alkyl group is not particularly limited, but is generally about C1 to C10, preferably C1 to C6.
最表面にそれらの官能基を導入する方法としては、それらの官能基の前駆体を含有するヒドロゲルを金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体からそれらの官能基を生成させる方法が挙げられる。 As a method for introducing these functional groups on the outermost surface, a hydrogel containing precursors of these functional groups is coated on a metal surface or a metal film, and then the precursors located on the outermost surface are subjected to chemical treatment. The method of producing | generating a functional group is mentioned.
上記のようにして得られた測定チップにおいて、上記の官能基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属膜に生理活性物質を固定化することができる。 In the measurement chip obtained as described above, the physiologically active substance can be immobilized on the metal film by covalently bonding the physiologically active substance via the functional group.
本発明の測定チップの表面上に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。 The physiologically active substance immobilized on the surface of the measurement chip of the present invention is not particularly limited as long as it interacts with the measurement target. For example, immune proteins, enzymes, microorganisms, nucleic acids, low molecular organic compounds, non-molecular compounds, Examples include immune proteins, immunoglobulin-binding proteins, sugar-binding proteins, sugar chains that recognize sugars, fatty acids or fatty acid esters, or polypeptides or oligopeptides having ligand binding ability.
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。 Examples of immunity proteins include antibodies and haptens that use the measurement target as an antigen. As the antibody, various immunoglobulins, that is, IgG, IgM, IgA, IgE, and IgD can be used. Specifically, when the measurement target is human serum albumin, an anti-human serum albumin antibody can be used as the antibody. In addition, when using pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, cocaine, heroin, cracks, etc. as antigens, for example, anti-atrazine antibodies, anti-kanamycin antibodies, anti-methamphetamine antibodies, or pathogenic E. coli Among them, antibodies against O antigen 26, 86, 55, 111, 157 and the like can be used.
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。 The enzyme is not particularly limited as long as it shows activity against the measurement object or a substance metabolized from the measurement object, and various enzymes such as oxidoreductase, hydrolase, isomerase , A desorbing enzyme, a synthesizing enzyme, etc. Specifically, if the measurement object is glucose, glucose oxidase can be used, and if the measurement object is cholesterol, cholesterol oxidase can be used. In addition, when pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, cocaine, heroin, cracks, etc. are used as measurement objects, they exhibit specific reactions with substances metabolized from them, such as acetylcholinesterase. Enzymes such as catecholamine esterase, noradrenaline esterase and dopamine esterase can be used.
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
The microorganism is not particularly limited, and various microorganisms including Escherichia coli can be used.
As the nucleic acid, one that hybridizes complementarily with the nucleic acid to be measured can be used. As the nucleic acid, either DNA (including cDNA) or RNA can be used. The type of DNA is not particularly limited, and may be any of naturally derived DNA, recombinant DNA prepared by gene recombination technology, or chemically synthesized DNA. Examples of the low molecular weight organic compound include any compound that can be synthesized by an ordinary organic chemical synthesis method.
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
The non-immune protein is not particularly limited, and for example, avidin (streptavidin), biotin or a receptor can be used.
As the immunoglobulin-binding protein, for example, protein A or protein G, rheumatoid factor (RF) and the like can be used.
Examples of sugar-binding proteins include lectins.
Examples of the fatty acid or fatty acid ester include stearic acid, arachidic acid, behenic acid, ethyl stearate, ethyl arachidate, and ethyl behenate.
生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。 When the physiologically active substance is a protein or nucleic acid such as an antibody or an enzyme, the immobilization can be performed by covalently bonding to a functional group on the metal surface using the amino group, thiol group or the like of the physiologically active substance. .
上記のようにして生理活性物質を固定化した測定チップは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。 The measurement chip on which the physiologically active substance is immobilized as described above can be used for detection and / or measurement of a substance that interacts with the physiologically active substance.
即ち、本発明によれば、生理活性物質が固定化された本発明の測定チップを用いて、これに被験物質を接触させることにより、該測定チップに固定化されている生理活性物質と相互作用する物質を検出及び／又は測定する方法が提供される。
被験物質としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。
That is, according to the present invention, by using the measurement chip of the present invention on which a physiologically active substance is immobilized and bringing the test substance into contact therewith, the interaction with the physiologically active substance immobilized on the measurement chip is achieved. A method of detecting and / or measuring a substance to be provided is provided.
As the test substance, for example, a sample containing a substance that interacts with the above physiologically active substance can be used.
本発明では、測定チップの表面に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術により検出する。 In the present invention, the interaction between the physiologically active substance immobilized on the surface of the measurement chip and the test substance is detected by a surface plasmon resonance (SPR) measurement technique.
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。 The phenomenon of surface plasmon resonance is due to the fact that the intensity of monochromatic light reflected from the boundary between an optically transparent substance such as glass and the metal thin film layer depends on the refractive index of the sample on the metal exit side. Yes, so the sample can be analyzed by measuring the intensity of the reflected monochromatic light.
次に、本発明の測定チップを備えた表面プラズモン共鳴測定装置について説明する。
表面プラズモン共鳴測定装置とは、表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析するための装置である。
Next, a surface plasmon resonance measuring apparatus provided with the measuring chip of the present invention will be described.
A surface plasmon resonance measuring apparatus is an apparatus for analyzing the characteristics of a substance to be measured using a phenomenon in which surface plasmons are excited by light waves.
本発明で用いられる表面プラズモン共鳴測定装置は、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備える。 The surface plasmon resonance measuring apparatus used in the present invention includes a dielectric block, a metal film formed on one surface of the dielectric block, a light source for generating a light beam, and the light beam to the dielectric block. Measure the intensity of the light beam that is totally reflected at the interface, and an optical system that makes the total reflection condition obtained at the interface between the dielectric block and the metal film and includes various incident angle components. And a light detection means for detecting the state of surface plasmon resonance.
また、前記の通り、前記誘電体ブロックは、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されている。さらには前記金属膜がヒドロゲルでコーティングされている。 Further, as described above, the dielectric block is formed as one block including all of the light beam incident surface, the light exit surface, and one surface on which the metal film is formed, and the metal film is formed on the dielectric block. It is integrated. Furthermore, the metal film is coated with a hydrogel.
本発明では、具体的には、特開２００１−３３０５６０号公報記載の図１〜図３２で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置、特開２００２−２９６１７７号公報記載の図１〜図１５で説明されている表面プラズモン共鳴測定装置を好ましく用いることができる。特開２００１−３３０５６０号公報および特開２００２−２９６１７７号公報に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする。 In the present invention, specifically, the surface plasmon resonance measuring apparatus described in FIGS. 1 to 32 described in JP 2001-330560 A and described in FIGS. 1 to 15 described in JP 2002-296177 A are described. A surface plasmon resonance measuring apparatus which is used can be preferably used. The contents described in Japanese Patent Laid-Open No. 2001-330560 and Japanese Patent Laid-Open No. 2002-296177 are all cited in this specification as part of the disclosure of this specification.
例えば、特開２００１−３３０５６０号公報記載の表面プラズモン共鳴測定装置としては、例えば、誘電体ブロック、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜からなる薄膜層、およびこの薄膜層の表面上に試料を保持する試料保持機構を備えてなる複数の測定ユニットと、これら複数の測定ユニットを支持した支持体と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと前記金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の入射角で入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して、表面プラズモン共鳴による全反射減衰の状態を検出する光検出手段と、前記複数の測定ユニットの各誘電体ブロックに関して順次前記全反射条件および種々の入射角が得られるように、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、各測定ユニットを順次前記光学系および光検出手段に対して所定位置に配置する駆動手段とを備えてなることを特徴とする表面プラズモン共鳴測定装置が挙げられる。 For example, as a surface plasmon resonance measuring apparatus described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-330560, for example, a dielectric block, a thin film layer made of a metal film formed on one surface of the dielectric block, and a surface of the thin film layer A plurality of measurement units each including a sample holding mechanism for holding a sample; a support that supports the plurality of measurement units; a light source that generates a light beam; and the light beam with respect to the dielectric block. An optical system that is incident at various incident angles so that a total reflection condition can be obtained at the interface between the dielectric block and the metal film, and the intensity of the light beam that is totally reflected at the interface are measured, and the total intensity by surface plasmon resonance. The total reflection condition and various incident angles can be obtained sequentially with respect to the light detection means for detecting the reflection attenuation state and each dielectric block of the plurality of measurement units. As described above, the apparatus includes a driving unit that relatively moves the support, the optical system, and the light detection unit, and sequentially arranges each measurement unit at a predetermined position with respect to the optical system and the light detection unit. And a surface plasmon resonance measuring apparatus.
なお、上記の測定装置においては、例えば前記光学系および光検出手段が静止状態に保たれるものとされ、前記駆動手段が、前記支持体を移動させるものとされる。 In the above measurement apparatus, for example, the optical system and the light detection means are kept stationary, and the driving means moves the support.
その場合、前記支持体は、回動軸を中心とする円周上に前記複数の測定ユニットを支持するターンテーブルであり、また前記駆動手段は、このターンテーブルを間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、この支持体を前記複数の測定ユニットの並び方向に間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。 In that case, the support body is a turntable that supports the plurality of measurement units on a circumference around a rotation axis, and the driving means rotates the turntable intermittently. It is desirable to be. Further, in this case, the support body is one that supports the plurality of measurement units arranged in a line in a straight line, and the support body is intermittently linear in the arrangement direction of the plurality of measurement units as the driving means. You may apply what is moved.
一方、上記とは反対に、前記支持体が静止状態に保たれるものであり、前記駆動手段が、前記光学系および光検出手段を移動させるものであっても構わない。 On the other hand, contrary to the above, the support may be kept stationary, and the drive means may move the optical system and the light detection means.
その場合、前記支持体は、円周上に前記複数の測定ユニットを支持するものであり、前記駆動手段は、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に回動させるものであることが望ましい。またこの場合、前記支持体として、前記複数の測定ユニットを直線的に１列に並べて支持するものを用い、前記駆動手段として、前記光学系および光検出手段を、前記支持体に支持された複数の測定ユニットに沿って間欠的に直線移動させるものを適用してもよい。 In that case, the support body supports the plurality of measurement units on a circumference, and the driving means places the optical system and the light detection means on the plurality of measurement units supported by the support body. It is desirable to rotate intermittently along. Further, in this case, the support body is one that supports the plurality of measurement units arranged in a line in a line, and the optical system and the light detection means are supported by the support body as the drive means. You may apply what moves linearly intermittently along this measurement unit.
他方、前記駆動手段が、その回動軸を支承するころがり軸受けを有するものである場合、この駆動手段は、該回動軸を一方向に回動させて前記複数の測定ユニットに対する一連の測定が終了したならば、この回動量と同量だけ該回動軸を他方向に戻してから、次回の一連の測定のためにこの回動軸を前記一方向に回動させるように構成されることが望ましい。 On the other hand, when the drive means has a rolling bearing that supports the rotation shaft, the drive means rotates the rotation shaft in one direction to perform a series of measurements on the plurality of measurement units. When completed, the rotation shaft is returned to the other direction by the same amount as the rotation amount, and then the rotation shaft is rotated in the one direction for the next series of measurements. Is desirable.
また上記の測定装置においては、前記複数の測定ユニットが連結部材により１列に連結されてユニット連結体を構成し、前記支持体が、このユニット連結体を支持するように構成されていることが望ましい。 Further, in the measurement apparatus, the plurality of measurement units are connected in a row by a connecting member to form a unit connection body, and the support body is configured to support the unit connection body. desirable.
また上記の測定装置においては、前記支持体に支持されている複数の測定ユニットの各試料保持機構に、自動的に所定の試料を供給する手段が設けられることが望ましい。 In the measurement apparatus, it is preferable that a means for automatically supplying a predetermined sample is provided to each sample holding mechanism of the plurality of measurement units supported by the support.
さらに上記の測定装置においては、前記測定ユニットの誘電体ブロックが前記支持体に固定され、測定ユニットの薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが上記誘電体ブロックに対して交換可能に形成されていることが望ましい。 Furthermore, in the measurement apparatus, the dielectric block of the measurement unit is fixed to the support, and the thin film layer of the measurement unit and the sample holding mechanism are integrated to form a measurement chip. It is desirable that the block is formed to be exchangeable.
そして、このような測定チップを適用する場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、前記誘電体ブロックと組み合う状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。 When such a measurement chip is applied, a cassette containing a plurality of the measurement chips, and a chip supply means for taking out the measurement chips one by one from the cassette and supplying the measurement chips in combination with the dielectric block are provided. It is desirable to be provided.
あるいは、測定ユニットの誘電体ブロック、薄膜層および試料保持機構が一体化されて測定チップを構成し、この測定チップが前記支持体に対して交換可能に形成されてもよい。 Alternatively, the dielectric block, the thin film layer, and the sample holding mechanism of the measurement unit may be integrated to form a measurement chip, and the measurement chip may be formed to be replaceable with respect to the support.
測定チップをそのような構成とする場合は、この測定チップを複数収納したカセットと、このカセットから測定チップを１つずつ取り出して、支持体に支持される状態に供給するチップ供給手段とが設けられることが望ましい。 When the measurement chip has such a configuration, a cassette in which a plurality of measurement chips are stored and chip supply means for taking out the measurement chips one by one from the cassette and supplying them in a state supported by the support are provided. It is desirable that
他方、前記光学系は、光ビームを誘電体ブロックに対して収束光あるいは発散光の状態で入射させるように構成され、そして前記光検出手段は、全反射した光ビームに存在する、全反射減衰による暗線の位置を検出するように構成されることが望ましい。 On the other hand, the optical system is configured to make the light beam incident on the dielectric block in the state of convergent light or divergent light, and the light detection means is present in the totally reflected light beam, and is attenuated by total reflection. It is desirable to be configured to detect the position of the dark line.
また上記光学系は、光ビームを前記界面にデフォーカス状態で入射させるものとして構成されることが望ましい。そのようにする場合、光ビームの上記界面における、前記支持体の移動方向のビーム径は、この支持体の機械的位置決め精度の１０倍以上とされることが望ましい。 The optical system is preferably configured to allow a light beam to enter the interface in a defocused state. In that case, it is desirable that the beam diameter in the moving direction of the support at the interface of the light beam be 10 times or more the mechanical positioning accuracy of the support.
さらに上記の測定装置において、測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光源は前記支持体より上の位置から下方に向けて前記光ビームを射出するように配設され、前記光学系は、前記下方に向けて射出された前記光ビームを上方に反射して、前記界面に向けて進行させる反射部材を備えていることが望ましい。 Furthermore, in the measurement apparatus, the measurement unit is supported above the support, the light source is disposed so as to emit the light beam downward from a position above the support, and the optical system includes It is desirable that a reflection member that reflects the light beam emitted toward the lower side to travel upward toward the interface is preferably provided.
また、上記の測定装置において、前記測定ユニットは前記支持体の上側に支持され、前記光学系は、前記光ビームを前記界面の下側から該界面に入射させるように構成され、前記光検出手段は前記支持体よりも上の位置で光検出面を下方に向けて配設されるとともに、前記界面で全反射した光ビームを上方に反射して、前記光検出手段に向けて進行させる反射部材が設けられることが望ましい。 In the measurement apparatus, the measurement unit is supported on an upper side of the support, and the optical system is configured to cause the light beam to enter the interface from a lower side of the interface. Is a reflecting member that is disposed at a position above the support so that the light detection surface faces downward, reflects the light beam totally reflected at the interface upward, and travels toward the light detection means. It is desirable to be provided.
他方、上記の測定装置においては、前記支持体に支持される前および／または支持された後の前記測定ユニットを、予め定められた設定温度に維持する温度調節手段が設けられることが望ましい。 On the other hand, in the above-described measuring apparatus, it is preferable that temperature adjusting means for maintaining the measuring unit at a predetermined set temperature before and / or after being supported by the support body is provided.
また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された測定ユニットの試料保持機構に貯えられた試料を、前記全反射減衰の状態を検出する前に撹拌する手段が設けられることが望ましい。 In the measurement apparatus, it is preferable that a means for stirring the sample stored in the sample holding mechanism of the measurement unit supported by the support before detecting the total reflection attenuation state is provided.
また、上記の測定装置においては、前記支持体に支持された複数の測定ユニットの少なくとも１つに、前記試料の光学特性と関連した光学特性を有する基準液を供給する基準液供給手段が設けられるとともに、前記光検出手段によって得られた、試料に関する前記全反射減衰の状態を示すデータを、前記基準液に関する前記全反射減衰の状態を示すデータに基づいて補正する補正手段が設けられることが望ましい。 In the measurement apparatus, a reference liquid supply unit that supplies a reference liquid having optical characteristics related to the optical characteristics of the sample is provided in at least one of the plurality of measurement units supported by the support. In addition, it is preferable that correction means for correcting the data indicating the total reflection attenuation state relating to the sample obtained by the light detection means based on the data indicating the total reflection attenuation state relating to the reference liquid is preferably provided. .
そのようにする場合、試料が被検体を溶媒に溶解させてなるものであるならば、前記基準液供給手段は、基準液として前記溶媒を供給するものであることが望ましい。 In that case, it is desirable that the reference liquid supply means supplies the solvent as a reference liquid if the sample is obtained by dissolving the analyte in the solvent.
さらに、上記の測定装置は、測定ユニットの各々に付与された、個体識別情報を示すマークと、測定に使用される測定ユニットから前記マークを読み取る読取手段と、測定ユニットに供給される試料に関する試料情報を入力する入力手段と、測定結果を表示する表示手段と、この表示手段、前記入力手段および前記読取手段に接続されて、各測定ユニット毎の前記個体識別情報と前記試料情報とを対応付けて記憶するとともに、ある測定ユニットに保持された試料について求められた測定結果を、その測定ユニットに関して記憶されている前記個体識別情報および前記試料情報と対応付けて前記表示手段に表示させる制御手段とを備えることが望ましい。 Further, the measuring apparatus includes a mark indicating individual identification information given to each measurement unit, reading means for reading the mark from the measurement unit used for measurement, and a sample relating to a sample supplied to the measurement unit An input means for inputting information, a display means for displaying a measurement result, and connected to the display means, the input means, and the reading means to associate the individual identification information and the sample information for each measurement unit And a control means for displaying the measurement result obtained for the sample held in a certain measurement unit on the display means in association with the individual identification information and the sample information stored for the measurement unit. It is desirable to provide.
上記した測定装置を用いて生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する場合、前記測定ユニットの１つにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出した後、前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、別の測定ユニットにおける試料に関して全反射減衰の状態を検出し、その後前記支持体と前記光学系および光検出手段とを相対移動させて、前記１つの測定ユニットにおける試料に関して、再度全反射減衰の状態を検出することにより測定を行うことができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
When detecting or measuring a substance that interacts with a physiologically active substance using the measurement apparatus described above, after detecting the state of total reflection attenuation with respect to the sample in one of the measurement units, the support, the optical system, and the light are detected. The detection means is moved relative to each other to detect the state of total reflection attenuation with respect to the sample in another measurement unit, and then the support, the optical system and the light detection means are moved relative to each other in the one measurement unit. Measurement can be performed on the sample by detecting the total reflection attenuation state again.
The following examples further illustrate the present invention, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
以下の実験は、特開２００１−３３０５６０号公報の図２２に記載の装置（以下、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置と呼ぶ）（本明細書において図１として示す）、及び同公報の図２３に記載の誘電体ブロック（以下、本発明の誘電体ブロックと呼ぶ）（本明細書において図２として示す）を用いて行った。 The following experiment was performed using the apparatus shown in FIG. 22 of Japanese Patent Laid-Open No. 2001-330560 (hereinafter referred to as the surface plasmon resonance measuring apparatus of the present invention) (shown as FIG. 1 in this specification), and FIG. 1 (hereinafter referred to as the dielectric block of the present invention) (shown as FIG. 2 in this specification).
図１に示す表面プラズモン共鳴測定装置は、測定ユニットを支持する支持体として、互いに平行に配された２本のガイドロッド400,400に摺動自在に係合し、それらに沿って図中の矢印Ｙ方向に直線移動自在とされたスライドブロック401が用いられている。そしてこのスライドブロック401には、上記ガイドロッド400,400と平行に配された精密ねじ402が螺合され、この精密ねじ402はそれとともに支持体駆動手段を構成するパルスモータ403によって正逆回転されるようになっている。
The surface plasmon resonance measuring apparatus shown in FIG. 1 slidably engages two
なおこのパルスモータ403の駆動は、モータコントローラ404によって制御される。すなわちモータコントローラ404には、スライドブロック401内に組み込まれてガイドロッド400,400の長手方向における該スライドブロック401の位置を検出するリニアエンコーダ（図示せず）の出力信号Ｓ40が入力され、モータコントローラ404はこの信号Ｓ40に基づいてパルスモータ403の駆動を制御する。
The driving of the
またガイドロッド400,400の側下方には、それに沿って移動するスライドブロック401をそれぞれ左右から挟む形で、レーザ光源31および集光レンズ32と、光検出器40とが配設されている。集光レンズ32は光ビーム30を集光する。また、光検出器40が設置されている。
A
ここで本実施形態においては、一例として８個の測定ユニット10を連結固定してなるスティック状のユニット連結体410が用いられ、測定ユニット10は８個一列に並べた状態でスライドブロック401にセットされるようになっている。
Here, in the present embodiment, as an example, a stick-like
図２は、このユニット連結体410の構造を詳しく示すものである。ここに示される通りユニット連結体410は、測定ユニット10が８個、連結部材411により連結されてなるものである。
FIG. 2 shows the structure of the
この測定ユニット10は、誘電体ブロック11と試料保持枠13とを例えば透明樹脂等から一体成形してなるものであり、ターンテーブルに対して交換可能な測定チップを構成している。交換可能とするためには、例えばターンテーブルに形成された貫通孔に、測定ユニット10を嵌合保持させる等すればよい。なお本例では、金属膜12の上にセンシング物質14が固定されている。
The
実施例１：測定チップの作製
（１）比較例：ヒドロゲルで被覆されていない測定チップの作製
金属膜として50nmの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分間処理した後、エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行った。このサンプルを金表面チップと呼ぶ。
Example 1: Production of measurement chip (1) Comparative example: Production of measurement chip not coated with hydrogel The dielectric block of the present invention in which 50 nm of gold was deposited as a metal film was applied to Model-208 UV-ozone cleaning system (TECHNOVISION). INC.) For 30 minutes, and then washed 5 times with ethanol, once with an ethanol / water mixed solvent, and 5 times with water. This sample is called a gold surface chip.
（２）有機低分子化合物（本文中のＸ−Ｒ−Ｙに相当）を介してヒドロゲルで被覆された測定チップの作成
金属膜として50nmの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分間処理した後、エタノール／水（80/20）で溶解した11−ヒドロキシ-1-ウンデカンチオールの5.0mM溶液を金属膜に接触するように添加し、25℃で18時間表面処理を行った。その後、エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行った。
(2) Preparation of measurement chip coated with hydrogel via low molecular weight organic compound (corresponding to X-R-Y in this text) The dielectric block of the present invention in which 50 nm gold is deposited as a metal film is model- After treatment with 208 UV-ozone cleaning system (TECHNOVISION INC.) For 30 minutes, add 5.0 mM solution of 11-hydroxy-1-undecanethiol dissolved in ethanol / water (80/20) to contact the metal film. Surface treatment was performed at 25 ° C. for 18 hours. Thereafter, washing was performed 5 times with ethanol, once with an ethanol / water mixed solvent, and 5 times with water.
次に、11−ヒドロキシ-1-ウンデカンチオールで被覆した表面に10重量%のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：0.4M水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの1：1混合溶液）を接触させ、25℃の振盪インキュベーター中で4時間反応を進行させた。その後表面をエタノールで2回、水で5回洗浄した。次に、25重量%のデキストラン（T500,Pharmacia）水溶液40.5mlに4.5mlの1M水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で25℃で20時間インキュベートした。表面を50℃の水で10回洗浄した。続いて、ブロモ酢酸3.5gを27gの2M水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、28℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を１回繰り返した。このサンプルをヒドロゲル被覆チップ１と呼ぶ。 Next, a 10% by weight epichlorohydrin solution (solvent: 1: 1 mixed solution of 0.4 M sodium hydroxide and diethylene glycol dimethyl ether) was brought into contact with the surface coated with 11-hydroxy-1-undecanthiol, and 25 ° C. The reaction was allowed to proceed for 4 hours in a shaking incubator. Thereafter, the surface was washed twice with ethanol and five times with water. Next, 4.5 ml of 1 M sodium hydroxide was added to 40.5 ml of a 25 wt% aqueous dextran (T500, Pharmacia) solution and the solution was contacted on the epichlorohydrin treated surface. It was then incubated for 20 hours at 25 ° C. in a shaking incubator. The surface was washed 10 times with 50 ° C. water. Subsequently, a mixture of 3.5 g of bromoacetic acid dissolved in 27 g of 2M sodium hydroxide solution was brought into contact with the dextran-treated surface and incubated for 16 hours in a shaking incubator at 28 ° C. The surface was washed with water and then the above procedure was repeated once. This sample is referred to as a hydrogel-coated tip 1.
（３）疎水性高分子膜を介してヒドロゲルで被覆された測定チップの作成
金属膜として50nmの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分間処理した後、0.5mg/mlのポリスチレンのメチルエチルケトン溶液5μｌを金属膜に接触するように添加し、5℃で15分間静置した。溶媒が蒸発することで、約100オングストロームのポリスチレン薄膜が作成できた。
(3) Preparation of measurement chip covered with hydrogel through hydrophobic polymer film Dielectric block of the present invention in which gold of 50 nm is deposited as a metal film is modeled by Model-208 UV-ozone cleaning system (TECHNOVISION INC.). After the treatment for 30 minutes, 5 μl of 0.5 mg / ml polystyrene methyl ethyl ketone solution was added so as to contact the metal film, and the mixture was allowed to stand at 5 ° C. for 15 minutes. As the solvent evaporated, a polystyrene thin film of about 100 angstroms could be produced.
さらに、ホルムアルデヒド（17.5%）と酢酸（1M）の混合液100μｌをポリスチレン薄膜に接触するように添加し、25℃で8時間静置し、その後エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行った。この操作により、ポリスチレン薄膜表面に存在するベンゼン環に-CH2OH基が導入される。 Furthermore, 100 μl of a mixed solution of formaldehyde (17.5%) and acetic acid (1M) was added so as to come into contact with the polystyrene thin film, allowed to stand at 25 ° C. for 8 hours, and then 5 times with ethanol and once with an ethanol / water mixed solvent. Washed 5 times with water. By this operation, a —CH 2 OH group is introduced into the benzene ring present on the surface of the polystyrene thin film.
この表面に、10重量%のエピクロロヒドリン溶液（溶媒：0.4M水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの1：1混合溶液）を接触させ、25℃の振盪インキュベーター中で4時間反応を進行させ、その後表面をエタノールで2回、水で5回洗浄した。次に、25重量%のデキストラン（T500,Pharmacia）水溶液40.5mlに4.5mlの1M水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で25℃で20時間インキュベートした。表面を50℃の水で10回洗浄した。続いて、ブロモ酢酸3.5gを27gの2M水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、28℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を１回繰り返した。このサンプルをヒドロゲル被覆チップ２と呼ぶ。 This surface was brought into contact with a 10% by weight epichlorohydrin solution (solvent: 1: 1 mixed solution of 0.4M sodium hydroxide and diethylene glycol dimethyl ether), and the reaction was allowed to proceed for 4 hours in a shaking incubator at 25 ° C. The surface was washed twice with ethanol and five times with water. Next, 4.5 ml of 1 M sodium hydroxide was added to 40.5 ml of a 25 wt% aqueous dextran (T500, Pharmacia) solution and the solution was contacted on the epichlorohydrin treated surface. It was then incubated for 20 hours at 25 ° C. in a shaking incubator. The surface was washed 10 times with 50 ° C. water. Subsequently, a mixture of 3.5 g of bromoacetic acid dissolved in 27 g of 2M sodium hydroxide solution was brought into contact with the dextran-treated surface and incubated for 16 hours in a shaking incubator at 28 ° C. The surface was washed with water and then the above procedure was repeated once. This sample is referred to as a hydrogel-coated tip 2.
（４）有機低分子化合物（本文中のＸ−Ｒ−Ｙに相当）で被覆された測定チップの作成
金属膜として50nmの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分間処理した後、エタノール／水（80/20）で溶解した11−ヒドロキシ-1-ウンデカンチオールの5.0mM溶液を金属膜に接触するように添加し、25℃で18時間表面処理を行った。その後、エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行った。このサンプルをＳＡＭ被覆チップと呼ぶ。
(4) Preparation of measurement chip coated with organic low molecular weight compound (corresponding to X-R-Y in the text) Model-208 UV-ozone cleaning of dielectric block of the present invention in which 50 nm gold is deposited as metal film After treatment with the system (TECHNOVISION INC.) For 30 minutes, a 5.0 mM solution of 11-hydroxy-1-undecanthiol dissolved in ethanol / water (80/20) was added so as to come into contact with the metal film, and at 25 ° C. Surface treatment was performed for 18 hours. Thereafter, washing was performed 5 times with ethanol, once with an ethanol / water mixed solvent, and 5 times with water. This sample is called a SAM coated chip.
実施例２：測定チップの性能評価：
各測定用チップにAnti-Human IL-6（PIERCE社製）を固定化し、Human IL-6（Pepro Tech EC社製）との抗原抗体反応の測定を行った。
Example 2: Performance evaluation of measurement chip:
Anti-Human IL-6 (manufactured by PIERCE) was immobilized on each measurement chip, and antigen-antibody reaction with Human IL-6 (manufactured by Pepro Tech EC) was measured.
（１）Anti-Human IL-6の固定化
金表面チップ（実施例１−（１）の方法で作製）、ヒドロゲル被覆チップ１（実施例１−（２）の方法で作製）、ヒドロゲル被覆チップ２（実施例１−（３）の方法で作製）、並びにＳＡＭ被覆チップ（実施例１−（４）の方法で作製）に、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液を添加し、２０分間静置後、50mM酢酸バッファー（pH4.5、ビアコア社製）で洗浄した。次に、Anti-Human IL-6溶液（１００μｇ／ｍｌ、50mM酢酸バッファー、pH4.5）を添加し、３０分静置後、50mM酢酸バッファー(pH4.5)で洗浄した。
(1) Immobilization of Anti-Human IL-6 Gold surface chip (produced by the method of Example 1- (1)), hydrogel-coated chip 1 (produced by the method of Example 1- (2)), hydrogel-coated chip 2 (prepared by the method of Example 1- (3)) and SAM-coated chip (prepared by the method of Example 1- (4)) and 1-ethyl-2,3-dimethylaminopropylcarbodiimide (400 mM) and A mixed solution with N-hydroxysuccinimide (100 mM) was added, allowed to stand for 20 minutes, and then washed with 50 mM acetate buffer (pH 4.5, manufactured by Biacore). Next, an Anti-Human IL-6 solution (100 μg / ml, 50 mM acetate buffer, pH 4.5) was added, left standing for 30 minutes, and then washed with 50 mM acetate buffer (pH 4.5).
さらに、エタノールアミン・HCl溶液（１M、ｐH8.5）を各測定チップに添加後、50mM酢酸バッファー(pH4.5)で洗浄することにより、Anti-Human IL-6と反応せずに残存したCOOH基をブロックした。 Furthermore, after adding ethanolamine / HCl solution (1M, pH8.5) to each measurement chip, it was washed with 50mM acetic acid buffer (pH4.5), thereby remaining COOH without reacting with Anti-Human IL-6. Blocked the group.
以上の操作により、Anti-Human IL-6を各測定チップ表面に共有結合で固定化した。Anti-Human IL-6の添加前と洗浄後の共鳴シグナル（RU値）変化量をAnti-Human IL-6の固定化量（RU値）とした。以上の実験を5回繰り返し、固定化量の平均値、CV値（CV値（％）＝（標準偏差/平均値）×１００であり、この数値が小さいほどばらつきが少なく、性能が良好であることを示す。）を算出した。 Through the above operation, Anti-Human IL-6 was immobilized on each measurement chip surface by a covalent bond. The amount of change in resonance signal (RU value) before addition of Anti-Human IL-6 and after washing was defined as the amount of immobilized Anti-Human IL-6 (RU value). The above experiment was repeated 5 times, and the average value of the immobilization amount, CV value (CV value (%) = (standard deviation / average value) × 100). The smaller this value, the less the variation and the better the performance. Calculated).
（２）固定化したAnti-Human IL-6に対するIL-6の結合測定
各測定チップをHBS-Nバッファーで洗浄後、本発明の表面プラズモン共鳴測定装置に設置し、IL-6溶液（１μｇ／ｍｌ、HBS-Nバッファー）を各測定チップに添加し、１２０分間静置後、HBS-Nバッファーで洗浄した。IL-6の添加前と洗浄後の共鳴シグナル（RU値）変化量をAnti-Human IL-6に対するIL-6の結合量とした。以上の実験を5回繰り返し、固定化量の平均値、CV値を算出した。なお、上記で用いたHBS-Nバッファーの組成は、ＨＥＰＥＳ（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid）0.01mol/l（ｐＨ7.4）、ＮａＣｌ0.15mol/lである。
(2) Measurement of IL-6 binding to immobilized Anti-Human IL-6 After each measurement chip was washed with an HBS-N buffer, it was placed on the surface plasmon resonance measurement apparatus of the present invention, and an IL-6 solution (1 μg / ml, HBS-N buffer) was added to each measurement chip, allowed to stand for 120 minutes, and then washed with HBS-N buffer. The amount of resonance signal (RU value) change before and after the addition of IL-6 was defined as the amount of IL-6 binding to Anti-Human IL-6. The above experiment was repeated 5 times, and the average value of the immobilization amount and the CV value were calculated. The composition of the HBS-N buffer used above is HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic Acid) 0.01 mol / l (pH 7.4) and NaCl 0.15 mol / l.
（３）結果
表1にAnti-Human IL-6固定化の測定結果を、表２にIL-6結合反応の測定結果を示す。
(3) Results Table 1 shows the measurement results of Anti-Human IL-6 immobilization, and Table 2 shows the measurement results of IL-6 binding reaction.
表１の結果から、本発明の測定チップにより、リガンド蛋白質を再現よく多量に固定化できることがわかる。また、表２の結果から、検体の結合に対応するSPR信号の再現性も極めて良好であることがわかる。本発明により、リガンド蛋白質の固定化量、および検体との結合量の再現性に優れた表面プラズモン共鳴測定装置用の測定チップを提供することが可能になった。 From the results in Table 1, it can be seen that a large amount of ligand protein can be reproducibly immobilized with the measuring chip of the present invention. In addition, it can be seen from the results in Table 2 that the reproducibility of the SPR signal corresponding to the binding of the specimen is very good. According to the present invention, it has become possible to provide a measurement chip for a surface plasmon resonance measuring apparatus that is excellent in reproducibility of the amount of ligand protein immobilized and the amount bound to a specimen.
１０ 測定ユニット
１１ 誘電体ブロック
１２ 金属膜
１３ 試料保持枠
１４ センシング物質
３１ レーザ光源
３２ 集光レンズ
４０ 光検出器
Ｓ４０ 出力信号
４００ ガイドロッド
４０１ スライドブロック
４０２ 精密ねじ
４０３ パルスモータ
４０４ モータコントローラ
４１０ ユニット連結体
４１１ 連結部材
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