JP4280820B2 - Method for producing O-phosphoserine and novel serine phosphotransferase - Google Patents
Method for producing O-phosphoserine and novel serine phosphotransferase Download PDFInfo
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Description
本発明は、Ｏ−ホスホセリンの製造方法に関する。より詳細には、ＡＴＰをリン酸供与体として使用して、セリンからＯ−ホスホセリンを製造する方法に関する。更に本発明は、ヌクレオチド、特にＡＴＰをリン酸供与体としてセリンからＯ−ホスホセリンを合成する新規なセリンホスホトランスフェラーゼに関する。 The present invention relates to a method for producing O-phosphoserine. More specifically, it relates to a method for producing O-phosphoserine from serine using ATP as a phosphate donor. The present invention further relates to a novel serine phosphotransferase that synthesizes O-phosphoserine from serine using nucleotides, particularly ATP, as a phosphate donor.
Ｏ−ホスホセリンは、しみ・そばかすなどの色素沈着改善作用があるシステインや去痰作用があるカルボシステイン（システイン誘導体）の原料化合物として知られている。 O-phosphoserine is known as a raw material compound of cysteine having a pigmentation-improving action such as stains and freckles and carbocysteine (cysteine derivative) having an expectorant action.
従来、Ｏ−ホスホセリンの酵素的な合成としては、Propionibacterium shermanii由来
の酵素を、ピロリン酸をリン酸供与体としてセリンに作用させる方法が知られている（下反応式参照）。しかしながら、当該酵素を使用する反応において、リン酸供与体としてピロリン酸の代わりにヌクレオチド（例えばＡＴＰ）を使用すると、Ｏ−ホスホセリンは生成しない。
また、タンパク質中のセリン残基をＡＴＰ存在下でリン酸化する酵素が知られているが、この酵素では遊離しているセリンに対しては反応性を示さないことが分かっている。 In addition, an enzyme that phosphorylates a serine residue in a protein in the presence of ATP is known, but it has been found that this enzyme does not react with free serine.
一方、ＡＴＰをリン酸供与体としてホモセリンからＯ−ホスホホモセリンを合成する酵素として、ホモセリンキナーゼが知られているが、当該酵素は基質としてセリンを使用することができない。 On the other hand, homoserine kinase is known as an enzyme that synthesizes O-phosphohomoserine from homoserine using ATP as a phosphate donor, but the enzyme cannot use serine as a substrate.
このように、ヌクレオチドをリン酸供与体として、セリンからＯ−ホスホセリンを酵素反応により合成することは、これまでに知られていない。
そこで本発明の目的は、従来にない新たな方法でＯ−ホスホセリンを製造する方法を提供することである。より詳細には、本発明は、ヌクレオチド、特にＡＴＰをリン酸供与体として、セリンからＯ−ホスホセリンを酵素反応によって製造する方法を提供することを目的とする。更に本発明は、ヌクレオチド、特にＡＴＰをリン酸供与体としてセリンからＯ−ホスホセリンを合成する酵素を提供することを目的とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing O-phosphoserine by a new method that has not been conventionally used. More specifically, an object of the present invention is to provide a method for producing O-phosphoserine from serine by enzymatic reaction using nucleotide, particularly ATP, as a phosphate donor. A further object of the present invention is to provide an enzyme that synthesizes O-phosphoserine from serine using a nucleotide, particularly ATP, as a phosphate donor.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、ヌクレオチド、特にＡＴＰ
をリン酸供与体としてセリンからＯ−ホスホセリンを合成する酵素（以下、これをセリンホスホトランスフェラーゼという）を新たに見出し、該酵素を用いることにより、従来にない新たな方法でＯ−ホスホセリンを製造できることを確認した。本発明はかかる知見に基づいて、更に検討を重ねて完成されたものである。
The inventors of the present invention have intensively studied to solve the above-mentioned problems.
A new enzyme that synthesizes O-phosphoserine from serine (hereinafter referred to as serine phosphotransferase) using phosphine as a phosphate donor, and by using this enzyme, O-phosphoserine can be produced by a new method that has not been used before It was confirmed. The present invention has been completed based on these findings and further studies.
即ち、本発明は、下記に掲げるＯ−ホスホセリンの製造方法を提供する。
項１． ヌクレオチドの存在下でセリンに、セリンホスホトランスフェラーゼを作用させて、Ｏ−ホスホセリンを生成させることを特徴とする、Ｏ−ホスホセリンの製造方法。
項２． ヌクレオチドがＡＴＰである、項１に記載の製造方法。
項３． 該セリンホスホトランスフェラーゼとして、該セリンホスホトランスフェラーゼを産生する微生物の菌体処理物、粗酵素、又は精製酵素を作用させる、項１又は２に記載の製造方法。
項４． 該微生物が、アエロパイラム属に属する微生物である、項３に記載の製造方法。項５． 該微生物が、アエロパイラム・ペルニックスである、項４に記載の製造方法。
That is, the present invention provides the following methods for producing O-phosphoserine.
Item 1. A method for producing O-phosphoserine, wherein serine phosphotransferase is allowed to act on serine in the presence of nucleotides to produce O-phosphoserine.
Item 2. Item 2. The production method according to Item 1, wherein the nucleotide is ATP.
Item 3. Item 3. The production method according to Item 1 or 2, wherein a treated product of a microorganism, a crude enzyme, or a purified enzyme of a microorganism that produces the serine phosphotransferase is allowed to act as the serine phosphotransferase.
Item 4. Item 4. The production method according to Item 3, wherein the microorganism belongs to the genus Aeropyram. Item 5. Item 5. The production method according to Item 4, wherein the microorganism is Aeropyram pernicus.
更に、本発明は、下記に掲げるセリンホスホトランスフェラーゼを提供する。
項６． ヌクレオチドをリン酸供与体としてセリンからＯ−ホスホセリンを合成する、セリンホスホトランスフェラーゼ。
項７． ヌクレオチドがＡＴＰである、項６に記載のセリンホスホトランスフェラーゼ。項８． アエロパイラム属に属する微生物に由来する、項６又は７に記載のセリンホスホトランスフェラーゼ。
項９． アエロパイラム・ペルニックスに由来する、項６又は７に記載のセリンホスホトランスフェラーゼ。
Furthermore, the present invention provides serine phosphotransferases listed below.
Item 6. Serine phosphotransferase that synthesizes O-phosphoserine from serine using a nucleotide as a phosphate donor.
Item 7. Item 7. The serine phosphotransferase according to Item 6, wherein the nucleotide is ATP. Item 8. Item 8. The serine phosphotransferase according to Item 6 or 7, which is derived from a microorganism belonging to the genus Aeropyram.
Item 9. Item 8. The serine phosphotransferase according to Item 6 or 7, which is derived from Aeropyram pernicus.
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
本発明のセリンホスホトランスフェラーゼは、ヌクレオチドをリン酸供与体として利用してセリンをリン酸化して、Ｏ−ホスホセリンを合成する酵素である（下反応式参照；該式には、ヌクレオチドとしてＡＴＰを用いた場合の反応式を示す）。
当該セリンホスホトランスフェラーゼとしては、アエロパイラム（Aeropyrum）属に属
する微生物が産生する酵素が挙げられる。当該酵素として、より具体的には、アエロパイラム・ペルニックス（Aeropyrum pernix）（JCM 9820）が産生する酵素を例示できる。
Examples of the serine phosphotransferase include enzymes produced by microorganisms belonging to the genus Aeropyrum. More specifically, examples of the enzyme include an enzyme produced by Aeropyrum pernix (JCM 9820).
当該セリンホスホトランスフェラーゼは、上記微生物を通常の方法で培養することによって得ることができる。培養は液体培養であっても、或いは固体培養であってもよい。培養に使用する培地としては、当該微生物が良好に生育して該セリンホスホトランスフェラーゼを産生する適当な培地であれば特に制限されず、適当な炭素源、窒素源、無機塩、その他栄養源を含有する合成培地或いは天然培地を使用することができる。例えば、培地の炭素源としては、グルコース、スクロース、フラクトース、マルトース、グリセリン、デキストリン、オリゴ糖、デンプン、糖蜜、コーンスティープリカー、麦芽エキス、有機酸
等が挙げられる。また、窒素源としては、コーンスティープリカー、酵母エキス、各種ペプトン、大豆粉、肉エキス、フスマエキス、カゼイン、アミノ酸及び尿素等の有機窒素源、硝酸塩、アンモニウム塩等の無機窒素源等が挙げられる。無機塩類としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩及びその他の金属塩等が挙げられる。更に、その他の栄養源としては、ビタミン類、アミノ酸類、核酸類等が挙げられる。培養は、静置培養または通気撹拌培養などで行われる。培養温度は使用する微生物の種類によって異なるが、通常６０〜１００℃、好ましくは８０〜１００℃を例示できる。培養中、培地のｐＨが５〜９、好ましくは６〜８の範囲となるように、ｐＨ調整することが望ましい。培養時間は、通常１〜７日、好ましくは２〜５日である。
The serine phosphotransferase can be obtained by culturing the above microorganisms by a usual method. The culture may be liquid culture or solid culture. The medium used for the culture is not particularly limited as long as the microorganism grows well and produces the serine phosphotransferase, and contains an appropriate carbon source, nitrogen source, inorganic salt, and other nutrient sources. Synthetic media or natural media can be used. For example, examples of the carbon source of the medium include glucose, sucrose, fructose, maltose, glycerin, dextrin, oligosaccharide, starch, molasses, corn steep liquor, malt extract, organic acid and the like. Examples of nitrogen sources include corn steep liquor, yeast extract, various peptones, soybean flour, meat extract, bran extract, organic nitrogen sources such as casein, amino acids and urea, and inorganic nitrogen sources such as nitrates and ammonium salts. Examples of inorganic salts include sodium salts, potassium salts, magnesium salts, iron salts, and other metal salts. Further, other nutrient sources include vitamins, amino acids, nucleic acids and the like. The culture is performed by static culture or aeration-agitation culture. Although culture | cultivation temperature changes with kinds of microorganisms to be used, normally 60-100 degreeC, Preferably 80-100 degreeC can be illustrated. During the culture, it is desirable to adjust the pH so that the pH of the medium is in the range of 5 to 9, preferably 6 to 8. The culture time is usually 1 to 7 days, preferably 2 to 5 days.
本発明では、上記セリンホスホトランスフェラーゼとして、前記のようにして得られる培養物から回収した上記微生物の菌体処理物をそのまま使用してもよいし、該微生物から単離した粗酵素又は精製酵素を使用してもよい。該菌体処理物としては、具体的には、超音波破砕物、機械的摩砕処理物、機械的圧力処理物、菌体のタンパク質画分等が挙げられる。該菌体処理物の一態様として、超音波破砕物の水溶性画分を硫安沈殿した後、透析することによって得られる菌体処理物を挙げることができる。また、該粗酵素又は精製酵素は、上記菌体処理物を通常酵素精製に用いられる方法、例えば塩析、有機溶媒沈殿、透析、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過または凍結乾燥等の方法により得ることができる。 In the present invention, as the serine phosphotransferase, a treated product of the microorganism recovered from the culture obtained as described above may be used as it is, or a crude enzyme or purified enzyme isolated from the microorganism may be used. May be used. Specific examples of the microbial cell treated product include an ultrasonic pulverized product, a mechanically milled product, a mechanical pressure treated product, and a microbial cell protein fraction. As one embodiment of the treated cell product, a treated cell product obtained by dialyzing the water-soluble fraction of the ultrasonic crushed material after ammonium sulfate precipitation can be exemplified. In addition, the crude enzyme or purified enzyme is obtained by a method generally used for enzyme purification of the above-mentioned processed bacterial cell product, such as salting out, organic solvent precipitation, dialysis, ion exchange column chromatography, gel filtration, or freeze drying. be able to.
また、上記セリンホスホトランスフェラーゼとして、上記菌体処理物、粗酵素又は精製酵素を適当な担体に固定化した固定化酵素を使用してもよい。 In addition, as the serine phosphotransferase, an immobilized enzyme obtained by immobilizing the treated microbial cell product, crude enzyme, or purified enzyme on an appropriate carrier may be used.
なお、上記セリンホスホトランスフェラーゼは、遺伝子組み換え技術を利用して調製した酵素であってもよい。 The serine phosphotransferase may be an enzyme prepared using a gene recombination technique.
なお、アエロパイラム・ペルニックスは、ＤＮＡの全配列が明らかにされている。従って、アエロパイラム・ペルニックスが産生する該セリンホスホトランスフェラーゼのＮ末端側及びＣ末端側の一部のアミノ酸配列を同定し、そのデータをアエロパイラム・ペルニックスのＤＮＡの全配列に照合させることにより、該酵素をコードするＤＮＡ配列及びそのアミノ酸全配列を同定できる。これによって該酵素及びこれをコードするＤＮＡを取得することが可能である。 Aeropiram Pernics has revealed the entire DNA sequence. Therefore, by identifying the partial amino acid sequences of the N-terminal side and C-terminal side of the serine phosphotransferase produced by Aeropyram pernicus and collating the data with the entire sequence of the DNA of Aeropyram pernicus, The encoding DNA sequence and its entire amino acid sequence can be identified. This makes it possible to obtain the enzyme and the DNA encoding it.
本発明で使用するセリンは、Ｄ体、Ｌ体の別を問うものではないが、好ましくはＬ−セリンである。 The serine used in the present invention does not ask whether the D-form or L-form is used, but is preferably L-serine.
上記セリンホスホトランスフェラーゼのリン酸供与体は、ヌクレオチドをリン酸供与体として利用する。当該ヌクレオチドとしては、特に制限されないが、一例として、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＤＰ、ＧＤＰ等を挙げることができる。これらの中で好ましくはＡＴＰである。 The serine phosphotransferase phosphate donor uses nucleotides as phosphate donors. The nucleotide is not particularly limited, and examples thereof include ATP, ADP, UTP, GTP, CTP, UDP, GDP and the like. Of these, ATP is preferred.
本発明のＯ−ホスホセリンの製造では、ヌクレオチドの存在下で、セリンに上記セリンホスホトランスフェラーゼを作用させて、Ｏ−ホスホセリンを生成させる。Ｏ−ホスホセリンを生成させる反応は水性溶媒中で行われる。反応時の水性溶媒のｐＨとしては、使用する酵素の特性に応じて適宜設定すればよいが、例えば、６．５〜９、好ましくは７〜８．２、更に好ましくは７．５程度となる範囲を挙げることができる。 In the production of O-phosphoserine according to the present invention, the serine phosphotransferase is allowed to act on serine in the presence of nucleotides to produce O-phosphoserine. The reaction for producing O-phosphoserine is carried out in an aqueous solvent. The pH of the aqueous solvent at the time of reaction may be appropriately set according to the characteristics of the enzyme used, and is, for example, 6.5 to 9, preferably 7 to 8.2, more preferably about 7.5. A range can be mentioned.
本発明のＯ−ホスホセリンの製造において、セリンは、水性溶媒中の初期濃度が、通常５〜１００ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭ、更に好ましくは１０ｍＭ程度となるように、水性溶媒に添加すればよい。 In the production of O-phosphoserine of the present invention, serine may be added to the aqueous solvent so that the initial concentration in the aqueous solvent is usually 5 to 100 mM, preferably 5 to 20 mM, more preferably about 10 mM.
また、リン酸供与体として使用するヌクレオチドは、該ヌクレオチドの種類によっても異なるが、種類水性溶媒中の初期濃度が、通常５〜１００ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭ、更に好ましくは１０ｍＭ程度となるように、水性溶媒に添加すればよい。 The nucleotide used as the phosphate donor varies depending on the type of the nucleotide, but the initial concentration in the type aqueous solvent is usually 5 to 100 mM, preferably 5 to 20 mM, more preferably about 10 mM. What is necessary is just to add to an aqueous solvent.
上記セリンホスホトランスフェラーゼは、水性溶媒中に、例えば０．００５〜０．２Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜０．１Ｕ／ｍｌ、更に好ましくは０．０１〜０．０２Ｕ／ｍｌとなるように添加して用いられる。なお、セリンホスホトランスフェラーゼの活性は、０．３ｍｌのHepes緩衝液（ｐＨ 7.5）を溶媒として、１０ｍＭセリン及び１０ｍＭ ＡＴＰ存在下で、８０℃で１分間反応を行った場合に、１μmolのホスホセリンを生成する
酵素活性を１Ｕとして表示する。
The serine phosphotransferase is, for example, 0.005 to 0.2 U / ml, preferably 0.01 to 0.1 U / ml, more preferably 0.01 to 0.02 U / ml in an aqueous solvent. Used by adding. The serine phosphotransferase activity is 1 μmol of phosphoserine when reacted at 80 ° C. for 1 minute in the presence of 10 mM serine and 10 mM ATP using 0.3 ml of Hepes buffer (pH 7.5) as a solvent. Is expressed as 1U.
本発明のＯ−ホスホセリンの製造において、水性溶媒には、必要に応じて各種キレート剤、界面活性剤及び有機溶媒等を添加してもよい。 In the production of O-phosphoserine according to the present invention, various chelating agents, surfactants, organic solvents and the like may be added to the aqueous solvent as necessary.
上記セリンホスホトランスフェラーゼを作用させる際の反応温度は、該酵素の特性に応じて、適宜設定することができるが、通常６０〜９５℃、好ましくは７０〜９５℃、更に好ましくは８０〜９０℃を挙げることができる。 The reaction temperature when the serine phosphotransferase is allowed to act can be appropriately set according to the properties of the enzyme, but is usually 60 to 95 ° C, preferably 70 to 95 ° C, more preferably 80 to 90 ° C. Can be mentioned.
反応時間としては、例えば１〜２４時間、好ましくは２〜５時間、更に好ましくは２〜３時間を挙げることができる。 Examples of the reaction time include 1 to 24 hours, preferably 2 to 5 hours, and more preferably 2 to 3 hours.
上記の如く上記セリンホスホトランスフェラーゼをセリン及びヌクレオチドに作用させることにより、Ｏ−ホスホセリンを水性溶媒中に蓄積をさせることができる。 As described above, by acting the serine phosphotransferase on serine and nucleotides, O-phosphoserine can be accumulated in an aqueous solvent.
本発明のＯ−ホスホセリンの製造では、ヌクレオチドの存在下で、セリンに上記セリンホスホトランスフェラーゼを作用させて酵素反応を行うことにより、Ｏ−ホスホセリンを反応液中に蓄積をさせることができる。 In the production of O-phosphoserine according to the present invention, O-phosphoserine can be accumulated in the reaction solution by causing the serine phosphotransferase to act on serine in the presence of nucleotides to carry out an enzymatic reaction.
得られたＯ−ホスホセリンの分離、精製は、イオン交換樹脂による処理、膜処理、有機溶媒による沈澱濃縮等の公知の方法により行うことができる。 Separation and purification of the obtained O-phosphoserine can be performed by a known method such as treatment with an ion exchange resin, membrane treatment, or precipitation concentration with an organic solvent.
本発明のＯ−ホスホセリンの製造方法によれば、リン酸供与体としてヌクレオチド、好適にはＡＴＰを利用して、セリンからＯ−ホスホセリンを製造することができる。本発明は、従来にない新たな手法で、Ｏ−ホスホセリンを製造する方法を提供するものである。 According to the method for producing O-phosphoserine of the present invention, O-phosphoserine can be produced from serine using a nucleotide, preferably ATP, as a phosphate donor. The present invention provides a method for producing O-phosphoserine by a novel technique that has not been conventionally used.
本発明の方法は、リン酸供与体としてヌクレオチドを利用するため、菌体破砕後の核酸の分解物を原料として用いることができるといった点で利点がある。また、リン酸供与体として、ＡＴＰを使用する系では、菌体内においてＡＴＰ再生系酵素と共役して、ＡＴＰを再合成することができるという点でも有用である。 Since the method of the present invention uses nucleotides as phosphate donors, there is an advantage in that a degradation product of nucleic acid after disrupting cells can be used as a raw material. In addition, a system using ATP as a phosphate donor is also useful in that ATP can be re-synthesized by coupling with an ATP regeneration system enzyme in the microbial cells.
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１
（１）アエロパイラム・ペルニックス菌体処理物の調製
アエロパイラム・ペルニックス（JCM 9820）を１Ｌ当たり37.4gのMarine broth2216と
１gのチオ硫酸塩を含有する液体培地に植菌し、９０℃で５０時間、通気攪拌培養を行っ
た。得られた培養液から、遠心分離により菌体を回収し、該菌体１ｇ（湿潤重量）を８０
ｍｌのバッファーＡ（５０ｍＭ Hepes-NaOH、０．２ｍＭピリドキサールリン酸、ｐＨ７
．５）に懸濁した。これを超音波破砕した後、遠心分離により、固形分を除去し、得られた上清に８０％となるように硫安を添加し、沈殿を生成させた。生じた沈殿を遠心分離により回収し、４ｍｌのバッファーＡに溶解してバッファーＡに対して透析を行い、得られた溶液をアエロパイラム・ペルニックス菌体処理物とした。得られた菌体処理物（液体状）は、０．００４４Ｕ／ｍｇのセリンホスホトランスフェラーゼ酵素活性を有していた。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is shown and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these Examples.
Example 1
(1) Preparation of Aeropyram pernicus treated product Aeropyram pernicus (JCM 9820) is inoculated into a liquid medium containing 37.4g Marine broth2216 and 1g thiosulfate per liter, and aerated at 90 ° C for 50 hours. Stirring culture was performed. The bacterial cells are collected from the obtained culture broth by centrifugation, and 1 g (wet weight) of the bacterial cells is added to 80%.
ml of buffer A (50 mM Hepes-NaOH, 0.2 mM pyridoxal phosphate, pH 7
. It was suspended in 5). After ultrasonically crushing this, the solid content was removed by centrifugation, and ammonium sulfate was added to the resulting supernatant to 80% to produce a precipitate. The resulting precipitate was collected by centrifugation, dissolved in 4 ml of buffer A, dialyzed against buffer A, and the resulting solution was treated with Aeropyram pernicus cells. The obtained microbial cell processed product (liquid state) had a serine phosphotransferase enzyme activity of 0.0044 U / mg.
（２）Ｏ−ホスホセリンの製造
０．３ｍｌの水性溶媒（０．１Ｍ Hepes-NaOH、０．２ｍＭピリドキサールリン酸、ｐ
Ｈ７．５）に、Ｌ−セリンを１０ｍＭ、ＡＴＰを１０ｍＭ、ＭｇＣｌ2を２ｍＭ、及びア
エロパイラム・ペルニックス菌体処理物を４ｍｇ／ｍｌとなるように添加して、８０℃で２時間反応を行った。得られた反応液中のＯ−ホスホ−Ｌ−セリンをアミノ酸分析計によって分析した結果、反応液中にＯ−ホスホ−Ｌ−セリンが２．１ｍＭの濃度で蓄積していることが明らかとなった。
(2) Production of O-phosphoserine 0.3 ml of aqueous solvent (0.1 M Hepes-NaOH, 0.2 mM pyridoxal phosphate, p
H7.5) was added with L-serine 10 mM, ATP 10 mM, MgCl 2 2 mM, and Aeropyram pernicus cells treated to 4 mg / ml, and reacted at 80 ° C. for 2 hours. . As a result of analyzing the O-phospho-L-serine in the obtained reaction solution with an amino acid analyzer, it became clear that O-phospho-L-serine was accumulated in the reaction solution at a concentration of 2.1 mM. It was.
この結果から、ＡＴＰをリン酸供与体としてセリンからＯ−ホスホセリンを酵素反応により製造できることが確認された。 From this result, it was confirmed that O-phosphoserine can be produced from serine using ATP as a phosphate donor.
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