JP4276462B2 - Method for producing modified peptide - Google Patents

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オクタノイル基(C8)以外にも、ブタノイル基 (C4)、ヘキサノイル基(C6)、デカノイル基(C10)、ドデカノイル基(C12)修飾体が存在する。また、不飽和脂肪酸による修飾体も存在する。
【０００４】
グレリンやコレシストキニンのように、ペプチド又は蛋白質の中には、アミノ酸配列中のある特異的なアミノ酸残基がアシル化やスルホン化、糖付加又はリン酸化等の修飾を受けることにより、その生理学的役割を発現するものがある。これらの修飾は生体内における精緻な酵素系により施されると考えられており、修飾を有するペプチド又は蛋白質を、高品質かつ効率的に大量に製造する一般的な方法はこれまで報告されていない。たとえば、グレリンは長鎖脂肪酸により特定のアミノ酸側鎖が修飾を受けることで成長ホルモン分泌促進作用を示すことから、脂肪酸修飾は必須の構造的要素であるが、生体がどのような酵素系を駆使して、脂肪酸を特定のアミノ酸側鎖の水酸基上にエステル結合させるのか、あるいは脂肪酸が伸長していくのか現時点では明らかにされていない。特にグレリンは、アミノ酸側鎖の水酸基が脂肪酸で修飾された構造を有することが初めて明らかにされた生理活性ペプチドであるために、本ペプチドが摂食障害治療薬、成長ホルモン分泌促進薬等の医薬品として期待される有用なペプチド性ホルモンであるにもかかわらず、特定の水酸基含有アミノ酸側鎖に脂肪酸修飾を有するペプチドの製造は一般化されていない、即ち、大量に製造するのに有利な工業的製造方法が確立されていないのが現状である。
【０００５】
現在、インスリン、成長ホルモン、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ＬＨ−ＲＨ誘導体、副腎皮質刺激ホルモン誘導体など種々のペプチド又は蛋白質製剤が医薬品として使用されている。これらのペプチド又は蛋白質の製造方法としては、化学合成法、酵素法、遺伝子組換法による製造方法が知られている。いずれの方法を選ぶかは適宜選択されるが、一般的に残基数が少ない場合には化学合成法が、残基数が多い場合は酵素法もしくは遺伝子組換法が選択される。
【０００６】
例えば、化学合成法は最も確実にグレリン等の修飾をもつ生理活性ペプチド又は蛋白質を製造できる方法である。修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法として、化学合成法による製造方法はすでに数多く報告されている。グレリンの例では、Bednarekら（J. Med. Chem., 43巻、p.4370-4376, 2000年）、Matsumotoら（Biochem. Biophys. Res. Commun., 284巻、p.655-659、2001年）により報告されている。また、国際公開番号：WO 01/07475に、グレリン及びグレリン誘導体であるペプチド又はその塩の製造方法として、化学合成法による方法が記載されている。しかし、化学合成法による製造方法においては、一定の品質（純度）を保って合成できるペプチドの鎖長に通常制限がある。液相化学合成法は高純度のペプチドを合成することが可能であるが、長鎖ペプチドの合成には、溶解度、長い製造工程、反応処理に要する特別の技術等の点で一般的でない。即ち、効率的に大量に製造することは、液相化学合成法を用いる製造方法では難しい。一方、樹脂上でペプチド鎖を延長する固相化学合成は、工程が単純化されており、大量生産にはより有利であるが、本法も一定品質の目的物を得るにはおのずと構築可能な鎖長に制限がある。加えて、試薬を過剰に用いるために、特に長鎖ペプチドの製造において経済性で劣るという問題もある。
【０００７】
また、酵素法のようにペプチド断片を酵素的に結合させていく方法は、アミノ酸側鎖の保護を最小に出来る点で優れているが、本法においては、通常加水分解の逆反応を用いるために、原理的に条件の設定が難しく実用的ではない。
一方、遺伝子組換法による生理活性ペプチド又は蛋白質の製造は、大量生産に適した有用な製造方法である。しかしながら、生産性の高い大腸菌等の原核生物を用いる方法は、原核生物が翻訳後修飾の系をもたないため、修飾部位をもつペプチドの直接的な製造は難しい。酵母や各種卵細胞のような真核細胞を用いる遺伝子組換法においては、糖修飾、アシル化、スルホン化、リン酸化等の修飾は可能であるが、例えば脂肪酸に関して、一定長の脂肪酸のみを導入することは難しい。単離されたグレリンのなかには、オクタン酸（Ｃ８）だけではなく、ブタン酸（Ｃ４）、デカン酸（Ｃ１０）、あるいはこれらの不飽和脂肪酸を有するものが発見されていることからも、特定鎖長の脂肪酸の導入を制御することの困難さは明らかである。加えて、真核細胞による生産性は一般的に低いことからも、修飾の系を有する酵母や各種卵細胞の生産系はグレリン等の修飾を受けたペプチド又は蛋白質の大量生産という観点からは、多くの改良の余地がある。
【０００８】
以上述べてきたように、修飾ペプチド又は蛋白質を合成する方法として化学合成法があり、すでに種々の報告がなされているが、大量に製造するためには、収率、コストの点において改良の余地がある。大腸菌等の原核細胞を用いた遺伝子組換法で直接的に翻訳修飾を受けたペプチド又は蛋白質を製造するのは難しい。また、酵母等の真核細胞を用いた遺伝子組換法による製造も、単一性又は生産性の点で問題があり、これを克服するために改良の余地がある。加水分解反応の逆反応を使う酵素法は、各々の縮合条件の設定が困難であり、大量生産に有利な方法であるとはいえない。
このように、従来知られている、化学合成法、酵素法、遺伝子組換法を単独で適用して、糖修飾、アシル化、スルホン化、リン酸化等の修飾を有するペプチド又は蛋白質を、品質と量的な要素を満足させ、かつ効率よく製造することについては、更なる改良の余地があった。
【０００９】
そこで、上記方法の長所を生かし、欠点を補う方法の一つに、化学合成法と遺伝子組換法を組み合わせた半合成法が挙げられる。本製造方法の重要な点は、縮合に適した形態のペプチド断片を効率よく製造することである。修飾されたアミノ酸残基を有するペプチド断片（以下、修飾成分ともいう。）及び修飾されたアミノ酸残基を有さないペプチド断片（以下、非修飾成分ともいう。）は、Ｎ末端側又はＣ末端側の何れであっても良く、また、修飾成分が複数であっても良い。適宜、目的とするペプチド又は蛋白質に合わせて、製造方法を設計することができる。一例として、修飾成分がＮ末端側に存在し、当該ペプチド断片（修飾成分）と縮合される他方のペプチド断片が非修飾成分である場合について詳細に言及する。
近年注目されている、Native chemical ligation法（Dawsonら、Science, 266巻、p.776-779、1994年）は、Ligation部位にCys残基が残る欠点があったが、最近、本方法を改良したチオエステル法が提案された。例えば、Kawakamiらにより、チオエステルを用いた方法でリン酸化ペプチドの合成が報告されている（Tetrahedron Letter, 41巻, p.2625-2628、2000年）。
【００１０】
前記チオエステル法の具体例を以下に示す。リン酸化されたp21Max蛋白質の合成例において（Kawakamiら、Tetrahedron Lett., 39巻、p.7901-7904, 1998年）、固相化学合成法でリン酸修飾部位を含むペプチド断片（修飾成分）（13 mer）をチオエステルとして製造する。一方、非修飾成分のＮ末端に一アミノ酸残基を付加させた配列を有するペプチド断片を大腸菌で製造し、このものに２価銅又はニッケルイオン存在下で、グリオキシル酸を作用させ、Ｎ末端に付加したアミノ酸残基をαケトアシル基に変換したのち、側鎖アミノ基をBoc基で保護する。次に、フェニレンジアミンでαケトアシル基を除去することで、Ｎ末端アミノ酸残基のアミノ基のみが遊離したペプチド断片（非修飾成分）を調製している。最後にこれらの両断片を銀塩、過剰のHOOBt等の活性エステル化剤を加え縮合している。
【００１１】
上記方法においても、まだ下記のような課題が残る。ペプチド断片（修飾成分）の製造において、そのチオエステルの安定性上の課題があり、収率は１１％と記載されている。また、ペプチド断片（非修飾成分）の製造において、αケトアシル基を用いる本方法はＮ末端アミノ基を遊離させる化学的方法として選択性が高いが、αケトアシル基が不安定であること、及び本基の脱離にフェニレンジアミン等の変異原性物質を使用する点で、医薬品用の生理活性ペプチド又は蛋白質の製造の場合、安全性の課題が残る。また、両断片の縮合反応において、銀塩、過剰のHOOBt等の活性エステル化剤を使用しており、ラセミ化、毒性、コストの点でも課題がある。
【００１２】
化学合成法と遺伝子組換法を組み合わせた半合成法は、国際公開番号：WO 01/07475にも、グレリン及びグレリン誘導体であるペプチド又はその塩の製造方法として記載されている。より具体的には、化学合成法により調製したラットグレリン(1-5)と遺伝子組換法により調製したラットグレリン(6-28)を縮合してラットグレリン(1-28)を調製する方法が記載されている。しかし、かかる方法においてもまた下記のような課題を有することから、効率のよい工業的製造に有利な製造方法とするには、多くの改良の余地がある。即ち、TFAによりペプチド鎖を樹脂から離脱させてラットグレリン(1-5)を得る際に、同時にBoc基、t-Bu基が除去されるため、再度Boc基をＮ末端に導入する必要があること、また、Ser側鎖が無保護になるために、ラットグレリン(6-28)との縮合に、強い活性化剤を使用できない等の点において、生産性を向上させる余地がある。また、保護ラットグレリン(1-5)及び保護ラットグレリン(6-28)を縮合する過程において、アシルペプチド断片部のＣ末端アミノ酸がラセミ化しうるため、これを抑制するために改良の余地があった。なお、グレリン（ｍ−ｎ）は、グレリンのＮ末端からｍ番目〜ｎ番目のアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。以下も同様である。
【００１３】
また、保護ペプチド断片（非修飾成分）を調製する際にもいくつかの課題がある。国際公開番号：WO 01/07475に記載された保護ラットグレリン(6-28)の製法は、基本的には２段階酵素処理法（国際公開番号WO99/38984）を採用しており、そのプロセッシング酵素として組換えV8プロテアーゼ誘導体（rV8D5）（特開平9-47291）とKex2プロテアーゼ（特開平10−229884）の２種類の酵素を使用している。しかしながら保護ラットグレリン(6-28)を含む融合たんぱく質を発現するプラスミド（pG97s rGR）は大腸菌β-ガラクトシダーゼ誘導体とヒト副甲状腺ホルモン(1-34)との融合蛋白質を高発現するプラスミド (特開平9−296000)を元に構築したものなので、保護ペプチド断片（非修飾成分）を調製する際には、そのアミノ酸配列に適したリンカー配列を選択する必要が生じる場合がある。
さらに、保護ラットグレリン(6-28)は水溶液中で保護基が離脱するという現象があり、精製における回収率は１０％と非常に低くグレリンを大量に安定供給するという側面においてなお課題を有する。
以上、化学合成法と遺伝子組換法の組み合わせによっても、効率がよく、かつ得られた製品を医薬品として使用できるような安全性の高い、修飾された生理活性ペプチド又は蛋白質の製造方法の実現には更なる課題がある。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、修飾をうけたペプチド又は蛋白質の簡便で効率のよい工業的製造方法を提供することを目的とするものである。具体的には、本発明は、修飾部位を含むペプチド断片（修飾成分）を化学合成法により製造し、修飾部位を含まないペプチド断片（非修飾成分）を遺伝子組換法により製造し、両者を縮合することで効率よく高品質の修飾をうけた生理活性ペプチド又は蛋白質を製造する方法を提供することを目的とするものである。前述したように、これらの各ペプチド断片（修飾成分及び非修飾成分）は、Ｎ末端側断片又はＣ末端側断片の何れであっても良く、また、修飾成分が複数であっても良い。適宜、目的とするペプチド又は蛋白質に合わせて、製造方法を設計することができる。また、本発明は、縮合反応に適した、保護されているペプチド断片（修飾成分）を修飾部位の構造に影響を与えない温和な条件で製造する方法、及び保護されているペプチド断片（非修飾成分）との縮合に適した保護されているペプチド断片（修飾成分）の製造方法を提供することを目的とするものである。さらに、本発明は、得られた製品を医薬品として使用できるような安全性の高い、修飾された生理活性ペプチド又は蛋白質の製造方法を提供することを目的とするものである。特に本発明は、グレリン及びグレリン誘導体の簡便で効率のよい工業的製造方法を提供することを目的とするものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、グレリンを素材に、グレリン又はその誘導体の中のアシル基により修飾されたアミノ酸を含むペプチド断片（修飾成分）の合成方法の改良を行い、ペプチド断片（修飾成分）の製造工程を大幅に簡略化かつ効率化しうる方法を確立した。即ち、２−クロロトリチル樹脂等の弱酸性離脱樹脂上でペプチド断片（修飾成分）のペプチド主鎖配列を構築し、引き続き、残基選択的修飾を施した後、酢酸等の弱酸処理により固相樹脂上から保護修飾ペプチドを切り出すことができることを見出した。従来の技術として、トリフルオロ酢酸等で樹脂から切り出せるWang樹脂等の樹脂上で修飾基を導入した後、樹脂からの切り出しとともに保護基も脱離させる方法が知られていた。しかし、本法においては、切り出したペプチド断片（修飾成分）は、引き続き、もう一方のペプチド断片（非修飾成分）との縮合反応に供するため、樹脂からの切り出しとともに保護基も脱離されてしまう従来技術による方法は、再び保護基を導入しなければならないため、簡便で効率的な製造という観点からは好ましくない。そこで、本発明者らは、ペプチド断片（修飾成分）の樹脂からの切り出しには、アミノ酸側鎖の保護基を脱離させにくい弱酸（希釈された強酸を含む）を用い、一方で、ペプチドが樹脂から離脱せずに、樹脂上で特定のアミノ酸側鎖の保護基を脱離させて残基選択的修飾を施す方法として、フッ化四級アンモニウムを用いる方法が有効であることを鋭意検討の結果、見出した。従来、フッ化四級アンモニウムのなかでも、テトラブチルアンモニウムフロオリド（TBAF）は固相樹脂からペプチドを離脱させる試薬として用いられていた（J.Chem.Soc., Chem.Commun., p.414-415，1988年、Tetrahedron Letters, 34巻, p.7599-7602，1993年）が、本発明者らは弱酸性離脱樹脂上に構築したペプチドはTBAF処理によって樹脂から離脱しないことを見出した。この結果、ＴＢＡＦを用いれば、ペプチドが樹脂から離脱することなく、そのゆえに、樹脂上で特定のアミノ酸側鎖の保護基を脱離させて残基選択的修飾を施すことができ、ついで、アミノ酸側鎖の保護基を脱離させにくい弱酸（希釈された強酸を含む）を用いペプチド断片（修飾成分）を樹脂から切り出すことにより、次工程のペプチド断片（非修飾成分）との縮合反応の際に、事前にペプチド断片（修飾成分）を保護する工程が必要なくなり、修飾をうけた生理活性ペプチド又は蛋白質の製造工程を大幅に簡略化かつ効率化することができた。
【００１６】
さらに本発明者らは、グレリンの保護ペプチド断片（非修飾成分）の調製方法を改良し、保護グレリン（８−２８）断片を２段階酵素処理法で大量に調製するために最適なリンカー配列を見出した。さらに本発明者らは、保護基が離脱しないpH条件で精製することで保護ペプチド断片（非修飾成分）の製造工程を大幅に簡略化かつ効率化しうる方法を確立した。すなわち、保護ペプチドの調製時に保護基が離脱する現象は水溶液のｐＨ及び温度に依存しており、水溶液のｐＨを４−８とすることにより保護基の離脱が阻止でき、収率よく保護ペプチド（非修飾成分）を調製できることを見出した。
【００１７】
また、各ペプチド断片の縮合方法を改良し、アミノ酸の活性化時、及び縮合時のラセミ化を抑制し、グレリン又はグレリン誘導体をより高品質かつ高収率で得ることができる製造方法を見出した。特に、弱酸性離脱樹脂を用いたグレリンの製造方法は、副反応により生じるジケトピペラジンの形成を抑制することができるという利点がある。即ち、Ｃ末端アミノ酸残基が7位のプロリンであるので、ジペプチド(-Ser-Pro-）に３個目のアミノ酸（Leu)を縮合する時に、ジケトピペラジンを巻いて樹脂から離脱する副反応を最小限に抑えることができる。
この知見に基づき、さらに、アルキル基はいうまでもなく、アシル基、リン酸基又は硫酸基を、グリコシド結合、ジスルフィド結合、エーテル結合、チオエーテル結合又はアミド結合等を介してアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖に結合した種々の修飾構造を有する生理活性ペプチド又は蛋白質の製造にも容易に適用できることを見出し、本発明を完成した。
【００１８】
即ち、本発明は、
（１） 弱酸性離脱樹脂を用いることを特徴とする、式１；−Ａ（Ｒ）−（式中、Ａはアミノ酸又は非アミノ酸を示し、ＲはＡの側鎖に結合している置換基を示す、）で表わされる修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護されているペプチド断片の製造方法、
（２） （ａ）弱酸性離脱樹脂上に、側鎖が保護されているアミノ酸又は／及び非アミノ酸の所望の配列を有するペプチド断片を作製し、（ｂ）前記ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂上から脱離させることなく、置換基Ｒにより修飾をうけるアミノ酸又は非アミノ酸Ａの側鎖の保護基を脱保護し、（ｃ）前記脱保護した側鎖を置換基Ｒで修飾し、（ｄ）弱酸性離脱樹脂からペプチド断片を切り出すことを特徴とする前記（１）に記載のペプチド断片の製造方法、
（３） アミノ酸又は非アミノ酸Ａの側鎖の保護基が、シリル系保護基であり、前記保護基の脱保護にフッ化四級アンモニウムを用いることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載のペプチド断片の製造方法、
（４） シリル系保護基が、ｔ−ブチルジメチルシリル（TBDMS）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（TBDPS）、トリイソプロピルシリル（TIPS）、トリイソブチルシリル（TIBS）、ｔ−ヘキシルジメチルシリル（ThxDMS）又はトリフェニルシリル（TPS）であり、フッ化四級アンモニウムがテトラブチルアンモニウムフルオリド（TBAF）、テトラエチルアンモニウムフルオリド（TEF）又はアンモニウムフルオリドであることを特徴とする前記（３）に記載のペプチド断片の製造方法、
に関する。
【００１９】
また、本発明は、
（５） Ａがセリン、スレオニン、システイン、ホモシステイン、リジン、オルニチン、グルタミン酸、２−アミノアジピン酸、ジアミノ酢酸、２−アミノマロン酸、アスパラギン酸、チロシン又はアスパラギンであり、Ｒがエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、Ｏ−グリコシド結合又はＮ−グリコシド結合等を介してＡの側鎖に結合していることを特徴とする前記（１）〜（４）に記載のペプチド断片の製造方法、
（６） Ａがセリン又はスレオニンであり、Ｒがエステル結合を介してＡの側鎖に結合していることを特徴とする前記（５）に記載のペプチド断片の製造方法、
（７） ペプチド断片が、グレリンもしくはその誘導体、又は前記グレリンもしくはその誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸を含む部分であることを特徴とする前記（６）に記載のペプチド断片の製造方法、
に関する。
【００２０】
また、本発明は、
（８） （ａ）式１；−Ａ（Ｒ）−（式中、Ａはアミノ酸又は非アミノ酸を示し、ＲはＡの側鎖に結合している置換基を示す、）で表わされる修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護されているペプチド断片を、弱酸性離脱樹脂を用いて製造し、前記（ａ）のペプチド断片とは別個に、（ｂ）修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造し、前記（ａ）及び（ｂ）で製造されたペプチド断片を縮合することを特徴とする修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（９） 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護されているペプチド断片を、前記（２）〜（４）に記載の方法で製造することを特徴とする前記（８）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１０） Ａがセリン、スレオニン、システイン、ホモシステイン、リジン、オルニチン、グルタミン酸、２−アミノアジピン酸、ジアミノ酢酸、２−アミノマロン酸、アスパラギン酸、チロシン又はアスパラギンであり、Ｒがエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、Ｏ−グリコシド結合又はＮ−グリコシド結合によりＡの側鎖に結合していることを特徴とする前記（８）又は（９）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１１） Ａがセリン又はスレオニンであり、Ｒがエステル結合を介してＡの側鎖に結合していることを特徴とする前記（１０）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１２） 修飾ペプチド又は蛋白質が、グレリン又はその誘導体であることを特徴とする前記（１１）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
に関する。
【００２１】
また、本発明は、
（１３） ペプチド断片の縮合が、縮合剤を用いて行われることを特徴とする前記（８）〜（１２）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１４） 縮合剤が、２−(１−ヒドロベンゾトリアゾール−１−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（HBTU）、２−(１−ヒドロベンゾトリアゾール−１−イル) −1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TBTU）、ジフェニルホスホリルアジド（DPPA）、ジフェニルホスホロシアニデート（DEPC）、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPC）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）であることを特徴とする前記（１３）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１５） 縮合剤が、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPC）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）であり、前記縮合剤を用いるペプチド断片の縮合が、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、１−ヒドロキシスクシンイミド（HOSu）又は３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−ベンゾトリアジン（HOOBt）の存在下、行われることを特徴とする前記（１３）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
に関する。
【００２２】
より具体的に、本発明は、修飾をうけたペプチド又は蛋白質を断片縮合により製造する過程において、（ａ）修飾基を含むペプチド断片を製造するとき、２−クロロトリチル樹脂等の弱酸性離脱樹脂を用いて合成することを特徴とする、修飾をうけた生理活性ペプチド又は蛋白質の製造方法、（ｂ）酸で脱離しやすいアシル基、硫酸基等を含むペプチド断片を合成する際、２−クロロトリチル樹脂等の弱酸性離脱樹脂を用いて製造することを特徴とする、修飾を有する生理活性ペプチド又は蛋白質、特にグレリン又はグレリン誘導体の製造方法、（ｃ）修飾を含むペプチド断片（修飾成分）と修飾を含まないペプチド断片（非修飾成分）との縮合を行うとき、活性化させるＮ末端側断片のＣ末端残基にプロリンを介することにより、構成アミノ酸のラセミ化を抑制したことを特徴とするグレリン又はグレリン誘導体の製造方法、（ｄ）グレリン又はグレリン誘導体の製造に顕著に良好であった縮合剤に関する。
【００２３】
更に、本発明は、
（１） アミノ酸又は／及び非アミノ酸からなる所望の配列を有し、そのうち少なくとも１のアミノ酸又は非アミノ酸が式１；−Ａ（Ｒ）−（式中、Ａはアミノ酸又は非アミノ酸を示し、ＲはＡの側鎖に結合している修飾のために導入された置換基を示す。）で表わされる修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸であり、かつアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、ペプチド断片作製に際して望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基が保護基により保護されているペプチド断片を弱酸性離脱樹脂上で作製し、ついで、弱酸性条件で前記ペプチド断片における保護基を脱離させることなく前記ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱することを特徴とする、修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護されているペプチド断片の製造方法、
（２） （ａ）アミノ酸又は／及び非アミノ酸からなる所望の配列を有し、かつアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、ペプチド断片作製に際して望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基が保護基により保護されているペプチド断片を弱酸性離脱樹脂上で作製し、（ｂ）前記ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂上から離脱させることなく、置換基Ｒにより修飾をうけるアミノ酸又は非アミノ酸Ａの側鎖における反応性官能基に保護基が導入されている場合は、当該保護基を脱保護し、（ｃ）前記脱保護した側鎖を置換基Ｒで修飾し、（ｄ）弱酸性条件で前記ペプチド断片における保護基を脱離させることなく前記ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させることを特徴とする前記（１）に記載のペプチド断片の製造方法、
（３） （ａ）弱酸性離脱樹脂上で、アミノ酸又は／及び非アミノ酸の所望の配列を有し、かつアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の反応性置換基が保護基により保護されているペプチド断片を作製し、ついで、（ｂ）弱酸性条件で前記ペプチド断片における保護基を脱離させることなく前記ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させ、（ｃ）離脱させたペプチド断片の少なくとも１のアミノ酸又は非アミノ酸Ａの側鎖における反応性置換基の保護基を脱保護し、（ｄ）前記脱保護した側鎖を置換基Ｒで修飾することを特徴とする式１；−Ａ（Ｒ）−（式中、Ａはアミノ酸又は非アミノ酸を示し、ＲはＡの側鎖に結合している置換基を示す。）で表わされる修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護されているペプチド断片の製造方法、
に関する。
【００２４】
また、本発明は、
（４） 置換基Ｒにより修飾を受けるアミノ酸又は非アミノ酸Ａの側鎖における反応性置換基の保護基が、シリル系保護基であり、前記保護基の脱保護にフッ化四級アンモニウムを用いることからなる前記（２）又は（３）に記載のペプチド断片の製造方法、
（５） シリル系保護基が、ｔ−ブチルジメチルシリル（TBDMS）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（TBDPS）、トリイソプロピルシリル（TIPS）、トリイソブチルシリル（TIBS）、ｔ−ヘキシルジメチルシリル（ThxDMS）又はトリフェニルシリル（TPS）であり、フッ化四級アンモニウムがテトラブチルアンモニウムフルオリド（TBAF）、テトラエチルアンモニウムフルオリド（TEF）又はアンモニウムフルオリドである前記（４）に記載のペプチド断片の製造方法、
（６） Ａがセリン、スレオニン、システイン、ホモシステイン、リジン、オルニチン、グルタミン酸、２−アミノアジピン酸、ジアミノ酢酸、２−アミノマロン酸、アスパラギン酸、チロシン又はアスパラギンであり、Ｒがエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、Ｏ−グリコシド結合又はＮ−グリコシド結合を介してＡの側鎖の反応性官能基に結合していることからなる前記（１）〜（５）に記載のペプチド断片の製造方法、
（７） Ａがセリン又はスレオニンであり、Ｒがエステル結合を介してＡの側鎖の水酸基に結合していることからなる前記（６）に記載のペプチド断片の製造方法、
（８） ペプチド断片が、グレリンもしくはその誘導体、又は前記グレリンもしくはその誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸を含むペプチド断片である前記（７）に記載のペプチド断片の製造方法、
に関する。
【００２５】
また、本発明は、
（９） （ａ）前記（１）〜（８）に記載の方法によって修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護されているペプチド断片を製造し、前記（ａ）のペプチド断片とは別個に、（ｂ）修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まず、かつ、アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基およびカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基が保護されているペプチド断片を製造し、前記（ａ）及び（ｂ）で製造されたペプチド断片を縮合することを特徴とする修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１０） ペプチド断片の縮合が、縮合剤を用いて行われることからなる前記（９）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１１） 縮合剤が、２−(１−ヒドロベンゾトリアゾール−１−イル)−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（HBTU）、２−(１−ヒドロベンゾトリアゾール−１−イル) −１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（TBTU）、ジフェニルホスホリルアジド（DPPA）、ジフェニルホスホロシアニデート（DEPC）、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPC）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）である前記（１０）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１２） 縮合剤が、ジイソプロピルカルボジイミド（DIPC）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）であり、前記縮合剤を用いるペプチド断片（ａ）と（ｂ）の縮合が、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）、１−ヒドロキシスクシンイミド（HOSu）又は３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−ベンゾトリアジン（HOOBt）の存在下で行われることからなる前記（１０）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
に関する。
【００２６】
また、本発明は、
（１３） 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を、酵素法又は／及び遺伝子組換法により製造することからなる前記（９）〜（１２）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１４） 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を、下記方法；
工程（１）；前記ペプチド断片のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、本項において目的ペプチドという。）をコードする塩基配列又は目的ペプチドに所望によりリンカー配列を介して保護ペプチドが付加されている融合蛋白質をコードする塩基配列のいずれかを有する発現ベクターにより形質転換された細胞を培養して、当該培養物から目的ペプチド又は前記融合蛋白質を採取する工程；
工程（２）；工程（１）において融合蛋白質を採取した場合、得られた融合蛋白質から、保護ペプチド及び所望によりリンカー配列と目的ペプチドとを切断分離し、所望により目的ペプチドをさらに精製する工程；
工程（３）；工程（１）又は（２）で得られた目的ペプチドの側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基を保護基により保護する工程；
を含む方法により製造することからなる前記（１３）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１５） 工程（２）における保護ペプチド及び所望によりリンカー配列と目的ペプチドとの切断分離が、ＯｍｐＴプロテアーゼ又はその誘導体及びＫｅｘ２プロテアーゼ又はその誘導体を用いて２段階で行われることからなる前記（１４）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１６） リンカー配列が、配列番号２７に記載の配列である前記（１４）又は（１５）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１７） ペプチド断片が、グレリンもしくはその誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ基を含まないペプチド断片であることを特徴とする前記（１３）〜（１６）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１８） 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を、ｐＨ４〜８の溶液中で精製及び保存することを特徴とする前記（１３）〜（１７）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１９） 保護基がＢｏｃ基である前記（１３）〜（１８）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
に関する。
【００２７】
また、本発明は、
（２０） 工程（１）；所望のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、本項において目的ペプチドという。）をコードする塩基配列又は目的ペプチドに所望によりリンカー配列を介して保護ペプチドが付加されている融合蛋白質をコードする塩基配列のいずれかを有する発現ベクターにより形質転換された細胞を培養して、当該培養物から目的ペプチド又は前記融合蛋白質を採取する工程；
工程（２）；工程（１）において融合蛋白質を採取した場合、得られた融合蛋白質から、保護ペプチド及び所望によりリンカー配列と目的ペプチドとを切断分離し、所望によりさらに精製する工程；
工程（３）；工程（１）又は（２）で得られた目的ペプチドの側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基を保護基により保護する工程；
工程（４）；工程（３）で得られた保護されている目的ペプチドを、ｐＨ４〜８の溶液中で精製及び保存する工程；
を含む方法により製造することを特徴とする修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方法、
（２１） 保護基がＢｏｃ基である前記（２０）に記載の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方法、
（２２） 工程（２）における保護ペプチド及び所望によりリンカー配列と目的ペプチドとの切断分離が、ＯｍｐＴプロテアーゼ又はその誘導体及びＫｅｘ２プロテアーゼ又はその誘導体を用いて２段階で行われることからなる前記（２０）または（２１）に記載の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方法、
（２３） リンカー配列が、配列番号２７に記載の配列である前記（２０）〜（２２）に記載の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方法、
（２４） ペプチド断片が、グレリンもしくはその誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ基を含まないペプチド断片であることを特徴とする前記（２０）〜（２３）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
に関する。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明を説明するに際し、下記用語を以下のように定義する。
「アミノ酸」とは、同一分子内にアミノ基とカルボキシル基を有する化合物であり、例えば、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸等あらゆるアミノ酸を含む。
「天然アミノ酸」とは、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸をいう。
「非天然アミノ酸」とは、α−アミノ酸におけるα炭素が天然アミノ酸又はそれに対応するＤ−アミノ酸に存在しない任意の置換基で修飾されている化合物をいう。即ち、α−アミノ酸を下記式；
【化１】

で表したとき、Ｒ’、Ｒ”で示される置換基として、天然アミノ酸又はそれに対応するＤ−アミノ酸に存在しない任意の置換基又は水素原子（但し、Ｒ’及びＲ”がともに水素原子である場合を除く。）を有する化合物が挙げられる。
「非アミノ酸」とは、Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選ばれる１種以上の原子からなるアミノ酸の類似体であって、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸に含まれない化合物をいう。なかでも、分子鎖長がペプチド相当長又はジペプチド相当長の化合物が好ましい。例えば、NH₂-CH(CH₂OH)-CH₃、CH₃-CH(R₁₁)-COOH、CH₃-CH(R₁₁)- CH₃（何れも分子鎖長がペプチド相当長）、又はNH₂-(CH₂)₃CH(CH₂OH)-COOH、NH₂-(CH₂)₄-COOH、NH₂-C(CH₃)₂-(CH₂)₃-COOH、 NH₂-CH(CH₃)-(CH₂)₂-CH(CH₃)-COOH、NH₂-(CH₂)₃CH(CH₂OH)- CH₃、NH₂-(CH₂)₃CH(R₁₁)- CH₃（何れも分子鎖長がジペプチド相当長）等が本発明でいう「非アミノ酸」に含まれる。ここで、R₁₁は、天然アミノ酸の側鎖を表す。ペプチドにおける「非アミノ酸残基」としては、例えば、-NH-CH(CH₂OH)-CH₂-、-CH₂-CH(R₁₁)-CO-、-CH₂-CH(R₁₁)-CH₂-（何れも分子鎖長がペプチド相当長）、又は-NH-(CH₂)₃CH(CH₂OH)-CO-、-NH-(CH₂)₄-CO-、-NH-C(CH₃)₂-(CH₂)₃-CO-、-NH-CH(CH₃)-(CH₂)₂-CH(CH₃)-CO-、-NH-(CH₂)₃CH(CH₂OH)-CH₂-、-NH-(CH₂)₃CH(R₁₁)-CH₂-（何れも分子鎖長がジペプチド相当長）等が挙げられ、隣接するアミノ酸との結合はペプチド結合でない場合がありえる。
【００２９】
「ペプチド」又は「ペプチド断片」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合で連なった化合物のことをいう。ここで、非アミノ酸を含む場合は、当該非アミノ酸と隣接するアミノ酸との結合はペプチド結合ではない場合があるが、この場合の化合物もペプチド又はペプチド断片と総称する。
「保護されているペプチド断片」とは、ペプチド断片のアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、ペプチド断片作製に際して又はペプチド断片の縮合反応に際して、望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基が保護基によって保護されているペプチドの断片をいう。以下、本明細書においては、「保護ペプチド断片」と略称する。
【００３０】
「修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸」は、式１；−Ａ（Ｒ）−（式中、Ａはアミノ酸又は非アミノ酸を示し、ＲはＡの側鎖に結合している修飾のために導入された置換基を示す。）で表わされる。
上記置換基Ｒは、アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基又はカルボキシル基から水素原子を除去して形成される基に結合している場合もあるし、アミノ酸又は非アミノ酸のα炭素に直接結合している場合もある。置換基Ｒは、アミノ酸又は非アミノ酸の修飾された側鎖であってもよい。
上記置換基Ｒとしては、特に限定されない。例えば、Ｒとしては、式２；−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｐ−Ｑ（式中、ｎは１〜１０の整数を示し、Ｐは、−ＣＯ−、−ＳＯ_２−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＣＳ−Ｓ−、−Ｓ−ＣＳ−、−Ｓ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＳ−ＮＨ−ＣＳ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＳ−ＮＨ−又は−ＮＨ−ＣＳ−を示し、Ｑは、水素原子、又はＣ_１−３５、好ましくはＣ_１−２０のアルキル基、Ｃ_６−２０のアリール基もしくはＣ_７−１６のアラルキル基を示す。）で表わされる基、式３；−Ｐ−Ｑ（式中、Ｐ及びＱは前記と同意義。）で表わされる基、又は式４；−Ｑ（式中、Ｑは前記と同意義。）で表わされる基等が挙げられる。なかでも、上記Ｒとしては、アミノ酸又は非アミノ酸のα炭素に直接結合している場合、炭素数１以上のアルキル基を介して又は介さずに、エステル、エーテル、チオエステル、チオエーテル、アミド又はカルバミドからなる群から選ばれる結合により、Ｃ_１−３５、好ましくはＣ_１−２０のアルキル基、Ｃ_６−２０のアリール基又はＣ_７−１６のアラルキル基が結合している基が好ましい。置換基Ｒがアミノ酸又は非アミノ酸のα炭素に直接結合している場合、置換基Ｒは天然アミノ酸においてα炭素に結合している置換基を含まない。置換基Ｒがアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における反応性置換基に結合している場合、当該置換基Ｒは式４；−Ｑ（式中、Ｑは前記と同意義。）で表わされる基であることが好ましい。
【００３１】
ここで、上記「アルキル基」とは、環状、直鎖又は分枝鎖アルキル基を表し、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ネオペンチル基、シクロペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロヘキシル基、３，３−ジメチルブチル基、ヘプチル基、１−プロピルブチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基又はペンタデシル基等が挙げられ、これらは部分的に不飽和炭素結合を含んでいてもよく、炭素数は１乃至３５、より好ましくは１乃至２０、さらに好ましくは１乃至１０である。
上記「アリール基」とは、例として、フェニル基、１−もしくは２−ナフチル基、ビフェニル基、１−，２−もしくは９−アントリル基、１−，２−，３−，４−もしくは９−フェナントリル基、アセナフチル基、アントラセニル基、アズレニル基等が挙げられる。炭素数は６乃至２０、より好ましくは６乃至１５である。
上記「アラルキル基」としては、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、ｏ−ニトロベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ベンズヒドリル基、トリチル基等が挙げられる。炭素数は、好ましくは７乃至１６である。
さらに、これらアルキル基、アリール基及びアラルキル基は、当技術分野で通常用いられる置換基を化学的に許容される位置及び個数で有していてもよい。
【００３２】
「修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸」としては、アミノ酸又は非アミノ酸Ａがセリン、スレオニン、システイン、ホモシステイン、リジン、オルニチン、グルタミン酸、２−アミノアジピン酸、ジアミノ酢酸、２−アミノマロン酸、アスパラギン酸、チロシン又はアスパラギンであり、置換基Ｒが式５；−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｐ^１−Ｑ^１（式中、ｎは前記と同意義。Ｐ^１は、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、Ｏ−グリコシド結合又はＮ−グリコシド結合を表し、Ｑ^１は、前記Ｑと同意義。）で示される基である場合が好ましい。
具体的には、例えば、アミノ酸Ａがセリン、スレオニン、チロシン又はオキシプロリンである場合、そのアミノ酸は側鎖に水酸基を有するから、「修飾をうけたアミノ酸」としては、側鎖の水酸基がエーテル化又はエステル化されているセリン、スレオニン、チロシン又はオキシプロリンが挙げられる。アミノ酸Ａがシステインである場合は、そのアミノ酸は側鎖にメルカプト基を有するから、「修飾をうけたアミノ酸」としては、側鎖のメルカプト基がチオエーテル化、チオエステル化又はジスルフィド化されているシステインが挙げられる。アミノ酸Ａがリジン、アルギニン又は２，３−ジアミノプロピオン酸である場合は、側鎖にアミノ基を有するから、「修飾をうけたアミノ酸」としては、側鎖のアミノ基がアミド化、チオアミド化、カルバミド化、チオカルバミド化又はアルキル化されているリジン、アルギニン又は２，３−ジアミノプロピオン酸が挙げられる。アミノ酸Ａがヒスチジン、トリプトファン、プロリン又はオキシプロリンである場合は、側鎖にアミノ基を有するから、「修飾をうけたアミノ酸」としては、側鎖のアミノ基がアミド化、チオアミド化、イミノエーテル化、イミノチオエーテル化、アルキル化されているヒスチジン、トリプトファン、プロリン又はオキシプロリンが挙げられる。
なかでも、「修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸」としては、側鎖の水酸基がエステル化されているセリン又はスレオニンが好ましい。
【００３３】
さらに、上記置換基Ｒとしては、アミノ酸又は非アミノ酸Ａの側鎖に−OH、−SH、−NH−又は−NH_２を含む場合、これらをアシル化して形成される基がより好適な例として挙げられる。そのためのアシル基としては、例えば有機カルボン酸、有機スルホン酸、有機リン酸化合物から水酸基を除去して形成される基が挙げられる。前記有機カルボン酸としてはより具体的には、脂肪酸が挙げられ、その炭素数は好ましくは２〜３５、より好ましくは６〜１８、最も好ましくは８〜１６である。そのような脂肪酸としては、例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、酪酸、カプロン酸、ウンデシル酸、パルミチン酸、デカン酸、ノナデカン酸、ベヘン酸、モンタン酸もしくはラクセン酸等の飽和脂肪酸、例えばアクリル酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸もしくはアアテアロール酸等の不飽和脂肪酸が挙げられる。不飽和脂肪酸はモノエンであってもよいし、ポリエンであってもよい。なかでも、オクタン酸（好ましくは、カプリル酸）、デカン酸（好ましくは、カプリン酸）、ドデカン酸（好ましくは、ラウリル酸）等が好適な例として挙げられる。前記有機スルホン酸又は有機リン酸化合物についても、その炭素数は２〜３５のものが好ましい。
【００３４】
「修飾ペプチド又は蛋白質」とは、ペプチド又は蛋白質中に、上述の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を、１以上含むペプチド又は蛋白質をいう。
「グレリン」とは、内因性成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）のことであり、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有する。なかでも、ヒト、ラット、マウス、ブタ、ニワトリ、ウナギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、カエル、ニジマス又はイヌ由来のグレリンが好ましい。より具体的には、「グレリン」としては、配列番号１〜２１のいずれかに記載のアミノ酸配列を有し、３位セリン又はスレオニンの側鎖水酸基の水素原子が、ｎ−オクタノイル基、ブタノイル基、ヘキサノイル基、デカノイル基又はドデカノイル基のいずれかで置換されている蛋白質、又は配列番号１〜２１のいずれに記載のアミノ酸配列において、Ｎ末端の１番目から４番目までのアミノ酸配列以外の部分で、１〜１０個、好ましくは１〜数個程度のアミノ酸が置換、付加又は欠失しているアミノ酸配列を有し、３位セリン又はスレオニンの側鎖水酸基の水素原子が、ｎ−オクタノイル基、ブタノイル基、ヘキサノイル基、デカノイル基又はドデカノイル基のいずれかで置換されており、かつ細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する蛋白質が挙げられる。
【００３５】
「グレリン誘導体」としては、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有し、修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含むことを特徴とするペプチド又はその薬学的に許容される塩が挙げられる。なかでも、配列番号１に記載のアミノ酸配列においてアミノ末端から４番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から５番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から６番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から７番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から８番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から９番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から１０番目までのアミノ酸配列を少なくとも有するペプチド又はその薬学的に許容される塩が好ましい。さらに、配列番号１〜２１に記載のアミノ酸配列において、アミノ末端から４番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から５番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から６番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から７番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から８番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から９番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から１０番目までのアミノ酸配列以外の部分で、少なくともひとつのアミノ酸、好ましくは１〜１０個程度のアミノ酸、より好ましくは１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むペプチド又はその薬学的に許容される塩が好ましい。なかでも、上記態様の全てのペプチド又はその薬学的に許容される塩においては、アミノ末端から２番目又は３番目のアミノ酸、より好ましくはアミノ末端から３番目のアミノ酸が、修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸であることが特に好ましい。
【００３６】
また、配列番号１〜２１に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列の少なくともひとつのアミノ酸、好ましくは１〜１０個程度のアミノ酸、より好ましくは１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列において、アミノ末端から４番目までのアミノ酸配列が、式６；Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−（式中Ａはアミノ酸、非アミノ酸、又はないことを示し、Ｂはアミノ酸、非アミノ酸、又はないことを示す。ただし、Ａ＋Ｂの分子鎖長がジペプチド相当長ある。Ｃ又はＤは同一であっても異なっていてもよく、（ａ）修飾されたアミノ酸、（ｂ）疎水性側鎖を有するアミノ酸、又は（ｃ）塩基性側鎖を有するアミノ酸を示す。）で表されるペプチド断片に置き換えられているペプチド又はその薬学的に許容される塩も好ましい態様として挙げられる。前記「疎水性側鎖を有するアミノ酸」としては、ロイシン、バリン、ノルロイシン、ホモロイシン、ホモイソロイシン、ナフチルアラニン類、トリプトファン、フェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン等、あるいは、これらのＮ−メチルアミノ酸又はＤ−体などが挙げられる。前記「塩基性側鎖を有するアミノ酸」としては、リジン、アルギニン又はヒスチジン又はこれらのＤ−体などが挙げられる。中でも、前記式６中、Ｃが、上記修飾をうけたアミノ酸であり、Ｄが疎水性側鎖を有するアミノ酸であることがより好ましい。
【００３７】
前記式６；Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−で表されるペプチド断片の代わりに、次式７；Ａ^１−Ｂ^１−Ｃ^１−Ｄ^１−（式中、Ａ^１はアミノ酸又は非アミノ酸、好ましくは天然アミノ酸又はそのＤ−体を示す。Ｂ^１又はＣ^１は、少なくとも一方が修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸であり、Ｂ^１又はＣ^１のうち一方のみが修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸である場合、他方は修飾をうけていないアミノ酸又は非アミノ酸、好ましくは天然アミノ酸又はそのＤ−体である。また、Ａ^１＋Ｂ^１の分子鎖長がジペプチド相当長ある。Ｄ^１は、疎水性側鎖を有するアミノ酸又は塩基性側鎖を有するアミノ酸を示す。）で表されるペプチド断片を用いてもよい。
また、前記式６；Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−で表されるペプチド断片の代わりに、次式８；Ｂ^２−Ｃ^２−Ｄ^２−（式中、Ｂ^２は、ジペプチド相当長の分子鎖長を有する非アミノ酸であり、Ｃ^２は修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸であり、Ｄ^２は、疎水性側鎖を有するアミノ酸又は塩基性側鎖を有するアミノ酸を示す。）で表されるペプチド断片を用いてもよい。
【００３８】
さらに、「グレリン誘導体」としては、上述のような態様のペプチド又はその薬学的に許容される塩のアミノ末端やカルボキシル末端に修飾が施されていてもよい。具体的には、上述のような態様のペプチド又はその薬学的に許容される塩のカルボキシル末端に、更に塩基性アミノ酸が結合していることが好ましい。また、上述のような態様のペプチド又はその薬学的に許容される塩のアミノ末端が炭素数１以上の飽和あるいは不飽和アルキル基又はアシル基により修飾され及び／又はカルボキシル末端のカルボキシル基のＯＨがＯＺ又はＮＲ２Ｒ３（Ｚは薬学的に許容し得る陽イオン又は低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基、Ｒ２及びＲ３は、水素原子及び低級（Ｃ_１−６）の分枝鎖又は直鎖アルキル基からなる群から選択される互いに同一又は異なる基を示す）に変換されていることが好ましい。さらには、これらの修飾が組み合わされていてもよい。
【００３９】
本発明にかかる修飾ペプチド又は蛋白質を製造する方法は、（ａ）修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護ペプチド断片を、弱酸性離脱樹脂を用いて製造し、また（ｂ）修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護ペプチド断片を、前記（ａ）の保護ペプチド断片とは別個に製造し、前記（ａ）及び（ｂ）で製造された保護ペプチド断片を縮合するという３工程からなることを特徴とする。
以下に、修飾ペプチド又は蛋白質の製造における各工程についてより具体的に述べる。
【００４０】
本発明の製造方法によって得られる修飾ペプチド又は蛋白質、又はそれらの断片はペプチド性のものであるので、自体公知のペプチド合成法によって合成することができる。ここで、修飾ペプチドもしくは蛋白質、又はそれらの断片とは、これらの反応性官能基が保護基で保護された化合物も含む。ペプチドの合成方法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。即ち、粗修飾ペプチドもしくは蛋白質、又はそれらの断片を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離方法としては、例えば、以下の文献１〜３に記載された方法が挙げられる。
１. 泉屋信夫他「ペプチド合成の基礎と実験」丸善株式会社発行（1985年）
２. 矢島治明及び榊原俊平「生化学実験講座１、蛋白質の化学IV」日本生化学会編、東京化学同人発行（1977年）
３. 矢島治明監修「続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成」廣川書店発行
【００４１】
修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護ペプチド断片を製造する工程は、弱酸性離脱樹脂上でペプチド鎖を延長する固相化学合成を用いることを特徴とする。より具体的には、弱酸性離脱樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖における、ペプチド断片作製に際して望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基を適当に保護したアミノ酸又は非アミノ酸を、目的とするペプチド断片の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、弱酸性離脱樹脂上で縮合させ、作製された保護ペプチド断片を保護基を脱離させることなく弱酸性離脱樹脂から離脱させることにより、目的とする保護ペプチド断片を得ることができる。
【００４２】
上記弱酸性離脱樹脂とは、ペプチド合成に用いられる樹脂であって、樹脂上に作製されたペプチド断片を弱酸性条件で樹脂から離脱させることができる樹脂をいう。例えば、弱酸性離脱樹脂としては、酢酸、トリフルオロ酢酸もしくはギ酸などのカルボン酸類、およびトリフルオロエタノールもしくはヘキサフルオロイソプロパノールなどのフッ素化アルコール類からなる群からなる１以上の化合物を含む溶液中で、樹脂上に作製されたペプチド断片を樹脂から離脱させることができる樹脂が好ましい。より具体的には、弱酸性離脱樹脂としては、例えば、２−クロロトリチル樹脂、トリチル樹脂、４−メチルトリチル樹脂、４−メトキシトリチル樹脂、Rink Amide Barlos樹脂等のトリチル系樹脂や、Sieber Amide樹脂等を挙げることができる。
【００４３】
α−アミノ基と側鎖における反応性官能基（以下単に、側鎖官能基という。）の保護基としては、特に限定されない。例えば、 α−アミノ基の保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル（Boc）、トリクロロエチルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）、メチルスルホニルエトキシカルボニル、トリクロロエトキシカルボニル、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニルもしくはピリジン−４−メトキシカルボニル等の置換基を有していてもよいアルコキシカルボニル基；シクロペプチルオキシカルボニルもしくはシクロヘキシルオキシカルボニル等の置換基を有していてもよいシクロアルキルオキシカルボニル基；ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（ｐＭＺ）、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル（Ｃｌ−Ｚ）、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂｒ−Ｚ）、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−フェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｐ−メチルフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシ−α，α−ジメチルベンジルオキシカルボニル等の置換基を有していてもよいアラルキルオキシカルボニル基；ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンズヒドリル、トリチル等の置換基を有していてもよいアラルキル基；トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｓ）、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２，４−ジニトロフェニルスルフェニル、３−ニトロ−２−ピリジルスルフェニル等の置換基を有していてもよいアシル基；ジチアスクシノイル、２−ニトロフェニルチオ、ジフェニルホスフィニル、ジフェニルホスフィノチオイル、ジメチルホスフィノチオイル等が挙げられる。
【００４４】
セリン等の水酸基は、例えば、アセチル基等の低級（Ｃ_１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基等のアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等の炭酸から誘導される基等で保護できる。
アルギニンのグアニジノ基は、例えば、ニトロ基、Ｚ基、Ｔｓ基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基（Ｍｂｓ）、４−メトキシ−２，６−ジメチルベンゼンスルホニル基（Ｍｄｓ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル基（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル基（Ｍｔｓ）、２，３，４，５，６−ペンタメチルベンゼンスルホニル基（Ｐｍｅ）、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホニル基（Ｍｔｂ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル基（Ｐｍｃ）、２，２，４，６，７−ペンタメチル−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル基（Ｐｂｆ）等で保護できる。
また、システインのメルカプト基は、例えば、トリチル基、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メチルベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基、ブチルチオ基等で保護できる。
ヒスチジンのイミダゾリル基の保護基としては、例えば、Ｂｏｃ基、トリチル（Ｔｒｔ）基、Ｔｓ基、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル基、２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）基、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）基、ｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ）基、Ｆｍｏｃ基等が用いられる。
また、トリプトファンのインドリル基は、例えば、ホルミル基、Ｚ基、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル基、トリクロロエチルオキシカルボニル基、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル基、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホニル基等で保護できる。
【００４５】
固相合成法による縮合反応は、上述の弱酸性離脱樹脂にアミノ酸を１個ずつ順次縮合させる逐次延長法、２個以上のアミノ酸で構成されたペプチド断片を縮合させる断片縮合法やこれらの方法を組み合わせた方法の何れの方法で行ってもよい。前記２個以上のアミノ酸で構成されたペプチド断片は、各アミノ酸から慣用の液相法、固相法等により製造することができる。
【００４６】
まず、上記のようなα−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸又は非アミノ酸（以下、特に断りのない限り、保護アミノ酸と略称する。）を活性化し、弱酸性離脱樹脂に活性化された保護アミノ酸を縮合する。その際、保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等の酸アミド類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；トリフルオロエタノール、フェノール等のアルコール類；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類；ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフラン等のエーテル類；アセトニトリル，プロピオニトリル等のニトリル類；酢酸メチル，酢酸エチル等のエステル類又はこれらの適宜の混合物等が用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応の反応温度と同一であってよく、通常約−２０℃〜５０℃程度の範囲から適宜選択される。活性化された保護アミノ酸は通常１〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸又はアセチルイミダゾールを用いて未反応保護アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００４７】
ついで、弱酸性離脱樹脂に縮合された保護アミノ酸に、所望の配列どおりに、保護アミノ酸を縮合させていく。各保護アミノ酸の縮合反応は、慣用の方法、例えば、Ｃ端活性化法、カップリング試薬を用いるカップリング法等により行うことができる。Ｃ端活性化法には、活性エステル法、対称酸無水物法等が含まれる。前記活性エステル法で用いる活性エステルとしては、例えば、シアノメチルエステル等のアルキルエステル；チオフェニルエステル、ｐ−ニトロチオフェニルエステル、ｐ−メタンスルホニルフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、２，４−ジニトロフェニルエステル、２，４，６−トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル等のフェニルエステル；１−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、Ｎ−ヒドロキシフタル酸イミドエステル、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）等のジカルボン酸イミドエステル；８−ヒドロキノリンエステル、Ｎ−ヒドロキシピペリジンエステル、２−ヒドロキシピリジンエステル等のヒドロキシルアミン誘導体等が挙げられる。
【００４８】
上記カップリング試薬を用いるカップリング法としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）等を用いるカルボジイミド法；ＤＣＣ−アディティブ法；カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）法；ウッドワード（Woodward）反応剤（Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホン酸塩）もしくはＮ−エチル−２’−ヒドロキシベンズイソオキサゾリウムトリフルオロホウ酸塩等のイソオキサゾリウム塩、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキシキノリン（ＥＥＤＱ）、１−エトキシカルボニル−２−イソブトキシ−１，２−ジヒドロキシキノリン（ＩＩＤＱ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）−フォスホニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＢＯＰ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）を用いる方法等が例示される。
【００４９】
上記カルボジイミド法で用いられる水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）には、例えば、ＥＤＣ(１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−モルホリノエチルカルボジイミド、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）シクロヘキシルカルボジイミド等が含まれる。水溶性カルボジイミドは、塩酸塩等の塩であってもよい。
また、上記ＤＣＣ−アディティブ法には、例えば、ＤＣＣ−ＨＯＳｕ法、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）法、ＤＣＣ−ＨＯＮＢ法、ＤＣＣ−２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステル法、ＷＳＣ−ＨＯＳｕ法、ＷＳＣ−ＨＯＢｔ法等が含まれる。
【００５０】
好ましい縮合反応には、カルボジイミド法、活性エステル法、ＤＣＣ−アディティブ法が含まれる。さらに好ましい縮合反応には、ラセミ化を抑制する方法、例えば、活性エステル法、ＤＣＣ−アディティブ法（例えば、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ法、ＤＣＣ−ＨＯＳｕ法、ＷＳＣ−ＨＯＳｕ法、ＷＳＣ−ＨＯＢｔ法等）等が含まれる。
【００５１】
目的とする保護ペプチド断片には、修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む。ペプチド鎖に修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を挿入する方法としては、下記２通りの方法が挙げられる。
第一の方法としては、所望のアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖を特異的に予め修飾しておき、かかるアミノ酸又は非アミノ酸（以下、残基特異的に修飾されたアミノ酸又は非アミノ酸という。）を、ペプチド鎖の伸長段階で導入するという方法が挙げられる。より具体的には、残基特異的に修飾されたアミノ酸又は非アミノ酸（これらのαアミノ基に保護基を付した化合物を含む）は、自体公知の合成方法によって合成することができる。例えば、エステル化反応、アミド化反応、エーテル化反応、アシル化反応、アルキル化反応などが挙げられ、これらは当業者に周知の方法により行われ得る。さらに、これを前述した縮合反応のいずれかによりペプチド鎖に導入することができる。この場合、その弱酸性離脱樹脂からの保護ペプチド断片の脱離は後述する条件から適宜選択されるが、好ましくは目的とする残基特異的に修飾されたアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の置換基Ｒを脱離させない条件から適宜選択されることが好ましい。
【００５２】
第二の方法としては、アミノ酸又は／及び非アミノ酸からなる所望の配列を有するペプチド断片を上記方法により作製し、その後、所望のアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖を特異的に修飾する（以下、残基特異的修飾という。）という方法が挙げられる。前記の残基特異的修飾の方法は特に限定されず、公知の方法を用いてよい。例えば、エステル化反応、アミド化反応、エーテル化反応、アシル化反応、アルキル化反応などが挙げられ、これらは当業者に周知の方法により行われ得る。さらに、リン酸化修飾する方法としては、Tetrahedron Letter, 41巻, p.4457-4461,2000年、Biopolymers, 60巻, p.3-31, 2001年等が挙げられる。また、糖修飾する方法としてはInt. J. Peptide Protein Res., 42巻, p.165-170, 1993年、Science, 291巻, p.2344-2350, 2001年、Science, 291巻, p.2357-2364, 2001年等が挙げられる。
【００５３】
かかる方法は、下記２通りの場合に分けられる。即ち、残基特異的修飾を施すアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の官能基が保護基により保護されている場合、かかる保護基の脱保護の際に同時に保護ペプチド断片が樹脂から離脱してしまう場合と、かかる保護基の脱保護の際には保護ペプチド断片は樹脂から離脱しない場合とに大別される。前者の場合、Ｃ末端のカルボキシル基を保護基により保護した後、自体公知の合成方法により残基特異的修飾を施し、その後、Ｃ末端のカルボキシル基を後述する方法から適宜選択して脱保護することにより目的のペプチド断片を得ることができる。また、後者の場合、樹脂上で自体公知の合成法により残基特異的修飾を施すことができ、その後、目的のペプチド断片を、後述する方法から適宜選択して樹脂から離脱すればよい。
【００５４】
本発明においては、アミノ酸又は／及び非アミノ酸からなる所望の配列を有するペプチド断片を上記方法により作製し、その後、残基特異的修飾を施すアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の反応性官能基が保護基により保護されている場合は、その保護基を脱保護し、樹脂上で自体公知の合成法により残基特異的修飾を施し、ついで、後述する弱酸性離脱樹脂からの保護ペプチド断片の離脱、及び所望により各保護基の脱保護を行うという方法が最も好ましい。
上記方法において、残基特異的修飾を施すアミノ酸又は非アミノ酸の保護基としては、かかる保護基を脱保護する際に保護ペプチド断片が樹脂から離脱しないものであれば特に限定されないが、好ましくはｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基等のシリル基等が挙げられる。このような保護基を脱保護する際は、保護ペプチド断片が樹脂から離脱されず、かつ、残基特異的修飾を施すアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖官能基の保護基を特異的に脱保護することができる試薬を用いる。かかる試薬は、弱酸性離脱樹脂及び前記保護基の種類に応じて適宜選択されるが、前記保護基がシリル基である場合は、フッ化四級アンモニウムを用いることが好ましく、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）を用いることがより好ましい。
【００５５】
上記のように保護基を選択すると、ペプチド伸長の縮合のためＮ末端アミノ基を脱保護する際に、各保護アミノ酸の側鎖官能基の保護基及び弱酸性離脱樹脂から保護ペプチド断片が脱離せず、また、得られたペプチド−樹脂結合体から弱酸性離脱樹脂を脱離する際に、各アミノ酸残基の側鎖官能基の保護基が脱離しない。しかも、このことに起因して、副反応物の生成を抑制することができる。そのため、側鎖官能基が保護基により保護されたペプチド断片を、高い純度で収率よくしかも簡易に得ることができる。このペプチド断片は、側鎖官能基が保護されているので、新たに保護基を導入する必要がなく、次工程において、液相法により目的とする修飾ペプチド又は蛋白質を製造する際の原料として、好適に使用することができる。
【００５６】
最後に、作製された保護ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させる。このとき、保護ペプチド断片における保護基、即ち、アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖官能基の保護基が脱保護されない弱酸性条件で行う。弱酸性条件とは、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸もしくはギ酸などのカルボン酸類、および／またはトリフルオロエタノールもしくはヘキサフルオロイソプロパノールなどのフッ素化アルコール類を含む溶液中に、弱酸性離脱樹脂を懸濁させた条件が挙げられる。具体的には、上記溶液中で、所望時間、好ましくは５分〜４時間程度、より好ましくは１０分〜２時間程度攪拌することにより、作製された保護ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させることができる。より具体的には、例えば、Barlosらの方法（Tetrahedron Lett, Vol.30, p.3947,1989）等に記載されている公知の方法、例えば、0.5%トリフルオロ酢酸/ジクロロメタン、あるいは酢酸/トリフルオロエタノール/ジクロロメタン＝1/2/7、あるいは酢酸/トリフルオロエタノール/ジクロロメタン＝2/2/6等の溶媒に懸濁させる方法に従えばよい。
【００５７】
本発明においては、ペプチド鎖に修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を挿入することなく、保護ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させ、ついで所望のアミノ酸残基に残基特異的修飾を施すことによっても、修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含むペプチド断片を製造することができる。残基特異的修飾の方法は、上記と同一である。
【００５８】
以上述べてきた製造方法は、修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護ペプチド断片であれば、特に制限なく適用されうる。中でも、下記式９で表わされる修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護ペプチド断片又はその塩の作製に、上記方法を用いるのが好ましい。
即ち、式９；（Ｒ１）_ｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｘ１）−Ａ（Ｒ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（Ｘ２）−Ｐｒｏ−ＯＲ２
（式中、−Ａ（Ｒ）−は、上記修飾を受けたアミノ酸又は非アミノ化合物である。なかでも、Ａは、セリン、スレオニン、システイン、ホモシステイン、リジン、オルニチン、グルタミン酸、２−アミノアジピン酸、ジアミノ酢酸、２−アミノマロン酸、アスパラギン酸、チロシン、アスパラギンが好ましく、Ｒは、アシル基、糖、リン酸基、硫酸基、アルキル基、アラルキル基、アロイル基等の修飾基が好ましく、ＲがＡの側鎖の反応性置換基にエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、Ｏ−グリコシド結合又はＮ−グリコシド結合を介して結合していることが好ましい。
Ｒ１は、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、トリクロロエチルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル、トリクロロエトキシカルボニル、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニルもしくはピリジン−４−メトキシカルボニル等の置換基を有していてもよいアルコキシカルボニル基；シクロペプチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル等の置換基を有していてもよいシクロアルキルオキシカルボニル基；ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（ｐＭＺ）、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル（Ｃｌ−Ｚ）、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂｒ−Ｚ）、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−フェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｐ−メチルフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシ−α，α−ジメチルベンジルオキシカルボニル等の置換基を有していてもよいアラルキルオキシカルボニル基；ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンズヒドリル、トリチル等の置換基を有していてもよいアラルキル基；トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｓ）、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２，４−ジニトロフェニルスルフェニル、３−ニトロ−２−ピリジルスルフェニル等の置換基を有していてもよいアシル基；ジチアスクシノイル、２−ニトロフェニルチオ、ジフェニルホスフィニル、ジフェニルホスフィノチオイル、ジメチルホスフィノチオイルを示し、
ｎは、１もしくは２であり、
Ｘ１及びＸ２は、セリン側鎖の水酸基の保護基を示し、アセチル基等の低級（Ｃ_１−６ ）アルカノイル基；ベンゾイル基等のアロイル基；ベンジルオキシカルボニル基もしくはエトキシカルボニル基等の炭酸から誘導される基を示すか、又は、側鎖に上述の置換記Ｒをエーテル結合を介して結合させるというエーテル化に適する基として、例えば、ｔ−ブチル基、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、トリチル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基等のシリル基を示し、
Ｒ２は、保護基又は保護基が無いことを示し、保護基がある場合は、アルキルエステル基（例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、ｔ−ブチルエステル、シクロペンチルエステル、シクロヘキシルエステル、シクロヘプチルエステル、シクロオクチルエステル、２−アダマンチルエステル等の直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル基）、アラルキルエステル基（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル基）、フェナシルエステル基、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド基、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド基、トリチルヒドラジド基を示す。）
で表されるペプチド又はその塩等である。
【００５９】
式９中、Ｒ１はＢｏｃ基、Ｚ基、ｐＭＺ基又はＦｍｏｃ基が好ましく、Ｘ１及びＸ２で表される保護基としては、好ましくはｔ−ブチル基又は３４ベンジル基、さらに好ましくはｔ−ブチル基が挙げられる。Ｒ２は、水素あるいはチオエステル基が好ましい。
【００６０】
さらに、以上述べてきた製造方法は、グレリン、好ましくはヒト、ラット、マウス、ブタ、ニワトリ、ウナギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、カエル、ニジマスもしくはイヌのグレリン、又はグレリン誘導体を製造する際に好適に用いられる。また、前記グレリン又はグレリン誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含む部分を製造する際にも好適に用いられる。前記各生物のグレリンの構造は、表１に記載している。
より具体的には、（ａ）配列番号１〜２１のいずれかに記載のアミノ酸配列において、少なくともＮ末端の１番目から４番目のアミノ酸配列を有し、好ましくは当該アミノ酸配列においてＮ末端の１番目から５番目のアミノ酸配列からなるか、又は当該アミノ酸配列においてＮ末端の１番目から７番目のアミノ酸配列からなり、（ｂ）Ｎ末端から３番目のセリン又はスレオニンの側鎖の水酸基が、アシル化、好ましくは飽和又は不飽和の炭素数２〜３５、好ましくは６〜１８のアルキル基によりアシル化されており、（ｃ）アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、ペプチド断片作製に際して望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基、好ましくは水酸基及びアミノ基が保護基により保護されているペプチド断片の製造に、以上述べてきた製造方法は有用である。
【００６１】
本発明においては、修飾を受けたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護ペプチド断片を、前記修飾を受けたアミノ酸又は非アミノ酸を含む保護ペプチド断片とは別個に製造する。
本発明におけるペプチド又は蛋白質の、アシル化、糖化、リン酸化等の修飾を受けたアミノ酸もしくは非アミノ酸を含まないペプチド断片は、自体公知の遺伝子組換法もしくは酵素法により製造することができる。例えば、前記ペプチド断片のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、目的ペプチドという。）をコードする塩基配列を有する発現ベクターにより形質転換された細胞を培養して、当該培養物から目的ペプチドを採取する工程、及び前記工程で得られた目的ペプチドの側鎖官能基のうち、望ましくない副反応を惹起する可能性を有する官能基を保護基により保護する工程を含む方法により製造することができる。発現ベクターの作製方法は、当技術分野における常法に従って行うことができる。発現ベクター作製の際には、目的ペプチドの高発現に必要なその他の要素、例えばプロモーター、ターミネーター、スプライス部位等についても従来の方法において既に知られているものを適宜用いることができる。前記発現ベクターにより形質転換される宿主細胞も特に限定されるものではなく、従来の方法において既に用いられている原核細胞又は真核細胞、例えは大腸菌等の微生物細胞、酵母又は動物細胞等から、目的ペプチドをコードする塩基配列が好適に発現できるものを適宜選択して用いることができる。目的ペプチドの側鎖官能基の保護も、上述と同一の方法で行えばよい。
【００６２】
修飾を受けたアミノ酸もしくは非アミノ酸を含まないペプチド断片は、
工程（１）；（ａ）目的ペプチドに所望によりリンカー配列を介して保護ペプチドが付加されている融合蛋白質をコードする塩基配列を有する発現ベクターにより形質転換された細胞を培養して、当該培養物から前記融合蛋白質を採取する工程；
工程（２）；工程（１）において得られた融合蛋白質から、保護ペプチド及び所望によりリンカー配列と目的ペプチドと切断分離し、所望によりさらに精製する工程；
工程（３）；（２）で得られた目的ペプチドの側鎖官能基のうち、望ましくない副反応を惹起する可能性を有する官能基を保護基により保護する工程；
を含む方法により製造することもできる。
【００６３】
保護ペプチドは、目的ペプチドが宿主細胞内で酵素により分解されるのを抑制する目的で用いられるものであり、当該目的を達成できるものであれば特に限定されないが、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼに係るアミノ酸配列を有するフラグメントを用いることができる。当該酵素に係るアミノ酸配列は当業者にとって公知であり、β−ガラクトシダーゼ由来のペプチドフラグメントは広く当業者により融合蛋白法における保護ペプチドとして用いられている。
リンカー配列は、工程（２）において保護ペプチドと目的ペプチドとの切断分離に適した酵素がない等、保護ペプチドと目的ペプチドとの切断分離がうまくいかない場合、保護ペプチドと目的ペプチドとの間に挿入される配列である。従って、工程（２）においてリンカー配列と目的ペプチドとの切断分離がうまくいくように、その配列を適宜選択することができる。
【００６４】
保護ペプチド及び所望によりリンカー配列と目的ペプチドと切断分離は、酵素的又は／及び化学的な方法で行うことができる。
酵素的及び化学的な切断方法としてはMethods in ENZYMOLOGY，185巻，Gene Expression Technology（David V．Goeddel編集、出版社ACADEMIC PRESS，INC）に記載されている方法も用いることができる。
化学的切断方法としては、メチオニンのＣ末端側をブロムシアンで切断する方法（D.V．Goeddel et al，Proc．Natl．Acad.Sci．USA，Vol.76，p106-110，1979）、-Asp-Pro-配列の間を蟻酸で切断する方法（Biochem．Biophys．Res．Commun.，Vol.40，p1173，1970）、-Asn-Gly-配列の間をヒドロキシルアミンで切断する方法及びトリプシンのＣ末端側をBNPS-スカトール又はN-クロロスクシンイミドで切断する方法等が挙げられる。例えば、目的ペプチドに係るアミノ酸配列中にメチオニンが含まれない場合は目的ペプチドに隣接する切断部位領域の末端にメチオニンを導入し、ブロムシアン処理により化学的に切断部位領域での切断を行うことができる。
また、酵素的切断方法としては、切断処理に用いる酵素が基質として特異的に認識することができる切断部位領域を設定すれば良く、それらの例としては、アルギニン−アルギニン、リジン−リジン、アルギニン−リジンおよびリジン−アルギニンの塩基性アミノ酸対の中央のペプチド結合、またはアルギニン−メチオニン、アルギニン−アラニンもしくはアルギニン−バリンのアミノ酸対の中央のペプチド結合を大腸菌ＯｍｐＴプロテアーゼ(Sugimura, K. and Nishihara, T. J. Bacteriol. 170: 5625-5632, 1988)で、X-Gly又はPro-X-Gly-Pro配列の-X-Gly-配列の間をコラゲナーゼ（Collagenase）（Proc．Natl.Acad．Sci．USA,Vol.81，p4692-4696，1984）で、-Asp-Asp-Asp-Lys-配列（配列番号：２２）のLysのＣ末端側をエンテロキナーゼ（Enterokinase）で、-Ile-Glu-Gly-Arg-配列（配列番号：２３）のArgのＣ末端側を血液凝固因子Xa（blood coagulation Factor Xa）（特開昭61-135591）で、-Gly-Pro-Arg-配列のArgのＣ末端側をトロンビン（Thrombin）（特開昭62-135500）で、-Arg-のＣ末端側をトリプシン（Trypsin）又はクロストリパイン（Clostripain）で、Arg又はLysのＣ末端側をエンドプロテアーゼ（endoprotease）Arg-C（Nature，Vol.285，p456-461，1980）で、Lys-Arg、Arg-Arg又はPro-Arg配列のＣ末端側をサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）Kex2プロテアーゼ及びその誘導体（Biochem．Biophys．Res．Commun.，Vol.144，p807-814，1987、特開平1-199578、特開平10-229884）で、LysのＣ末端側をリシル エンドペプチダーゼ（lysl endopeptidase）又はエンドペプチダーゼ（endopeptidase）Lys-C（特開昭61-275222）で、Asp又はGluのＣ末端側をスタフィロコッカス・アウレウス（S．aureus）V8プロテアーゼ（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，Vol.69，p3506-3509，1972）で、-Phe-Arg-配列のＣ末端側をカリクレイン（Kallikrein）（特開昭62-248489）で、-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr-配列（配列番号：２４）のLeu-Leuの間をレニン（renin）で（特開昭60-262595）、-Glu-Gly-Arg-配列のＣ末端側をウロキナーゼ（Urokinase）（特開平2-100685）で、Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys配列（配列番号：２５）のＣ末端側をエンテロペプチダーゼ（entero-peptidase）（Biotechnology，Vol.6，p1204-1210，1988）で、poly-GlyのＣ末端側をリソスタフィン（lysostaphin）（特開平1-160496）で、Lys-Arg，Arg-Arg又はPro-Arg等のＣ末端側をクリベロミセス・ラクチス（Kluverromyces lactls）（特開平1-124390）で切断する方法等が挙けられる。
【００６５】
本方法における発現ベクター、宿主細胞及び目的ペプチドの側鎖官能基の保護については、上記方法と同様である。
さらに、遺伝子組換法もしくは酵素法を用いた修飾を受けたアミノ酸もしくは非アミノ酸を含まないペプチド断片の製造方法は、国際公開番号：WO99/38984に記載されている方法を用いることもできる。
【００６６】
修飾を受けたアミノ酸もしくは非アミノ酸を含まないペプチド断片が、グレリン及びグレリン誘導体の修飾を受けたアミノ酸もしくは非アミノ酸を含まないペプチド断片（以下、グレリン断片（非修飾成分）という。）である場合、国際公開番号：WO 01/07475に、遺伝子組換法及び酵素法による製造方法が記載されている。
【００６７】
さらに、国際公開番号：WO 00/52193に記載されているGlucagon like peptide-1の生産で使用している保護たんぱく質及びリンカー配列を適応させて、ＯｍｐＴプロテアーゼ又はその誘導体、ならびにＫｅｘ２プロテアーゼ又はその誘導体による２段階酵素法を用いてもグレリン断片（非修飾成分）を製造することができる。この方法では宿主である大腸菌の内在性ＯｍｐＴプロテアーゼを活用することが可能なため、酵素を別途調製する必要がない。前記ＯｍｐＴプロテアーゼまたはＫｅｘ２プロテアーゼの誘導体としては、ＯｍｐＴプロテアーゼまたはＫｅｘ２プロテアーゼと同一の活性を有するものであれば特に限定されない。ＯｍｐＴプロテアーゼ誘導体としては大腸菌のＯｍｐＰプロテアーゼ、サルモレラのｐｇｔＥプロテアーゼに代表されるOmptinファミリーに属する酵素やＯｍｐＴプロテアーゼの活性部位を含む部分ペプチドなどが挙げられ、Ｋｅｘ２プロテアーゼ誘導体としては、特開平10-229884に記載の誘導体およびＦｕｒｉｎ、ＰＣ１/３に代表されるＫｅｘ２ファミリーに属する酵素などが挙げられる。
本方法では、実施例１３に示すように、国際公開番号：WO 00/52193に記載されているリンカー配列EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR（配列番号２６）の代わりに、当該配列における３５番目プロリン残基をアルギニン残基に置換した配列EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHRR（配列番号２７）をリンカー配列として用いることにより、ＯｍｐＴプロテアーゼ及びＫｅｘ２プロテアーゼを使用した２段階酵素処理法で、グレリン断片（非修飾成分）、なかでもグレリン（８−２８）断片、特にヒトグレリン（８−２８）断片を効率よく得ることができる。新たに見出された配列番号２７に記載のリンカー配列内にはＯｍｐＴプロテアーゼの切断認識部位以外にも別箇に切断認識部位が生じるにもかかわらず、目的の部位でのみ正常に切断が起きている（実施例３参照）。
【００６８】
さらに、保護ペプチド断片（非修飾成分）を精製・保存する際に、精製又は保存に用いる溶液のｐＨを４−８に調整することにより保護基の離脱を防ぐことができる。そして、保護基の脱離を抑制することにより、高回収率で高純度の修飾ペプチド又は蛋白質を調製することができる。前記精製又は保存に用いる溶液としては、水溶液が好ましい。具体的には、水、好ましくは限外ろ過水、酢酸ナトリウム溶液などが挙げられる。水溶液中での保護ヒトグレリン（８−２８）断片の安定性を調べた実施例１５から明らかなように、Ｂｏｃ基により保護されたペプチド断片は水溶液状態によってその安定性が異なり、特にｐＨ２以下の水溶液状態においては明らかな本保護基の離脱が認められたことから、保護基としてＢｏｃ基を用いた場合は、特に精製・保存時の溶液のｐＨを４−８の間に設定することが好ましい。
【００６９】
ついで、本発明においては、以上のようにして得られた（ａ）修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護ペプチド断片と、（ｂ）修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護ペプチド断片とを、縮合し、所望により、アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖官能基の保護基を脱保護する。
【００７０】
上記縮合反応は、液相法により行われることが好ましい。また、上記（ａ）及び（ｂ）のペプチド断片を液相法により縮合する反応において、前記ペプチド断片の各アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖官能基は、通常、保護基で保護されている。前記保護基としては、各官能基の保護基として上記に例示した保護基が挙げられる。好ましい保護基としては、前記（ａ）及び（ｂ）の保護ペプチド断片の保護基を、同様の脱離条件下で脱離することができる保護基が挙げられる。なお、この場合には、弱酸性離脱樹脂がすでに脱離しているため弱酸性離脱樹脂の脱離条件を考慮する必要はなく、また、この場合の側鎖官能基の保護基としては、Ｎ末端アミノ基の脱離条件で脱離する保護基がより好ましい。
【００７１】
前記（ａ）及び（ｂ）の保護ペプチド断片を液相法により縮合する反応において、縮合に用いる試薬や条件等は上述のアミノ酸縮合反応において記載したものから適宜選択される。好ましくは、ペプチド又は蛋白質のラセミ化異性体等の不純物をより副生しにくい方法から選択される。特に、縮合に用いる試薬（縮合剤）としては、例えば、２−（１−ヒドロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（１−ヒドロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、ジフェニルホスホロシアニデート（ＤＥＰＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等が好適な例として挙げられる。中でも、縮合剤が、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）であり、前記縮合剤を用いるペプチド断片の縮合が、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）又は３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）の存在下、行われることがより好ましい。
【００７２】
縮合した反応生成物において、アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の保護基は適宜脱保護することができる。この場合における脱保護の試薬や条件等は、好ましくは、ペプチド又は蛋白質のラセミ化異性体等の不純物をより副生しにくい方法から選択される。
各保護基の脱離条件は、例えば、前記「ペプチド合成の基礎と実験」等に記載されている公知の方法に従えばよい。保護基の脱離方法には、強酸、弱酸、塩基、還元試薬（接触還元、金属、チオール等）、酸化試薬、親核試薬、親電子試薬、イオン、電子、光、溶媒、酵素等をそれぞれ利用する方法があり、前記保護基の選択には、これらの脱離方法の脱離条件を考慮して行うことができる。
【００７３】
保護基の除去方法（脱保護反応）としては、例えば、トリフルオロ酢酸、酢酸、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、あるいはこれらの混合液等（好ましくはトリフルオロ酢酸、酢酸等）による酸処理；ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジン等による塩基処理；Ｐｄ−炭素等の触媒の存在下での水素気流中での接触還元；酢酸中亜鉛末処理（Ｚｎ／ＡｃＯＨ）；又は、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）処理等も用いられる。上記の脱保護反応は一般に約４０℃以下の温度で行なわれるが、好ましくは約２５℃以下で行うことにより、保護ペプチド断片のラセミ化異性体の副生を効果的に抑制することができる。上記の脱保護反応の反応時間は通常約０．５〜約５時間である。
【００７４】
上記酸処理においては、例えば、水、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、フェノール、アニソール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオール等（好ましくはフェノール等）のようなカチオン捕捉剤を添加することが好ましい。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジオール等の存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア等によるアルカリ処理によっても除去される。
【００７５】
本発明により得られた反応生成物は、例えば、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、電気泳動法等の慣用の分離精製手段により、単離精製できる。また、精製する生成物は、最終目的とする修飾されたペプチド又は蛋白質に限らず、修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護ペプチド断片、もしくは修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護ペプチド断片、又はこれらの製造工程における中間体として得られた生成物を、上述の分離精製手段により適宜精製することができることは言うまでも無い。
【００７６】
以上のようにして、修飾ペプチド又は蛋白質を製造することができる。本発明にかかる上記製造方法は、修飾ペプチド又は蛋白質であれば、特に制限なく適用されうる。中でも、グレリン、好ましくはヒト、ラット、マウス、ブタ、ニワトリ、ウナギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、カエル、ニジマス、もしくはイヌのグレリン、又はグレリン誘導体を製造する際に好適に用いられる。なお、前記各生物のグレリンの構造は、表１に記載している。本発明により得られるグレリン又はグレリン誘導体は、従来の技術により得られるグレリン又はグレリン誘導体に比べ、不純物（特にグレリン又はグレリン誘導体のラセミ化異性体）の量が大幅に少ない極めて高品質のグレリン又はグレリン誘導体である。その結果、より簡便な精製方法により十分な精製を効果的に行うことができ、作業時間を短縮し、高収率でグレリン又はグレリン誘導体を製造することができる。この点からも従来技術に比べ、本発明の製造方法はグレリン又はグレリン誘導体の工業的製造方法として極めて有利な方法である。
【００７７】
上記「高品質のグレリン又はグレリン誘導体」としてより具体的には、例えば、総類縁物質の含量が約１％以下（好ましくは約０．９％以下、より好ましくは約０．８％以下、更に好ましくは約０．７％以下）である精製グレリン又はグレリン誘導体又はその塩等が挙げられる。ここで、総類縁物質とは、高速液体クロマトグラフィー等により検出される、全ての不純物の合計を意味し、不純物としては、グレリン又はグレリン誘導体のラセミ化異性体、高極性類縁物質、その他の不純物が挙げられる。
【００７８】
本発明にかかる修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法の特に好ましい態様は、以下の通りである。すなわち、
工程１；（ａ）配列番号１〜２１のいずれかに記載のアミノ酸配列において、少なくともＮ末端の１番目から４番目のアミノ酸配列を有し、好ましくは当該アミノ酸配列においてＮ末端の１番目から５番目のアミノ酸配列からなるか、又は当該アミノ酸配列においてＮ末端の１番目から７番目のアミノ酸配列からなり、（ｂ）Ｎ末端から３番目のセリン又はスレオニンの側鎖の水酸基が、アシル化、好ましくは飽和又は不飽和の炭素数２〜３５、好ましくは６〜１８のアルキル基によりアシル化されており、（ｃ）アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、ペプチド断片作製及び下記工程（４）におけるペプチド断片の縮合反応に際して望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基、好ましくは水酸基及びアミノ基が保護基により保護されているペプチド断片を、弱酸性離脱樹脂上で製造する工程、
工程（２）；弱酸性条件で前記ペプチド断片における保護基を脱離させることなく前記ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させる工程、
工程（３）；配列番号１〜２１のいずれかに記載のアミノ酸配列において、工程（１）及び（２）で作製されたペプチド断片が有するアミノ酸配列以外のアミノ酸配列、好ましくは当該アミノ酸配列においてＮ末端の６番目から２８番目のアミノ酸配列からなるか、又は当該アミノ酸配列においてＮ末端の８番目から２８番目のアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、ペプチド断片作製及び下記工程（４）におけるペプチド断片の縮合反応に際して望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基、好ましくは水酸基及びアミノ基が保護基により保護されているペプチド断片を製造する工程、
工程（４）；前記工程（２）で製造されたペプチド断片と工程（３）で製造されたペプチド断片を縮合し、ついで、所望により反応性官能基の保護基を脱保護する工程
を含む修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法である。
【００７９】
本発明にかかる方法により得られる修飾ペプチド又は蛋白質は、反応条件により、遊離のペプチド又はその塩の形態で得られる。遊離のペプチドとその塩は、慣用の方法により相互に変換可能である。遊離のペプチドを、薬理的に許容できる塩とする場合には、例えば、次記例示の無機酸、有機酸等と反応させればよい。上記のペプチド又は蛋白質の塩としては、薬理学的に許容される塩が好ましく、このような塩としては、該ペプチド又は蛋白質がアミノ基等の塩基性基を有する場合、無機酸（無機の遊離酸とも称する）（例、炭酸、重炭酸、塩酸、硫酸、硝酸、ホウ酸等）、有機酸（有機の遊離酸とも称する）（例、コハク酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸等）等との塩があげられる。該ペプチド又は蛋白質がカルボキシル基等の酸性基を有する場合、無機塩基（無機の遊離塩基とも称する）（例、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属等）や有機塩基（有機の遊離塩基とも称する）（例、トリエチルアミン等の有機アミン類、アルギニン等の塩基性アミノ酸類等）等との塩があげられる。また、該ペプチド又は蛋白質は金属錯体化合物（例、銅錯体、亜鉛錯体等）を形成していてもよい。
【００８０】
本発明にかかる方法で製造される修飾ペプチド又は蛋白質は、種々の用途に利用することができる。例えば、上記の精製グレリン又はグレリン誘導体は、低毒性であり、哺乳動物（例、ヒト、サル、イヌ、ラット、マウス）に対して、摂食障害治療薬、成長ホルモン分泌促進薬、心疾患治療薬、胃機能性疾患治療剤、腸管粘膜保護剤もしくは経静脈栄養時の小腸粘膜障害予防剤、骨粗鬆症治療剤、慢性疾患による悪液質の減少剤、肺機能不全治療剤等の医薬品として、投与することができる。また、上記の精製グレリン又はグレリン誘導体は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、徐放性製剤等として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤、徐放性製剤等の注射剤；溶液、懸濁液剤等の経鼻投与製剤；噴霧剤もしくは吸入剤等の経肺投与製剤；座剤の形で非経口的に投与できる。上記の精製グレリン又はグレリン誘導体を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって上記製剤を製造することができる。
【００８１】
【実施例】
本発明を以下の実施例で更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本実施例において用いた試験法と機器は、特に記載しない限り以下に記載のものを使用した。
〔主な略号〕
HBTU；２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェイト（2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate）,
DCC；ジシクロヘキシルカルボジイミド（dicyclohexylcarbodiimide）,
HOBt；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（1-hydroxybezotriazole）,
HOOBt; ３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（3-hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazine）,
TFA；トリフルオロ酢酸（trifluoroacetic acid）,
TIPS；トリイソプロピルシラン（triisopropylsilane）,
DIPEA；ジイソプロピルエチルアミン（diisopropylethylamine）,
TBAF；テトラブチルアンモニウムフルオリド（tetrabutylammonium fluoride）,
TFE；トリフルオロエタノール（trifluoroethanol）,
Fmoc；フルオレニルメトキシカルボニル（fluorenylmethoxycarbonyl）,
Boc；ｔ−ブチルオキシカルボニル（t-butyloxycarbonyl）,
tBu；ｔ−ブチル（t-butyl）,
TBDMS；ｔ−ブチル ジメチルシリル（t-butyl dimethylsilyl）,
Trt；トリチル（trityl）,
Pac；フェナシル（phenacyl）,
DMF；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（N,N-dimethylformamide）,
DCM；ジクロロメタン（dichloromethane）,
NMP；Ｎ−メチルピロリドン（N-methylpyrrolidone）,
Et₂O；ジエチルエーテル（diethylether）,
DMAP；４−ジメチルアミノピリジン（4-dimethylaminopyridine）,
EDC ;１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ 1-ehtyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide）
【００８２】
〔合成に使用した保護アミノ酸と樹脂〕
Boc-Gly, Fmoc-Ser(TBDMS), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Leu, Fmoc-Ser, Fmoc-Pro（以上、渡辺化学工業社製又はアプライドバイオシステム社製）, プロリル-2-クロロトリチル樹脂（ノババイオケム社製）。
【００８３】
〔使用機器〕
（ａ）ペプチド自動合成機
アプライドバイオシステム社製：４３３Ａ合成機
（ｂ）分析用ＨＰＬＣシステム
機器：島津LC-10Aシステム
カラム：YMC-Pack PROTEIN-RP又はYMC-Pack ODS AP-302又はYMC-Pack PROTEIN-C8 (全て4.6 mmφ×150 mm)
カラム温度：40 ℃
溶出液：0.1%トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル濃度を最高100%まで直線的に変化させた。
流速：1 mL/分
検出：UV (210 nm又は214nm)
注入量：10〜50μL
【００８４】
（ｃ）分取用クロマトシステム
機器１：AKTA explorer 10S（アマシャムファルマシア社製クロマトシステム）カラム SP-sepharose big beads (XK26/30)（アマシャムファルマシア社製樹脂）
内径26mm x長さ300mm
YMC-ODS 120 s50 (HR26/15) (YMC社製樹脂)
内径26mm x長さ15mm
Vydac C4 (HR10/30) （Vydac社）
内径10mm x長さ300mm
Source 30RPC (HR10/30) 23 mL (アマシャムファルマシア社製樹脂)
内径10mm x長さ30mm
流速、溶出液等の条件は別途実施例に記載した。
機器２：Applied Biosystem BioCAD perfusion Chromatography workstation
カラム SP-Toyopearl 550-c(内径16mm x 280mm TOSOH社製)
YMC-ODS AM(粒径20μm、内径21.5mm x 300mm、YMC社製)
逆相クロマトカラムODS-80Ts
(内径21.5mm x 300mmカラム(108 mL) 粒径20um, TOSOH社製)
流速、溶出液等の条件は別途実施例に示した。
（ｄ）分取用ＨＰＬＣシステム
機器：Waters 600 Multisolvent Delivery System
カラム：YMC-Pack ODS-A (5 μm, 20 mm x 250 mm)又はYMC-Pack PROTEIN-RP (5μm, C4, 20 mm x 250mm)
溶出液：0.1%トリフルオロ酢酸中、適宜アセトニトリル濃度を最高100%まで直線的に変化させた。
流速：10 mL/分
検出：210 nm及び260 nm
注入：10〜2000μL、2000μL以上はポンプにより注入
【００８５】
（ｅ）質量分析機
機器１：フィニガンMAT TSQ700
イオン源：ESI
検出イオンモード：positive
スプレー電圧：4.5kV
キャピラリー温度：250℃
移動相：0.2%酢酸・メタノール混液（１：１）
流速：0.2 mL/分
スキャン範囲：m/z 300〜1,500
機器２：API3000(宝酒造)
検出イオンモード： positive mode
スキャンタイプ: Q1scan
流速： 0.3 mL/分
1 count/0.1msec during 5min chase
Molecular range 500〜3000 Mass
（ｆ）アミノ酸配列分析
機器：パーキンエルマー社製 アプライドバイオシステム 477A型シークエンサー
（ｇ）アミノ酸組成分析
機器：日立製作所製 L-8500型アミノ酸分析機計
試料：封管中、0.1%フェノールを含む6M塩酸で110℃、24時間加水分解した。
【００８６】
〔 [Lys^16,19,20,24(Boc)] ヒト由来グレリン(8-28)の製造スケールと概要 〕
以下、実施例２から実施例８は最終精製品として0.6 g程度の[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)（hGhrelinはヒト由来グレリンを示す。以下も同様である。）とを得ることを目的とした培養及び精製結果である。大腸菌に実施例１に示す発現ベクターを形質転換し、同実施例に示すアミノ酸配列を持つ融合蛋白質を発現させた。培養は2 Ｌ培養槽を用いた高密度培養で行い、封入体を回収した。回収した封入体の半量を用いて精製を開始した。OmpT反応[0.9 Lスケール]、陽イオン交換SP-sepharose big beads[160 mLスケール]、Boc化反応[0.5 Lスケール]、逆相カラムＹＭＣ ODS-120 s50 [80 mLスケール]、Kex2反応 [0.3 Lスケール]はそれぞれ一回ずつ行い、最終精製の逆相カラムVydac C4[ 25 mLスケール]は２回実施した。最終精製工程のみ直線濃度勾配による溶出で分画分析を実施した。また、脱溶媒にはエバポレーターを、濾過にはガラス繊維濾紙（ワットマン社）を用いた減圧濾過を実施した。
【００８７】
実施例１ hGhrelin(8-28)誘導体発現ベクターp117 8-28oRRの構築
hGhrelinのcDNA遺伝子配列（Kojimaら、Nature, 402巻, p. 656-660、1999年）に基づき、全合成オリゴDNA (ファルマシアバイオテック社)を用いてアニーリング法によりhGhrelin(8-28)のDNA断片を得た。アニーリングに用いた全合成オリゴDNAならびにアミノ酸配列を図１Aに示す。
このDNA断片を大腸菌β-ガラクトシダーゼ誘導体とヒトGlucagon like peptide-1との融合蛋白質遺伝子を導入したプラスミドpGP117ompPR(国際公開番号：WO 00/ 52193)に挿入するため、pGP117ompPRを制限酵素SalI及びSacIIで処理し、ヒトGlucagon like peptide-1遺伝子を欠失させたDNA断片を寒天ゲル電気泳動により調製した。さらにアルカリホスファターゼ処理後、先にSacII処理、T4 DNAキナーゼ処理を施したhGhrelin(8-28)誘導体遺伝子断片とT4 DNAリガーゼにより連結させた。連結したプラスミドを大腸菌DH5α株に形質転換し、プラスミドp117 8-28oPRを得た。当該プラスミドはhGhrelin（8-28）のアミノ酸配列とβガラクトシダーゼの部分断片117アミノ酸残基をEPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR（配列番号２６）というアミノ酸配列を有するリンカー配列で繋いだ融合蛋白質を発現する。
【００８８】
さらに、このプラスミドp117 8-28oPRを鋳型とし、酵素としてKOD plusポリメラーゼ（東洋紡）、プライマーには以下の２種のプライマー
ORI-RR: GGTTCCGGATCCCCTTCTCGACATCGCCGGGAACAC（配列番号２８）
SAL*R : ATAAGTCGACTTATCGTGGCTGCAG（配列番号２９）
を用いPCRを行い増幅断片を電気泳動ゲルから切り出した。さらに、これを制限酵素SalI、BamHIで処理した。先にp117 8-28oPRを同じく制限酵素SalI、BamHI処理し精製したものとこの断片とをT4 DNAリガーゼで連結させ、連結したプラスミドを大腸菌DH5α株に形質転換し、プラスミドp117 8-28oRRを得た。当該プラスミドはhGhrelin（8-28）のアミノ酸配列とβ−ガラクトシダーゼの部分断片117アミノ酸残基をEPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHRR（配列番号２７）というアミノ酸配列を有するリンカー配列で繋いだ融合蛋白質を発現する。発現する融合蛋白質を以下図１Bに示す。
【００８９】
実施例２ 大腸菌での組換えhGhrelin(8-28)融合蛋白質の発現と封入体回収
実施例１で作成したプラスミドp117 8-28oRRを大腸菌W3110株に形質転換した大腸菌を用いて3L培養槽にて2Lの培養を実施した。なおこの発現プラスミドはpBR322由来のプラスミドでlac promoterで発現誘導される。また薬剤耐性遺伝子としてテトラサイクリン耐性遺伝子を保持する。前培養はLB brothにて32℃で14時間振とう培養した。本培養には以下の組成の培地を使用した。培地組成は4g/L酵母エキス、4g/L K₂HPO4、4g/L KH₂PO₄、2.7 g/L Na₂HPO₄、0.2g/L NH₄Cl、1.2ｇ/L（NH₄）₂SO₄、2g/L MgSO₄・7H₂O、40 mg/L CaCl₂、40 mg/L FeSO₄・7H₂O、10 mg/L MnSO₄・nH₂O、10 mg/L AlCl₃・6H₂O、4 mg/L CoCl₂・6H₂O、2 mg/L ZnSO₄・7H₂O、2 mg/L Ｎa₂MoO₄・2H₂O、1 mg/L CuCl₂・2H₂O、0.5 mg/L H₃BO₄である。炭素源としてはグルコースを最初培地中に1 %添加して、37℃で培養を開始した。グルコースが枯渇した後、グリセロールを添加して培養を行った。その後培養液を加圧式菌体破砕機（マントンゴーリン）にて菌体を破砕し、さらに遠心機にて約80 gの封入体を回収した。さらに、この封入体を脱イオン水2 Lで再懸濁したのち、遠心分離機で回収することで封入体を洗浄した。最終的にOD₆₆₀値が530である封入体懸濁液200 mLを得た。
以下の実施例はこの封入体懸濁液の半分の量である100 mLを用いて行った。
【００９０】
実施例３ hGhrelin(8-28)融合蛋白質の内在性OmpTプロテアーゼによるプロセッシング
実施例２で得られた封入体懸濁液をOD₆₆₀の値が100.0になるように下記の反応条件に示す添加物と脱イオン水で希釈し、以下の反応条件でOmpT反応を実施した。
反応条件：
4M尿素、20mM Tris-HCl pH 7.4、50mM NaCl、反応容量：800 mL、反応温度32℃、反応時間40分
封入体を100OD₆₆₀/ mLになるように8M尿素400 mLで溶解希釈し、Tris-HCl、NaClを上記の濃度になるように添加し、脱イオン水で800 mLになるようにメスアップする。さらにpHを7.4に調整して反応を開始させた。反応開始0分、20分、40分でサンプリングしHPLCにて分析を行い切断率が80%を超えた40分で反応を停止させた。反応停止は5N NaOHによりpH11まで上昇させて行った。反応停止後、低速遠心により残渣を除去し、上清を得た。
[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)濃度： 2.23 mg/ mL
溶液量： 800 mL
ペプチド含量： 1.7 g
HPLC測定結果、及び質量分析の結果、正常にプロセシングが起きており、[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)が遊離していることが示された。フィニガンMAT社の質量分析計（TSQ-700）で行ったESI-MSでの測定値は4078(理論値；4077)であった。
【００９１】
実施例４ [RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)の精製（陽イオン交換による精製）
実施例３で得られたOmpTプロテアーゼ反応液上清を陽イオンクロマトグラフィーにより精製を行った。
方法：
使用カラム：SP-sepharose big beads (XK26/30)(160 mL)
（アマシャムファルマシア社製樹脂）内径 26mm x 長さ 300mm
平衡化、洗浄液: 1.5 M 尿素, 50 mM NaHCO₃ pH11
溶出液: 1.5 M尿素,0.5 M NaCl, 50 mM NaHCO₃ pH11
初期化、再生液： 0.4M NaOH
流速： 10 mL/min (2.5cm/min)
操作：
初期化、平衡化： 0.4M NaOH₂カラムボリューム → 脱イオン水2カラムボリューム → 平衡化液:100% 3カラムボリューム
サンプル負荷： サンプルを負荷し、平衡化、洗浄液でUVが下がってくるまで洗浄する（約4カラムボリューム程度）
溶出： 溶出液100%のステップワイズで実施した。
結果：溶出液で得られたペプチドの純度は９０％で、工程回収率は91.6%であった。
[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)濃度：4.75 mg/mL
溶液量： 300 mL
ペプチド含量： 1.43 g
【００９２】
実施例５ [RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)のBoc化
精製した[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)にBoc基の付加反応を行い、N末端のαアミノ基及び配列中に含まれるLys残基の側鎖のアミノ基をBoc基により保護する。
方法：陽イオンクロマト溶出液300 mL全量をガラスビーカーに移し、50% アセトニトリルになるように等量（300 mL）のアセトニトリルを加えた。さらに攪拌しながら、1Mの(Boc)₂Oを[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)内に存在するαアミノ基とリジン残基側鎖のεアミノ基数（計５箇所）の5倍モル量にあたる8.8 mL（終濃度20mM,25当量）加えた。さらにpHが９を下らないように5N NaOHで調整し、スターラーで攪拌しながら室温で60分間反応させた。
反応効率の測定はHPLC分析及び分子量の測定によりモニターした。
反応終了後ただちにエバポレーターにより脱溶媒を実施した。脱溶媒後、酢酸にてpHを5.5にあわせて沈殿をガラス繊維濾紙(ワットマン社)にて減圧濾過を行った。この工程により[N^α-Boc, Lys^16,19,20,24 (Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)を1740 mg含む溶液、580 mLを得た。
工程回収率： 116% (工程回収率が100%より大きいのは、Boc基付加によりHPLCでの吸光度が上昇し、見かけの回収率が増加したためであると考えられる。)質量分析はフィニガンMAT社の質量分析計（TSQ-700）を使用した。行ったESI-MSでの測定値は4578(理論値；4577)であった。
Boc化前（測定分子量＝4077、理論上分子量＝4077）に比べ反応後では分子量が500多くなったもの（測定分子量＝4578、理論上分子量＝4577）が主に見られた。このピークはhGhrelin(8-28)配列内のリジン残基側鎖に存在する4個所のεアミノ基、及びＮ末端のαアミノ基がBoc化された[N^α-Boc, Lys^16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)であると推定された。
【００９３】
実施例６ [N^α-Boc, Lys(Boc)^16,19,20,24]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)の逆相カラムによる精製
実施例５にて得られた[N^α-Boc, Lys^16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)を逆相カラムにて精製した。
方法：
使用カラム：YMC-ODS 120 s50 (HR26/15) 80 mL (YMC社製樹脂) 内径26mm x長さ15mm
平衡化、洗浄液： 10% アセトニトリル, 30 mM酢酸ナトリウムpH 5.5
溶出液：50% アセトニトリル, 30 mM酢酸ナトリウムpH 5.5
再生液：80% アセトニトリル
流速：7 mL/分 (2cm/分)
平衡化液で3カラムボリューム平衡化の後、サンプルを負荷し、平衡化液にて3カラムボリューム（UVが下がるまで）カラムを洗浄する。溶出は溶出液100％のステップワイズ溶出で行った。溶出後再生液でカラムを洗浄した。
溶出液は1770 mgの[N^α-Boc, Lys^16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)を含む150 mLの溶液で得られた。これに限外濾過水を75 mL添加することで1.5倍希釈し、エバポレーターにて溶液中に含まれるアセトニトリルを留去した。
工程回収率： 98%
【００９４】
実施例７ Kex2プロテアーゼによる[Lys^16,19,20,24(Boc)]-hGhrelin(8-28)の製造
実施例６で得られたペプチド溶液を以下に示す条件に調製してKex2反応を実施した。すなわち、ODS溶出液を限外濾過水で8 mg/ mLに希釈後、1M Tris-HCl pH8.3を50 mMになるように添加した。さらに0.25M CaCl₂を5 mMになるように添加し、30℃ 10min プレインキュベート後、Kex2プロテアーゼ（特開平１０−２２９８８４）溶液(1x10⁷ unit/mL)を2.5x10⁴unitとなるように加えて、スターラーで攪拌しながら、30℃の恒温槽で120分間反応させた。反応後、酢酸を用いてpH 5.5に調整し反応を停止させた。ＨＰＬＣ、質量分析及びアミノ酸分析から、切断前後で原料である[N^α-Boc, Lys^16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)は消失し、 [Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)が出現増加していることがわかり、正常にプロセシングされていることが分かった。
【００９５】
実施例８ [Lys^16,19,20,24(Boc)] hGhrelin(8-28)体の精製
実施例７で得られた[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28) を含む反応後溶液を逆相カラムにて以下の条件で精製した。
方法：
使用逆相カラムVydac C4 (HR10/30) 23 mLカラム（Vydac社） 内径10mm x長さ300mm
条件：
平衡化、洗浄液10%アセトニトリル, 0.1% TFA pH 3
溶出液： 50% アセトニトリル, 0.1% TFA pH 3
流速：2 mL/分 (線流速3cm/分)
3カラムボリューム平衡化液を流した後、Kex2反応後溶液を2回に分けて負荷(20 mg/mL樹脂)し、溶出液10%で2カラムボリューム洗浄した後、溶出液10％〜80％の直線濃度勾配を8カラムボリュームで終了するプログラムで溶出させ、続いて溶出液100% で2カラムボリューム洗浄し、この間の溶出液を6 mLずつフラクション分取した。フラクションはHPLC分析し、リンカー [N^α-Boc]-[RHHGSGSPSRHRR]及び、未切断体[N^α-Boc, Lys^16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]- hGhrelin(8-28)を含まないフラクションをプールした。
結果：
収率：84.4％ 純度97.5％
[Lys^16,19,20,24(Boc)] hGhrelin(8-28)濃度：5.62 mg/ mL
溶液量： 120 mL
ペプチド含量： 600 mg
溶出した溶液をエバポレーターにて脱溶媒を行った後、凍結乾燥を実施し、OmpTプロテアーゼ誘導体によるプロセッシングで得られた1700 mgの前駆体（実施例３）より、[Lys^16,19,20,24 (Boc)]hGhrelin(8-28)を600 mg得た(図２)。
【００９６】
実施例９ [Lys^16,19,20,24 (Boc)] hGhrelin(8-28)体の精製回収率、純度表
以下に実施例３から実施例８で示した[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)の製造収率一覧表を表２に示す。
【表２】

【００９７】
実施例１０
（１０−１）Ｎ末端側断片（[N^α-Boc, Ser^{2, 6}(tBu)]hGhrelin(1-7)）の合成
（方法１）
プロリル-2-クロロトリチル樹脂（ノババイオケム社製、1.39 g、1.0 mmol）をガラスフィルター付き反応容器に入れ、順次HBTUによるFmoc-アミノ酸の導入とピペリジンによる脱Fmocを繰り返し、N末端残基にBoc-Glyを導入して、Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(TBDMS)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-２-クロロトリチル樹脂を構築した。得られた保護ペプチド樹脂を0.1 M TBAF/DMF溶液（50 mL）で30分間処理した。ペプチド樹脂を濾取し、DMF（30 mL）で数回洗浄した後、イソプロピルアルコール、次いでDCM(30 mL)で洗浄した。次に、得られた脱TBDMSペプチド樹脂をNMP (5 mL)に膨潤させ、DMAP（374 mg, 3.1 mmol）存在下、オクタン酸（588 mg, 4.1 mmol）、EDC・HCl（848 mg, 4.4 mmol）を加え16時間反応させた。樹脂を濾取し、NMP、イソプロピルアルコール、DCMで順次洗浄し、減圧下乾燥して、３位セリン側鎖がオクタノイル化された保護ペプチド樹脂を得た。このものに、0.5% TFA/DCM溶液30 mLを加え、室温で30分間攪拌し、保護ペプチドを樹脂から離脱させた。樹脂を濾去し、濾液を濃縮後、残査に水を加え沈殿とした。沈殿を濾取した後、さらにヘキサン中で攪拌して洗浄し、再度濾取した。これを終夜、減圧して乾燥し、目的物742 mg（収率72%）を得た。HPLCによりこのものの純度を調べたところ、94%であった。
【００９８】
（１０−２）Ｎ末端側断片（[N^α-Boc, Ser^{2, 6}(tBu)]hGhrelin(1-7) ）の合成
（方法２）
プロリル-2-クロロトリチル樹脂（ノババイオケム社製、1.95 g、1.0 mmol）をガラスフィルター付き反応容器に入れ、順次HBTUによるFmoc-アミノ酸の導入とピペリジンによる脱Fmocを繰り返し、Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-２-クロロトリチル樹脂を構築した。次にHOOBt/DCCによりFmoc-Ser-OHを導入し、次いで脱FmocとHOOBt/DCCによる縮合を繰り返し、N末端残基にBoc-Glyを導入して、Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-２-クロロトリチル樹脂を構築した。得られたペプチド樹脂をNMP (5 mL)に膨潤させ、DMAP（374 mg, 3.1 mmol）存在下、オクタン酸（579 mg, 4.0 mmol）、EDC・HCl（847 mg, 4.4 mmol）を加え16時間反応させた。樹脂を濾取し、NMP、イソプロピルアルコール、DCMで順次洗浄し、減圧下乾燥して、３位セリン側鎖がオクタノイル化された保護ペプチド樹脂を得た。このものに、0.5% TFA/DCM溶液30 mLを加え、室温で30分間攪拌し、保護ペプチドを樹脂から離脱させた。樹脂を濾去し、濾液を濃縮後、残査に水を加え沈殿とした。沈殿を濾取した後、さらにヘキサン中で攪拌して洗浄し、再度濾取した。これを終夜、減圧して乾燥し、目的物715 mg（収率69%）を得た。HPLCによりこのものの純度を調べたところ、74%であった。
【００９９】
実施例１１ 断片縮合と脱保護
それぞれ実施例１０−１と実施例８で得られた[N^α-Boc, Ser(tBu)^2,6]hGhrelin(1-7)及び[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)を、あらかじめアミノ酸分析計を用い定量したのち、縮合反応に供した。[N^α-Boc, Ser(tBu)^2,6]hGhrelin(1-7)、HBTU、DIPEAそれぞれ0.19 mmolをDMF 1 mLに溶解し、30分間室温で撹拌した。その後、[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)を0.16 mmol及びDIPEA 0.48 mmolをDMF 1.5 mLに溶解し、撹拌下、前述の活性化Ｎ末端側断片溶液を滴下した。1時間後、反応溶媒を減圧留去し、残査にEt₂Oを加え析出させ、洗浄後、乾燥した。得られた粉末にTFA 6 mLを加え、30分間室温でゆるやかに撹拌した。TFAを減圧留去し、残査にEt₂Oを加え析出させ、洗浄、乾燥を経て、白色粉末状の粗ペプチド0.70 gを得た。このものを分析用HPLCで分析した結果、チャート上の目的物純度は80%であり、また全化学合成品と保持時間が一致した。さらに半合成品及び全化学合成品をコインジェクションしたところクロマト上ピークが一致した。縮合前後のHPLCチャートを図３に示す。
【０１００】
実施例１２ hGhrelinの精製
実施例１１で得られた白色粉末状の粗ペプチド0.70 gを5%酢酸で7 mg/mLに溶解し、以下の条件で精製を実施した。
方法、条件；
使用カラム：Source 30RPC (HR10/30) 23 mL カラム
(アマシャムファルマシア社製樹脂) 内径10mm x長さ30mm
平衡化、洗浄液： 10% アセトニトリル, 50mM酢酸
溶出液：60% アセトニトリル, 50mM酢酸
再生液 ：80% アセトニトリル
流速：2.5 mL/分(2cm/分)
平衡化液で3カラムボリューム平衡化の後、hGhrelin溶解液を２分し、半量ずつを負荷し、平衡化液にて3カラムボリューム（UVが下がるまで）カラムを洗浄する。溶出は溶出液０％から１００％までの直線濃度勾配を6カラムボリュームで終了するプログラムで溶出させた。溶出液は5 mLずつフラクション分画し、適時HPLCで分析し、hGhrelinを含むフラクションをプールした。プールはエバポレーターで脱溶媒した後、凍結乾燥を実施した。結果、純度98％のhGhrelinを512 mg（回収率73％）得た。精製hGhrelinのHPLCでの分析結果を図４に示す。
【０１０１】
以下の実施例１３から１５までは、上記の実施例１から１２までに示した条件の最適化に関するものである。したがって、本発明が下記条件に限定されないことは言うまでもない。
実施例１３ 融合蛋白質の配列の違いによるＫｅｘ２の切断効率の違い
Kex2の切断効率はその基質の認識配列により大きく異なる。その切断効率はin vivoでKex2切断配列KR(10)>>RR(5)>>TR(1.2) >PR(1.0) [（）内はPRを1とした際の切断効率]の順で切れにくくなる（Proc. Natl. Acad. Sci 95 p10384-10389
1998）ことが報告されている。
以下図５に実施例１で作成したp117s 8-28oPR 、p117 8-28 oRRとさらに、p117 8-28oPRを鋳型にしてPCRで作成したプラスミドp117 8-28oKRが発現する蛋白質を示す。
これら3種類の蛋白質を発現するプラスミドを保持する大腸菌W3110を用いてそれぞれ培養を実施し、実施例２から６に示した方法の約10分の１のスケールで精製を行い、それぞれ[N^α-Boc, Lys^16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHPR]-hGhrelin(8-28)(以下PR-hGhrelin(8-28))、[N^α-Boc, Lys^16,19,20,24 (Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)(以下RR-hGhrelin(8-28))、[N^α-Boc, Lys^16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHKR]-hGhrelin(8-28) （以下KR-hGhrelin(8-28)）の3種類のペプチドを調製した。
調製したペプチドについて、実施例７で示した方法を用いてKex2プロテアーゼ処理を実施した。反応開始60分のHPLCの分析プロファイルを図６に示す。
図６に示すように切断率の順番ではRR-hGhrelin(8-28)＞PR-hGhrelin(8-28)＞KR-hGhrelin(8-28)でRR-hGhrelin(8-28)が一番切断率が高かった。またKR-hGhrelin(8-28)についてはBoc基がKRのリジン残基を保護してしまい、リジンの電荷を消失させることになるため、切断がまったく起きなかった。またPR-hGhrelin(8-28)は切断効率が低く、hGhrelin(8-28)内で切断が生じた。このhGhrelin(8-28)内での分解はhGhrelinのアミノ酸番号１５のアルギニンと１６のリジンの間で切断が生じていた。
【０１０２】
実施例１４ 大腸菌の培養に適した融合蛋白質の構築
培養に適した融合蛋白質を得るため、実施例１３図５で示した融合蛋白質以外にも以下図７に示すような融合蛋白質を発現するプラスミドを作成した。図７に示すいずれの融合蛋白質ともp117 8-28oPRを鋳型にしてそれぞれ異なるプライマーからPCRで作成した。p117 8-28oRRに対して、蛋白質の等電点の低下を目的として変異体を構築した。
作成した融合蛋白質プラスミドをそれぞれ大腸菌W3110株に形質転換した大腸菌を用いて３L培養槽にて2Lの培養を実施した。前培養はLB brothにて32℃で14時間振とう培養した。本培養の培地組成は実施例２で示したものと同一である。炭素源としてはグルコースを最初培地中に1%添加して、3２℃で培養を開始した。グルコースの枯渇後、グリセロールを添加して培養を行った。またグルコースの枯渇時に培養温度を37℃に上昇させ、培養後は加圧式菌体破砕機（マントンゴーリン）にて菌体を破砕した。培養の成果については最終濁度と菌体破砕時の濁度で判断した。菌体の濁度及び、菌体破砕前後の濁度の比が高いものほど封入体の生産性が高い菌と判断した。結果を図８のグラフＡ，Ｂに示す。
グラフＡ，Ｂから分かるように最終濁度、菌体破砕後の濁度比率から、構築した融合蛋白質の中で117 8-28oRR融合蛋白質がもっとも高い生産性を示した。実施例１３、１４の結果から実施例２では当該蛋白質を発現するプラスミドp117 8-28oRRが培養にも適していると考えられた。
【０１０３】
実施例１５ [Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)の安定性
実施例６、７、８において、[N^α-Boc, Lys^16,19,20,24 (Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)及び[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)において1〜10％程度Boc基が脱離するという現象が認められた。[Lys^16,19,20,24(Boc)] hGhrelin(8-28)は付加したBoc基が一箇所でも脱離すると、その後の縮合工程で大幅な縮合率低下につながるため、Boc基の脱離を防ぐ目的で[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)の安定性を調べた。
分解に影響を及すパラメータとしては保存中のpHと保存温度が考えられた。そこで以下のような条件での安定性をHPLCにより分析し、評価した。
方法：新たに精製した[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)を30mM 酢酸ナトリウム溶液に溶解し、ｐＨ２，３，４はTFAをもちいて、pH６，７，８は5N NaOHを用いてｐＨを調整し、さらに、4℃、20℃、37℃、42℃の恒温槽で１週間放置した。放置開始後、0時間、2時間、6時間、9時間、24時間、48時間、96時間、168時間でサンプリングを行い、HPLCにて分析を実施した。解析方法としてはHPLCでの分析結果の総ピーク面積に対する[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)のピーク面積の割合（％）を経時的に評価することで行った。
結果：以下図９及び１０に保存温度毎にまとめたグラフを４種類示す。pHが低いほど（pH3以下）、温度が高いほど、分解物が増加することがわかった。またpH4以上であれば、42℃でも安定であることがわかった。よってpHをコントロールすることが、この分解物生成の抑制に重要であることが判明した。
【０１０４】
実施例１６ hGhrelin (1-28)の製造（方法２）
（１） hGhrelin (8-28)誘導体発現ベクターp117-8-28okの構築
実施例１と同一の方法で、プラスミドp117-8-28okを得た。実施例１で作成したプラスミドp117 8-28oPRとプラスミドp117-8-28okの相違は、前者のリンカー配列がEPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR（配列番号２６）であるのに対し、後者のリンカー配列はRRHHGSGSPSRHPR（配列番号３５）である点のみである。
（２） 大腸菌での組換えhGhrelin(8-28)融合蛋白質の発現
hGhrelin(8-28)融合蛋白質発現プラスミドp117-8-28okを大腸菌W3110株に形質転換し、形質転換株を得た。この株をグルコース及びグリセロールを炭素源とする20 Lの培地で培養を行い、最終OD₆₆₀値が54の培養液を得た。
（３） hGhrelin(8-28)融合蛋白質の内在性OmpTプロテアーゼによるプロセッシング
前記（２）で得られた培養液より菌体（約680 g）をTE（10mM Tris-HCl, 1mM EDTA pH8.0）バッファー20 Lに懸濁後、高圧ホモジナイザーを用いて菌体の破砕処理を２回行った。その後、遠心分離で封入体を回収し、脱イオン水で再度懸濁し、遠心分離することで封入体を洗浄した。次に遠心分離により得られた封入体ペレット（湿重量約170 g）を少量の脱イオン水で懸濁し、OD₆₆₀値が826の封入体濃縮液550 mLを得た。550 mLの封入体濃縮液より50 mLを採取後、OD660の値が50.0になるように脱イオン水で希釈し、Tris-HCl (pH8.2) 、EDTA(pH8.0)をそれぞれ終濃度50mM、1mMになるように加え、尿素（終濃度4.0M）により封入体を溶解させた。尿素により封入体を溶解することで、内在性のOmpTプロテアーゼにより融合蛋白質のリンカー配列RRHHGSGSPSRHPR（配列番号３５）のArg-Arg間を切断させた。即ち、反応溶液を30℃で５分保温後、30℃で15分OmpTプロテアーゼ処理を行った。その後3%AcOHを添加して反応を停止させた。本処理により、RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)を1.3 g得た。ESI-MS 4019 （理論値；4018） hGhrelin(8-28)融合蛋白質の内在性OmpTプロテアーゼによるプロセッシング工程の高速液体クロマトグラフィーによる解析の結果、RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)が遊離していることが示された。
【０１０５】
（４） RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)の精製（陽イオン交換による精製）
前記（３）で得られたOmpTプロテアーゼ反応液(900 mL)を、平衡化液（1.5M Urea,20mM NaCl, 10mM Tris-HCl pH8.3）にて平衡化させた陽イオン交換カラムSP-Toyopearl 550-c(bed volume 55 mL、16mmID x 280mm TOSOH社製)に４回に分けて負荷した。各回、平衡化液で十分カラムを洗浄後、平衡化液75%、溶出液（1.5M Urea,1.5M NaCl, 10mM Tris-HCl pH8.3）25%から溶出液100%の濃度勾配を1.5カラムボリュームで完了するプログラムで溶出を行った。5 mL毎にサンプリングを行い、各分画を高速液体クロマトグラフィーで分析し、大腸菌β-ガラクトシダーゼ誘導体の含まないピークを分取した。４回分の合計収量は約950 mgであった。
上記精製溶出液（660 mL）を２等分し、2%アセトニトリル、0.1%TFAで平衡化したYMC-ODS AM(粒径20μm、YMC社製)21.5mmID x 300mmカラムに２回負荷した。平衡化液で十分洗った後、溶出液 [ 50%アセトニトリル、0.095%TFA ]で溶出を行った。溶出ピークを分取後、溶出液中に含まれるアセトニトリルはロータリーエバポレーターにて除去し、RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)を720 mg含む溶液220 mLを得た。（３）、（４）で用いた高速液体クロマトグラフィーの条件を以下に示す。
カラム；YMC ODS AP-302、検出器；Hitachi高速液体クロマトグラフィーシステム（D7000）、流速；1 mL/min、溶出；バッファーA [ 1.0%アセトニトリル、0.1%TFA] 100%からバッファーB [ 50.0% アセトニトリル、0.1% TFA ] 100%の20分間直線濃度勾配。
【０１０６】
（５） RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)のt-ブトキシカルボニル（Boc）化
前記（４）で得られた試料220 mL（RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)を720 mg含む）をガラス三角フラスコに移し、等量のアセトニトリル(220 mL)を加えた。これに1Mの二炭酸ジ-t-ブチルをRHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)内に存在するαアミノ基とＬｙｓεアミノ基数（計５箇所）の5倍モル量にあたる4.4 mL（終濃度10mM,25当量）加えた。さらにトリエチルアミンにてpH9に調整し、スターラーで攪拌しながら室温で60分反応させた。反応の停止は酢酸を終濃度0.5%になるように添加し、pHを中性付近にした後、速やかにロータリーエバポレーターによりアセトニトリルを除去し、Boc-RHHGSGSPSRHPR-[Lys^16,19,20,24(Boc)] hGhrelin(8-28)を530 mg含む溶液、300 mLを得た。ESI-MS; 4519 (理論値；4518)。
Boc化前後のRHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)の溶出プロファイル、及びマススペクトロメトリー測定結から、Boc-RHHGSGSPSRHPR-[Lys^16,19,20,24(Boc)] hGhrelin(8-28)の生成を確認した。本反応のモニターには以下のクロマトシステムを使用した。カラム；YMC-C8、検出器；Hitachi高速液体クロマトグラフィーシステム（D7000）、流速；1 mL/min、溶出；バッファーA [ 1.0%アセトニトリル、0.1%TFA] 100%からバッファーB [ 60.0% アセトニトリル、0.095% TFA ] 100%の20分間の直線濃度勾配。
【０１０７】
（６）Kex2プロテアーゼによる[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)の製造
前記（５）で得られたBoc-RHHGSGSPSRHPR-[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)を逆相カラムにて精製した。2%アセトニトリル、0.1%TFA、10mM酢酸ナトリウム、pH4.5で平衡化したYMC-ODS AM(粒径20μm、TOSOH社製)21.5mmID x 300mmカラムに上記Boc誘導体（約500 mg）を負荷した。平衡化液で十分洗った後、溶出液 [ 70%アセトニトリル、0.095%TFA、10mM酢酸ナトリウム、pH4.5 ]で溶出した。Boc-RHHGSGSPSRHPR-[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)（420 mg）を含む溶出ピークを分取後、アセトニトリルをエバポレーターにて除去した。本溶液に250mM塩化カルシウム溶液、1M Tris-HCl pH8.2をそれぞれ終濃度5mM、50mMになるように添加した。30℃、5分間保温後、Kex2プロテアーゼ（特開平１０−２２９８８４）溶液(1x10⁷ unit/mL)を3x10⁴ unit/mLになるように添加し、30℃、45分間反応した。
本工程の高速液体クロマトグラフィーによる解析の結果、linker配列RHHGSGSPSRHPRと[Lys^16,19,20,24(Boc)] hGhrelin(8-28)とが切断されていることが示された。
【０１０８】
（７） [Lys^16,19,20,24(Boc)] hGhrelin(8-28)体の精製
前記（６）で得られた[Lys^16,19,20,24(Boc)] hGhrelin(8-28) (320 mg)を含む反応後溶液（300 mL）を酢酸でpH3.5に調整後、10%アセトニトリル、0.095%TFAで平衡化した逆相クロマトカラムODS-80Ts(21.5mmID x 300mmカラム(108 mL) 粒径20um, TOSOH社製)に負荷した。平衡化液で2カラムボリューム洗浄後、バッファーA [10%アセトニトリル、0.095%TFA] 70%、バッファーB [65%アセトニトリル、0.1%TFA]30%からバッファーB 100%の濃度勾配を5カラムボリュームにて完了するプログラムを行い、[Lys^16,19,20,24(Boc)] hGhrelin(8-28)体を溶出させた。フラクション(5 mLずつ)を分取し、高速液体クロマトグラフィー（条件は（６）と同様である）にて分析を行った。 [Lys^16,19,20,24(Boc)] hGhrelin(8-28)の溶出画分を集め。濃縮後、凍結乾燥し、136 mgの[Lys^16,19,20,24(Boc)] hGhrelin(8-28)体を得た。OmpTプロテアーゼ誘導体によるプロセッシングで得られた1300 mgの前駆体（前記（３））より136 mgの[Lys^16,19,20,24(Boc)] hGhrelin(8-28)体最終標品を得た。
【０１０９】
（８−１）N末側断片（[N^α-Boc, Ser^{2, 6}(tBu)] Ghrelin(1-7)の合成 （方法１）
プロリル-2-クロロトリチル樹脂（ノババイオケム社製、548 mg、0.25 mmol）上に、ペプチド自動合成機を用いて、順次HBTUによるFmoc-アミノ酸の導入とピペリジンによる脱Fmocを繰り返し、N末端残基にBoc-Glyを導入して、Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(TBDMS)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-２-クロロトリチル樹脂を構築した。得られた保護ペプチド樹脂 (757 mg )を0.1 M TBAF/DMF溶液（5 mL）で1時間処理した。ペプチド樹脂をろ取し、DMF（10 mL）で数回洗浄した後、イソプロピルアルコール、ついで塩化メチレン(10 mL)で洗浄した。次に、得られた脱TBDMSペプチド樹脂をDMF (10 mL)に膨潤させ、DMAP（31 mg, 0.25 mmol）存在下、オクタン酸（144.2 mg, 1.0 mmol）、EDC・HCｌ（211 mg, 1.1 mmol）を加え16時間反応させた。樹脂をろ取し、DMF、イソプロピルアルコール、塩化メチレンで順次洗浄し、減圧下乾燥して、３位セリン側鎖がオクタノイル化された保護ペプチド樹脂を得た。このものに、酢酸 2 mL / TFE 2 mL / 塩化メチレン 6 mLの混合溶液を加え、室温で１時間攪拌し、保護ペプチドを樹脂から離脱させた。樹脂をろ去し、ろ液を濃縮後、残査にエーテルを加え沈殿とした。沈殿をろ取、乾燥し、粗ペプチド248 mg（収率96%）を得た。本品を酢酸水及びアセトニトリルの混液約2 mLに溶解し、YMC-Pack ODS-A（20 mm x 250mmに添加し、0.1% トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル40%から80%までの60分間直線グラジエント（流速:10 mL/min）で溶出させた。目的画分を分取後、凍結乾燥し、210 mgの目的物を得た。
【０１１０】
（８−２）N末側断片（[N^α-Boc, Ser^{2, 6}(tBu)] Ghrelin(1-7)の合成 （方法２）
プロリル-2-クロロトリチル樹脂（ノバビオケム社製、466 mg、0.25 mmol）上に、ペプチド自動合成機を用いて、順次HBTUによるFmoc-アミノ酸の導入とピペリジンによる脱Fmocを繰り返し、N末端残基にBoc-Glyを導入して、Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(Trt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-２-クロロトリチル樹脂を構築した。この樹脂を1% TFA, 5% TIPS / ジクロロメタンで30 min処理することにより、Trt基の除去及び樹脂からの切断を同時に行った。樹脂をろ去した後、ジクロロメタンを減圧留去して濃縮し、これにEt₂Oを加えて析出させ乾燥したところ、白色沈殿としてBoc-Gly-Ser(tBu)-Ser-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-OHを165 mg得た。次に、臭化フェナシル（Phenacyl Bromide、40 mg、1.1当量）、トリエチルアミン（20 mg、1.1当量）を加え、DMF 約3 mL中で2 hr反応させた。反応後、反応溶液を約5倍量の酢酸エチル中に入れ、水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムを加え乾燥させ、これをろ去した後濃縮し、Et₂Oで析出させ乾燥したところ、白色沈殿としてBoc-Gly-Ser(tBu)-Ser-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-OPacを得た。次に、オクタン酸（18.2 mg、1.1当量）、EDC・HCl（26.4 mg、 1.2当量）、DMAP（1.4 mg、0.1当量）を加え、DMF約2 mL中で終夜反応させた。、反応溶液を約5倍量の酢酸エチル中に入れ、水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムを加え乾燥させ、これをろ去した後濃縮、Et₂Oで析出させ乾燥し、白色沈殿としてBoc-Gly-Ser(tBu)-Ser(Octanoyl)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-OPacを144 mg得た。次に、酢酸 1.5 mL、亜鉛末（Zinc Powder、163 mg、20当量）を加え1 hr反応させた後、ろ過し、冷水を加え析出させ、Et₂Oで洗浄し乾燥した。白色沈殿としてBoc-Gly-Ser(tBu)-Ser(Octanoyl)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-OHを65 mg得た。本品を酢酸水及びアセトニトリルの混液約2 mLに溶解し、YMC-Pack ODS-A（20 mm x 250mmに添加し、0.1% トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル40%から80%までの60分間直線グラジエント（流速:10 mL/min）で溶出させた。目的画分を分取後、凍結乾燥して目的物50 mgを得た。
【０１１１】
（９） 断片縮合と脱保護
それぞれ前記（８−１）と前記（７）で得られた [N^α-Boc, Ser(tBu)^{2, 6}]-Ghrelin(1-7)及び[Lys^{16, 19, 20, 24}(Boc)] hGhrelin(8-28)を、あらかじめアミノ酸分析計を用い定量したのち、縮合反応に供した。[N^α-Boc, Ser(tBu)^{2, 6}]-Ghrelin(1-7)を19.3 μmol、HBTU 20.3 μmol及びDIPEA 20.3 μmolをDMF 500μLに溶解し、1時間室温で撹拌した。その後、[Lys^{16, 19, 20, 24}(Boc)] hGhrelin(8-28)を18.4 μmol及びDIPEA 55.2 μmolをDMF 1 mLに溶解し、撹拌下、前述の活性化N末側断片溶液を滴下した。3時間後、反応溶媒を減圧留去し、残査にEt₂Oを加え析出させ、洗浄後、乾燥した。えられた粉末にTFA 3 mLを加え、30 min室温でゆるやかに撹拌した。TFAを減圧留去し、残査にEt₂Oを加え析出させ、洗浄、乾燥を経て、白色粉末状の粗ペプチド77 mgを得た。このものを分析用HPLCで分析した結果、チャート上の目的物純度は83%であり、また化学合成品と保持時間が一致した。さらに半合成品及び全合成品をコインジェクションしたところクロマト上ピークが一致した。
【０１１２】
（１０） hGhrelin(1-28)体の精製
前記（９）で得られた白色粉末状の粗hGhrelin 67 mgを1%酢酸で1 mg/mLに溶解し、0.1 M酢酸で平衡化した逆相クロマトカラムTSK-ODS-80Ts 108 mL (ID21.5 mm x 300 mm) に負荷した。平衡化液で2カラムボリューム洗浄後、バッファーA [0.1M酢酸] 100%からバッファーB [40%アセトニトリル、0.1M酢酸]100%の濃度勾配を5カラムボリュームにて完了するプログラムを行い、hGhrelin(1-28)体を溶出させた。高純度の画分を集め、凍結乾燥してhGhrelin(1-28) 34.4 mgを得た。
ESI-MS 3371 (理論値 3370.86)、6N塩酸化水分解後のアミノ酸組成比 Ala ; 1.01 （1）, Arg ; 2.97 （3）, Glx ; 5.95 （6）, Gly ; 1.02 （1）, His ; 1.00 （1）, Leu ; 2 （2）, Lys ; 4.01 （4）, Phe ; 1.00 （1）, Pro ; 4.01 （4）, Ser ; 3.60 （4）, Val ; 1.00 （1） （括弧内は理論値）、Ca mobiliｚation活性 1.3 nM（ref.1.5 nM）
【０１１３】
実施例１７ Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(TBDMS)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-OHの脱TBDMS条件とオクタノイル化条件の最適化
実施例１６（８−１）の方法に従って、3位セリンTBDMS基の除去反応及びオクタノイル化反応の最適条件について検討した。プロリル-2-クロロトリチル樹脂上に、ペプチド自動合成機（アプライドバイオシステムジャパン(株)製、433A）を用いて、順次HBTUによるFmoc-アミノ酸の導入とピペリジンによる脱Fmocを繰り返し、N末端残基はBoc-Glyを導入することにより、Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(TBDMS)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-２クロロトリチル樹脂を構築した。次に、樹脂を0.05 mmol（約150 mg）ずつに分け、表３及び表４に示す条件でオクタノイル化を行った。樹脂の洗浄、樹脂からのペプチド切断等の条件は、実施例１６（８−１）と同様に行った。
その結果、TBDMS基の除去反応は0.1 M TBAF溶液を用いて30分間から1時間反応させることが好ましく、またオクタノイル化反応はオクタン酸4当量、EDC 4.4当量、DMAP 1当量を用いて8〜16時間反応させることが好ましいことが明らかになった。
【表３】

a ; TBDMS基の除去率は、TBAF処理したペプチド樹脂をオクタノイル化したのち、脱保護して得られるオクタノイル体とTBDMS未除去を示すデスオクタノイル体との比で求めた。オクタノイル化は、オクタン酸4当量、EDC 4.4当量、DMAP 1当量を用い、24時間反応。
b ; プロリル-2-クロロトリチル樹脂の置換率を基準に算出。
c ; 目的物純度及び比率は、分析用HPLCにより算出。
d ; N.D.検出されず。
【表４】

a ; 全てのサンプルは0.1 M TBAFで１時間処理して、TBDMS基を除去した。
b ; プロリル−２−クロロトリチル樹脂の置換率を基準に算出。
c ; 目的物純度及び比率は、分析用HPLCにより算出。
d ; N.D. 検出されず。
【０１１４】
実施例１８ 断片縮合条件の検討
[N^α-Boc, Ser(tBu)^2,6]hGhrelin(1-7)と[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)を用い、種々の縮合試薬の反応効率を検討したところ、HBTUがもっとも良い結果を与えたが、EDC/HOBt、EDC/HOSu、DPPAでも反応が進行することが明らかになった。
【表５】

【０１１５】
【発明の効果】
本発明の製造方法により、非常に高品質の修飾ペプチド又は蛋白質を高収量で得ることができる。
【０１１６】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、hGhrelin(8-28)の全合成オリゴDNAならびにアミノ酸配列を表している。図１Ｂは、p117 8-28oRRにより発現されるhGhrelin(8-28)融合蛋白質のアミノ酸配列を示している。
【図２】図２は、精製した[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)のHPLC分析結果を示している。ピーク ア）は、[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)のピークを示す。
【図３】図３は、断片の縮合反応を示している。ピークＡは[N^α-Boc, Ser^2,6(tBu)]hGhrelin(1-7)のピークを、ピークＢは[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)のピークを、ピークＣは[N^α-Boc, Ser^2,6(tBu), Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelinのピークを、ピークＤはhGhrelinのピークを示す。
【図４】図４は、精製したhGhrelinのHPLC測定結果を示している。
【図５】図５は、Kex2プロテアーゼの切断認識部位が異なる融合蛋白質のアミノ酸配列を示している。
【図６】図６は、図５で作成した各融合蛋白質のKex２切断効率をHPLCで分析した結果を示している。図６Ａは、PR-hGhrelin(8-28)のKex２酵素反応後のHPLC分析結果を示す。図６Ｂは、RR-hGhrelin(8-28)のKex２酵素反応後のHPLC分析結果を示す。図６Ｃは、KR-hGhrelin(8-28)のKex２酵素反応後のHPLC分析結果を示す。ピーク ア）は、リンカー配列を含む[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)のピークを示す。ピーク イ）は、[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)のピークを示す。ピーク ウ）は、[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(16-28)のピークを示す。
【図７】図７は、培養に最適な融合蛋白質を決定するために作成した各hGhrelin(8-28)融合蛋白質のアミノ酸配列を示している。
【図８】図８Ａは、融合蛋白質の違いによる培養結果の差を示し、図８Ｂは、各融合蛋白質での培養液の菌体破砕前の濁度に対する菌体破砕後の濁度（融合蛋白質による相違）を示している。
【図９】図９は、[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)の安定性評価結果を示している。
【図１０】図１０は、[Lys^16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)の安定性評価結果を示している。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a modified peptide or protein, and a method for producing a protected peptide fragment containing one or more modified amino acids or non-amino acids that are preferably used in the production method.
[0002]
[Prior art]
Endogenous growth hormone secretagogue (GHS) for growth hormone secretagogue receptor (GHS-R), one of the orphan receptors, was purified and isolated from rat stomach in 1999 and named ghrelin (Kojima et al., Nature, 402, p.656-660, 1999). This peptide is known to have a characteristic structure in which the hydroxyl group of a serine residue is acylated with a fatty acid. In addition, from vertebrates other than rats, such as humans, mice, pigs, chickens, eels, cows, horses, sheep, frogs, rainbow trout or dogs, ghrelin with a serine or threonine residue at the 3-position has a fatty acid modification site. Or estimated from cDNA (Table 1). For example, human ghrelin consists of 28 amino acids, and the serine side chain at position 3 is acylated with a fatty acid (n-octanoic acid). This novel peptide has a strong growth hormone secretion-promoting activity, and it has been found that fatty acid modification of serine 3- or threonine is essential for its expression (Kojima et al., Nature, 402, p.656-660). 1999). In addition, it has been elucidated that ghrelin secreted from the stomach functions as a blood hormone in the regulation of growth hormone secretion, and is interested in the physiological role of ghrelin and its application to pharmaceuticals.
[0003]
[Table 1]

In addition to the octanoyl group (C8), there are modified butanoyl groups (C4), hexanoyl groups (C6), decanoyl groups (C10), and dodecanoyl groups (C12). There are also modifications with unsaturated fatty acids.
[0004]
Some peptides or proteins, such as ghrelin and cholecystokinin, have a specific amino acid residue in the amino acid sequence that is modified by acylation, sulfonation, sugar addition, or phosphorylation. There is something that expresses an important role. These modifications are considered to be carried out by a precise enzyme system in vivo, and no general method has been reported so far for producing high-quality, efficient peptides and proteins in large quantities. . For example, ghrelin exhibits growth hormone secretion-promoting action by modifying certain amino acid side chains with long-chain fatty acids, so fatty acid modification is an essential structural element. Thus, it has not been clarified at present whether the fatty acid is ester-bonded to the hydroxyl group of a specific amino acid side chain or whether the fatty acid is elongated. In particular, ghrelin is a physiologically active peptide that was first shown to have a structure in which the hydroxyl group of the amino acid side chain was modified with a fatty acid, so this peptide is a pharmaceutical product such as an eating disorder drug or a growth hormone secretagogue. Although it is a useful peptide hormone expected as a peptide, the production of a peptide having a fatty acid modification in a specific hydroxyl group-containing amino acid side chain has not been generalized, that is, industrially advantageous for mass production. At present, no manufacturing method has been established.
[0005]
Currently, various peptides or protein preparations such as insulin, growth hormone, calcitonin, atrial natriuretic peptide, LH-RH derivative, and corticotropin derivative are used as pharmaceuticals. As a method for producing these peptides or proteins, a chemical synthesis method, an enzyme method, or a gene recombination method is known. Which method is selected is appropriately selected. Generally, when the number of residues is small, a chemical synthesis method is selected, and when the number of residues is large, an enzymatic method or a gene recombination method is selected.
[0006]
For example, the chemical synthesis method is the method that can most reliably produce a bioactive peptide or protein having a modification such as ghrelin. Many methods for producing modified peptides or proteins have already been reported by chemical synthesis methods. Examples of ghrelin include Bednarek et al. (J. Med. Chem., 43, p. 4370-4376, 2000), Matsumoto et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., 284, p. 655-659, 2001). Year). In addition, International Publication No. WO 01/07475 describes a chemical synthesis method as a method for producing ghrelin and a peptide that is a ghrelin derivative or a salt thereof. However, in the production method by the chemical synthesis method, there is usually a limit to the chain length of the peptide that can be synthesized with a certain quality (purity). The liquid phase chemical synthesis method is capable of synthesizing highly pure peptides, but the synthesis of long-chain peptides is not common in terms of solubility, long production steps, special techniques required for reaction treatment, and the like. That is, it is difficult to manufacture a large amount efficiently by a manufacturing method using a liquid phase chemical synthesis method. On the other hand, the solid-phase chemical synthesis that extends the peptide chain on the resin has a simplified process and is more advantageous for mass production. However, this method can naturally be constructed to obtain a target of constant quality. Chain length is limited. In addition, since the reagent is used in excess, there is also a problem that it is inferior in economical efficiency especially in the production of a long chain peptide.
[0007]
In addition, the method of enzymatically linking peptide fragments as in the enzymatic method is superior in that the protection of amino acid side chains can be minimized, but in this method, the reverse reaction of hydrolysis is usually used. However, it is not practical because it is difficult to set conditions.
On the other hand, the production of a physiologically active peptide or protein by a genetic recombination method is a useful production method suitable for mass production. However, in the method using prokaryotic organisms such as Escherichia coli having high productivity, since the prokaryotic organism does not have a post-translational modification system, it is difficult to directly produce a peptide having a modified site. In genetic recombination methods using eukaryotic cells such as yeast and various egg cells, modifications such as sugar modification, acylation, sulfonation, and phosphorylation are possible. For example, only a certain length of fatty acid is introduced. Difficult to do. Among the isolated ghrelins, not only octanoic acid (C8) but also butanoic acid (C4), decanoic acid (C10), or those having these unsaturated fatty acids have been discovered. The difficulty of controlling the introduction of fatty acids is obvious. In addition, since the productivity of eukaryotic cells is generally low, the production system of yeast and various egg cells having a modification system is much from the viewpoint of mass production of modified peptides or proteins such as ghrelin. There is room for improvement.
[0008]
As described above, there are chemical synthesis methods for synthesizing modified peptides or proteins, and various reports have already been made. However, in order to produce them in large quantities, there is room for improvement in terms of yield and cost. There is. It is difficult to produce a peptide or protein that has been directly translationally modified by gene recombination using prokaryotic cells such as E. coli. In addition, production by genetic recombination using eukaryotic cells such as yeast also has problems in terms of unity or productivity, and there is room for improvement in order to overcome this problem. The enzymatic method using the reverse reaction of the hydrolysis reaction is difficult to set each condensation condition and cannot be said to be an advantageous method for mass production.
In this way, conventionally known chemical synthesis methods, enzyme methods, and gene recombination methods are applied alone to produce peptides or proteins having modifications such as sugar modification, acylation, sulfonation, phosphorylation, etc. There is room for further improvement in satisfying the quantitative factors and producing efficiently.
[0009]
Thus, a semi-synthetic method combining a chemical synthesis method and a gene recombination method is mentioned as one of methods for making use of the advantages of the above method and compensating for the drawbacks. The important point of this production method is to efficiently produce peptide fragments in a form suitable for condensation. A peptide fragment having a modified amino acid residue (hereinafter also referred to as a modifying component) and a peptide fragment not having a modified amino acid residue (hereinafter also referred to as an unmodified component) are N-terminal or C-terminal. It may be on either side, and there may be a plurality of modifying components. The production method can be designed appropriately according to the target peptide or protein. As an example, the case where the modifying component is present on the N-terminal side and the other peptide fragment condensed with the peptide fragment (modifying component) is an unmodified component will be described in detail.
The native chemical ligation method (Dawson et al., Science, 266, p.776-779, 1994), which has been attracting attention in recent years, has a defect that a Cys residue remains in the Ligation site. The proposed thioester method was proposed. For example, Kawakami et al. Reported the synthesis of phosphorylated peptides by a method using a thioester (Tetrahedron Letter, 41, p.2625-2628, 2000).
[0010]
Specific examples of the thioester method are shown below. In the synthesis example of phosphorylated p21Max protein (Kawakami et al., Tetrahedron Lett., 39, p.7901-7904, 1998), a peptide fragment containing a phosphate modification site by a solid phase chemical synthesis method (modifying component) ( 13 mer) as the thioester. On the other hand, a peptide fragment having a sequence in which one amino acid residue is added to the N-terminus of the unmodified component is produced in E. coli, and glyoxylic acid is allowed to act on this in the presence of divalent copper or nickel ions. After converting the added amino acid residue to an α-ketoacyl group, the side chain amino group is protected with a Boc group. Next, by removing the α-ketoacyl group with phenylenediamine, a peptide fragment (unmodified component) in which only the amino group of the N-terminal amino acid residue is released is prepared. Finally, both these fragments are condensed by adding an active esterifying agent such as silver salt and excess HOOBt.
[0011]
The above method still has the following problems. In the production of peptide fragments (modifying components), there is a problem in stability of the thioester, and the yield is described as 11%. In the production of peptide fragments (unmodified components), this method using an α-ketoacyl group is highly selective as a chemical method for releasing the N-terminal amino group, but the α-ketoacyl group is unstable and In the production of bioactive peptides or proteins for pharmaceuticals, there remains a problem of safety in that a mutagenic substance such as phenylenediamine is used for group elimination. Further, in the condensation reaction of both fragments, active esterifying agents such as silver salts and excess HOOBt are used, and there are problems in terms of racemization, toxicity and cost.
[0012]
A semi-synthetic method combining a chemical synthesis method and a gene recombination method is also described in International Publication No. WO 01/07475 as a method for producing ghrelin and a peptide that is a ghrelin derivative or a salt thereof. More specifically, there is a method for preparing rat ghrelin (1-28) by condensing rat ghrelin (1-5) prepared by chemical synthesis and rat ghrelin (6-28) prepared by gene recombination. Are listed. However, since this method also has the following problems, there is much room for improvement in order to make it a production method advantageous for efficient industrial production. That is, when the peptide chain is released from the resin by TFA to obtain rat ghrelin (1-5), the Boc group and t-Bu group are simultaneously removed, so it is necessary to introduce the Boc group to the N-terminal again. In addition, since the Ser side chain is unprotected, there is room for improving productivity in that a strong activator cannot be used for condensation with rat ghrelin (6-28). In addition, in the process of condensing protected rat ghrelin (1-5) and protected rat ghrelin (6-28), the C-terminal amino acid of the acyl peptide fragment can be racemized, so there is room for improvement to suppress this. It was. Ghrelin (mn) means a peptide having the m-th to n-th amino acid sequence from the N-terminus of ghrelin. The same applies to the following.
[0013]
There are also some problems when preparing protected peptide fragments (unmodified components). International publication number: The production method of protected rat ghrelin (6-28) described in WO 01/07475 basically adopts a two-step enzyme treatment method (international publication number WO99 / 38984), and its processing enzyme Two types of enzymes, recombinant V8 protease derivative (rV8D5) (Japanese Patent Laid-Open No. 9-47291) and Kex2 protease (Japanese Patent Laid-Open No. 10-229884) are used. However, a plasmid (pG97s rGR) that expresses a fusion protein containing protected rat ghrelin (6-28) is a plasmid that highly expresses a fusion protein of E. coli β-galactosidase derivative and human parathyroid hormone (1-34). -296000), it may be necessary to select a linker sequence suitable for the amino acid sequence when preparing a protected peptide fragment (unmodified component).
Furthermore, protected rat ghrelin (6-28) has a phenomenon that the protecting group is removed in an aqueous solution, and the recovery rate in purification is as low as 10%, and there is still a problem in terms of stably supplying a large amount of ghrelin.
As described above, even by a combination of the chemical synthesis method and the gene recombination method, it is possible to realize a method for producing a modified physiologically active peptide or protein that is efficient and can be used as a pharmaceutical product with high efficiency. Has further challenges.
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a simple and efficient industrial production method of a modified peptide or protein. Specifically, in the present invention, a peptide fragment (modified component) containing a modified site is produced by a chemical synthesis method, a peptide fragment (unmodified component) containing no modified site is produced by a genetic recombination method, It is an object of the present invention to provide a method for producing a physiologically active peptide or protein efficiently subjected to high-quality modification by condensation. As described above, each of these peptide fragments (modified component and unmodified component) may be either an N-terminal fragment or a C-terminal fragment, and a plurality of modifying components may be present. The production method can be designed appropriately according to the target peptide or protein. The present invention also provides a method for producing a protected peptide fragment (modifying component) suitable for a condensation reaction under mild conditions that do not affect the structure of the modified site, and a protected peptide fragment (unmodified). It is an object of the present invention to provide a method for producing a protected peptide fragment (modifying component) suitable for condensation with a component. Furthermore, an object of the present invention is to provide a highly safe method for producing a modified physiologically active peptide or protein so that the obtained product can be used as a pharmaceutical product. In particular, an object of the present invention is to provide a simple and efficient industrial production method for ghrelin and ghrelin derivatives.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have improved the method for synthesizing peptide fragments (modifying components) containing amino acids modified with an acyl group in ghrelin or a derivative thereof using ghrelin as a raw material, and a process for producing peptide fragments (modifying components) We have established a method that can greatly simplify and improve efficiency. That is, a peptide main chain sequence of a peptide fragment (modifying component) is constructed on a weakly acidic leaving resin such as 2-chlorotrityl resin, followed by residue-selective modification, followed by treatment with a weak acid such as acetic acid. It was found that a protected modified peptide can be cut out from the resin. As a conventional technique, there has been known a method of introducing a modifying group on a resin such as a Wang resin that can be cut out from the resin with trifluoroacetic acid or the like, and then removing the protective group together with the cutting out from the resin. However, in this method, the cleaved peptide fragment (modified component) is subsequently subjected to a condensation reaction with the other peptide fragment (unmodified component), so that the protecting group is also removed along with cleaving from the resin. The method according to the prior art is not preferable from the viewpoint of simple and efficient production because the protecting group must be introduced again. Therefore, the present inventors used a weak acid (including a diluted strong acid) that does not easily remove the protecting group of the amino acid side chain for cleaving the peptide fragment (modifying component) from the resin. As a method for selectively modifying residues by removing specific amino acid side chain protecting groups on the resin without leaving the resin, the method using quaternary ammonium fluoride has been intensively studied. As a result, I found out. Conventionally, among quaternary ammonium fluorides, tetrabutylammonium fluoride (TBAF) has been used as a reagent for releasing peptides from solid phase resins (J. Chem. Soc., Chem. Commun., P.414). -415, 1988, Tetrahedron Letters, 34, p.7599-7602 (1993), the present inventors have found that peptides constructed on weakly acidic release resins do not release from the resin by TBAF treatment. As a result, when TBAF is used, the peptide does not leave the resin, and therefore, it is possible to remove a protecting group of a specific amino acid side chain on the resin and perform residue-selective modification. During the condensation reaction with the peptide fragment (unmodified component) in the next step by cutting out the peptide fragment (modified component) from the resin using a weak acid (including diluted strong acid) that does not easily remove the side chain protecting group. In addition, the process of protecting the peptide fragment (modifying component) in advance is not necessary, and the production process of the bioactive peptide or protein subjected to the modification can be greatly simplified and made efficient.
[0016]
Furthermore, the present inventors improved the method for preparing a protected peptide fragment (unmodified component) of ghrelin, and prepared an optimal linker sequence for preparing a large amount of a protected ghrelin (8-28) fragment by a two-step enzyme treatment method. I found it. Furthermore, the present inventors have established a method capable of greatly simplifying and increasing the efficiency of the production process of a protected peptide fragment (unmodified component) by purifying under pH conditions where the protecting group does not leave. That is, the phenomenon in which the protecting group is removed during preparation of the protecting peptide depends on the pH and temperature of the aqueous solution. By setting the pH of the aqueous solution to 4-8, removal of the protecting group can be prevented, and the protecting peptide ( It has been found that (unmodified components) can be prepared.
[0017]
In addition, the inventors have found a production method that improves the condensation method of each peptide fragment, suppresses racemization during amino acid activation and condensation, and can obtain ghrelin or a ghrelin derivative with higher quality and higher yield. . In particular, the method for producing ghrelin using a weakly acidic release resin has an advantage that formation of diketopiperazine caused by a side reaction can be suppressed. That is, since the C-terminal amino acid residue is proline at the 7-position, when the third amino acid (Leu) is condensed to the dipeptide (-Ser-Pro-), the side reaction is caused by winding diketopiperazine and leaving the resin. Can be minimized.
Based on this finding, further, an acyl group, a phosphoric acid group or a sulfuric acid group, not to mention an alkyl group, is connected to an amino acid or non-amino acid side via a glycosidic bond, a disulfide bond, an ether bond, a thioether bond or an amide bond. The present invention was completed by finding that it can be easily applied to the production of physiologically active peptides or proteins having various modified structures bound to chains.
[0018]
That is, the present invention
(1) A weak acidic release resin is used, Formula 1; -A (R)-(wherein A represents an amino acid or a non-amino acid, and R represents a substituent bonded to the side chain of A. A method for producing a protected peptide fragment comprising one or more amino acids or non-amino acids subjected to the modification represented by
(2) (a) A peptide fragment having a desired sequence of amino acids and / or non-amino acids whose side chains are protected is prepared on a weak acid leaving resin, and (b) the peptide fragment is formed on the weak acid leaving resin. Deprotecting the protective group of the side chain of amino acid or non-amino acid A to be modified by substituent R without leaving from (c) modifying the deprotected side chain with substituent R; The method for producing a peptide fragment according to (1), wherein the peptide fragment is cut out from the weakly acidic release resin,
(3) The protective group on the side chain of amino acid or non-amino acid A is a silyl-based protective group, and quaternary ammonium fluoride is used for deprotection of the protective group (1) or (2) A method for producing the peptide fragment described in
(4) The silyl protecting group is t-butyldimethylsilyl (TBDMS), t-butyldiphenylsilyl (TBDPS), triisopropylsilyl (TIPS), triisobutylsilyl (TIBS), t-hexyldimethylsilyl (ThxDMS) or The peptide according to (3) above, which is triphenylsilyl (TPS) and the quaternary ammonium fluoride is tetrabutylammonium fluoride (TBAF), tetraethylammonium fluoride (TEF), or ammonium fluoride. A method for producing fragments,
About.
[0019]
The present invention also provides:
(5) A is serine, threonine, cysteine, homocysteine, lysine, ornithine, glutamic acid, 2-aminoadipic acid, diaminoacetic acid, 2-aminomalonic acid, aspartic acid, tyrosine or asparagine, R is an ester bond, ether The peptide according to (1) to (4) above, which is bonded to the side chain of A via a bond, a thioether bond, a disulfide bond, an amide bond, an O-glycoside bond, an N-glycoside bond, or the like. A method for producing fragments,
(6) The method for producing a peptide fragment according to (5), wherein A is serine or threonine, and R is bonded to the side chain of A via an ester bond,
(7) The method for producing a peptide fragment according to (6), wherein the peptide fragment is ghrelin or a derivative thereof, or a part containing a modified amino acid in the ghrelin or the derivative thereof,
About.
[0020]
The present invention also provides:
(8) A modification represented by (a) Formula 1; -A (R)-(wherein A represents an amino acid or a non-amino acid, and R represents a substituent bonded to the side chain of A). A protected peptide fragment containing at least one amino acid or non-amino acid is produced using a weakly acidic release resin, and separately from the peptide fragment of (a), (b) a modified amino acid or non-amino acid A method for producing a modified peptide or protein, comprising producing a protected peptide fragment containing no amino acid and condensing the peptide fragments produced in (a) and (b) above,
(9) The protected peptide fragment containing one or more modified amino acids or non-amino acids is produced by the method according to (2) to (4) above, Method for producing modified peptide or protein,
(10) A is serine, threonine, cysteine, homocysteine, lysine, ornithine, glutamic acid, 2-aminoadipic acid, diaminoacetic acid, 2-aminomalonic acid, aspartic acid, tyrosine or asparagine, R is an ester bond, ether The modified peptide or protein according to (8) or (9) above, which is bonded to the side chain of A by a bond, thioether bond, disulfide bond, amide bond, O-glycoside bond or N-glycoside bond Manufacturing method,
(11) A method for producing a modified peptide or protein according to (10) above, wherein A is serine or threonine, and R is bonded to the side chain of A via an ester bond,
(12) The method for producing a modified peptide or protein according to (11) above, wherein the modified peptide or protein is ghrelin or a derivative thereof,
About.
[0021]
The present invention also provides:
(13) The method for producing a modified peptide or protein according to the above (8) to (12), wherein the peptide fragments are condensed using a condensing agent,
(14) The condensing agent is 2- (1-hydrobenzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), 2- (1-hydrobenzotriazole-1 -Yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU), diphenylphosphoryl azide (DPPA), diphenylphosphorocyanidate (DEPC), diisopropylcarbodiimide (DIPC), dicyclohexylcarbodiimide (DCC) Or 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), the method for producing a modified peptide or protein according to the above (13),
(15) The condensing agent is diisopropylcarbodiimide (DIPC), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), or 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), and the condensation of the peptide fragment using the condensing agent includes: (13) characterized in that it is carried out in the presence of 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 1-hydroxysuccinimide (HOSu) or 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-benzotriazine (HOOBt). ) A method for producing the modified peptide or protein according to
About.
[0022]
More specifically, the present invention provides a weakly acidic release resin such as 2-chlorotrityl resin when (a) a peptide fragment containing a modifying group is produced in the process of producing a modified peptide or protein by fragment condensation. (B) When synthesizing a peptide fragment containing an acyl group, a sulfate group, etc., which is easily removed by an acid, A method for producing a physiologically active peptide or protein having a modification, particularly ghrelin or a ghrelin derivative, characterized by being produced using a weakly acidic release resin such as a trityl resin, and (c) a peptide fragment (modification component) containing the modification; When condensing with a peptide fragment (unmodified component) that does not contain a modification, a proline is inserted into the C-terminal residue of the N-terminal fragment to be activated. Method for producing a ghrelin or ghrelin derivative, characterized in that inhibited racemization acid, relating to the condensation agent was significantly better for the production of (d) ghrelin or ghrelin derivative.
[0023]
Furthermore, the present invention provides
(1) It has a desired sequence consisting of amino acids and / or non-amino acids, of which at least one amino acid or non-amino acid is represented by formula 1; -A (R)-(where A represents an amino acid or non-amino acid, R Represents a substituent introduced for the modification bonded to the side chain of A.) and is a amino acid or a non-amino acid subjected to the modification represented by One or more selected from the group consisting of a group, a guanidino group, an imidazolyl group, an indolyl group, a mercapto group, and a carboxyl group, and the reactive substituent having a possibility of causing an undesirable side reaction in producing a peptide fragment is a protective group Produce a protected peptide fragment on a weakly acidic release resin, and then do not remove the protecting group in the peptide fragment under weakly acidic conditions. A method for producing a protected peptide fragment comprising one or more modified amino acids or non-amino acids, wherein the peptide fragment is released from a weakly acidic release resin,
(2) (a) Hydroxyl group, amino group, guanidino group, imidazolyl group, indolyl group, mercapto group and carboxyl group in the side chain of amino acid or non-amino acid having a desired sequence consisting of amino acid and / or non-amino acid Producing one or more peptide fragments selected from the group consisting of, on a weakly acidic leaving resin, a peptide fragment in which a reactive substituent having a possibility of causing an undesirable side reaction in producing a peptide fragment is protected by a protecting group; (B) without removing the peptide fragment from the weakly acidic leaving resin, when a protective group is introduced into the reactive functional group in the side chain of the amino acid or non-amino acid A that is modified by the substituent R, Deprotecting the protecting group, (c) modifying the deprotected side chain with a substituent R, and (d) a protecting group in the peptide fragment under mildly acidic conditions. The method for producing a peptide fragment according to (1), wherein the peptide fragment is released from the weakly acidic release resin without releasing the peptide,
(3) (a) a weakly acidic leaving resin having a desired amino acid or / and non-amino acid sequence, and a side chain of the amino acid or non-amino acid, a hydroxyl group, an amino group, a guanidino group, an imidazolyl group, an indolyl group A peptide fragment in which one or more reactive substituents selected from the group consisting of a mercapto group and a carboxyl group are protected by a protecting group, and (b) a protecting group in the peptide fragment under a weakly acidic condition. Detaching the peptide fragment from the weakly acidic detachment resin without detachment, and (c) deprotecting the protecting group of the reactive substituent in the side chain of at least one amino acid or non-amino acid A of the detached peptide fragment, (D) Formula 1 characterized by modifying the deprotected side chain with a substituent R; -A (R)-(wherein A represents an amino acid or a non-amino acid, and R represents an A A method for producing a protected peptide fragment comprising one or more amino acids or non-amino acids subjected to the modification represented by
About.
[0024]
The present invention also provides:
(4) The protecting group of the reactive substituent in the side chain of the amino acid or non-amino acid A modified by the substituent R is a silyl protecting group, and quaternary ammonium fluoride is used for deprotection of the protecting group. A method for producing the peptide fragment according to (2) or (3), comprising:
(5) The silyl protecting group is t-butyldimethylsilyl (TBDMS), t-butyldiphenylsilyl (TBDPS), triisopropylsilyl (TIPS), triisobutylsilyl (TIBS), t-hexyldimethylsilyl (ThxDMS) or Triphenylsilyl (TPS), and the method for producing a peptide fragment according to (4) above, wherein the quaternary ammonium fluoride is tetrabutylammonium fluoride (TBAF), tetraethylammonium fluoride (TEF) or ammonium fluoride,
(6) A is serine, threonine, cysteine, homocysteine, lysine, ornithine, glutamic acid, 2-aminoadipic acid, diaminoacetic acid, 2-aminomalonic acid, aspartic acid, tyrosine or asparagine, R is an ester bond, ether The description in (1) to (5) above, which is bonded to a reactive functional group on the side chain of A via a bond, thioether bond, disulfide bond, amide bond, O-glycoside bond or N-glycoside bond. A method for producing the peptide fragment of
(7) The method for producing a peptide fragment according to (6), wherein A is serine or threonine, and R is bonded to the hydroxyl group of the side chain of A via an ester bond,
(8) The method for producing a peptide fragment according to (7), wherein the peptide fragment is ghrelin or a derivative thereof, or a peptide fragment containing an amino acid subjected to modification in the ghrelin or derivative thereof,
About.
[0025]
The present invention also provides:
(9) (a) producing a protected peptide fragment containing at least one amino acid or non-amino acid that has been modified by the method described in (1) to (8) above, and the peptide fragment of (a) Separately, (b) does not contain a modified amino acid or non-amino acid, and consists of a hydroxyl group, amino group, guanidino group, imidazolyl group, indolyl group, mercapto group and carboxyl group in the side chain of the amino acid or non-amino acid Producing one or more peptide fragments selected from the group, wherein a reactive functional group having a possibility of causing an undesirable side reaction is protected, and the peptide fragments produced in the above (a) and (b) A method for producing a modified peptide or protein characterized by condensation,
(10) The method for producing a modified peptide or protein according to (9) above, wherein the peptide fragment is condensed using a condensing agent,
(11) The condensing agent is 2- (1-hydrobenzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), 2- (1-hydrobenzotriazole-1 -Yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU), diphenylphosphoryl azide (DPPA), diphenylphosphorusanidate (DEPC), diisopropylcarbodiimide (DIPC), dicyclohexylcarbodiimide (DCC) Or the method for producing a modified peptide or protein according to (10), which is 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC),
(12) The peptide fragment (a) using the condensing agent, wherein the condensing agent is diisopropylcarbodiimide (DIPC), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), or 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). The condensation of (b) is carried out in the presence of 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 1-hydroxysuccinimide (HOSu) or 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-benzotriazine (HOOBt) A method for producing the modified peptide or protein according to (10), comprising:
About.
[0026]
The present invention also provides:
(13) The modified peptide according to the above (9) to (12), which comprises producing a protected peptide fragment containing no modified amino acid or non-amino acid by an enzymatic method or / and a genetic recombination method Or a method for producing a protein,
(14) A modified peptide fragment that does not contain a modified amino acid or non-amino acid;
Step (1); a fusion protein in which a protective peptide is added to a base sequence encoding the peptide having the amino acid sequence of the peptide fragment (hereinafter referred to as a target peptide in this section) or a target peptide, if desired, via a linker sequence A step of culturing cells transformed with an expression vector having any of the nucleotide sequences coding for and collecting the target peptide or the fusion protein from the culture;
Step (2): when the fusion protein is collected in step (1), a step of cleaving and separating the protective peptide and optionally the linker sequence and the target peptide from the obtained fusion protein, and further purifying the target peptide if desired;
Step (3): 1 selected from the group consisting of a hydroxyl group, an amino group, a guanidino group, an imidazolyl group, an indolyl group, a mercapto group, and a carboxyl group in the side chain of the target peptide obtained in Step (1) or (2) Protecting reactive substituents of a species or more that have the potential to cause undesirable side reactions with protecting groups;
A method for producing the modified peptide or protein according to the above (13), comprising producing by a method comprising
(15) The above-mentioned (14), wherein the cleavage separation of the protected peptide in step (2) and optionally the linker sequence and the target peptide is performed in two steps using OmpT protease or a derivative thereof and Kex2 protease or a derivative thereof. A method for producing the modified peptide or protein according to claim 1,
(16) The method for producing the modified peptide or protein according to (14) or (15), wherein the linker sequence is the sequence described in SEQ ID NO: 27,
(17) The modified peptide or protein according to any one of (13) to (16) above, wherein the peptide fragment is a peptide fragment that does not contain a modified amino acid or non-amino group in ghrelin or a derivative thereof Manufacturing method,
(18) The modification according to (13) to (17) above, wherein the protected peptide fragment containing no modified amino acid or non-amino acid is purified and stored in a solution having a pH of 4 to 8. A method for producing a peptide or protein,
(19) The method for producing a modified peptide or protein according to the above (13) to (18), wherein the protecting group is a Boc group,
About.
[0027]
The present invention also provides:
(20) Step (1); fusion in which a protective peptide is optionally added to a base sequence encoding a peptide having a desired amino acid sequence (hereinafter referred to as target peptide in this section) or a target peptide via a linker sequence. A step of culturing a cell transformed with an expression vector having any one of the base sequences encoding the protein, and collecting the target peptide or the fusion protein from the culture;
Step (2): When the fusion protein is collected in Step (1), a protective peptide and optionally a linker sequence and a target peptide are cleaved and separated from the obtained fusion protein, and further purified if desired;
Step (3): 1 selected from the group consisting of a hydroxyl group, an amino group, a guanidino group, an imidazolyl group, an indolyl group, a mercapto group, and a carboxyl group in the side chain of the target peptide obtained in Step (1) or (2) Protecting reactive substituents of a species or more that have the potential to cause undesirable side reactions with protecting groups;
Step (4); Step of purifying and storing the protected target peptide obtained in Step (3) in a solution having a pH of 4 to 8;
A method for producing a protected peptide fragment containing no modified amino acids or non-amino acids, characterized in that it is produced by a method comprising
(21) A method for producing a protected peptide fragment containing no amino acid or non-amino acid subjected to the modification according to (20), wherein the protecting group is a Boc group,
(22) Cleaving separation of the protected peptide in step (2) and optionally the linker sequence and the target peptide is performed in two steps using OmpT protease or a derivative thereof and Kex2 protease or a derivative thereof (20) Or a method for producing a protected peptide fragment containing no amino acid or non-amino acid subjected to the modification described in (21),
(23) A method for producing a protected peptide fragment containing no amino acid or non-amino acid subjected to the modification according to (20) to (22), wherein the linker sequence is the sequence described in SEQ ID NO: 27,
(24) The modified peptide or protein according to the above (20) to (23), wherein the peptide fragment is a peptide fragment that does not contain a modified amino acid or non-amino group in ghrelin or a derivative thereof Manufacturing method,
About.
[0028]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In describing the present invention, the following terms are defined as follows.
“Amino acid” is a compound having an amino group and a carboxyl group in the same molecule, for example, L-amino acid, D-amino acid, α-amino acid, β-amino acid, γ-amino acid, natural amino acid, unnatural amino acid, Includes all amino acids such as synthetic amino acids.
“Natural amino acids” refer to 20 types of amino acids encoded by genes.
“Non-natural amino acid” refers to a compound in which the α-carbon in an α-amino acid is modified with any substituent not present in the natural amino acid or the corresponding D-amino acid. That is, α-amino acid is represented by the following formula:
[Chemical 1]

As a substituent represented by R ′ and R ″, any substituent or hydrogen atom that does not exist in the natural amino acid or the corresponding D-amino acid (provided that both R ′ and R ″ are hydrogen atoms) Excluding cases).
“Non-amino acid” refers to an analog of an amino acid consisting of one or more atoms selected from the group consisting of C, H, O, N, and S, and not a natural amino acid or a non-natural amino acid. . Of these, compounds having a molecular chain length corresponding to a peptide or a dipeptide are preferable. For example, NH ₂ -CH (CH ₂ OH) -CH _Three , CH _Three -CH (R ₁₁ ) -COOH, CH _Three -CH (R ₁₁ )-CH _Three (Both molecular chain length is equivalent to peptide) or NH ₂ -(CH ₂ ) _Three CH (CH ₂ OH) -COOH, NH ₂ -(CH ₂ ) _Four -COOH, NH ₂ -C (CH _Three ) ₂ -(CH ₂ ) _Three -COOH, NH ₂ -CH (CH _Three )-(CH ₂ ) ₂ -CH (CH _Three ) -COOH, NH ₂ -(CH ₂ ) _Three CH (CH ₂ OH)-CH _Three , NH ₂ -(CH ₂ ) _Three CH (R ₁₁ )-CH _Three (In all cases, the molecular chain length is equivalent to a dipeptide) and the like are included in the “non-amino acid” in the present invention. Where R ₁₁ Represents the side chain of a natural amino acid. As the “non-amino acid residue” in the peptide, for example, —NH—CH (CH ₂ OH) -CH ₂ -, -CH ₂ -CH (R ₁₁ ) -CO-, -CH ₂ -CH (R ₁₁ ) -CH ₂ -(Both molecular chain length is equivalent to peptide), or -NH- (CH ₂ ) _Three CH (CH ₂ OH) -CO-, -NH- (CH ₂ ) _Four -CO-, -NH-C (CH _Three ) ₂ -(CH ₂ ) _Three -CO-, -NH-CH (CH _Three )-(CH ₂ ) ₂ -CH (CH _Three ) -CO-, -NH- (CH ₂ ) _Three CH (CH ₂ OH) -CH ₂ -, -NH- (CH ₂ ) _Three CH (R ₁₁ ) -CH ₂ -(Both molecular chain lengths are equivalent to dipeptides) and the like, and the bond with an adjacent amino acid may not be a peptide bond.
[0029]
“Peptide” or “peptide fragment” refers to a compound in which a plurality of amino acids are linked by peptide bonds. Here, when a non-amino acid is included, the bond between the non-amino acid and an adjacent amino acid may not be a peptide bond, and the compound in this case is also collectively referred to as a peptide or a peptide fragment.
The “protected peptide fragment” is one kind selected from the group consisting of a hydroxyl group, an amino group, a guanidino group, an imidazolyl group, an indolyl group, a mercapto group and a carboxyl group of the amino acid or non-amino acid side chain of the peptide fragment. The peptide fragment in which the reactive substituent having the possibility of causing an undesirable side reaction during the peptide fragment preparation or the peptide fragment condensation reaction is protected by a protecting group. Hereinafter, in the present specification, it is abbreviated as “protected peptide fragment”.
[0030]
"Modified amino acid or non-amino acid" refers to Formula 1; -A (R)-(where A represents an amino acid or non-amino acid, and R is introduced for modification linked to the side chain of A. Represents a substituted group represented by:
The substituent R is bonded to a group formed by removing a hydrogen atom from a hydroxyl group, amino group, guanidino group, imidazolyl group, indolyl group, mercapto group or carboxyl group in the side chain of an amino acid or non-amino acid. In some cases, it may be directly linked to the alpha carbon of an amino acid or non-amino acid. The substituent R may be an amino acid or a non-amino acid modified side chain.
The substituent R is not particularly limited. For example, as R, formula 2; — (CH ₂ ) _n -PQ (wherein n represents an integer of 1 to 10, P represents -CO-, -SO ₂ -, -CO-O-, -O-CO-, -O-, -CO-S-, -S-CO-, -CS-S-, -S-CS-, -S-, -CO-NH. -, -NH-CO-, -CO-NH-CO-, -CS-NH-CS-, -S-S-, -CS-NH- or -NH-CS-, wherein Q is a hydrogen atom, Or C _1-35 , Preferably C _1-20 Alkyl group of _6-20 Aryl group or C _7-16 Represents an aralkyl group. ), A group represented by formula 3; -PQ (wherein P and Q are as defined above), or a group represented by formula 4; -Q (wherein Q is as defined above.) The group etc. which are represented by these are mentioned. Among these, as R, when directly bonded to the α-carbon of an amino acid or a non-amino acid, from an ester, an ether, a thioester, a thioether, an amide, or a carbamide, with or without an alkyl group having 1 or more carbon atoms. A bond selected from the group consisting of C _1-35 , Preferably C _1-20 Alkyl group of _6-20 Aryl group or C _7-16 The group to which the aralkyl group is bonded is preferred. When the substituent R is directly bonded to the α-carbon of an amino acid or non-amino acid, the substituent R does not include a substituent bonded to the α-carbon in a natural amino acid. When the substituent R is bonded to a reactive substituent in the side chain of an amino acid or a non-amino acid, the substituent R is a group represented by the formula 4; -Q (wherein Q is as defined above). Preferably there is.
[0031]
Here, the above “alkyl group” represents a cyclic, linear or branched alkyl group, for example, methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, butyl group, sec-butyl group, isobutyl. Group, tert-butyl group, cyclobutyl group, pentyl group, isopentyl group, tert-pentyl group, neopentyl group, cyclopentyl group, hexyl group, isohexyl group, cyclohexyl group, 3,3-dimethylbutyl group, heptyl group, 1-propyl A butyl group, an octyl group, a nonyl group, a decyl group, an undecyl group, a dodecyl group, a tridecyl group, a tetradecyl group, or a pentadecyl group, and the like, which may partially contain an unsaturated carbon bond, 1 to 35, more preferably 1 to 20, and still more preferably 1 to 10.
Examples of the “aryl group” include a phenyl group, 1- or 2-naphthyl group, biphenyl group, 1-, 2- or 9-anthryl group, 1-, 2-, 3-, 4- or 9-. Examples include a phenanthryl group, an acenaphthyl group, an anthracenyl group, an azulenyl group. The number of carbon atoms is 6 to 20, more preferably 6 to 15.
Examples of the “aralkyl group” include benzyl group, p-methoxybenzyl group, 3,4-dimethoxybenzyl group, o-nitrobenzyl group, p-nitrobenzyl group, benzhydryl group, trityl group and the like. The carbon number is preferably 7 to 16.
Further, these alkyl group, aryl group and aralkyl group may have a substituent usually used in this technical field at a chemically acceptable position and number.
[0032]
As "modified amino acid or non-amino acid", amino acid or non-amino acid A is serine, threonine, cysteine, homocysteine, lysine, ornithine, glutamic acid, 2-aminoadipic acid, diaminoacetic acid, 2-aminomalonic acid, asparagine An acid, tyrosine or asparagine and the substituent R is of formula 5; ₂ ) _n -P ¹ -Q ¹ (In the formula, n is as defined above. P ¹ Represents an ester bond, an ether bond, a thioether bond, a disulfide bond, an amide bond, an O-glycoside bond or an N-glycoside bond; ¹ Is the same as Q above. ) Is preferred.
Specifically, for example, when amino acid A is serine, threonine, tyrosine, or oxyproline, the amino acid has a hydroxyl group in the side chain. Therefore, as the “modified amino acid”, the hydroxyl group in the side chain is etherified. Alternatively, serine, threonine, tyrosine or oxyproline that has been esterified can be mentioned. When amino acid A is cysteine, the amino acid has a mercapto group in the side chain. Therefore, “modified amino acid” includes cysteine in which the side chain mercapto group is thioetherified, thioesterified, or disulfidized. Can be mentioned. When amino acid A is lysine, arginine or 2,3-diaminopropionic acid, since it has an amino group in the side chain, as the “modified amino acid”, the amino group in the side chain is amidated, thioamidated, Examples include lysine, arginine or 2,3-diaminopropionic acid which are carbamidated, thiocarbamidated or alkylated. When amino acid A is histidine, tryptophan, proline or oxyproline, since it has an amino group in the side chain, the amino group in the side chain is amidated, thioamidated, iminoetherified as “modified amino acid” , Iminothioetherified, alkylated histidine, tryptophan, proline or oxyproline.
Among them, as the “modified amino acid or non-amino acid”, serine or threonine in which the hydroxyl group of the side chain is esterified is preferable.
[0033]
Further, as the substituent R, -OH, -SH, -NH- or -NH is added to the side chain of the amino acid or non-amino acid A. ₂ As a more preferable example, a group formed by acylating these is included. Examples of the acyl group for this purpose include groups formed by removing hydroxyl groups from organic carboxylic acids, organic sulfonic acids, and organic phosphoric acid compounds. More specifically, examples of the organic carboxylic acid include fatty acids, and the carbon number thereof is preferably 2 to 35, more preferably 6 to 18, and most preferably 8 to 16. Examples of such fatty acids include saturated fatty acids such as caprylic acid, capric acid, lauric acid, butyric acid, caproic acid, undecylic acid, palmitic acid, decanoic acid, nonadecanoic acid, behenic acid, montanic acid or lactenoic acid, such as acrylic acid. And unsaturated fatty acids such as oleic acid, linoleic acid, linolenic acid or atearolic acid. The unsaturated fatty acid may be a monoene or a polyene. Of these, preferred examples include octanoic acid (preferably caprylic acid), decanoic acid (preferably capric acid), dodecanoic acid (preferably lauric acid), and the like. The organic sulfonic acid or the organic phosphoric acid compound also preferably has 2 to 35 carbon atoms.
[0034]
“Modified peptide or protein” refers to a peptide or protein containing one or more amino acids or non-amino acids subjected to the above-described modification in the peptide or protein.
“Ghrelin” is an endogenous growth hormone secretagogue (GHS), and has an activity to increase intracellular calcium ion concentration and an activity to induce growth hormone secretion. Of these, ghrelin derived from human, rat, mouse, pig, chicken, eel, cow, horse, sheep, frog, rainbow trout or dog is preferable. More specifically, “ghrelin” has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 21, and the hydrogen atom of the side chain hydroxyl group of serine 3-position or threonine is an n-octanoyl group or butanoyl group , A protein substituted with any of a hexanoyl group, a decanoyl group or a dodecanoyl group, or an amino acid sequence described in any of SEQ ID NOS: 1 to 21, in a portion other than the first to fourth amino acid sequences at the N-terminus 1 to 10 and preferably about 1 to several amino acids are substituted, added or deleted, and the hydrogen atom of the side chain hydroxyl group of serine 3-position or threonine is an n-octanoyl group, An activity that is substituted with any of a butanoyl group, a hexanoyl group, a decanoyl group, or a dodecanoyl group, and increases the intracellular calcium ion concentration. Protein, and the like having.
[0035]
Examples of the “ghrelin derivative” include a peptide having an activity of increasing intracellular calcium ion concentration and containing one or more modified amino acids or non-amino acids, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. It is done. Among them, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence from the amino terminus to the fourth amino acid, preferably the amino terminus to the fifth amino acid sequence, preferably the amino terminus to the sixth amino acid sequence, preferably the amino terminus. A peptide having at least an amino acid sequence from the amino terminus to the eighth amino acid sequence, preferably an amino acid sequence from the amino terminus to the eighth amino acid, preferably an amino acid sequence from the amino terminus to the ninth amino acid, preferably an amino acid sequence from the amino terminus to the tenth amino acid, or a pharmaceutical thereof Preferred salts are preferred. Furthermore, in the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 21, the amino acid sequence from the amino terminus to the fourth amino acid, preferably the amino acid sequence from the amino terminus to the fifth, preferably the amino acid sequence from the amino terminus to the sixth, preferably An amino acid sequence from the amino terminus to the seventh amino acid, preferably an amino acid sequence from the amino terminus to the eighth, preferably an amino acid sequence from the amino terminus to the ninth, preferably a portion other than the amino acid sequence from the amino terminus to the tenth; A peptide comprising an amino acid sequence in which at least one amino acid, preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to several amino acids are deleted, substituted and / or added, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. preferable. Among them, in all the peptides of the above aspect or a pharmaceutically acceptable salt thereof, the second or third amino acid from the amino terminus, more preferably the third amino acid from the amino terminus is a modified amino acid or Particularly preferred is a non-amino acid.
[0036]
Further, the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 21, or at least one amino acid of the amino acid sequence, preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to several amino acids are deleted, substituted and / or In the added amino acid sequence, the amino acid sequence from the amino terminus to the 4th amino acid sequence is represented by the formula 6; ABCDD (where A represents an amino acid, non-amino acid, or none, and B represents an amino acid, non-amino acid. Amino acids or not, provided that the molecular chain length of A + B is equivalent to a dipeptide, C or D may be the same or different, (a) modified amino acid, (b) hydrophobic side A peptide having a chain or a peptide fragment represented by (c) an amino acid having a basic side chain) or a pharmaceutically acceptable salt thereof is also preferable. And the like as modal. Examples of the “amino acid having a hydrophobic side chain” include leucine, valine, norleucine, homoleucine, homoisoleucine, naphthylalanines, tryptophan, phenylalanine, cyclohexylalanine and the like, or their N-methyl amino acids or D-forms. Can be mentioned. Examples of the “amino acid having a basic side chain” include lysine, arginine, histidine or D-forms thereof. Among them, in Formula 6, it is more preferable that C is an amino acid subjected to the above modification and D is an amino acid having a hydrophobic side chain.
[0037]
In place of the peptide fragment represented by the formula 6; ABCD-, the following formula 7; A ¹ -B ¹ -C ¹ -D ¹ -(Where A ¹ Represents an amino acid or a non-amino acid, preferably a natural amino acid or a D-form thereof. B ¹ Or C ¹ Is an amino acid or non-amino acid at least one of which has been modified, and B ¹ Or C ¹ When only one of them is a modified amino acid or non-amino acid, the other is an unmodified amino acid or non-amino acid, preferably a natural amino acid or a D-form thereof. A ¹ + B ¹ The molecular chain length of is equivalent to a dipeptide. D ¹ Represents an amino acid having a hydrophobic side chain or an amino acid having a basic side chain. A peptide fragment represented by) may be used.
Further, instead of the peptide fragment represented by the above formula 6; ABCD-, the following formula 8; B ² -C ² -D ² -(Wherein B ² Is a non-amino acid having a molecular chain length equivalent to a dipeptide, and C ² Is a modified amino acid or non-amino acid, and D ² Represents an amino acid having a hydrophobic side chain or an amino acid having a basic side chain. A peptide fragment represented by) may be used.
[0038]
Furthermore, as the “ghrelin derivative”, the amino terminus and carboxyl terminus of the peptide of the above-described embodiment or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be modified. Specifically, it is preferable that a basic amino acid is further bonded to the carboxyl terminus of the peptide of the above-described aspect or a pharmaceutically acceptable salt thereof. In addition, the amino terminus of the peptide of the above-described embodiment or a pharmaceutically acceptable salt thereof is modified with a saturated or unsaturated alkyl group or acyl group having 1 or more carbon atoms and / or OH of the carboxyl group at the carboxyl terminus is OZ or NR2R3 (Z is a pharmaceutically acceptable cation or lower branched or unbranched alkyl group; R2 and R3 are hydrogen atoms and lower (C _1-6 Are preferably the same or different groups selected from the group consisting of branched or straight chain alkyl groups). Furthermore, these modifications may be combined.
[0039]
The method for producing a modified peptide or protein according to the present invention comprises (a) producing a protected peptide fragment containing one or more modified amino acids or non-amino acids using a weakly acidic release resin, and (b) modifying the peptide. 3 steps of producing a protected peptide fragment containing no received amino acid or non-amino acid separately from the protected peptide fragment of (a), and condensing the protected peptide fragment produced in (a) and (b) It is characterized by comprising.
Below, each process in manufacture of a modified peptide or protein is described more concretely.
[0040]
Since the modified peptide or protein obtained by the production method of the present invention, or a fragment thereof is peptidic, it can be synthesized by a peptide synthesis method known per se. Here, the modified peptide or protein, or a fragment thereof includes a compound in which these reactive functional groups are protected with a protecting group. As a peptide synthesis method, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the peptide or amino acid that can constitute the crude modified peptide or protein, or a fragment thereof is condensed with the remaining part, and if the product has a protecting group, the target peptide is produced by removing the protecting group. can do. Examples of known condensation methods and protecting group elimination methods include the methods described in the following documents 1 to 3.
1. Nobuo Izumiya et al. “Basics and Experiments of Peptide Synthesis” published by Maruzen Co., Ltd. (1985)
2. Haruaki Yajima and Shunpei Sugawara "Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV", edited by the Japanese Biochemical Society, published by Tokyo Kagaku Dojin (1977)
3. Published by Yasukawa Shoten, directed by Haruaki Yajima, “Development of pharmaceutical products, Volume 14, Peptide synthesis”
[0041]
The step of producing a protected peptide fragment containing one or more modified amino acids or non-amino acids is characterized by using solid-phase chemical synthesis that extends the peptide chain on a weakly acidic release resin. More specifically, an amino acid or non-amino acid using a weakly acidic leaving resin and appropriately protecting a reactive functional group in the α-amino group and side chain, which may cause an undesirable side reaction during peptide fragment production. In accordance with the sequence of the desired peptide fragment according to various condensation methods known per se on a weakly acidic leaving resin, and the produced protected peptide fragment is released from the weakly acidic leaving resin without removing the protecting group. Thus, the desired protected peptide fragment can be obtained.
[0042]
The weakly acidic release resin is a resin used for peptide synthesis and can release a peptide fragment produced on the resin from the resin under weakly acidic conditions. For example, the weakly acidic release resin may include a carboxylic acid such as acetic acid, trifluoroacetic acid or formic acid, and a solution containing one or more compounds consisting of a fluorinated alcohol such as trifluoroethanol or hexafluoroisopropanol. A resin capable of releasing a peptide fragment produced on the resin from the resin is preferred. More specifically, examples of weakly acidic release resins include trichloro resins such as 2-chlorotrityl resin, trityl resin, 4-methyltrityl resin, 4-methoxytrityl resin, Rink Amide Barlos resin, and Sieber Amide resin. Etc.
[0043]
The protecting group for the reactive functional group in the α-amino group and the side chain (hereinafter simply referred to as a side chain functional group) is not particularly limited. For example, the protecting group for α-amino group includes t-butoxycarbonyl (Boc), trichloroethyloxycarbonyl, t-amyloxycarbonyl, 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), methylsulfonylethoxycarbonyl, trichloroethoxycarbonyl. , Alkoxycarbonyl group optionally having a substituent such as 2- (trimethylsilyl) ethoxycarbonyl or pyridine-4-methoxycarbonyl; optionally having a substituent such as cyclopeptyloxycarbonyl or cyclohexyloxycarbonyl A cycloalkyloxycarbonyl group; benzyloxycarbonyl (Z), p-methoxybenzyloxycarbonyl (pMZ), p-chlorobenzyloxycarbonyl (Cl-Z), p-bromobenzyloxycarbonyl ( Br-Z), p-nitrobenzyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, 2-phenylisopropyloxycarbonyl, p-methylphenylisopropyloxycarbonyl, p-biphenylisopropyloxycarbonyl, 3,5-dimethoxy-α, α-dimethylbenzyl Aralkyloxycarbonyl group optionally having a substituent such as oxycarbonyl; Aralkyl group optionally having a substituent such as benzyl (Bzl), benzhydryl, trityl; trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, benzenesulfonyl An acyl group which may have a substituent such as p-toluenesulfonyl (Ts), o-nitrophenylsulfenyl, 2,4-dinitrophenylsulfenyl, 3-nitro-2-pyridylsulfenyl; Noyl, 2-nitrophenylthio, diphenylphosphinyl, diphenylphosphinothioyl, dimethylphosphinothioyl and the like.
[0044]
The hydroxyl group such as serine is, for example, a lower group such as acetyl group (C _1-6 It can be protected with an aroyl group such as an alkanoyl group or a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group or an ethoxycarbonyl group.
Arginine guanidino group includes, for example, nitro group, Z group, Ts group, p-methoxybenzenesulfonyl group (Mbs), 4-methoxy-2,6-dimethylbenzenesulfonyl group (Mds), 4-methoxy-2,3 , 6-trimethylbenzenesulfonyl group (Mtr), mesitylene-2-sulfonyl group (Mts), 2,3,4,5,6-pentamethylbenzenesulfonyl group (Pme), 2,4,6-trimethoxybenzenesulfonyl Group (Mtb), 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl group (Pmc), 2,2,4,6,7-pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl group (Pbf), etc. Can be protected.
The mercapto group of cysteine is, for example, a trityl group, an acetamidomethyl (Acm) group, a tert-butyl group, a benzyl group, a p-methylbenzyl group, a p-methoxybenzyl group, or a 3-nitro-2-pyridinesulfenyl group. It can be protected with a butylthio group or the like.
Examples of the protecting group for the imidazolyl group of histidine include Boc group, trityl (Trt) group, Ts group, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl group, 2,4-dinitrophenol (DNP) group, Benzyloxymethyl (Bom) group, t-butoxymethyl (Bum) group, Fmoc group and the like are used.
The indolyl group of tryptophan includes, for example, formyl group, Z group, 2,4-dichlorobenzyloxycarbonyl group, trichloroethyloxycarbonyl group, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl group, 2,4 It can be protected with a 1,6-trimethoxybenzenesulfonyl group or the like.
[0045]
The condensation reaction by the solid-phase synthesis method includes a sequential extension method in which amino acids are sequentially condensed one by one to the weakly acidic leaving resin, a fragment condensation method in which peptide fragments composed of two or more amino acids are condensed, and these methods. Any of the combined methods may be used. The peptide fragment composed of two or more amino acids can be produced from each amino acid by a conventional liquid phase method, solid phase method or the like.
[0046]
First, an amino acid or a non-amino acid (hereinafter, abbreviated as a protected amino acid unless otherwise specified) in which the α-amino group and the side chain functional group are appropriately protected as described above is activated to be active on a weakly acidic release resin. Condensed protected amino acids. In this case, the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the peptide condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform; alcohols such as trifluoroethanol and phenol; dimethyl sulfoxide Such as pyridine, dioxane, tetrahydrofuran, etc .; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or appropriate mixtures thereof. The reaction temperature may be the same as the reaction temperature of the peptide bond forming reaction, and is usually appropriately selected from the range of about -20 ° C to 50 ° C. The activated protected amino acid is usually used in an excess of 1 to 4 times. As a result of the test using the ninhydrin reaction, when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation is not obtained even if the reaction is repeated, acetylation of the unreacted protected amino acid using acetic anhydride or acetylimidazole can prevent the subsequent reaction from being affected.
[0047]
Next, the protected amino acid is condensed with the protected amino acid condensed with the weakly acidic release resin in the desired sequence. The condensation reaction of each protected amino acid can be performed by a conventional method such as a C-terminal activation method or a coupling method using a coupling reagent. The C-terminal activation method includes an active ester method, a symmetric acid anhydride method, and the like. Examples of the active ester used in the active ester method include alkyl esters such as cyanomethyl ester; thiophenyl ester, p-nitrothiophenyl ester, p-methanesulfonylphenyl ester, p-nitrophenyl ester, 2,4-dinitro. Phenyl esters, phenyl esters such as 2,4,6-trichlorophenyl ester, pentachlorophenyl ester; 1-hydroxysuccinimide (HOSu), N-hydroxyphthalimide ester, N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboxylic acid Examples thereof include dicarboxylic acid imide esters such as acid imide (HONB); hydroxylamine derivatives such as 8-hydroquinoline ester, N-hydroxypiperidine ester and 2-hydroxypyridine ester.
[0048]
Examples of the coupling method using the above coupling reagent include carbodiimide method using dicyclohexylcarbodiimide (DCC), water-soluble carbodiimide (WSC), etc .; DCC-additive method; carbonyldiimidazole (CDI) method; Woodward Isoxazolium salts such as reactant (N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3′-sulfonate) or N-ethyl-2′-hydroxybenzisoxazolium trifluoroborate, 1 -Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxyquinoline (EEDQ), 1-ethoxycarbonyl-2-isobutoxy-1,2-dihydroxyquinoline (IIDQ), benzotriazol-1-yl-oxy-tris (dimethylamino) ) -Phosphonium hexa Fluorophosphate (BOP), O-benzotriazole-N, N, N ′, N′-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate (HBTU), O-benzotriazole-N, N, N ′, N′— Examples thereof include a method using tetramethyl-uronium-tetrafluoroborate (TBTU) and diphenylphosphoryl azide (DPPA).
[0049]
Examples of the water-soluble carbodiimide (WSC) used in the carbodiimide method include EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), N-cyclohexyl-N′-morpholinoethylcarbodiimide, N-cyclohexyl- N ′-(N, N-diethylamino) cyclohexylcarbodiimide and the like are included. The water-soluble carbodiimide may be a salt such as hydrochloride.
Examples of the DCC-additive method include DCC-HOSu method, DCC-HOBt (1-hydroxybenzotriazole) method, DCC-HONB method, DCC-2-hydroxyimino-2-cyanoacetic acid ethyl ester method, WSC. -HOSu method, WSC-HOBt method and the like are included.
[0050]
Preferred condensation reactions include the carbodiimide method, the active ester method, and the DCC-additive method. More preferable condensation reactions include a method for suppressing racemization, such as an active ester method, a DCC-additive method (for example, a DCC-HOBt method, a DCC-HOSu method, a WSC-HOSu method, a WSC-HOBt method, etc.) and the like. included.
[0051]
The target protected peptide fragment contains one or more modified amino acids or non-amino acids. As a method for inserting a modified amino acid or non-amino acid into a peptide chain, the following two methods can be mentioned.
As a first method, a side chain of a desired amino acid or non-amino acid is specifically modified in advance, and such amino acid or non-amino acid (hereinafter referred to as residue-specifically modified amino acid or non-amino acid) is used. And a method of introducing it at the elongation stage of the peptide chain. More specifically, residue-specifically modified amino acids or non-amino acids (including compounds in which these α-amino groups are protected) can be synthesized by synthetic methods known per se. For example, esterification reaction, amidation reaction, etherification reaction, acylation reaction, alkylation reaction and the like can be mentioned, and these can be carried out by methods well known to those skilled in the art. Furthermore, this can be introduced into the peptide chain by any of the condensation reactions described above. In this case, the elimination of the protected peptide fragment from the weakly acidic leaving resin is appropriately selected from the conditions described later, but preferably the target residue-specifically modified amino acid or non-amino acid side chain substituent It is preferable to select appropriately from the conditions that do not allow R to be eliminated.
[0052]
In the second method, a peptide fragment having a desired sequence consisting of amino acids and / or non-amino acids is prepared by the above method, and then the side chain of the desired amino acid or non-amino acid is specifically modified (hereinafter referred to as the rest). A method called group-specific modification). The method for the residue-specific modification is not particularly limited, and a known method may be used. For example, esterification reaction, amidation reaction, etherification reaction, acylation reaction, alkylation reaction and the like can be mentioned, and these can be carried out by methods well known to those skilled in the art. Furthermore, examples of the phosphorylation modification method include Tetrahedron Letter, 41, p.4457-4461, 2000, Biopolymers, 60, p.3-31, 2001, and the like. As a method for sugar modification, Int. J. Peptide Protein Res., 42, p.165-170, 1993, Science, 291, p.2344-2350, 2001, Science, 291, p. 2357-2364, 2001, etc.
[0053]
Such a method is divided into the following two cases. That is, when the functional group of the amino acid or non-amino acid side chain subjected to residue-specific modification is protected by a protecting group, the protected peptide fragment is detached from the resin simultaneously with the deprotection of the protecting group. In the deprotection of the protecting group, the protected peptide fragment is roughly divided into cases where it does not leave the resin. In the former case, the C-terminal carboxyl group is protected with a protecting group, and then residue-specific modification is performed by a synthesis method known per se, and then the C-terminal carboxyl group is appropriately selected from the methods described later and deprotected. Thus, the desired peptide fragment can be obtained. In the latter case, the residue-specific modification can be performed on the resin by a synthesis method known per se, and then the desired peptide fragment may be appropriately selected from the methods described later and released from the resin.
[0054]
In the present invention, a peptide fragment having a desired sequence consisting of amino acids and / or non-amino acids is prepared by the above method, and then the reactive functional groups on the side chains of amino acids or non-amino acids subjected to residue-specific modification are protected. In the case where it is protected by a group, the protective group is deprotected, subjected to residue-specific modification by a synthetic method known per se on the resin, and then the protected peptide fragment is released from the weakly acidic leaving resin described later, The method in which each protecting group is deprotected as required is most preferable.
In the above method, the protecting group for amino acid or non-amino acid to be subjected to residue-specific modification is not particularly limited as long as the protected peptide fragment is not detached from the resin when the protecting group is deprotected, but preferably t Examples thereof include silyl groups such as -butyldimethylsilyl group and t-butyldiphenylsilyl group. When deprotecting such a protecting group, the protected peptide fragment is not removed from the resin, and the protecting group of the amino acid or non-amino acid side chain functional group that is subjected to residue-specific modification is specifically deprotected. Reagents that can be used are used. Such a reagent is appropriately selected according to the type of the weakly acidic leaving resin and the protecting group. When the protecting group is a silyl group, it is preferable to use quaternary ammonium fluoride, and tetrabutylammonium fluoride. It is more preferable to use (TBAF).
[0055]
When a protecting group is selected as described above, when the N-terminal amino group is deprotected for peptide extension condensation, the protected peptide fragment is detached from the protecting group of the side chain functional group of each protected amino acid and the weakly acidic leaving resin. In addition, when the weak acid leaving resin is released from the obtained peptide-resin conjugate, the protecting group of the side chain functional group of each amino acid residue is not released. In addition, due to this, the generation of by-products can be suppressed. Therefore, a peptide fragment in which the side chain functional group is protected by a protecting group can be easily obtained with high purity and good yield. In this peptide fragment, since the side chain functional group is protected, it is not necessary to introduce a new protecting group. In the next step, as a raw material for producing the target modified peptide or protein by the liquid phase method, It can be preferably used.
[0056]
Finally, the produced protected peptide fragment is released from the weakly acidic release resin. At this time, it is carried out under weakly acidic conditions in which the protecting group in the protected peptide fragment, that is, the protecting group of the amino acid or non-amino acid side chain functional group is not deprotected. The weakly acidic condition means, for example, that a weakly acidic release resin is suspended in a solution containing carboxylic acids such as acetic acid, trifluoroacetic acid or formic acid and / or fluorinated alcohols such as trifluoroethanol or hexafluoroisopropanol. Conditions. Specifically, the prepared protected peptide fragment is released from the weakly acidic release resin by stirring in the solution for a desired time, preferably about 5 minutes to 4 hours, more preferably about 10 minutes to 2 hours. be able to. More specifically, for example, a known method described in, for example, the method of Barlos et al. (Tetrahedron Lett, Vol. 30, p. 3947, 1989), such as 0.5% trifluoroacetic acid / dichloromethane, or acetic acid / trimethyl A method of suspending in a solvent such as fluoroethanol / dichloromethane = 1/2/7 or acetic acid / trifluoroethanol / dichloromethane = 2/2/6 may be followed.
[0057]
In the present invention, without inserting a modified amino acid or non-amino acid into the peptide chain, the protected peptide fragment is removed from the weakly acidic leaving resin, and then a residue-specific modification is performed on the desired amino acid residue. Alternatively, peptide fragments containing modified amino acids or non-amino acids can be produced. The method of residue-specific modification is the same as described above.
[0058]
The production method described above can be applied without particular limitation as long as it is a protected peptide fragment containing one or more modified amino acids or non-amino acids. Among them, the above method is preferably used for the production of a protected peptide fragment containing one or more amino acids or non-amino acids subjected to the modification represented by the following formula 9 or a salt thereof.
That is, Formula 9; (R1) _n -Gly-Ser (X1) -A (R) -Phe-Leu-Ser (X2) -Pro-OR2
(In the formula, -A (R)-is an amino acid or a non-amino compound subjected to the above-mentioned modification. Among them, A is serine, threonine, cysteine, homocysteine, lysine, ornithine, glutamic acid, 2-aminoadipine. Acid, diaminoacetic acid, 2-aminomalonic acid, aspartic acid, tyrosine, asparagine are preferred, and R is preferably a modifying group such as acyl group, sugar, phosphate group, sulfate group, alkyl group, aralkyl group, aroyl group, R is preferably bonded to the reactive substituent on the side chain of A via an ester bond, ether bond, thioether bond, disulfide bond, amide bond, O-glycoside bond or N-glycoside bond.
R1 is t-butoxycarbonyl (Boc), trichloroethyloxycarbonyl, t-amyloxycarbonyl, 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), methylsulfonylethoxycarbonyl, trichloroethoxycarbonyl, 2- (trimethylsilyl) ethoxycarbonyl or An alkoxycarbonyl group which may have a substituent such as pyridine-4-methoxycarbonyl; a cycloalkyloxycarbonyl group which may have a substituent such as cyclopeptyloxycarbonyl, cyclohexyloxycarbonyl; benzyloxycarbonyl (Z), p-methoxybenzyloxycarbonyl (pMZ), p-chlorobenzyloxycarbonyl (Cl-Z), p-bromobenzyloxycarbonyl (Br-Z), p-nitroben Has substituents such as ruoxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, 2-phenylisopropyloxycarbonyl, p-methylphenylisopropyloxycarbonyl, p-biphenylisopropyloxycarbonyl, 3,5-dimethoxy-α, α-dimethylbenzyloxycarbonyl Aralkyloxycarbonyl group which may be substituted; Aralkyl group which may have a substituent such as benzyl (Bzl), benzhydryl, trityl; trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, benzenesulfonyl, p-toluenesulfonyl (Ts) , O-nitrophenylsulfenyl, 2,4-dinitrophenylsulfenyl, acyl group optionally having substituents such as 3-nitro-2-pyridylsulfenyl; dithiasuccinoyl, 2-nitrophenyl It indicates Oh, diphenylphosphinyl, diphenylphosphinothioyl, dimethyl phosphino Ji oil,
n is 1 or 2,
X1 and X2 each represent a protecting group for a hydroxyl group on the serine side chain, and may be a lower group such as an acetyl group (C _1-6 An alkanoyl group; an aroyl group such as a benzoyl group; a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group or an ethoxycarbonyl group, or the above-mentioned substituent R is bonded to the side chain via an ether bond. Examples of groups suitable for etherification include silyl groups such as t-butyl, benzyl, tetrahydropyranyl, trityl, and t-butyldimethylsilyl groups.
R2 indicates that there is no protecting group or protecting group, and when there is a protecting group, an alkyl ester group (for example, methyl ester, ethyl ester, propyl ester, butyl ester, t-butyl ester, cyclopentyl ester, cyclohexyl ester, Linear, branched or cyclic alkyl ester groups such as cycloheptyl ester, cyclooctyl ester, 2-adamantyl ester), aralkyl ester groups (for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4 -Chlorobenzyl ester, benzhydryl ester group), phenacyl ester group, benzyloxycarbonyl hydrazide group, t-butoxycarbonyl hydrazide group, trityl hydrazide group. )
Or a salt thereof or the like.
[0059]
In formula 9, R1 is preferably a Boc group, a Z group, a pMZ group or an Fmoc group, and the protecting group represented by X1 and X2 is preferably a t-butyl group or a 34 benzyl group, more preferably a t-butyl group. Is mentioned. R2 is preferably hydrogen or a thioester group.
[0060]
Furthermore, the production method described above is suitable for producing ghrelin, preferably human, rat, mouse, pig, chicken, eel, cow, horse, sheep, frog, rainbow trout or dog ghrelin, or a ghrelin derivative. Used. Further, it is also preferably used when producing a modified amino acid or non-amino acid-containing moiety in the ghrelin or ghrelin derivative. The structure of ghrelin of each organism is shown in Table 1.
More specifically, (a) the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 1 to 21 has at least the first to fourth amino acid sequences at the N-terminus, and preferably 1 at the N-terminus in the amino acid sequence. The amino acid sequence from the 5th to the 5th amino acid sequence, or from the 1st to the 7th amino acid sequence at the N-terminal in the amino acid sequence, and (b) the hydroxyl group of the side chain of the third serine or threonine from the N-terminus is acyl , Preferably acylated with a saturated or unsaturated alkyl group having 2 to 35 carbon atoms, preferably 6 to 18 carbon atoms, (c) a hydroxyl group, amino group, guanidino group, imidazolyl group in the side chain of the amino acid, One or more selected from the group consisting of indolyl group, mercapto group, and carboxyl group, which causes an undesirable side reaction when preparing a peptide fragment. Reactive functional groups which have the potential to, preferably the manufacturing method for the preparation of peptide fragments is hydroxyl and amino groups are protected by protecting groups, it has been described above useful.
[0061]
In the present invention, a protected peptide fragment containing no modified amino acid or non-amino acid is produced separately from the protected peptide fragment containing the modified amino acid or non-amino acid.
A peptide fragment that does not contain amino acids or non-amino acids that have been modified by acylation, glycation, phosphorylation or the like of the peptide or protein of the present invention can be produced by a gene recombination method or an enzymatic method known per se. For example, a step of culturing cells transformed with an expression vector having a base sequence encoding a peptide having the amino acid sequence of the peptide fragment (hereinafter referred to as target peptide), and collecting the target peptide from the culture, Among the side chain functional groups of the target peptide obtained in the above step, the functional group can be produced by a method comprising a step of protecting a functional group having a possibility of causing an undesirable side reaction with a protective group. The method for producing the expression vector can be performed according to a conventional method in the art. When preparing an expression vector, other elements necessary for high expression of the target peptide, such as a promoter, terminator, and splice site, which are already known in conventional methods can be appropriately used. The host cell transformed with the expression vector is not particularly limited, and prokaryotic cells or eukaryotic cells already used in conventional methods, for example, microbial cells such as E. coli, yeast or animal cells, Those capable of suitably expressing the base sequence encoding the target peptide can be appropriately selected and used. The side chain functional group of the target peptide may be protected by the same method as described above.
[0062]
Peptide fragments that do not contain modified amino acids or non-amino acids
Step (1); (a) culturing a cell transformed with an expression vector having a base sequence encoding a fusion protein in which a protective peptide is added to a target peptide via a linker sequence if desired, and then the culture Collecting the fusion protein from
Step (2); a step of cleaving and separating the protective peptide and optionally the linker sequence and the target peptide from the fusion protein obtained in Step (1), and further purifying if necessary;
Step (3); Protecting a functional group having a possibility of causing an undesirable side reaction among the side chain functional groups of the target peptide obtained in (2) with a protecting group;
It can also be manufactured by a method including:
[0063]
The protective peptide is used for the purpose of inhibiting the target peptide from being degraded by the enzyme in the host cell, and is not particularly limited as long as it can achieve the purpose, but it relates to β-galactosidase derived from E. coli. Fragments having an amino acid sequence can be used. The amino acid sequence related to the enzyme is known to those skilled in the art, and peptide fragments derived from β-galactosidase are widely used by those skilled in the art as protective peptides in the fusion protein method.
The linker sequence is inserted between the protective peptide and the target peptide when the cleavage and separation of the protective peptide and the target peptide are not successful, for example, there is no enzyme suitable for the cleavage and separation of the protective peptide and the target peptide in step (2). Array. Therefore, in step (2), the sequence can be appropriately selected so that the linker sequence and the target peptide can be cleaved and separated.
[0064]
Cleavage separation of the protective peptide and optionally the linker sequence and the target peptide can be performed by enzymatic or / and chemical methods.
As the enzymatic and chemical cleavage methods, methods described in Methods in ENZYMOLOGY, Vol. 185, Gene Expression Technology (edited by David V. Goeddel, publisher ACADEMIC PRESS, INC) can also be used.
As a chemical cleavage method, a method in which the C-terminal side of methionine is cleaved with bromocyan (DV. Goeddel et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 76, p106-110, 1979), -Asp-Pro -Method of cleaving between sequences with formic acid (Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol.40, p1173, 1970), Method of cleaving between -Asn-Gly- sequences with hydroxylamine and C-terminal side of trypsin And BNPS-skatole or N-chlorosuccinimide. For example, when methionine is not included in the amino acid sequence of the target peptide, methionine can be introduced into the end of the cleavage site region adjacent to the target peptide and chemically cleaved at the cleavage site region by bromocyan treatment. .
Moreover, as an enzymatic cleavage method, a cleavage site region that can be specifically recognized as a substrate by the enzyme used for the cleavage treatment may be set. Examples thereof include arginine-arginine, lysine-lysine, arginine- The central peptide bond of the basic amino acid pair of lysine and lysine-arginine, or the central peptide bond of the amino acid pair of arginine-methionine, arginine-alanine or arginine-valine is transformed into E. coli OmpT protease (Sugimura, K. and Nishihara, TJ Bacteriol 170: 5625-5632, 1988), between X-Gly or Pro-X-Gly-Pro sequences, between the -X-Gly- sequences, Collagenase (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 81, p4692-4696, 1984), the -C-terminal side of Lys of the -Asp-Asp-Asp-Lys-sequence (SEQ ID NO: 22) is enterokinase, and the -Ile-Glu-Gly-Arg-sequence A of (SEQ ID NO: 23) Blood coagulation factor Xa (blood coagulation factor Xa) (JP 61-135591) is the C-terminal side of rg, and thrombin is the C-terminal side of Arg of the -Gly-Pro-Arg-sequence (JP 62-62A). -135500), the C-terminal side of -Arg- is Trypsin or Clostripain, and the C-terminal side of Arg or Lys is the endoprotease Arg-C (Nature, Vol.285, p456). -461, 1980), the C-terminal side of the Lys-Arg, Arg-Arg or Pro-Arg sequence was replaced with Saccharomyces cerevisiae Kex2 protease and its derivatives (Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 144, p807-814, 1987, JP-A-1-199578, JP-A-10-229884), and the C-terminal side of Lys is lysl endopeptidase or endopeptidase Lys-C (JP-A 61-275222) And the C-terminal side of Asp or Glu is replaced with Staphylococcus aureus V8 protease (Pr oc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 69, p3506-3509, 1972) -Phe-Arg-sequence with C-terminal side of Kallikrein (JP 62-248489) and -Pro-Phe-His-Leu-Leu- Between the Leu-Leu of the Val-Tyr-sequence (SEQ ID NO: 24) is renin (Japanese Patent Laid-Open No. 60-262595), and the C-terminal side of the -Glu-Gly-Arg-sequence is urokinase (Urokinase). In JP-A-2-00685), the C-terminal side of the Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys sequence (SEQ ID NO: 25) is the enteropeptidase (Biotechnology, Vol. 6, p1204-1210, 1988). ), The C-terminal side of poly-Gly is lysostaphin (Japanese Patent Laid-Open No. 1-160496), and the C-terminal side of Lys-Arg, Arg-Arg or Pro-Arg is Kluverromyces lactls (special The method of cutting in Kaihei 1-124390) is listed.
[0065]
The protection of the side chain functional groups of the expression vector, host cell and target peptide in this method is the same as in the above method.
Furthermore, the method described in International Publication No. WO99 / 38984 can also be used as a method for producing a peptide fragment that does not contain amino acids or non-amino acids that have been modified using genetic recombination or enzymatic methods.
[0066]
When the modified amino acid or non-amino acid-containing peptide fragment is a peptide fragment that does not contain ghrelin and ghrelin derivative-modified amino acid or non-amino acid (hereinafter referred to as ghrelin fragment (unmodified component)), International publication number: WO 01/07475 describes a production method by a genetic recombination method and an enzymatic method.
[0067]
Further, by adapting the protective protein and linker sequence used in the production of Glucagon like peptide-1 described in International Publication No. WO 00/52193, OmpT protease or its derivative, and Kex2 protease or its derivative A ghrelin fragment (unmodified component) can also be produced using a two-stage enzymatic method. In this method, since the endogenous OmpT protease of E. coli as a host can be used, it is not necessary to prepare an enzyme separately. The OmpT protease or Kex2 protease derivative is not particularly limited as long as it has the same activity as the OmpT protease or Kex2 protease. Examples of OmpT protease derivatives include enzymes belonging to the Omptin family represented by OmpP protease of Escherichia coli, pgtE protease of Salmorera, and partial peptides containing the active site of OmpT protease. Examples of Kex2 protease derivatives are described in JP-A-10-229884. Examples include the derivatives described above, Furin, enzymes belonging to the Kex2 family represented by PC1 / 3, and the like.
In this method, as shown in Example 13, instead of the linker sequence EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR (SEQ ID NO: 26) described in International Publication No. WO 00/52193, the 35th proline residue in the sequence is changed to an arginine residue. By using the substituted sequence EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHRR (SEQ ID NO: 27) as a linker sequence, a ghrelin fragment (unmodified component), especially a ghrelin (8-28) fragment, in a two-step enzyme treatment method using OmpT protease and Kex2 protease, In particular, a human ghrelin (8-28) fragment can be obtained efficiently. In the newly found linker sequence shown in SEQ ID NO: 27, although a cleavage recognition site other than the cleavage recognition site of OmpT protease is generated, cleavage occurs normally only at the target site. (See Example 3).
[0068]
Furthermore, when the protected peptide fragment (unmodified component) is purified and stored, the removal of the protecting group can be prevented by adjusting the pH of the solution used for purification or storage to 4-8. Then, by suppressing the elimination of the protective group, a highly purified modified peptide or protein can be prepared with a high recovery rate. The solution used for the purification or storage is preferably an aqueous solution. Specifically, water, preferably ultrafiltered water, sodium acetate solution and the like can be mentioned. As is clear from Example 15 in which the stability of the protected human ghrelin (8-28) fragment in the aqueous solution was examined, the stability of the peptide fragment protected by the Boc group varies depending on the aqueous solution state, and particularly an aqueous solution having a pH of 2 or less. Since clear removal of this protecting group was observed in the state, when the Boc group was used as the protecting group, it is particularly preferable to set the pH of the solution during purification and storage between 4-8.
[0069]
Next, in the present invention, (a) a protected peptide fragment containing one or more modified amino acids or non-amino acids obtained as described above, and (b) a protection containing no modified amino acids or non-amino acids. Peptide fragments are condensed and, optionally, the protecting groups on the amino acid or non-amino acid side chain functional groups are deprotected.
[0070]
The condensation reaction is preferably performed by a liquid phase method. In the reaction of condensing the peptide fragments (a) and (b) by the liquid phase method, each amino acid or non-amino acid side chain functional group of the peptide fragment is usually protected with a protecting group. Examples of the protecting group include the protecting groups exemplified above as protecting groups for each functional group. Preferable protecting groups include protecting groups that can remove the protecting groups of the protected peptide fragments of (a) and (b) under the same elimination conditions. In this case, since the weakly acidic leaving resin has already been released, it is not necessary to consider the releasing conditions for the weakly acidic leaving resin. In this case, the protecting group for the side chain functional group includes an N-terminal. A protecting group which is eliminated under the amino group elimination conditions is more preferred.
[0071]
In the reaction of condensing the protected peptide fragments (a) and (b) by a liquid phase method, the reagents and conditions used for the condensation are appropriately selected from those described in the above amino acid condensation reaction. Preferably, it is selected from a method in which impurities such as racemic isomers of peptides or proteins are less likely to be by-produced. In particular, as a reagent (condensation agent) used for condensation, for example, 2- (1-hydrobenzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), 2- (1-hydrobenzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU), diphenylphosphoryl azide (DPPA), diphenylphosphorocyanidate (DEPC), diisopropylcarbodiimide ( Suitable examples include DIPC), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), and the like. Among them, the condensing agent is diisopropylcarbodiimide (DIPC), dicyclohexylcarbodiimide (DCC) or 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), and the condensation of peptide fragments using the condensing agent is 1 More preferably, it is carried out in the presence of -hydroxybenzotriazole (HOBt), 1-hydroxysuccinimide (HOSu) or 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-benzotriazine (HOOBt).
[0072]
In the condensed reaction product, an amino acid or non-amino acid side chain protecting group can be appropriately deprotected. In this case, the deprotection reagent, conditions, and the like are preferably selected from methods in which impurities such as racemic isomers of peptides or proteins are less likely to be by-produced.
The removal conditions for each protecting group may be in accordance with, for example, known methods described in the above-mentioned “Basics and Experiments of Peptide Synthesis”. Protecting group removal methods include strong acids, weak acids, bases, reducing reagents (catalytic reduction, metals, thiols, etc.), oxidizing reagents, nucleophilic reagents, electrophilic reagents, ions, electrons, light, solvents, enzymes, etc. There are methods to be used, and the protecting group can be selected in consideration of the desorption conditions of these desorption methods.
[0073]
Examples of the protecting group removal method (deprotection reaction) include trifluoroacetic acid, acetic acid, anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, or a mixture thereof (preferably trifluoroacetic acid, acetic acid, etc.) Acid treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc .; catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-carbon; zinc dust treatment in acetic acid (Zn / AcOH); or Tetrabutylammonium fluoride (TBAF) treatment or the like is also used. The above deprotection reaction is generally carried out at a temperature of about 40 ° C. or less, but preferably by carrying out at a temperature of about 25 ° C. or less, the by-production of racemized isomers of protected peptide fragments can be effectively suppressed. The reaction time for the above deprotection reaction is usually about 0.5 to about 5 hours.
[0074]
In the acid treatment, for example, water, triisopropylsilane (TIPS), phenol, anisole, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc. (preferably It is preferable to add a cation scavenger such as phenol. The 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of diol or the like, it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
[0075]
The reaction product obtained by the present invention can be obtained by, for example, conventional separation and purification means such as gel filtration, ion exchange chromatography, partition chromatography, high performance liquid chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, electrophoresis, etc. Can be isolated and purified. The product to be purified is not limited to the final modified peptide or protein, but does not contain a protected peptide fragment containing one or more modified amino acids or non-amino acids, or a modified amino acid or non-amino acids. Needless to say, the protected peptide fragment or the product obtained as an intermediate in the production process can be appropriately purified by the above-described separation and purification means.
[0076]
As described above, a modified peptide or protein can be produced. The production method according to the present invention can be applied without particular limitation as long as it is a modified peptide or protein. Among them, ghrelin, preferably human, rat, mouse, pig, chicken, eel, cow, horse, sheep, frog, rainbow trout, or dog ghrelin, or a ghrelin derivative is preferably used. The structure of ghrelin of each organism is shown in Table 1. The ghrelin or ghrelin derivative obtained by the present invention has an extremely high quality ghrelin or ghrelin with a significantly lower amount of impurities (especially racemized isomers of ghrelin or ghrelin derivatives) than ghrelin or ghrelin derivatives obtained by conventional techniques. Is a derivative. As a result, sufficient purification can be effectively performed by a simpler purification method, the working time can be shortened, and ghrelin or a ghrelin derivative can be produced in high yield. Also in this respect, the production method of the present invention is a very advantageous method as an industrial production method of ghrelin or a ghrelin derivative as compared with the prior art.
[0077]
More specifically, the “high-quality ghrelin or ghrelin derivative” includes, for example, a total related substance content of about 1% or less (preferably about 0.9% or less, more preferably about 0.8% or less, Purified ghrelin or a ghrelin derivative or a salt thereof, which is preferably about 0.7% or less). Here, the total related substance means the sum of all impurities detected by high performance liquid chromatography or the like. Examples of impurities include racemic isomers of ghrelin or ghrelin derivatives, highly polar related substances, and other impurities. Is mentioned.
[0078]
Particularly preferred embodiments of the method for producing a modified peptide or protein according to the present invention are as follows. That is,
Step 1; (a) In the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 21, it has at least the 1st to 4th amino acid sequence at the N-terminus, and preferably 1 to 5 at the N-terminus in the amino acid sequence (B) the amino acid sequence of the N-terminal from the 1st to the 7th amino acid sequence, and (b) the side chain hydroxyl group of the third serine or threonine from the N-terminus is acylated, preferably Is acylated with a saturated or unsaturated alkyl group having 2 to 35 carbon atoms, preferably 6 to 18 carbon atoms, and (c) a hydroxyl group, amino group, guanidino group, imidazolyl group, indolyl group in the side chain of the amino acid, Production of one or more peptide fragments selected from the group consisting of mercapto groups and carboxyl groups, and peptide fragments in the following step (4) Reactive functional groups which have the potential to induce undesirable side reactions during the condensation reaction step preferably the peptide fragment is a hydroxyl group and an amino group is protected by a protecting group, to produce on weakly acidic withdrawal resin,
Step (2); a step of detaching the peptide fragment from the weakly acidic leaving resin without detaching the protecting group in the peptide fragment under weakly acidic conditions;
Step (3): In the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 21, an amino acid sequence other than the amino acid sequence possessed by the peptide fragment prepared in steps (1) and (2), preferably N in the amino acid sequence The amino acid sequence of the terminal from the 6th to the 28th amino acid sequence, or the amino acid sequence of the amino acid sequence from the 8th to the 28th amino acid sequence of the N terminus, and the amino acid or non-amino acid side chain; One or more kinds selected from the group consisting of a group, an imidazolyl group, an indolyl group, a mercapto group, and a carboxyl group, may cause an undesirable side reaction in the peptide fragment preparation and the peptide fragment condensation reaction in the following step (4). Reactive functional groups having, preferably hydroxyl and amino groups are protected by protecting groups Process for producing a peptide fragment that,
Step (4): a step of condensing the peptide fragment produced in the step (2) and the peptide fragment produced in the step (3), and then optionally deprotecting the protecting group of the reactive functional group
Is a modified peptide or protein production method.
[0079]
The modified peptide or protein obtained by the method according to the present invention can be obtained in the form of a free peptide or a salt thereof depending on the reaction conditions. Free peptides and their salts can be converted into each other by conventional methods. When the free peptide is converted into a pharmacologically acceptable salt, it may be reacted with, for example, the inorganic acids and organic acids exemplified below. As the above-mentioned peptide or protein salt, a pharmacologically acceptable salt is preferable. As such a salt, when the peptide or protein has a basic group such as an amino group, an inorganic acid (inorganic free salt) is used. (Also called acids) (eg, carbonic acid, bicarbonate, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, boric acid, etc.), organic acids (also called organic free acids) (eg, succinic acid, acetic acid, propionic acid, trifluoroacetic acid, etc.), etc. And salt. When the peptide or protein has an acidic group such as a carboxyl group, an inorganic base (also referred to as an inorganic free base) (eg, an alkali metal such as sodium or potassium, an alkaline earth metal such as calcium or magnesium) or an organic base (Also referred to as organic free base) (for example, organic amines such as triethylamine, basic amino acids such as arginine) and the like. The peptide or protein may form a metal complex compound (eg, copper complex, zinc complex, etc.).
[0080]
The modified peptide or protein produced by the method according to the present invention can be used for various applications. For example, the above purified ghrelin or ghrelin derivative has low toxicity, and is used for mammals (eg, humans, monkeys, dogs, rats, mice) as an eating disorder therapeutic agent, a growth hormone secretagogue, a heart disease treatment. Administered as pharmaceuticals such as drugs, gastric functional disease treatment agents, intestinal mucosa protective agents or preventive agents for small intestinal mucosal damage during parenteral nutrition, osteoporosis treatment, cachexia reduction agents due to chronic diseases, pulmonary dysfunction treatment agents, etc. can do. In addition, the purified ghrelin or ghrelin derivative may be used orally as a tablet, capsule, elixir, sustained-release preparation or the like with sugar coating as necessary, or water or other pharmaceutically acceptable liquid. Injectable aseptic solution or suspension, sustained-release preparation, etc .; Intranasal preparation, such as solution, suspension; Transpulmonary preparation, such as spray or inhalant; Non-suppository form Can be administered orally. The above purified ghrelin or ghrelin derivative in a unit dosage form required for the practice of the formulation generally accepted together with known physiologically recognized carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. The said formulation can be manufactured by mixing.
[0081]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto. The test methods and equipment used in the examples were as described below unless otherwise specified.
[Main abbreviations]
HBTU; 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (2- (1H-benzotriazole-1-yl) -1,1,3 , 3, -tetramethyluronium hexafluorophosphate),
DCC; dicyclohexylcarbodiimide,
HOBt; 1-hydroxybezotriazole,
HOOBt; 3-hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazine,
TFA: trifluoroacetic acid,
TIPS; triisopropylsilane,
DIPEA: diisopropylethylamine,
TBAF; tetrabutylammonium fluoride,
TFE: trifluoroethanol,
Fmoc: fluorenylmethoxycarbonyl,
Boc; t-butyloxycarbonyl,
tBu; t-butyl,
TBDMS; t-butyl dimethylsilyl,
Trt; trityl,
Pac; phenacyl,
DMF; N, N-dimethylformamide,
DCM; dichloromethane,
NMP; N-methylpyrrolidone,
Et ₂ O; diethylether,
DMAP; 4-dimethylaminopyridine,
EDC: 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
[0082]
[Protected amino acids and resins used in the synthesis]
Boc-Gly, Fmoc-Ser (TBDMS), Fmoc-Ser (tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Leu, Fmoc-Ser, Fmoc-Pro (Watanabe Chemical Industries or Applied Biosystems), Prolyl -2-Chlorotrityl resin (manufactured by Nova Biochem).
[0083]
〔Used equipment〕
(A) Peptide automatic synthesizer
Applied Biosystems: 433A synthesizer
(B) Analytical HPLC system
Equipment: Shimadzu LC-10A system
Column: YMC-Pack PROTEIN-RP or YMC-Pack ODS AP-302 or YMC-Pack PROTEIN-C8 (all 4.6 mmφ x 150 mm)
Column temperature: 40 ° C
Eluent: The acetonitrile concentration was varied linearly up to 100% in 0.1% trifluoroacetic acid.
Flow rate: 1 mL / min
Detection: UV (210 nm or 214 nm)
Injection volume: 10-50μL
[0084]
(C) Preparative chromatographic system
Equipment 1: AKTA explorer 10S (Amersham Pharmacia Chromatography System) Column SP-sepharose big beads (XK26 / 30) (Amersham Pharmacia Resin)
26mm ID x 300mm length
YMC-ODS 120 s50 (HR26 / 15) (YMC resin)
26mm ID x 15mm length
Vydac C4 (HR10 / 30) (Vydac)
10mm inside diameter x 300mm length
Source 30RPC (HR10 / 30) 23 mL (Amersham Pharmacia Resin)
10mm inside diameter x 30mm length
Conditions such as flow rate and eluate are described in the examples.
Device 2: Applied Biosystem BioCAD perfusion Chromatography workstation
Column SP-Toyopearl 550-c (ID 16mm x 280mm, manufactured by TOSOH)
YMC-ODS AM (particle size 20μm, inner diameter 21.5mm x 300mm, YMC)
Reversed phase chromatography column ODS-80Ts
(Inner diameter 21.5mm x 300mm column (108 mL) particle size 20um, manufactured by TOSOH)
Conditions such as flow rate and eluate are shown in the examples.
(D) Preparative HPLC system
Equipment: Waters 600 Multisolvent Delivery System
Column: YMC-Pack ODS-A (5 μm, 20 mm x 250 mm) or YMC-Pack PROTEIN-RP (5 μm, C4, 20 mm x 250 mm)
Eluent: In 0.1% trifluoroacetic acid, the acetonitrile concentration was changed linearly up to 100% as appropriate.
Flow rate: 10 mL / min
Detection: 210 nm and 260 nm
Injection: 10-2000μL, 2000μL or more injected by pump
[0085]
(E) Mass spectrometer
Equipment 1: Finigan MAT TSQ700
Ion source: ESI
Detection ion mode: positive
Spray voltage: 4.5kV
Capillary temperature: 250 ° C
Mobile phase: 0.2% acetic acid / methanol mixture (1: 1)
Flow rate: 0.2 mL / min
Scan range: m / z 300 ~ 1,500
Device 2: API3000 (Takara Shuzo)
Detection ion mode: positive mode
Scan type: Q1scan
Flow rate: 0.3 mL / min
1 count / 0.1msec during 5min chase
Molecular range 500-3000 Mass
(F) Amino acid sequence analysis
Equipment: Applied Biosystem 477A Sequencer manufactured by PerkinElmer
(G) Amino acid composition analysis
Instrument: Hitachi L-8500 type amino acid analyzer meter
Sample: Hydrolyzed with 6M hydrochloric acid containing 0.1% phenol at 110 ° C. for 24 hours in a sealed tube.
[0086]
[(Lys ^16,19,20,24 (Boc)] Production scale and outline of ghrelin derived from human (8-28)
Hereinafter, Examples 2 to 8 are about 0.6 g [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] hGhrelin (8-28) (hGhrelin indicates human-derived ghrelin; the same applies hereinafter) and culture and purification results. E. coli was transformed with the expression vector shown in Example 1 to express a fusion protein having the amino acid sequence shown in the same Example. The culture was performed by high-density culture using a 2 L culture tank, and the inclusion bodies were collected. Purification was started using half of the collected inclusion bodies. OmpT reaction [0.9 L scale], cation exchange SP-sepharose big beads [160 mL scale], Boc reaction [0.5 L scale], reverse phase column YMC ODS-120 s50 [80 mL scale], Kex2 reaction [0.3 L Each scale was performed once, and the final purified reverse phase column Vydac C4 [25 mL scale] was performed twice. Only the final purification step was fractionated by elution with a linear concentration gradient. Further, vacuum filtration using an evaporator for solvent removal and glass fiber filter paper (Whatman) for filtration was performed.
[0087]
Example 1 Construction of hGhrelin (8-28) derivative expression vector p117 8-28oRR
Based on the cDNA sequence of hGhrelin (Kojima et al., Nature, 402, p. 656-660, 1999), DNA of hGhrelin (8-28) was obtained by annealing using total synthetic oligo DNA (Pharmacia Biotech). A fragment was obtained. FIG. 1A shows the total synthetic oligo DNA and amino acid sequence used for annealing.
In order to insert this DNA fragment into plasmid pGP117ompPR (international publication number: WO 00/52193) into which a fusion protein gene of Escherichia coli β-galactosidase derivative and human Glucagon like peptide-1 was introduced, pGP117ompPR was treated with restriction enzymes SalI and SacII A DNA fragment from which the human Glucagon like peptide-1 gene was deleted was prepared by agar gel electrophoresis. Further, after alkaline phosphatase treatment, it was ligated with T4 DNA ligase and hGhrelin (8-28) derivative gene fragment previously treated with SacII and T4 DNA kinase. The ligated plasmid was transformed into E. coli DH5α strain to obtain plasmid p117 8-28oPR. This plasmid expresses a fusion protein in which the amino acid sequence of hGhrelin (8-28) and the partial fragment of β-galactosidase 117 amino acid residues are linked by a linker sequence having the amino acid sequence EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR (SEQ ID NO: 26).
[0088]
Furthermore, using this plasmid p117 8-28oPR as a template, KOD plus polymerase (Toyobo) as an enzyme, and the following two types of primers:
ORI-RR: GGTTCCGGATCCCCTTCTCGACATCGCCGGGAACAC (SEQ ID NO: 28)
SAL * R: ATAAGTCGACTTATCGTGGCTGCAG (SEQ ID NO: 29)
The amplified fragment was excised from the electrophoresis gel using PCR. Further, this was treated with restriction enzymes SalI and BamHI. First, p117 8-28oPR was treated with restriction enzymes SalI and BamHI and purified, and this fragment was ligated with T4 DNA ligase. The ligated plasmid was transformed into E. coli DH5α strain to obtain plasmid p117 8-28oRR. . This plasmid expresses a fusion protein in which the amino acid sequence of hGhrelin (8-28) and the partial fragment of β-galactosidase 117 amino acid residues are linked by a linker sequence having the amino acid sequence EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHRR (SEQ ID NO: 27). The expressed fusion protein is shown below in FIG. 1B.
[0089]
Example 2 Recombinant hGhrelin (8-28) fusion protein expression and inclusion body recovery in E. coli
2 L of culture was carried out in a 3 L culture tank using E. coli transformed with the plasmid p117 8-28oRR prepared in Example 1 into E. coli W3110 strain. This expression plasmid is derived from pBR322 and is induced by lac promoter. It also holds a tetracycline resistance gene as a drug resistance gene. Pre-culture was carried out in LB broth at 32 ° C for 14 hours with shaking. A medium having the following composition was used for the main culture. Medium composition is 4g / L yeast extract, 4g / LK ₂ HPO4, 4g / L KH ₂ PO _Four 2.7 g / L Na ₂ HPO _Four , 0.2g / L NH _Four Cl, 1.2 g / L (NH _Four ) ₂ SO _Four , 2g / L MgSO _Four ・ 7H ₂ O, 40 mg / L CaCl ₂ , 40 mg / L FeSO _Four ・ 7H ₂ O, 10 mg / L MnSO _Four ・ NH ₂ O, 10 mg / L AlCl _Three ・ 6H ₂ O, 4 mg / L CoCl ₂ ・ 6H ₂ O, 2 mg / L ZnSO _Four ・ 7H ₂ O, 2 mg / L Na ₂ MoO _Four ・ 2H ₂ O, 1 mg / L CuCl ₂ ・ 2H ₂ O, 0.5 mg / LH _Three BO _Four It is. As a carbon source, 1% of glucose was first added to the medium, and the culture was started at 37 ° C. After glucose depletion, glycerol was added and culture was performed. Thereafter, the culture broth was crushed with a pressurized cell crusher (Manton Gorin), and about 80 g of inclusion bodies were collected with a centrifuge. Further, this inclusion body was resuspended with 2 L of deionized water and then recovered by a centrifuge to wash the inclusion body. Finally OD ₆₆₀ An inclusion body suspension (200 mL) having a value of 530 was obtained.
The following examples were carried out using 100 mL, which is half the volume of this inclusion body suspension.
[0090]
Example 3 Processing of hGhrelin (8-28) fusion protein with endogenous OmpT protease
The inclusion body suspension obtained in Example 2 was OD ₆₆₀ The product was diluted with an additive and deionized water shown in the following reaction conditions so that the value of was 100.0, and the OmpT reaction was performed under the following reaction conditions.
Reaction conditions:
4M urea, 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 50 mM NaCl, reaction volume: 800 mL, reaction temperature 32 ° C., reaction time 40 minutes
100 OD inclusion body ₆₆₀ Dissolve and dilute with 400 mL of 8M urea to a volume of / mL, add Tris-HCl and NaCl to the above concentrations, and make up to 800 mL with deionized water. Further, the pH was adjusted to 7.4 to start the reaction. The reaction was sampled at 0 minutes, 20 minutes and 40 minutes and analyzed by HPLC, and the reaction was stopped at 40 minutes when the cleavage rate exceeded 80%. The reaction was stopped by raising the pH to 11 with 5N NaOH. After stopping the reaction, the residue was removed by low speed centrifugation to obtain a supernatant.
[RHHGSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28) concentration: 2.23 mg / mL
Solution volume: 800 mL
Peptide content: 1.7 g
As a result of HPLC measurement and mass spectrometry, it was shown that processing was normally occurring and [RHHGSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28) was released. The measured value by ESI-MS performed by Finigan MAT's mass spectrometer (TSQ-700) was 4078 (theoretical value: 4077).
[0091]
Example 4 Purification of [RHHGSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28) (Purification by cation exchange)
The supernatant of the OmpT protease reaction solution obtained in Example 3 was purified by cation chromatography.
Method:
Column used: SP-sepharose big beads (XK26 / 30) (160 mL)
(Resin made by Amersham Pharmacia) Inner Diameter 26mm x Length 300mm
Equilibration, wash solution: 1.5 M urea, 50 mM NaHCO _Three pH11
Eluent: 1.5 M urea, 0.5 M NaCl, 50 mM NaHCO _Three pH11
Initialization, regeneration solution: 0.4M NaOH
Flow rate: 10 mL / min (2.5cm / min)
operation:
Initialization, equilibration: 0.4M NaOH ₂ Column volume → Deionized water 2 column volume → Equilibration solution: 100% 3 column volume
Sample loading: Load sample, equilibrate, and wash with UV wash solution until UV drops (approximately 4 column volumes)
Elution: Performed stepwise with 100% eluate.
Results: The purity of the peptide obtained in the eluate was 90%, and the process recovery rate was 91.6%.
[RHHGSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28) concentration: 4.75 mg / mL
Solution volume: 300 mL
Peptide content: 1.43 g
[0092]
Example 5 Bocation of [RHHGSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28)
The purified [RHHGSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28) is subjected to Boc group addition reaction to protect the N-terminal α-amino group and the side chain amino group of the Lys residue contained in the sequence with the Boc group.
Method: The entire 300 mL of cation chromatography eluate was transferred to a glass beaker, and an equal volume (300 mL) of acetonitrile was added to 50% acetonitrile. While further stirring, 1M (Boc) ₂ 8.8 mL (final concentration 20 mM, 25 equivalents) equivalent to 5 times the amount of O in [RHHGSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28) added. Further, the pH was adjusted with 5N NaOH so as not to lower the pH, and the mixture was reacted at room temperature for 60 minutes while stirring with a stirrer.
The reaction efficiency was monitored by HPLC analysis and molecular weight measurement.
Immediately after completion of the reaction, the solvent was removed by an evaporator. After removing the solvent, the pH was adjusted to 5.5 with acetic acid, and the precipitate was filtered under reduced pressure with glass fiber filter paper (Whatman). [N ^α -Boc, Lys ^16,19,20,24 A solution containing 1740 mg of (Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28), 580 mL was obtained.
Process recovery rate: 116% (The process recovery rate is greater than 100% because the absorption by HPLC increases due to the addition of the Boc group, and the apparent recovery rate increases.) Mass spectrometry is Finigan MAT A mass spectrometer (TSQ-700) was used. The measured value by ESI-MS performed was 4578 (theoretical value: 4577).
The molecular weight increased by 500 after the reaction (measured molecular weight = 4578, theoretical molecular weight = 4577) compared to before Boc formation (measured molecular weight = 4077, theoretical molecular weight = 4077). In this peak, four ε-amino groups present in the side chain of lysine residues in the hGhrelin (8-28) sequence and the α-amino group at the N-terminal were Bocated [N ^α -Boc, Lys ^16,19,20,24 (Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28).
[0093]
Example 6 [N ^α -Boc, Lys (Boc) ^16,19,20,24 ]-[RHHGSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28) purification by reversed phase column
[N obtained in Example 5] ^α -Boc, Lys ^16,19,20,24 (Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28) was purified on a reverse phase column.
Method:
Column used: YMC-ODS 120 s50 (HR26 / 15) 80 mL (resin made by YMC) Inner Diameter 26mm x Length 15mm
Equilibration, washing solution: 10% acetonitrile, 30 mM sodium acetate pH 5.5
Eluent: 50% acetonitrile, 30 mM sodium acetate pH 5.5
Regeneration solution: 80% acetonitrile
Flow rate: 7 mL / min (2 cm / min)
After equilibrating the 3-column volume with the equilibration liquid, load the sample and wash the 3-column volume (until the UV drops) with the equilibration liquid. Elution was performed with stepwise elution of 100% eluate. After elution, the column was washed with a regenerating solution.
The eluate was 1770 mg [N ^α -Boc, Lys ^16,19,20,24 Obtained in a 150 mL solution containing (Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28). To this, 75 mL of ultrafiltered water was added to dilute 1.5 times, and acetonitrile contained in the solution was distilled off by an evaporator.
Process recovery rate: 98%
[0094]
Example 7 [Lys with Kex2 protease ^16,19,20,24 (Boc)]-hGhrelin (8-28)
The peptide solution obtained in Example 6 was prepared under the following conditions, and Kex2 reaction was performed. That is, the ODS eluate was diluted to 8 mg / mL with ultrafiltered water, and 1M Tris-HCl pH8.3 was added to 50 mM. 0.25M CaCl ₂ Was added to 5 mM, pre-incubated at 30 ° C. for 10 minutes, and then a Kex2 protease (Japanese Patent Laid-Open No. 10-229884) solution (1 × 10 ⁷ unit / mL) 2.5x10 ^Four In addition to being a unit, the mixture was reacted in a thermostatic bath at 30 ° C. for 120 minutes while stirring with a stirrer. After the reaction, the reaction was stopped by adjusting the pH to 5.5 with acetic acid. From HPLC, mass spectrometry and amino acid analysis, [N ^α -Boc, Lys ^16,19,20,24 (Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28) disappears and [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] hGhrelin (8-28) was found to increase in appearance and was found to be processed normally.
[0095]
Example 8 [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] Purification of hGhrelin (8-28)
[Lys obtained in Example 7] ^16,19,20,24 The post-reaction solution containing (Boc)] hGhrelin (8-28) was purified on a reverse phase column under the following conditions.
Method:
Reverse phase column Vydac C4 (HR10 / 30) 23 mL column (Vydac) Inner diameter 10mm x Length 300mm
conditions:
Equilibration, wash solution 10% acetonitrile, 0.1% TFA pH 3
Eluent: 50% acetonitrile, 0.1% TFA pH 3
Flow rate: 2 mL / min (Linear flow rate 3 cm / min)
After flowing 3 column volume equilibration solution, load the Kex2 post-reaction solution in 2 portions (20 mg / mL resin), wash 2 column volumes with 10% eluate, then eluate 10% -80% Was eluted with a program ending with 8 column volumes, followed by 2 column volume washes with 100% eluate, and 6 mL fractions of eluate were collected during this period. Fractions were analyzed by HPLC and the linker [N ^α -Boc]-[RHHGSGSPSRHRR] and uncut [N ^α -Boc, Lys ^16,19,20,24 Fractions not containing (Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28) were pooled.
result:
Yield: 84.4% Purity 97.5%
[Lys ^16,19,20,24 (Boc)] hGhrelin (8-28) concentration: 5.62 mg / mL
Solution volume: 120 mL
Peptide content: 600 mg
After the solvent was removed from the eluted solution with an evaporator, lyophilization was performed. From 1700 mg of the precursor (Example 3) obtained by processing with an OmpT protease derivative, [Lys ^16,19,20,24 600 mg of (Boc)] hGhrelin (8-28) was obtained (FIG. 2).
[0096]
Example 9 [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] Purification and recovery of hGhrelin (8-28) body, purity table
[Lys] shown in Examples 3 to 8 below ^16,19,20,24 The production yield list of (Boc)] hGhrelin (8-28) is shown in Table 2.
[Table 2]

[0097]
Example 10
(10-1) N-terminal fragment ([N ^α -Boc, Ser ^{2, 6} (tBu)] hGhrelin (1-7))
(Method 1)
Prolyl-2-chlorotrityl resin (Novabiochem, 1.39 g, 1.0 mmol) is placed in a reaction vessel equipped with a glass filter, and Fmoc-amino acid introduction with HBTU and de-Fmoc removal with piperidine are repeated sequentially, and Boc- is added to the N-terminal residue. Gly was introduced to construct Boc-Gly-Ser (tBu) -Ser (TBDMS) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-2-chlorotrityl resin. The obtained protected peptide resin was treated with a 0.1 M TBAF / DMF solution (50 mL) for 30 minutes. The peptide resin was collected by filtration, washed several times with DMF (30 mL), and then washed with isopropyl alcohol and then with DCM (30 mL). Next, the obtained de-TBDMS peptide resin was swollen in NMP (5 mL), and in the presence of DMAP (374 mg, 3.1 mmol), octanoic acid (588 mg, 4.1 mmol), EDC · HCl (848 mg, 4.4 mmol) ) Was added and allowed to react for 16 hours. The resin was collected by filtration, washed successively with NMP, isopropyl alcohol, and DCM, and dried under reduced pressure to obtain a protected peptide resin in which the 3-position serine side chain was octanoylated. To this, 30 mL of 0.5% TFA / DCM solution was added and stirred at room temperature for 30 minutes to release the protected peptide from the resin. The resin was removed by filtration, the filtrate was concentrated, and water was added to the residue to form a precipitate. The precipitate was collected by filtration, further washed by stirring in hexane, and collected again by filtration. This was dried under reduced pressure overnight to obtain 742 mg (yield 72%) of the desired product. When the purity of this product was examined by HPLC, it was 94%.
[0098]
(10-2) N-terminal fragment ([N ^α -Boc, Ser ^{2, 6} (tBu)] hGhrelin (1-7))
(Method 2)
Prolyl-2-chlorotrityl resin (Novabiochem, 1.95 g, 1.0 mmol) was placed in a reaction vessel equipped with a glass filter, and the introduction of Fmoc-amino acid with HBTU and de-Fmoc with piperidine were sequentially repeated, and Phe-Leu-Ser (tBu ) -Pro-2-chlorotrityl resin was constructed. Next, Fmoc-Ser-OH is introduced by HOOBt / DCC, then condensation with de-Fmoc and HOOBt / DCC is repeated, Boc-Gly is introduced at the N-terminal residue, and Boc-Gly-Ser (tBu) -Ser -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-2-chlorotrityl resin was constructed. The obtained peptide resin was swollen in NMP (5 mL), and in the presence of DMAP (374 mg, 3.1 mmol), octanoic acid (579 mg, 4.0 mmol) and EDC · HCl (847 mg, 4.4 mmol) were added for 16 hours. Reacted. The resin was collected by filtration, washed successively with NMP, isopropyl alcohol, and DCM, and dried under reduced pressure to obtain a protected peptide resin in which the 3-position serine side chain was octanoylated. To this, 30 mL of 0.5% TFA / DCM solution was added and stirred at room temperature for 30 minutes to release the protected peptide from the resin. The resin was removed by filtration, the filtrate was concentrated, and water was added to the residue to form a precipitate. The precipitate was collected by filtration, further washed by stirring in hexane, and collected again by filtration. This was dried overnight under reduced pressure to obtain 715 mg of the desired product (yield 69%). When the purity of this product was examined by HPLC, it was 74%.
[0099]
Example 11 Fragment condensation and deprotection
[N obtained in Example 10-1 and Example 8 respectively] ^α -Boc, Ser (tBu) ^2,6 ] hGhrelin (1-7) and [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] hGhrelin (8-28) was quantified in advance using an amino acid analyzer and then subjected to a condensation reaction. [N ^α -Boc, Ser (tBu) ^2,6 ] 0.19 mmol each of hGhrelin (1-7), HBTU, and DIPEA was dissolved in 1 mL of DMF and stirred at room temperature for 30 minutes. Then click Lys ^16,19,20,24 (Boc)] hGhrelin (8-28) 0.16 mmol and DIPEA 0.48 mmol were dissolved in DMF 1.5 mL, and the above-mentioned activated N-terminal fragment solution was added dropwise with stirring. After 1 hour, the reaction solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was Et. ₂ O was added to precipitate, washed and then dried. To the obtained powder, 6 mL of TFA was added, and the mixture was gently stirred at room temperature for 30 minutes. TFA is distilled off under reduced pressure, and Et ₂ O was added for precipitation, and after washing and drying, 0.70 g of a white powdery crude peptide was obtained. This product was analyzed by analytical HPLC. As a result, the purity of the target product on the chart was 80%, and the retention time was consistent with that of all chemically synthesized products. Furthermore, when the semi-synthetic product and the total chemical synthesis product were coinjected, the peaks on the chromatogram coincided. An HPLC chart before and after the condensation is shown in FIG.
[0100]
Example 12 Purification of hGhrelin
0.70 g of the white powdery crude peptide obtained in Example 11 was dissolved in 7 mg / mL with 5% acetic acid, and purification was performed under the following conditions.
Methods, conditions;
Column used: Source 30RPC (HR10 / 30) 23 mL column
(Resin made by Amersham Pharmacia) Inner diameter 10mm x Length 30mm
Equilibration, washing solution: 10% acetonitrile, 50 mM acetic acid
Eluent: 60% acetonitrile, 50 mM acetic acid
Regeneration solution: 80% acetonitrile
Flow rate: 2.5 mL / min (2 cm / min)
After equilibrating the 3-column volume with the equilibration solution, divide the hGhrelin lysate for 2 minutes, load half by volume, and wash the 3-column volume (until the UV drops) with the equilibration solution. Elution was performed with a program that completed a linear concentration gradient from 0% to 100% of the eluate with 6 column volumes. Fractions of the eluate were fractionated in 5 mL portions, analyzed by timely HPLC, and fractions containing hGhrelin were pooled. The pool was desolvated with an evaporator and then freeze-dried. As a result, 512 mg (recovery rate 73%) of hGhrelin having a purity of 98% was obtained. The analysis result by HPLC of purified hGhrelin is shown in FIG.
[0101]
Examples 13 to 15 below relate to optimization of the conditions shown in Examples 1 to 12 above. Therefore, it goes without saying that the present invention is not limited to the following conditions.
Example 13 Difference in cleavage efficiency of Kex2 due to difference in sequence of fusion protein
The cleavage efficiency of Kex2 varies greatly depending on the recognition sequence of the substrate. The cleavage efficiency is cut in the order of Kex2 cleavage sequence KR (10) >> RR (5) >> TR (1.2)> PR (1.0) [the cleavage efficiency when PR is set to 1] in vivo. (Proc. Natl. Acad. Sci 95 p10384-10389
1998) is reported.
FIG. 5 shows proteins expressed by p117s 8-28oPR and p117 8-28oRR prepared in Example 1 and plasmid p117 8-28oKR prepared by PCR using p117 8-28oPR as a template.
Cultivation was carried out using Escherichia coli W3110 carrying plasmids expressing these three types of proteins, and purification was carried out on the scale of about one-tenth of the method shown in Examples 2 to 6, respectively. ^α -Boc, Lys ^16,19,20,24 (Boc)]-[RHHGSGSPSRHPR] -hGhrelin (8-28) (hereinafter PR-hGhrelin (8-28)), [N ^α -Boc, Lys ^16,19,20,24 (Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28) (RR-hGhrelin (8-28)), [N ^α -Boc, Lys ^16,19,20,24 (Boc)]-[RHHGSGSPSRHKR] -hGhrelin (8-28) (hereinafter referred to as KR-hGhrelin (8-28)) were prepared.
The prepared peptide was subjected to Kex2 protease treatment using the method shown in Example 7. The HPLC analysis profile for 60 minutes from the start of the reaction is shown in FIG.
As shown in Fig. 6, RR-hGhrelin (8-28) is the most severely cut in order of cutting rate: RR-hGhrelin (8-28)> PR-hGhrelin (8-28)> KR-hGhrelin (8-28) The rate was high. As for KR-hGhrelin (8-28), the Boc group protected the lysine residue of KR and lost the charge of lysine, so that no cleavage occurred. PR-hGhrelin (8-28) had a low cleavage efficiency, and cleavage occurred in hGhrelin (8-28). This degradation within hGhrelin (8-28) resulted in cleavage between hGhrelin amino acid number 15 arginine and 16 lysine.
[0102]
Example 14 Construction of a fusion protein suitable for E. coli culture
In order to obtain a fusion protein suitable for culturing, a plasmid expressing a fusion protein as shown in FIG. 7 was prepared in addition to the fusion protein shown in FIG. All the fusion proteins shown in FIG. 7 were prepared by PCR from different primers using p117 8-28oPR as a template. For p117 8-28oRR, a mutant was constructed for the purpose of reducing the isoelectric point of the protein.
Each of the prepared fusion protein plasmids was cultured in 2 L in a 3 L culture tank using Escherichia coli transformed into Escherichia coli W3110. Pre-culture was carried out in LB broth at 32 ° C for 14 hours with shaking. The medium composition of the main culture is the same as that shown in Example 2. As a carbon source, 1% glucose was first added to the medium, and the culture was started at 32 ° C. After depletion of glucose, glycerol was added and culture was performed. In addition, when the glucose was depleted, the culture temperature was raised to 37 ° C., and after culturing, the cells were crushed with a pressurized cell crusher (Manton Gorin). The results of the culture were judged by the final turbidity and the turbidity at the time of disrupting the cells. The higher the turbidity of the bacterial body and the ratio of the turbidity before and after disrupting the bacterial body, the higher the inclusion body productivity. The results are shown in graphs A and B in FIG.
As can be seen from graphs A and B, from the final turbidity and the turbidity ratio after disrupting the cells, 117 8-28oRR fusion protein showed the highest productivity among the constructed fusion proteins. From the results of Examples 13 and 14, it was considered that in Example 2, the plasmid p117 8-28oRR expressing the protein was also suitable for culture.
[0103]
Example 15 [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] hGhrelin (8-28) stability
In Examples 6, 7, and 8, [N ^α -Boc, Lys ^16,19,20,24 (Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28) and [Lys ^16,19,20,24 In (Boc)] hGhrelin (8-28), a phenomenon that the Boc group was eliminated by about 1 to 10% was observed. [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] Since hGhrelin (8-28) leaves the added Boc group even at one position, it leads to a significant decrease in the condensation rate in the subsequent condensation step. ^16,19,20,24 The stability of (Boc)] hGhrelin (8-28) was investigated.
The parameters affecting the degradation were the pH during storage and the storage temperature. Therefore, the stability under the following conditions was analyzed and evaluated by HPLC.
Method: Freshly purified [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] hGhrelin (8-28) was dissolved in 30 mM sodium acetate solution, pH2,3,4 were adjusted with TFA, pH6,7,8 were adjusted with 5N NaOH, and further at 4 ° C. And left in a constant temperature bath at 20 ° C., 37 ° C. and 42 ° C. for 1 week. After starting to stand, sampling was performed at 0 hours, 2 hours, 6 hours, 9 hours, 24 hours, 48 hours, 96 hours, and 168 hours, and analysis was performed by HPLC. As an analysis method, [Lys to the total peak area of the analysis result by HPLC ^16,19,20,24 The (Boc)] hGhrelin (8-28) peak area ratio (%) was evaluated over time.
Results: Four types of graphs summarized for each storage temperature are shown in FIGS. It was found that the degradation product increased with decreasing pH (pH 3 or less) and increasing temperature. In addition, it was found that if the pH was 4 or more, it was stable even at 42 ° C. Therefore, it has been found that controlling the pH is important for the suppression of the formation of this decomposition product.
[0104]
Example 16 Production of hGhrelin (1-28) (Method 2)
(1) Construction of hGhrelin (8-28) derivative expression vector p117-8-28ok
In the same manner as in Example 1, plasmid p117-8-28ok was obtained. The difference between the plasmid p117 8-28oPR prepared in Example 1 and the plasmid p117-8-28ok is that the former linker sequence is EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR (SEQ ID NO: 26), whereas the latter linker sequence is RRHHGSGSPSRHPR (SEQ ID NO: 35). It is only the point which is.
(2) Expression of recombinant hGhrelin (8-28) fusion protein in E. coli
The hGhrelin (8-28) fusion protein expression plasmid p117-8-28ok was transformed into Escherichia coli W3110 strain to obtain a transformed strain. This strain is cultured in 20 L medium with glucose and glycerol as carbon sources, and the final OD ₆₆₀ A culture with a value of 54 was obtained.
(3) Processing of hGhrelin (8-28) fusion protein with endogenous OmpT protease
Cell suspension (approximately 680 g) is suspended in 20 L of TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8.0) buffer from the culture solution obtained in (2) above, and then disrupted using a high-pressure homogenizer. Was performed twice. Thereafter, the inclusion body was recovered by centrifugation, suspended again with deionized water, and centrifuged to wash the inclusion body. Next, the inclusion body pellet (wet weight about 170 g) obtained by centrifugation is suspended in a small amount of deionized water, and OD is obtained. ₆₆₀ An inclusion body concentrate 550 mL having a value of 826 was obtained. After collecting 50 mL from the 550 mL inclusion body concentrate, dilute with deionized water so that the OD660 value is 50.0, and Tris-HCl (pH 8.2) and EDTA (pH 8.0) each have a final concentration of 50 mM. The inclusion bodies were dissolved with urea (final concentration 4.0 M). By dissolving the inclusion body with urea, the Arg-Arg of the linker sequence RRHHGSGSPSRHPR (SEQ ID NO: 35) of the fusion protein was cleaved with endogenous OmpT protease. That is, the reaction solution was incubated at 30 ° C. for 5 minutes, and then treated with OmpT protease at 30 ° C. for 15 minutes. Thereafter, 3% AcOH was added to stop the reaction. By this treatment, 1.3 g of RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin (8-28) was obtained. ESI-MS 4019 (theoretical value; 4018) RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin (8-28) is released as a result of high-performance liquid chromatography analysis of the processing process of hGhrelin (8-28) fusion protein with endogenous OmpT protease It has been shown.
[0105]
(4) Purification of RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin (8-28) (purification by cation exchange)
The cation exchange column SP-Toyopearl obtained by equilibrating the OmpT protease reaction solution (900 mL) obtained in (3) above with an equilibration solution (1.5 M Urea, 20 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.3). 550-c (bed volume 55 mL, 16 mm ID x 280 mm, manufactured by TOSOH) was loaded in four portions. After washing the column thoroughly with the equilibration solution each time, the concentration gradient from 75% of the equilibration solution and 25% of the eluate (1.5M Urea, 1.5M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH8.3) to 100% of the eluate is 1.5 columns. Elution was performed with a volume complete program. Sampling was performed every 5 mL, and each fraction was analyzed by high performance liquid chromatography, and a peak not containing E. coli β-galactosidase derivative was collected. The total yield for four doses was about 950 mg.
The purified eluate (660 mL) was divided into two equal parts and loaded twice onto a YMC-ODS AM (particle size 20 μm, YMC) 21.5 mm ID × 300 mm column equilibrated with 2% acetonitrile and 0.1% TFA. After thoroughly washing with the equilibration solution, elution was performed with an eluent [50% acetonitrile, 0.095% TFA]. After fractionating the elution peak, acetonitrile contained in the eluate was removed by a rotary evaporator to obtain 220 mL of a solution containing 720 mg of RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin (8-28). The conditions of high performance liquid chromatography used in (3) and (4) are shown below.
Column; YMC ODS AP-302, detector; Hitachi high-performance liquid chromatography system (D7000), flow rate: 1 mL / min, elution; buffer A [1.0% acetonitrile, 0.1% TFA] 100% to buffer B [50.0% acetonitrile , 0.1% TFA] 100% linear gradient for 20 minutes.
[0106]
(5) Conversion of RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin (8-28) to t-butoxycarbonyl (Boc)
The sample 220 mL (containing 720 mg of RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin (8-28)) obtained in (4) above was transferred to a glass Erlenmeyer flask, and an equal amount of acetonitrile (220 mL) was added. To this, 4.4 mL (final concentration 10 mM, 25) of 1M di-t-butyl dicarbonate, which is 5 times the amount of α-amino and Lysε-amino groups present in RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin (8-28) Equivalent). Further, the pH was adjusted to 9 with triethylamine, and the mixture was reacted at room temperature for 60 minutes while stirring with a stirrer. To stop the reaction, acetic acid was added to a final concentration of 0.5%, and the pH was adjusted to near neutral. Then, acetonitrile was quickly removed by a rotary evaporator, and Boc-RHHGSGSPSRHPR- [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] A solution containing 530 mg of hGhrelin (8-28), 300 mL, was obtained. ESI-MS; 4519 (theoretical; 4518).
From the elution profile of RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin (8-28) before and after Boc formation, and mass spectrometry measurement results, Boc-RHHGSGSPSRHPR- [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] The production of hGhrelin (8-28) was confirmed. The following chromatographic system was used for monitoring this reaction. Column; YMC-C8, detector; Hitachi high performance liquid chromatography system (D7000), flow rate: 1 mL / min, elution; buffer A [1.0% acetonitrile, 0.1% TFA] 100% to buffer B [60.0% acetonitrile, 0.095 % TFA] 100% linear gradient over 20 minutes.
[0107]
(6) [Lys by Kex2 protease ^16,19,20,24 (Boc)] Production of hGhrelin (8-28)
Boc-RHHGSGSPSRHPR- [Lys obtained in (5) above ^16,19,20,24 (Boc)] hGhrelin (8-28) was purified on a reverse phase column. The above Boc derivative (about 500 mg) was loaded onto a YMC-ODS AM (particle size 20 μm, manufactured by TOSOH) 21.5 mm ID × 300 mm column equilibrated with 2% acetonitrile, 0.1% TFA, 10 mM sodium acetate, pH 4.5. After thoroughly washing with the equilibration solution, elution was performed with an eluent [70% acetonitrile, 0.095% TFA, 10 mM sodium acetate, pH 4.5]. Boc-RHHGSGSPSRHPR- [Lys ^16,19,20,24 After fractionating an elution peak containing (Boc)] hGhrelin (8-28) (420 mg), acetonitrile was removed with an evaporator. To this solution, 250 mM calcium chloride solution and 1M Tris-HCl pH8.2 were added to a final concentration of 5 mM and 50 mM, respectively. After incubating at 30 ° C. for 5 minutes, Kex2 protease (Japanese Patent Laid-Open No. 10-229884) solution (1 × 10 ⁷ unit / mL) 3x10 ^Four It added so that it might become unit / mL, and it reacted at 30 degreeC for 45 minutes.
As a result of high-performance liquid chromatography analysis of this process, the linker sequence RHHGSGSPSRHPR and [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] It was shown that hGhrelin (8-28) was cleaved.
[0108]
(7) [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] Purification of hGhrelin (8-28)
[Lys obtained in (6) above] ^16,19,20,24 (Boc)] ODS- reversed-phase chromatographic column equilibrated with 10% acetonitrile and 0.095% TFA after adjusting the reaction solution (300 mL) containing hGhrelin (8-28) (320 mg) to pH 3.5 with acetic acid The sample was loaded on 80Ts (21.5 mm ID × 300 mm column (108 mL), particle size 20 μm, manufactured by TOSOH). After washing 2 column volumes with the equilibration solution, the concentration gradient from buffer A [10% acetonitrile, 0.095% TFA] 70%, buffer B [65% acetonitrile, 0.1% TFA] 30% to buffer B 100% is increased to 5 column volumes. Complete the program, and then click Lys ^16,19,20,24 (Boc)] The hGhrelin (8-28) body was eluted. Fractions (5 mL each) were collected and analyzed by high performance liquid chromatography (conditions are the same as in (6)). [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] Collect the elution fractions of hGhrelin (8-28). After concentration, freeze-dry and 136 mg [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] An hGhrelin (8-28) body was obtained. 136 mg [Lys from 1300 mg precursor ((3) above) obtained by processing with OmpT protease derivative ^16,19,20,24 (Boc)] The hGhrelin (8-28) final product was obtained.
[0109]
(8-1) N-terminal fragment ([N ^α -Boc, Ser ^{2, 6} (tBu)] Synthesis of Ghrelin (1-7) (Method 1)
On a prolyl-2-chlorotrityl resin (manufactured by Nova Biochem, 548 mg, 0.25 mmol), using an automated peptide synthesizer, the introduction of Fmoc-amino acid with HBTU and de-Fmoc with piperidine were repeated in order to obtain an N-terminal residue. Boc-Gly was introduced to construct Boc-Gly-Ser (tBu) -Ser (TBDMS) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-2-chlorotrityl resin. The obtained protected peptide resin (757 mg) was treated with a 0.1 M TBAF / DMF solution (5 mL) for 1 hour. The peptide resin was collected by filtration, washed several times with DMF (10 mL), and then washed with isopropyl alcohol and then with methylene chloride (10 mL). Next, the obtained de-TBDMS peptide resin was swollen in DMF (10 mL), octanoic acid (144.2 mg, 1.0 mmol), EDC · HCI (211 mg, 1.1 mmol) in the presence of DMAP (31 mg, 0.25 mmol). ) Was added and allowed to react for 16 hours. The resin was collected by filtration, washed successively with DMF, isopropyl alcohol, and methylene chloride, and dried under reduced pressure to obtain a protected peptide resin in which the 3-position serine side chain was octanoylated. To this, a mixed solution of 2 mL of acetic acid / 2 mL of TFE / 6 mL of methylene chloride was added and stirred at room temperature for 1 hour to release the protected peptide from the resin. The resin was removed by filtration, the filtrate was concentrated, and ether was added to the residue to form a precipitate. The precipitate was collected by filtration and dried to obtain 248 mg of crude peptide (yield 96%). Dissolve this product in about 2 mL of a mixture of acetic acid and acetonitrile, add YMC-Pack ODS-A (20 mm x 250 mm, and add a linear gradient of 40% to 80% acetonitrile in 0.1% trifluoroacetic acid for 60 minutes. (Flow rate: 10 mL / min) The target fraction was collected and lyophilized to obtain 210 mg of the desired product.
[0110]
(8-2) N-terminal fragment ([N ^α -Boc, Ser ^{2, 6} (tBu)] Synthesis of Ghrelin (1-7) (Method 2)
On a prolyl-2-chlorotrityl resin (Novabiochem, 466 mg, 0.25 mmol), using an automatic peptide synthesizer, the introduction of Fmoc-amino acid with HBTU and de-Fmoc with piperidine were repeated in sequence to form an N-terminal residue. Boc-Gly was introduced to construct Boc-Gly-Ser (tBu) -Ser (Trt) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-2-chlorotrityl resin. This resin was treated with 1% TFA, 5% TIPS / dichloromethane for 30 min to simultaneously remove the Trt group and cleave from the resin. After removing the resin by filtration, the dichloromethane was distilled off under reduced pressure and concentrated. ₂ When O was added and precipitated, and dried, 165 mg of Boc-Gly-Ser (tBu) -Ser-Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-OH was obtained as a white precipitate. Next, phenacyl bromide (Phenacyl Bromide, 40 mg, 1.1 equivalents) and triethylamine (20 mg, 1.1 equivalents) were added, and the mixture was reacted in about 3 mL of DMF for 2 hr. After the reaction, the reaction solution was put into about 5 times amount of ethyl acetate, washed with water and saturated brine, dried by adding sodium sulfate, filtered, concentrated, and Et. ₂ When precipitated with O and dried, Boc-Gly-Ser (tBu) -Ser-Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-OPac was obtained as a white precipitate. Next, octanoic acid (18.2 mg, 1.1 equivalents), EDC · HCl (26.4 mg, 1.2 equivalents), and DMAP (1.4 mg, 0.1 equivalents) were added, and the reaction was allowed to proceed overnight in about 2 mL of DMF. The reaction solution was placed in about 5 times the amount of ethyl acetate, washed with water and saturated brine, dried by adding sodium sulfate, filtered, concentrated, and Et. ₂ Precipitation with O and drying gave 144 mg of Boc-Gly-Ser (tBu) -Ser (Octanoyl) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-OPac as a white precipitate. Next, 1.5 mL of acetic acid and zinc dust (Zinc Powder, 163 mg, 20 equivalents) were added and reacted for 1 hr, followed by filtration, precipitation with cold water, and Et. ₂ Washed with O and dried. 65 mg of Boc-Gly-Ser (tBu) -Ser (Octanoyl) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-OH was obtained as a white precipitate. Dissolve this product in about 2 mL of a mixture of acetic acid and acetonitrile, add YMC-Pack ODS-A (20 mm x 250 mm, and add a linear gradient of 40% to 80% acetonitrile in 0.1% trifluoroacetic acid for 60 minutes. (Flow rate: 10 mL / min) The target fraction was collected and lyophilized to obtain 50 mg of the desired product.
[0111]
(9) Fragment condensation and deprotection
[N] obtained in (8-1) and (7), respectively. ^α -Boc, Ser (tBu) ^{2, 6} ] -Ghrelin (1-7) and [Lys ^{16, 19, 20, 24} (Boc)] hGhrelin (8-28) was quantified in advance using an amino acid analyzer and then subjected to a condensation reaction. [N ^α -Boc, Ser (tBu) ^{2, 6} ] -Ghrelin (1-7), 19.3 μmol, HBTU 20.3 μmol and DIPEA 20.3 μmol were dissolved in DMF 500 μL and stirred at room temperature for 1 hour. Then click Lys ^{16, 19, 20, 24} (Boc)] 18.4 μmol of hGhrelin (8-28) and 55.2 μmol of DIPEA were dissolved in 1 mL of DMF, and the above-mentioned activated N-terminal fragment solution was added dropwise with stirring. After 3 hours, the reaction solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was Et. ₂ O was added to precipitate, washed and then dried. To the obtained powder, 3 mL of TFA was added, and the mixture was gently stirred at room temperature for 30 min. TFA is distilled off under reduced pressure, and Et ₂ O was added for precipitation, and after washing and drying, 77 mg of crude peptide in the form of white powder was obtained. As a result of analyzing this product by analytical HPLC, the purity of the target product on the chart was 83%, and the retention time coincided with the chemically synthesized product. Furthermore, when the semi-synthetic product and the total synthetic product were coinjected, the peaks on the chromatogram coincided.
[0112]
(10) Purification of hGhrelin (1-28)
Reverse-phase chromatographic column TSK-ODS-80Ts 108 mL (ID21.) Obtained by dissolving 67 mg of the white powdery crude hGhrelin obtained in (9) above with 1% acetic acid and equilibrating with 0.1 M acetic acid. 5 mm x 300 mm). After washing 2 column volumes with the equilibration solution, a program to complete a concentration gradient from 100% of buffer A [0.1M acetic acid] to 100% of buffer B [40% acetonitrile, 0.1M acetic acid] in 5 column volumes was performed, and hGhrelin ( 1-28) The body was eluted. High-purity fractions were collected and lyophilized to obtain 34.4 mg of hGhrelin (1-28).
ESI-MS 3371 (theoretical value 3370.86), amino acid composition ratio after 6N hydrochloric acid decomposition Ala; 1.01 (1), Arg; 2.97 (3), Glx; 5.95 (6), Gly; 1.02 (1), His; 1.00 (1), Leu; 2 (2), Lys; 4.01 (4), Phe; 1.00 (1), Pro; 4.01 (4), Ser; 3.60 (4), Val; 1.00 (1) (in parentheses Theoretical value), Ca mobilization activity 1.3 nM (ref. 1.5 nM)
[0113]
Example 17 Optimization of de-TBDMS conditions and octanoylation conditions for Boc-Gly-Ser (tBu) -Ser (TBDMS) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-OH
According to the method of Example 16 (8-1), the optimum conditions for the removal reaction of the 3-position serine TBDMS group and the octanoylation reaction were examined. Using an automatic peptide synthesizer (Applied Biosystems Japan Co., Ltd., 433A) on prolyl-2-chlorotrityl resin, the introduction of Fmoc-amino acid with HBTU and de-Fmoc with piperidine were repeated in order, and the N-terminal residue Constructed Boc-Gly-Ser (tBu) -Ser (TBDMS) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-2 chlorotrityl resin by introducing Boc-Gly. Next, the resin was divided into 0.05 mmols (about 150 mg), and octanoylation was performed under the conditions shown in Tables 3 and 4. Conditions such as resin washing and peptide cleavage from the resin were the same as in Example 16 (8-1).
As a result, the removal reaction of the TBDMS group is preferably performed using a 0.1 M TBAF solution for 30 minutes to 1 hour, and the octanoylation reaction is performed using 8 to 16 octanoic acid 4 equivalents, EDC 4.4 equivalents, and DMAP 1 equivalent. It became clear that it was preferable to react for a time.
[Table 3]

a; The removal rate of the TBDMS group was determined by the ratio of the octanoyl form obtained by deprotecting the peptide resin treated with TBAF and deprotecting it, and the desoctanoyl form showing no removal of TBDMS. Octanoylation was performed for 24 hours using 4 equivalents of octanoic acid, 4.4 equivalents of EDC, and 1 equivalent of DMAP.
b: Calculated based on the substitution rate of prolyl-2-chlorotrityl resin.
c; The purity and ratio of the target product are calculated by analytical HPLC.
d; ND not detected.
[Table 4]

a; All samples were treated with 0.1 M TBAF for 1 hour to remove TBDMS groups.
b: Calculated based on the substitution rate of prolyl-2-chlorotrityl resin.
c; The purity and ratio of the target product are calculated by analytical HPLC.
d; ND not detected.
[0114]
Example 18 Examination of fragment condensation conditions
[N ^α -Boc, Ser (tBu) ^2,6 ] hGhrelin (1-7) and [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] hGhrelin (8-28) was used to examine the reaction efficiency of various condensing reagents. HBTU gave the best results, but the reaction also proceeded with EDC / HOBt, EDC / HOSu, and DPPA. Became clear.
[Table 5]

[0115]
【The invention's effect】
By the production method of the present invention, a very high quality modified peptide or protein can be obtained in high yield.
[0116]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1A represents the total synthetic oligo DNA and amino acid sequence of hGhrelin (8-28). FIG. 1B shows the amino acid sequence of the hGhrelin (8-28) fusion protein expressed by p117 8-28oRR.
FIG. 2 shows purified [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] shows the results of HPLC analysis of hGhrelin (8-28). Peak A) is the Lys ^16,19,20,24 (Boc)] hGhrelin (8-28) peak is shown.
FIG. 3 shows a fragment condensation reaction. Peak A is [N ^α -Boc, Ser ^2,6 (tBu)] hGhrelin (1-7) peak, peak B is [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] hGhrelin (8-28) peak, peak C is [N ^α -Boc, Ser ^2,6 (tBu), Lys ^16,19,20,24 (Boc)] hGhrelin peak, and peak D shows hGhrelin peak.
FIG. 4 shows the results of HPLC measurement of purified hGhrelin.
FIG. 5 shows the amino acid sequences of fusion proteins with different cleavage recognition sites for Kex2 protease.
FIG. 6 shows the result of HPLC analysis of the Kex2 cleavage efficiency of each fusion protein prepared in FIG. FIG. 6A shows the results of HPLC analysis after the Kex2 enzyme reaction of PR-hGhrelin (8-28). FIG. 6B shows the HPLC analysis result after Kex2 enzyme reaction of RR-hGhrelin (8-28). FIG. 6C shows the result of HPLC analysis after Kex2 enzyme reaction of KR-hGhrelin (8-28). Peak A) contains a linker sequence [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] hGhrelin (8-28) peak is shown. Peak A) is the Lys ^16,19,20,24 (Boc)] hGhrelin (8-28) peak is shown. Peak C) is the Lys ^16,19,20,24 (Boc)] hGhrelin (16-28) peak is shown.
FIG. 7 shows the amino acid sequence of each hGhrelin (8-28) fusion protein prepared to determine the optimal fusion protein for culture.
FIG. 8A shows the difference in the culture results due to the difference in fusion protein, and FIG. 8B shows the turbidity after disruption of the cells relative to the turbidity before disruption of the culture in each fusion protein (fusion protein Difference).
FIG. 9 is a diagram of [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] The stability evaluation result of hGhrelin (8-28) is shown.
FIG. 10 shows a diagram of [Lys ^16,19,20,24 (Boc)] The stability evaluation result of hGhrelin (8-28) is shown.

Claims (19)

It has a desired sequence consisting of amino acids and / or non-amino acids, of which at least one amino acid or non-amino acid is represented by formula 1; -A (R)-(wherein A represents an amino acid or non-amino acid, and R represents A The amino acid or non-amino acid subjected to the modification represented by (1) and a hydroxyl group, an amino group in the side chain of the amino acid or non-amino acid, One or more reactive functional groups selected from the group consisting of a guanidino group, an imidazolyl group, an indolyl group, a mercapto group, and a carboxyl group are protected by a protective group, which may cause an undesirable side reaction when a peptide fragment is produced. a method of manufacturing a peptide fragment that is, the non-amino _{acid, NH 2 -CH (CH 2 OH} ) -CH 3 molecular chain length of peptide corresponding long molecular chain length Bae Plastid equivalent length a is _{CH 3 -CH (R 11) -COOH} , CH 3 -CH (R 11) molecular chain length of the peptide corresponds in length - CH _3, NH ₂ molecular chain length of dipeptide corresponding length - ( CH ₂ ) ₃ CH (CH ₂ OH) -COOH , NH _2- (CH ₂ ) ₄ -COOH whose molecular chain length is equivalent to a dipeptide, NH ₂ -C (CH ₃ ) whose molecular chain length is equivalent to a dipeptide _2- (CH ₂ ) ₃ -COOH , NH ₂ -CH (CH ₃ )-(CH ₂ ) ₂ -CH (CH ₃ ) -COOH , whose molecular chain length is equivalent to a dipeptide, and whose molecular chain length is equivalent to a dipeptide there _{NH 2 - (CH 2) 3} CH (CH 2 OH) - (CH 2) 3 CH (R 11) - - CH 3, and NH ₂ molecular chain length of dipeptide corresponding length selected from the group consisting of CH ₃ ( R ₁₁ represents a side chain of a natural amino acid),
(A) A group having a desired sequence consisting of an amino acid and / or a non-amino acid and consisting of a hydroxyl group, an amino group, a guanidino group, an imidazolyl group, an indolyl group, a mercapto group, and a carboxyl group in the side chain of the amino acid or non-amino acid A peptide fragment in which a reactive functional group having a possibility of causing an undesirable side reaction in preparing a peptide fragment is protected with a protecting group is prepared on a weakly acidic release resin, (b) T -butyldimethylsilyl ( TBDMS ) introduced into the reactive functional group in the side chain of the amino acid or non-amino acid A that is modified by the substituent R without leaving the peptide fragment on the weakly acidic leaving resin , t- butyldiphenylsilyl (TBDPS), triisopropyl silyl (TIPS), triisobutylsilyl (TIBS), - hexyldimethylsilyl (ThxDMS), and the silyl protecting group selected from the group consisting of triphenylsilyl (TPS), tetrabutylammonium fluoride (TBAF), tetraethylammonium fluoride (TEF), and consisting of ammonium fluoride Deprotecting with quaternary ammonium fluoride selected from the group , (c) modifying the deprotected side chain with substituent R, and (d) removing the protecting group in the peptide fragment under mildly acidic conditions method for producing the peptide fragment you characterized by disengaging the weakly acidic withdrawal resin is protected include one or more amino acids or non-amino acid underwent modified peptide fragments. The weakly acidic release resin is a trityl resin, and Sieber Amide The method for producing a peptide fragment according to claim 1, which is a resin selected from the group consisting of resins. A is serine, threonine, cysteine, homocysteine, lysine, ornithine, glutamic acid, 2-aminoadipic acid, diaminoacetic acid, 2-aminomalonic acid, aspartic acid, tyrosine or asparagine, and R is an ester bond, ether bond, thioether The method for producing a peptide fragment according to claim 1 or 2 , comprising binding to a reactive substituent on the side chain of A via a bond, disulfide bond, amide bond, O-glycoside bond or N-glycoside bond. . The method for producing a peptide fragment according to claim 3 , wherein A is serine or threonine, and R is bonded to the hydroxyl group of the side chain of A via an ester bond. The peptide fragment is
(1) Gureri down,
(2) in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, peptide or a salt thereof having at least an amino acid sequence from amino-terminus to 4-10 th, and the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1-21, from the amino terminus It is selected from the group consisting of a peptide consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted and / or added in a portion other than the amino acid sequence from the 4th to the 10th, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. A ghrelin derivative, or
(3) The method for producing a peptide fragment according to claim 4 , which is a peptide fragment containing an amino acid subjected to modification in the ghrelin or the ghrelin derivative. The weak acidic release resin is 2-chlorotrityl resin, and the silyl protecting group is t-butyldimethylsilyl ( TBDMS ) And quaternary ammonium fluoride is tetrabutylammonium fluoride ( TBAF The method for producing a peptide fragment according to any one of claims 1 to 5. In step (c), the deprotected side chain is modified with an octanoyl group, and the octanoylation reaction is carried out using 4 equivalents of octanoic acid, 1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide ( EDC 4.4 equivalents, 4-dimethylaminopyridine (DMAP) The method for producing a peptide fragment according to claim 6, which is carried out by reacting for 8 to 16 hours using 1 equivalent. (A) producing a protected peptide fragment containing one or more amino acids or non-amino acids modified by the method according to any one of claims 1 to 7, and separately from the peptide fragment of (a), (B) selected from the group consisting of a hydroxyl group, an amino group, a guanidino group, an imidazolyl group, an indolyl group, a mercapto group, and a carboxyl group in the side chain of the amino acid or non-amino acid without containing a modified amino acid or non-amino acid Producing a peptide fragment protected with a reactive functional group having the possibility of inducing one or more undesirable side reactions, and condensing the peptide fragments produced in (a) and (b) above A method for producing a modified peptide or protein characterized by the above. The method for producing a modified peptide or protein according to claim 8 , wherein the peptide fragments are condensed using a condensing agent. The condensing agent is 2- (1-hydrobenzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), 2- (1-hydrobenzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU), diphenylphosphoryl azide (DPPA), diphenylphosphorocyanidate (DEPC), diisopropylcarbodiimide (DIPC), dicyclohexylcarbodiimide (DCC) or 1- The method for producing a modified peptide or protein according to claim 9 , which is ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Peptide fragments (a) and (b) in which the condensing agent is diisopropylcarbodiimide (DIPC), dicyclohexylcarbodiimide (DCC) or 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), and the condensing agent is used. The condensation of is carried out in the presence of 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 1-hydroxysuccinimide (HOSu) or 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-benzotriazine (HOOBt) Item 10. A method for producing the modified peptide or protein according to Item 9 . Condensation of the peptide fragment produced in (a) above with the peptide fragment produced in (b) above is performed using 2- ( 1-hydrobenzotriazol-1-yl ) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate ( HBTU ) Or 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide ( EDC 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) The method for producing a modified peptide or protein according to claim 9, which is carried out in the presence of. The modified peptide or protein according to any one of claims 8 to 12, which comprises producing a protected peptide fragment containing no modified amino acid or non-amino acid by an enzymatic method or / and a genetic recombination method. Production method. A modified peptide fragment that does not contain a modified amino acid or non-amino acid;
Step (1): a base sequence encoding a peptide having the amino acid sequence of the peptide fragment (hereinafter referred to as the target peptide in this section), or a fusion in which a protective peptide is added to the target peptide via a linker sequence if desired A step of culturing a cell transformed with an expression vector having any one of the base sequences encoding the protein, and collecting the target peptide or the fusion protein from the culture;
Step (2): when the fusion protein is collected in step (1), a step of cleaving and separating the protective peptide and optionally the linker sequence and the target peptide from the obtained fusion protein, and further purifying the target peptide if desired;
Step (3): 1 selected from the group consisting of a hydroxyl group, an amino group, a guanidino group, an imidazolyl group, an indolyl group, a mercapto group, and a carboxyl group in the side chain of the target peptide obtained in Step (1) or (2) Protecting a reactive functional group having a possibility of inducing an undesirable side reaction of a species or more with a protecting group;
The method for producing a modified peptide or protein according to claim 13 , which comprises producing the modified peptide or protein according to claim 13 . Cutting and separating the linker sequence and the target peptide by protecting the peptide and optionally in step (2) is, OmpT protease, or OmpT protease derived selected from the group consisting of a partial peptide containing an active site of Omptin family enzymes, and OmpT protease body,及 beauty Kex2 protease, or Kex2 modified peptide or protein the method according to claim 14 consisting be performed in two stages using a derivative selected from the family enzymes. The method for producing a modified peptide or protein according to claim 14 or 15 , wherein the linker sequence is the sequence set forth in SEQ ID NO: 27. The peptide fragment according to any one of claims 12 to 16, wherein the peptide fragment is a peptide fragment which does not contain ghrelin or a modified amino acid or non-amino group in the ghrelin derivative. Method. The modified peptide or protein according to any one of claims 12 to 17 , wherein the protected peptide fragment containing no modified amino acid or non-amino acid is purified and stored in a solution having a pH of 4 to 8. Manufacturing method. The method for producing a modified peptide or protein according to any one of claims 12 to 18 , wherein the protecting group is a Boc group.

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