JP4276390B2

JP4276390B2 - Environmental monitoring system using nucleic acids

Info

Publication number: JP4276390B2
Application number: JP2001193075A
Authority: JP
Inventors: 希一福井; 伸介藤原
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2001-06-26
Filing date: 2001-06-26
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2021-06-26
Also published as: JP2003000241A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、環境モニタリング方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、基板上に固定化した核酸をモニタリング対象環境に曝し、核酸に生じる損傷から環境をモニタリングする方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
現代社会において我々が生活する環境には、化学物質や電子線、放射線等の電磁波等、様々な影響因子が存在する。近年、人体や環境に悪影響を及ぼすと考えられるこれらの因子に対する危機感が高まっており、様々な調査、報告がなされている。
【０００３】
化学物質は、今や産業廃棄物や工業排水、排ガスに限らず、保存料等の食品添加物、各種の医農薬品、洗剤等の香粧品、建築建材の防腐剤や塗料等のあらゆる形態で我々の生活に浸透しており、近年、これらの化学物質の人体や環境への影響が懸念されている。これらの化学物質の安全性については、従来、実験動物を用いた試験による評価が一般的に行われていた。また、大気や河川、あるいは各種製品中の化学物質の量については、種々の化学的分析方法により測定されている。これらの試験、測定方法はいずれも煩雑な操作と長期間を要し、リアルタイムでの測定が困難であるという問題があった。さらに、人体への直接的および遺伝的影響を正確に知るためには、過敏症等の症状があらわれた患者に対して種々の候補物質を接触あるいは投与して原因物質を特定したり、反応性を判断したりするしかなく、患者に多大な苦痛を強いる上検査結果が得られるまでに長時間を有するという問題があった。
【０００４】
一方、電磁波はその波長に応じて種類の異なる様々なものが、我々の生活における多様な分野で利用されている。波長〜１０^-8ｍ程度のγ線（放射線、宇宙線）やＸ線、１０^-8〜４×１０^-7ｍの紫外線、４×１０^-7〜８×１０^-7ｍの可視光、８×１０^-7〜１０^-3ｍの赤外線、１０^-3〜１０^-1ｍのマイクロ波、１０^-1〜１０⁴ｍの電波に分けられる。中でも、通信用に用いられる電波に関しては、携帯電話や携帯端末の普及とともに、近年、その人体に与える影響が懸念されている。また、電子レンジに利用されるマイクロ波についても、最近になってその人体への影響が心配されている。しかし腫瘍や免疫疾患等とこれらの電磁波の具体的な因果関係については、これまでのところ明らかになっていないのが実情である。さらに、放射線については、原子力施設や医療施設での放射能事故により、社会不安の大きな要因であるといわざるを得ない。
【０００５】
放射線には自然界の中に存在する自然放射線と人工的に作られた人工放射線がある。自然放射線は、人類が太古から浴びてきたものであり、太陽や銀河系宇宙から地球に降り注ぐさまざまな放射線（宇宙線）と、その大部分を占める高速の陽子線が大気中の窒素や酸素の原子核と衝突して作り出される高エネルギーの原子核、中性子、中間子、γ線といった二次宇宙線、さらには、大地に含まれるウラン、トリウム、カリウム４０等の自然の放射性同位元素から出されるγ線などがある。
【０００６】
一方、放射線は微量のものも含めれば、様々な分野で人工的に利用されている。例えば夜光時計の文字盤、蛍光灯のスタータ、カメラのストロボ充電表示用の表示管、煙探知器等は、いずれも微量のγ線やα線を放出する放射性同位体を利用したものである。また、テレビやパソコンのモニター等のブラウン管は、電子線を利用したものである。さらに、ほとんどすべての疾患に対して行われ、集団検診でも実施されるレントゲンでは、比較的大量の人工放射線が利用されている。したがって、一般的に認識されている以上に、我々は日常生活において放射線に曝されているのである。
【０００７】
１９９２年の調査によれば、日本人が被曝する放射線の発生源の平均的割合は、３９％が自然放射線、５９％がレントゲンやＣＴスキャン、放射線治療等の医療用放射線であり、残る２％に、職業上の被曝、原子力施設からの放射線、航空機の利用により曝されるもの、一般消費物によるもの等が含まれる。
【０００８】
近年、石油資源の枯渇が懸念され、新たなエネルギー源として、原子力が検討されている。また、癌治療を始めとする医療分野でも放射線の有効性がますます注目されている。しかし、原子力施設における放射能漏れ事故や患者の大量被曝等により、作業者や施設付近の住民の間で、放射線に対する不安感や危機感が高まっており、施設内の安全管理や作業環境および付近の放射線量の検地が社会的に重要な課題となっている。
【０００９】
放射線は、呼吸によって大気中の放射性同位元素を吸い込んだり、宇宙線や大地、放射性降下物からのγ線を体外から浴びたり、飲食物を通じて体内に取り込んだりすることにより、人体に影響を及ぼす。人体への影響は、大きく分けて、本人に現れる身体的、生理的影響とその子孫に影響が現れる遺伝的影響があり、身体的、生理的影響には急性効果と晩発効果がある。前記のとおりに、我々の日常生活における放射線被曝は、医療診断や自然界からのものが大半を占め、通常人体に影響を及ぼさない程度のものであるが、放射線には色も臭いもないため、放射線設備の安全管理、作業者や周辺住民の放射線防護、あるいは社会的不安の除去のためにも施設内外の放射線量の正確な測定が重要といえる。
【００１０】
従来の放射線量測定ではその蛍光、写真、電離作用を利用する方法が用いられてきた。具体的には、蛍光体に生じる蛍光を測定、記録するシンチレーションカウンター（蛍光作用）、フィルムバッジやオートラジオグラフ（写真作用）、気体の電離を測定するＧＭ計数管（電離作用）が代表的な放射線量測定方法として挙げられる。
【００１１】
しかし、従来の検出器はいずれも放射線の線質、線量に応じて異なったものが使用されており、人体への影響を評価する場合には、放射線荷重計数、組織荷重計数で補正し、実効線量を算出する必要があった。また、既存の方法は遺伝子への影響を直接的に測定するものではなく、間接的に評価しているにすぎないため、遺伝的影響や晩発効果に関わるより実際的な放射線量の測定ができないという問題があった。
【００１２】
原子力施設や放射線治療設備の安全管理や、作業者および付近住民の健康を守る上で、人体やＤＮＡを始めとする核酸への放射線の影響を直接的、かつ簡便に、精度高く測定できる方法の開発は重要と考えられる。
【００１３】
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解決するものとして、化学物質や電磁波、放射線等の環境による核酸への影響をも測定でき、高い検出感度を有する環境モニタリング方法を提供することを課題としている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、まず第１には、核酸および核酸類似体からなる群より選択される少なくとも１種の核酸を基板に固定化した核酸固定化基板をモニタリング対象環境に曝し、該基板上の核酸に生じる損傷を検出、測定することを特徴とする環境モニタリング方法を提供する。
【００１５】
この出願の発明は、第２には、核酸固定化基板は、核酸と基板表面の静電的相互作用により固定化されている環境モニタリング方法を、第３には、基板がガラス基板である前記の環境モニタリング方法を、第４には、基板がシリコン基板である前記の環境モニタリング方法を、また第５には、基板がプラスチック基板である前記の環境モニタリング方法を提供する。
【００１６】
また、この出願の発明は、前記のいずれかの環境モニタリング方法において、第６には、基板が表面処理により、正電荷が付与されていること、および第７には、基板がアミノシラン溶液によって表面処理されることを態様として提供する。
【００１７】
この出願の発明は、また、第８には、モニタリング対象環境が放射線である前記の環境モニタリング方法を、第９には、モニタリング対象環境が化学物質である前記の環境モニタリング方法を提供する。
【００１８】
第１０には、この出願の発明は、核酸に生じる損傷は、核酸にインターカレーターを接触させた後モニタリング対象環境に曝し、検出、測定する環境モニタリング方法を、第１１には、インターカレーターが蛍光色素である前記の環境モニタリング方法を提供する。
【００１９】
この出願の発明は、さらに、第１２には、核酸に生じる損傷を、蛍光顕微鏡、高感度ＣＣＤカメラおよび走査型プローブ顕微鏡から選択される少なくとも１つの検出手段により検出、測定すること、第１３には、核酸がＤＮＡであること、および第１４には、ＤＮＡが繊維状の環状ＤＮＡまたは繊維状の直線状ＤＮＡから選択されることを前記の環境モニタリング方法の態様として提供する。
【００２０】
さらに、この出願の発明は、第１５には、前記のいずれかの環境モニタリング方法において用いられるプローブであって、少なくとも基板表面に核酸が固定化された核酸固定化基板を有する環境モニタリング用プローブを、また、第１６には、前記のいずれかの環境モニタリング方法において用いられるプローブであって、少なくとも基板表面に核酸が固定化された核酸固定化基板と蓋を有し、その間にインターカレーターが封入されている環境モニタリング用プローブを提供する。
【００２１】
この出願の発明は、第１７には、前記の環境モニタリング用プローブの製造方法であって、基板表面に核酸を固定化することを特徴とする環境モニタリング用プローブの製造方法を提供する。
【００２２】
また、この出願の発明は、第１８には、前記の環境モニタリング用プローブの製造方法であって、基板表面に核酸を固定化して得られる核酸固定化基板の表面にインターカレーターを塗布した後、蓋で覆って封入することを特徴とする環境モニタリング用プローブの製造方法。
【００２３】
第１９には、この出願の発明は、核酸を、基板に正電荷を付与した後、核酸含有溶液を塗布し、乾燥させて静電的相互作用により基板表面に固定化する前記のいずれかの環境モニタリング用プローブの製造方法を提供し、第２０には、核酸が、ＤＮＡである前記のいずれかの環境モニタリング用プローブの製造方法を提供する。
【００２４】
この出願の発明は、第２１には、ＤＮＡを、任意の区画に分割されたＤＮＡについて各区画を増幅するプライマーを設計し、各区画の長さに相当する間隔で基板上にプライマーを固定化した後、該ＤＮＡを鋳型にＤＮＡ合成して基板表面に伸長、固定化する環境モニタリング用プローブの製造方法を提供する。
【００２５】
そして、第２２には、この出願の発明は、前記のいずれかの環境モニタリング方法を用いて放射線を測定するためのシステムであって、少なくとも前記の環境モニタリング測定用プローブと、該プローブにおける核酸の損傷を検出するための損傷検出手段と、検出結果解析手段を有する環境モニタリングシステムをも提供する。
【００２６】
【発明の実施の形態】
この出願の発明の放射線測定方法では、ＤＮＡ等の核酸に注目し、化学物質や放射線が核酸に与える損傷の度合いを検出することにより、環境と核酸損傷度の関係を明らかにし、化学種や線質の違いを考慮することなく生物への損傷度を評価できるものである。
【００２７】
従来、放射線測定方法として用いられてきたフィルムバッチやガラス線量計等では生物への影響を間接的に予測することが可能であったが、この出願の発明の環境モニタリング方法では、核酸への影響を直接測定できるため、極めて正確な測定が可能となる。また、この出願の発明の環境モニタリング方法は、核酸損傷の検出において煩雑な生化学的操作を必要とせず、微細な基板上に固定化した核酸を直接的に、あるいは蛍光色素等を用いて、可視化することにより損傷を簡便に検出、定量できる。
【００２８】
核酸の中でも遺伝子の本体であるＤＮＡを例に挙げれば、一般にＤＮＡの切断は放射線量が数Ｇｙ以下の場合でも起こるが、溶液中での吸光度変化や電気泳動などの生化学的手法によりＤＮＡ切断を検出するには１００Ｇｙ以上の放射線照射が必要となる。核酸の損傷を顕微鏡等の下で直読するこの出願の発明の環境モニタリング方法を用いることにより、放射線の検出感度を飛躍的に向上させることが可能なのである。同様に、化学物質についても、基板上に固定化されたＤＮＡ等の核酸を直接化学物質に曝露し、その損傷を直読することができることから、感度高い検出が可能となるのである。
【００２９】
この出願の発明の放射線測定方法は、基板上に放射線の影響を測定したい対象生物の細胞核や染色体から得られるＤＮＡ、クローニング、あるいは合成により得られるＤＮＡやＲＮＡ等の核酸や核酸類似体を固定化し、この核酸固定化基板をモニタリングしたい環境下に曝した後、核酸固定化基板における核酸の損傷を検出、測定するものである。具体的には、例えば核酸としてＤＮＡやＲＮＡを用いるとき、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）固定化基板に放射線を照射したり、化学物質を含有する溶液を塗布したりして、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）の断片化を蛍光顕微鏡や高感度ＣＣＤカメラ、走査型プローブ顕微鏡等で検出、測定できる。このとき、ＤＮＡ固定化基板にインターカレーターを接触させれば、ＤＮＡの螺旋構造が歪み、モニタリング環境による損傷を受けてＤＮＡの切断が生じやすくなるため、好ましい。また、インターカレーターとして蛍光色素を選択すれば、核酸の損傷が可視化されるため、蛍光顕微鏡や高感度ＣＣＤカメラ等での検出、測定が容易となる。蛍光色素ではないインターカレーターを用いる場合には、走査型プローブ顕微鏡で損傷を検出、測定できる。また、高線量の放射線を検出する場合や、長時間にわたって放射線を測定する場合など、目的に応じてインターカレーターは必要ない。
【００３０】
この出願の発明の環境モニタリング方法において、核酸固定化基板を環境モニタリング用プローブとして使用するためには、（１）核酸が絡まることなく固定されること、（２）核酸が操作中に物理的な切断を受けることなく、長さを保った状態にあること、および（３）顕微鏡等の手段により観察できる程度に可視化することが可能であることが必要である。したがって、ＤＮＡを核酸として用いる場合を例示すれば、基板表面に固定化されたＤＮＡは、繊維状態（直鎖状）を保持していることが好ましく、このような条件を満たすためには、ＤＮＡとして繊維状ＤＮＡを用いることが好ましい。このとき、繊維状ＤＮＡは、環状であっても直鎖状であってもよい。
【００３１】
このような種々の核酸を固定化する基板としては、その材質は固定化される核酸に影響を及ぼさず、モニタリング対象の環境を阻害したり、それにより劣化したりしないものであればよく、とくに限定されない。ガラス基板は入手が容易で安価であり、表面処理を施すことにより静電的にＤＮＡ等の核酸を固定化できるため、好ましく、シリコン基板は、フォトレジスト法等の半導体微細加工技術を応用してＤＮＡを伸長、固定化できるため、好ましい。また、シリコン基板は、体の形状に合わせた変形が可能であることから、体内の目的とする位置での測定も可能となる。さらに、基板は、種々の熱可塑性樹脂や熱硬化性樹脂からなるプラスチック基板であってもよい。これらのプラスチック基板は、表面にエポキシドを呈示させ、核酸塩基のグアニンのアミノ基と結合させることにより、核酸を固定化でき、好ましい。
【００３２】
また、このような基板については、その大きさもとくに限定されない。この出願の発明の放射線測定方法では、核酸の損傷を可視化できることから、顕微鏡や高感度カメラ（ＣＣＤカメラ）等によって観察、検出できる程度の大きさがあればよい。例えばガラス基板としては、汎用のスライドガラスが適用できる。
【００３３】
以上のとおりの基板表面に核酸を固定化する方法としては、ＤＮＡ等の核酸を基板表面に伸長、展開し、乾燥させる方法や化学的に結合させる方法等が考慮される。具体的には、基板表面を化学修飾することにより正電荷を付与させ、負電荷を有するＤＮＡとの間に静電的相互作用を生じさせてＤＮＡを固定化させる方法が好ましい。ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板のいずれの場合においても、基板表面をアミノシラン化することにより、正電荷を生じさせることができる。
【００３４】
また、基板上にＤＮＡを固定化する方法としては、オンチップＤＮＡ合成反応法も考慮される。具体的には、ＤＮＡが、任意の区画に分割されたＤＮＡについて、各区画を増幅するＤＮＡプライマーを設計し、各区画の長さに相当する間隔で基板上にプライマーを固定化した後、ＤＮＡ合成すれば、基板表面に伸長、固定化された状態でＤＮＡが合成されるのである。ＤＮＡ合成方法としては、ホットスタート法等の公知の合成手法が適用できる。もちろん、これ以外の種々の公知または新規の方法でＤＮＡ等の核酸を固定化してもよい。
【００３５】
この出願の発明の環境モニタリング方法では、得られた核酸固定化基板を化学物質、電子線、電磁波、放射線等のモニタリング対象環境に曝し、核酸に生じる損傷を可視化して直読することにより化学物質量、電子線量、電磁波量、放射線量等、さらには、それらによる該核酸への影響を定量できるのである。可視化方法としては、核酸固定化基板表面にインターカレータ−となる蛍光色素を塗布する方法が好ましく例示される。このような蛍光色素を塗布した核酸固定化基板をプローブとして用いれば、例えば、直鎖状に固定化された繊維状ＤＮＡに一定の線量の放射線を照射した際に、繊維状ＤＮＡ上に生じる二本鎖切断を可視化でき、蛍光顕微鏡を用いてただちに直読、定量できるのである。もちろん、核酸は、ＤＮＡに限定されず、ＲＮＡや他の核酸類似体であってもよく、１種に限らず、複数種を併用してもよい。
【００３６】
可視化に用いられる蛍光色素としては、種々のものが考慮される。例えば、インターカレーターとしてＤＮＡのらせん構造内に取り込まれ、励起光下でＤＮＡを可視化する試薬等が考慮される。すなわち、ＤＮＡの切断を可視化できるプローブであれば、どのようなものであってもよい。前記（１）〜（３）の条件を満たすためには、蛍光色素は、ＤＡＰＩ、propidium iodide、YoYo-1等のインターカレーターであることが好ましい。
【００３７】
この出願の発明の環境モニタリング方法では、さらに、核酸固定化基板に前記の蛍光色素溶液を塗布し、その表面に蓋を施してもよい。蓋を施すことにより、塗布された蛍光色素溶液が乾固することを少なくとも一定時間防止でき、核酸の損傷を安定に検出、定量できるようになる。
【００３８】
以上のとおりに、核酸の損傷は、前記のとおりのインターカレーターにより可視化して検出されるが、検出方法としては、蛍光顕微鏡、高感度ＣＣＤカメラ、および走査型プローブ顕微鏡（原子間力顕微鏡等）等の各種のものが例示される。好ましくは、断片化を蛍光色素であるインターカレーターにより可視化し、蛍光顕微鏡により確認し、高感度カメラにより画像化する方法で、これにより、ＤＮＡ断片化への線量や線質の影響を比較したり、経時的な断片化を測定したりできるようになる。また、走査型プローブ顕微鏡を用いる場合には、インターカレーターが蛍光色素である必要はない。さらに、このようにして得られた画像は、電子情報化し、コンピューター上に保存、あるいは解析、加工してもよい。
【００３９】
この出願の発明は、以上のとおりの方法により環境による核酸への影響を測定するための環境モニタリング用プローブをも提供する。すなわち、以上の環境モニタリングは、基板表面に核酸が固定化された核酸固定化基板を有するプローブ、あるいは、核酸固定化基板と蓋を有し、それらの間にインターカレーターが封入されたプローブを用いて行われるものなのである。
【００４０】
さらに、この出願の発明は、このような環境モニタリング用プローブの製造方法をも提供する。具体的には、基板表面に核酸を固定化して核酸固定化基板を得る、あるいはこの表面に、さらに蛍光色素の溶液を塗布し、蓋をする。このとき、核酸の固定化方法は、前記のＤＮＡプライマーの固定化方法に例示されるとおりの様々な方法が適用できる。
【００４１】
この出願の発明は、さらに、以上のとおりの放射線測定方法を用いて放射線量を測定するためのシステムをも提供する。このようなシステムとしては、図１の概略図に示されるように、少なくとも前記の環境モニタリング用プローブ（１）における核酸の損傷を検出するための顕微鏡（２）や高感度ＣＣＤカメラ（３）等の検出手段と画像解析ソフト（４）等の検出結果解析手段を有するものであればよい。核酸の損傷を検出するための検出装置（２）としては、蛍光顕微鏡が好ましく例示される。このようなシステムを用いることにより、前記のとおりの環境モニタリングが簡便に、かつスムーズに実施できるだけでなく、コンピューター（４）上に様々な化学物質や放射線質、化学物質量や放射線量による核酸の損傷に関するデータベースを構築することも可能となり、これらの各種の因子による生物への直接的影響や遺伝的影響はもとより、遺伝子治療等の研究においても重要な知見が得られ、有用であるといえる。
【００４２】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００４３】
【実施例】
以下の実施例および比較例では、ＤＮＡとして、入手が容易で観察に適した長さをもつλファージＤＮＡ（宝酒造株式会社製）を用いた。また、蛍光色素としては、蛍光顕微鏡下での断片化ＤＮＡの直接観察が可能となる蛍光強度を有するYoYo-1（フナコシ株式会社製、YoYo-1 Iodide）を用いた。
【００４４】
また、各試薬や溶媒は、記載のない限り、和光純薬工業株式会社製のものを用いた。
＜実施例１＞
スライドガラス（松浪硝子工業株式会社7.6ｃｍ×2.6ｃｍ×0.8ｍｍ）を５％水酸化カリウム溶液中で３０分間超音波洗浄した後、イオン交換水で３０分、超純水でさらに３０分間洗浄した。洗浄後のガラスを８０℃のオーブン中で乾燥し、過酸化水素液・硫酸混合液（過酸化水素液（３０％）：硫酸（３６Ｎ）＝１：２）中で２０分間処理した。超純水で洗浄した後、アミノシラン溶液（エタノール：超純水：γ−アミノプロピルエトキシシラン＝５００：５００：１）中で１時間処理し、エタノールおよび超純水で洗浄して、オーブン（１２０℃）にて３０分乾燥した。
【００４５】
得られたアミノシラン化ガラス基板をλファージＤＮＡ溶液（６ｎｇ／ｍＬ純水溶液）に浸漬し、０．１５ｍｍ／ｓｅｃの速度でアミノシラン化ガラス基板を上昇させた、デシケーター中で乾燥させた。
【００４６】
蛍光色素YoYo-1（フナコシ株式会社製、YoYo-1 Iodide）を1μｇ／ｍＬの濃度になるように退色防止剤（ベクターシールド：Vector社製）を用いて調製し、得られたＤＮＡ固定化ガラス基板に滴下した後、直ちにカバーガラス（2.4ｃｍ×2.4ｃｍ×0.12ｍｍ）を乗せ、使用時まで遮光して保存した。
【００４７】
この放射線測定用ＤＮＡ線量計に⁶⁰Ｃｏからの放射線（γ線）を照射し、ＤＮＡ切断を蛍光顕微鏡（ZEISS Axioplan2 Imaging）下で観察した。蛍光色素YoYo-1は４９１ｎｍの光で励起し、５０９ｎｍ付近に蛍光を発した。得られた画像は直ちにＣＣＤカメラ（Princeton Instruments, MODEL PTE/CCD-1401, MicroMax）で撮影し、電子情報化して保存した。
【００４８】
図２に２０Ｇｙのγ線を照射した際のλファージＤＮＡの切断を見た写真を示した。
作成されたＤＮＡ線量計の放射線（γ線）に対する感受性を確認するために、単位長さ（４８．５ｋｂ、１６．５μｍ）あたりの切断数を数え、ＤＮＡの損傷度を評価した。
【００４９】
図３に放射線照射線量とＤＮＡ切断数の関係を示した。放射線照射線量と単位長さあたりのＤＮＡの切断数には相関が認められた。
また、図４に、０〜６．０Ｇｙの範囲における放射線照射線量とＤＮＡ切断数の関係を示した。
＜比較例１＞
５０μＬλファージＤＮＡ溶液（３μｇ／ｍＬ純水溶液）に⁶⁰Ｃｏからの放射線（γ線）を照射し、得られた溶液を、アガロースゲルを用いて電気泳動した。
【００５０】
図５に結果を示した。
図５より、１００ＧｙでＤＮＡの損傷が確認され、５００ＧｙでＤＮＡが完全に消失した。したがって、電気泳動法による検出範囲は、１００Ｇｙ以上であることが示された。
【００５１】
一方、この出願の発明のＤＮＡ線量計を用いると、０．１Ｇｙの線量でも検出が可能であることから（図４）、放射線検出感度は溶液状態のものを電気泳動で調べる方法に比べて極めて高いことが確認された。
＜実施例２＞オンチップＤＮＡ合成によるＤＮＡ固定化基板の作成
シリコン基板にフォトレジスト法によりパタニングし、アビジン結合部位をアルミ蒸着により保護した。
【００５２】
２％フルオロシランをメタノールに溶解し、得られた処理基板を３０分間処理した後、超音波洗浄（３０分）し、MilliQイオン交換水でさらに洗浄した。
過酸化水素液・硫酸混合液（過酸化水素液（３０％）：硫酸（３６Ｎ）＝１：２）中で１０分間処理した後、イオン交換水で１０分間洗浄し、さらに、アミノシラン溶液（エタノール：超純水：γ−アミノプロピルエトキシシラン＝５０：５０：１）中で１時間、エタノールで１０分間処理した。その後１２０℃で３０分間熱処理し、得られた基板に、マイクロマニピュレーターを用いてビオチン化ＤＮＡプライマーを添加した。
【００５３】
ＤＮＡ合成を行ったところ、ＤＮＡが直線状に固定化されたことが確認された。
【００５４】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明により、化学物質や放射線等の環境因子の核酸への影響を精度高く直接測定できる新規なモニタリング方法が得られた。
【図面の簡単な説明】
【図１】この出願の発明の放射線測定システムを例示した概略模式図である。
【図２】この出願の発明の実施例において、γ線照射により切断されたＤＮＡを蛍光顕微鏡で観察した写真に代わる図である。
【図３】この出願の発明の実施例において、照射線量とλファージＤＮＡ単位長さあたりの切断数の関係を示した図である。
【図４】この出願の発明の実施例において、０〜６．０Ｇｙの範囲での放射線照射線量とＤＮＡ切断数の関係を示した図である。
【図５】この出願の発明の実施例において、電気泳動により、ＤＮＡ損傷を確認した際のアガロースゲルの写真に代わる図である。
【符号の説明】
１環境モニタリング用プローブ
２蛍光顕微鏡
３高感度ＣＣＤカメラ
４画像解析ソフト（コンピューター）
ａ λ／Hind III
ｂ０Ｇｙ
ｃ４Ｇｙ
ｄ２０Ｇｙ
ｅ１００Ｇｙ
ｆ５００Ｇｙ[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The invention of this application relates to an environmental monitoring method. More specifically, the invention of this application relates to a method for monitoring the environment from damage caused to the nucleic acid by exposing the nucleic acid immobilized on the substrate to the monitoring target environment.
[0002]
[Prior art and its problems]
In the environment where we live in modern society, there are various influential factors such as chemical substances, electron beams, electromagnetic waves such as radiation. In recent years, there is a growing sense of crisis for these factors that are thought to have a negative impact on the human body and the environment, and various investigations and reports have been made.
[0003]
Chemical substances are now not limited to industrial waste, industrial wastewater, and exhaust gas, but in all forms such as food additives such as preservatives, various medical and agrochemical products, cosmetics such as detergents, preservatives and paints for building materials, etc. In recent years, there are concerns about the effects of these chemicals on the human body and the environment. Conventionally, the safety of these chemical substances has been generally evaluated by tests using laboratory animals. The amount of chemical substances in the atmosphere, rivers, or various products is measured by various chemical analysis methods. Both of these tests and measurement methods require complicated operations and a long period of time, and there is a problem that measurement in real time is difficult. Furthermore, in order to accurately know the direct and genetic effects on the human body, various causative substances can be contacted or administered to patients with symptoms such as hypersensitivity to identify the causative substance, or the reactivity In addition, there is a problem that the patient is forced to suffer a great deal of pain and that it takes a long time to obtain a test result.
[0004]
On the other hand, various types of electromagnetic waves are used in various fields in our lives depending on the wavelength. Wavelength-10 ^-8 γ rays (radiation, cosmic rays), X rays, 10 m ^-8 ~ 4x10 ^-7 m UV, 4 × 10 ^-7 ~ 8x10 ^-7 m visible light, 8 × 10 ^-7 -10 ^-3 m infrared, 10 ^-3 -10 ^-1 m microwave, 10 ^-1 -10 ^Four m radio waves. Above all, with respect to radio waves used for communication, with the spread of mobile phones and mobile terminals, in recent years, there are concerns about the effect on the human body. In addition, recently, there is a concern about the influence of the microwaves used in the microwave oven on the human body. However, the actual causal relationship between these electromagnetic waves and tumors and immune diseases has not been clarified so far. Furthermore, radiation must be a major factor in social unrest due to radioactive accidents at nuclear and medical facilities.
[0005]
There are two types of radiation: natural radiation that exists in nature and artificially created artificial radiation. Natural radiation has been bathed by mankind since ancient times, and various radiations (cosmic rays) that fall from the sun and the galactic universe to the earth, and high-speed protons that occupy most of them are the nuclei of nitrogen and oxygen in the atmosphere. High-energy nuclei, neutrons, mesons, γ-rays and other cosmic rays produced by collisions with γ-rays emitted from natural radioactive isotopes such as uranium, thorium and potassium 40 contained in the earth is there.
[0006]
On the other hand, the radiation is artificially used in various fields including a trace amount. For example, a dial of a night clock, a starter of a fluorescent lamp, a display tube for a strobe charge display of a camera, a smoke detector, etc. all use radioactive isotopes that emit a very small amount of γ rays or α rays. In addition, cathode ray tubes such as televisions and personal computer monitors use electron beams. Furthermore, X-rays, which are performed for almost all diseases and are also performed in mass screening, use a relatively large amount of artificial radiation. Therefore, we are more exposed to radiation in our daily lives than is generally recognized.
[0007]
According to a 1992 survey, the average proportion of radiation sources exposed to Japanese people is 39% natural radiation, 59% is medical radiation such as X-rays, CT scans, and radiotherapy, and the remaining 2% This includes occupational exposure, radiation from nuclear facilities, exposure through the use of aircraft, and general consumer consumption.
[0008]
In recent years, there is concern about the depletion of petroleum resources, and nuclear power is being considered as a new energy source. In addition, the effectiveness of radiation is attracting more and more attention in the medical field including cancer treatment. However, radiation accidents at nuclear facilities and large-scale patient exposures have increased anxiety and a sense of crisis among workers and residents near the facilities. The survey of radiation dose is a socially important issue.
[0009]
Radiation affects the human body by breathing in radioisotopes in the atmosphere, taking γ rays from cosmic rays, the earth, and fallout from the body, and taking them into the body through food and drink. The effects on the human body can be broadly divided into physical and physiological effects appearing on the person and genetic influences affecting their offspring, and there are acute and late effects on physical and physiological effects. As mentioned above, radiation exposure in our daily lives is mostly from medical diagnosis and from the natural world, and usually does not affect the human body, but radiation has neither color nor smell, Accurate measurement of radiation dose inside and outside the facility is important for safety management of radiation equipment, radiation protection for workers and residents in the vicinity, and removal of social anxiety.
[0010]
In conventional radiation dose measurement, methods utilizing the fluorescence, photographs, and ionization effects have been used. Specific examples include scintillation counters (fluorescence action) for measuring and recording fluorescence generated in phosphors, film badges and autoradiographs (photographic action), and GM counters (ionization action) for measuring ionization of gases. It is mentioned as a radiation dose measuring method.
[0011]
However, all of the conventional detectors are used depending on the radiation quality and dose of radiation, and when evaluating the effects on the human body, it is corrected by radiation load count and tissue load count, and effective. It was necessary to calculate the dose. In addition, since existing methods do not directly measure the effects on the genes, but only indirectly, it is possible to measure more practical radiation doses related to genetic effects and late effects. There was a problem that I could not.
[0012]
A method that can directly, easily, and accurately measure the effects of radiation on the human body and DNA and other nucleic acids in the safety management of nuclear facilities and radiation therapy equipment and the health of workers and nearby residents. Development is considered important.
[0013]
Therefore, the invention of this application was made in view of the circumstances as described above, and measures the influence on the nucleic acid by the environment of chemical substances, electromagnetic waves, radiation, etc. as a solution to the problems of the prior art. It is an object to provide an environmental monitoring method that can be performed and has high detection sensitivity.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, the invention of this application firstly monitors a nucleic acid-immobilized substrate in which at least one nucleic acid selected from the group consisting of nucleic acids and nucleic acid analogs is immobilized on the substrate. Provided is an environmental monitoring method characterized by detecting and measuring damage caused to nucleic acids on a substrate by exposure to a target environment.
[0015]
The second aspect of the invention of this application is an environmental monitoring method in which the nucleic acid-immobilized substrate is immobilized by electrostatic interaction between the nucleic acid and the substrate surface, and thirdly, the substrate is a glass substrate. Fourthly, the environmental monitoring method is provided, wherein the substrate is a silicon substrate, and fifth, the environmental monitoring method is provided, wherein the substrate is a plastic substrate.
[0016]
According to the invention of this application, in any one of the environmental monitoring methods described above, sixthly, the substrate is subjected to surface treatment to impart a positive charge, and seventhly, the substrate is surface-treated with an aminosilane solution. It is provided as an aspect to be processed.
[0017]
The invention of this application also provides, in the eighth aspect, the environmental monitoring method in which the monitoring target environment is radiation, and in the ninth aspect, the environmental monitoring method in which the monitoring target environment is a chemical substance.
[0018]
Tenth, the invention of this application is directed to an environmental monitoring method in which damage caused to nucleic acid is exposed to a monitoring target environment after contacting the nucleic acid with an intercalator, and detected and measured. Eleventh, the intercalator is fluorescent. Provided is the above environmental monitoring method which is a pigment.
[0019]
The invention of this application is further characterized in that, in a twelfth aspect, the damage caused to the nucleic acid is detected and measured by at least one detection means selected from a fluorescence microscope, a high-sensitivity CCD camera, and a scanning probe microscope. Provides, as an aspect of the environmental monitoring method, that the nucleic acid is DNA, and 14th, that the DNA is selected from fibrous circular DNA or fibrous linear DNA.
[0020]
The fifteenth aspect of the invention of this application is a probe for use in any one of the above-described environmental monitoring methods, the probe for environmental monitoring having a nucleic acid-immobilized substrate on which at least the nucleic acid is immobilized on the substrate surface. In the sixteenth aspect, the probe is used in any one of the environmental monitoring methods described above, and has at least a nucleic acid-immobilized substrate on which the nucleic acid is immobilized and a lid, and an intercalator is enclosed between them. Provided environmental monitoring probes.
[0021]
According to a seventeenth aspect of the present invention, there is provided a method for producing an environmental monitoring probe as described above, wherein the nucleic acid is immobilized on the substrate surface.
[0022]
The invention of this application is, in the eighteenth aspect, the method for producing an environmental monitoring probe described above, wherein an intercalator is applied to the surface of a nucleic acid-immobilized substrate obtained by immobilizing nucleic acid on the substrate surface, A method for producing an environmental monitoring probe, characterized by covering and enclosing with a lid.
[0023]
Nineteenth, according to the invention of this application, the nucleic acid is applied with a positive charge to the substrate, and then a nucleic acid-containing solution is applied and dried to be immobilized on the substrate surface by electrostatic interaction. A method for producing an environmental monitoring probe is provided, and twentieth, a method for producing an environmental monitoring probe as described above, wherein the nucleic acid is DNA.
[0024]
According to the invention of this application, in the 21st, a primer for amplifying each section of DNA divided into an arbitrary section is designed, and the primer is immobilized on the substrate at an interval corresponding to the length of each section. Then, a method for producing an environmental monitoring probe is provided in which the DNA is synthesized using the DNA as a template, and is extended and immobilized on the substrate surface.
[0025]
In a twenty-second aspect, the invention of this application is a system for measuring radiation using any one of the environmental monitoring methods described above, and includes at least the environmental monitoring measurement probe and the nucleic acid in the probe. There is also provided an environmental monitoring system having a damage detection means for detecting damage and a detection result analysis means.
[0026]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the radiation measurement method of the invention of this application, attention is paid to nucleic acids such as DNA, and the relationship between the environment and the nucleic acid damage level is clarified by detecting the degree of damage caused by chemical substances and radiation to the nucleic acid, and chemical species and It is possible to evaluate the degree of damage to living organisms without considering quality differences.
[0027]
Conventionally, in film batches and glass dosimeters that have been used as radiation measurement methods, it was possible to indirectly predict the effects on living organisms, but in the environmental monitoring method of the invention of this application, the effects on nucleic acids Can be measured directly, so that extremely accurate measurement is possible. Further, the environmental monitoring method of the invention of this application does not require complicated biochemical operation in detection of nucleic acid damage, directly using a nucleic acid immobilized on a fine substrate, or using a fluorescent dye, Visualization makes it possible to easily detect and quantify damage.
[0028]
For example, in the case of DNA, which is the main body of a gene among nucleic acids, DNA cleavage generally occurs even when the radiation dose is several Gy or less. However, the DNA is cleaved by a biochemical technique such as change in absorbance in solution or electrophoresis. In order to detect this, radiation irradiation of 100 Gy or more is required. By using the environmental monitoring method of the invention of this application in which nucleic acid damage is directly read under a microscope or the like, the radiation detection sensitivity can be dramatically improved. Similarly, for chemical substances, nucleic acids such as DNA immobilized on the substrate can be directly exposed to the chemical substance, and the damage can be read directly, so that highly sensitive detection is possible.
[0029]
The radiation measurement method of the invention of this application immobilizes on a substrate nucleic acid or a nucleic acid analog such as DNA obtained from the cell nucleus or chromosome of a target organism for which the influence of radiation is to be measured, DNA obtained by cloning or synthesis, or RNA, and the like. The nucleic acid-immobilized substrate is exposed to an environment to be monitored, and then nucleic acid damage on the nucleic acid-immobilized substrate is detected and measured. Specifically, for example, when DNA or RNA is used as a nucleic acid, a DNA (or RNA) fragment is obtained by irradiating the DNA (or RNA) immobilization substrate with radiation or applying a solution containing a chemical substance. Can be detected and measured with a fluorescence microscope, a high-sensitivity CCD camera, a scanning probe microscope, or the like. At this time, it is preferable to bring the intercalator into contact with the DNA-immobilized substrate, because the DNA helical structure is distorted and the DNA is easily cut by being damaged by the monitoring environment. Further, if a fluorescent dye is selected as the intercalator, damage to the nucleic acid is visualized, so that detection and measurement with a fluorescent microscope, a high-sensitivity CCD camera, or the like becomes easy. When an intercalator that is not a fluorescent dye is used, damage can be detected and measured with a scanning probe microscope. Also, an intercalator is not necessary depending on the purpose, such as when detecting a high dose of radiation or when measuring radiation over a long period of time.
[0030]
In the environmental monitoring method of the invention of this application, in order to use the nucleic acid-immobilized substrate as an environmental monitoring probe, (1) the nucleic acid is immobilized without being entangled, and (2) the nucleic acid is physically manipulated during the operation. It is necessary to maintain the length without being cut, and (3) to be visible to the extent that it can be observed by means such as a microscope. Therefore, for example, when DNA is used as a nucleic acid, it is preferable that the DNA immobilized on the substrate surface maintain a fiber state (straight chain). It is preferable to use a fibrous DNA. At this time, the fibrous DNA may be circular or linear.
[0031]
As a substrate for immobilizing such various nucleic acids, any material may be used as long as the material does not affect the nucleic acid to be immobilized and does not inhibit or deteriorate the monitoring target environment. It is not limited. Glass substrates are easy to obtain and inexpensive, and can be electrostatically immobilized nucleic acids such as DNA by surface treatment. Silicon substrates are preferably applied by applying semiconductor microfabrication technology such as photoresist method. This is preferable because DNA can be extended and immobilized. In addition, since the silicon substrate can be deformed according to the shape of the body, measurement at a target position in the body is also possible. Further, the substrate may be a plastic substrate made of various thermoplastic resins or thermosetting resins. These plastic substrates are preferable because they can immobilize nucleic acids by presenting an epoxide on the surface and bonding them to the amino group of the nucleobase guanine.
[0032]
Further, the size of such a substrate is not particularly limited. In the radiation measurement method of the invention of this application, since damage to nucleic acids can be visualized, it is sufficient that the size is such that it can be observed and detected with a microscope, a high-sensitivity camera (CCD camera), or the like. For example, a general-purpose slide glass can be applied as the glass substrate.
[0033]
As a method for immobilizing a nucleic acid on the substrate surface as described above, a method in which a nucleic acid such as DNA is stretched and developed on the substrate surface, dried, or chemically bonded is considered. Specifically, a method of immobilizing DNA by imparting a positive charge by chemically modifying the substrate surface and generating an electrostatic interaction with negatively charged DNA is preferable. In any case of a glass substrate, a silicon substrate, and a plastic substrate, a positive charge can be generated by aminosilanizing the substrate surface.
[0034]
An on-chip DNA synthesis reaction method is also considered as a method for immobilizing DNA on a substrate. Specifically, for DNA in which DNA is divided into arbitrary compartments, a DNA primer for amplifying each compartment is designed, and the primer is immobilized on the substrate at intervals corresponding to the length of each compartment, and then DNA When synthesized, DNA is synthesized in a state of being stretched and immobilized on the substrate surface. As the DNA synthesis method, a known synthesis method such as a hot start method can be applied. Of course, nucleic acids such as DNA may be immobilized by various other known or novel methods.
[0035]
In the environmental monitoring method of the invention of this application, the obtained nucleic acid-immobilized substrate is exposed to a monitoring target environment such as a chemical substance, electron beam, electromagnetic wave, radiation, etc., and damage caused to the nucleic acid is visualized and directly read. It is possible to quantify the electron dose, electromagnetic wave amount, radiation dose, and the like, and their influence on the nucleic acid. As a visualization method, a method of applying a fluorescent dye serving as an intercalator on the surface of a nucleic acid-immobilized substrate is preferably exemplified. If a nucleic acid-immobilized substrate coated with such a fluorescent dye is used as a probe, for example, when a certain amount of radiation is irradiated to linear DNA-immobilized fibrous DNA, it is generated on the fibrous DNA. The strand breaks can be visualized and immediately read and quantified using a fluorescence microscope. Of course, the nucleic acid is not limited to DNA, but may be RNA or other nucleic acid analogs, and is not limited to one type, and a plurality of types may be used in combination.
[0036]
Various fluorescent dyes used for visualization are considered. For example, a reagent that is incorporated into the helical structure of DNA as an intercalator and visualizes DNA under excitation light is considered. That is, any probe that can visualize DNA cleavage can be used. In order to satisfy the conditions (1) to (3), the fluorescent dye is preferably an intercalator such as DAPI, propidium iodide, YoYo-1.
[0037]
In the environmental monitoring method of the invention of this application, the fluorescent dye solution may be further applied to the nucleic acid-immobilized substrate, and the surface may be covered. By applying the lid, it is possible to prevent the applied fluorescent dye solution from drying out for at least a certain period of time, and to detect and quantify nucleic acid damage stably.
[0038]
As described above, nucleic acid damage is visualized and detected by the intercalator as described above. As a detection method, a fluorescence microscope, a high-sensitivity CCD camera, and a scanning probe microscope (atomic force microscope, etc.) are used. Etc. are exemplified. Preferably, the fragmentation is visualized with an intercalator, which is a fluorescent dye, confirmed with a fluorescence microscope, and imaged with a high-sensitivity camera, thereby comparing the effects of dose and radiation quality on DNA fragmentation. It will be possible to measure fragmentation over time. Further, when a scanning probe microscope is used, the intercalator does not need to be a fluorescent dye. Further, the image thus obtained may be converted into electronic information and stored on a computer, or analyzed and processed.
[0039]
The invention of this application also provides an environmental monitoring probe for measuring the influence of the environment on nucleic acid by the method as described above. That is, the environmental monitoring described above uses a probe having a nucleic acid-immobilized substrate on which nucleic acid is immobilized on the substrate surface, or a probe having a nucleic acid-immobilized substrate and a lid, and an intercalator enclosed between them. It is done.
[0040]
Furthermore, the invention of this application also provides a method for manufacturing such an environmental monitoring probe. Specifically, nucleic acid is immobilized on the surface of the substrate to obtain a nucleic acid-immobilized substrate, or a fluorescent dye solution is further applied to the surface and a lid is applied. At this time, as the nucleic acid immobilization method, various methods as exemplified in the above-described DNA primer immobilization method can be applied.
[0041]
The invention of this application further provides a system for measuring the radiation dose using the radiation measurement method as described above. As such a system, as shown in the schematic diagram of FIG. 1, at least a microscope (2) for detecting nucleic acid damage in the environmental monitoring probe (1), a high-sensitivity CCD camera (3), etc. And a detection result analysis means such as image analysis software (4). As a detection apparatus (2) for detecting damage of nucleic acid, a fluorescence microscope is preferably exemplified. By using such a system, environmental monitoring as described above can be carried out easily and smoothly, as well as various chemical substances, radiation qualities, nucleic acid quantities by chemical quantity and radiation dose on the computer (4). It is also possible to construct a database on damage, and it is useful because not only the direct and genetic effects of these various factors on organisms but also important findings in research such as gene therapy.
[0042]
Hereinafter, embodiments will be described with reference to the accompanying drawings, and embodiments of the present invention will be described in more detail. Of course, the present invention is not limited to the following examples, and it goes without saying that various aspects are possible in detail.
[0043]
【Example】
In the following examples and comparative examples, λ phage DNA (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) having a length that is easily available and suitable for observation was used as the DNA. As the fluorescent dye, YoYo-1 (YoYo-1 Iodide, manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) having a fluorescence intensity that enables direct observation of fragmented DNA under a fluorescence microscope was used.
[0044]
Each reagent and solvent used were those manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. unless otherwise specified.
<Example 1>
A glass slide (Matsunami Glass Industrial Co., Ltd. 7.6 cm × 2.6 cm × 0.8 mm) was ultrasonically washed in a 5% potassium hydroxide solution for 30 minutes, then washed with ion-exchanged water for 30 minutes, and further washed with ultrapure water for 30 minutes. . The glass after washing was dried in an oven at 80 ° C. and treated in a hydrogen peroxide solution / sulfuric acid mixed solution (hydrogen peroxide solution (30%): sulfuric acid (36N) = 1: 2) for 20 minutes. After washing with ultrapure water, it was treated in an aminosilane solution (ethanol: ultrapure water: γ-aminopropylethoxysilane = 500: 500: 1) for 1 hour, washed with ethanol and ultrapure water, and oven (120 At 30 ° C.) for 30 minutes.
[0045]
The obtained aminosilanized glass substrate was immersed in a λ phage DNA solution (6 ng / mL pure aqueous solution) and dried in a desiccator where the aminosilanized glass substrate was raised at a rate of 0.15 mm / sec.
[0046]
Fluorescent dye YoYo-1 (manufactured by Funakoshi Co., Ltd., YoYo-1 Iodide) was prepared using a discoloration inhibitor (Vector Shield: manufactured by Vector) to a concentration of 1 μg / mL, and the resulting DNA-immobilized glass Immediately after dropping onto the substrate, a cover glass (2.4 cm × 2.4 cm × 0.12 mm) was placed and stored in a shaded state until use.
[0047]
In this DNA dosimeter for radiation measurement ⁶⁰ Radiation (γ rays) from Co was irradiated, and DNA cleavage was observed under a fluorescence microscope (ZEISS Axioplan2 Imaging). The fluorescent dye YoYo-1 was excited by light of 491 nm and emitted fluorescence near 509 nm. The obtained image was immediately taken with a CCD camera (Princeton Instruments, MODEL PTE / CCD-1401, MicroMax), converted into electronic information, and stored.
[0048]
FIG. 2 shows a photograph showing the cleavage of λ phage DNA when irradiated with 20 Gy of γ rays.
In order to confirm the sensitivity of the prepared DNA dosimeter to radiation (γ rays), the number of cuts per unit length (48.5 kb, 16.5 μm) was counted to evaluate the degree of DNA damage.
[0049]
FIG. 3 shows the relationship between the radiation dose and the number of DNA cuts. There was a correlation between the radiation dose and the number of DNA breaks per unit length.
FIG. 4 shows the relationship between the radiation irradiation dose and the number of DNA breaks in the range of 0 to 6.0 Gy.
<Comparative Example 1>
50 μLλ phage DNA solution (3 μg / mL pure aqueous solution) ⁶⁰ Radiation (γ rays) from Co was irradiated, and the resulting solution was electrophoresed using an agarose gel.
[0050]
The results are shown in FIG.
From FIG. 5, DNA damage was confirmed at 100 Gy, and DNA was completely lost at 500 Gy. Therefore, the detection range by electrophoresis was shown to be 100 Gy or more.
[0051]
On the other hand, if the DNA dosimeter of the invention of this application is used, it is possible to detect even with a dose of 0.1 Gy (FIG. 4). Therefore, the radiation detection sensitivity is much higher than the method of examining the solution state by electrophoresis. It was confirmed to be high.
<Example 2> Preparation of DNA-immobilized substrate by on-chip DNA synthesis
A silicon substrate was patterned by a photoresist method, and avidin binding sites were protected by aluminum deposition.
[0052]
2% fluorosilane was dissolved in methanol, and the resulting treated substrate was treated for 30 minutes, followed by ultrasonic cleaning (30 minutes) and further washing with MilliQ ion-exchanged water.
After being treated in a hydrogen peroxide solution / sulfuric acid mixed solution (hydrogen peroxide solution (30%): sulfuric acid (36N) = 1: 2) for 10 minutes, washed with ion-exchanged water for 10 minutes, and further an aminosilane solution (ethanol : Ultrapure water: γ-aminopropylethoxysilane = 50: 50: 1) for 1 hour and with ethanol for 10 minutes. Thereafter, heat treatment was performed at 120 ° C. for 30 minutes, and a biotinylated DNA primer was added to the obtained substrate using a micromanipulator.
[0053]
When DNA synthesis was performed, it was confirmed that the DNA was immobilized linearly.
[0054]
【The invention's effect】
As described above in detail, according to the present invention, a novel monitoring method capable of directly and accurately measuring the influence of environmental factors such as chemical substances and radiation on nucleic acids has been obtained.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a radiation measurement system of the invention of this application.
FIG. 2 is a view replacing a photograph obtained by observing DNA cut by γ-ray irradiation with a fluorescence microscope in the examples of the invention of this application.
FIG. 3 is a graph showing the relationship between the irradiation dose and the number of cleavages per λ phage DNA unit length in the examples of the invention of this application.
FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the radiation dose and the number of DNA breaks in the range of 0 to 6.0 Gy in the examples of the invention of this application.
FIG. 5 is a diagram instead of a photograph of an agarose gel when DNA damage is confirmed by electrophoresis in the example of the invention of this application.
[Explanation of symbols]
1 Environmental monitoring probe
2 Fluorescence microscope
3 High sensitivity CCD camera
4 Image analysis software (computer)
a λ / Hind III
b 0Gy
c 4Gy
d 20Gy
e 100Gy
f 500Gy

Claims

An environmental monitoring method for detecting damage caused to DNA on a substrate by exposing a DNA-immobilized substrate prepared by immobilizing a fibrous linear DNA prepared from a chromosome to the substrate, and comprising an intercalator fluorescent dye on the DNA A method comprising: exposing a DNA-immobilized substrate to gamma rays after contacting YoYo-1 to detect damage caused to DNA.

2. The environmental monitoring method according to claim 1, wherein the DNA-immobilized substrate is immobilized by electrostatic interaction between DNA and the substrate surface.

The environmental monitoring method according to claim 1, wherein the substrate is a glass substrate.

The environmental monitoring method according to claim 1, wherein the substrate is a silicon substrate.

The environmental monitoring method according to claim 1, wherein the substrate is a plastic substrate.

The environmental monitoring method according to claim 1, wherein the substrate is given a positive charge by surface treatment.

The environmental monitoring method according to claim 6, wherein the substrate is surface-treated with an aminosilane solution.

The environmental monitoring method according to claim 1, wherein damage occurring in DNA is detected by at least one detection means selected from a fluorescence microscope, a high-sensitivity CCD camera, and a scanning probe microscope.

A probe for use in the environmental monitoring method according to any one of claims 1 to 8, comprising at least a DNA-immobilized substrate on which DNA is immobilized on a substrate surface and a lid, and an intercalator fluorescent dye YoYo- between them. An environmental monitoring probe characterized in that 1 is enclosed.

The method for producing an environmental monitoring probe according to claim 9, wherein a solution of the intercalator fluorescent dye YoYo-1 is applied to the surface of a DNA-immobilized substrate obtained by immobilizing DNA on the substrate surface, and then covered with a lid. A method for producing an environmental monitoring probe, comprising: sealing.

11. The method for producing an environmental monitoring probe according to claim 10 , wherein the DNA is imparted with a positive charge on the substrate, and then a DNA-containing solution is applied, dried, and immobilized on the substrate surface by electrostatic interaction.

A system for measuring γ-rays using the environmental monitoring method according to any one of claims 1 to 8, wherein at least the environmental monitoring probe according to claim 9 and DNA damage in the probe are detected. An environmental monitoring system comprising damage detection means and detection result analysis means.