JP4271925B2

JP4271925B2 - Diabetes model animal and method for producing the same

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Publication number: JP4271925B2
Application number: JP2002308600A
Authority: JP
Inventors: 三喜男菅野; 寿美恵後藤; 淳二角地; 英之大和
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 2002-10-23
Filing date: 2002-10-23
Publication date: 2009-06-03
Anticipated expiration: 2022-10-23
Also published as: JP2004141043A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病モデル動物及びその作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は、慢性の高血糖とそれに伴う慢性の全身性代謝障害、例えば、細小血管障害（例えば、網膜症、腎症、又は神経障害等）を主な特徴とする疾患であり、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）とインスリン非依存性糖尿病（２型糖尿病）とに分類される。いずれもその発症には、遺伝素因と環境因子とが関連している。
【０００３】
インスリン依存型は、若年型ともいわれ、小児期に急激に発症し、初期発症状態としては、多飲、多尿、及び／又は夜尿で、多食にもかかわらず、体重減少が著しいという特徴がある。
また、インスリン非依存型は、成人型ともいわれる。成人型は、検尿又は糖負荷試験によって肥満者に発見されることが多い。もっとも、近年においては、肥満者のみならず、比較的やせ型の者であっても、インスリン非依存型の糖尿病が発見される場合も多い。
現在、我が国の糖尿病患者数は、約５００万人で、そのうち９５％がインスリン非依存型糖尿病である。
【０００４】
糖尿病等の疾患に対する薬理作用の確認を目的とする薬効スクリーニング試験は、健常動物ではなく、一定の病態状態にある疾患モデル動物を用いて行なわれている。糖尿病モデル動物の作製方法としては、マウス、ラット、ハムスター、又はモルモット等の動物をモデル動物として、前記動物の膵臓を摘出し、インスリン欠乏症を引き起こす方法や、あるいは、前記動物に、薬物〔例えば、アロキサン又はストレプトゾトシン（ＳＴＺ）等〕、インスリン分泌を抑制する薬、又はインスリン抗体等を投与し、前記動物の膵臓のランゲルハンス島β細胞を特異的に破壊し、インスリン欠乏症を引き起こして、糖尿病を惹起する方法などが公知である。
【０００５】
例えば、特許第２９４８６６９号公報（特許文献１）には、ストレプトゾトシン及びメチルグアニジンを連続投与して作製される腎不全病態モデル動物及びその作製方法が開示されている。また、特開２０００−２７０７１３号公報（特許文献２）には、成熟した動物に、インスリン欠乏症を引き起こす物質（例えば、ストレプトゾトシン）を投与して作製される、進行性のインスリン非依存型糖尿病態モデル動物及びその作製方法が開示されている。
【０００６】
しかし、特許第２９４８６６９号公報に記載のモデル動物では、尿毒症性毒素であるメチルグアニジンを連続投与することにより、腎機能の低下（微量アルブミン尿の増加）を惹起させており、糖尿病に特徴的な代謝異常からの腎機能障害とは一致しない欠点がある。
また、特開２０００−２７０７１３号公報に記載のモデル動物にはマウスが使用され、経時的に糖尿病及び糖尿病性腎症の病態を検討するには、採血量が限定されるなどの欠点がある。
【０００７】
【特許文献１】
特許第２９４８６６９号公報
【特許文献２】
特開２０００−２７０７１３号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、従来技術の前記の欠点を解消し、ヒト糖尿病の内、２型糖尿病の病態モデルとして、より適切であって、しかも、代謝異常から糸球体硬化が出現し、腎不全への進行が経時的に観察可能なモデル動物及びその作製方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、インスリン欠乏症を引き起こす化合物を投与した後、全腎臓の１／２〜３／４を摘出することにより作製される、糖尿病モデル動物によって解決することができる。
また、本発明は、前記糖尿病モデル動物に、高脂肪食を摂取させることにより作製される、糖尿病から糖尿病性腎症に進行するモデル動物に関する。
また、本発明は、インスリン欠乏症を引き起こす化合物を投与した後、全腎臓の１／２〜３／４を摘出する、糖尿病モデル動物の作製方法に関する。
また、本発明は、前記糖尿病モデル動物に、高脂肪食を摂取させる、糖尿病から糖尿病性腎症に進行するモデル動物の作製方法に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の糖尿病モデル動物には、
（１）境界型糖尿病モデル動物、
（２）高血糖型糖尿病モデル動物、及び
（３）糖尿病から糖尿病性腎症に進行するモデル動物（以下、単に、糖尿病性腎症モデル動物と称することがある）
が含まれる。
【００１１】
本明細書において、「境界型糖尿病」とは、正常な状態と糖尿病との境界に位置し、耐糖能試験から基礎インスリン分泌は或る程度保たれつつも、食後のインスリン分泌が少ないか、あるいは、分泌が遅延し、脂肪摂取量が多くなると糖尿病に移行する病態を意味する。
境界型糖尿病の症状としては、例えば、随時血糖値が正常値より若干高値であるが、尿中には糖が出現しない状態を挙げることができる。例えば、ラットの場合には、随時血糖値が正常値（１６３±２２ｍｇ／ｄＬ）より若干高値（１８８±１０ｍｇ／ｄＬ）であるが、尿中には糖が出現しない状態を挙げることができる。
【００１２】
また、本明細書において、「高血糖型糖尿病」とは、膵β細胞からのインスリン分泌が著しく低下し、基礎インスリン及び食後のインスリン不足により高血糖を呈し、尿中に糖が出現する病態を意味する。
【００１３】
また、本明細書において、「糖尿病性腎症」とは、糖代謝異常により発症・進展し、慢性の経過をとる腎臓の疾患を意味する。
糖尿病性腎症の症状としては、例えば、ＤＣＣＴ（ＤｉａｂｅｔｅｓＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＣｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎＴｒｉａｌ）、熊本スタディー、ＵＫＰＤＳ（ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｄｉａｂｅｔｅｓｓｔｕｄｙ）、又はＲＣＴ（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｔｒｉａｌ）の結果からも、糖尿病性腎症の発症・進展に高血圧及び高血糖の関与が明らかにされた。高血糖の下流に大きく分けて３つの経路が推定されている：
（１）糸球体の血行動態の異常（糸球体過剰濾過又は糸球体高血圧）、
（２）糸球体細胞内の代謝異常、及び
（３）非酵素的糖化（グリケーション）による終末糖化産物の産生。
（１）〜（３）により、メサンギウム細胞の形質変換及び／又は細胞外基質産生亢進などが起こり、糸球体硬化へと進展する。
【００１４】
本発明に用いることのできるモデル動物は、ヒトの疾患に対するモデル動物として一般的に用いられている哺乳動物である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ラット、マウス、ハムスター、又はモルモット等を用いることができ、ラットを用いることが好ましい。
【００１５】
モデル動物としてラットを用いる場合には、各種試験研究用として幅広く使用されているラットである限り、特に限定されるものではなく、例えば、ジェイシーエル・スプレーグ・ドーリー（Ｊｃｌ−ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ）系ラット、ジェイシーエル・ウィスター（Ｊｃｌ−Ｗｉｓｔａｒ）系ラット、Ｃｒｊ：ＳＤ系ラット、又はＣｒｊ：ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）系ラットなどを用いることができる。性別も特に限定されるものではないが、雄が好ましい。雄では、性周期によるホルモン量の変化がないため、病態のばらつきを抑えることができるからである。
【００１６】
本発明の糖尿病モデル動物の内、本発明の境界型糖尿病モデル動物及び本発明の高血糖型糖尿病モデル動物は、例えば、
インスリン欠乏症を引き起こす化合物（例えば、ストレプトゾトシン）を、動物に投与する工程（インスリン欠乏誘発化合物投与工程）、及び
前記インスリン欠乏誘発化合物を投与した動物から、全腎臓の１／２〜３／４を摘出する工程（腎臓摘出工程）
を少なくとも含む、本発明による、境界型又は高血糖型糖尿病モデル動物の作製方法により作製することができる。
【００１７】
より詳細には、本発明の境界型糖尿病モデル動物及び本発明の高血糖型糖尿病モデル動物は、例えば、
（１）インスリン欠乏症を引き起こす化合物を、動物に投与する工程（インスリン欠乏誘発化合物投与工程）、
（２）前記インスリン欠乏誘発化合物投与から所定日数経過後に、血糖値（初回血糖値）を測定する工程（初回血糖値測定工程）、
（３）前記初回血糖値が所定範囲内である動物を選択し、前記インスリン欠乏誘発化合物投与から所定日数経過後に、全腎臓の１／２〜３／４を摘出する工程（腎臓摘出工程）、
（４）前記腎臓摘出から所定日数経過後に、再度、血糖値（第２回血糖値）を測定する工程（第２回血糖値測定工程）、及び
（５）前記第２回血糖値が所定範囲内である動物を選択する工程（最終選択工程）
を含む、本発明による境界型又は高血糖型糖尿病モデル動物の作製方法により、作製することができる。
【００１８】
インスリン欠乏誘発化合物投与工程に用いるインスリン欠乏誘発化合物としては、例えば、ストレプトゾトシンを挙げることができる。ストレプトゾトシン〔Ｎ−（Ｍｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｃａｒｂａｍｏｙｌ）−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ；Ｃ₈Ｈ₁₅Ｎ₃Ｏ₇；ＦＷ＝２６５．２〕は、インスリン欠乏症を引き起こす化合物であり、膵β細胞を選択的に破壊して糖尿病状態を惹起する実験的糖尿病発症剤として知られている。
【００１９】
インスリン欠乏誘発化合物投与工程において、インスリン欠乏誘発化合物の投与方法、例えば、投与手段又は投与量などは、インスリン欠乏症を引き起こすことができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、使用するモデル動物の種類などに応じて、適宜選択することができる。
投与手段としては、例えば、静脈（例えば、頸静脈又は尾静脈）内投与、又は腹腔内投与などを用いることができる。
また、ストレプトゾトシンを用いる場合のその投与量としては、通常、ラットでは３５〜４５ｍｇ／ｋｇの投与量で単回投与することができる。
【００２０】
初回血糖値測定工程においては、インスリン欠乏誘発化合物投与から所定日数経過後に、初回血糖値を測定する。測定の時期は、インスリン欠乏誘発化合物の作用によりインスリン欠乏症が引き起こされて血糖値が安定した状態である限り、特に限定されるものではなく、例えば、使用するモデル動物の種類、インスリン欠乏誘発化合物の投与方法、又は投与量に応じて、適宜選択することができる。
例えば、モデル動物としてラットを用いる場合には、インスリン欠乏誘発化合物(例えば、ストレプトゾトシン)投与から３〜９日経過後であることが好ましく、７〜９日経過後であることがより好ましい。３日未満では、インスリン欠乏誘発化合物の効果が充分に発揮されていないことがあり、１０日を越えると、血糖値が経時的に高値となることがある。
なお、インスリン欠乏誘発化合物投与から初回血糖値の測定までの期間は、通常食を自由摂取させることが好ましい。
【００２１】
本明細書においては、血糖値の測定方法としては、グルコースオキシダーゼ法を用いることが好ましい。具体的には、グルコースがグルコン酸に変換されるのと同じ確率で酸素が消費される。この消費された酸素を電極を用いた酵素レート法によりグルコースを測定する。測定機器としては、例えば、シンクロンシステムＣＸ３デルタ（ベックマン社製）を用いることができる。
【式１】

【００２２】
また、血糖値測定のための採血時期は、特に限定されるものではないが、モデル動物として一般的に用いられる哺乳動物は夜行性であり、夜間摂餌することから、例えば、午前９時〜午前１１時（空腹時）の一定時間に採血することが好ましい。
【００２３】
腎臓摘出工程では、初回血糖値が所定範囲内である動物を選択し、前記インスリン欠乏誘発化合物投与から所定日数経過後に、腎臓の一方を摘出する。
本工程で腎臓を摘出する動物の初回血糖値の範囲は、例えば、モデル動物の種類に応じて異なるが、糖尿病状態であることが必要である。
例えば、モデル動物としてラットを用いる場合には、初回血糖値が、好ましくは１９３〜６３４ｍｇ／ｄＬ、より好ましくは２１５〜６３４ｍｇ／ｄＬであるラットを選択し、腎臓摘出を行なうことができる。
【００２４】
初回血糖値を指標として選択した動物について、腎臓を摘出する時期は、血糖値が糖尿病状態で安定した時期である限り、特に限定されるものではなく、例えば、使用するモデル動物の種類に応じて、適宜選択することができる。
例えば、モデル動物としてラットを用いる場合には、インスリン欠乏誘発化合物投与から１０〜１６日経過後であることが好ましく、１４〜１６日経過後であることがより好ましい。１０日未満では、手術の急襲で摂餌量が減少することにより血糖値が見掛け上、低下することがある。２０日を越えると、糖尿病が重症化する（インスリン分泌不足が進行する）ことがある。
なお、初回血糖値の測定から腎臓摘出までの期間は、通常食を自由摂取させることが好ましい。
【００２５】
腎臓摘出工程で摘出する腎臓は、全腎臓（すなわち、２個の腎臓）の１／２〜３／４である。例えば、全腎臓の１／２を摘出するとは、例えば、２個の腎臓の一方を全摘出すること、２個の腎臓を各々１／２ずつ部分的に摘出すること、あるいは、２個の腎臓を各々、適当な割合で部分的に摘出し、その割合の合計が１／２となることなどを挙げることができる。一方の腎臓を全摘出するか、あるいは、一方の腎臓を全摘出すると共に、残る腎臓の一部（１個の腎臓の１／２以下）を摘出することが好ましい。一方の腎臓を全摘出する場合には、２個ある腎臓のどちらであることもできるが、右腎を摘出することが好ましい。左腎は、解剖学上、右腎より下部に位置し、病理組織学的検査での生検用として腎臓の一部の採取が容易であるからである。
【００２６】
摘出方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ネンブタール麻酔下でラットの右腹部を横切開し、腎内部（動脈、静脈、及び尿管）を鉗子で止め、絹製縫合糸（例えば、ネスコスーチャー製１−０）で鉗子の内側を結紮し、鉗子の外側で右腎臓を全摘出することができる。また、腎臓の一部摘出又は他方の腎臓の摘出は、例えば、縫合糸（５−０）で血流を遮断し、ステンレス製のカミソリ刃で切除し、血液凝固剤（例えば、トロンビン）の滴下により摘出することができる。
【００２７】
第２回血糖値測定工程では、腎臓摘出から所定日数経過後に、第２回血糖値を測定する。測定の時期は、腎臓摘出の影響から回復し、摂餌量及び血糖値が安定した状態である限り、特に限定されるものではなく、例えば、使用するモデル動物の種類に応じて、適宜選択することができる。
例えば、モデル動物としてラットを用いる場合には、腎臓摘出から７日以上経過後であることが好ましく、７〜１０日経過後であることがより好ましい。７日未満では、手術の急襲で摂餌量が減少することにより血糖値が見掛け上、低下することがある。
なお、腎臓摘出から第２回血糖値の測定までの期間は、通常食を自由摂取させることが好ましい。
【００２８】
最終選択工程では、第２回血糖値が所定範囲内である動物を選択することにより、本発明の境界型糖尿病モデル動物又は本発明の高血糖型糖尿病モデル動物を取得することができる。
本発明の境界型糖尿病モデル動物を取得する場合には、本工程で選択する動物の第２回血糖値の範囲は、例えば、モデル動物の種類に応じて異なるが、ヒトでの耐糖能異常又は軽症糖尿病に相当し、尿中への糖の出現は認められない状態であることが必要である。
例えば、モデル動物としてラットを用いる場合には、第２回血糖値が好ましくは１５０〜２１０ｍｇ／ｄＬ（より好ましくは１７０〜２００ｍｇ／ｄＬ）であるラットを選択することができる。
【００２９】
一方、本発明の高血糖型糖尿病モデル動物を取得する場合には、最終選択工程で選択する動物の第２回血糖値の範囲は、例えば、モデル動物の種類に応じて異なるが、ヒトでの１型糖尿病に相当し、尿中への糖の出現も認められる状態であることが必要である。
例えば、モデル動物としてラットを用いる場合には、第２回血糖値が好ましくは２１５〜７００ｍｇ／ｄＬ（より好ましくは２１５〜６３４ｍｇ／ｄＬ）であるラットを選択することができる。
【００３０】
最終選択工程において第２回血糖値を指標として選択することにより得られる、本発明の境界型糖尿病モデル動物は、随時血糖値が正常値より若干高値であるが、尿中には糖が出現しない。また、インスリン分泌低下と、インスリン抵抗性とが観察され、ヒト境界型糖尿病に類似する症状を示す。
また、最終選択工程において第２回血糖値を指標として選択することにより得られる、本発明の高血糖型糖尿病モデル動物は、１型糖尿病、すなわち、インスリン依存性の糖尿病の症状を示す。
【００３１】
本発明の糖尿病性腎症モデル動物は、本発明の境界型糖尿病モデル動物又は高血糖型糖尿病モデル動物に高脂肪食を摂取させることにより作製することができる。すなわち、本発明の糖尿病性腎症モデル動物は、例えば、
インスリン欠乏症を引き起こす化合物（例えば、ストレプトゾトシン）を、動物に投与する工程（インスリン欠乏誘発化合物投与工程）、
前記インスリン欠乏誘発化合物を投与した動物から、全腎臓の１／２〜３／４を摘出する工程（腎臓摘出工程）、及び
腎臓を摘出した動物に、高脂肪食を摂取させる工程（高脂肪食摂取工程）
を少なくとも含む、本発明による、糖尿病性腎症モデル動物の作製方法により作製することができ、より詳細には、
（１）インスリン欠乏症を引き起こす化合物を、動物に投与する工程（インスリン欠乏誘発化合物投与工程）、
（２）前記インスリン欠乏誘発化合物投与から所定日数経過後に、血糖値（初回血糖値）を測定する工程（初回血糖値測定工程）、
（３）前記初回血糖値が所定範囲内である動物を選択し、前記インスリン欠乏誘発化合物投与から所定日数経過後に、全腎臓の１／２〜３／４を摘出する工程（腎臓摘出工程）、
（４）前記腎臓摘出から所定日数経過後に、再度、血糖値（第２回血糖値）を測定する工程（第２回血糖値測定工程）、
（５）前記第２回血糖値が所定範囲内である動物を選択する工程（最終選択工程）、及び
（６）高脂肪食を摂取させる工程（高脂肪食摂取工程）
を含む、本発明による、糖尿病性腎症モデル動物の作製方法により、作製することができる。
【００３２】
本発明による糖尿病性腎症モデル動物の作製方法における、前記工程（１）〜工程（５）は、それぞれ、本発明による境界型又は高血糖型糖尿病モデル動物の作製方法における、前記工程（１）〜工程（５）と同じ工程である。
高脂肪食摂取工程では、最終選択工程で選択された動物（すなわち、本発明の境界型糖尿病モデル動物又は高血糖型糖尿病モデル動物）に、高脂肪食を摂取させる。
本発明の境界型糖尿病モデル動物に高脂肪食を摂取させると、境界型糖尿病から糖尿病性腎症に進行するモデル動物を取得することができる。一方、本発明の高血糖型糖尿病モデル動物に高脂肪食を摂取させると、高血糖型糖尿病から糖尿病性腎症に進行するモデル動物を取得することができる。
【００３３】
前記高脂肪食としては、例えば、用いるモデル動物に対する通常飼料に、脂肪含有量が高くなるように、脂肪を更に添加した飼料を挙げることができる。例えば、モデル動物としてラットを使用する場合には、脂肪含有量が好ましくは４〜５８％、より好ましくは８．６〜１１．３％の高脂肪食を用いることができる。高脂肪食としては、例えば、ラボＭＲ−ＤＢＴ（脂肪含量＝１１．３％，タンパク質含量＝１３．５％；日本農産工業）を用いることができる。
また、糖尿病性腎症の進行を早めるために、更にタンパク質含量を高くした飼料を用いることができる。高タンパク質食としては、例えば、ラボＨ−スタンダード（脂肪含量＝８．６％，タンパク質含量＝３０．４％；日本農産工業）を挙げることができる。
【００３４】
高脂肪食を与える期間としては、糖尿病性腎症の症状が現われるのに充分な期間である限り、特に限定されるものではなく、例えば、使用するモデル動物の種類、又は高脂肪食の種類に応じて、適宜選択することができる。
例えば、モデル動物としてラットを用いる場合には、高脂肪食の摂取を開始してから２０〜３５週間であることが好ましく、３０〜３５週間であることがより好ましい。２０週間未満では、糖尿病性腎症の症状が現われないことがある。
高脂肪食を与える方法も特に限定されるものではないが、病態を一定に保つには、一日当たり４０〜６０ｇに制限することが好ましい。
【００３５】
高脂肪食摂取の結果、本発明による糖尿病性腎症モデル動物が得られたか否かは、糖尿病性腎症に見られる各種症状を指標として判断することができる。例えば、尿中へのアルブミンを主体としたタンパクの出現が認められれば、本発明による糖尿病性腎症モデル動物が得られたと判断することができる。
【００３６】
本発明の糖尿病性腎症モデル動物は、高血糖の持続と高脂血症を呈する。また、尿中タンパク質の増加と同時に、血圧の上昇が認められ、高脂肪食負荷直後から亢進していた腎臓機能（クレアチニンクリアランス；Ｃｃｒ）も低下する。腎臓は肥大し、組織病理所見によれば、糸球体には、び慢性病変から硬化性病変が認められ、ヒトの糖尿病性腎症と類似した症状を示す。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《境界型糖尿病モデルラットの作製》
ジェイシーエル・スプレーグ・ドーリー（Ｊｃｌ−ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ）系の雄性ラット（８週齢，体重＝約３００ｇ；日本クレア）２０匹に、インスリン欠乏症を引き起こすストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を４０ｍｇ／ｋｇの量で頸静脈内に注射した。通常食（ＣＥ−２；日本クレア）を自由摂取させ、ストレプトゾトシン投与から９日経過後に、各ラットの血糖値を測定した。この時の血糖値が２１５〜６３４ｍｇ／ｄＬ以上を呈したラット（１９匹）について、血糖値測定から５日経過後（すなわち、ストレプトゾトシン投与から２週間経過後）に、右腎臓の摘出を行なった。腎臓摘出から１０日経過後に、再度、血糖値を測定し、血糖値が２０８ｍｇ／ｄＬ以下であるラット（１４匹）を、本発明の境界型糖尿病モデルラットとして選択した。
なお、ストレプトゾトシンを投与したラットに対する、右腎摘出を行なったラットの割合（すなわち、作製確立の割合）は９５％であり、右腎摘出を行なったラットに対する、血糖値が２０８ｍｇ／ｄＬ以下であるラットの割合は７４％（ストレプトゾトシンを投与したラットに対する、血糖値が２０８ｍｇ／ｄＬ以下であるラットの割合は７０％）であった。
【００３８】
得られた本発明の境界型糖尿病モデルラットでは、再度血糖値を測定した２日後から１０週経過時まで、血中インスリン値が上昇している（右腎摘出時の血中インスリン値に比べて）にもかかわらず血糖値が上昇していることと、後述のトログリタゾン投与実験とから、前記期間の間、末梢骨格筋、肝臓、及び脂肪細胞においてインスリン抵抗性の存在が判明した。
【００３９】
すなわち、得られた本発明の境界型糖尿病モデルラットについて、インスリン感受性を亢進させることが知られているチアゾリジン誘導体であるトログリタゾンを２００ｍｇ／ｋｇ／日の量で２週間にわたって混餌投与したところ、インスリン分泌を増加させないで血糖値を低下させた。結果を表１に示す（各群の個体数＝３匹）。
なお、チアゾリジン誘導体は、膵臓ランゲルハンス島β細胞からのインスリン分泌に影響を与えることなく、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αによるインスリンシグナル伝達系の阻害、あるいは、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）によるグルコース輸送担体（ＧＬＵＴ）−４のトランスロケーションへの阻害を抑える働きがある薬剤であり、インスリン抵抗性の有無を評価するのに一般的に使用される薬剤である。すなわち、ストレプトゾトシン投与により膵β細胞を破壊したラットでは、チアゾリジン誘導体により糖尿病は改善されず、チアゾリジン誘導体が作用するには、インスリン分泌が保たれている必要がある。境界型糖尿病モデルラットでは、トログリタゾンによって血糖値の上昇が抑えられたことから、インスリン抵抗性の存在が判明した。
【００４０】
これまで述べたように、得られた本発明の境界型糖尿病モデルラットは、インスリン分泌低下（正常ラットに比べて）と、インスリン抵抗性とが確認され、ヒト境界型糖尿病に類似する症状を示した。
【００４１】

【００４２】
【実施例２】
《糖尿病性腎症モデルラットの作製（１）》
実施例１と同様の操作により得られた、本発明の境界型糖尿病モデルラットを、２群（各群の個体数＝１４匹）、すなわち、脂肪含有量が４．１％である通常食（ラボＭＲストック；日本農産工業）を自由摂取させる通常食群（ＵＣ群）と、脂肪含有量が１１．３％である高脂肪食（ラボＭＲ−ＤＢＴ；日本農産工業）を自由摂取させる高脂肪食群（ＵＨＬ群）とに分け、３７週間観察した。なお、対照群として、右腎臓を摘出し、前記高脂肪食を自由摂取させる右腎臓摘出群（Ｕｎｉ群）を設けた。
【００４３】
結果を図１〜図１６に示す。
図１〜図５は、それぞれ、血清中血糖値（Ｓ−Ｇｌｕ）、インスリン、血圧（ＢＰ）、尿中タンパク排泄量（Ｕ−Ｐｒｏ）、及びクレアチニンクリアランス（Ｃｃｒ）の推移を示すグラフである。
図６〜図１１は、それぞれ、各群における血糖、ヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１Ｃ）、中性脂肪（ＴＧ）、総コレステロール（Ｔ−ｃｈｏ）、動脈硬化指数〔Ｔ−ｃｈｏ−ＨＤＬ−ｃ／ＨＤＬ−ｃ（−）〕、及び血中クレアチニン（Ｓ−Ｃｒ）を示すグラフである。
図１２は、各群における腎重量（絶対重量）を示すグラフであり、図１３は、各群における腎重量（相対重量）を示すグラフである。図１４は、各群における肝臓重量（絶対重量）を示すグラフであり、図１５は、各群における肝臓重量（相対重量）を示すグラフである。
なお、図６〜図１５は、３７週間経過後における結果である。
図１６は、３５週間経過後の各群における尿中ペントシジン排泄量を示すグラフである。図１６において、記号「＊」は、ＵＣ群に対する有意差が、ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）であることを意味し、記号「＋」は、Ｕｎｉ群に対する有意差が、ｐ＜０．１（スチューデントのｔ検定）であることを意味する。
【００４４】
この間のラットの状態を観察したところ、持続的に高脂血症を伴う高血糖の糖尿病を発症し、２０週経過時から尿中タンパク質の増加と同時に血圧も上昇し、３０週以降、腎臓の機能（クレアチニンクリアランス；Ｃｃｒ）低下が認められた。
剖検時の腎臓は肥大（高脂肪食群で約３倍増加）し、更に、腎臓の組織病理所見では、通常食群では、メサンギウムの融解像は見られるものの、メサンギウム領域へのマトリックスの増加は認められなかった。高脂肪食群では、メサンギウムの融解とメサンギウム領域の拡大が見られ、その内部は、硬化したマトリックスで置換され、硝子化や硬化が広範囲に認められた。高血糖状態で、しかも、血圧が１５０ｍｍＨｇ以上且つ尿中タンパク質量が１００ｍｇ／日以上のラットでは、糸球体に硝子化や硬化性病変が広範囲に認められた。
【００４５】
以上の結果から明らかなように、本発明の境界型糖尿病モデルラットに高脂肪食を摂取させることにより得られた本発明の糖尿病性腎症モデルラットは、早期ではインスリン分泌不全とインスリン抵抗性が存在し、経時的な高脂肪食の負荷の影響により、高血糖が持続し、脂質代謝異常から高脂血症を呈した。この症状は、ヒトの２型糖尿病の患者の病態を反映する。また、腎症への進行に関係する血圧の上昇と、高血糖により産生が増加する終末糖化産物（ＡＧＥ）の１つであるペントシジンの産生も増加が認められ、腎機能の低下と、腎臓の糸球体における硬化性病変とが認められたことから、糖尿病性腎症モデル（腎症II期、III期から腎不全期まで反映する）として有用であることが判明した。
【００４６】
【実施例３】
《糖尿病性腎症モデルラットの作製（２）》
ジェイシーエル・スプレーグ・ドーリー系の雄性ラット（８週齢，体重＝約３００ｇ；日本クレア）６７匹に、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を５０ｍｇ／ｋｇの量で頸静脈内に注射した。通常食（ＣＥ−２；日本クレア）を自由摂取させ、ストレプトゾトシン投与から５日経過後に、各ラットの血糖値を測定した。この時の血糖値が３００ｍｇ／ｄＬであったラット（６２匹；作製確立の割合＝９０％以上）について、ストレプトゾトシン投与から２週間経過後に、右腎臓の全摘出と左腎臓の１／２の摘出、すなわち、全腎臓の３／４の摘出を行なった。腎臓摘出から１週間経過後に、再度、血糖値を測定し、血糖値が２４６〜５９４ｍｇ／ｄＬであるラット（２９匹）を、本発明の高血糖型糖尿病モデルラットとして選択した。
得られた高血糖型糖尿病モデルラット（１０匹）に、高脂肪食（ラボＭＲ−ＤＢＴ；日本農産工業）を与え、糖尿病を促進させることにより、本発明の糖尿病性腎症モデルラットを得た。
なお、比較のために、全腎臓の３／４の摘出を行なわなかったこと以外は、前記操作をそのまま繰り返した（以下、ＳＴＺ群と称する）。
【００４７】
本モデル群では、１７週間の試験期間中、合併症の一つである白内障が高率に発症した。ＳＴＺ群では発症率が７８％であったのに対して、本モデルでは全例に発症した。
本モデル群及びＳＴＺ群の両方において、摂餌量が、３０ｇ／日／匹から増加し、高脂肪食の摂取開始から２週目以降、５０ｇ／日／匹以上摂取した。
血糖値は、本モデル群及びＳＴＺ群のいずれも、６００〜８００ｍｇ／ｄＬと高値で推移した。
本モデル群及びＳＴＺ群において、同程度の脂質代謝異常が認められた。具体的には、総コレステロールが平均２００〜３００ｍｇ／ｄＬで推移し、中性脂肪が平均２０００ｍｇ／ｄＬで推移した。
本モデル群では、血圧が上昇した（２００ｍｍＨｇ）。ＳＴＺ群では、血圧上昇は認められなかった。
【００４８】
腎臓機能の中で、尿中タンパク質排泄量は、ＳＴＺ群では増加が認められなかったのに対して、本モデル群では、高脂肪食の摂取開始から１０週経過時から増加した。クレアチニンクリアランス（Ｃｃｒ）は、両群とも開始時から亢進した状態であり、クレアチニン（Ｃｒ）及び血液尿素窒素（ＢＵＮ）上昇も認められなかった。
腎臓の重量は、ＳＴＺ群では正常ラットより肥大（左腎比で約２倍）したが、本モデル群では約３．６倍に達した。測定結果を表２に示す。
【００４９】

【００５０】
腎臓の組織病理所見では、ＳＴＺ群では、メサンギウムの拡大とメサンギウム領域への細胞外基質の増加とが認められるものの、糸球体硬化は認められなかった。一方、本モデル群では、ヒト糖尿病性腎症に特徴的なメサンギウム融解像が見られ、ＳＴＺ群の像で認められた所見の他、糸球体硬化も広範囲に認められた。
本モデルラットは、インスリン依存性、すなわち、１型糖尿病から腎症に陥る動物モデルとして有用であることが判明した。
【００５１】
【発明の効果】
本発明のモデル動物によれば、糖尿病又は糖尿病性腎症に対する、例えば、薬効スクリーニング試験を行なうことができる。また、本発明によるモデル動物の作製方法によれば、短期間で容易に糖尿病性腎症に進行するモデル動物を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、血清中血糖値（Ｓ−Ｇｌｕ）の推移を示すグラフである。
【図２】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、インスリンの推移を示すグラフである。
【図３】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、血圧（ＢＰ）の推移を示すグラフである。
【図４】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、尿中タンパク排泄量（Ｕ−Ｐｒｏ）の推移を示すグラフである。
【図５】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、クレアチニンクリアランス（Ｃｃｒ）の推移を示すグラフである。
【図６】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、血糖を示すグラフである。
【図７】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、ヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１Ｃ）を示すグラフである。
【図８】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、中性脂肪（ＴＧ）を示すグラフである。
【図９】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、総コレステロール（Ｔ−ｃｈｏ）を示すグラフである。
【図１０】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、動脈硬化指数〔Ｔ−ｃｈｏ−ＨＤＬ−ｃ／ＨＤＬ−ｃ（−）〕を示すグラフである。
【図１１】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、血中クレアチニン（Ｓ−Ｃｒ）を示すグラフである。
【図１２】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、腎重量（絶対重量）を示すグラフである。
【図１３】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、腎重量（相対重量）を示すグラフである。
【図１４】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、肝臓重量（絶対重量）を示すグラフである。
【図１５】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、肝臓重量（相対重量）を示すグラフである。
【図１６】本発明の糖尿病性腎症モデルラットにおける、尿中ペントシジン排泄量を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a diabetes model animal and a production method thereof.
[0002]
[Prior art]
Diabetes mellitus is a disease mainly characterized by chronic hyperglycemia and accompanying chronic systemic metabolic disorders such as microangiopathy (for example, retinopathy, nephropathy, or neuropathy). It is classified into (type 1 diabetes) and non-insulin dependent diabetes (type 2 diabetes). In both cases, genetic predisposition and environmental factors are associated with the onset.
[0003]
Insulin-dependent type is said to be a young type, and develops rapidly in childhood. The initial onset is polyphagia, polyuria, and / or nocturnal urine. There is.
Insulin-independent type is also called adult type. Adult forms are often found in obese individuals by urinalysis or glucose tolerance tests. However, in recent years, not only obese people but also relatively thin people often find insulin-independent diabetes.
At present, there are about 5 million diabetic patients in Japan, 95% of which are non-insulin dependent diabetes mellitus.
[0004]
Drug efficacy screening tests aimed at confirming the pharmacological action against diseases such as diabetes are conducted using disease model animals in a certain pathological state, not healthy animals. As a method for preparing a diabetes model animal, an animal such as a mouse, rat, hamster, or guinea pig is used as a model animal, and the pancreas of the animal is removed to cause insulin deficiency, or a drug [for example, Alloxan or streptozotocin (STZ), etc.], drugs that suppress insulin secretion, insulin antibodies, etc. are administered to specifically destroy the pancreatic islets of Langerhans, causing insulin deficiency and causing diabetes Methods and the like are known.
[0005]
For example, Japanese Patent No. 2948669 (Patent Document 1) discloses a renal failure disease model animal produced by continuously administering streptozotocin and methylguanidine and a method for producing the animal. Further, JP 2000-270713 A (Patent Document 2) describes a progressive non-insulin dependent diabetes model prepared by administering a substance (for example, streptozotocin) that causes insulin deficiency to a mature animal. An animal and its production method are disclosed.
[0006]
However, in the model animal described in Japanese Patent No. 2948669, methylguanidine, which is a uremic toxin, is continuously administered to cause a decrease in renal function (increase in microalbuminuria), which is characteristic of diabetes. There is a drawback that is not consistent with renal dysfunction due to abnormal metabolic disorders.
In addition, mice are used for the model animals described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-270713, and in order to examine the pathological conditions of diabetes and diabetic nephropathy over time, there are disadvantages such as the amount of blood collected being limited.
[0007]
[Patent Document 1]
Japanese Patent No. 2948669
[Patent Document 2]
JP 2000-270713 A
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to solve the above-mentioned drawbacks of the prior art, more suitable as a pathological model of type 2 diabetes in human diabetes, and further, glomerulosclerosis appears due to metabolic abnormality, An object of the present invention is to provide a model animal in which progression to failure can be observed over time and a method for producing the same.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The above-mentioned problem can be solved by a diabetic model animal prepared by extracting 1/2 to 3/4 of the whole kidney after administering a compound causing insulin deficiency according to the present invention.
The present invention also relates to a model animal that progresses from diabetes to diabetic nephropathy, which is prepared by feeding the diabetes model animal a high-fat diet.
The present invention also relates to a method for producing a diabetes model animal, in which after administration of a compound causing insulin deficiency, 1/2 to 3/4 of the whole kidney is removed.
The present invention also relates to a method for producing a model animal that progresses from diabetes to diabetic nephropathy, wherein the diabetes model animal is fed with a high fat diet.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The diabetes model animal of the present invention includes
(1) Boundary type diabetes model animal,
(2) Hyperglycemic type diabetes model animal, and
(3) Model animal that progresses from diabetes to diabetic nephropathy (hereinafter sometimes simply referred to as diabetic nephropathy model animal)
Is included.
[0011]
In the present specification, “boundary diabetes” is located at the boundary between normal state and diabetes, and basal insulin secretion is maintained to a certain extent from the glucose tolerance test, but insulin secretion after meals is low, or It means a pathological condition that shifts to diabetes when secretion is delayed and fat intake is increased.
As a symptom of borderline diabetes, for example, a state in which the blood glucose level is slightly higher than the normal value at any time but no sugar appears in the urine can be mentioned. For example, in the case of rats, the blood glucose level is sometimes slightly higher (188 ± 10 mg / dL) than the normal value (163 ± 22 mg / dL), but no sugar appears in the urine.
[0012]
Further, in the present specification, “hyperglycemic diabetes” refers to a pathological condition in which insulin secretion from pancreatic β cells is significantly reduced, hyperglycemia occurs due to insufficient basal insulin and postprandial insulin, and sugar appears in urine. means.
[0013]
In the present specification, “diabetic nephropathy” means a kidney disease that develops and progresses due to abnormal sugar metabolism and has a chronic course.
Symptoms of diabetic nephropathy include, for example, DCCT (Diabetes Control and Complication Trial), Kumamoto Study, UKPDS (United Kingdom prospective study), or RCT (Randomized Condrome).・ It was revealed that hypertension and hyperglycemia were involved in the progress. Three major routes have been estimated downstream of hyperglycemia:
(1) Abnormal glomerular hemodynamics (glomerular hyperfiltration or glomerular hypertension),
(2) Abnormal metabolism in glomerular cells, and
(3) Production of terminal glycation products by non-enzymatic saccharification (glycation).
(1) to (3) cause transformation of mesangial cells and / or enhanced production of extracellular matrix, and progress to glomerulosclerosis.
[0014]
The model animal that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is a mammal generally used as a model animal for human diseases. For example, rats, mice, hamsters, guinea pigs, etc. It is preferable to use rats.
[0015]
When a rat is used as a model animal, it is not particularly limited as long as it is a rat that is widely used for various research studies. For example, a Jcl-Sprague Dawley rat, JCL-Wistar rats, Crj: SD rats, Crj: Wistar rats, or the like can be used. The sex is not particularly limited, but male is preferable. This is because, in males, there is no change in the amount of hormones due to the sexual cycle, so that variations in pathological conditions can be suppressed.
[0016]
Among the diabetes model animals of the present invention, the borderline diabetes model animals of the present invention and the hyperglycemic diabetes model animals of the present invention are, for example,
Administering to the animal a compound that causes insulin deficiency (eg, streptozotocin) (insulin deficiency inducing compound administration step); and
A step of removing 1/2 to 3/4 of the whole kidney from the animal administered with the insulin deficiency inducing compound (nephrectomy step)
Can be produced by a method for producing a borderline or hyperglycemic type diabetes model animal according to the present invention.
[0017]
More specifically, the borderline diabetes model animal of the present invention and the hyperglycemic diabetes model animal of the present invention are, for example,
(1) A step of administering a compound causing insulin deficiency to an animal (insulin deficiency inducing compound administration step),
(2) a step of measuring a blood glucose level (initial blood glucose level) after a predetermined number of days from the administration of the insulin deficiency inducing compound (initial blood glucose level measuring step),
(3) A step of selecting an animal having the initial blood glucose level within a predetermined range, and extracting 1/2 to 3/4 of the whole kidney after the elapse of a predetermined number of days from administration of the insulin deficiency inducing compound (nephrectomy step),
(4) a step of measuring blood glucose level (second blood glucose level) again after the elapse of a predetermined number of days from the nephrectomy (second blood glucose level measuring step); and
(5) A step of selecting an animal whose second blood glucose level is within a predetermined range (final selection step)
Can be produced by the method for producing a boundary type or hyperglycemic type diabetes model animal according to the present invention.
[0018]
Examples of the insulin deficiency inducing compound used in the insulin deficiency inducing compound administration step include streptozotocin. Streptozotocin [N- (Methylnitrosocarbamoyl) -D-glucosamine; C ₈ H ₁₅ N _Three O ₇ FW = 265.2] is a compound that causes insulin deficiency, and is known as an experimental diabetes onset agent that selectively destroys pancreatic β-cells to induce a diabetic state.
[0019]
In the insulin deficiency inducing compound administration step, the administration method of the insulin deficiency inducing compound, for example, administration means or dosage is not particularly limited as long as it can cause insulin deficiency. Depending on the type, it can be selected as appropriate.
As the administration means, for example, intravenous (for example, jugular vein or tail vein) or intraperitoneal administration can be used.
Moreover, as a dose when using streptozotocin, it is usually possible to administer a single dose of 35 to 45 mg / kg in rats.
[0020]
In the initial blood glucose level measuring step, the initial blood glucose level is measured after a predetermined number of days have elapsed since administration of the insulin deficiency inducing compound. The timing of the measurement is not particularly limited as long as insulin deficiency is caused by the action of the insulin deficiency inducing compound and the blood glucose level is stable. For example, the type of model animal to be used, the insulin deficiency inducing compound It can select suitably according to an administration method or dosage.
For example, when a rat is used as a model animal, it is preferably 3 to 9 days after administration of an insulin deficiency inducing compound (for example, streptozotocin), and more preferably 7 to 9 days. If it is less than 3 days, the effect of the insulin deficiency inducing compound may not be sufficiently exerted, and if it exceeds 10 days, the blood glucose level may become high over time.
In addition, during the period from administration of the insulin deficiency inducing compound to the measurement of the initial blood glucose level, it is preferable to freely take a normal diet.
[0021]
In the present specification, it is preferable to use the glucose oxidase method as a method for measuring the blood glucose level. Specifically, oxygen is consumed with the same probability that glucose is converted to gluconic acid. Glucose is measured from the consumed oxygen by an enzyme rate method using an electrode. As a measuring device, for example, SYNCHRON System CX3 Delta (manufactured by Beckman) can be used.
[Formula 1]

[0022]
The blood collection time for measuring the blood glucose level is not particularly limited, but mammals generally used as model animals are nocturnal and are fed at night. It is preferable to collect blood at a fixed time of 11:00 am (fasting).
[0023]
In the nephrectomy step, an animal whose initial blood glucose level is within a predetermined range is selected, and one of the kidneys is removed after a predetermined number of days have elapsed since the administration of the insulin deficiency inducing compound.
The range of the initial blood glucose level of the animal from which the kidney is removed in this step varies depending on, for example, the type of the model animal, but needs to be in a diabetic state.
For example, when a rat is used as a model animal, a rat having an initial blood glucose level of preferably 193 to 634 mg / dL, more preferably 215 to 634 mg / dL, can be selected for nephrectomy.
[0024]
For animals selected with the initial blood glucose level as an index, the time to remove the kidney is not particularly limited as long as the blood glucose level is stable in a diabetic state. For example, depending on the type of model animal used Can be appropriately selected.
For example, when a rat is used as a model animal, it is preferably 10 to 16 days after administration of the insulin deficiency inducing compound, and more preferably 14 to 16 days. If it is less than 10 days, the blood sugar level may seem to fall apparently due to a decrease in food consumption due to a surge in surgery. If it exceeds 20 days, diabetes may become severe (insufficient insulin secretion may progress).
In addition, during the period from the measurement of the initial blood glucose level to the nephrectomy, it is preferable to freely take a normal diet.
[0025]
The kidneys removed in the nephrectomy step are 1/2 to 3/4 of the total kidneys (that is, two kidneys). For example, removing one half of the whole kidney means, for example, removing one whole of two kidneys, partially removing two half of each of two kidneys, or two kidneys Can be partially extracted at an appropriate ratio, and the total of the ratio can be halved. It is preferable to remove one of the kidneys, or to remove one of the kidneys and remove a part of the remaining kidney (1/2 or less of one kidney). When one whole kidney is removed, it can be either of two kidneys, but it is preferable to remove the right kidney. This is because the left kidney is anatomically located below the right kidney, and it is easy to collect a part of the kidney for biopsy in histopathological examination.
[0026]
The extraction method is not particularly limited. For example, the right abdomen of the rat is incised laterally under Nembutal anesthesia, the inside of the kidney (arteries, veins, and ureters) is clamped with forceps, and silk sutures (for example, The inner side of the forceps can be ligated with 1-0) manufactured by Nescostar, and the right kidney can be completely removed outside the forceps. In addition, for example, part of the kidney or the other kidney is removed by blocking blood flow with a suture (5-0), excising with a stainless steel razor blade, and dropping a blood coagulant (eg thrombin). It can be extracted by.
[0027]
In the second blood sugar level measurement step, the second blood sugar level is measured after a predetermined number of days have elapsed since the nephrectomy. The time of measurement is not particularly limited as long as it recovers from the effect of nephrectomy and the amount of food intake and blood glucose level is stable, and is appropriately selected according to, for example, the type of model animal to be used. be able to.
For example, when a rat is used as a model animal, it is preferably after 7 days or more from the nephrectomy, and more preferably after 7 to 10 days. If it is less than 7 days, the blood sugar level may apparently decrease due to a decrease in food intake due to a surge in surgery.
It should be noted that during the period from the nephrectomy to the second blood glucose level measurement, it is preferable to have a normal diet ad libitum.
[0028]
In the final selection step, the borderline diabetes model animal of the present invention or the hyperglycemia type diabetes model animal of the present invention can be obtained by selecting an animal whose second blood glucose level is within a predetermined range.
In the case of obtaining the borderline diabetes model animal of the present invention, the range of the second blood glucose level of the animal selected in this step varies depending on, for example, the type of the model animal. Corresponds to mild diabetes, and it is necessary that no sugar appears in the urine.
For example, when a rat is used as a model animal, a rat having a second blood glucose level of preferably 150 to 210 mg / dL (more preferably 170 to 200 mg / dL) can be selected.
[0029]
On the other hand, when acquiring the hyperglycemic diabetes model animal of the present invention, the range of the second blood glucose level of the animal selected in the final selection step varies depending on, for example, the type of the model animal. It is necessary to be in a state corresponding to type 1 diabetes and the appearance of sugar in urine.
For example, when a rat is used as a model animal, a rat having a second blood glucose level of preferably 215 to 700 mg / dL (more preferably 215 to 634 mg / dL) can be selected.
[0030]
In the boundary type diabetes model animal of the present invention obtained by selecting the second blood glucose level as an index in the final selection step, the blood glucose level is slightly higher than the normal value as needed, but no sugar appears in the urine. . Moreover, a decrease in insulin secretion and insulin resistance are observed, and symptoms similar to human borderline diabetes are shown.
In addition, the hyperglycemic diabetes model animal of the present invention obtained by selecting the second blood glucose level as an index in the final selection step exhibits type 1 diabetes, that is, symptoms of insulin-dependent diabetes.
[0031]
The diabetic nephropathy model animal of the present invention can be prepared by ingesting the borderline diabetes model animal or hyperglycemic type diabetes model animal of the present invention with a high fat diet. That is, the diabetic nephropathy model animal of the present invention is, for example,
Administering a compound that causes insulin deficiency (eg, streptozotocin) to an animal (insulin deficiency inducing compound administration step),
A step of removing 1/2 to 3/4 of the whole kidney from the animal administered with the insulin deficiency inducing compound (nephrectomy step), and
The process of ingesting a high-fat diet to animals whose kidneys have been removed (high-fat diet intake process)
Can be produced by a method for producing a diabetic nephropathy model animal according to the present invention, and more particularly,
(1) A step of administering a compound causing insulin deficiency to an animal (insulin deficiency inducing compound administration step),
(2) a step of measuring a blood glucose level (initial blood glucose level) after a predetermined number of days from the administration of the insulin deficiency inducing compound (initial blood glucose level measuring step),
(3) A step of selecting an animal having the initial blood glucose level within a predetermined range, and extracting 1/2 to 3/4 of the whole kidney after the elapse of a predetermined number of days from administration of the insulin deficiency inducing compound (nephrectomy step),
(4) A step of measuring a blood glucose level (second blood glucose level) again after the elapse of a predetermined number of days from the nephrectomy (second blood glucose level measuring step),
(5) a step of selecting an animal whose second blood glucose level is within a predetermined range (final selection step); and
(6) Process of ingesting a high fat diet (high fat diet intake process)
Can be produced by the method for producing a diabetic nephropathy model animal according to the present invention.
[0032]
In the method for producing a diabetic nephropathy model animal according to the present invention, the steps (1) to (5) are respectively the steps (1) in the method for producing a borderline type or hyperglycemic type diabetes model animal according to the present invention. -It is the same process as process (5).
In the high fat diet intake step, the animal selected in the final selection step (that is, the borderline diabetes model animal or hyperglycemic diabetes model animal of the present invention) is fed with the high fat diet.
When a borderline diabetes model animal of the present invention is fed with a high fat diet, a model animal that progresses from borderline diabetes to diabetic nephropathy can be obtained. On the other hand, when a high-fat diet is fed into the hyperglycemic diabetes model animal of the present invention, a model animal that progresses from hyperglycemic diabetes to diabetic nephropathy can be obtained.
[0033]
Examples of the high-fat food include a feed in which fat is further added to a normal feed for a model animal to be used so that the fat content is high. For example, when a rat is used as a model animal, a high fat diet having a fat content of preferably 4 to 58%, more preferably 8.6 to 11.3% can be used. As the high fat diet, for example, Lab MR-DBT (fat content = 11.3%, protein content = 13.5%; Nippon Agricultural Industry) can be used.
Moreover, in order to accelerate the progression of diabetic nephropathy, a feed having a higher protein content can be used. Examples of the high protein food include Labo H-standard (fat content = 8.6%, protein content = 30.4%; Nippon Agricultural Industry).
[0034]
The period of giving a high fat diet is not particularly limited as long as it is a period sufficient for the symptoms of diabetic nephropathy to appear. For example, the type of model animal used or the type of high fat diet is used. Depending on the situation, it can be appropriately selected.
For example, when a rat is used as a model animal, it is preferably 20 to 35 weeks after ingestion of a high fat diet, and more preferably 30 to 35 weeks. Below 20 weeks, symptoms of diabetic nephropathy may not appear.
The method of giving a high fat diet is not particularly limited, but it is preferable to limit the amount to 40 to 60 g per day in order to keep the disease state constant.
[0035]
Whether or not a diabetic nephropathy model animal according to the present invention has been obtained as a result of intake of a high fat diet can be determined using various symptoms observed in diabetic nephropathy as indicators. For example, if the appearance of a protein mainly composed of albumin is observed in urine, it can be determined that the diabetic nephropathy model animal according to the present invention has been obtained.
[0036]
The diabetic nephropathy model animal of the present invention exhibits sustained hyperglycemia and hyperlipidemia. Simultaneously with the increase in urinary protein, an increase in blood pressure is observed, and kidney function (creatinine clearance; Ccr), which has been increased immediately after loading with a high fat diet, also decreases. The kidneys are enlarged, and according to histopathological findings, the glomeruli show diffuse to sclerotic lesions that are similar to human diabetic nephropathy.
[0037]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.
[Example 1]
《Preparation of borderline diabetes model rats》
20 male rats of Jcl-Sprague Dawley (8 weeks old, body weight = about 300 g; Japan Claire) were treated with streptozotocin (STZ) causing insulin deficiency in an amount of 40 mg / kg. Injected into. A normal diet (CE-2; Nippon Claire) was ad libitum, and the blood glucose level of each rat was measured after 9 days from the administration of streptozotocin. For the rats (19 rats) having a blood glucose level of 215 to 634 mg / dL or more at this time, the right kidney was removed 5 days after blood glucose measurement (that is, 2 weeks after streptozotocin administration). After 10 days from nephrectomy, blood glucose level was measured again, and 14 rats (14 rats) having a blood glucose level of 208 mg / dL or less were selected as borderline diabetes model rats of the present invention.
Note that the ratio of rats that have undergone right nephrectomy relative to rats administered streptozotocin (ie, the percentage of establishment) is 95%, and the blood glucose level for rats that have undergone right nephrectomy is 208 mg / dL or less. The proportion of rats was 74% (the proportion of rats with a blood glucose level of 208 mg / dL or less relative to rats administered with streptozotocin was 70%).
[0038]
In the obtained borderline diabetic model rat of the present invention, the blood insulin level increased from 2 days after the blood glucose level was measured again to 10 weeks later (compared to the blood insulin level at the time of right nephrectomy). ) Nevertheless, from the fact that the blood glucose level was elevated and the troglitazone administration experiment described below, it was found that insulin resistance was present in peripheral skeletal muscle, liver, and adipocytes during the period.
[0039]
That is, when the obtained borderline diabetes model rat of the present invention was administered with troglitazone, a thiazolidine derivative known to enhance insulin sensitivity, at a dose of 200 mg / kg / day for 2 weeks, insulin secretion was observed. The blood glucose level was lowered without increasing. The results are shown in Table 1 (number of individuals in each group = 3).
The thiazolidine derivative does not affect insulin secretion from pancreatic islets of Langerhans, and inhibits the insulin signal transduction system by tumor necrosis factor (TNF) -α or the glucose transporter carrier by free fatty acid (FFA) ( GLUT) -4 is a drug that acts to suppress inhibition of translocation and is a drug that is generally used to evaluate the presence or absence of insulin resistance. That is, in rats in which pancreatic β cells are destroyed by administration of streptozotocin, diabetes is not ameliorated by the thiazolidine derivative, and insulin secretion needs to be maintained for the thiazolidine derivative to act. In borderline diabetic model rats, the increase in blood glucose level was suppressed by troglitazone, indicating the presence of insulin resistance.
[0040]
As described above, the obtained borderline diabetes model rat of the present invention was confirmed to have decreased insulin secretion (compared to normal rats) and insulin resistance, and exhibited symptoms similar to human borderline diabetes. It was.
[0041]

[0042]
[Example 2]
<< Preparation of diabetic nephropathy model rat (1) >>
The borderline diabetes model rat of the present invention obtained by the same operation as in Example 1 was divided into two groups (number of individuals in each group = 14), that is, a normal diet having a fat content of 4.1% ( Labo MR stock; Japan Agricultural Industry) free dietary normal diet group (UC group) and high fat diet with a fat content of 11.3% (Lab MR-DBT; Japan Agricultural Industry) high fat It was divided into a food group (UHL group) and observed for 37 weeks. As a control group, a right kidney excision group (Uni group) in which the right kidney was removed and the high-fat diet was freely ingested was provided.
[0043]
The results are shown in FIGS.
1 to 5 are graphs showing changes in serum blood glucose level (S-Glu), insulin, blood pressure (BP), urinary protein excretion (U-Pro), and creatinine clearance (Ccr), respectively. .
6 to 11 show blood glucose, hemoglobin A1C (HbA1C), neutral fat (TG), total cholesterol (T-cho), arteriosclerosis index [T-cho-HDL-c / HDL-c in each group, respectively. It is a graph which shows (-)] and blood creatinine (S-Cr).
FIG. 12 is a graph showing the kidney weight (absolute weight) in each group, and FIG. 13 is a graph showing the kidney weight (relative weight) in each group. FIG. 14 is a graph showing liver weight (absolute weight) in each group, and FIG. 15 is a graph showing liver weight (relative weight) in each group.
6 to 15 show the results after 37 weeks.
FIG. 16 is a graph showing urinary pentosidine excretion in each group after 35 weeks. In FIG. 16, the symbol “*” means that the significant difference with respect to the UC group is p <0.05 (Student's t test), and the symbol “+” indicates that the significant difference with respect to the Uni group is p <0.05. 0.1 (Student's t-test).
[0044]
During this period, the rats were observed to develop hyperglycemic diabetes with continuous hyperlipidemia. The blood pressure increased simultaneously with the increase in urinary protein after 20 weeks. A decrease in function (creatinine clearance; Ccr) was observed.
The kidney at the time of necropsy is enlarged (increased by about 3 times in the high fat diet group). Furthermore, in the histopathological findings of the kidney, although the mesangial melting image is seen in the normal diet group, the increase of the matrix to the mesangial region is I was not able to admit. In the high fat diet group, melting of mesangium and expansion of the mesangial region were observed, and the inside was replaced with a hardened matrix, and nitrification and hardening were observed extensively. In rats with hyperglycemia and blood pressure of 150 mmHg or more and urinary protein content of 100 mg / day or more, vitrealization and sclerotic lesions were widely observed in the glomeruli.
[0045]
As is clear from the above results, the diabetic nephropathy model rat of the present invention obtained by ingesting the borderline diabetic model rat of the present invention with a high-fat diet has early insulin secretion failure and insulin resistance. Due to the influence of the high fat diet over time, hyperglycemia persisted and hyperlipidemia occurred due to abnormal lipid metabolism. This symptom reflects the pathology of human type 2 diabetes patients. In addition, an increase in blood pressure related to progression to nephropathy and an increase in production of pentosidine, one of the advanced glycation end products (AGE) that increase production due to hyperglycemia, was observed. Since sclerotic lesions were observed in the glomeruli, it was found useful as a diabetic nephropathy model (reflecting from nephropathy stage II, stage III to stage renal failure).
[0046]
[Example 3]
<< Production of diabetic nephropathy model rat (2) >>
67 male rats of JC Sprague-Dawley strain (8 weeks old, body weight = about 300 g; Japan Claire) were injected with streptozotocin (STZ) in an amount of 50 mg / kg into the jugular vein. A normal diet (CE-2; Nippon Claire) was ad libitum, and the blood glucose level of each rat was measured 5 days after the administration of streptozotocin. For rats (62 rats; establishment rate = 90% or more) whose blood glucose level was 300 mg / dL at this time, two weeks after streptozotocin administration, all of the right kidney and half of the left kidney were removed. That is, 3/4 of the whole kidney was removed. One week after the nephrectomy, the blood glucose level was measured again, and rats (29 rats) having a blood glucose level of 246 to 594 mg / dL were selected as hyperglycemic type diabetes model rats of the present invention.
The obtained hyperglycemic diabetes model rats (10 rats) were fed with a high fat diet (Lab MR-DBT; Nippon Agricultural Industry) to promote diabetes, thereby obtaining the diabetic nephropathy model rats of the present invention. .
For comparison, the above operation was repeated as it was, except that 3/4 of the whole kidney was not removed (hereinafter referred to as STZ group).
[0047]
In this model group, cataract, a complication, developed at a high rate during the 17-week study period. In the STZ group, the incidence was 78%, whereas in this model, all cases developed.
In both the model group and the STZ group, the amount of food intake increased from 30 g / day / animal, and 50 g / day / animal or more was ingested after 2 weeks from the start of intake of the high fat diet.
The blood glucose level remained high at 600 to 800 mg / dL in both the model group and the STZ group.
In this model group and STZ group, lipid metabolism abnormalities of the same degree were observed. Specifically, total cholesterol changed at an average of 200 to 300 mg / dL, and neutral fat changed at an average of 2000 mg / dL.
In this model group, blood pressure increased (200 mmHg). In the STZ group, no increase in blood pressure was observed.
[0048]
Among the renal functions, urinary protein excretion was not increased in the STZ group, whereas in this model group, it increased from 10 weeks after the start of intake of the high fat diet. Creatinine clearance (Ccr) was elevated from the beginning in both groups, and neither creatinine (Cr) nor blood urea nitrogen (BUN) was increased.
In the STZ group, the kidney weight was larger than that in normal rats (approximately twice the left kidney ratio), but in this model group, it reached approximately 3.6 times. The measurement results are shown in Table 2.
[0049]

[0050]
In the histopathological findings of the kidney, glomerulosclerosis was not observed in the STZ group although mesangial expansion and extracellular matrix increase in the mesangial region were observed. On the other hand, in this model group, a mesangial melting image characteristic of human diabetic nephropathy was observed. In addition to the findings observed in the STZ group image, glomerulosclerosis was also observed in a wide range.
This model rat was proved to be useful as an animal model dependent on insulin, that is, from type 1 diabetes to nephropathy.
[0051]
【The invention's effect】
According to the model animal of the present invention, for example, a drug efficacy screening test for diabetes or diabetic nephropathy can be performed. Further, according to the method for producing a model animal according to the present invention, a model animal that easily progresses to diabetic nephropathy can be produced in a short period of time.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing changes in serum blood glucose level (S-Glu) in diabetic nephropathy model rats of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing changes in insulin in diabetic nephropathy model rats of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing changes in blood pressure (BP) in diabetic nephropathy model rats of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing changes in urinary protein excretion (U-Pro) in diabetic nephropathy model rats of the present invention.
FIG. 5 is a graph showing the transition of creatinine clearance (Ccr) in the diabetic nephropathy model rat of the present invention.
FIG. 6 is a graph showing blood glucose levels in the diabetic nephropathy model rat of the present invention.
FIG. 7 is a graph showing hemoglobin A1C (HbA1C) in the diabetic nephropathy model rat of the present invention.
FIG. 8 is a graph showing neutral fat (TG) in the diabetic nephropathy model rat of the present invention.
FIG. 9 is a graph showing total cholesterol (T-cho) in the diabetic nephropathy model rat of the present invention.
FIG. 10 is a graph showing the arteriosclerosis index [T-cho-HDL-c / HDL-c (−)] in the diabetic nephropathy model rat of the present invention.
FIG. 11 is a graph showing blood creatinine (S-Cr) in the diabetic nephropathy model rat of the present invention.
FIG. 12 is a graph showing kidney weight (absolute weight) in the diabetic nephropathy model rat of the present invention.
FIG. 13 is a graph showing renal weight (relative weight) in diabetic nephropathy model rats of the present invention.
FIG. 14 is a graph showing liver weight (absolute weight) in the diabetic nephropathy model rat of the present invention.
FIG. 15 is a graph showing liver weight (relative weight) in diabetic nephropathy model rats of the present invention.
FIG. 16 is a graph showing urinary pentosidine excretion in the diabetic nephropathy model rat of the present invention.

Claims

After 10-16 days the lapse of given compounds Monoto causing insulin deficiency, is produced by extracting the 1/2 of the total kidney, diabetic model animals (excluding humans).

After 10-16 days of given compounds Monoto causing insulin deficiency, were excised 1/2 of the total kidney, blood glucose was measured after nephrectomy, the blood sugar level to select animals that are 150～210Mg / dL Borderline diabetes model animals (except humans) .

A model animal that progresses from diabetes to diabetic nephropathy (excluding humans), which is prepared by feeding the diabetes model animal according to claim 1 or 2 a high-fat diet.

After 10-16 days of given compounds Monoto causing insulin deficiency, a manufacturing method of excising a 1/2 of the total kidney, diabetic model animals (excluding humans).

After 10-16 days of given compounds Monoto causing insulin deficiency, were excised 1/2 of the total kidney, blood glucose was measured after nephrectomy, the blood sugar level to select animals that are 150～210Mg / dL , A method for producing borderline diabetes model animals (excluding humans) .

Diabetes model animal according to any one of claims 1 or 2, the method for manufacturing a to high fat diet, the model animal of progression to diabetic nephropathy diabetes (excluding humans).