JP4257472B2

JP4257472B2 - Promoter, recombinant containing the promoter, and use thereof

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Publication number: JP4257472B2
Application number: JP17480499A
Authority: JP
Inventors: 真由美久保村; 修治斎藤
Original assignee: Zeon Corp
Current assignee: Zeon Corp
Priority date: 1999-06-22
Filing date: 1999-06-22
Publication date: 2009-04-22
Anticipated expiration: 2019-06-22
Also published as: JP2001000188A

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、プロモーター活性を有する新規ＤＮＡ分子とその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、組み換えウイルスなどの組み換え体を、生体に直接接種する生ワクチンタイプの使用が検討されている（特開平６−０７８７６４号公報など）。こうした組み換えウイルスをワクチンとして用いる場合、一つのウイルス（以下、親ウイルスということがある）に複数の病原ウイルス由来の抗原遺伝子を挿入して多価組み換え体を得、これを多価ワクチンに用いることが可能である（特開平９−００９７９号公報など）。しかし、実際にはこうした多価組み換え体のワクチンは実用化されていない。これは、組織培養、１４巻、４号、１０７〜１１１頁、１９８８年発行や特開平１０−３２７８７１号公報などで指摘されているように、一つのウイルスゲノム内に複数の抗原遺伝子を挿入されて肥大化したゲノムを持った多価組み換え体である組み換えウイルスは増殖性が低下したり、挿入した遺伝子が脱落する、といった問題をもつことに起因している。通常、親ウイルスゲノムに対して挿入できる遺伝子は数％であるとされている。そこでゲノムの肥大化を抑えるため、親ウイルスゲノムの非必須な領域を削除し、そこに抗原遺伝子などを挿入する方法が広く用いられているが、このほか挿入する遺伝子を短くする方法も考えられている。
【０００３】
組み換え体には、抗原遺伝子の他にプロモーターなどの機能遺伝子を挿入するのが一般的である。プロモーターは通常、一つの抗原遺伝子に一つ必要であるため、挿入される抗原遺伝子の数が増えれば、挿入されるプロモーターの数も増える。従って親ウイルスゲノムの肥大化を防止するためにも、挿入するプロモーターを短くする必要が生じている。
【０００４】
ところで、プロモーターの下流領域には、イントロンと呼ばれる領域を持つものがある。一般に、イントロン領域があることでプロモーターの活性が高まると言われている（Ｇｒｏｓｓ、Ｍ．Ｋ．、Ｋａｉｎｚ、Ｍ．Ｓ．ａｎｄＭｅｒＲＩｌｌ、Ｇ．Ｆ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，４５７６−，Ｂｕｃｈｍａｎ、Ａ．Ｒ．ａｎｄＢｅｒｇ，Ｐ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８、４３９５−，Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄＳｃａｒｐｕｌｌａ、Ｒ．Ｃ．（１９８９）Ｇｅｎｅ８４，１３５−，Ｈｕａｎｇ，Ｍ．Ｔ．Ｆ．ａｎｄＧｏｒｍａｎ、Ｃ．Ｍ．（１９９０）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８、９３７−，）。
【０００５】
高発現プロモーターとして知られている鶏由来のβ−アクチンプロモーターの全長は約１．５ｋｂｐと長い（Ｋｏｓｔ、Ｔ．Ａ．、Ｔｈｅｏｄｏｒａｋｉｓ、Ｎ．ａｎｄＨｕｇｈｅｓ、Ｓ．Ｈ．（１９８３）Ｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｃｈｉｃｋｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｂｅｔａ−ａｃｔｉｎｇｅｎｅ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１１：８２８７−３０１）。この鶏由来のβ−アクチンプロモーターの発現量をさらに高める目的で、このプロモーターにスプライシングアクセプター配列やエンハンサー配列などをプロモーターに付加することが提案されている（特開平２−１５６８９１号公報、特開平３−１６８０８１号公報、特開平７−２９８８７７号公報など）。しかしながら、こうした高発現プロモーター研究の流れは、上述した挿入遺伝子をより短くするという多価組み換え体構築の要請に合致しない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
かかる従来技術のもと、全長が短い高発現プロモーターを得るべく鋭意研究した結果、本発明者らは、これまで高発現化に有効といわれてきたイントロン部分を欠いても鶏由来のβ−アクチンプロモーターが高発現を実現できることを見いだし本発明を完成するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
かくして本発明によれば、配列番号３記載の第１番目〜第５５５番目の塩基配列又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するプロモーター活性を有するＤＮＡ分子（以下、これらをまとめて、本発明のプロモーターということがある）が提供され、また当該ＤＮＡ分子と外来タンパク質をコードする遺伝子とを有する組み換え体が提供され、さらに当該組み換え体を有効成分とするワクチンが提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡ分子は、配列番号３記載の第１番目〜第５５５番目の塩基配列又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するＤＮＡ分子である。また、本発明のＤＮＡ分子はプロモーター活性を有する。
このＤＮＡ分子は、配列番号１記載の塩基配列を有し、またはこれと相同性を有し、配列番号２記載の塩基配列と相同性を有さないものである。配列番号１記載の塩基配列は、鶏由来のβ−アクチンプロモーターの５’側に存在する塩基配列との相同性が高く、配列番号２記載の塩基配列は、鶏由来のβ−アクチンプロモーターの３’末端寄りに存在するイントロン中の配列と相同性が高い。従って、配列番号２記載の塩基配列と相同性を有さない本発明のＤＮＡ断片は、公知のβ−アクチンプロモーターとは異なるプロモーターである。
【０００９】
本発明のＤＮＡ分子として、配列番号３記載の塩基配列を有するＤＮＡ分子が挙げられる。
【００１０】
配列番号３記載のＤＮＡ分子は、ＤＮＡ合成などにより得ることができるほか、配列番号１記載のＤＮＡ分子の５’側に、サイトメガロウイルス（以下ＣＭＶと言うことがある）のＩＥプロモーター（以下、単にＣＭＶプロモーターということがある。Ｂｏｓｈａｒｔ，Ｍ．ら（１９８５）Ｃｅｌｌ４１，５２１−）の一部を付加することによって得ることもできる。
【００１１】
また、本発明のＤＮＡ分子は、少なくとも配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ分子と相同性を有し、配列番号２記載の塩基配列と相同性を有さず、配列番号１記載のＤＮＡ分子と同等またはそれ以上のプロモーター活性を有する限り、常法によって塩基が置換、欠損、または付加されたものであってもよい（その例が配列番号３記載のＤＮＡ分子である）。プロモーターとしての機能を十分に発揮させる点からＤＮＡ分子の全長は、１２０〜８５０ｂｐ、好ましくは１５０〜６００ｂｐ、特に好ましくは１５０〜３５０ｂｐである。
【００１２】
また、ＴＡＴＡＡＡで表される塩基配列は転写開始のシグナル領域であり、本発明のプロモーターに必須であるので、たとえば配列番号１記載のＤＮＡ分子を修飾する場合でもこの領域を変更することはできない。
この部分塩基配列の最も５’側の塩基Ｔ（チミジン）より３’末端側の塩基の数の上限が、２００ｂｐ、好ましくは１８０ｂｐ、より好ましくは１５０ｂｐ、特に好ましくは１２０ｂｐであり、下限は３０ｂｐ、好ましくは５０ｂｐである場合、特に優れたプロモーター活性を示す。
【００１３】
本発明において「相同性を有する」とは、ＬｉｐｍａｎａｎｄＰｅａｒｓｏｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１４３５−（１９８５）のアルゴニズムを利用した配列データベースソフト「ＤＮＡＳＩＳ」（販売元：宝酒造社、製造元：ＨｉｔａｃｈｉＳｏｆｔｗａｒｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社）によって算出されたスコアが２００以上あることをいう。本発明において「相同性を有しない」とは同ソフトで算出されたスコアが１００以下であることをいう。
【００１４】
本発明において「プロモーター活性」とは、当該ＤＮＡ分子の下流にある遺伝子の発現を促す活性であり、その測定方法はプロモーターと思われるＤＮＡ領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子を挿入した組み換え体を作成し、マーカー遺伝子産物の発現量を測定する一般的な方法でよい。
【００１５】
より具体的には、以下の手順が例示される。
プロモーター活性を測定したいＤＮＡ配列の下流にマーカー遺伝子を挿入したプラスミドベクターを作製する。このマーカー遺伝子としてはサンプルの調製および測定の容易さからルシフェラーゼ遺伝子が好ましい。このプラスミドは他の領域に同じマーカー遺伝子を含まないものであれば特に限定されるものではなく、後述する組み換え体の説明で例示されるものと同じものが使用できる。
【００１６】
この組み換えプラスミドを用いて組み換えベクターは常法に従って作製される。作製されたベクターは細胞内に導入される。ここで用いられる細胞は、プロモーターが転写され、マーカー酵素の測定に影響を与える物質、ルシフェラーゼを例に取れば発光基質、発光酵素などを含まない細胞であればよい。
【００１７】
このように遺伝子導入した細胞を一定時間培養した後、マーカー遺伝子によって発現されたタンパク質を抽出、回収する。培養時間は、マーカー遺伝子によって任意に設定できる。ルシフェラーゼの場合は１０時間後から５日以内であり、好ましくは１８時間後から３日以内で、より好ましくは約２４時間後である。培養時間はあまり短いとプロモーターの活性が完全に現れる前であり、長すぎると発現したタンパク質が分解され、プロモーターの活性が正しく測定できない。
【００１８】
回収されたマーカ遺伝子産物の活性を測定し、培養量あたりのマーカー遺伝子産物量を算出し、一定細胞あたりのプロモーターの量を換算する。マーカー遺伝子としてルシフェラーゼを使用する場合、発現量の測定にはルミノメーターを用いるのがよい。既知濃度のルシフェラーゼをまず測定し、ルシフェラーゼ量とルミノメーターより読みとれる数値の換算の標準直線を求める。この標準線より、ルシフェラーゼの量を換算する。この方法によれば、マーカー遺伝子産物量を換算することによって、プロモーター強度を測定することができる。
【００１９】
（２）組み換え体
本発明の組み換え体は、上述した本発明のプロモーターとその下流に外来性のタンパク質をコードする遺伝子（以下、外来遺伝子という）とを有するものである。
本発明において組み換え体は、組み換えウイルスや組み換えプラスミドなどの組み換えベクターである。組み換えウイルスは特に限定されるものではないが、真核生物の核内でＤＮＡ複製がおこるものが望ましい。具体例としては、組み換えウイルスとしては、組み換えアデノウイルスや組み換えヘルペスウイルスが好ましく、特に組み換え七面鳥ヘルペスウイルスや組み換えマレック病ウイルスなどの組み換えヘルペスウイルスが好ましい。
【００２０】
組み換えウイルスは、例えば、以下のように調製される。ベクターにクローニングされたウイルスゲノムの非必須領域に、当該ウイルス内で機能するプロモーターとともに他の病原体の抗原遺伝子を組み込む。ウイルス感染細胞に該ベクターを導入することにより、相同組み換えを起こさせ、その結果生じた組み換えウイルスを選択、純化する。ここで非必須領域は、外来遺伝子が挿入されても生体内での増殖低下が起こらないか、低下が少ないゲノム領域を選択するのが望ましい。
【００２１】
組み換えウイルスをワクチンとして用いる場合、組み込む外来遺伝子として抗原遺伝子を用いる。具体的な作製方法は以下の通りである。
すなわち、あらかじめウイルスを感染させた細胞に、例えば、リン酸カルシウム共沈法、電気穿孔法、遺伝子銃による挿入、リポフェクチン法等により組み換えベクターが導入することで、ベクターと感染細胞中のウイルスゲノムＤＮＡとの間で相同組み換えが起こさせ、組み換えウイルスが構築される。または、感染性のあるウイルスゲノムＤＮＡとともに組み換えベクターを上記方法で細胞に導入することによっても組み換えウイルスを構築することができる。
【００２２】
得られた組み換えウイルスを、イーグルＭＥＭなどの培地で培養された宿主細胞に感染させ、組み込んだ抗原遺伝子をプローブとするハイブリダイゼーション法や、抗原遺伝子と共に組み込んだマーカー遺伝子の発現等の方法により、生育してくるプラークの中から候補株を純化する。候補株が目的の組み換えウイルスであることは、組み込んだ抗原遺伝子のコードするポリペプチドに対する抗体を使用したイムノアッセイ等の方法により確認できる。例えば、マーカー遺伝子としてｌａｃＺ遺伝子が組み込まれている組み換えウイルスの場合、β−ガラクトシダーゼを発現する。よって、その基質の１つであるＢｌｕｏ−ｇａｌ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）存在下で青いプラークを形成するので、その性質を利用して選択、純化することができる。
宿主細胞としては、用いるウイルスが感染し、増殖することが可能なものであれば特に限定されず、例えば、組み換え七面鳥ヘルペスウイルスを用いた場合は、ＣＥＦ細胞や、発育鶏卵しょう尿膜細胞等が挙げられる。
【００２３】
（ウイルス）
組み換えウイルスを作製するために用いるウイルス（親ウイルス）は、真核生物の核内で増殖するいかなるウイルスでもよいが、鶏、七面鳥、アヒルなどの家禽類の細胞中で増殖可能な、例えばトリアデノウイルスや、七面鳥ヘルペスウイルス（以下、ＨＶＴということがある）、マレック病ウイルス（以下、ＭＤＶということがある）、伝染性咽頭気管炎ウイルス（以下、ＩＬＴＶということがある）などのヘルペスウイルスが例示される。
【００２４】
ヘルペスウイルスの具体例としては、ＨＶＴではＦＣ１２６（ＡＴＣＣＶＲ−５８４Ｂ）、ＰＢ−ＴＨＶ１、Ｈ−２、ＹＴ−７、ＷＴＨＶ−１、ＨＰＲＳ−２６などが挙げられ、例えば、ＦＣ１２６株を好適に使用することができる。また、ＭＤＶとしては、具体的にはＣＶＩ９８８やＳＢ１などが挙げられる。
ここに例示されたウイルスは、寄託機関、市販ワクチンとしてあるいはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）などの機関から入手できる。
【００２５】
（非必須領域を含有するベクター）
組み換え用ベクターの構築に用いられるウイルスの非必須領域をクローニングするためのベクターは、特に限定されない。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ１８等のプラスミド、λファージ、Ｍ１３ファージなどのファージ、ｐＨＣ７９等のコスミドなどのベクターを適当な制限酵素で処理して、ウイルスの非必須領域を組み込めばよい。
【００２６】
（非必須領域）
ウイルスの非必須領域は、親ウイルスゲノムと相同組み換えを起こしうる領域であって、親ウイルスの増殖に非必須な領域であれば特に制限されない。こうした非必須領域は、公知のものを用いることができ、例えばＷＯ９９／１８２１５号公報に記載された遺伝子間領域などを利用することもできる。より具体的に好ましい非必須領域としては、七面鳥ヘルペスウイルスのＵＬ４５遺伝子とＵＬ４６遺伝子間が挙げられる。
【００２７】
（抗原遺伝子）
抗原遺伝子は、組み換えウイルスが感染細胞中で、転写、翻訳し抗原タンパク質として発現しうるものであればよく、例えば、ニューカッスル病ウイルス（以下、ＮＤＶということがある）のＨＮタンパク質をコードする遺伝子（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６７、１９１７−１９２７（１９８６））、Ｆタンパク質をコードする遺伝子（ＭｃＧｉｎｎｅｓら、ＶｉｒｕｓＲｅｓ．，５、３４３−３５６（１９８６））、ＭＤＶの糖タンパク質ｇＢをコードする遺伝子（Ｒｏｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７０、１７８９−１８０４（１９８８））、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（以下、ＩＢＤＶということがある）の構造タンパクＶＰ２をコードする遺伝子（Ｂａｙｌｉｓｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７１、１３０３−１３１２（１９９０））、マイコプラズマ（以下、ＭＧということがある）のアドヘシンタンパク質、ＨＭＷ関連タンパク質、４０Ｋタンパク質（ＷＯ９３／２４６４６号公報）、６６Ｋタンパク質、６７Ｋタンパク質など（ＷＯ９７／０３１８７号公報）、伝染性喉頭気管炎ウイルスのｇＢタンパク質（Ｐｏｕｌｓｅｎら、ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ、５、３３５−３４７（１９９１）、ＵＳＰ５，４４３，８３１）、ＵＬ３２タンパク質（ＷＯ９８／０７８６６号公報）等の感染防御に関与した抗原をコードした遺伝子が好ましい。
【００２８】
また、これら抗原遺伝子のうち、特にＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質などは株間によって変異が激しいことが知られているが、挿入される遺伝子は株によって特定されるものではなく、日本の超強毒株である、岡山株、愛媛株、徳島株、ヨーロッパの超強毒株であるＵＫ６６１、アメリカの強毒株であるＳＴＣ株やＶｉｒｕｌｅｎｔＥ株など由来のＶＰ２遺伝子（ＹａｍａｇｕｃｈｉＴ．ら、ＡｒｃｈＶｉｒｏｌ．、１４２、１４４１−１４５８（１９９７））を例示することができる。
【００２９】
（組み換え用ベクター）
本発明で用いる組み換え用ベクターは、非必須領域に抗原遺伝子とそれを支配するプロモーターが挿入されたものである。前述の非必須領域中に前述の抗原遺伝子及びそれを支配する本発明のプロモーターを挿入すればよい。さらに、組み換えウイルスの純化などの効率化のために大腸菌由来のｌａｃＺ遺伝子などのマーカー遺伝子をプロモーターとともに組み込んでもよい。
【００３０】
（プロモーター）
本発明で用いるプロモーターは、上述した本発明のプロモーターである。このプロモーターは上述した外来遺伝子の発現を支配するようにウイルスゲノム中で、プロモーターの下流に抗原遺伝子が位置するように挿入される。
マーカーを挿入する場合、マーカーの発現を支配するプロモーターを用いる。ここで用いるプロモーターは特に制限されず、組み換えウイルス感染宿主中でプロモーターとして機能するものであればよい。
【００３１】
（エンハンサー）
さらに、本発明の組み換え体には、請求項１記載のプロモーターにエンハンサー配列を入れたものである。全長が短いプロモーターにエンハンサーを含ませても遺伝子の脱落が生じにくい。
【００３２】
（３）ワクチン
本発明を利用する生ワクチンは、上述した本発明の組み換え体を１種類以上含有し、これが有効成分となっているワクチンである。即ち、本発明の組み換え体、好ましくは組み換えウイルスを単独、または２種類以上混合または併用して用いることができる。さらにこのほか、本発明のワクチンと他のワクチンとを組み合わせてもよい。ここで、組み合わせ可能な他のワクチンとしては、たとえば特開平２−１５７３８１号公報や特開平３−２７２８４号公報記載の抗ＮＤＶワクチンとなる組み換えアビポックスウイルスや特開平６−７８７６４号公報や米国特許出願第０８／４９９，４７４号明細書に記載されている抗ＭＤＶワクチンとなる組み換えアビポックスウイルスなどの組み換えワクチン、抗ＭＤＶワクチンとして用いられる七面鳥ヘルペスウイルスワクチンなどが例示される。
また、組み換え体以外にも薬理学的に問題のないキャリアー、例えば生理食塩水、安定剤などを含んでいてもよい。
【００３３】
本ワクチンの調製法は、組み換えウイルスを用いる場合、その感染細胞を当該ウイルスが生育できる細胞（以下、宿主細胞という）に感染させ、ウイルスを増殖させた後、感染細胞を回収し、ウイルスをワクチンとして調製する。ＨＶＴの生ワクチンの場合を例にとって説明する。
宿主細胞としては、トリ由来の細胞が好ましく、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）、ニワトリ腎細胞などを好適に使用することができる。このような宿主細胞に感染させ、ウイルスを増殖させた後、細胞をスクレーパーまたはトリプシンではがし、遠心分離によって感染細胞と上清とに分離する。得られた感染細胞は、１０％のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を含む培養用培地に懸濁し、液体窒素存在下で凍結保存する。ワクチンとして使用するときは１００倍量のリン酸緩衝液にこの凍結保存品を溶かして使用する。
【００３４】
液体窒素下で上記感染細胞を保存するための安定剤やその他の成分は、ウイルス感染細胞が安定に生存でき、かつレシピエントにとって薬理学的に問題のない成分であれば特に限定されない。
【００３５】
本発明のワクチンの投与方法は特に限定されない。ＨＶＴの生ワクチンの場合は皮下に注射により接種する方法が一般的に用いられており、現行のＨＶＴワクチンと同じである。接種量も従来ワクチンと同様でよく、１０〜１０^５ＴＣＩＤ_５０を接種、好ましくは初日齢に鶏の背部皮下においての１０^３ＴＣＩＤ_５０接種である。
【００３６】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３７】
（実施例１）高活性Ｐｅｃプロモーターの構築と活性測定
１−１末端切り縮めβ−アクチンプロモーター
ＷＯ９９／１８２１５号公報に記載された、ｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトにｐｏｌｙＡ付加シグナルとＳｆｉＩサイトを導入したプラスミドｐＧＩＭＩＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉ（全長２７７３ｂｐ）を制限酵素ＮｈｅＩで処理して得られた断片と、ＰｉｃａｇｅｎｅＥｎｈａｎｃｅｒ２（全長５０６４ｂｐ。東洋インキ社製）をＮｈｅＩ及びＸｂａＩで切り出して得られた１７２１ｂｐとを連結し、プラスミドｐＬＵＣ−ｐｒｏ（全長４４９４ｂｐ）を作製した。
【００３８】
次に、ニワトリのゲノムバンクを作製し、これをテンプレートとして、配列番号８記載のプライマーＰｒＢａｃ１（５’−ＣＡＧＴＧＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＧＣＡＴＧＣＡＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣＣ−３’）及び配列番号９記載のプライマーＰｒＢａｃ２（５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴＧＣＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧＧＧ−３’）を用いてＰＣＲによりβ−アクチンプロモーターを含むＤＮＡ断片（約１．５Ｋｂｐ）を得た。
【００３９】
この断片をＰｓｔＩとＸｂａＩで処理して得られた約１．５ＫｂｐのＤＮＡ断片と、ｐＬＵＣ−ｐｒｏをＰｓｔＩおよびＸｂａＩで処理して得られた４４８２ｂｐのＤＮＡ断片とを連結して、β−アクチンプロモータ領域を含むｐＬＵＣ−ｂａｃ（５９８６ｂｐ）を作製した。
【００４０】
得られたｐＬＵＣ−ｂａｃをＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで処理した後、５９５８ｂｐの断片を回収、ライゲーションしてｐＬＵＣ−ｂａｃ−Ｓｍａを作製した。このｐＬＵＣ−ｂａｃ−Ｓｍａを、５’側の切り縮めにはＰｓｔＩとＳｍａＩ、３’末端側にはＳａｃＩとＸｂａＩを用いて処理した。引き続き、得られたＤＮＡ断片をＫｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用ＤｅｌｅｔｉｏｎＫｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて、ＥｘｏＩＩＩと３分間反応させ、１分おきにサンプルを分取し、約２００ｂｐ〜約１５００ｂｐのプロモーター断片を含むプラスミドを多数取得した。
【００４１】
ルシフェラーゼ活性測定は、東洋インキ製造株式会社（販売元：和光純薬）の「ピッカジーン」を用いた。まず、これらのプラスミド２９個について各１μｇを、２×１０^６個の細胞に、０．４ｃｍギャップのキュベットを用いて、室温でジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて１．２ｋＶ、０．４ｍｓｅｃの条件にて遺伝子を導入した。
約２４時間培養した後、培養液を捨て、細胞融解液を加えた後、−８０℃で１時間凍結し、細胞を完全に融解した。得られた液体を遠心分離して得られた上澄み活性測定用のサンプルとした。１００μｌずつ分注した前述記載のＫｉｔ添付の基質液に、１０μｌのサンプルを加え、１分後にルミノメータ（型番「ｍｏｄｅｌ１１２５３」、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて、発光の強さ（単位：ＲＬＵ）からルシフェラーゼ生産量を算出し、プロモータ活性を調べた（図１参照）。
【００４２】
全長β−アクチンプロモーターのルシフェラーゼ生産量を１とすると、５’側の切り縮めサンプルは図１のように、ＴＡＴＡＡＡの配列より５’側が１２０ｂｐ以上欠損しているものの活性が急激に低下した。
一方、切り縮めた長さと活性には相関がなく、約８５０ｂｐ切り縮めたときの活性が最も高く、逆に１００ｂｐ足らずの切り縮めサンプルでは活性が全長の０．２倍にとどまった。
【００４３】
１−２コアシークエンスプロモーター
ｐＬＵＣ−ｂａｃのβ−アクチンプロモーターを鋳型として、配列番号１０記載の５’−ＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴ−３’、配列番号１１記載の５’−ＡＣＧＴＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＡＣＧＣＡＧＣＧＡＣＴ−３’及び配列番号１３記載の５’−ＣＴＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＧＣＧＧＴＣＡＧＴＣＡＧＡ−３’をプライマーとしたＰＣＲを行ったところ、２７３ｂｐ、２１１ｂｐの他、１７５ｂｐ、１６３ｂｐの長さの断片も得られた。
得られたＤＮＡ断片をコアシークエンスプロモーター（ＣＯＡ）と名付けた。これらのＣＯＡを、ＰｓｔＩ及びＸｂａＩで処理して得られたＤＮＡ断片と、ｐＬＵＣ−ｐｒｏをＰｓｔＩ及びＸｂａＩで処理して得られた約４４８２ｂｐの断片とをライゲーションしてプラスミドを得た。得られたプラスミドをそれぞれｐＵＬＣ−ＣＯＡ２７３、ｐＬＵＣ−ＣＯＡ２１１、ｐＵＬＣ−ＣＯＡ１７５、ｐＬＵＣ−ＣＯＡ１６３と銘々した。
得られたプラスミドを用いてプロモーターの活性を、前記１−１の方法と同様にして測定したところ、全長β−アクチンプロモーターのルシフェラーゼ生産量を１とすると２７３ｂｐで０．９７、２１１ｂｐで０．７６、１７５ｂｐで０．９６、１６３ｂｐで０．３４となった。
【００４４】
１−３エンハンサー領域の付加
配列番号５記載のＣＭＶ由来（５９０ｂｐ）のエンハンサー、配列番号６記載のＲＳＶ由来のエンハンサー（９０ｂｐ）は、プラスミドｐＬＵＣ−ＣＯＡ２７３中のプロモーターより上流に位置するＰｓｔＩサイトに挿入した。これらは、プラスミドへの挿入のために、５’側にはＣＴＧＣＡＧの６塩基を、３’末端側にはＧＡＡＴＴＣの６塩基が付加されている。
配列番号７記載のＳＶ４０由来のエンハンサー（２００ｂｐ）を、プラスミドｐＬＵＣ−ＣＯＡ２７３のルシフェラーゼ遺伝子より下流側に位置するＥｃｏＲＩサイトに挿入した。
これらエンハンサー付加プラスミドについて、上述と同様の方法によりルシフェラーゼ生産量で求められるプロモーター活性を測定したところ、ＲＳＶエンハンサーを有するプラスミドでは１．４倍、ＳＶ４０を有するプラスミドでは３．６倍に活性が上昇することが確認された（図２参照）。
また、ＣＭＶエンハンサーについては、切り縮めたＤＮＡ断片を用意した。具体的には、配列番号５記載の第７番目〜第３７０番目、同配列の第７番目〜第２８２番目、同配列の第７番目〜第１５９番目、同配列の第７番目〜第８９番目、同配列の第９３番目〜第３７０番目、同配列の第９３番目〜第２８２番目、第９３番目〜第１５９番目のＤＮＡ断片を用意し、これらの断片を、プラスミドｐＬＵＣ−ＣＯＡ２７３中のプロモーターより上流に位置するＰｓｔＩサイトに挿入しプロモーター活性への影響を確認した。その結果、挿入する領域によって活性促進の効果が異なっていたが、配列番号５記載の第７〜２８２番目の２７５ｂｐを付加した場合にプロモーター活性が６．５倍と最も高い活性を示した。
【００４５】
この最も高い活性が得られたプラスミドには、ＣＭＶ２７５ｂｐエンハンサーとコアシークエンス２７３ｂｐプロモーターとからなるキメラＤＮＡ領域が含まれている。このエンハンサーとプロモーターとからなるキメラＤＮＡ領域（Ｐｅｃ（＋））のサイズは５５７ｂｐである。また、このキメラＤＮＡ領域中、５’側にあるＢｇｌＩサイト（ＧＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣ）からＴを、３’末端側にあるＢｇｌＩサイト（ＧＣＣＣＡＣＴＴＧＧＣ）のＡとＴの間のＣを欠失させた５５５ｂｐのキメラＤＮＡ領域を含むプラスミドｐＬＵＣ−Ｐｅｃ（全長５０３７ｂｐ）も作成した。いずれのプラスミドにおいても、従来組み換えＨＶＴの外来遺伝子用プロモーターであるＲＳＶやＣＭＶプロモーターの数倍以上の活性を示した（図３参照）。
【００４６】
（実施例２）組み換えベクターの構築
２−１ＩＢＤＶ用組み換えベクターｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ（＋）ＶＰ２Ｓの構築
新規合成プロモーターＰｅｃ（＋）でＩＢＤＶのＶＰ２を発現させる組み換えベクターｐＮＺ４５／４６ＰＥＣ（＋）ＶＰ２Ｓを、以下の手順で構築した。
ｐＧＩＭＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉを制限酵素ＢｇｌＩで処理して得られた１２０ｂｐのマルチクローニングサイトを含むＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｆｉＩで処理したｐＮＺ４５／４６Ｓｆｉ（全長５４８６ｂｐ、ＷＯ９９／１８２１５号公報）に挿入し、ｐＮＺ４５／４６ＭＣＳｐｏｌｙＡ（全長５６０６ｂｐ）を作製した。次に、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切り出したプロモーターＰｅｃ（＋）領域を含むＤＮＡ断片（５６１ｂｐ）とｐＮＺ４５／４６ＭＣＳｐｏｌｙＡを制限酵素ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩまたはＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで処理したＤＮＡ断片（それぞれ３６１７ｂｐ、１９７７ｂｐ）の３断片をライゲーションによってｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ（＋）ＭＣＳｐｏｌｙＡ（全長６１５５ｂｐ）を構築した。
【００４７】
ＩＢＤＶ超強毒株である岡山株よりｃＤＮＡを合成して、ＰＣＲにより、ｐＵＣ１９ＳｍａＩ部位にクローニングした３つの断片（Ｖｉｒｏｌ．２２３，２１９−２２３，１９９６）を岐阜大学より入手した。これら３つの断片をＣｌａＩ、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩを用いて接続して、ＳｅｇｍｅｎｔＡ全長約３．２Ｋｂｐを持つｐＵＣ１９ＳｅｇＡ−ＯＫＹＭを作製した。このｐＵＣ１８ＳｅｇＡ−ＯＫＹＭをテンプレートとして、配列番号１３記載のプライマーＰｒＶＰ２−２（５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＣＡＧＣＧＡＴＧＡＣＧＡＡＣＣＴＧＣ−３’）及び配列番号１４記載のプライマーＰｒＶＰ２−３（５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＡＧＧＧＣＣＣ−３’）を用いたＰＣＲにより、ＶＰ２のみを含有するＤＮＡ断片を得た。
【００４８】
このＰＣＲ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切り出したＩＢＤＶのＶＰ２Ｓ遺伝子を、ｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ（＋）ＭＣＳｐｏｌｙＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで処理したＤＮＡ断片（６１１３ｂｐ）にライゲーションによって挿入し、ｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ（＋）ＶＰ２Ｓ（ＯＫＹＭ）（全長７４９０ｂｐ）を構築した。
【００４９】
２−２ＮＤＶ用組み換えベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦＨＮの構築
新規合成プロモーターＰｅｃでＮＤＶのＦおよびＨＮ遺伝子を発現させるトランスファーベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦＨＮを以下の手順で構築した。
ｐＬＵＣ−Ｐｅｃから制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切り出したＰｅｃ領域を含むＤＮＡ断片（５５９ｂｐ）と、ｐＧＩＭＣＳｐｏｌｙＡＳｆｉを制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで処理して得られたＤＮＡ断片（２７６１ｂｐ）と連結し、ｐＧＩＰｅｃ（全長３３２０ｂｐ）を作製した。
【００５０】
ＸＬＩＩＩ１０Ｈ（ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ、７，２４１−２５５（１９８７））をテンプレートとして、配列番号１５記載のプライマーＰｒＦ１（５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣ−３’）及び配列番号１６記載のプライマーＰｒＦ２（５’−ＧＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＣＣＡＴＧＡＣＴＧＡＡＧＡＣＴＧＣＴＡＴＴＧＧ−３’）を用いて、ＰＣＲを行いＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａＩで切り出したＮＤＶのＦ遺伝子を含む領域（１８８９ｂｐ）を同じ制限酵素処理をしたｐＧＩＰｅｃにライゲーションによって挿入し、ｐＧＩＰｅｃＦ（全長５１９１ｂｐ）を作製した。
【００５１】
同様に、ＸＬＩＩＩ１０Ｈをテンプレートとして、配列番号１７記載のプライマーＰｒＨＮ１（５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＡＧＴＣＡＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＡＧＴＴＡＧＣＣＡＡＧＴＴＧＣＧＣ−３’）及び配列番号１８記載のプライマーＰｒＨＮ２（５’−ＧＣＧＧＴＡＣＣＧＣＡＴＧＣＧＧＧＣＣＣＧＣＴＡＧＣＧＡＧＣＴＣＧＣＧＣＣＧＧＴＡＣＴＣＡＧＴＴＴＧＡＴＴＣＴＴＧＧＣＧ−３’）を用いて、ＰＣＲを行い、ＨＮ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
このＤＮＡ断片をＢａｍＨＩとＫｐｎＩで処理し（１８４２ｂｐ）、同じ制限酵素処理をしたｐＧＩＰｅｃにライゲーションによって挿入し、ｐＧＩＰｅｃＨＮ（全長５１２３ｂｐ）を作製した。
【００５２】
ｐＧＩＰｅｃＦのプロモーターおよび抗原遺伝子領域を制限酵素ＢｇｌＩによって切り出し（２５３８ｂｐ）、ｐＮＺ４５／４６Ｓｆｉ（全長５４８６ｂｐ）の制限酵素ＳｆｉＩに挿入することによって、ｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦ（全長８０２４ｂｐ）を構築し、次にｐＧＩＰｅｃＨＮのプロモーターおよび抗原遺伝子領域を制限酵素ＢｇｌＩによって切り出し（２４７０ｂｐ）、ｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦの制限酵素ＳｆｉＩに挿入することによって、ｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦＨＮ（全長１０４９４ｂｐ）を構築した。
【００５３】
２−３ＭＧ用組み換えベクターｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ４０ＫＳ
新規合成プロモーターＰｅｃでＭＧの４０Ｋ遺伝子を発現させるトランスファーベクターｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ４０ＫＳを、以下の手順で構築した。
ｐＧＴＰｓ４０Ｋ−Ｓ（ＷＯ９７／３６９２４、全長３９６７ｂｐ）より制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切り出したＭＧの４０Ｋを含む領域（１３４４ｂｐ）を同じ制限酵素処理をしたｐＧＩＰｅｃにライゲーションによって挿入し、ｐＧＩＰｅｃ４０ＫＳ（全長４６２２ｂｐ）を作製した。ｐＧＩＰｅｃ４０ＫＳのプロモーターおよび抗原遺伝子領域を制限酵素ＢｇｌＩによって切り出し（１９６７ｂｐ）、ｐＮＺ４５／４６Ｓｆｉ（全長５４９３ｂｐ）の制限酵素ＳｆｉＩに挿入することによって、ｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ４０ＫＳ（全長１１４０５ｂｐ）を構築した。
【００５４】
２−４ＩＬＴＶ用組み換えベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＩＬＵＬ３２ｇＢ新規合成プロモーターＰｅｃでＩＬＴＶのＵＬ３２およびｇＢ遺伝子を発現させるトランスファーベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＩＬＵＬ３２ｇＢを、以下の手順で構築した。
ＷＯ９８／０７８６６号公報記載のｐＧＴＰｓＩＬＵＬ３２（全長４３８３ｂｐ）より制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切り出したＩＬＴＶのＵＬ３２遺伝子を含む領域（１７６０ｂｐ）、およびＷＯ９８／０７８６６号公報記載のｐＧＴＰｓＩＬｇＢ（ＢｇｌＩ−）（全長５３０７ｂｐ）より制限酵素ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切り出したｇＢ遺伝子を含む領域２６４８ｂｐをそれぞれ挿入領域を切り出した制限酵素と同じ制限酵素処理をしたｐＧＩＰｅｃにライゲーションによって挿入し、ｐＧＩＰｅｃＩＬＵＬ３２（全長５０３８ｂｐ）、およびｐＧＩＰｅｃＩＬｇＢ（全長５９１８ｂｐ）を作製した。ｐＧＩＰｅｃＩＬＵＬ３２のプロモーターおよび抗原遺伝子領域を制限酵素ＢｇｌＩによって切り出し（２３８５ｂｐ）、これをｐＮＺ４５／４６Ｓｆｉ（全長５４９３ｂｐ）の制限酵素ＳｆｉＩに挿入することによって、ｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＩＬＵＬ３２（全長７８７８ｂｐ）を構築し、次にｐＧＩＰｅｃＩＬｇＢのプロモーターおよび抗原遺伝子領域を制限酵素ＢｇｌＩによって切り出し（３２６５ｂｐ）、これをｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦの制限酵素ＳｆｉＩに挿入することによって、ｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＩＬＵＬ３２ｇＢ（全長１１１４３ｂｐ）を構築した。
【００５５】
（実施例３）組み換えウイルスの構築純化
実施例２に記載のプラスミドについて、以下のブラックプラーク法を用いた純化法によって、組み換えＨＶＴの構築・純化を行った。
まず、Ｍｏｒｇａｎらの方法（ＡＶＩＡＮＤＩＳＥＡＳＥＳ、３４：３４５−３５１（１９９０））によって、野生型ＨＶＴ（以下ｗｔＨＶＴ）のＤＮＡの調製を行った。
組み換えベクターは、骨格領域にユニークに存在する制限酵素サイトを利用して直鎖状に加工した。
【００５６】
遺伝子導入は電気穿孔法を用い、具体的には以下の方法で行った。
組み換えベクターＤＮＡ５μgおよび2５μgのＨＶＴ-ＤＮＡを１００μｌのＳａｌｉｎｅＧ（０．１４Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ塩化カリウム、１．１ｍＭリン酸一水素二ナトリウム、１．５ｍＭリン酸二水素一ナトリウム０．５ｍＭ塩化マグネシウム・６水和物、０．０１１％グルコース）に懸濁した。２×１０^６コのニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を０．７ｍｌのＳａｌｉｎｅＧに懸濁し、上記ＤＮＡ液を加え、室温でジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて１．２ｋＶ、０．４ｍｓｅｃの条件にて遺伝子導入した。細胞を室温で１０分間静置した後、４％牛血清を含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓＬ−１５、ＭｃＣｏｙ’ｓ５ＡＭｅｄｉｕｎ（ともにＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）（以下、ＬＭ（＋）と言う）を加え、６ｃｍ径の細胞培養用ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社）で、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター中で６日、培養した。この細胞を適当に希釈し、ＬＭ（＋）に懸濁したＣＥＦと混ぜ、９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（Ｆａｌｃｏｎ）に分注し、プラークがでるまで培養した。各プレートから２枚ずつレプリカのプレートを作製し、同様にプラークがでるまで培養した。そのうちの１枚をメタノールで固定し、挿入遺伝子に対するウサギ抗体を１次抗体とした抗原抗体反応により、組み換えＨＶＴが存在しているかどうかの確認を行った。組み換えＨＶＴの確認されたｗｅｌｌに相当するレプリカより細胞を回収、希釈し、ＬＭ（＋）に懸濁したＣＥＦとまぜて９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに分注し、培養した。この、希釈・レプリカの作製・組み換えＨＶＴの確認の繰り返しを、１ｗｅｌｌから由来するプラークがほぼ１００％組み換えＨＶＴであることを確認できるまで行った。この組み換えＨＶＴを１０^５ｐｆｕ程度までＣＥＦで増殖後、超音波破砕処理を行い、遠心上清を、９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに新たに調製したＣＥＦに感染させた。再び、希釈・レプリカの作製を、組み換えＨＶＴが１００％になるまで繰り返した。
【００５７】
組み換えベクターｐＮＺ４５／４６Ｐｅｃ（＋）ＶＰ２Ｓ（ＯＫＹＭ）を用いた場合、抗ＶＰ２タンパク質ウサギ抗体を用いたＢＰＡ法による純化によって、組み換えＨＶＴ；ＨＦ０１６（以下、ＨＦ−ＰｅｃＶＰ２と言うことがある）を作製した。また、組み換えベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＦＨＮを用いた場合、抗ＮＤＶウサギ抗体を用いたＢＰＡ法による純化によって、組み換えＨＶＴ；ＨＦ０１８（以下、ＨＦ−ＰｅｃＨＮＦと言うことがある）を作製した。同様に、組み換えベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＭＧを用いた場合、抗ＭＧ４０Ｋタンパク質ウサギ抗体を用いたＢＰＡ法による純化によって、組み換えＨＶＴ；ＨＦ−Ｐｅｃ４０ＫＳを、組み換えベクターｐＮＺ４５／４６ＰｅｃＩＬＵＬ３２ｇＢを用いた場合、抗ｇＢタンパク質およびＵＬ３２タンパク質ウサギ抗体を用いたＢＰＡ法による純化によって、組み換えＨＶＴ；ＨＦ−ＰｅｃＩＬＴを作製した。
【００５８】
純化の終了したウイルスＤＮＡをＭｏｒｇａｎらの方法により回収し、制限酵素で処理し、アガロース電気泳動後にナイロン膜に移した。挿入抗原遺伝子を鋳型としたランダムプライマー法でサザンハイブリダイゼーションを行った。
その結果、組み換えウイルス中に挿入遺伝子が設計どおり正しく存在することが確認された。
【００５９】
（実施例４）挿入遺伝子の安定性
挿入遺伝子の安定性を選択なしに５代継代を重ねた組み換えウイルスについて調べた。
ＨＦ−ＰｅｃＨＮＦの組み換え体について、継代後のウイルスを用いて、抗ＮＤＶ抗体を用いたＢＰＡ法によって純度の検定を行ったところ、すべてのプラークが継代前と全く同様に陽性であった。
また、組み換えに用いた相同領域および挿入遺伝子をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、正しい組み換えが起こっていると得られる理論どおりの大きさの、継代前と同様な位置にバンドを検出することができ、これら挿入遺伝子がウイルス中で安定に存在することを確認した。
【００６０】
（実施例５）免疫蛍光抗体法による挿入遺伝子発現の確認
ＨＦ−Ｐｅｃ４０ＫＳおよびＨＦ−ＰｅｃＩＬＴについて、免疫蛍光抗体法を行った。それぞれの組み換え体をＣＥＦに感染させ、３７℃でプラークが出現するまで培養後、冷アセトンで固定し、抗４０Ｋウサギ抗体または抗ＵＬ３２、抗ｇＢウサギ抗体を一次抗体として、１００から１０００倍に希釈して反応させた。これらの培養細胞をさらに蛍光物質（ＦＩＴＣ）を結合した抗ウサギイムノグロブリンと反応させ、非特異反応部分を洗い流したのち蛍光励起波長光下で顕微鏡観察した。反応性は表１に示した。
【００６１】
【表１】

【００６２】
この結果から本発明によるプロモーターによって抗原遺伝子が非常に良く発現していることがわかった。
【００６３】
（実施例６）鶏感染防御試験
６−１ＮＤＶに対する効果実験
実施例３によって得られた組み換えＨＶＴのワクチン効果を判定するためにワクチン効果実験を実施した。
各群１０羽以上の市販されている白色レグホン（Ｄｅｋａｌｂ鶏、神奈川養鶏連合会）から生まれた初生鶏に、新規プロモーターの組み換えＨＶＴ：ＨＦ−ＰｅｃＨＮＦを接種した。陽性対照群にはＮＤＶの市販生ワクチン（ＮＤＶ−Ｂ１
ｓｔｒａｉｎ日本生物科学研究所）を接種し、陰性対照群は非接種とした。
【００６４】
初生鶏に、組み換えＨＶＴを鶏の背部皮下に１０^３ＴＣＩＤ_５ ₀となるように２６Ｇの注射針を使って接種した。陽性対照群に使用した市販のＮＤＶ生ワクチンは、７日齢鶏に用法通り点眼接種した。
接種４週後に、各群の雛に強毒ＮＤＶ（Ｓａｔｏ株）を１０^４ｐｆｕとなるように右大腿部にチャレンジした。チャレンジ後４日目にＮＤＶの発症の有無を観察した。
また、ＮＤＶウイルスをチャレンジする前に各鶏から採血を行い、各鶏の血清中のＮＤＶに対する赤血球凝集抑制抗体の検出を行った。判定は市販されているＮＤＶ赤血球凝集素（日本生物科学研究所）の使用説明書に従った。
結果を表２にまとめた。
【００６５】
【表２】

【００６６】
なお、初生齢のＨＩ抗体価は２^９であった。
この結果から明らかなように、ＨＦ−ＰｅｃＨＮＦを接種した群ではＮＤＶのチャレンジに対してほぼ完璧なワクチン効果が示された。また、チャレンジ時のＨＩ抗体価も非接種群（＜２）と比較して明らかに高い値を示した。
これらの結果から明らかなように、本発明による組み換えＨＶＴによる生ワクチンは移行抗体鶏に対しても充分な感染防御を付与できることが示された。
【００６７】
６−２鶏ワクチンのＩＢＤＶに対する効果実験
実施例３によって得られた組み換えＨＶＴのワクチン効果を判定するためにＩＢＤＶに対するワクチン効果実験を実施した。なお、プロモーター配列がＣＭＶであることを除き、実施例２，３とほぼ同様な手順で作製した組み換えＨＶＴをコントロールとして用いた。
各群１０羽以上の試験用ＳＰＦ鶏（ＬｉｎｅＭ：日本生物科学研究所）に、ＰｅｃプロモーターまたはＣＭＶプロモーターに制御されるＶＰ２遺伝子を発現する組み換えＨＶＴを接種した。陽性対照群にはＩＢＤＶの市販のワクチンを接種し、陰性対照群は非接種とした。
【００６８】
試験用ＳＰＦ鶏が孵化したとき、各組み換えＨＶＴを鶏の背部皮下に１０^４ＰＦＵとなるように２６Ｇの注射針をつかって接種した。陽性対照群に使用した市販のＩＢＤＶワクチン（北里研究所）は、１６日齢の雛に用法通り点眼接種した。
【００６９】
生ワクチン接種１７日後に、各群の雛に超強毒ＩＢＤＶ（Ｏｋａｙａｍａ株）を１．５×１０^３ ^.8ＥＩＤ_５ ₀となるように経口でチャレンジした。チャレンジ後約３日までの鶏の生死を観察した。その後生存した鶏を屠殺し、ＩＢＤＶの発症の有無をファブリキウス嚢の病変形成状態を指標として効果を判定した。ファブリキウス嚢の病変形成状態は、出血（Ａ）、嚢内チーズ様浸出物形成（Ｂ）、黄色病変（Ｃ）、ゼリー様浸出物形成（Ｄ）、水腫（Ｅ）の５点で判定した。各病変スコアは、病変を示した鶏羽数で表した。
結果は表３に示した。
【００７０】
【表３】

【００７１】
ファブリキウス嚢体重比について各群間で統計的処理（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｅｎｅｙＵ−ｔｅｓｔ）で有意差検定を実施したところ、ＣＭＶ−ＶＰ２接種群および市販ワクチン接種群は非接種対照群と有意差（ｐ＜０．０５）を示したが、ＨＦ−ＰｅｃＶＰ２接種群はさらに強い有意差（ｐ＜０．０１）を示した。この結果から明らかなように、本発明によるプロモーターを有する組み換えＨＶＴを接種した群では従来のプロモーターを有する組み換えＨＶＴに比較してより効果の良いスコアを示した。また、このスコアは市販ワクチン接種よりもより高い感染防御効果を示していることがわかった。
【００７２】
【発明の効果】
本発明によれば、必要領域が短く高活性かつ安全で安定な新規プロモーターが提供され、そのプロモーターを含む組み換えベクター、および組み換えベクターを利用し創出される組み換えウイルス、組み換えウイルスを主成分とする遺伝子組み換えワクチン、あるいは組み換えＤＮＡワクチンが提供される。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> NIPPON ZEON Co. Ltd.,
<120> Novel Promoter, Recombinant Thereof, and the Uses Thereof
<130> pec promoter ID01-18
<140>
<141>
<160> 18
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 159
<212> DNA
<213> chicken
<400> 1
ggggcggggc caggggcggg gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag 60
cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa 120
gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc gttgccttc 159
<210> 2
<211> 102
<212> DNA
<213> chicken
<400> 2
tgtcgaggcg cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag 60
ggacttcctt tgtcccaaat ctggcggagc cgaaatctgg ga 102
<210> 3
<211> 561
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Pec Promoter
<400> 3
agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 60
gttacataac ttacggtaaa tggcccgccg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 120
cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 180
gggtggagta tttacggtaa actgcccatt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 240
tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggatgcag tattttgtgc agcgatgggg 300
gcgggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc 360
gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat 420
ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc 480
tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct 540
ctgactgacc gcgtctagag g 561
<210> 4
<211> 1495
<212> DNA
<213> chicken
<400> 4
gctgcagctc agtgcatgca cgctcattgc ccatcgctat ccctgcctct cctgctggcg 60
ctccccggga ggtgacttca aggggaccgc aggaccacct cgggggtggg gggagggctg 120
cacacgcgga ccccgctccc cctccccaac aaagcactgt ggaatcaaaa aggggggagg 180
ggggatggag gggcgcgtca cacccccgcc ccacaccctc acctcgaggt gagccccacg 240
ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttttt 300
tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg 360
gggcggggcc aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc 420
ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag 480
cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgcgcc 540
gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg 600
gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag cgcttggttt aatgacggct cgtttctttt 660
ctgtggctgc gtgaaagcct taaagggctc cgggagggcc ctttgtgcgg gggggagcgg 720
ctcggggggt gcgtgcgtgt gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggcc cgcgctgccc 780
ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg gggctttgtg cgctccgcgt gtgcgcgagg 840
ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggc tgcgagggga acaaaggctg 900
cgtgcggggt gtgtgcgtgg gggggtgagc agggggtgtg ggcgcggcgg tcgggctgta 960
acccccccct gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg cccggcttcg ggtgcggggc 1020
tccgtgcggg gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg ggggtggcgg caggtggggg 1080
tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc gggggagggg cgcggcggcc 1140
ccggagcgcc ggcggctgtc gaggcgcggc gagccgcagc cattgccttt tatggtaatc 1200
gtgcgagagg gcgcagggac ttcctttgtc ccaaatctgg cggagccgaa atctgggagg 1260
cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa 1320
tgggcgggga gggccttcgt gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccat ctccagcctc 1380
ggggctgccg cgggggaccg ctgccttcgg gggggcgggg cagggcgggg ttcggcttct 1440
ggcgtgtgac cggcggggtt tatatcttcc cttctctgtt cctccgcagc cagcc 1495
<210> 5
<211> 599
<212> DNA
<213> cytomegalovirus
<400> 5
ctgcagagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag 60
ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 120
ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 180
cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 240
atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 300
cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 360
attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca 420
cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat 480
caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg 540
cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctggtttag tgaaccgtca gatatgcat 599
<210> 6
<211> 101
<212> DNA
<213> Rous sarcoma virus
<400> 6
ctgcagaatt ccgcattgca gagatattgt atttaagtgc ctagctcgat acaataaacg 60
ccatttgacc attcaccaca ttggtgtgca cctccatgca t 101
<210> 7
<211> 269
<212> DNA
<213> Simian virus 40
<400> 7
caattggatc tgctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 60
gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc 120
ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata 180
gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg 240
ccccatggtt cagatcctct agggaattc 269
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PrBac1
<400> 8
cagtgtcgct gcagctcagt gcatgcacgc tcattgccc 39
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PrBac2
<400> 9
gctctagagt cgacaagctt catggctggc tgcggaggaa cagagaaggg 50
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:non
<400> 10
tttctgcagt attttgtgca gcgat 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:non2
<400> 11
acgtctagaa ggcaacgcag cgact 25
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:non3
<400> 12
ctgtctagat aacgcggtca gtcaga 26
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PrVP2-2
<400> 13
gcggatcccc cgcagcgatg acgaacctgc 30
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PrVP2-3
<400> 14
gcgtcgactc acctccttag ggccc 25
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:prF1
<400> 15
gctctagagg atccgcatgg gctccagatc ttctaccagg atccc 45
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:prF2
<400> 16
gcgagctcgg tccatgactg aagactgcta ttgg 34
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PrHN1
<400> 17
gcggatcctc ttcagtcatg gaccgcgcag ttagccaagt tgcgc 45
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:PrHN2
<400> 18
gcggtaccgc atgcgggccc gctagcgagc tcgcgccggt actcagtttg attcttggcg 60
【図面の簡単な説明】
【図１】切り縮めたプロモーターの相対活性を示した図である。尚、図中１５００番目は切り縮める前のβ−アクチンプロモータの活性であり、この活性を基準（１．０）とした。
【図２】プロモーターとエンハンサーの連結様式と相対活性を示した図である。
【図３】本発明のプロモーターと従来のプロモーターとの相対活性を示した図である。[0001]
[Technical field to which the invention belongs]
The present invention relates to a novel DNA molecule having promoter activity and use thereof.
[0002]
[Prior art]
In recent years, the use of a live vaccine type in which a recombinant such as a recombinant virus is directly inoculated into a living body has been studied (Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-078764). When these recombinant viruses are used as vaccines, a multivalent recombinant is obtained by inserting antigen genes derived from multiple pathogenic viruses into one virus (hereinafter sometimes referred to as a parent virus), and this is used for a multivalent vaccine. Is possible (JP-A-9-00979, etc.). In practice, however, such multivalent recombinant vaccines have not been put to practical use. As pointed out in Tissue Culture, Vol. 14, No. 4, pp. 107-111, published in 1988 and Japanese Patent Laid-Open No. 10-327871, multiple antigen genes are inserted into one viral genome. Recombinant viruses, which are multivalent recombinants with a large and enlarged genome, are caused by problems such as reduced growth and loss of inserted genes. Usually, only a few percent of genes can be inserted into the parent virus genome. Therefore, in order to suppress the enlargement of the genome, a method of deleting a non-essential region of the parent virus genome and inserting an antigen gene or the like is widely used, but other methods of shortening the inserted gene are also conceivable. ing.
[0003]
In general, a functional gene such as a promoter is inserted in addition to an antigen gene into a recombinant. Since one promoter is usually required for one antigen gene, the number of inserted promoters increases as the number of inserted antigen genes increases. Therefore, in order to prevent enlargement of the parent virus genome, it is necessary to shorten the inserted promoter.
[0004]
By the way, there is one having a region called an intron in the downstream region of the promoter. In general, it is said that the presence of an intron region increases promoter activity (Gross, MK, Kainz, MS and MerRIll, GF (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 4576-, Buchman, AR and Berg, P. (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 4395-, Evans, MJ and Scarpulla, RC (1989) Gene 84, 135-, Huang M. T. F. and Gorman, C. M. (1990) Nucl. Acids Res.
[0005]
The full length of chicken-derived β-actin promoter known as a high expression promoter is as long as about 1.5 kbp (Kost, TA, Theodorakis, N. and Hughes, SH (1983) The nucleotide sequence of. the chic cytoplasmic beta-actin gene.Nucleic Acids Research 11: 8287-301). In order to further increase the expression level of this chicken-derived β-actin promoter, it has been proposed to add a splicing acceptor sequence, an enhancer sequence, etc. to this promoter (Japanese Patent Laid-Open Nos. 2-156871 and 2). 3-168081, JP-A-7-298877, etc.). However, such a high expression promoter research flow does not meet the requirement for constructing a multivalent recombinant that shortens the above-mentioned inserted gene.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
As a result of diligent research to obtain a highly expressed promoter with a short overall length under such conventional techniques, the present inventors have found that chicken-derived β-actin is lacking in the intron portion that has been said to be effective for high expression so far. The inventors have found that a promoter can realize high expression and have completed the present invention.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
  Thus, according to the present invention,1st to 555th base sequence described in SEQ ID NO: 3 or a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequenceA DNA molecule having promoter activity (hereinafter, these may be collectively referred to as the promoter of the present invention) is provided, and a recombinant having the DNA molecule and a gene encoding a foreign protein is provided. A vaccine comprising the body as an active ingredient is provided.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  The DNA molecule of the present invention comprisesDNA molecule having the first to 555th base sequence described in SEQ ID NO: 3 or a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequenceIt is. Moreover, the DNA molecule of the present invention has promoter activity.
  This DNA molecule has the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or has homology thereto, and has no homology with the base sequence described in SEQ ID NO: 2.The base sequence described in SEQ ID NO: 1 has high homology with the base sequence present on the 5 ′ side of the chicken-derived β-actin promoter, and the base sequence described in SEQ ID NO: 2 is 3 of the chicken-derived β-actin promoter. 'Highly homologous to sequences in introns near the ends. Therefore, the DNA fragment of the present invention having no homology with the base sequence described in SEQ ID NO: 2 is a promoter different from the known β-actin promoter.
[0009]
  As the DNA molecule of the present invention, ArrangementDNA fragment having the base sequence described in column number 3ChildCan be mentioned.
[0010]
The DNA molecule described in SEQ ID NO: 3 can be obtained by DNA synthesis or the like, and on the 5 ′ side of the DNA molecule described in SEQ ID NO: 1, an IE promoter of cytomegalovirus (hereinafter sometimes referred to as CMV) (hereinafter referred to as “CMV”). It may be simply referred to as a CMV promoter, which can also be obtained by adding a part of Boshart, M. et al (1985) Cell 41, 521-).
[0011]
In addition, the DNA molecule of the present invention has at least homology with a DNA molecule comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1, does not have homology with the base sequence described in SEQ ID NO: 2, and the DNA molecule described in SEQ ID NO: 1 As long as it has a promoter activity equal to or higher than that of the DNA, a base may be substituted, deleted, or added by a conventional method (an example is the DNA molecule described in SEQ ID NO: 3). The full length of the DNA molecule is 120 to 850 bp, preferably 150 to 600 bp, particularly preferably 150 to 350 bp from the viewpoint of sufficiently exerting the function as a promoter.
[0012]
Further, since the base sequence represented by TATAAA is a signal region for initiation of transcription and is essential for the promoter of the present invention, for example, this region cannot be changed even when the DNA molecule described in SEQ ID NO: 1 is modified.
The upper limit of the number of bases on the 3 ′ end side from the most 5 ′ base T (thymidine) of this partial base sequence is 200 bp, preferably 180 bp, more preferably 150 bp, particularly preferably 120 bp, and the lower limit is 30 bp. When it is preferably 50 bp, particularly excellent promoter activity is exhibited.
[0013]
In the present invention, “having homology” means sequence database software “DNASIS” using the algorithm of Lipman and Pearson (Science, 227, 1435- (1985) (distributor: Takara Shuzo Co., Ltd., manufacturer: Hitachi Software Engineering) Means that the score calculated by means of 200 is not less than 200. In the present invention, “having no homology” means that the score calculated by the software is not more than 100.
[0014]
In the present invention, the “promoter activity” is an activity that promotes the expression of a gene downstream of the DNA molecule, and the measurement method is a recombinant in which a marker gene such as a luciferase gene is inserted downstream of a DNA region considered to be a promoter. And a general method for measuring the expression level of the marker gene product may be used.
[0015]
More specifically, the following procedures are illustrated.
A plasmid vector in which a marker gene is inserted downstream of the DNA sequence whose promoter activity is to be measured is prepared. As this marker gene, a luciferase gene is preferable in terms of ease of sample preparation and measurement. This plasmid is not particularly limited as long as it does not contain the same marker gene in other regions, and the same plasmid as exemplified in the explanation of the recombinant described later can be used.
[0016]
Using this recombinant plasmid, a recombinant vector is prepared according to a conventional method. The produced vector is introduced into the cell. The cell used here may be a cell that does not contain a luminescent substrate, a luminescent enzyme, etc., if a promoter is transcribed and a substance that affects measurement of a marker enzyme, luciferase, is taken as an example.
[0017]
The cells thus introduced with the gene are cultured for a certain period of time, and then the protein expressed by the marker gene is extracted and collected. The culture time can be arbitrarily set depending on the marker gene. In the case of luciferase, it is within 10 days to 5 days, preferably within 18 hours to 3 days, and more preferably after about 24 hours. If the culture time is too short, it is before the promoter activity appears completely, and if it is too long, the expressed protein is degraded and the promoter activity cannot be measured correctly.
[0018]
The activity of the collected marker gene product is measured, the amount of marker gene product per culture volume is calculated, and the amount of promoter per fixed cell is converted. When luciferase is used as a marker gene, a luminometer is preferably used for measuring the expression level. First, a known concentration of luciferase is measured, and a standard straight line for conversion between the amount of luciferase and the value that can be read from the luminometer is obtained. From this standard line, the amount of luciferase is converted. According to this method, the promoter strength can be measured by converting the amount of the marker gene product.
[0019]
(2) Recombinant
The recombinant of the present invention has the above-described promoter of the present invention and a gene encoding a foreign protein (hereinafter referred to as a foreign gene) downstream thereof.
In the present invention, the recombinant is a recombinant vector such as a recombinant virus or a recombinant plasmid. The recombinant virus is not particularly limited, but it is preferable that the DNA is replicated in the eukaryotic nucleus. As specific examples, the recombinant virus is preferably a recombinant adenovirus or a recombinant herpesvirus, and particularly preferably a recombinant herpesvirus such as a recombinant turkey herpesvirus or a recombinant Marek's disease virus.
[0020]
The recombinant virus is prepared as follows, for example. An antigen gene of another pathogen is incorporated into a non-essential region of the viral genome cloned into the vector together with a promoter that functions in the virus. By introducing the vector into a virus-infected cell, homologous recombination is caused, and the resulting recombinant virus is selected and purified. Here, as the non-essential region, it is desirable to select a genomic region that does not cause a decrease in growth in vivo even when a foreign gene is inserted, or has a small decrease.
[0021]
When a recombinant virus is used as a vaccine, an antigen gene is used as a foreign gene to be incorporated. A specific manufacturing method is as follows.
That is, by introducing a recombinant vector into cells previously infected with a virus by, for example, calcium phosphate coprecipitation method, electroporation method, gene gun insertion, lipofectin method, etc., the vector and viral genomic DNA in the infected cell Homologous recombination occurs between them, and a recombinant virus is constructed. Alternatively, a recombinant virus can also be constructed by introducing a recombinant vector into a cell with the infectious viral genomic DNA by the above method.
[0022]
The obtained recombinant virus is infected with a host cell cultured in a medium such as Eagle MEM, and is grown by a hybridization method using the incorporated antigen gene as a probe or expression of a marker gene incorporated together with the antigen gene. Purify candidate strains from the coming plaques. That the candidate strain is the target recombinant virus can be confirmed by a method such as immunoassay using an antibody against the polypeptide encoded by the incorporated antigen gene. For example, in the case of a recombinant virus in which the lacZ gene is incorporated as a marker gene, β-galactosidase is expressed. Therefore, blue plaques are formed in the presence of Bluo-gal (GIBCO-BRL), which is one of the substrates, and can be selected and purified using its properties.
The host cell is not particularly limited as long as the virus to be used can be infected and propagated. For example, when a recombinant turkey herpesvirus is used, CEF cells, embryonated chicken embryo membrane cells, etc. Can be mentioned.
[0023]
(Virus)
The virus (parent virus) used to make the recombinant virus may be any virus that grows in the nucleus of a eukaryote, but can grow in poultry cells such as chickens, turkeys, ducks, etc. Examples include viruses, herpes viruses such as turkey herpes virus (hereinafter sometimes referred to as HVT), Marek's disease virus (hereinafter sometimes referred to as MDV), and infectious pharyngeal tracheitis virus (hereinafter also referred to as ILTV). Is done.
[0024]
Specific examples of herpes viruses include FC126 (ATCC VR-584B), PB-THV1, H-2, YT-7, WTHV-1, HPRS-26 and the like in HVT. For example, the FC126 strain is preferably used. can do. Specific examples of MDV include CVI988 and SB1.
The viruses exemplified here can be obtained from depository institutions, commercial vaccines or from institutions such as the American Type Culture Collection (ATCC).
[0025]
(Vector containing non-essential regions)
A vector for cloning a non-essential region of a virus used for construction of a recombination vector is not particularly limited. For example, vectors such as plasmids such as pBR322, pBR325, pUC7, pUC8, and pUC18, phages such as λ phage and M13 phage, and cosmids such as pHC79 may be treated with appropriate restriction enzymes to incorporate the non-essential region of the virus. .
[0026]
(Non-essential area)
The non-essential region of the virus is a region that can undergo homologous recombination with the parent virus genome and is not particularly limited as long as it is a region that is not essential for the growth of the parent virus. As such a non-essential region, a known one can be used, and for example, an intergenic region described in WO99 / 18215 can be used. More specifically preferred non-essential regions include the region between the UL45 gene and the UL46 gene of turkey herpesvirus.
[0027]
(Antigen gene)
The antigen gene may be any gene as long as the recombinant virus can be transcribed and translated in an infected cell and expressed as an antigen protein. For example, a gene encoding the HN protein of Newcastle disease virus (hereinafter sometimes referred to as NDV) ( Miller et al., J. Gen. Virol., 67, 1917-1927 (1986)), a gene encoding F protein (McGinnes et al., Virus Res., 5, 343-356 (1986)), MDV glycoprotein gB. The gene encoding the structural protein VP2 of the encoding gene (Ross et al., J. Gen. Virol., 70, 1789-1804 (1988)) and infectious bursal disease virus (hereinafter sometimes referred to as IBDV) (Bayliss et al. J. Gen. Virol. 71, 1303-1313 (1990)), mycoplasma (hereinafter sometimes referred to as MG) adhesin protein, HMW-related protein, 40K protein (WO93 / 24646), 66K protein, 67K protein, etc. (WO97 / 03187) Infectious laryngotracheitis virus gB protein (Poulsen et al., Virus Genes 5, 335-347 (1991), USP 5,443,831), UL32 protein (WO 98/07866), etc. A gene encoding the antigen is preferred.
[0028]
Among these antigen genes, the IBDV VP2 protein, etc., is known to vary greatly among strains, but the inserted gene is not specified by the strain, and is a Japanese highly toxic strain. , Okayama strain, Ehime strain, Tokushima strain, European extremely virulent strain UK661, American virulent strain STC strain and Virulent E strain, etc. (Yamaguchi T. et al., Arch Virol., 142, 1441) -1458 (1997)).
[0029]
(Recombination vector)
The recombination vector used in the present invention is one in which an antigen gene and a promoter governing it are inserted into a non-essential region. What is necessary is just to insert the above-mentioned antigen gene and the promoter of the present invention governing it into the above-mentioned non-essential region. Furthermore, a marker gene such as an lacZ gene derived from E. coli may be incorporated together with a promoter for efficiency such as purification of recombinant virus.
[0030]
(promoter)
The promoter used in the present invention is the promoter of the present invention described above. This promoter is inserted in the viral genome so that the antigen gene is located downstream of the promoter so as to control the expression of the foreign gene described above.
When inserting a marker, a promoter that controls the expression of the marker is used. The promoter used here is not particularly limited as long as it functions as a promoter in a recombinant virus-infected host.
[0031]
(Enhancer)
  Furthermore, the recombinant of the present invention contains an enhancer sequence in the promoter according to claim 1.It isTheFor short-length promotersEven if an enhancer is included, gene loss is unlikely to occur.
[0032]
(3) Vaccine
The live vaccine utilizing the present invention is a vaccine containing one or more of the recombinants of the present invention described above, which is an active ingredient. That is, the recombinant of the present invention, preferably a recombinant virus, can be used alone or in combination of two or more. In addition, the vaccine of the present invention may be combined with other vaccines. Here, as other vaccines that can be combined, for example, recombinant avipox virus, which is an anti-NDV vaccine described in JP-A-2-157811 and JP-A-3-27284, JP-A-6-78764, and US Patent Examples include recombinant vaccines such as recombinant avipox virus, which are anti-MDV vaccines described in application 08 / 499,474, and turkey herpesvirus vaccines used as anti-MDV vaccines.
In addition to the recombinant, a carrier having no pharmacological problems, such as physiological saline, a stabilizer, and the like, may be included.
[0033]
In the case of using a recombinant virus, this vaccine is prepared by infecting the infected cell with a cell capable of growing the virus (hereinafter referred to as a host cell), proliferating the virus, collecting the infected cell, and Prepare as A case of a live vaccine of HVT will be described as an example.
As a host cell, a cell derived from a bird is preferable, and a chicken embryo fibroblast (CEF), a chicken kidney cell, etc. can be used conveniently. After infecting such a host cell and propagating the virus, the cell is peeled off with a scraper or trypsin and separated into an infected cell and a supernatant by centrifugation. The obtained infected cells are suspended in a culture medium containing 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and stored frozen in the presence of liquid nitrogen. When used as a vaccine, the cryopreserved product is dissolved in a 100-fold amount of phosphate buffer.
[0034]
The stabilizer and other components for preserving the infected cells under liquid nitrogen are not particularly limited as long as the virus-infected cells can stably survive and are pharmacologically acceptable for the recipient.
[0035]
The administration method of the vaccine of this invention is not specifically limited. In the case of a live vaccine of HVT, a method of inoculating by subcutaneous injection is generally used and is the same as the current HVT vaccine. The inoculation amount may be the same as the conventional vaccine, 10-10⁵TCID₅₀Preferably 10% subcutaneously on the back of the chicken at the first day of age.³TCID₅₀It is an inoculation.
[0036]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
[0037]
(Example 1) Construction and activity measurement of highly active Pec promoter
1-1 truncated β-actin promoter
A fragment obtained by treating plasmid pGIMICSplyASfi (full length 2773 bp) introduced with a polyA addition signal and SfiI site into the multicloning site of pUC18 described in WO99 / 18215, with a restriction enzyme NheI, and Picagene enhancer 2 (full length 5064 bp) Toyo Ink Co., Ltd.) was ligated with 1721 bp obtained by cutting out with NheI and XbaI to prepare plasmid pLUC-pro (full length 4494 bp).
[0038]
Next, a chicken genome bank was prepared, and using this as a template, the primer PrBac1 (5′-CAGTGTGCCGTCAGCTCAGTGCATGCACGCCTCATTGGCGCAGGATGAGGCAGGATGAGGCAGGATGGCGAGCAGGATGGCAGAGGCTGAGGCAGGCTGAGGCAGGCTGAGGG The DNA fragment (about 1.5 Kbp) containing the β-actin promoter was obtained by PCR.
[0039]
An approximately 1.5 Kbp DNA fragment obtained by treating this fragment with PstI and XbaI and a 4482 bp DNA fragment obtained by treating pLUC-pro with PstI and XbaI were ligated to form a β-actin promoter. PLUC-bac (5986 bp) containing the region was prepared.
[0040]
After the obtained pLUC-bac was treated with BamHI and BglII, a 5958 bp fragment was recovered and ligated to prepare pLUC-bac-Sma. This pLUC-bac-Sma was treated with PstI and SmaI for 5'-side truncation and SacI and XbaI for the 3'-end side. Subsequently, the obtained DNA fragment was reacted with ExoIII for 3 minutes using a deletion kit for Kilo-Sequence (manufactured by Takara), and a sample was taken every other minute and contained a promoter fragment of about 200 bp to about 1500 bp. A number of plasmids were obtained.
[0041]
For the measurement of luciferase activity, “Piccagene” manufactured by Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd. (distributor: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used. First, 1 μg each of 29 of these plasmids was 2 × 10⁶A gene was introduced into each cell under conditions of 1.2 kV and 0.4 msec using Gene Pulser (Bio-Rad) at room temperature using a 0.4 cm gap cuvette.
After culturing for about 24 hours, the culture solution was discarded and a cell lysate was added, followed by freezing at −80 ° C. for 1 hour to completely thaw the cells. A sample for measuring the supernatant activity obtained by centrifuging the obtained liquid was used. Add 10 μl of sample to the substrate solution attached to the kit described above, dispensed 100 μl each, and after 1 minute, using a luminometer (model number “model11253”, manufactured by Bio-Rad), intensity of light emission (unit: RLU) The amount of luciferase produced was calculated from the above, and the promoter activity was examined (see FIG. 1).
[0042]
Assuming that the production amount of luciferase of the full-length β-actin promoter is 1, as shown in FIG. 1, the 5′-truncated sample showed a sharp decrease in activity although it lacked 120 bp or more on the 5′-side from the TATAAA sequence.
On the other hand, there was no correlation between the shortened length and the activity, and the activity was highest when the length was shortened by about 850 bp. On the other hand, in the truncated sample less than 100 bp, the activity was only 0.2 times the full length.
[0043]
1-2 Core sequence promoter
Using the β-actin promoter of pLUC-bac as a template, 5′-TATTTTGTGCAGCGGAT-3 ′ described in SEQ ID NO: 10, 5′-ACGTCTAGAGAGCACAGCAGCGACT-3 ′ described in SEQ ID NO: 11, and 5′-CTGTCTAGATAACCGCGGTCAGTCAGA-3 ′ described in SEQ ID NO: 13 As a result of PCR using primers, fragments of 175 bp and 163 bp in addition to 273 bp and 211 bp were also obtained.
The obtained DNA fragment was named a core sequence promoter (COA). A DNA fragment obtained by treating these COAs with PstI and XbaI and a fragment of about 4482 bp obtained by treating pLUC-pro with PstI and XbaI were ligated to obtain a plasmid. The obtained plasmids were named pULC-COA273, pLUC-COA211, pULC-COA175, and pLUC-COA163, respectively.
Using the obtained plasmid, the activity of the promoter was measured in the same manner as in the above method 1-1. As a result, assuming that the luciferase production amount of the full-length β-actin promoter was 1, it was 0.97 at 273 bp and 0.76 at 211 bp. It was 0.96 at 175 bp and 0.34 at 163 bp.
[0044]
1-3 Addition of enhancer region
The enhancer derived from CMV (590 bp) described in SEQ ID NO: 5 and the enhancer derived from RSV described in SEQ ID NO: 6 (90 bp) were inserted into the PstI site located upstream from the promoter in the plasmid pLUC-COA273. These are added with 6 bases of CTGCAG on the 5 'side and 6 bases of GAATTC on the 3' end side for insertion into the plasmid.
The enhancer (200 bp) derived from SV40 described in SEQ ID NO: 7 was inserted into the EcoRI site located downstream of the luciferase gene of plasmid pLUC-COA273.
When these promoter-added plasmids were measured for the promoter activity determined by the amount of luciferase produced by the same method as described above, the activity increased by 1.4 times for the plasmid having RSV enhancer and 3.6 times for the plasmid having SV40. This was confirmed (see FIG. 2).
For the CMV enhancer, a truncated DNA fragment was prepared. Specifically, 7th to 370th of SEQ ID NO: 5, 7th to 282th of the same sequence, 7th to 159th of the same sequence, 7th to 89th of the same sequence DNA fragments 93 to 370 of the same sequence and 93 to 282 and 93 to 159 of the same sequence were prepared, and these fragments were obtained from the promoter in the plasmid pLUC-COA273. It was inserted into the upstream PstI site, and the influence on the promoter activity was confirmed. As a result, the effect of promoting activity was different depending on the region to be inserted, but when the 275 bp of the 7th to 282nd sequences described in SEQ ID NO: 5 was added, the promoter activity showed the highest activity of 6.5 times.
[0045]
The plasmid having the highest activity contains a chimeric DNA region consisting of a CMV 275 bp enhancer and a core sequence 273 bp promoter. The size of the chimeric DNA region (Pec (+)) consisting of this enhancer and promoter is 557 bp. Further, in this chimeric DNA region, a 555 bp chimeric DNA in which T is deleted from the BglI site (GCCCGCCCTGGC) on the 5 ′ side and C between A and T on the BglI site (GCCCACTTGGC) on the 3 ′ end is deleted. A plasmid pLUC-Pec (full length 5037 bp) containing the region was also prepared. All plasmids exhibited activity several times higher than that of RSV or CMV promoter, which are promoters for exogenous genes of conventional recombinant HVT (see FIG. 3).
[0046]
(Example 2) Construction of recombinant vector
2-1 Construction of recombinant vector pNZ45 / 46Pec (+) VP2S for IBDV
A recombinant vector pNZ45 / 46PEC (+) VP2S for expressing VP2 of IBDV with a novel synthetic promoter Pec (+) was constructed according to the following procedure.
A DNA fragment containing a 120 bp multicloning site obtained by treating pGIMCSpolyASfi with the restriction enzyme BglI was inserted into pNZ45 / 46Sfi (full length 5486 bp, WO99 / 18215) treated with the restriction enzyme SfiI, and pNZ45 / 46MCSPolyA ( A total length of 5606 bp) was produced. Next, a DNA fragment (561 bp) containing the promoter Pec (+) region excised with restriction enzymes PstI and XbaI and a DNA fragment (3617 bp, 1977 bp) treated with restriction enzymes PstI and HindIII or HindIII and XbaI with pNZ45 / 46MCSpolyA, respectively. Three fragments were ligated to construct pNZ45 / 46Pec (+) MCSpolyA (full length 6155 bp).
[0047]
Three fragments (Virol. 223, 219-223, 1996) cloned from the pUC19SmaI site were obtained from Gifu University by cDNA synthesis from Okayama strain, which is an IBDV hypervirulent strain. These three fragments were connected using ClaI, SpeI, and BamHI to prepare pUC19SegA-OKYM having a total SegmentA length of about 3.2 Kbp. Using this pUC18SegA-OKYM as a template, the primer PrVP2-2 (5′-GCGGATCCCCGCCAGCGATGACGAACCCTGC-3 ′) described in SEQ ID NO: 13 and the primer PrVP2-3 (5′-GCGTCGACTACTCCCTCCTTAGGGGCCC-3 ′) described in SEQ ID NO: 14 were used. A DNA fragment containing only VP2 was obtained.
[0048]
This PCR fragment was excised with restriction enzymes BamHI and SalI and the VP2S gene of IBDV was inserted by ligation into a DNA fragment (6113 bp) treated with restriction enzymes BamHI and SalI with pNZ45 / 46Pec (+), and pNZ45 / 46Pec (+ ) VP2S (OKYM) (full length 7490 bp) was constructed.
[0049]
2-2 Construction of recombinant vector pNZ45 / 46PecFHN for NDV
A transfer vector pNZ45 / 46PecFHN for expressing the NDV F and HN genes with a novel synthetic promoter Pec was constructed by the following procedure.
A DNA fragment (559 bp) containing a Pec region excised from pLUC-Pec with restriction enzymes PstI and XbaI and a DNA fragment (2761 bp) obtained by treating pGICSPolyASfi with restriction enzymes PstI and XbaI were ligated, and pGIPec (full length 3320 bp) ) Was produced.
[0050]
Using XLIII10H (Virus Research, 7, 241-255 (1987)) as a template, the primer PrF1 (5′-GCTCTAGAGGAGCTCCGCATGGTCCCAGGATCTCCTACCAGGATCCCTG-3CT) described in SEQ ID NO: 15 and the primer PrF2 (5′-GATGGCTGCTCTGATCTGCTCTGACTCTGACTCT) ) To obtain a DNA fragment containing the F gene.
A region containing the NDV F gene (1889 bp) obtained by excising this DNA fragment with restriction enzymes SacI and XbaI was inserted into pGIPec treated with the same restriction enzyme by ligation to prepare pGIPecF (full length 5191 bp).
[0051]
Similarly, using XLIII10H as a template, primer PrHN1 (5′-GCGGATCCCTCTTCAGTCATGGGACCGCCGCATGGTCGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCT A DNA fragment containing the gene was obtained.
This DNA fragment was treated with BamHI and KpnI (1842 bp), and inserted by ligation into the same restriction enzyme-treated pGIPEc to prepare pGIPecHN (full length 5123 bp).
[0052]
The promoter and antigen gene region of pGIPEcF was excised by restriction enzyme BglI (2538 bp) and inserted into restriction enzyme SfiI of pNZ45 / 46Sfi (full length 5486 bp) to construct pNZ45 / 46PecF (full length 8024 bp), and then the promoter of pGIPEcHN Then, the antigen gene region was excised with the restriction enzyme BglI (2470 bp) and inserted into the restriction enzyme SfiI of pNZ45 / 46PecF to construct pNZ45 / 46PecFHN (full length 10494 bp).
[0053]
2-3 MG recombinant vector pNZ45 / 46Pec40KS
A transfer vector pNZ45 / 46Pec40KS for expressing the MG 40K gene with a novel synthetic promoter Pec was constructed according to the following procedure.
A region containing 1400 bp of MG excised with restriction enzymes BamHI and SalI from pGTPs40K-S (WO97 / 36924, full length 3967 bp) was inserted by ligation into pGIPec treated with the same restriction enzyme to produce pGIPec40KS (full length 4622 bp). did. The promoter and antigen gene region of pGIPec40KS was excised with the restriction enzyme BglI (1967 bp) and inserted into the restriction enzyme SfiI of pNZ45 / 46Sfi (full length 5493 bp) to construct pNZ45 / 46Pec40KS (full length 11405 bp).
[0054]
2-4 ILTV Recombinant Vector pNZ45 / 46PecILUL32gB A transfer vector pNZ45 / 46PecILUL32gB for expressing the IL32 UL32 and gB genes with a newly synthesized promoter Pec was constructed by the following procedure.
From the region (1760 bp) containing the UL32 gene of ILTV excised with restriction enzymes BamHI and SalI from pGTPsILUL32 (full length 4383 bp) described in WO98 / 07866, and pGTPsILgB (BglI-) (full length 5307 bp) described in WO98 / 07866 The region 2648 bp containing the gB gene excised with the restriction enzymes BamHI and KpnI was inserted into pGIPec treated with the same restriction enzyme as the restriction enzyme excised from the insertion region by ligation, and pGIPEILUL32 (full length 5038 bp) and pGIPEILgB (full length 5918 bp) were inserted. Produced. The pGIPecILUL32 promoter and antigen gene region was excised with the restriction enzyme BglI (2385 bp) and inserted into the restriction enzyme SfiI of pNZ45 / 46Sfi (full length 5493 bp) to construct pNZ45 / 46PecILUL32 (full length 7878 bp), and then pGIPEcILgBp PNZ45 / 46PecILUL32gB (total length 11143bp) was constructed by cutting out the promoter and antigen gene region of (3265 bp) with the restriction enzyme BglI (3265 bp) and inserting it into the restriction enzyme SfiI of pNZ45 / 46PecF.
[0055]
(Example 3) Construction purification of recombinant virus
For the plasmid described in Example 2, recombinant HVT was constructed and purified by the following purification method using the black plaque method.
First, DNA of wild-type HVT (hereinafter referred to as wtHVT) was prepared by the method of Morgan et al. (AVIAN DISEASES, 34: 345-351 (1990)).
The recombinant vector was processed into a linear form using a restriction enzyme site that is uniquely present in the backbone region.
[0056]
Gene transfer was performed by electroporation, specifically by the following method.
Recombinant vector DNA 5 μg and 25 μg HVT-DNA were added to 100 μl of Saline G (0.14 M sodium chloride, 0.5 mM potassium chloride, 1.1 mM disodium monohydrogen phosphate, 1.5 mM monosodium dihydrogen phosphate 0.5 mM chloride) Magnesium hexahydrate, 0.011% glucose). 2 × 10⁶Suspended chick embryo fibroblasts (CEF) in 0.7 ml of Saline G, added the above DNA solution, and at room temperature under conditions of 1.2 kV and 0.4 msec using Gene Pulser (Bio-Rad). The gene was introduced. After the cells were allowed to stand at room temperature for 10 minutes, Leibovitz's L-15 containing 4% bovine serum, McCoy's 5A Mediun (both manufactured by GIBCO BRL) (hereinafter referred to as LM (+)) were added, and 6 cm Diameter cell culture dish (Falcon) at 37 ° C., 5% CO₂The cells were cultured for 6 days in an incubator. The cells were appropriately diluted, mixed with CEF suspended in LM (+), dispensed into 96-well plate (Falcon), and cultured until plaques appeared. Two replica plates were prepared from each plate and similarly cultured until plaques appeared. One of them was fixed with methanol, and it was confirmed whether or not recombinant HVT was present by an antigen-antibody reaction using a rabbit antibody against the inserted gene as a primary antibody. Cells were collected from a replica corresponding to a well in which recombinant HVT was confirmed, diluted, mixed with CEF suspended in LM (+), dispensed into a 96-well plate, and cultured. This repetition of dilution, replica production, and confirmation of recombinant HVT was repeated until it was confirmed that the plaque derived from 1 well was almost 100% recombinant HVT. 10 of this recombinant HVT⁵After growing in CEF to about pfu, sonication treatment was performed, and the centrifugal supernatant was infected with CEF newly prepared in 96-well plate. Again, dilution and replica production were repeated until the recombinant HVT was 100%.
[0057]
When the recombinant vector pNZ45 / 46Pec (+) VP2S (OKYM) was used, recombinant HVT; HF016 (hereinafter sometimes referred to as HF-PecVP2) was prepared by purification by BPA method using an anti-VP2 protein rabbit antibody. . In addition, when the recombinant vector pNZ45 / 46PecFHN was used, recombinant HVT; HF018 (hereinafter sometimes referred to as HF-PecHNF) was prepared by purification by BPA method using an anti-NDV rabbit antibody. Similarly, when the recombinant vector pNZ45 / 46PecMG is used, the recombinant HVT; HF-Pec40KS is purified by the BPA method using an anti-MG40K protein rabbit antibody, and when the recombinant vector pNZ45 / 46PecILUL32gB is used, the anti-gB protein and UL32 are used. Recombinant HVT; HF-PecILT was prepared by purification by BPA method using protein rabbit antibody.
[0058]
The purified viral DNA was recovered by the method of Morgan et al., Treated with a restriction enzyme, and transferred to a nylon membrane after agarose electrophoresis. Southern hybridization was performed by the random primer method using the inserted antigen gene as a template.
As a result, it was confirmed that the inserted gene was correctly present in the recombinant virus as designed.
[0059]
(Example 4) Stability of inserted gene
The stability of the inserted gene was examined for recombinant virus over 5 passages without selection.
When the recombinant of HF-PecHNF was tested for purity by the BPA method using an anti-NDV antibody using the virus after passage, all plaques were positive just as before passage.
In addition, when Southern hybridization was performed using the homologous region used for recombination and the inserted gene as a probe, a band was detected at the same position as before passage, with the theoretical size obtained when correct recombination occurred. It was confirmed that these inserted genes exist stably in the virus.
[0060]
(Example 5) Confirmation of inserted gene expression by immunofluorescence antibody method
Immunofluorescence antibody method was performed for HF-Pec40KS and HF-PecILT. Each recombinant is infected with CEF, cultured at 37 ° C. until plaques appear, fixed with cold acetone, and diluted with anti-40K rabbit antibody or anti-UL32, anti-gB rabbit antibody as a primary antibody 100 to 1000 times And reacted. These cultured cells were further reacted with an anti-rabbit immunoglobulin conjugated with a fluorescent substance (FITC), and after washing away non-specific reaction parts, they were observed under a microscope under fluorescence excitation wavelength light. The reactivity is shown in Table 1.
[0061]
[Table 1]

[0062]
From this result, it was found that the antigen gene was very well expressed by the promoter according to the present invention.
[0063]
(Example 6) Chicken infection prevention test
6-1 Effect experiment on NDV
In order to determine the vaccine effect of the recombinant HVT obtained by Example 3, a vaccine effect experiment was conducted.
A new promoter, recombinant HVT: HF-PecHNF, was inoculated to primary chickens born from 10 or more commercially available white leghorns (Decalb chicken, Kanagawa poultry federation). The positive control group contained a live NDV vaccine (NDV-B1
Strain) was inoculated, and the negative control group was not inoculated.
[0064]
Recombinant HVT is applied subcutaneously to the chicken's back 10³TCID₅ ₀Inoculated using a 26G needle. The commercially available NDV live vaccine used for the positive control group was instilled into 7-day-old chickens as indicated.
Four weeks after vaccination, each group of chicks received 10 highly virulent NDV (Sato strain).⁴The right thigh was challenged to become pfu. On day 4 after the challenge, the presence or absence of NDV was observed.
Moreover, blood was collected from each chicken before challenge with the NDV virus, and hemagglutination-inhibiting antibodies against NDV in the serum of each chicken were detected. The determination was made according to the instruction manual of a commercially available NDV hemagglutinin (Nippon Bioscience Institute).
The results are summarized in Table 2.
[0065]
[Table 2]

[0066]
The initial HI antibody titer is 2⁹Met.
As is clear from this result, the group inoculated with HF-PecHNF showed almost perfect vaccine effect against NDV challenge. In addition, the HI antibody titer at the time of challenge was clearly higher than that in the non-inoculated group (<2).
As is clear from these results, it was shown that the live vaccine by the recombinant HVT according to the present invention can confer sufficient infection protection to the migrating antibody chicken.
[0067]
6-2 Effect experiment of chicken vaccine on IBDV
In order to determine the vaccine effect of the recombinant HVT obtained in Example 3, a vaccine effect experiment against IBDV was performed. Recombinant HVT prepared in substantially the same procedure as in Examples 2 and 3 was used as a control except that the promoter sequence was CMV.
Recombinant HVT expressing VP2 gene controlled by Pec promoter or CMV promoter was inoculated into 10 or more test SPF chickens (LineM: Japan Bioscience Institute) in each group. The positive control group was vaccinated with a commercial vaccine of IBDV, and the negative control group was not vaccinated.
[0068]
When the test SPF chicken hatched, each recombinant HVT was placed under the chicken back 10⁴A 26G needle was used to inoculate the PFU. Commercially available IBDV vaccine (Kitasato Research Institute) used for the positive control group was instilled into 16-day-old chicks as needed.
[0069]
Seventeen days after live vaccination, each group of chicks received 1.5 × 10 supertoxic IBDV (Okayama strain).³ ^.8EID₅ ₀Orally challenged to become. The chickens were observed for life and death until about 3 days after the challenge. Thereafter, the surviving chickens were slaughtered, and the effect of IBDV onset was determined using the lesion formation state of the Fabricius sac as an index. The lesion formation state of the Fabricius sac was determined by five points: bleeding (A), intracapsular cheese-like exudate formation (B), yellow lesion (C), jelly-like exudate formation (D), and edema (E). Each lesion score was represented by the number of chicken wings that showed the lesion.
The results are shown in Table 3.
[0070]
[Table 3]

[0071]
When a significant difference test was performed by statistical treatment (Mann-Whitney U-test) between each group regarding the weight ratio of Fabricius sac, the CMV-VP2 inoculated group and the commercial vaccinated group were significantly different from the non-inoculated control group (p < 0.05), but the HF-PecVP2 inoculated group showed a stronger difference (p <0.01). As is clear from this result, the group inoculated with the recombinant HVT having the promoter according to the present invention showed a more effective score than the recombinant HVT having the conventional promoter. Moreover, it turned out that this score has shown the higher infection protection effect than commercial vaccination.
[0072]
【The invention's effect】
According to the present invention, a novel promoter having a short necessary region, high activity, safety and stability is provided, a recombinant vector containing the promoter, a recombinant virus created using the recombinant vector, and a gene based on the recombinant virus. Recombinant vaccines or recombinant DNA vaccines are provided.
[Sequence Listing]
SEQUENCE LISTING
<110> NIPPON ZEON Co. Ltd.,
<120> Novel Promoter, Recombinant Thereof, and the Uses Thereof
<130> pec promoter ID01-18
<140>
<141>
<160> 18
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 159
<212> DNA
<213> chicken
<400> 1
ggggcggggc caggggcggg gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag 60
cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa 120
gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc gttgccttc 159
<210> 2
<211> 102
<212> DNA
<213> chicken
<400> 2
tgtcgaggcg cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag 60
ggacttcctt tgtcccaaat ctggcggagc cgaaatctgg ga 102
<210> 3
<211> 561
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Pec Promoter
<400> 3
agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 60
gttacataac ttacggtaaa tggcccgccg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 120
cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat 180
gggtggagta tttacggtaa actgcccatt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag 240
tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggatgcag tattttgtgc agcgatgggg 300
gcgggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc 360
gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat 420
ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc 480
tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct 540
ctgactgacc gcgtctagag g 561
<210> 4
<211> 1495
<212> DNA
<213> chicken
<400> 4
gctgcagctc agtgcatgca cgctcattgc ccatcgctat ccctgcctct cctgctggcg 60
ctccccggga ggtgacttca aggggaccgc aggaccacct cgggggtggg gggagggctg 120
cacacgcgga ccccgctccc cctccccaac aaagcactgt ggaatcaaaa aggggggagg 180
ggggatggag gggcgcgtca cacccccgcc ccacaccctc acctcgaggt gagccccacg 240
ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttttt 300
tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg 360
gggcggggcc aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc 420
ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag 480
cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgcgcc 540
gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg 600
gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag cgcttggttt aatgacggct cgtttctttt 660
ctgtggctgc gtgaaagcct taaagggctc cgggagggcc ctttgtgcgg gggggagcgg 720
ctcggggggt gcgtgcgtgt gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggcc cgcgctgccc 780
ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg gggctttgtg cgctccgcgt gtgcgcgagg 840
ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggc tgcgagggga acaaaggctg 900
cgtgcggggt gtgtgcgtgg gggggtgagc agggggtgtg ggcgcggcgg tcgggctgta 960
acccccccct gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg cccggcttcg ggtgcggggc 1020
tccgtgcggg gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg ggggtggcgg caggtggggg 1080
tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc gggggagggg cgcggcggcc 1140
ccggagcgcc ggcggctgtc gaggcgcggc gagccgcagc cattgccttt tatggtaatc 1200
gtgcgagagg gcgcagggac ttcctttgtc ccaaatctgg cggagccgaa atctgggagg 1260
cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa 1320
tgggcgggga gggccttcgt gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccat ctccagcctc 1380
ggggctgccg cgggggaccg ctgccttcgg gggggcgggg cagggcgggg ttcggcttct 1440
ggcgtgtgac cggcggggtt tatatcttcc cttctctgtt cctccgcagc cagcc 1495
<210> 5
<211> 599
<212> DNA
<213> cytomegalovirus
<400> 5
ctgcagagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag 60
ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 120
ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 180
cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 240
atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 300
cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 360
attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg gtttgactca 420
cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat 480
caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat gggcggtagg 540
cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctggtttag tgaaccgtca gatatgcat 599
<210> 6
<211> 101
<212> DNA
<213> Rous sarcoma virus
<400> 6
ctgcagaatt ccgcattgca gagatattgt atttaagtgc ctagctcgat acaataaacg 60
ccatttgacc attcaccaca ttggtgtgca cctccatgca t 101
<210> 7
<211> 269
<212> DNA
<213> Simian virus 40
<400> 7
caattggatc tgctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 60
gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc 120
ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata 180
gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg 240
ccccatggtt cagatcctct agggaattc 269
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PrBac1
<400> 8
cagtgtcgct gcagctcagt gcatgcacgc tcattgccc 39
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PrBac2
<400> 9
gctctagagt cgacaagctt catggctggc tgcggaggaa cagagaaggg 50
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: non
<400> 10
tttctgcagt attttgtgca gcgat 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: non2
<400> 11
acgtctagaa ggcaacgcag cgact 25
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: non3
<400> 12
ctgtctagat aacgcggtca gtcaga 26
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PrVP2-2
<400> 13
gcggatcccc cgcagcgatg acgaacctgc 30
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PrVP2-3
<400> 14
gcgtcgactc acctccttag ggccc 25
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: prF1
<400> 15
gctctagagg atccgcatgg gctccagatc ttctaccagg atccc 45
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: prF2
<400> 16
gcgagctcgg tccatgactg aagactgcta ttgg 34
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PrHN1
<400> 17
gcggatcctc ttcagtcatg gaccgcgcag ttagccaagt tgcgc 45
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: PrHN2
<400> 18
gcggtaccgc atgcgggccc gctagcgagc tcgcgccggt actcagtttg attcttggcg 60
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the relative activity of a truncated promoter. The 1500th in the figure is the activity of the β-actin promoter before trimming, and this activity was used as the reference (1.0).
FIG. 2 is a diagram showing the ligation mode and relative activity of a promoter and an enhancer.
FIG. 3 is a diagram showing the relative activities of the promoter of the present invention and a conventional promoter.

Claims

A DNA molecule having promoter activity having a first to 555th base sequence described in SEQ ID NO: 3 or a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in the base sequence .

A recombinant comprising the DNA molecule according to claim 1 and a gene encoding a foreign protein.

The recombinant according to claim 2, wherein the recombinant is a virus.

The recombinant according to claim 3, wherein the foreign protein is a protein derived from a pathogen selected from the group consisting of Newcastle disease virus, infectious bursal disease virus, infectious laryngotracheitis virus, and mycoplasma.

A vaccine comprising the recombinant according to any one of claims 2 to 4 as an active ingredient.