JP4248900B2 - Novel gene encoding fructosylamine oxidase and method for producing fructosylamine oxidase using the same - Google Patents

Description

【００１０】
ヘモグロビンA1cの本来の定義であるβ鎖のN末端バリンの糖化部位を特異的に認識し、測定するためにフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、α鎖のＮ末端バリンの糖化部位であるフルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないヘモグロビンA1cの測定に適したフルクトシルアミンオキシダーゼである。しかしながらその酵素生産性は最大0.007ユニット/mlと非常に低く、実用化には酵素生産性の向上が必須である。また、生産性向上に利用できるこの酵素をコードする遺伝子については全く記載されていない。
【００１１】
【特許文献１】
特公平05-33997号公報
【特許文献２】
特公平6-65300号公報
【特許文献３】
特開平02-195900号公報
【特許文献４】
特開平03-155780号公報
【特許文献５】
特開平04-4874号公報
【００１２】
【特許文献６】
特開平05-192193号公報
【特許文献７】
特開平06-46846号公報
【特許文献８】
特開平02-195899号公報
【特許文献９】
特開平02-19590号公報
【特許文献１０】
特開平05-192193号公報
【００１３】
【特許文献１１】
特開平06-46846号公報
【特許文献１２】
特開昭61-268178号公報
【特許文献１３】
特開平3-155780号公報
【特許文献１４】
特開平4-4874号公報
【特許文献１５】
特開平5-192193号公報
【００１４】
【特許文献１６】
特開平7-289253号公報
【特許文献１７】
特開平8-154672号公報
【特許文献１８】
特開平5-192193号公報
【特許文献１９】
特開平7-289253号公報
【特許文献２０】
特開平6-46846号公報
【００１５】
【特許文献２１】
特開平10-33177号公報
【特許文献２２】
特開平10-33180号公報
【特許文献２３】
特開2000-300294号公報
【特許文献２４】
特開2001-95598号公報
【００１６】
【非特許文献１】
Chromatogr. Sci., 10:659(1979)
【非特許文献２】
Clin. Chem. 26:1598(1982)
【非特許文献３】
JJCLA 18:620(1993)
【非特許文献４】
Clin. Chim. Acta 127:87(1982)
【非特許文献５】
Clin. Chim. Acta 112:197(1981)
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、フルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼ、すなわち、カーブラリア属、ピレノケータ属およびアルスリニウム属等由来のフルクトシルアミンオキシダーゼを効率よく製造することができる方法を提供しようとするものである。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、フルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼを効率よく製造する方法として、カーブラリア属、ピレノケータ属およびアルスリニウム属等由来のフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子をクローニングすべく種々検討した結果、カーブラリア属、ピレノケータ属およびアルスリニウム属の微生物からフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするゲノムDNA及びcDNAをクローニングすることに成功し、本発明を完成させた。
【００１９】
従って本発明は、配列番号：２、配列番号：４又は配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードする遺伝子、すなわち、ゲノムDNA及びcDNAを提供する。
【００２０】
本発明はまた、配列番号：２、配列番号：４又は配列番号：６に示すアミノ酸配列中のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び/又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、且つフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を有する修飾されたフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードする遺伝子を提供する。
【００２１】
本発明はまた、配列番号：1、配列番号：３および配列番号：５に示す塩基配列を有する核酸のエクソン領域とストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができ、且つフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。
【００２２】
本発明はまた、前記の遺伝子を含んで成るベクター、特に発現ベクターを提供する。
本発明はさらに、前記ベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明はさらに、前記宿主を培養し、該培養物から、フルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼを採取することを特徴とする、フルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼの製造方法を提供する。
【００２３】
また、実質的に作用しない酵素とは測定したい基質に対する活性を100％とした時、測定対象としたくない基質に対する相対活性が例えば20％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下である酵素をいう。
【００２４】
【本発明の実施の形態】
本発明はまず、配列番号：２、配列番号：４又は配列番号：６に示すアミノ酸配列を有するフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードする遺伝子、すなわちゲノムDNA及びcDNAを提供する。
【００２５】
しかしながら、ある酵素がその酵素活性を発揮するには、生来のアミノ酸配列の全てがそのまま必要なわけではなく、活性の発現に必須の領域以外の領域においては、アミノ酸の欠失、付加、置換等によりアミノ酸配列が修飾されていても本来の酵素活性を発揮することが知られている。従って本発明は、配列番号：２、配列番号：４又は配列番号：６に記載のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び/又は置換により修飾されているアミノ酸配列を有し、且つフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を維持している修飾型フルクトシルアミンオキシダーゼをコードする遺伝子を提供する。
【００２６】
上記の修飾の程度は、PCR、部位特定変異誘発等、周知の技術により修飾できる程度であり、且つフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を喪失しない範囲である。例えば、配列番号：２、配列番号：４又は配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して、80%以上、85%以上、90%以上、又は95%以上の相同性を有するものである。
従って本発明はまた、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して、80%以上、85%以上、90%以上、又は95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を維持している修飾型フルクトシルアミンオキシダーゼをコードする遺伝子を含む。
【００２７】
一旦、酵素をコードする生来のゲノムDNA又はcDNAがクローニングされれば、該ゲノムDNA特にそのエクソン部分もしくはcDNA、又はそれらの一部をプローブとして用いることにより、同じ酵素活性を有する他の蛋白質をコードするDNAを選択することができる。従って、本発明は、配列番号：1、配列番号：３及び配列番号５に記載の塩基配列を有する核酸、例えばDNA、特にエクソン部分の配列を有する核酸、例えばDNA、例えば、ゲノムDNA又はcDNA、あるいはそれらの断片、例えば好ましくは15塩基以上、さらに好ましくは20塩基以上、例えば30残基以上の長さの断片とハイブリダイズすることができ、且つフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸も提供できる。
【００２８】
上記の場合のハイブリダイゼーション条件は、例えば、野村慎太郎、稲澤譲治著「脱アイソトープ実験プロトコール」p.40（秀潤社、1994）に記載の条件 (500mM NaPi 緩衝液(pH7.2), 7％ SDS, 1mM EDTA)である。上記ハイブリダイゼーションによるスクリーニングの対象となる核酸は特に限定される。例えば合成DNA や、生来のDNA を前記のごとく修飾したものでもよいが、天然のDNA 、例えば、ゲノムDNA やcDNAのライブラリーが好ましい。この様なDNA ライブラリーは、例えばカーブラリア属、ピレノケータ属およびアルスリニウム属の微生物等から、常法に従って調製することができる。
【００２９】
本発明のフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸、特にDNA は配列番号：１、配列番号：３、又は配列番号：５に示す塩基配列を有するゲノムDNA 又はそのエクソン部分のみから成るcDNAである。ゲノムDNA のクローニング方法の１例は、実施例１において具体的に記載する。
【００３０】
一旦、ゲノムDNA がクローニングされれば、該ゲノムDNA 、又はその１部分、特にエクソン部分のDNA をプローブとして、cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより本発明のフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするcDNAを得ることができる。
cDNAライブラリーの調製及びプローブハイブリダイゼーションによるそのスクリーニングは常法に従って行うことができる。cDNAライブラリーは、例えば前記の出発材料、例えばカーブラリア属、ピレノケータ属、アルスリニウム属微生物等から調製することができる。
【００３１】
また、修飾されたフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするDNA は、生来のゲノムDNA 又はcDNAを基礎とし、部位特定変異誘発、PCR 、ランダム変異、ジーンシャッフリング等の常法に従って行うことができる。また、１又は複数個のアミノ酸が欠失した短縮型酵素をコードするDNA は、生来のDNA に開始コドン及び／又は終止コドンを導入することによっても得られる。さらに、適当な制限酵素により、生来のDNAを切断することによっても得られる。
【００３２】
本発明はまた、上記のDNA を含んで成るベクター、特に発現ベクター、及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞に関する。フルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼを生産するための宿主細胞としては、フルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするDNA がゲノムDNA である場合にはスプライシング活性を有する宿主細胞である必要があり、真核性細胞、例えば真菌類、例えば酵母又は糸状真菌類、又は動物細胞、さらには植物細胞が使用される。
【００３３】
酵母としては例えばサッカロミセス(Saccharomyces) 属酵母、例えばサッカロミセス・セービシエー(Saccharomyces cerevisiae)等が挙げられ、糸状真菌類としては、例えばアスペルギルス属微生物、例えばアスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー、等が挙げられる。動物細胞としては、昆虫細胞、例えばカイコの細胞、哺乳類培養細胞、例えばCOS 細胞等が挙げられる。さらに植物細胞を用いることもできる。
【００３４】
さらに、フルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするDNA がcDNAである場合、上記の宿主の他に、原核性宿主、例えば細菌宿主を用いることができる。細菌宿主としては、例えば大腸菌(Escherichia coli)、バシルス(Bacillus)属細菌、例えばバシルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等の常用の宿主が用いられる。
【００３５】
発現ベクターは、宿主に応じて発現制御配列、例えばプロモーター、ターミネーター等を含有する必要がある。例えば、酵母用のプロモーターとしては解糖系酵素、遺伝子のプロモーター、Gal プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしてはAmyAプロモーター等が挙げられ、動物細胞用プロモーターとしてはウイルスプロモーター等が用いられる。また、細菌用プロモーターとしては、ウイルスベクター用プロモーター等が用いられる。
宿主としての細胞とそれに適合するベクター系の使用はすでに常用技術となっており、本発明においては、それらの既知の発現系を適宜選択して使用することができる。
【００３６】
本発明はまた、本発明のフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼの製造方法を提供する。本発明のフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼの製造方法によれば、本発明のフルクトシルバリルヒスチジンに作用し、フルクトシルバリルロイシンに実質的に作用しないフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするDNA を含んで成る発現プラスミドにより形質転換された宿主を培養する。宿主としては詳細に前記したものを使用し、常法に従って培養、好ましくは液体培養すればよい。
【００３７】
培養物もしくは菌体を水又は水性緩衝液、例えばリン酸緩衝液等により抽出することにより酵素含有水溶液が得られる。酵素含有液から酵素を採取、精製するには、酵素の精製のための常法を用いればよい。
例えば、塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等を組合せて使用することができる。
【００３８】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例 1. ピレノケータ エスピー（ Pyrenocaeta sp. ） YH807 （ FERM P-19210 ）フルクトシルアミンオキシダーゼをコードするゲノム DNA のクローニング
部分アミノ酸配列の決定
特願2003-の記載の方法に従って、ピレノケータ・エスピー（Pyrenocaeta sp.）YH807（FERM P-19210）から得た精製酵素の凍結乾燥品60μgを用い、常法（マイクロシークエンスのための微量タンパク質精製法、ｐ48-52、羊土社、1992年）に準じて、酵素の断片を得て、その配列を決定した。即ち、50μlの45mMジチオスレイトールを加え、50℃、15分間処理を行い、5μlの100mMヨードアセトアミドを加え、15分間放置した。
【００３９】
140μlの蒸留水を加え、1.0μgエンドプロテーナーゼLys-C（ロッシュ・ダイアグノスティックス製）を添加後、37℃、一晩インキュベートした。その断片化した酵素をHPLCにより分離し、各酵素断片を取得した。その各断片をN末端配列シークエンサー（島津製作所製 PPSQ-21）を用いて解析した。得られた配列は次のようになった。
【００４０】
断片（１）Val Xaa Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr Arg Phe Lys（配列番号：７）
断片（２）Glu Leu Phe Asn Arg Ala Met Xaa Trp Xaa Thr Asp Thr Ala Asp Ala Ala（配列番号：８）
断片（３）Thr Thr Val Ile Val Val Gly Gly Gly Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His（配列番号：９）
断片（４）Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Asn His Asp Glu Ser Pro Arg Ala Lys（配列番号：10）
断片（５）Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser Pro Ala Leu Val Asp Leu Glu Asp Gln Xaa: Val Ser Lys（配列番号：11）
断片（６）Asn Phe Met Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys（配列番号：12）
断片（７）His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro His Ala Ser Glu Ala Ser Ile Lys（配列番号：13）
断片（８）Ala Trp Val Tyr Ala His Met Gln Leu Thr Pro Lys（配列番号：14）
【００４１】
ピレノケータ エスピー（ Pyrenocaeta sp. ） YH807 （ FERM P-19210 ）フルクトシルアミンオキシダーゼをコードするゲノム DNA のクローニング
（１） 染色体DNAの調製
サブロー培地（グルコース4.0%、ポリペプトン1.0%、pH5.6）100mlを500ml容坂口フラスコに入れ、オートクレーブし、ピレノケータ エスピー（Pyrenocaeta sp.）YH807を植菌した。25℃で4日間振盪培養した後、No.2ろ紙でろ過して菌体を回収した。
【００４２】
液体窒素で菌体を凍結し、乳鉢で微粉末になるまで粉砕した。DNA抽出用緩衝液（5.0%SDS、0.1M NaCl、50mM Tris-HCl、pH8.0）15mlを加え、ゆっくり振盪して溶解した。遠心分離（5,000rpm、6min、rt.）により上清を得、フェノール/クロロホルム抽出を3回、エーテル抽出を2回行い、エーテルを蒸発させた後、3M酢酸ナトリウム1ml、エタノール25mlを加え、-30℃で30分間放置した。
【００４３】
遠心分離（12,000rpm、10min、4℃）により染色体DNAを回収し、70%エタノール似て洗浄した後、TE400μlに溶解した。次に、得られたDNA溶液にRNase 10μl（0.132U）を加え、37℃で1時間処理した後、プロテイナーゼKを5μl（0.6U）を加え、50℃で1時間処理した。フェノール/クロロホルム抽出（2回）、クロロホルム/イソアミルアルコール抽出（1回）を行った後、エタノール沈殿にてDNAを回収した。70%エタノール溶液により洗浄した後、エタノールを除去し、TE200μlに溶解した。
【００４４】
（２） フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子断片の増幅
ｉ. プライマーの設計
断片（1）中の(Lys) Val (Cys) Asp Glu Phe Pro Glyの配列（配列番号：15）からセンスで P1 プライマーを設計した。
P1 AA(A/G)GT(T/C/A/G)TG(T/C)GA(T/C)GA(A/G)TT(T/C)CC(A/T/G/C)GG（配列番号：16）
断片（２）のMet (Cys) Trp (Cys) Thr Asp Thr Alaの配列（配列番号：17）
からアンチセンスで P2 プライマーを設計した。
P2 GC(A/T/G/C)GT(G/A)TC(A/T/G/C)GT(G/A)CACCA(G/A)CACAT（配列番号：18）
【００４５】
ii. フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子断片の取得
前述の方法で得られた染色体DNAを鋳型DNAとしてP1プライマーとP2プライマーの組み合わせでPCR反応を35サイクル行った。その結果、230 bpのDNA断片が特異的に増幅された。得られたDNA断片の塩基配列「配列番号：19」（配列番号：１の 1148 〜 1377 番目までの塩基配列）を決定した。
【００４６】
（３）フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列の決定
ｉ 5’上流域のDNA断片の増幅
「配列番号：19」から P3 プライマーを設計した。
P3 TTTGGCATGAGATCTGGGAACCGA（配列番号：20）
（配列番号：１の 1229 〜 1252 番目までの塩基配列の相補配列）
「配列番号：1９」から P4 プライマーを設計した。
P4 GCCCTTGCACCAAATGGTTGATGC（配列番号：21）
（配列番号：１の 1192 〜 1215 番目までの塩基配列の相補配列）
【００４７】
5’上流域のDNA断片の増幅は、次のようにして行った。Raeder らの方法（U. Raeder and P. Broda, Lett. Appl. Microb., 1, 17-20 (1985)）にしたがって調製した ピレノケータ・エスピーYH807（FERM P-19210）株の染色体DNAを制限酵素 Eco RI で消化した後、宝酒造製 LA-PCR in vitro Cloning kit を用いて、cassette-ligation-mediated PCR を行った。
【００４８】
即ち、制限酵素処理断片にEco RIカセット（宝酒造製）を結合させ、このDNAを鋳型 DNAとして C1プライマ−（宝酒造製）及び P3プライマ−をそれぞれ使用して、PCR反応を35サイクル行った。100倍希釈した反応液を鋳型DNAとしてC2プライマ−（宝酒造製）及びP4プライマ−を使用して、PCR反応をさらに35サイクル行った。その結果、1,200 bpのDNA断片が特異的に増幅された。その塩基配列「配列番号：22」（配列番号：１の1 〜 1,180番目の塩基配列）を決定した。
【００４９】
ii. 3’下流域のDNA断片の増幅
「配列番号：２２」から P5 プライマーを設計した。
P5 TACTTATCCTCACGCATCCGAAGCC（配列番号：23）（配列番号：１の 1,264 〜 1,288 番目までの塩基配列）
「配列番号：２２」から P6 プライマーを設計した。
P6 GCGGCATTCTTACCACAGTTCAAGG（配列番号：24）（配列番号：１の 1,307 〜 1,331 番目までの塩基配列）
【００５０】
3’下流域のDNA断片の増幅は、次のようにして行った。ピレノケータ・エスピーYH807株の染色体 DNA を制限酵素 Sal I で消化した後、制限酵素処理断片に Sal Iカセット（宝酒造製）を結合させ、宝酒造製 LA-PCR in vitro Cloning kit を用いて、cassette-ligation-mediated PCR を行った。このDNAを鋳型DNAとしてC1プライマ−及びP5プライマ−を使用して、PCR反応を35サイクル行った。
【００５１】
100倍希釈した反応液を鋳型DNAとしてC2プライマ−及びP6プライマ−を使用して、PCR反応をさらに35サイクル行った。その結果、720 bp の DNA 断片が特異的に増幅された。増幅されたDNA断片の塩基配列「配列番号：25」（配列番号：１の1,338 〜 2,025番目の塩基配列）を決定した。
配列番号：19、配列番号：22、配列番号：25をつなぎ合わせて、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列「配列番号：１」を決定した。
【００５２】
得られた塩基配列を元に既知のフルクトシルアミンオキシダーゼとの相同性を検索した結果、ペニスリウム・ヤンシネラム（Penicillium janthinellum）のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（特開平11-46769）と67.1%、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（Jeong, H. Y. et. al., Arch. Microbiol. 178 (5), 344-350 (2002)）と66.7%の相同性を示した。
【００５３】
実施例２. ピレノケータ エスピー（ Pyrenocaeta sp. ） YH807 （ FERM P-19210 ）フルクトシルアミンオキシダーゼをコードする cDNA のクローニング
（１）全RNAの調製
YM培地（グルコース1.0%、ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.3%、麦芽エキス0.3%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄・7H₂O 0.05%、pH 6.0）100 mlを500 ml容坂口フラスコに入れ、オートクレーブし、ピレノケータ・エスピーYH807を植菌した。25℃で4日間振盪培養した後、No.2ろ紙でろ過して菌体を回収した。培養後の培養物を液体窒素で凍結した後、乳鉢で粉砕し、ライフテックオリエンタル社製 TRIZOL Reagent を用い、そのプロトコールに従って抽出し、全RNA を得た。
【００５４】
（２）フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子のcDNAの取得
Ａ）プライマ−の設計
転写開始点と思われるATGを推測し、その上流の配列よりP7プライマーを設計した。
P7 AGGAAGAAGTTTCACCTCGACTCCAGC（配列番号：26）（配列番号：１の91〜117番目までの塩基配列）
断片（５）のLys Val Val Leu Ala Ala Gly Alaの配列（配列番号：27）からセンスで P8 プライマーを設計した。
P8 AAAGTTGTCCTGGCAGCTGGTGCA（配列番号：28）（配列番号：１の864〜887番目までの塩基配列）
断片（８）のAla His Met Gln Leu Thr Pro Lysの配列（配列番号：29）からアンチセンスで P9 プライマーを設計した。
P9 CTTCGGGGTGAGCTGCATGTGAGC（配列番号：30）（配列番号：１の864〜887番目までの塩基配列）
【００５５】
Ｂ）cDNA配列の決定
約1 μgの全RNAから3’-Full RACE Core Set （宝酒造製）用いて、プロトコールに準じた条件でcDNAの合成を行った。得られたcDNAを鋳型DNAとしてプライマ−に3site Adaptor Primer（宝酒造製）とP8プライマー及びP7プライマーとP9プライマーを用いてPCR反応を35サイクル行った。得られたDNA断片の塩基配列を決定して「配列番号：31」（配列番号：１の225〜440番目までのアミノ酸配列）、「配列番号：32」（配列4の1〜237番目までのアミノ酸配列）を決定した。配列番号：31及び配列番号：32をつなぎ合わせて、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子cDNAの塩基配列「配列番号：33」を決定した。
【００５６】
得られた塩基配列から推定されるアミノ酸配列を元に既知のフルクトシルアミンオキシダーゼとの相同性を検索した結果、ペニスリウム・ヤンシネラム（Penicillium janthinellum）のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（特開平11-46769）と71%、アスペルギルス・ニドランス（Aspergillus nidulans）のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（Jeong, H. Y. et. al., Arch. Microbiol. 178 (5), 344-350 (2002)）と74.8%の相同性を示した。
【００５７】
実施例３ . ピレノケータ エスピー（ Pyrenocaeta sp. ） YH807 （ FERM P-19210 ）フルクトシルアミンオキシダーゼの発現
フルクトシルアミンオキシダーゼを効率よく発現させるため、ピレノケータ エスピー（Pyrenocaeta sp.）YH807（FERM P-19210）株からゲノムDNAを再度クローニングした。
ピレノケータ・エスピー（Pyrenocaeta sp.）YH807フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子塩基配列を基にP10プライマー、P11プライマーを設計した。
P10 AAAGGATCCATGCATGCTTCACGAGCAAAGACGACAGTGATCGTC（配列番号：34）（配列番号：１の124〜153番目までの塩基配列にEco T22IとBam HIサイトを付加した配列）
P11 ATTGAATTCTTGCTCCCACGTGCTTCAGGCCTGAAAAGG（配列番号：35）（配列番号：１の1,941〜1,970番目までの塩基配列の相補配列にEco RIサイトを付加した配列）
【００５８】
Raeder らの方法（U. Raeder and P. Broda, Lett. Appl. Microb., 1, 17-20 (1985)）にしたがって調製したピレノケータ・エスピー（ Pyrenochaeta sp.）YH807株の染色体DNAを単離精製し、そのDNA を鋳型DNAとして P10プライマーとP11プライマーを用いてPCR 反応を35サイクル行った。その結果、約 1,900bpの DNA 断片が得られた。得られた DNA 断片を制限酵素 EcoT22I 及び Eco RI で消化した後、制限酵素 EcoT22I 及び Eco RI で消化したベクター pTF100 （N. Kitamoto, J. Matsui, Y. Kawai, Y. Kato, S. Yoshino, K. Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85 - 92 (1998)）に組み込みフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を含むベクターpTFFAODP100を作製した。
【００５９】
上述の方法で作成した組み込みベクターpTFFAODP100 でアスペルギルス・オリゼー（ A. oryzae）KBN616-39（ niaD^-） 株を形質転換した。すべての形質転換株をGP 培地（N. Kitamoto, J. Matsui, Y. Kawai, Y. Kato, S. Yoshino, K. Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85 - 92 (1998)） 100 mlを用い、30℃、5日間液体振盪培養を行ったところ、5.98ユニット/ml のフルクトシルアミンオキシダーゼ活性（基質としてフルクトシルバリルヒスチジンを使用し、測定は特願2003-67266に準じて行った。）を有するフルクトシルアミンオキシダーゼ高生産アスペルギルス・オリゼー（A. oryzae）FAODP株を得ることができた。酵素活性１単位は37℃で１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成させる酵素量とした。
【００６０】
また、同じ培養液を濃縮後、Laemmli の方法に基づく SDS-PAGE を行ったところ、精製したフルクトシルアミンオキシダーゼと同様の位置にバンドが存在し、同様のフルクトシルアミンオキシダーゼの発現が確認できた。
【００６１】
実施例４． アルスリニウム・エスピー（ Arthrinium sp.)TO6 (FERM P-19211 ）フルクトシルアミンオキシダーゼをコードするゲノムＤＮＡのクローニング
（１）染色体DNAの調製
サブロー培地（グルコース4.0%、ポリペプトン1.0%、pH5.6）100mlを500ml容坂口フラスコに入れ、オートクレーブし、アルスリニウム・エスピー（Arthrinium sp.）TO6を植菌した。25℃で4日間振盪培養した後、No.2ろ紙でろ過して菌体を回収した。
【００６２】
液体窒素で菌体を凍結し、乳鉢で微粉末になるまで粉砕した。DNA抽出用緩衝液（5.0%SDS、0.1M NaCl、50mM Tris-HCl、pH8.0）15mlを加え、ゆっくり振盪して溶解した。遠心分離（5,000rpm、6min、rt.）により上清を得、フェノール/クロロホルム抽出を3回、エーテル抽出を2回行い、エーテルを蒸発させた後、3M酢酸ナトリウム1ml、エタノール25mlを加え、-30℃で30分間放置した。
【００６３】
遠心分離（12,000rpm、10min、4℃）により染色体DNAを回収し、70%エタノール似て洗浄した後、TE400μlに溶解した。次に、得られたDNA溶液にRNase 10μl（0.132U）を加え、37℃で1時間処理した後、プロテイナーゼKを5μl（0.6U）を加え、50℃で1時間処理した。フェノール/クロロホルム抽出（2回）、クロロホルム/イソアミルアルコール抽出（1回）を行った後、エタノール沈殿にてDNAを回収した。70%エタノール溶液により洗浄した後、エタノールを除去し、TE200μlに溶解した。
【００６４】
（２）フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子断片の増幅
ｉ. プライマーの設計
実施例１、実施例２に記載のピレノケータ・エスピー（Pyrenocaeta sp.）YH807（FERM P-19210）由来フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号１）を基に下記のP12〜P17プライマーを設計した。
配列番号：１のPhe Arg Asp Phe Phe His Asnの配列（配列番号：36）（85〜91番目までのアミノ酸配列）からセンスで P12 プライマーを設計した。
P12 TT(T/C)(A/C)A(T/C/A/G)GA(T/C)TT(T/C)TT(T/C)CA(T/C)AA(T/C)GT（配列番号：37）
【００６５】
配列番号：１のLys Ala Ile Asn Ala Ile Glyの配列（配列番号：38）（164〜170番目までのアミノ酸配列）からセンスで P13 プライマーを設計した。
P13 AA(A/G)GC(C/T)AT(C/T)AACGC(C/T)AT(C/T)GG（配列番号：39）
配列番号：１のPhe Phe Phe Glu Pro Asn Gluの配列（配列番号：40）（265〜271番目までのアミノ酸配列）からセンスで P14 プライマーを設計した。
P14 TT(T/C)TT(T/C)TT(T/C)GA(A/G)CC(T/A/C)AA(T/C)GA（配列番号：41）
配列番号：１のPhe Phe Phe Glu Pro Asn Gluの配列（配列番号：42）（265〜271番目までのアミノ酸配列）からアンチセンスで P15 プライマーを設計した。
P15 TC(A/G)TT(A/T/G)GG(T/C)TC(A/G)AA(A/G)AA(A/G)AA（配列番号：43）
【００６６】
配列番号：１のMet Cys Trp Cys Thr Asp Thrの配列（配列番号：44）（344〜350番目までのアミノ酸配列）からアンチセンスで P16 プライマーを設計した。
P16 GTGTC(T/C/G)GTGCACCAGCACAT（配列番号：45）
配列番号：１のAsn Ile Gly Lys His Val Valの配列（配列番号：46）（382〜388番目までのアミノ酸配列）からアンチセンスで P17 プライマーを設計した。
P17 AC(C/G)ACGTGCTT(A/G)CC(A/G)ATGTT（配列番号：47）
【００６７】
ii. フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子断片の取得
前述の方法で得られた染色体DNAを鋳型DNAとしてP12プライマーとP17プライマーの組み合わせでPCR反応を35サイクル行った。その結果、約900 bpのDNA断片が特異的に増幅された。得られたDNA断片の塩基配列「配列番号：48」（配列番号：３の601 〜 1494 番目までの塩基配列）を決定した。
【００６８】
（３） フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列の決定
ｉ. 5’上流域のDNA断片の増幅
「配列番号：48」から P18 プライマーを設計した。
P18 TCTTTGCCAGGATGGCATCCTCA（配列番号：49）（配列番号：３の 726 〜 748 番目までの塩基配列の相補配列）
「配列番号：48」から P19 プライマーを設計した。
P19 AGCAAGGTCTGGTACTGCTGCTT（配列番号：50）（配列番号：３の 658 〜 680 番目までの塩基配列の相補配列）
【００６９】
5’上流域のDNA断片の増幅は、次のようにして行った。Raeder らの方法（U. Raeder and P. Broda, Lett. Appl. Microb., 1, 17-20 (1985)）にしたがって調製した Arthrinium sp. TO6株の染色体DNAを制限酵素 Ｐst I で消化した後、宝酒造製 LA-PCR in vitro Cloning kit を用いて、cassette-ligation-mediated PCR を行った。
【００７０】
即ち、制限酵素処理断片にＰst Iカセット（宝酒造製）を結合させ、このDNAを鋳型 DNAとして C1プライマ−（宝酒造製）及び P18プライマ−をそれぞれ使用して、PCR反応を35サイクル行った。100倍希釈した反応液を鋳型DNAとしてC2プライマ−（宝酒造製）及びP19プライマ−を使用して、PCR反応をさらに35サイクル行った。その結果、約700 bpのDNA断片が特異的に増幅された。その塩基配列「配列番号：51」（配列番号：３の1 〜 641番目の塩基配列）を決定した。
【００７１】
ii. 3’下流域のDNA断片の増幅
「配列番号：４８」から P20 プライマーを設計した。
P20 ATGTGCTGGTGCACCGACACG（配列番号：52）（配列番号：３の 1,375 〜 1,395 番目までの塩基配列）
「配列番号：48」から P21 プライマーを設計した。
P21 TATTCTGGCTACGGGCGACAGC（配列番号：53）（配列番号：３の 1,443 〜 1,464 番目までの塩基配列）
【００７２】
3’下流域のDNA断片の増幅は、次のようにして行った。アルスリニウム・エスピーTO6株の染色体 DNA を制限酵素Eco RIで消化した後、制限酵素処理断片に Eco RIカセット（宝酒造製）を結合させ、宝酒造製 LA-PCR in vitro Cloning kit を用いて、cassette-ligation-mediated PCR を行った。このDNAを鋳型DNAとしてC1プライマ−及びP20プライマ−を使用して、PCR反応を35サイクル行った。
【００７３】
100倍希釈した反応液を鋳型DNAとしてC2プライマ−及びP21プライマ−を使用して、PCR反応をさらに35サイクル行った。その結果、1,200 bp の DNA 断片が特異的に増幅された。増幅されたDNA断片の塩基配列「配列番号：54」（配列番号：３の1,500 〜 1,876番目の塩基配列）を決定した。
配列番号：48、配列番号：51、配列番号：54をつなぎ合わせて、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列「配列番号：３」を決定した。
【００７４】
得られた塩基配列を元に既知のフルクトシルアミンオキシダーゼとの相同性を検索した結果、ピレノケータ・エスピーYH807のフルクトシルアミンオキシダーゼと70.0%、ペニスリウム・ヤンシネラムのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（特開平11-46769）と66.9%、アスペルギルス・ニドランスのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（Jeong, H. Y. et. al., Arch. Microbiol. 178 (5), 344-350 (2002)）と70.7%の相同性を示した。
【００７５】
実施例５ . アルスリニウム・エスピー（ Arthrinium sp. ） TO6 （ FERM P-19211 ）フルクトシルアミンオキシダーゼをコードする cDNA のクローニング
（１）全RNAの調製
YM培地（グルコース1.0%、ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.3%、麦芽エキス0.3%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄・7H₂O 0.05%、pH 6.0）100 mlを500 ml容坂口フラスコに入れ、オートクレーブし、アルスリニウム・エスピー TO6を植菌した。25℃で4日間振盪培養した後、No.2ろ紙でろ過して菌体を回収した。培養後の培養物を液体窒素で凍結した後、乳鉢で粉砕し、ライフテックオリエンタル社製 TRIZOL Reagent を用い、そのプロトコールに従って抽出し、全RNA を得た。
【００７６】
（２）フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子のcDNAの取得
Ａ）プライマ−の設計
転写開始点と思われるATGを推測し、その上流の配列よりP22プライマーを設計した。
P22 GGATTCCACAGGGGCTTCAACAACACC（配列番号：55）（配列番号：３の310〜336番目までの塩基配列）
断片（５）のLys Val Val Leu Ala Ala Gly Alaの配列（配列番号：56）からセンスで P23 プライマーを設計した。
P23 AAGGTCGTCCTGGCCGCGGGCGCG（配列番号：57）（配列番号：３の979〜1002番目までの塩基配列）
断片（８）のAla His Met Gln Leu Thr Pro Hisの配列（配列番号：58）からアンチセンスで P24 プライマーを設計した。
P24 GCCCACATGCAGCTGACGCCGCAC（配列番号：59）（配列番号：３の1060〜1083番目までの塩基配列）
【００７７】
Ｂ）cDNA配列の決定
約１μgの全RNAから3’-Full RACE Core Set （宝酒造製）用いて、プロトコールに準じた条件でcDNAの合成を行った。得られたcDNAを鋳型DNAとしてプライマ−に3site Adaptor Primer（宝酒造製）とP23プライマー及びP22プライマーとP24プライマーを用いてPCR反応を35サイクル行った。得られたDNA断片の塩基配列を決定して「配列番号：60」（配列番号：３の213〜452番目までのアミノ酸配列）、「配列番号：61」（配列番号：３の1〜239番目までのアミノ酸配列）を決定した。配列番号：60及び配列番号：61をつなぎ合わせて、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子cDNAの塩基配列「配列番号：62」を決定した。
【００７８】
得られた塩基配列から推定されるアミノ酸配列を元に既知のフルクトシルアミンオキシダーゼとの相同性を検索した結果、ピレノケータ・エスピーYH807のフルクトシルアミンオキシダーゼと80.2%、ペニシリウム・ヤンシネラムのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（特開平11-46769）と74.6%、アスペルギルス・ニドランスのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（Jeong, H. Y. et. al., Arch. Microbiol. 178 (5), 344-350 (2002)）と74.3%の相同性を示した。
【００７９】
実施例６．アルスリニウム・エスピー（ Arthrinium sp. ） TO6 （ FERM P-19211 ）フルクトシルアミンオキシダーゼの発現
フルクトシルアミンオキシダーゼを効率よく発現させるため、アルスリニウム・エスピー（Arthrinium sp.）TO6（FERM P-19211）株からゲノムDNAを再度クローニングした。
アルスリニウム・エスピー（Arthrinium sp.）TO6フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子の転写開始点下流の配列を基にP25プライマー、P26プライマーを設計した。
P25 AAAGGATCCATGCATCGTCACGAAAGACCACCAAAGTGATTGTCG（配列番号：63）（配列番号：３の344〜373番目までの塩基配列にEco T22IとBam HIサイトを付加した配列）
P26 ATTGAATTCTTGGTGTCACCCACTTGGGGAAACAAATCA（配列番号：64）（配列番号：３の1,831〜1,860番目までの塩基配列の相補配列にEco RIサイトを付加した配列）
【００８０】
Raeder らの方法（U. Raeder and P. Broda, Lett. Appl. Microb., 1, 17-20 (1985)）にしたがって調製したアルスリニウム・エスピー（Arthrinium sp.）TO6株の染色体DNAを単離精製し、そのDNA を鋳型DNAとして P25プライマーとP26プライマーを用いてPCR 反応を35サイクル行った。その結果、約 1,500bpの DNA断片が得られた。得られた DNA 断片を制限酵素 EcoT22I 及び Eco RI で消化した後、制限酵素 EcoT22I 及び Eco RI で消化したベクター pTF100 （N. Kitamoto, J. Matsui, Y. Kawai, Y. Kato, S. Yoshino, K. Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85 - 92 (1998)）に組み込みフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を含むベクターpTFFAODA100を作製した。
【００８１】
上述の方法で作成した組み込みベクターpTFFAODA100 でアスペルギルス・オリゼー（ A. oryzae）KBN616-39（ niaD^-） 株を形質転換した。すべての形質転換株をGP 培地（N. Kitamoto, J. Matsui, Y. Kawai, Y. Kato, S. Yoshino, K. Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85 - 92 (1998)） 100 mlを用い、30℃、5日間液体振盪培養を行ったところ、5.31ユニット/ml のフルクトシルアミンオキシダーゼ活性（基質としてフルクトシルバリルヒスチジンを使用し、測定は特願2003-67266に準じて行った。）を有するフルクトシルアミンオキシダーゼ高生産アスペルギルス・オリゼー（A. oryzae）FAODA株を得ることができた。
【００８２】
また、同じ培養液を濃縮後、Laemmli の方法に基づく SDS-PAGE を行ったところ、精製したフルクトシルアミンオキシダーゼと同様の位置にバンドが存在し、同様のフルクトシルアミンオキシダーゼの発現が確認できた。
【００８３】
実施例７ . カーブラリア・クラベータ（ Curvularia claveta ） YH923 (FERM-P19209) フルクトシルアミンオキシダーゼをコードするゲノム DNA のクローニング
（１）染色体DNAの調製
サブロー培地（グルコース4.0%、ポリペプトン1.0%、pH5.6）100mlを500ml容坂口フラスコに入れ、オートクレーブし、カーブラリア・クラベータ（Curvularia claveta. ）YH923を植菌した。25℃で4日間振盪培養した後、No.2ろ紙でろ過して菌体を回収した。
【００８４】
液体窒素で菌体を凍結し、乳鉢で微粉末になるまで粉砕した。DNA抽出用緩衝液（5.0%SDS、0.1M NaCl、50mM Tris-HCl、pH8.0）15mlを加え、ゆっくり振盪して溶解した。遠心分離（5,000rpm、6min、rt.）により上清を得、フェノール/クロロホルム抽出を3回、エーテル抽出を2回行い、エーテルを蒸発させた後、3M酢酸ナトリウム1ml、エタノール25mlを加え、-30℃で30分間放置した。
【００８５】
遠心分離（12,000rpm、10min、4℃）により染色体DNAを回収し、70%エタノール似て洗浄した後、TE400μlに溶解した。次に、得られたDNA溶液にRNase 10μl（0.132U）を加え、37℃で1時間処理した後、プロテイナーゼKを5μl（0.6U）を加え、50℃で1時間処理した。フェノール/クロロホルム抽出（2回）、クロロホルム/イソアミルアルコール抽出（1回）を行った後、エタノール沈殿にてDNAを回収した。70%エタノール溶液により洗浄した後、エタノールを除去し、TE200μlに溶解した。
【００８６】
（２）フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子断片の増幅
ｉ. プライマーの設計
実施例４に記載のP12〜P17プライマーを設計した。
【００８７】
ii. フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子断片の取得
前述の方法で得られた染色体DNAを鋳型DNAとしてP13プライマーとP17プライマーの組み合わせでPCR反応を35サイクル行った。その結果、それぞれ約800 bpのDNA断片が特異的に増幅された。得られたDNA断片の塩基配列「配列番号：６５」（配列番号：６の 1021 〜 1790 番目までの塩基配列）を決定した。
【００８８】
フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列の決定
ｉ. 5’上流域のDNA断片の増幅
「配列番号：65」から P27 プライマーを設計した。
P27 GCCAAAAGAGGCTGCTTGAACGAT（配列番号：66）（配列番号：５の 1083 〜 1106 番目までの塩基配列の相補配列）
「配列番号：65」から P28 プライマーを設計した。
P28 CGATCCAGCACCACCAAAACCAAAC（配列番号：67）（配列番号：５の 1062 〜 1086 番目までの塩基配列の相補配列）
【００８９】
5’上流域のDNA断片の増幅は、次のようにして行った。Raeder らの方法（U. Raeder and P. Broda, Lett. Appl. Microb., 1, 17-20 (1985)）にしたがって調製したカーブラリア・クラベータ（Curvularia claveta） YH923株の染色体DNAを制限酵素 Xba I で消化した後、宝酒造製 LA-PCR in vitro Cloning kit を用いて、cassette-ligation-mediated PCR を行った。
【００９０】
即ち、制限酵素処理断片にXba Iカセット（宝酒造製）を結合させ、このDNAを鋳型 DNAとして C1プライマ−（宝酒造製）及び P27プライマ−をそれぞれ使用して、PCR反応を35サイクル行った。100倍希釈した反応液を鋳型DNAとしてC2プライマ−（宝酒造製）及びP28プライマ−を使用して、PCR反応をさらに35サイクル行った。その結果、1,200 bpのDNA断片が特異的に増幅された。その塩基配列「配列番号：68」（配列番号：５の1 〜 1044番目の塩基配列）を決定した。
【００９１】
ii. 3’下流域のDNA断片の増幅
「配列番号：65」から P29 プライマーを設計した。
P29 TGGTGCCAGAACAACATGTACTGACC（配列番号：69）（配列番号：５の 1,713 〜 1,738 番目までの塩基配列）
「配列番号：65」から P30 プライマーを設計した。
P30 ACCTGGTTTGCCTAGGCACACA（配列番号：70）（配列番号：５の 1,736 〜 1,757 番目までの塩基配列）
【００９２】
3’下流域のDNA断片の増幅は、次のようにして行った。カーブラリア・クラベータ（Curvularia claveta） YH923株の染色体 DNA を制限酵素 Sal I で消化した後、制限酵素処理断片に Sal Iカセット（宝酒造製）を結合させ、宝酒造製 LA-PCR in vitro Cloning kit を用いて、cassette-ligation-mediated PCR を行った。このDNAを鋳型DNAとしてC1プライマ−及びP29プライマ−を使用して、PCR反応を35サイクル行った。100倍希釈した反応液を鋳型DNAとしてC2プライマ−及びP30プライマ−を使用して、PCR反応をさらに35サイクル行った。その結果、1,000 bp の DNA 断片が特異的に増幅された。増幅されたDNA断片の塩基配列「配列番号：71」（配列番号：５の1,775 〜 2,212番目の塩基配列）を決定した。
配列番号：65、配列番号：68、配列番号：71をつなぎ合わせて、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列「配列番号：５」を決定した。
【００９３】
得られた塩基配列を元に既知のフルクトシルアミンオキシダーゼとの相同性を検索した結果、ピレノケータ・エスピーYH807のフルクトシルアミンオキシダーゼと75.0%、アルスリニウム・エスピーTO6のフルクトシルアミンオキシダーゼと71.5%、ペニシリウム・ヤンシネラムのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（特開平11-46769）と67.2%、アスペルギルス・ニドランスのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（Jeong, H. Y. et. al., Arch. Microbiol. 178 (5), 344-350 (2002)）と67.8%の相同性を示した。
【００９４】
実施例８ . カーブラリア・クラベータ（ Curvularia claveta. ） YH923 (FERM-P19209) フルクトシルアミンオキシダーゼをコードする cDNA のクローニング
（１）全RNAの調製
YM培地（グルコース1.0%、ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.3%、麦芽エキス0.3%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄・7H₂O 0.05%、pH 6.0）100 mlを500 ml容坂口フラスコに入れ、オートクレーブし、カーブラリア・クラベータ（Curvularia claveta）YH923を植菌した。25℃で4日間振盪培養した後、No.2ろ紙でろ過して菌体を回収した。培養後の培養物を液体窒素で凍結した後、乳鉢で粉砕し、ライフテックオリエンタル社製 TRIZOL Reagent を用い、そのプロトコールに従って抽出し、全RNA を得た。
【００９５】
（２）フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子のcDNAの取得
Ａ）プライマ−の設計
転写開始点と思われるATGを推測し、その上流の配列よりP31プライマーを設計した。
P31 TCATTTAGACATGGCGCCCTCAAGAGC（配列番号：72）（配列番号：５の471〜500番目までの塩基配列）
断片（５）のLys Val Val Leu Ala Ala Gly Alaの配列（配列番号：73）からセンスで P32 プライマーを設計した。
P32 AAAGTTGTGCTTGCAGCTGGTGCTTG（配列番号：74）（配列番号：５の1,162〜1,187番目までの塩基配列）
断片（８）のAla His Ile Gln Leu Thr Pro Gluの配列（配列番号：75）からアンチセンスで P33 プライマーを設計した。
P33 TCCTCAGGCGTAAGCTGTATGTGAGC（配列番号：76）（配列番号：５の1,292〜1,317番目までの塩基配列）
【００９６】
Ｂ）cDNA配列の決定
約1μgの全RNAから3’-Full RACE Core Set （宝酒造製）用いて、プロトコールに準じた条件でcDNAの合成を行った。得られたcDNAを鋳型DNAとしてプライマ−に3site Adaptor Primer（宝酒造製）とP32プライマー及びP31プライマーとP33プライマーを用いてPCR反応を35サイクル行った。得られたDNA断片の塩基配列を決定して「配列番号：77」（配列番号：５の213〜440番目までのアミノ酸配列）、「配列番号：78」（配列番号：５の1〜237番目までのアミノ酸配列）を決定した。配列番号：77及び配列番号：78をつなぎ合わせて、フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子cDNAの塩基配列「配列番号：79」を決定した。
【００９７】
得られた塩基配列から推定されるアミノ酸配列を元に既知のフルクトシルアミンオキシダーゼとの相同性を検索した結果、ピレノケータ・エスピーYH807のフルクトシルアミンオキシダーゼと86.1%、アルスリニウム・エスピーTO6のフルクトシルアミンオキシダーゼと80.3%、ペニシリウム・ヤンシネラムのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（特開平11-46769）と75.2%、アスペルギルス・ニドランスのフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子（Jeong, H. Y. et. al., Arch. Microbiol. 178 (5), 344-350 (2002)）と74.6%の相同性を示した。
【００９８】
実施例９ . カーブラリア・クラベータ（ Curvularia claveta ） YH923 (FERM-P19209) フルクトシルアミンオキシダーゼの発現
フルクトシルアミンオキシダーゼを効率よく発現させるため、カーブラリア・クラベータ（Curvularia claveta）YH923株からゲノムDNAを再度クローニングした。
カーブラリア・クラベータ（Curvularia claveta）YH923フルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列を基にP34プライマー、P35プライマーを設計した。
P34 GACATGCATCCCTCAAGAGCAAACACTTCTGTTATCGTT（配列番号：80）（配列番号：５の477〜506番目までの塩基配列にEco T22IとBam HIサイトを付加した配列）
P35 TCCATGCATGTGCCAGATCCTCCGCGAGTGTACCC（配列番号：81）（配列番号：５の1,805〜1,839番目までの塩基配列の相補配列）
P36 CACATGCATGGAGATGGCGGCCTGGTACTGGCGAT（配列番号：82）（配列番号：５の1,828〜1,862番目までの塩基配列）
P37 ATTGAATTCTCAGATTCTTTCCCCTGCACCAGTCGCACC（配列番号：83）（配列番号：５の2,281〜2,210番目までの塩基配列の相補配列にEco RIサイトを付加した配列）
【００９９】
Raeder らの方法（U. Raeder and P. Broda, Lett. Appl. Microb., 1, 17-20 (1985)）にしたがって調製したカーブラリア・クラベータ（Curvularia claveta）YH923株の染色体DNAを単離精製し、そのDNA を鋳型DNAとして P34プライマーとP35プライマー、P36プライマーとP37プライマーを用いてPCR 反応を35サイクル行った。その結果、約 1,400bpと約400bpの DNA 断片が得られた。得られた DNA 断片を制限酵素 EcoT22I 及び Eco RI で消化した後、制限酵素 EcoT22I 及び Eco RI で消化したベクター pTF100 （N. Kitamoto, J. Matsui, Y. Kawai, Y. Kato, S. Yoshino, K. Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85 - 92 (1998)）に組み込みフルクトシルアミンオキシダーゼ遺伝子を含むベクターpTFFAODC100を作製した。
【０１００】
上述の方法で作成した組み込みベクターpTFFAODC100 でアスペルギルス・オリゼー（ A. oryzae）KBN616-39（ niaD^-） 株を形質転換した。すべての形質転換株をGP 培地（N. Kitamoto, J. Matsui, Y. Kawai, Y. Kato, S. Yoshino, K. Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85 - 92 (1998)） 100 mlを用い、30℃、5日間液体振盪培養を行ったところ、6.52ユニット/ml のフルクトシルアミンオキシダーゼ活性（基質としてフルクトシルバリルヒスチジンを使用し、測定は特願2003-67266に準じて行った。）を有するフルクトシルアミンオキシダーゼ高生産アスペルギルス・オリゼー（A. oryzae）FAODC株を得ることができた。
【０１０１】
また、同じ培養液を濃縮後、Laemmli の方法に基づく SDS-PAGE を行ったところ、精製したフルクトシルアミンオキシダーゼと同様の位置にバンドが存在し、同様のフルクトシルアミンオキシダーゼの発現が確認できた。
【０１０２】
比較例１ . ペニシリウム・ヤンシネラム NBRC6581 由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの基質特異性
＜培養方法と酵素調製方法＞
500mlの坂口フラスコに100mlの0.5％のフルクトシル-ε-リジン、1.0％のグルコース、0.1％のリン酸２カリウム、0.1％リン酸１ナトリウム、0.05％硫酸マグネシウム、0.01％塩化カリウム、0.2％酵母エキスを含有する培地（pH 6.0）をそれぞれ入れ、殺菌後、ペニシリウム・ヤンシネラムNBRC6581菌株を植菌し、２８℃、48時間間振とう培養した。培養終了後、集菌し、液体窒素で凍結した菌体を乳鉢で磨砕して菌体破砕を行い、40 mlの0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH 7.3)を加えて、５℃で１晩放置した後、遠心分離して無細胞抽出液を得た。
【０１０３】
得られた無細胞抽出液を濃縮後、0.2Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）にて平衡化したハイロード16/60スーパーデックス200pg（アマシャムファルマシア バイオテク製）によるゲルろ過を行い、フルクトシルバリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ画分（分子量約50,000〜10,000）を集めた。得られたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ画分を濃縮し、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを得た。得られた酵素液のフルクトシルバリンに対する活性は４．３ｍＵ／ｍｌであった。
【０１０４】
得られたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いてフルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルバリルロイシンに対する作用を調べた。測定方法は特願2003-67266に準じて行った。その結果、ペニシリウム・ヤンシネラムNBRC6581由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、フルクトシルバリルヒスチジンならびにフルクトシルバリルロイシンには全く作用しなかった。
【０１０５】
比較例２ . アスペルギルス・ニドランス FGSCA4 由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの基質特異性
＜培養方法と酵素調製方法＞
500ml坂口フラスコに100mlの1.0％のフルクトシルバリン、2.0％のグルコース、1.0％のポリペプトンを含有する培地（pH6.0）をそれぞれ入れ、殺菌後、アスペルギルス・ニドランスFGSCA4株を植菌し、30℃、48時間振とう培養した。培養終了後、集菌し、液体窒素で凍結した菌体を乳鉢で磨砕して菌体破砕を行い、40mlの0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH7.3）を加え、５℃で一晩放置した後、遠心分離して無細胞抽出液を得た。
【０１０６】
得られた無細胞抽出液を濃縮した後、0.2Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）にて平衡化したハイロード16/60スーパーデックス200pg（アマシャムファルマシアバイオテク製）による濾過を行い、フルクトシルバリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ画分（分子量約50,000〜10,000）を集めた。得られたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ画分を濃縮し、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを得た。得られた酵素液を用いて特願2003-67266に準じてフルクトシルバリンに対する活性を測定したところ、3.5mU/mlであった。
【０１０７】
また、得られたフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いてフルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルバリルロイシンに対する対する作用を同様に調べた結果、アスペルギルス・ニドランスFGSCA4由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、フルクトシルバリルヒスチジン及びフルクトシルバリルロイシンに全く作用しなかった。
【０１０８】
【配列表】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention acts on 1-deoxyfructosyl-L-valyl-L-histidine (hereinafter referred to as fructosylvalylhistidine) and 1-deoxyfructosyl-L-valyl-L-leucine (hereinafter referred to as fructosylvalyl). A novel gene system encoding fructosylamine oxidase that does not substantially act on fructosylvalylhistidine, and a method for producing fructosylamine oxidase that acts on fructosylvalylhistidine and does not substantially act on fructosylvalylleucine About.
[0002]
[Prior art]
When a reducing sugar such as glucose coexists, the glycated protein is produced by the non-enzymatic and irreversible bond between the amino group and the aldehyde group, and Amadori transfer. In vivo, glycohemoglobin in which hemoglobin in blood is glycated, glycoalbumin in which albumin is glycated, fructosamine in which protein in blood is glycated are known.
[0003]
These blood concentrations reflect the average blood glucose level over a certain period in the past, and the measured value can be an important indicator for diagnosis and management of symptoms of diabetes. Very useful. Among them, the most common and clinical data that is currently used as an index for diagnosis of diabetes is the blood hemoglobin A1c concentration, and the establishment of a measuring means is particularly required.
[0004]
Conventionally, as a method for measuring an Amadori compound, a method using high performance liquid chromatography (Chromatogr. Sci., 10: 659 (1979)), a method using a column packed with a solid bound with boric acid (Clin. Chem. 26: 1598 (1982)), method using antigen-antibody reaction (JJCLA 18: 620 (1993)) colorimetric determination of reducing ability using tetrazolium salt (Clin. Chim. Acta 127: 87 (1982) ), A method for colorimetric determination using thiovaribituric acid (Clin. Chim. Acta 112: 197 (1981)) and the like are known. However, all of these methods are complicated and require expensive equipment, and are not always accurate and quick methods.
[0005]
At present, an enzymatic method has been proposed as a method for measuring glycoproteins that is simpler and less expensive than the above-described method and is accurate in a short time. As methods for quantifying Amadori compounds, Japanese Patent Publication No. 05-33997, Japanese Patent Publication No. 6-65300, Japanese Patent Publication No. 02-195900, Japanese Patent Publication No. 03-155780, Japanese Patent Publication No. 04-4874, Japanese Patent JP 05-192193, JP 06-46846, glycated protein measurement methods for diabetes diagnosis, JP 02-195899, JP 02-19590, JP 05-192193 JP-A 06-46846 and the like are known.
[0006]
As the fructosylamine oxidase used in the above method, the genus Corynebacterium (JP 61-268178 A), Aspergillus (JP 3-155780 A), Penicillium genus (JP 4-155780 A) No. 4874), Fusarium genus (Japanese Patent Laid-Open No. 5-192193, Japanese Patent Laid-Open No. 7-289253, Japanese Patent Laid-Open No. 8-154672), Gibberella (Japanese Patent Laid-Open No. 5-192193, Japanese Patent Laid-Open No. 7-289253) Gazette), Candida genus (JP-A-6-46846), and Aspergillus genus (JP-A-10-33177, JP-A-10-33180) have been reported.
[0007]
As a measurement method using an enzyme of glycated hemoglobin, a method was devised in which only the N-terminal glycated valine of the β chain was released by the action of a protease that cleaves the C-terminal side of leucine and dipeptidyl carboxypeptidase (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-2008). However, this method requires a large amount of expensive dipeptidylcarboxypeptidase to completely decompose the desired fructosyl valyl histidyl leucine. There are problems such as. In addition, a measurement method using fructosylamine oxidase that acts on N-terminal glycated valylhistidine (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-95598) has been reported, which includes fructosylvalyl liberated from the α chain of glycated hemoglobin. There was no mention of reactivity to leucine.
[0008]
In other words, instead of specifically recognizing and measuring the glycation site of the N-terminal valine of the β-chain of hemoglobin, the N-terminal glycated valine of both the α-chain and β-chain is measured, and the original hemoglobin A1c That is, N-terminal glycated valine of β chain was not measured.
Regarding an enzyme that can solve this problem and can measure the original hemoglobin A1c, a fructosylamine oxidase produced by microorganisms such as the genus Curvularia, the genus Pyrenochaeta, and the genus Arthrinium has been filed as a patent application 2003- 67266. The properties of these fructosylamine oxidases are summarized in Table 1.
[0009]
[Table 1]

[0010]
In order to specifically recognize and measure the glycation site of β-chain N-terminal valine, which is the original definition of hemoglobin A1c, it acts on fructosylvalylhistidine, and fructose is the glycation site of α-chain N-terminal valine. It is a fructosylamine oxidase suitable for measurement of hemoglobin A1c that does not substantially act on silvalylleucine. However, the enzyme productivity is very low at a maximum of 0.007 units / ml, and improvement of enzyme productivity is essential for practical use. In addition, there is no description of a gene encoding this enzyme that can be used to improve productivity.
[0011]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. 05-33997
[Patent Document 2]
Japanese Patent Publication No. 6-65300
[Patent Document 3]
Japanese Patent Laid-Open No. 02-195900
[Patent Document 4]
Japanese Patent Laid-Open No. 03-155780
[Patent Document 5]
JP 04-4874
[0012]
[Patent Document 6]
JP 05-192193 A
[Patent Document 7]
Japanese Patent Laid-Open No. 06-46846
[Patent Document 8]
Japanese Unexamined Patent Publication No. 02-195899
[Patent Document 9]
Japanese Patent Laid-Open No. 02-19590
[Patent Document 10]
JP 05-192193 A
[0013]
[Patent Document 11]
Japanese Patent Laid-Open No. 06-46846
[Patent Document 12]
JP-A-61-268178
[Patent Document 13]
Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-155780
[Patent Document 14]
Japanese Patent Laid-Open No. 4-4874
[Patent Document 15]
Japanese Unexamined Patent Publication No. 5-192193
[0014]
[Patent Document 16]
Japanese Unexamined Patent Publication No. 7-289253
[Patent Document 17]
Japanese Patent Laid-Open No. 8-154672
[Patent Document 18]
Japanese Unexamined Patent Publication No. 5-192193
[Patent Document 19]
Japanese Unexamined Patent Publication No. 7-289253
[Patent Document 20]
JP-A-6-46846
[0015]
[Patent Document 21]
Japanese Patent Laid-Open No. 10-33177
[Patent Document 22]
Japanese Patent Laid-Open No. 10-33180
[Patent Document 23]
JP 2000-300294 A
[Patent Document 24]
Japanese Patent Laid-Open No. 2001-95598
[0016]
[Non-Patent Document 1]
Chromatogr. Sci., 10: 659 (1979)
[Non-Patent Document 2]
Clin. Chem. 26: 1598 (1982)
[Non-Patent Document 3]
JJCLA 18: 620 (1993)
[Non-Patent Document 4]
Clin. Chim. Acta 127: 87 (1982)
[Non-Patent Document 5]
Clin. Chim. Acta 112: 197 (1981)
[0017]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, the present invention is effective for fructosylamine oxidase that acts on fructosyl valyl histidine and does not substantially act on fructosyl valyl leucine, that is, fructosyl amine oxidase derived from the genus Carbularia, Pyrenocateta and Arsurinium. It is intended to provide a method that can be manufactured.
[0018]
[Means for Solving the Problems]
As a method for efficiently producing fructosylamine oxidase that acts on fructosyl valyl histidine and does not substantially act on fructosyl valyl leucine, the present inventors have used flugens derived from the genus Carbularia, Pyrenoceta and Arsulium. As a result of various studies to clone the kutosylamine oxidase gene, the present inventors have succeeded in cloning genomic DNA and cDNA encoding fructosylamine oxidase from microorganisms belonging to the genus Carbularia, Pyrenoketa and Arsulinium, and thus completed the present invention.
[0019]
Therefore, the present invention provides a fructosylamine oxidase that acts on fructosyl valyl histidine having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 and does not substantially act on fructosyl valyl leucine. Encoding genes are provided, ie genomic DNA and cDNA.
[0020]
The present invention also provides an amino acid modified by deletion, addition and / or substitution of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6. Acts on modified fructosyl valyl histidine having fructosyl valyl histidine having a sequence and acting on fructosyl valyl histidine and having substantially no effect on fructosyl valyl leucine A gene encoding a fructosylamine oxidase that does not substantially act on the enzyme is provided.
[0021]
The present invention can also hybridize under stringent conditions with exon regions of nucleic acids having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5, and acts on fructosyl valyl histidine. And a gene encoding a protein having fructosylamine oxidase activity that does not substantially act on fructosylvalylleucine.
[0022]
The present invention also provides a vector, particularly an expression vector, comprising said gene.
The present invention further provides a host cell transformed with the vector.
The present invention further comprises culturing the host, and collecting fructosylamine oxidase that acts on fructosylvalylhistidine and does not substantially act on fructosylvalylleucine from the culture. Provided is a method for producing fructosylamine oxidase which acts on kutosylvalylhistidine and does not substantially act on fructosylvalylleucine.
[0023]
In addition, an enzyme that does not act substantially has a relative activity of, for example, 20% or less, preferably 5% or less, more preferably 1% or less, when the activity for a substrate to be measured is defined as 100%. An enzyme.
[0024]
[Embodiments of the Invention]
First, the present invention provides a fructosylamine oxidase that acts on fructosyl valyl histidine having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 and does not substantially act on fructosyl valyl leucine. The encoding genes, ie genomic DNA and cDNA, are provided.
[0025]
However, in order for a certain enzyme to exert its enzyme activity, not all of the natural amino acid sequence is required as it is, and amino acid deletion, addition, substitution, etc. in a region other than the region essential for the expression of activity. Even if the amino acid sequence is modified by the above, it is known to exhibit the original enzyme activity. Therefore, the present invention has an amino acid sequence modified by deletion, addition and / or substitution of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6. And a gene encoding a modified fructosylamine oxidase that acts on fructosylvalylhistidine and maintains fructosylamine oxidase activity that does not substantially act on fructosylvalylleucine.
[0026]
The degree of the above-mentioned modification is such that it can be modified by a well-known technique such as PCR and site-directed mutagenesis, and does not lose fructosylamine oxidase activity. For example, it has 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more homology to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.
Therefore, the present invention also provides amino acids having 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more homology to the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6. A gene encoding a modified fructosylamine oxidase having a sequence and acting on fructosylvalylhistidine and maintaining fructosylamine oxidase activity that does not substantially act on fructosylvalylleucine.
[0027]
Once the native genomic DNA or cDNA encoding the enzyme has been cloned, the genomic DNA, in particular its exon portion or cDNA, or part thereof, can be used as a probe to encode other proteins having the same enzymatic activity. DNA to be selected can be selected. Therefore, the present invention relates to a nucleic acid having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5, such as DNA, in particular a nucleic acid having the sequence of exon, such as DNA, such as genomic DNA or cDNA, Alternatively, it can hybridize with a fragment thereof, for example, preferably 15 bases or more, more preferably 20 bases or more, for example, a fragment of 30 residues or more, and acts on fructosyl valyl histidine. Nucleic acids encoding proteins with fructosylamine oxidase activity that do not substantially act on rilleucine can also be provided.
[0028]
The hybridization conditions in the above case are, for example, the conditions described in Shintaro Nomura and Joji Inazawa “Deisotope Experiment Protocol” p.40 (Shyujunsha, 1994) (500 mM NaPi buffer (pH 7.2), 7% SDS, 1 mM EDTA). Nucleic acids to be screened by the hybridization are particularly limited. For example, synthetic DNA or native DNA may be modified as described above, but natural DNA, for example, genomic DNA or cDNA library is preferred. Such a DNA library can be prepared according to a conventional method from, for example, microorganisms belonging to the genus Carbularia, the genus Pyrenoceta and the genus Arsolinium.
[0029]
A nucleic acid encoding a protein having fructosylamine oxidase activity that acts on the fructosylvalylhistidine of the present invention and does not substantially act on fructosylvalylleucine, in particular DNA is SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, or A genomic DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or a cDNA consisting only of its exon portion. One example of a genomic DNA cloning method is specifically described in Example 1.
[0030]
Once the genomic DNA has been cloned, it acts on the fructosylvalyl histidine of the present invention by screening the cDNA library using the genomic DNA or a portion thereof, in particular the DNA of the exon, as a probe. A cDNA encoding fructosylamine oxidase that does not substantially act on silvalylleucine can be obtained.
Preparation of a cDNA library and its screening by probe hybridization can be performed according to conventional methods. The cDNA library can be prepared from, for example, the above-mentioned starting materials, for example, the genus Carbularia, Pyrenoketa, Arsolinium, and the like.
[0031]
DNA encoding fructosylamine oxidase that acts on modified fructosylvalylhistidine and does not substantially act on fructosylvalylleucine is based on native genomic DNA or cDNA, site-directed mutagenesis, It can be performed according to conventional methods such as PCR, random mutation and gene shuffling. In addition, DNA encoding a truncated enzyme from which one or more amino acids have been deleted can also be obtained by introducing a start codon and / or a stop codon into the native DNA. It can also be obtained by cleaving native DNA with an appropriate restriction enzyme.
[0032]
The present invention also relates to a vector comprising the above DNA, in particular an expression vector, and a host cell transformed with the vector. As a host cell for producing fructosylamine oxidase that acts on fructosylvalylhistidine and does not substantially act on fructosylvalylleucine, it acts on fructosylvalylhistidine and is substantially If the DNA that encodes fructosylamine oxidase that does not act automatically is genomic DNA, it must be a host cell with splicing activity, such as a eukaryotic cell, such as a fungus, such as a yeast or filamentous fungus, or an animal Cells and even plant cells are used.
[0033]
Examples of yeasts include yeasts belonging to the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae. Examples of filamentous fungi include microorganisms belonging to the genus Aspergillus, such as Aspergillus oryzae and Aspergillus niger. Examples of animal cells include insect cells such as silkworm cells and cultured mammalian cells such as COS cells. Furthermore, plant cells can also be used.
[0034]
Further, when the DNA encoding fructosylamine oxidase that acts on fructosyl valyl histidine and does not substantially act on fructosyl valyl leucine is a cDNA, in addition to the above host, a prokaryotic host such as a bacterial host Can be used. As the bacterial host, a common host such as Escherichia coli, Bacillus genus bacteria such as Bacillus subtilis is used.
[0035]
The expression vector needs to contain an expression control sequence such as a promoter and a terminator depending on the host. For example, glycolytic enzymes, gene promoters, Gal promoters and the like are listed as promoters for yeast, AmyA promoter and the like are used as promoters for filamentous fungi, and viral promoters and the like are used as promoters for animal cells. Moreover, as a promoter for bacteria, a promoter for viral vectors or the like is used.
The use of cells as hosts and vector systems compatible therewith has already become a common technique, and in the present invention, those known expression systems can be appropriately selected and used.
[0036]
The present invention also provides a method for producing fructosylamine oxidase which acts on the fructosyl valyl histidine of the present invention and does not substantially act on fructosyl valyl leucine. According to the method for producing fructosylamine oxidase that acts on the fructosyl valyl histidine of the present invention and does not substantially act on fructosyl valyl leucine, the fructosyl valyl histidine of the present invention acts on the fructosyl valyl histidine. A host transformed with an expression plasmid comprising DNA encoding fructosylamine oxidase that does not substantially act on leucine is cultured. As the host, those described in detail above may be used, and culture may be performed according to a conventional method, preferably liquid culture.
[0037]
An enzyme-containing aqueous solution can be obtained by extracting the culture or cells with water or an aqueous buffer such as a phosphate buffer. In order to collect and purify the enzyme from the enzyme-containing solution, a conventional method for purifying the enzyme may be used.
For example, salting-out, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, adsorption chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC) and the like can be used in combination.
[0038]
【Example】
Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
Example 1.  Pyrenometer SP ( Pyrenocaeta sp. ) YH807 ( FERM P-19210 ) Genome encoding fructosylamine oxidase DNA Cloning
Determination of partial amino acid sequence
In accordance with the method described in Japanese Patent Application No. 2003-, 60 μg of lyophilized product of purified enzyme obtained from Pyrenocaeta sp. YH807 (FERM P-19210) was used. , P48-52, Yodosha, 1992), a fragment of the enzyme was obtained and its sequence was determined. That is, 50 μl of 45 mM dithiothreitol was added and treated at 50 ° C. for 15 minutes, 5 μl of 100 mM iodoacetamide was added and left for 15 minutes.
[0039]
140 μl of distilled water was added, and 1.0 μg endoproteinase Lys-C (manufactured by Roche Diagnostics) was added, followed by incubation at 37 ° C. overnight. The fragmented enzyme was separated by HPLC to obtain each enzyme fragment. Each fragment was analyzed using an N-terminal sequence sequencer (Shimadzu PPSQ-21). The resulting sequence was as follows:
[0040]
Fragment (1) Val Xaa Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr Arg Phe Lys (SEQ ID NO: 7)
Fragment (2) Glu Leu Phe Asn Arg Ala Met Xaa Trp Xaa Thr Asp Thr Ala Asp Ala Ala (SEQ ID NO: 8)
Fragment (3) Thr Thr Val Ile Val Val Gly Gly Gly Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His (SEQ ID NO: 9)
Fragment (4) Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Asn His Asp Glu Ser Pro Arg Ala Lys (SEQ ID NO: 10)
Fragment (5) Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser Pro Ala Leu Val Asp Leu Glu Asp Gln Xaa: Val Ser Lys (SEQ ID NO: 11)
Fragment (6) Asn Phe Met Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys (SEQ ID NO: 12)
Fragment (7) His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro His Ala Ser Glu Ala Ser Ile Lys (SEQ ID NO: 13)
Fragment (8) Ala Trp Val Tyr Ala His Met Gln Leu Thr Pro Lys (SEQ ID NO: 14)
[0041]
Pyrenometer SP ( Pyrenocaeta sp. ) YH807 ( FERM P-19210 ) Genome encoding fructosylamine oxidase DNA Cloning
(1) Preparation of chromosomal DNA
100 ml of Sabouraud medium (glucose 4.0%, polypeptone 1.0%, pH 5.6) was placed in a 500 ml Sakaguchi flask, autoclaved, and Pyrenocaeta sp. YH807 was inoculated. After shaking culture at 25 ° C. for 4 days, the cells were collected by filtration through No. 2 filter paper.
[0042]
The cells were frozen with liquid nitrogen and pulverized to a fine powder in a mortar. 15 ml of DNA extraction buffer (5.0% SDS, 0.1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0) was added, and dissolved by shaking gently. The supernatant was obtained by centrifugation (5,000 rpm, 6 min, rt.), Phenol / chloroform extraction was performed 3 times, ether extraction was performed 2 times, the ether was evaporated, 1 ml of 3M sodium acetate and 25 ml of ethanol were added, − Left at 30 ° C. for 30 minutes.
[0043]
Chromosomal DNA was recovered by centrifugation (12,000 rpm, 10 min, 4 ° C.), washed like 70% ethanol, and dissolved in 400 μl of TE. Next, 10 μl (0.132 U) of RNase was added to the obtained DNA solution and treated at 37 ° C. for 1 hour, and then 5 μl (0.6 U) of proteinase K was added and treated at 50 ° C. for 1 hour. After phenol / chloroform extraction (twice) and chloroform / isoamyl alcohol extraction (once), DNA was collected by ethanol precipitation. After washing with a 70% ethanol solution, ethanol was removed and dissolved in 200 μl of TE.
[0044]
(2) Amplification of fructosylamine oxidase gene fragment
i. Primer design
A P1 primer was designed by sense from the sequence (SEQ ID NO: 15) of (Lys) Val (Cys) Asp Glu Phe Pro Gly in the fragment (1).
P1 AA (A / G) GT (T / C / A / G) TG (T / C) GA (T / C) GA (A / G) TT (T / C) CC (A / T / G / C ) GG (SEQ ID NO: 16)
Fragment (2) Met (Cys) Trp (Cys) Thr Asp Thr Ala sequence (SEQ ID NO: 17)
P2 primer was designed with antisense.
P2 GC (A / T / G / C) GT (G / A) TC (A / T / G / C) GT (G / A) CACCA (G / A) CACAT (SEQ ID NO: 18)
[0045]
ii. Acquisition of fructosylamine oxidase gene fragment
Using the chromosomal DNA obtained by the above-mentioned method as a template DNA, 35 cycles of PCR reaction were carried out using a combination of P1 primer and P2 primer. As a result, a 230 bp DNA fragment was specifically amplified. The nucleotide sequence “SEQ ID NO: 19” (1148 to 1377th nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1) of the obtained DNA fragment was determined.
[0046]
(3) Determination of base sequence of fructosylamine oxidase gene
i 5 'Upstream DNA fragment amplification
A P3 primer was designed from “SEQ ID NO: 19”.
P3 TTTGGCATGAGATCTGGGAACCGA (SEQ ID NO: 20)
(The complementary sequence of the nucleotide sequence from 1229 to 1252 of SEQ ID NO: 1)
A P4 primer was designed from “SEQ ID NO: 19”.
P4 GCCCTTGCACCAAATGGTTGATGC (SEQ ID NO: 21)
(Complementary sequence of nucleotide sequence 1192 to 1215 of SEQ ID NO: 1)
[0047]
Amplification of the 5 'upstream region DNA fragment was performed as follows. The chromosomal DNA of Pyrenocator SP YH807 (FERM P-19210) prepared according to the method of Raeder et al. (U. Raeder and P. Broda, Lett. Appl. Microb., 1, 17-20 (1985)) After digestion with Eco RI, cassette-ligation-mediated PCR was performed using LA-PCR in vitro Cloning kit manufactured by Takara Shuzo.
[0048]
That is, an Eco RI cassette (Takara Shuzo) was bound to a restriction enzyme-treated fragment, and a PCR reaction was carried out for 35 cycles using C1 primer (Takara Shuzo) and P3 primer as the template DNA. Using the reaction solution diluted 100-fold as a template DNA, C2 primer (Takara Shuzo) and P4 primer were used, and PCR reaction was further carried out for 35 cycles. As a result, a 1,200 bp DNA fragment was specifically amplified. The base sequence “SEQ ID NO: 22” (1st to 1180th base sequence of SEQ ID NO: 1) was determined.
[0049]
ii. Amplification of 3 'downstream DNA fragment
A P5 primer was designed from “SEQ ID NO: 22”.
P5 TACTTATCCTCACGCATCCGAAGCC (SEQ ID NO: 23) (base sequence from 1,264 to 1,288 of SEQ ID NO: 1)
A P6 primer was designed from “SEQ ID NO: 22”.
P6 GCGGCATTCTTACCACAGTTCAAGG (SEQ ID NO: 24) (base sequence from SEQ ID NO: 1, 1,307 to 1,331)
[0050]
Amplification of the 3 'downstream DNA fragment was carried out as follows. After digesting the chromosomal DNA of Pyrenocateta sp. YH807 with the restriction enzyme Sal I, the restriction enzyme-treated fragment is ligated with the Sal I cassette (Takara Shuzo), and then the cassette-ligation is performed using the Takara Shuzo LA-PCR in vitro Cloning kit. -mediated PCR was performed. Using this DNA as a template DNA, C1 primer and P5 primer were used, and PCR reaction was carried out for 35 cycles.
[0051]
Using the reaction solution diluted 100-fold as a template DNA, C2 primer and P6 primer were used, and PCR reaction was further performed for 35 cycles. As a result, a 720 bp DNA fragment was specifically amplified. The base sequence “SEQ ID NO: 25” (base sequence 1,338 to 2,025 of SEQ ID NO: 1) of the amplified DNA fragment was determined.
SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, and SEQ ID NO: 25 were joined together to determine the base sequence “SEQ ID NO: 1” of the fructosylamine oxidase gene.
[0052]
As a result of searching for homology with known fructosylamine oxidase based on the obtained nucleotide sequence, Penicillium janthinellum fructosyl amino acid oxidase gene (Japanese Patent Laid-Open No. 11-46769), 67.1%, Aspergillus It showed 66.7% homology with the Aspergillus nidulans fructosyl amino acid oxidase gene (Jeong, HY et. Al., Arch. Microbiol. 178 (5), 344-350 (2002)).
[0053]
Example 2.Pyrenometer SP ( Pyrenocaeta sp. ) YH807 ( FERM P-19210 ) Encodes fructosylamine oxidase cDNA Cloning
(1) Preparation of total RNA
YM medium (glucose 1.0%, polypeptone 0.5%, yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, KH₂PO_Four 0.1% MgSO_Four・ 7H₂(O 0.05%, pH 6.0) 100 ml was placed in a 500 ml Sakaguchi flask, autoclaved, and inoculated with Pyrenocator SP YH807. After shaking culture at 25 ° C. for 4 days, the cells were collected by filtration through No. 2 filter paper. The cultured product after freezing was frozen in liquid nitrogen, pulverized in a mortar, and extracted according to its protocol using TRIZOL Reagent manufactured by Lifetech Oriental, to obtain total RNA.
[0054]
(2) Acquisition of fructosylamine oxidase gene cDNA
A) Primer design
ATG, which seems to be the transcription start point, was estimated, and a P7 primer was designed from the upstream sequence.
P7 AGGAAGAAGTTTCACCTCGACTCCAGC (SEQ ID NO: 26) (SEQ ID NO: 1 nucleotide sequence from 91 to 117)
A P8 primer was designed by sense from the sequence of Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala (SEQ ID NO: 27) of fragment (5).
P8 AAAGTTGTCCTGGCAGCTGGTGCA (SEQ ID NO: 28) (base sequence from 864 to 887 of SEQ ID NO: 1)
A P9 primer was designed by antisense from the sequence (SEQ ID NO: 29) of Ala His Met Gln Leu Thr Pro Lys of fragment (8).
P9 CTTCGGGGTGAGCTGCATGTGAGC (SEQ ID NO: 30) (base sequence from 864 to 887 of SEQ ID NO: 1)
[0055]
B) Determination of cDNA sequence
From about 1 μg of total RNA, cDNA was synthesized using 3′-Full RACE Core Set (Takara Shuzo) under conditions according to the protocol. Using the obtained cDNA as a template DNA, PCR was carried out for 35 cycles using 3site Adapter Primer (Takara Shuzo), P8 primer, P7 primer and P9 primer as primers. The nucleotide sequence of the obtained DNA fragment was determined, and “SEQ ID NO: 31” (amino acid sequence from 225 to 440th of SEQ ID NO: 1), “SEQ ID NO: 32” (from 1 to 237 of SEQ ID NO: 4) Amino acid sequence) was determined. SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 were joined together to determine the base sequence “SEQ ID NO: 33” of the fructosylamine oxidase gene cDNA.
[0056]
As a result of searching for homology with known fructosylamine oxidase based on the amino acid sequence deduced from the obtained base sequence, it was found that Penicillium janthinellum fructosyl amino acid oxidase (JP-A-11-46769) 71%, 74.8% homology with Aspergillus nidulans fructosyl amino acid oxidase gene (Jeong, HY et. Al., Arch. Microbiol. 178 (5), 344-350 (2002)) .
[0057]
Example 3 .  Pyrenometer SP ( Pyrenocaeta sp. ) YH807 ( FERM P-19210 ) Expression of fructosylamine oxidase
In order to efficiently express fructosylamine oxidase, genomic DNA was cloned again from the Pyrenocaeta sp. YH807 (FERM P-19210) strain.
P10 primer and P11 primer were designed based on the base sequence of Pyrenocaeta sp. YH807 fructosylamine oxidase gene.
P10 AAAGGATCCATGCATGCTTCACGAGCAAAGACGACAGTGATCGTC (SEQ ID NO: 34) (sequence in which Eco T22I and Bam HI sites are added to the nucleotide sequence from 124 to 153 of SEQ ID NO: 1)
P11 ATTGAATTCTTGCTCCCACGTGCTTCAGGCCTGAAAAGG (SEQ ID NO: 35) (sequence in which Eco RI site is added to the complementary sequence of nucleotide sequence from 1,941 to 1,970 of SEQ ID NO: 1)
[0058]
Isolation and purification of chromosomal DNA of Pyrenochaeta sp. YH807 prepared according to Raeder et al. (U. Raeder and P. Broda, Lett. Appl. Microb., 1, 17-20 (1985)) Then, 35 cycles of PCR reaction were performed using the DNA as template DNA and P10 primer and P11 primer. As a result, a DNA fragment of about 1,900 bp was obtained. The obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes EcoT22I and EcoRI, and then digested with restriction enzymes EcoT22I and EcoRI. Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85-92 (1998)), a vector pTFFAODP100 containing a fructosylamine oxidase gene was prepared.
[0059]
Aspergillus oryzae KBN616-39 (niaD) with the integration vector pTFFAODP100 created by the method described above^-) The strain was transformed. All transformants were transformed into GP medium (N. Kitamoto, J. Matsui, Y. Kawai, Y. Kato, S. Yoshino, K. Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85-92. (1998)) After 100 ml of liquid shaking culture at 30 ° C for 5 days, 5.98 units / ml of fructosylamine oxidase activity (fructosyl valyl histidine was used as a substrate and the measurement was performed in Japanese Patent Application 2003- As a result, it was possible to obtain an A. oryzae FAODP strain with high fructosylamine oxidase production. One unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that produced 1 micromole of hydrogen peroxide per minute at 37 ° C.
[0060]
In addition, SDS-PAGE based on the Laemmli method after concentrating the same culture broth revealed a band at the same position as the purified fructosylamine oxidase, confirming the expression of the same fructosylamine oxidase. .
[0061]
Example 4  Arsolinium SP ( Arthrinium sp.) TO6 (FERM P-19211 ) Cloning of genomic DNA encoding fructosylamine oxidase
(1) Preparation of chromosomal DNA
100 ml of Sabouraud medium (glucose 4.0%, polypeptone 1.0%, pH 5.6) was placed in a 500 ml Sakaguchi flask, autoclaved, and inoculated with Arthrinium sp. TO6. After shaking culture at 25 ° C. for 4 days, the cells were collected by filtration through No. 2 filter paper.
[0062]
The cells were frozen with liquid nitrogen and pulverized to a fine powder in a mortar. 15 ml of DNA extraction buffer (5.0% SDS, 0.1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0) was added, and dissolved by shaking gently. The supernatant was obtained by centrifugation (5,000 rpm, 6 min, rt.), Phenol / chloroform extraction was performed 3 times, ether extraction was performed 2 times, the ether was evaporated, 1 ml of 3M sodium acetate and 25 ml of ethanol were added, − Left at 30 ° C. for 30 minutes.
[0063]
Chromosomal DNA was recovered by centrifugation (12,000 rpm, 10 min, 4 ° C.), washed like 70% ethanol, and dissolved in 400 μl of TE. Next, 10 μl (0.132 U) of RNase was added to the obtained DNA solution and treated at 37 ° C. for 1 hour, and then 5 μl (0.6 U) of proteinase K was added and treated at 50 ° C. for 1 hour. After phenol / chloroform extraction (twice) and chloroform / isoamyl alcohol extraction (once), DNA was collected by ethanol precipitation. After washing with a 70% ethanol solution, ethanol was removed and dissolved in 200 μl of TE.
[0064]
(2) Amplification of fructosylamine oxidase gene fragment
i. Primer design
The following P12 to P17 primers are designed based on the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the fructosylamine oxidase gene derived from Pyrenocaeta sp. YH807 (FERM P-19210) described in Example 1 and Example 2. did.
A P12 primer was designed based on a sense from the sequence of Phe Arg Asp Phe Phe His Asn (SEQ ID NO: 36) (amino acid sequence from 85 to 91) of SEQ ID NO: 1.
P12 TT (T / C) (A / C) A (T / C / A / G) GA (T / C) TT (T / C) TT (T / C) CA (T / C) AA (T / C) GT (SEQ ID NO: 37)
[0065]
A P13 primer was designed with sense from the sequence of Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly (SEQ ID NO: 38) (amino acid sequence from 164 to 170) of SEQ ID NO: 1.
P13 AA (A / G) GC (C / T) AT (C / T) AACGC (C / T) AT (C / T) GG (SEQ ID NO: 39)
A P14 primer was designed with a sense from the sequence of Phe Phe Phe Glu Pro Asn Glu (SEQ ID NO: 40) (amino acid sequence from 265 to 271) of SEQ ID NO: 1.
P14 TT (T / C) TT (T / C) TT (T / C) GA (A / G) CC (T / A / C) AA (T / C) GA (SEQ ID NO: 41)
P15 primer was designed by antisense from the sequence of Phe Phe Phe Glu Pro Asn Glu (SEQ ID NO: 42) (amino acid sequence from 265 to 271) of SEQ ID NO: 1.
P15 TC (A / G) TT (A / T / G) GG (T / C) TC (A / G) AA (A / G) AA (A / G) AA (SEQ ID NO: 43)
[0066]
A P16 primer was designed by antisense from the sequence of Met Cys Trp Cys Thr Asp Thr of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 44) (amino acid sequence from 344 to 350).
P16 GTGTC (T / C / G) GTGCACCAGCACAT (SEQ ID NO: 45)
A P17 primer was designed by antisense from the sequence of Asn Ile Gly Lys His Val Val (SEQ ID NO: 46) (amino acid sequence from 382 to 388) of SEQ ID NO: 1.
P17 AC (C / G) ACGTGCTT (A / G) CC (A / G) ATGTT (SEQ ID NO: 47)
[0067]
ii. Acquisition of fructosylamine oxidase gene fragment
Using the chromosomal DNA obtained by the above-mentioned method as a template DNA, 35 cycles of PCR reaction were carried out using a combination of P12 primer and P17 primer. As a result, a DNA fragment of about 900 bp was specifically amplified. The base sequence “SEQ ID NO: 48” (base sequence from 601 to 1494 of SEQ ID NO: 3) of the obtained DNA fragment was determined.
[0068]
(3) Determination of base sequence of fructosylamine oxidase gene
i. Amplification of 5 'upstream DNA fragment
A P18 primer was designed from “SEQ ID NO: 48”.
P18 TCTTTGCCAGGATGGCATCCTCA (SEQ ID NO: 49) (SEQ ID NO: 3 complementary sequence of nucleotide sequence from position 726 to 748)
A P19 primer was designed from “SEQ ID NO: 48”.
P19 AGCAAGGTCTGGTACTGCTGCTT (SEQ ID NO: 50) (SEQ ID NO: 3 complementary sequence of nucleotide sequence from position 658 to 680)
[0069]
Amplification of the 5 'upstream region DNA fragment was performed as follows. After digesting the chromosomal DNA of Arthrinium sp. TO6 strain prepared according to the method of Raeder et al. (U. Raeder and P. Broda, Lett. Appl. Microb., 1, 17-20 (1985)) with the restriction enzyme Pst I Then, cassette-ligation-mediated PCR was performed using the Takara Shuzo LA-PCR in vitro Cloning kit.
[0070]
Specifically, a Pst I cassette (Takara Shuzo) was ligated to the restriction enzyme-treated fragment, and the PCR reaction was carried out for 35 cycles using C1 primer (Takara Shuzo) and P18 primer as the template DNA. Using the reaction solution diluted 100 times as a template DNA, C2 primer (Takara Shuzo) and P19 primer were used, and PCR reaction was further performed for 35 cycles. As a result, a DNA fragment of about 700 bp was specifically amplified. The base sequence “SEQ ID NO: 51” (base sequence 1 to 641 of SEQ ID NO: 3) was determined.
[0071]
ii. Amplification of 3 'downstream DNA fragment
A P20 primer was designed from “SEQ ID NO: 48”.
P20 ATGTGCTGGTGCACCGACACG (SEQ ID NO: 52) (SEQ ID NO: 3 from base sequence 1,375 to 1,395)
A P21 primer was designed from “SEQ ID NO: 48”.
P21 TATTCTGGCTACGGGCGACAGC (SEQ ID NO: 53) (SEQ ID NO: 3 nucleotide sequence from 1,443 to 1,464)
[0072]
Amplification of the 3 'downstream DNA fragment was carried out as follows. After digesting the chromosomal DNA of Arsulium sp. Strain TO6 with restriction enzyme Eco RI, the Eco RI cassette (Takara Shuzo) is ligated to the restriction enzyme-treated fragment and cassette-ligation using the Takara Shuzo LA-PCR in vitro Cloning kit. -mediated PCR was performed. Using this DNA as a template DNA, C1 primer and P20 primer were used, and PCR reaction was carried out for 35 cycles.
[0073]
Using the reaction solution diluted 100-fold as template DNA, C2 primer and P21 primer were used, and PCR reaction was further performed for 35 cycles. As a result, a 1,200 bp DNA fragment was specifically amplified. The base sequence “SEQ ID NO: 54” (base sequence 1,500 to 1,876 of SEQ ID NO: 3) of the amplified DNA fragment was determined.
SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 51, and SEQ ID NO: 54 were joined together to determine the base sequence “SEQ ID NO: 3” of the fructosylamine oxidase gene.
[0074]
As a result of searching for homology with the known fructosylamine oxidase based on the obtained base sequence, the fructosylamine oxidase gene of Pyrenecata sp. -46769) and 66.9%, and 70.7% homology with Aspergillus nidulans fructosyl amino acid oxidase gene (Jeong, HY et. Al., Arch. Microbiol. 178 (5), 344-350 (2002)) .
[0075]
Example 5 .  Arsolinium SP ( Arthrinium sp. ) TO6 ( FERM P-19211 ) Encodes fructosylamine oxidase cDNA Cloning
(1) Preparation of total RNA
YM medium (glucose 1.0%, polypeptone 0.5%, yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, KH₂PO_Four 0.1% MgSO_Four・ 7H₂(O 0.05%, pH 6.0) 100 ml was placed in a 500 ml Sakaguchi flask, autoclaved, and inoculated with Arsulium sp. TO6. After shaking culture at 25 ° C. for 4 days, the cells were collected by filtration through No. 2 filter paper. The cultured product after freezing was frozen in liquid nitrogen, pulverized in a mortar, and extracted according to its protocol using TRIZOL Reagent manufactured by Lifetech Oriental, to obtain total RNA.
[0076]
(2) Acquisition of fructosylamine oxidase gene cDNA
A) Primer design
ATG, which seems to be the transcription start point, was estimated and a P22 primer was designed from the upstream sequence.
P22 GGATTCCACAGGGGCTTCAACAACACC (SEQ ID NO: 55) (SEQ ID NO: 3 nucleotide sequence from 310 to 336)
A P23 primer was designed with a sense from the sequence (SEQ ID NO: 56) of the fragment (5) Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala.
P23 AAGGTCGTCCTGGCCGCGGGCGCG (SEQ ID NO: 57) (SEQ ID NO: 3 from 979 to 1002)
A P24 primer was designed by antisense from the sequence (SEQ ID NO: 58) of Ala His Met Gln Leu Thr Pro His in fragment (8).
P24 GCCCACATGCAGCTGACGCCGCAC (SEQ ID NO: 59) (base sequence from 1010 to 1083 of SEQ ID NO: 3)
[0077]
B) Determination of cDNA sequence
From about 1 μg of total RNA, cDNA was synthesized using 3'-Full RACE Core Set (Takara Shuzo) under conditions according to the protocol. PCR was performed for 35 cycles using the obtained cDNA as a template DNA and using 3site Adapter Primer (Takara Shuzo), P23 primer, P22 primer and P24 primer as primers. The nucleotide sequence of the obtained DNA fragment was determined, and "SEQ ID NO: 60" (amino acid sequence from 213 to 452 of SEQ ID NO: 3), "SEQ ID NO: 61" (1st to 239th of SEQ ID NO: 3) Amino acid sequence) was determined. SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 61 were joined together to determine the base sequence “SEQ ID NO: 62” of the fructosylamine oxidase gene cDNA.
[0078]
As a result of searching for homology with known fructosylamine oxidase based on the amino acid sequence deduced from the obtained base sequence, 80.2% of fructosylamine oxidase of Pyrenocator SP YH807, fructosyl amino acid oxidase of Penicillium yancineram (JP-A-11-46769) and 74.6%, Aspergillus nidulans fructosyl amino acid oxidase gene (Jeong, HY et. Al., Arch. Microbiol. 178 (5), 344-350 (2002)) and 74.3% homology Showed sex.
[0079]
Example 6 Arsolinium SP ( Arthrinium sp. ) TO6 ( FERM P-19211 ) Expression of fructosylamine oxidase
In order to efficiently express fructosylamine oxidase, genomic DNA was recloned from Arthrinium sp. TO6 (FERM P-19211) strain.
P25 and P26 primers were designed based on the sequence downstream of the transcription start site of Arthrinium sp. TO6 fructosylamine oxidase gene.
P25 AAAGGATCCATGCATCGTCACGAAAGACCACCAAAGTGATTGTCG (SEQ ID NO: 63) (sequence in which Eco T22I and Bam HI sites are added to the nucleotide sequence from 344 to 373 of SEQ ID NO: 3)
P26 ATTGAATTCTTGGTGTCACCCACTTGGGGAAACAAATCA (SEQ ID NO: 64) (sequence in which Eco RI site is added to the complementary sequence of nucleotide sequence from 1,831 to 1,860 of SEQ ID NO: 3)
[0080]
Isolation and purification of chromosomal DNA of Arthrinium sp. TO6 strain prepared according to the method of Raeder et al. (U. Raeder and P. Broda, Lett. Appl. Microb., 1, 17-20 (1985)) Then, the PCR reaction was carried out for 35 cycles using the P25 primer and P26 primer with the DNA as template DNA. As a result, a DNA fragment of about 1,500 bp was obtained. The obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes EcoT22I and EcoRI, and then digested with restriction enzymes EcoT22I and EcoRI. Vector pTF100 (N. Kitamoto, J. Matsui, Y. Kawai, Y. Kato, S. Yoshino, K Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85-92 (1998)), a vector pTFFAODA100 containing a fructosylamine oxidase gene was prepared.
[0081]
Aspergillus oryzae KBN616-39 (niaD) with the integration vector pTFFAODA100 created by the method described above^-) The strain was transformed. All transformants were transformed into GP medium (N. Kitamoto, J. Matsui, Y. Kawai, Y. Kato, S. Yoshino, K. Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85-92. (1998)) After 100 ml of liquid shaking culture at 30 ° C for 5 days, 5.31 units / ml of fructosylamine oxidase activity (fructosyl valyl histidine was used as a substrate. As a result, it was possible to obtain an A. oryzae FAODA strain with high production of fructosylamine oxidase.
[0082]
In addition, SDS-PAGE based on the Laemmli method after concentrating the same culture broth revealed a band at the same position as the purified fructosylamine oxidase, confirming the expression of the same fructosylamine oxidase. .
[0083]
Example 7 .  Carbraria Clavator ( Curvularia claveta ) YH923 (FERM-P19209) Genome encoding fructosylamine oxidase DNA Cloning
(1) Preparation of chromosomal DNA
100 ml of Sabouraud medium (glucose 4.0%, polypeptone 1.0%, pH 5.6) was placed in a 500 ml Sakaguchi flask, autoclaved, and inoculated with Curvularia claveta YH923. After shaking culture at 25 ° C. for 4 days, the cells were collected by filtration through No. 2 filter paper.
[0084]
The cells were frozen with liquid nitrogen and pulverized to a fine powder in a mortar. 15 ml of DNA extraction buffer (5.0% SDS, 0.1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0) was added, and dissolved by shaking gently. The supernatant was obtained by centrifugation (5,000 rpm, 6 min, rt.), Phenol / chloroform extraction was performed 3 times, ether extraction was performed 2 times, the ether was evaporated, 1 ml of 3M sodium acetate and 25 ml of ethanol were added, − Left at 30 ° C. for 30 minutes.
[0085]
Chromosomal DNA was recovered by centrifugation (12,000 rpm, 10 min, 4 ° C.), washed like 70% ethanol, and dissolved in 400 μl of TE. Next, 10 μl (0.132 U) of RNase was added to the obtained DNA solution and treated at 37 ° C. for 1 hour, and then 5 μl (0.6 U) of proteinase K was added and treated at 50 ° C. for 1 hour. After phenol / chloroform extraction (twice) and chloroform / isoamyl alcohol extraction (once), DNA was collected by ethanol precipitation. After washing with a 70% ethanol solution, ethanol was removed and dissolved in 200 μl of TE.
[0086]
(2) Amplification of fructosylamine oxidase gene fragment
i. Primer design
The P12 to P17 primers described in Example 4 were designed.
[0087]
ii. Acquisition of fructosylamine oxidase gene fragment
Using the chromosomal DNA obtained by the above-mentioned method as a template DNA, 35 cycles of PCR reaction were performed with a combination of P13 primer and P17 primer. As a result, a DNA fragment of about 800 bp was specifically amplified. The base sequence “SEQ ID NO: 65” (the base sequence from the 1021st to the 1790th base of SEQ ID NO: 6) of the obtained DNA fragment was determined.
[0088]
Determination of base sequence of fructosylamine oxidase gene
i. Amplification of 5 'upstream DNA fragment
A P27 primer was designed from “SEQ ID NO: 65”.
P27 GCCAAAAGAGGCTGCTTGAACGAT (SEQ ID NO: 66) (complementary sequence of nucleotide sequence from 1083 to 1106 of SEQ ID NO: 5)
A P28 primer was designed from “SEQ ID NO: 65”.
P28 CGATCCAGCACCACCAAAACCAAAC (SEQ ID NO: 67) (SEQ ID NO: 5 complementary sequence of nucleotide sequence from 1062 to 1086)
[0089]
Amplification of the 5 'upstream region DNA fragment was performed as follows. The chromosomal DNA of Curvularia claveta YH923 prepared according to the method of Raeder et al. (U. Raeder and P. Broda, Lett. Appl. Microb., 1, 17-20 (1985)) After digestion with the above, cassette-ligation-mediated PCR was performed using the Takara Shuzo LA-PCR in vitro Cloning kit.
[0090]
That is, an Xba I cassette (Takara Shuzo) was ligated to the restriction enzyme-treated fragment, and a PCR reaction was performed for 35 cycles using C1 primer (Takara Shuzo) and P27 primer as template DNA. Using the reaction solution diluted 100-fold as a template DNA, C2 primer (Takara Shuzo) and P28 primer were used, and PCR reaction was further carried out for 35 cycles. As a result, a 1,200 bp DNA fragment was specifically amplified. The base sequence “SEQ ID NO: 68” (1st to 1044th base sequence of SEQ ID NO: 5) was determined.
[0091]
ii. Amplification of 3 'downstream DNA fragment
A P29 primer was designed from “SEQ ID NO: 65”.
P29 TGGTGCCAGAACAACATGTACTGACC (SEQ ID NO: 69) (SEQ ID NO: 5 from nucleotide sequence 1,713 to 1,738)
A P30 primer was designed from “SEQ ID NO: 65”.
P30 ACCTGGTTTGCCTAGGCACACA (SEQ ID NO: 70) (SEQ ID NO: 5 from 1,736 to 1,757th nucleotide sequence)
[0092]
Amplification of the 3 'downstream DNA fragment was carried out as follows. After digesting the chromosomal DNA of the Curvularia claveta YH923 strain with the restriction enzyme Sal I, the Sal I cassette (Takara Shuzo) was ligated to the restriction enzyme-treated fragment, and the Takara Shuzo LA-PCR in vitro Cloning kit was used. Cassette-ligation-mediated PCR was performed. Using this DNA as a template DNA, C1 primer and P29 primer were used, and 35 cycles of PCR reaction were performed. Using the reaction solution diluted 100-fold as template DNA, C2 primer and P30 primer were used, and PCR reaction was further performed for 35 cycles. As a result, a 1,000 bp DNA fragment was specifically amplified. The base sequence “SEQ ID NO: 71” (the base sequence from 1775 to 2,212 of SEQ ID NO: 5) of the amplified DNA fragment was determined.
SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 68, and SEQ ID NO: 71 were joined together to determine the base sequence “SEQ ID NO: 5” of the fructosylamine oxidase gene.
[0093]
As a result of searching for homology with known fructosylamine oxidase based on the obtained base sequence, 75.0% of fructosylamine oxidase of Pyrenocateta SP YH807, 71.5% of fructosylamine oxidase of Arsolinium sp.TO6, penicillium・ The fructosyl amino acid oxidase gene of Jancineram (JP 11-46769) and 67.2%, the fructosyl amino acid oxidase gene of Aspergillus nidulans (Jeong, HY et. Al., Arch. Microbiol. 178 (5), 344-350 ( 2002)) and 67.8% homology.
[0094]
Example 8 .  Carbraria Clavator ( Curvularia claveta. ) YH923 (FERM-P19209) Encodes fructosylamine oxidase cDNA Cloning
(1) Preparation of total RNA
YM medium (glucose 1.0%, polypeptone 0.5%, yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, KH₂PO_Four 0.1% MgSO_Four・ 7H₂O 0.05%, pH 6.0) 100 ml was placed in a 500 ml Sakaguchi flask, autoclaved, and inoculated with Curvularia claveta YH923. After shaking culture at 25 ° C. for 4 days, the cells were collected by filtration through No. 2 filter paper. The cultured product after freezing was frozen in liquid nitrogen, pulverized in a mortar, and extracted according to its protocol using TRIZOL Reagent manufactured by Lifetech Oriental, to obtain total RNA.
[0095]
(2) Acquisition of fructosylamine oxidase gene cDNA
A) Primer design
ATG, which seems to be the transcription start point, was estimated, and a P31 primer was designed from the upstream sequence.
P31 TCATTTAGACATGGCGCCCTCAAGAGC (SEQ ID NO: 72) (SEQ ID NO: 5 nucleotide sequence from 471 to 500)
A P32 primer was designed by sense from the sequence of Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala (SEQ ID NO: 73) of fragment (5).
P32 AAAGTTGTGCTTGCAGCTGGTGCTTG (SEQ ID NO: 74) (SEQ ID NO: 5, nucleotide sequence from 1,162 to 1,187)
A P33 primer was designed by antisense from the sequence (SEQ ID NO: 75) of Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Glu of fragment (8).
P33 TCCTCAGGCGTAAGCTGTATGTGAGC (SEQ ID NO: 76) (SEQ ID NO: 5, nucleotide sequence from position 1,292 to 1,317)
[0096]
B) Determination of cDNA sequence
CDNA was synthesized from about 1 μg of total RNA using 3′-Full RACE Core Set (Takara Shuzo) under conditions according to the protocol. The obtained cDNA was used as a template DNA, and PCR was carried out for 35 cycles using 3site Adapter Primer (Takara Shuzo), P32 primer, P31 primer and P33 primer as primers. The nucleotide sequence of the obtained DNA fragment was determined, and "SEQ ID NO: 77" (amino acids 213 to 440 of SEQ ID NO: 5), "SEQ ID NO: 78" (1 to 237 of SEQ ID NO: 5) Amino acid sequence) was determined. SEQ ID NO: 77 and SEQ ID NO: 78 were joined together to determine the base sequence “SEQ ID NO: 79” of the fructosylamine oxidase gene cDNA.
[0097]
As a result of searching for homology with known fructosylamine oxidase based on the amino acid sequence deduced from the obtained base sequence, 86.1% of fructosylamine oxidase of pyrenocateta SP YH807 and fructosylamine of Arsolinium sp.TO6 Oxidase and 80.3%, Penicillium yancineram fructosyl amino acid oxidase (JP-A-11-46769) and 75.2%, Aspergillus nidulans fructosyl amino acid oxidase gene (Jeong, HY et. Al., Arch. Microbiol. 178 (5) 344-350 (2002)) and 74.6% homology.
[0098]
Example 9 .  Carbraria Clavator ( Curvularia claveta ) YH923 (FERM-P19209) Expression of fructosylamine oxidase
In order to efficiently express fructosylamine oxidase, genomic DNA was recloned from the Curvularia claveta strain YH923.
P34 and P35 primers were designed based on the nucleotide sequence of the Curvularia claveta YH923 fructosylamine oxidase gene.
P34 GACATGCATCCCTCAAGAGCAAACACTTCTGTTATCGTT (SEQ ID NO: 80) (sequence in which Eco T22I and Bam HI sites are added to the base sequence from 477 to 506 of SEQ ID NO: 5)
P35 TCCATGCATGTGCCAGATCCTCCGCGAGTGTACCC (SEQ ID NO: 81) (SEQ ID NO: 5 complementary sequence of nucleotide sequence from 1,805 to 1,839 of SEQ ID NO: 5)
P36 CACATGCATGGAGATGGCGGCCTGGTACTGGCGAT (SEQ ID NO: 82) (SEQ ID NO: 5 from 1,828 to 1,862 base sequences)
P37 ATTGAATTCTCAGATTCTTTCCCCTGCACCAGTCGCACC (SEQ ID NO: 83) (sequence in which Eco RI site is added to the complementary sequence of nucleotide sequence 2,281 to 2,210 of SEQ ID NO: 5)
[0099]
The chromosomal DNA of Curvularia claveta strain YH923 prepared according to the method of Raeder et al. (U. Raeder and P. Broda, Lett. Appl. Microb., 1, 17-20 (1985)) was isolated and purified. Using the DNA as a template DNA, PCR was performed for 35 cycles using P34 and P35 primers, and P36 and P37 primers. As a result, DNA fragments of about 1,400 bp and about 400 bp were obtained. The obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes EcoT22I and EcoRI, and then digested with restriction enzymes EcoT22I and EcoRI. Vector pTF100 (N. Kitamoto, J. Matsui, Y. Kawai, Y. Kato, S. Yoshino, K Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85-92 (1998)), a vector pTFFAODC100 containing the fructosylamine oxidase gene was prepared.
[0100]
Aspergillus oryzae KBN616-39 (niaD) using the integration vector pTFFAODC100 created by the method described above^-) The strain was transformed. All transformants were transformed into GP medium (N. Kitamoto, J. Matsui, Y. Kawai, Y. Kato, S. Yoshino, K. Ohmiya, and N. Tsukagoshi, Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 85-92. (1998)) After 100 ml of liquid shaking culture at 30 ° C for 5 days, 6.52 units / ml of fructosylamine oxidase activity (fructosylvalylhistidine was used as a substrate, and the measurement was performed in Japanese Patent Application 2003- As a result, it was possible to obtain an A. oryzae FAODC strain with high production of fructosylamine oxidase.
[0101]
In addition, SDS-PAGE based on the Laemmli method after concentrating the same culture broth revealed a band at the same position as the purified fructosylamine oxidase, confirming the expression of the same fructosylamine oxidase. .
[0102]
Comparative Example 1 .  Penicillium Yancineram NBRC6581 Substrate specificity of fructosyl amino acid oxidase
<Culture method and enzyme preparation method>
100ml 0.5% fructosyl-ε-lysine, 1.0% glucose, 0.1% dipotassium phosphate, 0.1% monosodium phosphate, 0.05% magnesium sulfate, 0.01% potassium chloride, 0.2% yeast extract in a 500ml Sakaguchi flask Each medium (pH 6.0) was added, and after sterilization, Penicillium yancineram NBRC6581 strain was inoculated and cultured with shaking at 28 ° C. for 48 hours. After completion of the culture, the cells are collected, and the cells frozen in liquid nitrogen are ground in a mortar to disrupt the cells. Then, 40 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.3) is added, and overnight at 5 ° C. After leaving it to stand, it was centrifuged to obtain a cell-free extract.
[0103]
Concentrate the resulting cell-free extract, perform gel filtration with Hiload 16/60 Superdex 200pg (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with 0.2M potassium phosphate buffer (pH 7.5) The fraction of fructosyl amino acid oxidase (molecular weight about 50,000-10,000) acting on silvaline was collected. The obtained fructosyl amino acid oxidase fraction was concentrated to obtain fructosyl amino acid oxidase. The activity of the obtained enzyme solution against fructosyl valine was 4.3 mU / ml.
[0104]
The effect | action with respect to fructosyl valyl histidine and fructosyl valyl leucine was investigated using the obtained fructosyl amino acid oxidase. The measuring method was performed according to Japanese Patent Application 2003-67266. As a result, fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium yancineram NBRC6581 had no effect on fructosyl valyl histidine and fructosyl valyl leucine.
[0105]
Comparative Example 2 .  Aspergillus nidurans FGSCA4 Substrate specificity of fructosyl amino acid oxidase
<Culture method and enzyme preparation method>
Place a medium (pH 6.0) containing 100 ml of 1.0% fructosyl valine, 2.0% glucose and 1.0% polypeptone in a 500 ml Sakaguchi flask. After sterilization, inoculate Aspergillus nidulans FGSCA4 strain. Cultured with shaking at 48 ° C. for 48 hours. After completion of the culture, the cells are collected, and the cells frozen in liquid nitrogen are ground in a mortar to disrupt the cells. Then, 40 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.3) is added and left at 5 ° C overnight. And then centrifuged to obtain a cell-free extract.
[0106]
The resulting cell-free extract was concentrated and then filtered through High Road 16/60 Superdex 200pg (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrated with 0.2M potassium phosphate buffer (pH 7.5) to obtain fructose. The fraction of fructosyl amino acid oxidase (molecular weight about 50,000-10,000) acting on silvaline was collected. The obtained fructosyl amino acid oxidase fraction was concentrated to obtain fructosyl amino acid oxidase. Using the obtained enzyme solution, the activity against fructosyl valine was measured according to Japanese Patent Application No. 2003-67266, and it was 3.5 mU / ml.
[0107]
Moreover, as a result of examining the action on fructosyl valyl histidine and fructosyl valyl leucine in the same manner using the obtained fructosyl amino acid oxidase, the fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans FSCCA4 is fructosyl valyl histidine and There was no effect on fructosylvalylleucine.
[0108]
[Sequence Listing]

Claims (6)

1-deoxyfructosyl-L-valyl-L-leucine acting on 1-deoxyfructosyl-L-valyl-L-histidine having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 gene encoding 5% or less, the fructosyl amine oxidase when the reactivity was defined as 100% reactivity to 1-deoxy-fructosyl -L- valyl -L- histidine against the. SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: in the amino acid sequence in the amino acid sequence shown in 6, one or a several amino acid deletions, additions and / or amino acid sequence modified by substitution and 1-deoxyfructosyl -L- valyl acts on -L- histidine, 1-deoxyfructosyl -L- valyl -L- leucine reactivity against 1-deoxyfructosyl -L- valyl -L- histidine A gene encoding a protein having fructosylamine oxidase activity , which is 5% or less when the reactivity with respect to is 100 % . 1-deoxyfructosyl-L-valyl-L-, which can hybridize with an exon region of a nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 under stringent conditions acts on histidine, 1-deoxyfructosyl -L- valyl -L- leucine reactivity against the reactivity to 1-deoxy-fructosyl -L- valyl -L- histidine is 100% at 5% or less there, a gene encoding a protein having a fructosyl amine oxidase activity.   A vector comprising the gene according to any one of claims 1 to 3.   A host cell transformed with the vector according to claim 4. Acts on the 1-deoxyfructosyl -L- valyl -L- histidine, 1-deoxyfructosyl -L- valyl -L- leucine reactivity against the reaction to 1-deoxy-fructosyl -L- valyl -L- histidine is 5% or less when the sexual and 100%, in the manufacturing method of fructosyl amine oxidase, culturing the host cell of claim 5, from the culture, 1-deoxyfructosyl -L- valyl - acts on l- histidine, 1-deoxyfructosyl -L- valyl -L- leucine reactivity against the reactivity to 1-deoxy-fructosyl -L- valyl -L- histidine is taken as 100% 5% Collecting fructosylamine oxidase , which is the following: