JP4238317B2

JP4238317B2 - Solid culture method of ectomycorrhizal fungi

Info

Publication number: JP4238317B2
Application number: JP2003195322A
Authority: JP
Inventors: 卓哉丸本; 宏秋岡部; 佳也大松
Original assignee: Forestry and Forest Products Research Institute; Yamaguchi University NUC
Current assignee: Forestry and Forest Products Research Institute; Yamaguchi University NUC
Priority date: 2003-07-10
Filing date: 2003-07-10
Publication date: 2009-03-18
Anticipated expiration: 2023-07-10
Also published as: JP2005027546A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、外生菌根菌の固体培養方法に関し、特に、数十リットル以上の培養槽を用いて、外生菌根菌を安定的に固体培養する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
外生菌根菌は、マツ科、ブナ科、カバノキ科などの木本植物の根に共生する担子菌類や子嚢菌類などであり、現在、世界中において65属5000種以上存在することが知られている。
宿主植物の根に共生した外生菌根菌は、宿主植物から供給されるグルコースなどの光合成産物をエネルギー源として、菌自身が増殖する一方で、広範囲の土壌中に張り巡らせた菌糸を通じて、可給態リン酸やカリウム、窒素などの無機養分または水分を宿主植物に供給する。
そのため、外生菌根菌が感染した植物は、感染していない植物よりも、宿主植物の生存率を向上させたり、成長を促進させたりすることが知られている。
また、これ以外にも、宿主植物の根に共生した外生菌根菌は、宿主植物根への病原菌の侵入を軽減したり、乾燥耐性、凍害耐性、重金属耐性を宿主植物に付与したりするなど宿主植物の生育環境を改善する効果が報告されている。
【０００３】
上述したような外生菌根性木本植物の生育しているところでは、通常、土着の外生菌根菌が既に存在しているため、ほとんどの根は、これら土着菌が高い割合で感染している。
しかし、道路建設などによって表層土が取り除かれ、下層土が剥き出しとなった裸地、火災や焼畑などの跡地、火山活動に伴う火砕流や自然災害による土石流などの堆積地、土壌浸食や沙漠化によって生じた裸地、地下資源を得るために掘削した鉱山跡地などには、土着菌が存在しないか、またはたとえ存在したとしても非常に少ない場合が多い。また、このような場所では、植物や菌類の種多様性も長期に亘って低い場合が多い。
【０００４】
ところで、今日、世界中では地球温暖化などの地球環境問題についての関心の高まりから、人類がこれまで開発した場所や自然災害によって裸地化した場所を、人為的に元の植生へ復元するための緑化や樹林化が行われている。
その際、導入する外生菌根性の木本植物の定着率を向上させたり、生育を促進させたりするために、播種および苗移植の前後に外生菌根菌を接種したり、外生菌根菌感染苗を移植したりする方法が行われてきた。
この場合の使用する接種源としては、（１）外生菌根性の木本植物の生育地土壌（土壌接種源）、（２）外生菌根菌の子実体から採取した胞子（胞子接種源）、（３）室内で人工的に培養、増殖させた栄養菌糸（栄養菌糸接種源）の主に3つの形態がある。
【０００５】
他方、我が国においては、国土の約70％が森林であり、外生菌根性樹種を主体とするほとんどの森林土壌には既に土着の外生菌根菌が存在し、これらの土壌を接種源とすることで、容易に外生菌根菌感染苗を作製することができる。
しかし、近年、我が国においては、道路や土地開発に伴う森林伐採、活発な火山活動などにより、広域の裸地面積が増加している。そのため、今後、国内においてもこれらの裸地化した場所を緑化または樹林化する機会が増加し、外生菌根菌の接種源を接種したり、外生菌根菌の感染苗を移植したりする場面が増加することが予測される。
このため、従来の土壌接種源だけではなく、胞子や栄養菌糸など多様な形態の接種源を安定的に確保する技術の開発が求められている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上述した問題を解決し、外生菌根菌の接種源のなかで、特に栄養菌糸を用いた外生菌根菌を、数十リットル以上の培養槽を用いて、短期間で安定かつ大量に培養することが可能であり、しかも、均質な菌体を培養することが可能な固体培養方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、請求項１に係る発明は、多孔質担体に含水率が３０〜４０重量％となるように液体培地を含有させた後、培養槽内において該多孔質担体を密閉状態で滅菌し、次に、外生菌根菌の栄養菌糸を含む液体培地を該培養槽内に添加して該多孔質担体の含水率を６５〜８０重量％に調整し、無菌状態で、多孔質担体を攪拌した後に静置状態とすることにより、外生菌根菌を培養することを特徴とする外生菌根菌の固体培養方法である。
なお、本発明における「静置状態」には、発育速度の異なる外生菌根菌の種類により、静置と撹拌を繰り返すことを含むものである。
【０００８】
好ましくは、請求項２に係る発明のように、請求項１に記載の外生菌根菌の固体培養方法において、該多孔質担体が主に無機質材料であることを特徴とする。
より好ましくは、請求項３に係る発明のように、該無機質材料は、バーミキュライトとパーライトとを単独又は混合して用いることを特徴とする。
【０００９】
また、請求項４に係る発明では、請求項１乃至３のいずれかに記載の外生菌根菌の固体培養方法において、該滅菌方法が、オートクレーブ滅菌であることを特徴とする。
【００１０】
さらに、請求項５に係る発明では、請求項１乃至４のいずれかに記載の外生菌根菌の固体培養方法において、該無菌状態で外生菌根菌を培養する温度が、２４〜２８℃であることを特徴とする。
【００１１】
また、請求項６に係る発明では、請求項１乃至５のいずれかに記載の外生菌根菌の固体培養方法において、該外生菌根菌は、ヌメリイグチ、ウラムラサキ、シノコッカムジオフィラムのうち少なくとも１種類以上を含有することを特徴とする。
さらに、請求項７に係る発明では、請求項１乃至６のいずれかに記載の外生菌根菌の固体培養方法において、該外生菌根菌の栄養菌糸を含む液体培地は、菌体が１ｍｍ以下に砕片化されていることを特徴とする。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明における好適例を用いて詳細に説明する。
本発明に係る外生菌根菌としては、ハラタケ目テングタケ科のテングタケ属である、Amanita murina、Amanita pantherina（テングタケ）、Amanita muscaria（ベニテングタケ）、Amanita porphyria、Amanita rubescens、Amanita aspera、Amanita citrina、Amanita spreta、Amanita xanthocephla、Amanita umbrenella、Amanita flavoconia、Amanita spissa（ヘビキノコ）や、イグチ科のイグチ属である、Boletus edulis（ヤマドリタケ）、Boletus aereus（ススケヤマドリタケ）、Boletus erythropus（オオウラベニイロガワリ）、Boletus calopus（アシベニイグチ）、Boletus pulverulentus（イロガワリ）、Boletus ornatipes（キアミアシイグチ）、ヌメリイグチ属である、Suillus collinitus、Suillus granulatus（チチアワタケ）、Suillus luteus（ヌメリイグチ）、Suillus brevipes、Suillus bovinus（アミタケ）、Suillus laricinus（シロヌメリイグチ）、Suillus subluteus（ヌメリツバイグチ）、Suillus plorans、Suillus variegatus、Suillus lakei、Suillus grevillei（ハナイグチ）、Suillus intermedius、Suillus bellinii、Suillus mediterraneensis、Suillus americanus（キヌメリイグチ）、Suillus neoalbidipes、Suillus ochraceoroseus、Suillus sinuspaulianus、Suillus spectabilis（キノボリイグチ）、Suillus tomentosus（ワタゲヌメリイグチ）、Suillus placidus（ゴヨウイグチ）、Suillus sibiricus、コショウイグチ属である、Chalciporus pierrhuguesii、Chalciporus piperatus（コショウイグチ）、アワタケ属である、Xerocomus subtomentosus（アワタケ）、Xerocomus chrysenteron（キッコウアワタケ）、 Xerocomus badius（ニセイロガワリ）、Xerocomus ferrugineus、ヤマイグチ属である、Leccinum aurantiacum、Leccinum arenicola、Leccinum holopus（シロヤマイグチ）、ニガイグチ属である、Tilopilus felleus（ニガイグチ）、アミハナイグチ属である、Boletinus cavipes（アミハナイグチ）、またフウセンタケ科のフウセンタケ属である、Cortinarius favrei、Cortinarius russus、Cortinarius purpurascens（カワムラフウセンタケ）、Cortinarius vibratilis（キアブラシメジ）、Cortinarius allutus（ニセマンジュウガサ）、Cortinarius amoenolens、Cortinarius anomalus（マルミノフウセンタケ）、Cortinarius brunneus、Cortinarius glaucopus、Cortinarius mucosus（アブラシメジモドキ）、Cortinarius subpurpurascens、Cortinarius caerulescens（ムラサキシメジモドキ）、ワカフサタケ属である、Hebeloma edurum、Hebeloma repandum、Hebeloma mesophaeum（ワカフサタケ）、Hebeloma hiemale、Hebeloma crustuliniforme（オオワカフサタケ）、Hebeloma cylindrosporum、Hebeloma sinapizans、Hebeloma marginatulum、Hebeloma polare、Hebeloma longicaudum（ナガエノワカフサタケ）、Hebeloma westraliense、Hebeloma eburneum、Hebeloma sinapizans、Hebeloma mesophacus、Hebeloma velutipes、Hebeloma vinosophyllum（アカヒダワカフサタケ）、またオキナタケ科のキショウゲンジ属である、Descolea maculata、ヌメリガサ科のヌメリガサ属である、Hygrophorus latitabundus、Hygrophorus russula（サクラシメジ）、ヒダハタケ科のヒダハタケ属である、Paxillus involutus（ヒダハタケ）、ベニタケ科のチチタケ属である、Lactarius deliciosus（アカモミタケ）、Lactarius sanguifluus、Lactarius rufus（アカチチタケ）、Lactarius hatsudake（ハツタケ）、Lactarius akahatsu（アカハツ）、Lactarius insulsus（カラハツモドキ）、Lactarius chrysorrheus（キチチタケ）、Lactarius deterrimus、Lactarius porninsis（カラマツチチタケ）、Lactarius scrobiculatus（キカラハツタケ）、Lactarius affinis、Lactarius hygrophoroides（ヒロハチチタケ）、Lactarius chelidonius、Lactarius indigo（ルリハツタケ）、Lactarius mucidus、Lactarius pubescens（シロカラハツタケ）、Lactarius subpurpureus、Lactarius thejogalus、Lactarius thyinos、Lactarius torminosus（カラハツタケ）、Lactarius vinaceorufescens、Lactarius acerrimus（カラハツタケ）、ベニタケ属である、Russula norvegica、Russula foetens（クサハツ）、Russula subfoetens、Russula velenovskyi、またキシメジ科のキツネタケ属である、Laccaria laccata（キツネタケ）、Laccaria fraterna、Laccaria amethystea（ウラムラサキ）、Laccaria deliciosus、Laccaria montana、Laccaria bicolor（オオキツネタケ）、Laccaria proxima、Laccaria ochropurpurea、Laccaria farinacea、キシメジ属である、Tricholoma matsutake（マツタケ）、Tricholoma focale、Tricholoma striatum（マツシメジ）、Tricholoma flavovirens（キシメジ）、Tricholoma portentosum（シモフリシメジ）、Tricholoma saponaceum（ミネシメジ）、Tricholoma vaccinum（クダアカゲシメジ）、Tricholoma tridentinum var. cedretorum、Tricholoma caligatum（オウシュウマツタケ）、Tricholoma cedrorum、Tricholoma terreum（クマシメジ）、Tricholoma aurantium、Tricholoma cingulatum、Tricholoma fulvum（キヒダマツシメジ）、Tricholoma myomyces、Tricholoma populinum（ムレワシメジ）、Tricholoma resplendens、Tricholoma virgatum（ネズミシメジ）、Tricholoma columbetta（シロケシメジ）、Tricholoma portentosum（シモフリシメジ）、Tricholoma sulphureum（ニオイキシメジ）、シメジ属である、Lyophyllum semitale（スミゾメシメジ）、Lyophyllum shimeji（ホンシメジ）、Lyophyllum fumosum（シャカシメジ）、Lyophyllum decastes（ハタケシメジ）、またオニイグチ科のキクバナイグチ属である、Boletellus russellii（セイタカイグチ）、オニイグチ属である、Strobilomyces floccopus（オニイグチ）、さらに、ニセショウロ目コツブタケ科のコツブタケ属である、Pisolithus tinctorius（コツブタケ）、Pisolithus albus、Pisolithus marmoratus、またニセショウロ科のニセショウロ属である、Scleroderma verrucosum（ザラツキカワタケ）、Scleroderma cepa（タマネギモドキ）、Scleroderma flavidum（ウスキニセショウロ）、Scleroderma dictyosporum、Scleroderma meridionale、Scleroderma polyrhizum（ツチグリカタワタケ）、Scleroderma areolatum（ヒメカタショウロ）、Scleroderma citrinum（ニセショウロ）、Scleroderma paradoxum、Scleroderma bovista（ハマニセショウロ）、さらに、スッポンタケ目ヒステランギウム科のヒステランギウム属である、Hysterangium incarceratum、Hysterangium clathroides、またヒメノガステル目ショウロ科のショウロ属である、Rhizopogon roseolus、Rhizopogon rubescens（ショウロ）、Rhizopogon vinicolor、Rhizopogon semireticulatus、Rhizopogon ochraceorubens、Rhizopogon luteolus（ホンショウロ）、Rhizopogon subaerolatus、Rhizopogon ventricisporus、Rhizopogon vulgaris、Rhizopogon bacteri、Rhizopogon fuscorubens、Rhizopogon ponderosus、Rhizopogon truncates、Rhizopogon abietis、Rhizopogon cusickensis、Rhizopogon liui、Rhizopogon occidentalis、Rhizopogon smithii、Rhizopogon vulgaris、Rhizopogon superiorensis、Rhizopogon colossus、Rhizopogon hawkerae、Rhizopogon parkii、Rhizopogon subareolatus、Rhizopogon villosulus、Rhizopogon clavitisporus、Rhizopogon subcinnamomeus、Rhizopogon arctostaphyli、Rhizopogon atroviolaceus、Rhizopogon ellenae、Rhizopogon subcaerulescens、Rhizopogon subgelatinosus、またヒメノガステル科のヒメノガステル属である、Hymenogaster albus、Hymenogaster viscidus、Hymenogaster zeylanicus、またヒドナンギウム科のヒドナンギウム属である、Hydnangium carneum（コイシタケ）、Hydnangium sublamellatum、Hydnangium archeri、さらに、塊菌目セイヨウショウロタケ科のセイヨウショウロタケ属である、Tuber borchii、Tuber brumale、Tuber albidum、Tuber melanosporum、さらに、ツチダンゴ目ツチダンゴ科のツチダンゴ属である、Elaphomyces granulatus（ツチダンゴ）などがある。また、最近になって遺伝子解析から小房子嚢菌類に分類するのが妥当とされるCenococcum geophilum（シノコッカムジオフィラム）がある。
これらは、純粋培養が可能な外生菌根菌であり、これらを単独または複数種類を組み合わせて用いることが可能である。本発明の実施例では、上述の中からヌメリイグチ、ウラムラサキ、シノコッカムジオフィラムの３種類を例示するが、これに限定されるものではない。
【００１３】
シイタケやマイタケなど難分解性木質資材を利用できる菌類を増殖するには、おがくずや米糠など１００％有機質材料を使用するが、外生菌根菌は主に低分子量の糖類を利用するため、上記のような有機質材料を分解して利用できない。また、製品化後、外生菌根菌の利用できない有機質材料が土壌に混入される場合、土着の腐生菌侵入の要因となる。本発明に係る方法は、無機質の鉱物資材、特に表面積の大きな多孔質担体で構成され、それらに低分子量の糖類や無機元素から構成された栄養液体培地を含有させた後、十分に撹拌することで、少量の種菌を該多孔質担体中に短期間に増殖させることを特徴とする。しかも、菌体を砕片化して添加するため、多孔質担体内での外生菌根菌を均質に増殖させることが可能となる。
外生菌根菌を固体培養する際に利用する担体の種類としては、外生菌根菌の栄養菌糸が侵入可能な孔隙を有する多孔質担体が好ましく、無機質材料としては、例えばバーミキュライト、パーライトなどを単独、または複数のものを混合して使用することが可能である。
バーミキュライトとパーライトとを混合する場合の混合割合は、バーミキュライトの総容量に対してパーライトを４０〜７０容量％用いる。また、菌種によって、有機質材料、例えばヤシ殻、ピートモスや草炭などの泥炭を、無機質材料に混合して用いることも可能である。
バーミキュライトとパーライトを主とし、ヤシ殻を混合するには、総容量の内、ヤシ殻を２０〜３０容量％用いることが好ましい。
【００１４】
さらに、外生菌根菌の生育促進剤として、無機質材料の焼成珪藻土、ベントナイト、ゼオライト、イソライト、炭、木炭、活性炭、竹炭、有機質材料のミズゴケ、あら粉（ダイズ、トウモロコシなど）、森林のリター、おがくず、のこくず、穀粒または籾殻（コムギ、オオムギ、ホワイトミレット、イネなど）、ミミズ糞、貝殻粉末、貝化石、カニ殻、シャコ殻などを適宜少量添加して使用することも可能である。
【００１５】
栄養液体培地としては、ＭＭＮ培地（麦芽エキス３．０ｇ、グルコース１０．０ｇ、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４０．２５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４０．５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．１５ｇ、ＣａＣｌ_２０．０５ｇ、ＦｅＣｌ_３０．０１２ｇ、ＮａＣｌ０．０２５ｇ、チアミンＨＣｌ０．１ｇ、純水１０００ｃｃの割合で構成されるもの）、ＭＰ培地（麦芽エキス１０．０ｇ、グルコース１０．０ｇ、ペプトン１．０ｇ、純粋１０００ｃｃの割合で構成されるもの）、酵母エキス培地（酵母エキス２．０ｇ、ペプトン２．０ｇ、グルコース１０．０ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４１．０ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、純粋１０００ｃｃの割合で構成されるもの）、ＰＤＡ培地（ディフコ社製ＰＤＡ培地３９ｇ、純粋１０００ｃｃの割合で構成されるもの）などが利用可能である。
【００１６】
次に、外生菌根菌の固体培養方法を説明する。
バーミキュライトやパーライトなどを混合した多孔質担体に、含水率が３０〜４０重量％となるように栄養液体培地を含有させる。多孔質担体の含水率を３０〜４０重量％に調整することにより、オートクレーブ滅菌効果を高めると共に、オートクレーブ滅菌後の撹拌効率を上げ、さらには、菌の繁殖効率を向上させることができる。水分が３０重量％未満では、オートクレーブ滅菌が部分的に不完全になるという不具合が生じ、４０重量％を超えると、後に行う外生菌根菌の栄養菌糸を含む栄養液体培地の添加処理によって担体が過湿になるため、攪拌効率が低下し、さらには、菌の繁殖効率も低下するという問題を生じる。
【００１７】
水分及び栄養液体培地を添加して含水率を調整した多孔質担体は、培養槽に入れられ、密閉状態にて滅菌処理を行う。これは、外生菌根菌を純粋培養するためには、可能な限り雑菌の繁殖を抑え、無菌状態に近い状態で培養するのが好ましいためである。
滅菌処理には、オートクレーブ滅菌を利用することができる。特に、多孔質担体に、無機質材料のみ利用する場合には、オートクレーブ滅菌が好ましい。オートクレーブの処理条件としては、担体が固体であること、容量が大きいことから１２１℃、２時間以上が望ましい。
多孔質担体に、ヤシ殻などの有機質材料を利用する場合には、オートクレーブ処理において、有機酸などの毒性物質を発生させる可能性がある。このような場合は、予め水に浸水させるなどして毒性物質を水抽出させた後、オートクレーブ滅菌する。
【００１８】
次に、培養槽内の滅菌処理した多孔質担体に、外生菌根菌の栄養菌糸を含む液体培地を添加して、該多孔質担体の含水率を６５〜８０重量％に調整する。栄養液体培地を添加して多孔質担体の含水率を６５〜８０重量％に調整するのは、効率的に栄養菌糸を増殖させるためである。含水率が６５重量％未満では、外生菌根菌の栄養菌糸を生育させるには若干乾燥しており、８０重量％を超えると過湿によって増殖が抑制されるという問題を生じる。
そして、添加された外生菌根菌以外の菌が培養槽内に入らないように、培養槽内を無菌状態に保持すると共に、多孔質担体を攪拌した後に静置状態とすることにより、外生菌根菌の培養を行う。
培養槽内の環境は、外生菌根菌の種類に対応して、培養に適した環境に設定する必要があり、例えば、ヌメリイグチ、ウラムラサキ、シノコッカムジオフィラムなどを培養する場合には、培養温度２４〜２８℃、培養初期のｐＨ５〜７が好ましい。外生菌根菌の最適生育温度は菌の種類によって数値範囲を多少とも異にするが、活性低下を生じない範囲として、この範囲が望ましい。また、ｐＨについては、菌の密度や生育期間によって変化するが、培養途中で酸やアルカリによってｐＨ調整を行わない場合、培養の最終段階では、ｐＨは３〜８程度に変化する。
菌の生育環境を最適に維持するため、必要に応じて、培養途中で酸やアルカリを添加し、ｐＨを一定の範囲に維持することも可能である。
【００１９】
培養槽内の多孔質担体の攪拌は、添加した外生菌根菌の栄養菌糸片が多孔質担体と完全に混合して均一となるように行う。例えば、固定された攪拌棒と培養槽の鉛直軸まわりの回転による攪拌や、培養槽自体の水平軸まわりの回転のみにより行う方法を利用することが可能である。また、攪拌回数や攪拌速度も適宜調整可能であり、１回の攪拌で、培養槽を１〜５回程度回転させ、鉛直軸周りの回転の場合には１回転当たり数分間を要する場合もある。
攪拌後の静置期間は、通常数週間であり、ヌメリイグチ、ウラムラサキ、シノコッカムジオフィラムなどでは、１７〜２７日間程度で培養が可能である。静置培養期間は、菌の増殖速度によって異なる。ヌメリイグチは扇状に速く伸長し、ウラムラサキは斑状に遅く伸長する。また、シノコッカムジオフィラムは、伸長速度は遅いが、砕片化した菌糸からよく伸長し、担体に侵入後、さらに細かく分岐して増殖するため、担体への定着能力が高い。本発明に係る方法では例示としてこれらの生育型の異なった種類の菌を用いて試験を行っている。砕片化した栄養菌糸を培養槽内で均質に撹拌して分散させ、栄養菌糸の担体への接触機会を高めて定着を確保した後、担体内での増殖を促進し、短期間の製品化を主要な技術とする。
【００２０】
外生菌根菌の栄養菌糸を含む多孔質資材は、培養後、吸引装置を用いて、無菌採取および包装される。従来、外生菌根菌の製品化に関しては、液体培養菌体をゲルに封入する方法が知られているが、固体培養したものを無菌で封入し、包装され供給された例は少ない。本発明では、培養槽内の担体の袋詰めあるいはカプセル化が可能である。また、培養期間を短期間に設定しているため、宿主植物への感染に至るまでに、担体に含まれる糖類や菌体の二次代謝物質の影響はほとんどないと考えられ、担体の滅菌水での洗浄や絞りとりなどの処理は行わない。
【００２１】
培養槽に添加される外生菌根菌の栄養菌糸を含む液体培地に関し、その製造方法について説明する。
まず、予備培養として、保存菌株を寒天培地へ置床し、静置培養を行う。
次に、液体培地への馴化を行うため、寒天培地上で増殖した栄養菌体を、液体培地へ添加し、静置培養を行うと共に、栄養菌体の砕片化をブレンダーによって１分間に１６８００回転、１０〜３０秒行う。この方法では、菌体は、１ｍｍ以下に砕片化する。そして、栄養菌体を増殖させるため、砕片化した栄養菌体を新たな液体培地へ添加し、静置培養し、再度、栄養菌体の砕片化することにより、種菌として使用可能な栄養菌糸を含む液体培地を得ることができる。この方法で、少量の種菌から早期に固体担体への供給を可能とした。
固体培地への供給には、液体培地で増殖した菌体を濃縮して高密度の接種源液とする必要がある。各液体培地を遠心分離機に一分間に３０００回転、２０分行い、これを集めて菌体を高密度とした接種源を作製する。この接種源は、菌によっては塊状となるものがあり、この場合には軽くブレンダーをかける。この接種源は、時間を経過すると互いに結合してしまうため、培養装置へ接種する数日前に調整する。菌の種類による生育速度の相違や、菌体が栄養液体培地に浮上あるいは浮遊しやすい性質をもつものなど取扱いに注意を要するが、総じて２〜４日前の調整が望ましい。ただし、これらは、全て無菌操作で行う。
【００２２】
次に、培養した外生菌根菌の試験方法を説明する。
（生存率の測定方法）
培養後の乾燥した多孔質担体、約０．３ｇ乾物を、栄養寒天培地の入ったシャーレに置床し、２５℃に保ったインキュベーターで、３０〜６０日間、静置培養し、全シャーレの数に対して、外生菌根菌の栄養菌糸の育成が確認されたシャーレ数を、生存率（％）として算出した。
（接種試験方法）
培養後の多孔質担体、約１．５ｇ乾物を、生育１年のコナラ、アラカシのポット上部に接種し、屋外で栽培した。１か月毎に２本ずつ採取し、実体顕微鏡により観察し、視覚的に外生菌根の形成過程を５段階（１：無し、２：非常に少ない、３：少ない、４：多い、５：非常に多い）で評価した。また、培養後の多孔質担体、約１８．８ｇ、５．７ｇ、１．４ｇ乾物を、ペーパーポットに充填した土壌表面より深さ約５〜１０ｃｍの層に接種し、クロマツ種子を播種し、５か月目に各接種量に対し、６本、３本、５本ずつの合計１４本および無接種苗５本を採取し、上記と同様に外生菌根の形成過程を評価した。
【００２３】
【実施例】
（実施例１）
多孔質担体として、バーミキュライト（旭工業株式会社製，商品名バーミキュライト）とパーライト（宇部興産株式会社製，商品名グリーンサム・グレイン）とを利用し、混合割合が容量比で３対２となるように混合した。ＭＰ液体培地（麦芽エキス１０．０ｇ、グルコース１０．０ｇ、ペプトン１．０ｇ、純水１０００ｃｃ）を多孔質担体の総重量の１０重量％吸収させ含水率を３０重量％に調整した。
培養槽としては、株式会社フジワラテクノアート製、（商品名）回転式通気無菌固体培養装置（型式ＡＦ−３５０、培養槽容量３０リットル、攪拌方法は固定攪拌棒と培養槽の鉛直軸まわりの回転による攪拌、温度制御方法は無菌空気の送風による制御）を利用した。
栄養液体培地を含む多孔質担体を、培養槽内に１５リットル入れ、培養槽を密閉した状態で、１２１℃、２時間のオートクレーブ滅菌を行い、培養槽内の担体温度が培養適用温度の２５℃に低下した後、外生菌根菌であるヌメリイグチの栄養菌糸を含む栄養液体培地を培養槽内へ担体重量あたり約１０％を培養槽内に添加した。
添加直後に、培養槽を５回回転させることにより培養槽内の担体を攪拌し、その後１週間毎に培養槽を２〜５回回転させる攪拌を行い、１７日間の静置培養を行った。培養温度は２４〜２８℃であり、多孔質担体の含水率はチョウ計量機（ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣＢＡＬＡＮＣＥＰＤ２−３００ＷＭＢ）で測定し、平均７７．７％であり、ｐＨは、ガラス電極式水素イオン濃度計（ＨＯＲＩＢＡｐＨＭＥＴＥＲＦ−１１）で測定し、静置培養の最終段階における平均ｐＨは４．８であった。
【００２４】
（実施例２）
バーミキュライトとパーライトとの混合割合が容量比で７対３となるように混合し、１週間目と２週間目に再度攪拌を行い、培養期間を２７日間とした以外は、実施例１と同様に、外生菌根菌の培養を行った。平均含水率は７１．１％、平均ｐＨは５．１であった。
【００２５】
（実施例３）
培養槽としては、株式会社フジワラテクノアート製、（商品名）回転式加圧蒸煮缶（型式ＮＫ−６０、培養槽容量１２０リットル、攪拌方法は手動による培養槽自体の水平軸まわりの回転による攪拌、温度制御方法は培養槽周囲のジャケットの温度調節により制御）を利用した。
また、栄養液体培地を含む多孔質担体の容量を７０リットル、培養期間を２１日間とした以外は、実施例２と同様に、外生菌根菌の培養を行った。平均含水率は６５．４％、平均ｐＨは５．０であった。
【００２６】
（実施例４）
多孔質担体として、ヤシ殻（フマキラー株式会社製，商品名簡単培養土）とパーライト（宇部興産株式会社製，商品名グリーンサム・グレイン）とを利用し、混合割合が容量比で３対２となるように混合した。培養期間を２５日間とした以外は、実施例１と同様に、外生菌根菌の培養を行った。平均含水率は７７．７％、平均ｐＨは５．０であった。
【００２７】
（実施例５）
外生菌根菌をウラムラサキとし、培養期間を２１日間とした以外は、実施例２と同様に、外生菌根菌の培養を行った。平均含水率は６９．５％、平均ｐＨは５．９であった。
【００２８】
（実施例６）
外生菌根菌をシノコッカムジオフィラムとし、培養後２週間目に再度攪拌を行い、培養期間を２３日間とした以外は、実施例１と同様に、外生菌根菌の培養を行った。平均含水率は６９．５％、平均ｐＨは７．１であった。
【００２９】
上記実施例１〜６の生存率を測定した結果を、表１に示す。
【００３０】
【表１】

【００３１】
実施例１と２とを比較すると、バーミキュライトとパーライトとの混合割合が３対２（バーミキュライトに対するパーライトの容量比は約６６％）の方が、７対３（同容量比は約４３％）より、ヌメリイグチの培養能力が高いことが理解される。
【００３２】
また、実施例２と３とを見ると、培養期間の差により単純に比較はできないが、栄養液体培地を含む多孔質担体の容量が１５リットルから７０リットルに増加しても、ヌメリイグチを培養することが可能であるが、該容量が増加するに従い、培養能力の低下が見られる。これは、３０リットルの培養装置は細部まで撹拌できるのに対し、１２０リットルの培養装置は培養槽自体を反転させて攪拌するため、細部まで攪拌できていなかった可能性がある。したがって、後者の培養装置は、前者のものよりも、種菌接種後の撹拌に注意を払う必要があると考えられる。
【００３３】
実施例１と４とを比較すると、ヌメリイグチの培養には、多孔質担体として、無機質材料であるバーミキュライトとパーライトを用いる方が、有機質材料であるヤシ殻を混合するより、培養能力が高いことが理解される。
【００３４】
実施例５と６とを見ると、ウラムラサキについては、生存率が低いものの、ウラムラサキ、シノコッカムジオフィラムに関しても、本発明に係る固体培養方法により、外生菌根菌の培養が可能であることが理解される。
【００３５】
次に、実施例２とほとんど培養条件を同じくするが、本実験では培養期間は１９日間、培養後1週間目に再度攪拌を行った。本例で得られた培養後の多孔質担体（ヌメリイグチの資材）をクロマツに、また、実施例６で得られた培養後の多孔質担体（シノコッカムジオフィラムの資材）をコナラ及びアラカシに接種した場合の試験結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】

【００３７】
表２より、本発明に係る固体培養方法で得られたヌメリイグチ、シノコッカムジオフィラムは、接種後５ヶ月も経過すると樹木幼苗への感染が目視でも確認できる程度まで成長している。
このため、本発明に係る固体培養方法で培養された外生菌根菌は、苗木への外生菌根菌の接種源として利用可能であり、しかも、上記実施例のように１５〜７０リットル単位での固体培養も可能である。この培養量は、苗畑などの野外において、数百から数千本の苗木への接種源を提供する能力を意味し、本発明は、外生菌根菌の生産能力向上に極めて有用であることが理解される。
【００３８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、外生菌根菌の接種源のなかで、特に栄養菌糸を用いた外生菌根菌を、数十リットル以上の培養槽を用いて、短期間で安定かつ大量に固体培養することが可能であり、しかも、均質な菌体を固体培養することが可能となる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a solid culture method for ectomycorrhizal fungi, and particularly to a method for stably solid-culturing ectomycorrhizal fungi using a culture tank of several tens of liters or more.
[0002]
[Prior art]
Ectomycorrhizal fungi are basidiomycetes and ascomycetes that coexist with the roots of woody plants such as pine, beech and birch, and are known to exist in over 65 species of 65 genera worldwide. It has been.
The ectomycorrhizal fungi symbiotic to the roots of the host plant can grow through the mycelia that are spread in a wide range of soil, while the fungus itself grows using photosynthesis products such as glucose supplied from the host plant as an energy source. Supply mineral nutrients such as phosphate, potassium and nitrogen or water to the host plant.
Therefore, it is known that a plant infected with an ectomycorrhizal fungus improves the survival rate of a host plant or promotes growth compared to a non-infected plant.
In addition, ectomycorrhizal fungi symbiotic to the roots of the host plant can reduce the invasion of pathogenic bacteria into the roots of the host plant, and can impart drought resistance, frost damage resistance, and heavy metal resistance to the host plant. The effect of improving the growth environment of host plants has been reported.
[0003]
Where ectomycorrhizal woody plants such as those described above are growing, indigenous ectomycorrhizal fungi usually already exist, so most roots are infected at a high rate. ing.
However, surface soil has been removed due to road construction, etc., bare soil from which underlying soil has been exposed, ruins such as fires and slash-and-burn fields, sedimentation sites such as pyroclastic flows associated with volcanic activity and debris flows caused by natural disasters, soil erosion and desertification. In many cases, indigenous bacteria do not exist or even if they exist, such as bare land and mine sites excavated to obtain underground resources. In such places, the species diversity of plants and fungi is often low for a long time.
[0004]
By the way, due to the growing concern about global environmental issues such as global warming all over the world today, the place where human beings have developed so far and places that have become bare due to natural disasters are artificially restored to their original vegetation. Tree planting and forestation.
At that time, in order to improve the establishment rate of the ectomycorrhizal woody plant to be introduced or promote the growth, inoculate with ectomycorrhizal fungi before or after sowing and seedling transplantation, There have been methods for transplanting seedlings infected with root fungi.
Inoculation sources used in this case include (1) soil where the ectomycorrhizal woody plant grows (soil inoculation source), and (2) spores collected from the fruiting body of ectomycorrhizal fungi (spore inoculation source) ), (3) There are mainly three forms of vegetative mycelium (source of vegetative mycelium) that has been artificially cultured and grown indoors.
[0005]
On the other hand, in Japan, about 70% of the national land is forest, and indigenous ectomycorrhizal fungi already exist in most forest soils mainly composed of ectomycorrhizal tree species. By doing so, an ectomycorrhizal fungus-infected seedling can be easily produced.
However, in recent years, the bare land area in a wide area has increased in Japan due to deforestation associated with roads and land development and active volcanic activity. Therefore, in the future, opportunities to plant or plant these bare places in the country will increase in the future, and inoculation with ectomycorrhizal fungus inoculation sources, transplanting ectomycorrhizal fungus infected seedlings, etc. It is predicted that the number of scenes will increase.
For this reason, there is a demand for the development of techniques for stably securing not only conventional soil inoculation sources but also various forms of inoculation sources such as spores and vegetative mycelia.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The problem of the present invention is to solve the above-mentioned problems, and among the inoculation sources of ectomycorrhizal fungi, in particular, ectomycorrhizal fungi using vegetative mycelium are used for a short period of time using a culture tank of several tens of liters or more. It is to provide a solid culture method capable of culturing homogeneous cells in a stable manner and in a large amount.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the invention according to claim 1 is characterized in that after the liquid medium is contained in the porous carrier so that the water content is 30 to 40% by weight, the porous carrier is sealed in the culture tank. Sterilized in a state, and then a liquid medium containing vegetative mycelium of ectomycorrhizal fungi is added to the culture tank to adjust the water content of the porous carrier to 65 to 80% by weight. A solid culturing method for ectomycorrhizal fungi characterized by culturing ectomycorrhizal fungi by stirring the porous carrier and leaving it stationary.
The “stationary state” in the present invention includes repeated standing and stirring depending on the type of ectomycorrhizal fungi having different growth rates.
[0008]
Preferably, as in the invention according to claim 2, in the solid culture method of ectomycorrhizal fungi according to claim 1, the porous carrier is mainly an inorganic material.
More preferably, as in the invention according to claim 3, the inorganic material is characterized in that vermiculite and perlite are used alone or in combination.
[0009]
The invention according to claim 4 is characterized in that, in the solid culture method of ectomycorrhizal fungi according to any one of claims 1 to 3, the sterilization method is autoclave sterilization.
[0010]
Furthermore, in the invention which concerns on Claim 5, in the solid culture method of the ectomycorrhizal fungus in any one of Claims 1 thru | or 4, the temperature which culture | cultivates an ectomycorrhizal fungus in this aseptic condition is 24-28. It is characterized by being at ° C.
[0011]
In the invention according to claim 6, in the solid culturing method of the ectomycorrhizal fungus according to any one of claims 1 to 5, the ectomycorrhizal fungus is at least one of Numeryiguchi, Uramrasaki, and Sinococcum geophyllum. It contains one or more types.
Furthermore, in the invention which concerns on Claim 7, in the solid culture method of the ectomycorrhizal fungus in any one of Claim 1 thru | or 6, the liquid culture medium containing the vegetative mycelium of this ectomycorrhizal fungus is a microbial cell. It is characterized by being fragmented to 1 mm or less.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, it demonstrates in detail using the suitable example in this invention.
As the ectomycorrhizal fungi according to the present invention, Amanita murina, Amanita pantherina (Amanita muscaria), Amanita porphyria, Amanita rubescens, Amanita aspera, Amanita citrina, Amanita citrina, Amanita citrina, Amanita citrina, spreta, Amanita xanthocephla, Amanita umbrenella, Amanita flavoconia, Amanita spissa (snake mushroom) and the genus Iguchi, Boletus edulis, Boletus aereus, Boletus erythropus, olethopus (Ashibeniiguchi), Boletus pulverulentus (Irokawari), Boletus ornatipes (Kiamashiiguchi), Numeriuchi, Suillus collinitus, Suillus granulatus, Suillus luteus, Suillus boricus, Suillus brevipes, Suillus brevipes , Suillus subluteus, Suillus plorans, Suillus variegatus, Suillus lakei, Suillus grevillei, Suillus intermedius, Suillus bellinii, Suillus mediterraneensis, Suillus americanus (Sunumus iillus), Suillus neoalbidipes, Suusus illusus Mushrooms, Suillus tomentosus, Suillus placidus, Suillus sibiricus, Pepper, Chalciporus pierrhuguesii, Chalciporus piperatus, eus ), Xerocomus badius, Xerocomus ferrugineus, Sorghum, Leccinum aurantiacum, Leccinum arenicola, Leccinum holopus, Scallop, Tilopilus felleus, Nigiri Boletinus cavipes, which is a genus, and Cortinarius favrei, Cortinarius russus, Cortinarius purpurascens, Cortinarius vibratilis, Cortinarius allen, Cortinarius allen, Corus Cortinarius anomalus, Cortinarius brunneus, Cortinarius glaucopus, Cortinarius mucosus, Cortinarius subpurpurascens, Cortinarius caerulescens, ebel Hum, ebel Hum, ebel Hum , Hebeloma hiemale, Hebeloma crustuliniforme, Hebeloma cylindrosporum, Hebeloma sinapizans, Hebeloma marginatulum, Hebeloma polare, Hebeloma longicaudum, Hebeloma westraliense, H ebeloma eburneum, Hebeloma sinapizans, Hebeloma mesophacus, Hebeloma velutipes, Hebeloma vinosophyllum, and the genus Papaveraceae, Descolea maculata, the genus Phylum ), Paxillus involutus, Amanitaceae, Lactarius deliciosus, Lactarius sanguifluus, Lactarius rufus, Lactarius hatsake, Lactarius hatsake, Lactarius hatsake , Lactarius insulsus, Lactarius chrysorrheus, Lactarius deterrimus, Lactarius porninsis, Lactarius scrobiculatus, Lactarius affinis, Lactarius hygroroid, Lactarius hygroroid Lactarius indigo, Lactarius mucidus, Lactarius pubescens (White-hulled bamboo), Lactarius subpurpuruss, Lactarius thejogalus, Lactarius thyinos, Lactarius torminosus foetens, Russula subfoetens, Russula velenovskyi, and the genus Lepidoptera, Laccaria laccata, Laccaria fraterna, Laccaria amethystea, Laccaria deliciosus, Laccaria montana, Laccaria montana, Laccaria montana, , Laccaria ochropurpurea, Laccaria farinacea, Tricholoma matsutake, Tricholoma focale, Tricholoma striatum, Tricholoma flavovirens, Tricholoma portentosum, Tricholoma saponace, Tricholoma saponace Shimeji, Tricholoma vaccinum, Tricholoma tridentinum var. Cedretorum, Tricholoma caligatum, Tricholoma cedrorum, Tricholoma terreum, Tricholoma aurantium, Tricholoma cingulatum, Tricholoma cingulatum, Tricholoma cingulatum Mulawashimeji, Tricholoma resplendens, Tricholoma virgatum, Tricholoma columbetta, Tricholoma portentosum, phyllum um, Lyophyllum semitale fumosum, Lyophyllum decastes, Boletellus russellii, Streptomyces floccopus, Strobilomyces floccopus Psilithus tinctorius, Pisolithus albus, Pisolithus marmoratus, Scleroderma verrucosum, cepaer, cepaer Scleroderma flavidum, Scleroderma dictyosporum, Scleroderma meridionale, Scleroderma polyrhizum, Scleroderma areolatum, Scleroderma citrinum, Scleroderma citrinum, Scleroderma citrinum, Scleroderma citrinum, Scleroderma citrinum Rhizopogon roseolus, Rhizopogon rubescens, Rhizopogon v, Hysterangium incarceratum, Hysterangium clathroides, and Rhizopogon roseolus, Rhizopogon rubescens, Rhizopogon v inicolor, Rhizopogon semireticulatus, Rhizopogon ochraceorubens, Rhizopogon luteolus (Honshouro), Rhizopogon subaerolatus, Rhizopogon ventricisporus, Rhizopogon vulgaris, Rhizopogon bacteri, Rhizopogon fuscorubens, Rhizopogon ponderosus, Rhizopogon truncates, Rhizopogon abietis, Rhizopogon cusickensis, Rhizopogon liui, Rhizopogon occidentalis, Rhizopogon smithii, Rhizopogon vulgaris, Rhizopogon superiorensis, Rhizopogon colossus, is a Himenogasuteru genus Rhizopogon hawkerae, Rhizopogon parkii, Rhizopogon subareolatus, Rhizopogon villosulus, Rhizopogon clavitisporus, Rhizopogon subcinnamomeus, Rhizopogon arctostaphyli, Rhizopogon atroviolaceus, Rhizopogon ellenae, Rhizopogon subcaerulescens, Rhizopogon subgelatinosus, also Himenogasuteru Department Hymenogaster albus, Hymenogaster viscidus, Hymenogaster zeylanicus, and Hydnangium carneum, Hydangium carneum, Hydangium ngium sublamellatum, Hydnangium archeri, and Tubero borchii, Tuber brumale, Tuber albidum, Tuber melanosporum, and the genus Tutus danos, granula, ulatus Tsuchidango). Recently, there is Cenococcum geophilum, which is considered appropriate to be classified into small ascomycetes from genetic analysis.
These are ectomycorrhizal fungi capable of pure culture, and these can be used alone or in combination of a plurality of types. In the embodiment of the present invention, three types of numeriiguchi, uramurarasaki, and shinococcum geophyllum are exemplified from the above, but the present invention is not limited thereto.
[0013]
To grow fungi that can use persistent wood materials such as shiitake mushrooms and maitake mushrooms, 100% organic materials such as sawdust and rice bran are used, but ectomycorrhizal fungi mainly use low molecular weight sugars. It cannot be used by decomposing organic materials such as In addition, after the commercialization, when organic materials that cannot be used by ectomycorrhizal fungi are mixed into the soil, it becomes a factor of invasion of indigenous rot fungi. The method according to the present invention comprises an inorganic mineral material, particularly a porous carrier having a large surface area, and contains a nutrient liquid medium composed of a low molecular weight saccharide or an inorganic element, followed by sufficient stirring. A small amount of inoculum is grown in the porous carrier in a short time. In addition, since the bacterial cells are fragmented and added, the ectomycorrhizal fungi in the porous carrier can be uniformly grown.
As the type of carrier used when solidifying ectomycorrhizal fungi, a porous carrier having pores into which vegetative mycelium of ectomycorrhizal fungi can enter is preferable. Examples of inorganic materials include vermiculite and pearlite. Can be used alone or in combination.
When mixing vermiculite and pearlite, 40 to 70% by volume of pearlite is used with respect to the total volume of vermiculite. Depending on the fungus species, organic materials such as coconut shells, peat moss, peat moss and grass peat can be mixed with the inorganic material.
For mixing vermiculite and pearlite and mixing the coconut shell, it is preferable to use 20 to 30% by volume of the coconut shell in the total volume.
[0014]
Furthermore, as growth promoters for ectomycorrhizal fungi, inorganic materials such as calcined diatomaceous earth, bentonite, zeolite, isolite, charcoal, charcoal, activated carbon, bamboo charcoal, organic material sphagnum, rough powder (soybean, corn, etc.), forest litter , Sawdust, sawdust, grains or rice husks (wheat, barley, white millet, rice, etc.), earthworm dung, shell powder, shell fossil, crab shell, giant clam shell, etc. is there.
[0015]
As nutrient liquid medium, MMN medium (3.0 g of malt extract, 10.0 g of glucose, (NH ₄ ) ₂ HPO ₄ 0.25g, KH ₂ PO ₄ 0.5g, MgSO ₄ ・ 7H ₂ O0.15g, CaCl ₂ 0.05g, FeCl ₃ 0.012g, NaCl 0.025g, Thiamine HCl 0.1g, pure water 1000cc), MP medium (malt extract 10.0g, glucose 10.0g, peptone 1.0g, pure 1000cc ratio) Yeast extract medium (yeast extract 2.0 g, peptone 2.0 g, glucose 10.0 g, KH) ₂ PO ₄ 1.0 g MgSO ₄ ・ 7H ₂ ODA 0.5 g and a pure 1000 cc ratio), PDA medium (Difco's PDA medium 39 g, a pure 1000 cc ratio), and the like can be used.
[0016]
Next, a method for solid culture of ectomycorrhizal fungi will be described.
A nutrient liquid medium is contained in a porous carrier mixed with vermiculite or pearlite so that the water content is 30 to 40% by weight. By adjusting the water content of the porous carrier to 30 to 40% by weight, the autoclave sterilization effect can be enhanced, the stirring efficiency after autoclave sterilization can be increased, and further, the bacteria propagation efficiency can be improved. If the water content is less than 30% by weight, there is a problem that autoclave sterilization is partially incomplete. If the water content exceeds 40% by weight, the carrier is added by a nutrient liquid medium containing vegetative mycelium of ectomycorrhizal fungi to be performed later. Since this becomes excessively humid, there arises a problem that the stirring efficiency is lowered, and further, the propagation efficiency of the bacteria is also lowered.
[0017]
The porous carrier whose water content is adjusted by adding water and nutrient liquid medium is placed in a culture tank and sterilized in a sealed state. This is because, in order to purely culture the ectomycorrhizal fungi, it is preferable to suppress the propagation of miscellaneous bacteria as much as possible and to cultivate in a state close to sterility.
Autoclave sterilization can be used for the sterilization treatment. In particular, when only the inorganic material is used for the porous carrier, autoclave sterilization is preferable. The processing conditions for the autoclave are preferably 121 ° C. and 2 hours or longer because the carrier is solid and the capacity is large.
When an organic material such as coconut shell is used for the porous carrier, toxic substances such as organic acids may be generated in the autoclave treatment. In such a case, the toxic substance is extracted with water by, for example, pre-immersing in water, and then sterilized by autoclave.
[0018]
Next, a liquid medium containing vegetative mycelium of ectomycorrhizal fungi is added to the sterilized porous carrier in the culture tank to adjust the water content of the porous carrier to 65 to 80% by weight. The reason why the nutrient liquid medium is added to adjust the water content of the porous carrier to 65 to 80% by weight is to efficiently grow the vegetative mycelium. If the water content is less than 65% by weight, the vegetative mycelium of ectomycorrhizal fungi is slightly dried, and if it exceeds 80% by weight, the growth is suppressed by excessive humidity.
Then, in order to prevent bacteria other than the added ectomycorrhizal fungi from entering the culture tank, the inside of the culture tank is maintained in a sterile state, and the porous carrier is stirred, and then left in a stationary state, Cultivate viable mycorrhizal fungi.
It is necessary to set the environment in the culture tank to an environment suitable for culture according to the type of ectomycorrhizal fungi. For example, when cultivating Numeriiguchi, Uramrasaki, Sinococcum geophyllum, etc. The pH is preferably 24 to 28 ° C and the initial pH is 5 to 7. The optimum growth temperature of ectomycorrhizal fungi varies slightly depending on the type of bacteria, but this range is desirable as a range that does not cause a decrease in activity. Moreover, although pH changes with the density and growth period of a microbe, when pH adjustment is not performed by an acid or an alkali during culture | cultivation, pH changes to about 3-8 at the last stage of culture | cultivation.
In order to optimally maintain the growth environment of the fungus, it is also possible to add an acid or an alkali during the cultivation as necessary to maintain the pH within a certain range.
[0019]
The porous carrier in the culture tank is stirred so that the added vegetative mycelium of ectomycorrhizal fungi is completely mixed with the porous carrier and becomes uniform. For example, it is possible to use a method of stirring only by rotating the fixed stirring rod and the culture tank around the vertical axis, or rotating only about the horizontal axis of the culture tank itself. In addition, the number of stirring and the stirring speed can be adjusted as appropriate, and the culture tank is rotated about 1 to 5 times by one stirring, and in the case of rotation around the vertical axis, it may take several minutes per rotation. .
The stationary period after stirring is usually several weeks, and in the case of Numeriiguchi, Uramrasaki, Shinokokham geophyllum, etc., the culture can be carried out in about 17 to 27 days. The stationary culture period varies depending on the growth rate of the bacteria. Numeriiguchi grows fast like a fan and uramurarasaki grows slowly like a patch. Although Sinococcum geophyllum has a low elongation rate, it grows well from fragmented mycelia, and after entering the carrier, it further diverges and grows, so it has a high ability to fix to the carrier. In the method according to the present invention, for example, tests are carried out using these types of bacteria having different growth types. The vegetative mycelium that has been broken into pieces is homogeneously stirred and dispersed in the culture tank to increase the chance of contact of the vegetative mycelium with the carrier to ensure its colonization, and then promote the growth in the carrier for a short-term commercialization. The main technology.
[0020]
Porous material containing vegetative mycelium of ectomycorrhizal fungi is aseptically collected and packaged using a suction device after culturing. Conventionally, regarding the commercialization of ectomycorrhizal fungi, a method of enclosing liquid culture cells in a gel is known, but there are few examples in which a solid culture is aseptically enclosed, packaged and supplied. In the present invention, the carrier in the culture tank can be packaged or encapsulated. In addition, since the culture period is set to a short period, it is considered that there is almost no influence of saccharides contained in the carrier and secondary metabolites of the bacterial cells until infection of the host plant. No cleaning or squeezing process is performed.
[0021]
The manufacturing method is demonstrated regarding the liquid culture medium containing the vegetative mycelium of the ectomycorrhizal fungi added to a culture tank.
First, as a preliminary culture, the preserved strain is placed on an agar medium and subjected to static culture.
Next, in order to acclimatize to the liquid medium, the vegetative cells grown on the agar medium are added to the liquid medium and subjected to stationary culture, and the fragmentation of the vegetative cells is performed by a blender at 16,800 rpm. 10-30 seconds. In this method, the bacterial cells are fragmented to 1 mm or less. Then, in order to grow vegetative cells, crushed vegetative cells are added to a new liquid medium, statically cultivated, and again crushed into vegetative cells. A liquid medium containing can be obtained. By this method, it was possible to supply the solid support early from a small amount of inoculum.
In order to supply the solid medium, it is necessary to concentrate the cells grown on the liquid medium to obtain a high-density inoculum. Each liquid medium is carried out in a centrifuge at 3000 rpm for 20 minutes, and these are collected to produce an inoculation source having a high density of bacterial cells. This inoculation source may be a lump depending on the bacteria, and in this case, a light blender is applied. Since these inoculation sources bind to each other over time, they are adjusted several days before inoculating the culture apparatus. Care should be taken in handling such as differences in growth rate depending on the type of fungus, and those in which the bacterial cells tend to float or float on the nutrient liquid medium, but adjustment in general 2 to 4 days in advance is desirable. However, these are all performed aseptically.
[0022]
Next, a method for testing cultured ectomycorrhizal fungi will be described.
(Measurement method of survival rate)
About 0.3 g of the dried porous carrier after culture is placed in a petri dish containing a nutrient agar medium, and left to stand for 30-60 days in an incubator kept at 25 ° C. On the other hand, the number of petri dishes in which the growth of vegetative mycelium of ectomycorrhizal fungi was confirmed was calculated as the survival rate (%).
(Inoculation test method)
The cultured porous carrier, about 1.5 g of dry matter, was inoculated on the upper part of a 1-year-old oak and arakashi pot and cultivated outdoors. Two samples are collected every month and observed with a stereomicroscope. Visually, the process of ectomycorrhiza formation is visually classified into five stages (1: none, 2: very low, 3: low, 4: high, 5 : Very many). Moreover, the porous support | carrier after culture | cultivation, about 18.8g, 5.7g, and 1.4g dry matter are inoculated in the layer about 5-10cm deep from the soil surface with which the paper pot was filled, and a pine seed is seed | inoculated, In the fifth month, for each inoculation amount, a total of 14 of 6, 3, 5 and 5 non-inoculated seedlings were collected, and the ectomycorrhiza formation process was evaluated in the same manner as described above.
[0023]
【Example】
Example 1
Vermiculite (made by Asahi Kogyo Co., Ltd., trade name Vermiculite) and perlite (made by Ube Industries, Inc., trade name Green Thumb Grain) are used as the porous carrier, so that the mixing ratio is 3 to 2 in volume ratio. Mixed. The MP liquid medium (malt extract 10.0 g, glucose 10.0 g, peptone 1.0 g, pure water 1000 cc) was absorbed by 10% by weight of the total weight of the porous carrier, and the water content was adjusted to 30% by weight.
As a culture tank, manufactured by Fujiwara Techno Art Co., Ltd., (Product name) Rotating aeration aseptic solid culture apparatus (model AF-350, culture tank capacity 30 liters, stirring method is rotating around the vertical axis of fixed stirring rod and culture tank The agitation and temperature control method used was controlled by blowing sterile air.
A porous carrier containing a nutrient liquid medium is placed in a culture tank at 15 liters and autoclaved at 121 ° C. for 2 hours with the culture tank sealed, and the carrier temperature in the culture tank is 25 ° C., the culture application temperature. After that, a nutrient liquid medium containing vegetative mycelium of Numeriiguchi, an ectomycorrhizal fungus, was added to the culture tank at about 10% per carrier weight.
Immediately after the addition, the carrier in the culture tank was agitated by rotating the culture tank 5 times, and then the culture tank was agitated by rotating the culture tank 2 to 5 times every week, followed by stationary culture for 17 days. The culture temperature is 24 to 28 ° C., the moisture content of the porous carrier is measured with a butterfly meter (ELECTRONIC BALANCE PD2-300WMB), and the average is 77.7%. The pH is measured by a glass electrode type hydrogen ion concentration meter ( HORIBA pH METER F-11) and the average pH in the final stage of static culture was 4.8.
[0024]
(Example 2)
As in Example 1, except that the mixing ratio of vermiculite and pearlite was 7 to 3 in volume ratio and stirred again in the first and second weeks, and the culture period was 27 days. The ectomycorrhizal fungi were cultured. The average water content was 71.1% and the average pH was 5.1.
[0025]
(Example 3)
As the culture tank, manufactured by Fujiwara Techno Art Co., Ltd., (Product name) Rotating pressurized steaming can (model NK-60, culture tank capacity 120 liters, stirring method is manual stirring by rotating around the horizontal axis of the culture tank itself. The temperature control method was controlled by adjusting the temperature of the jacket around the culture tank.
Further, ectomycorrhizal fungi were cultured in the same manner as in Example 2 except that the volume of the porous carrier containing the nutrient liquid medium was 70 liters and the culture period was 21 days. The average water content was 65.4% and the average pH was 5.0.
[0026]
(Example 4)
As a porous carrier, coconut husk (manufactured by Fumakilla Co., Ltd., trade name: simple culture soil) and pearlite (Ube Industries, Ltd., trade name: Green Sam Grain) are used, and the mixing ratio is 3 to 2 in volume ratio. It mixed so that it might become. Exogenous mycorrhizal fungi were cultured in the same manner as in Example 1 except that the culture period was 25 days. The average water content was 77.7% and the average pH was 5.0.
[0027]
(Example 5)
The ectomycorrhizal fungus was cultured in the same manner as in Example 2 except that the ectomycorrhizal fungus was uramurasaki and the culture period was 21 days. The average water content was 69.5% and the average pH was 5.9.
[0028]
(Example 6)
The ectomycorrhizal fungi were cultured in the same manner as in Example 1 except that the ectomycorrhizal fungi were Sinococcum diophyllum, stirred again two weeks after the culture, and the culture period was 23 days. The average water content was 69.5% and the average pH was 7.1.
[0029]
The results of measuring the survival rates of Examples 1 to 6 are shown in Table 1.
[0030]
[Table 1]

[0031]
Comparing Examples 1 and 2, the mixing ratio of vermiculite and pearlite is 3 to 2 (the volume ratio of pearlite to vermiculite is about 66%) than 7 to 3 (the volume ratio is about 43%). It is understood that the culture ability of Numeriiguchi is high.
[0032]
In addition, when Examples 2 and 3 are seen, it cannot be simply compared due to the difference in the culture period. However, even if the volume of the porous carrier containing the nutrient liquid medium is increased from 15 liters to 70 liters, the jellyfish is cultured. It is possible, but as the volume increases, the culture capacity decreases. This is because the 30-liter culture device can stir in detail, whereas the 120-liter culture device inverts the culture tank itself and stirs it. Therefore, it is considered that the latter culture apparatus needs to pay more attention to the agitation after inoculation than the former one.
[0033]
Comparing Examples 1 and 4, in the cultivation of Numeriiguchi, the use of vermiculite and pearlite, which are inorganic materials, as the porous carrier, has a higher culture ability than the mixing of coconut shell, which is an organic material. Understood.
[0034]
As seen from Examples 5 and 6, uramurasaki has a low survival rate, but uranium saki and synococcum geophyllum can also be used to culture ectomycorrhizal fungi by the solid culture method according to the present invention. Is understood.
[0035]
Next, the culture conditions were almost the same as in Example 2. In this experiment, the culture period was 19 days, and stirring was again performed one week after the culture. When inoculating the porous carrier after culturing (material of Numeriguchi) obtained in this example in black pine, and the porous carrier after culturing obtained in Example 6 (material of Sinococcum geophyllum) in Quercus and arakashi The test results are shown in Table 2.
[0036]
[Table 2]

[0037]
As shown in Table 2, Numeriguchi and Shinococcum diophyllum obtained by the solid culture method according to the present invention have grown to such an extent that infection of tree seedlings can be visually confirmed after 5 months have passed since inoculation.
For this reason, the ectomycorrhizal fungi cultured by the solid culture method according to the present invention can be used as an inoculation source of ectomycorrhizal fungi to seedlings, and 15 to 70 liters as in the above examples. Solid culture in units is also possible. This amount of culture means the ability to provide an inoculation source for hundreds to thousands of seedlings in the field such as nurseries, and the present invention is extremely useful for improving the production capacity of ectomycorrhizal fungi. It is understood.
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【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, among the inoculation sources of ectomycorrhizal fungi, ectomycorrhizal fungi using vegetative mycelium are used in a short period of time by using a culture tank of several tens of liters or more. Therefore, it is possible to perform solid culture stably and in large quantities, and it is possible to culture homogeneous cells in solid.

Claims

After the liquid medium is contained in the porous carrier so that the water content is 30 to 40% by weight, the porous carrier is sterilized in a sealed state in a culture tank, and then the vegetative mycelium of ectomycorrhizal fungi By adding a liquid culture medium containing the medium to the culture tank to adjust the water content of the porous carrier to 65 to 80% by weight, and stirring the porous carrier in a sterile state, A solid culture method of ectomycorrhizal fungi characterized by culturing viable mycorrhizal fungi.

The solid culture method of ectomycorrhizal fungi according to claim 1, wherein the porous carrier contains an inorganic material.

The solid culture method for ectomycorrhizal fungi according to claim 2, wherein the inorganic material is vermiculite and pearlite used alone or in combination.

The solid culture method for ectomycorrhizal fungi according to any one of claims 1 to 3, wherein the sterilization method is autoclave sterilization.

The solid culture method of ectomycorrhizal fungi according to any one of claims 1 to 4, wherein the temperature for culturing the ectomycorrhizal fungi in the aseptic state is 24 to 28 ° C. Solid culture method of mycorrhizal fungi.

The solid culture method of an ectomycorrhizal fungus according to any one of claims 1 to 5, wherein the ectomycorrhizal fungus contains at least one or more of Numeriiguchi, Uramrasaki and Shinococcum geophyllum. A solid culture method of ectomycorrhizal fungi.

In the solid culture method of the ectomycorrhizal fungus according to any one of claims 1 to 6, the liquid medium containing the vegetative mycelium of the ectomycorrhizal fungus is that the cells are fragmented to 1 mm or less. A solid culturing method of ectomycorrhizal fungi characterized by the above.