JP4233306B2

JP4233306B2 - Thermostable cordobiose phosphorylase

Info

Publication number: JP4233306B2
Application number: JP2002320576A
Authority: JP
Inventors: 拓生山本; 和久向井; 哲也仲田; 倫夫久保田; 恵温福田; 雅司栗本; 好夫辻阪
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2002-11-01
Filing date: 2002-11-01
Publication date: 2009-03-04
Anticipated expiration: 2022-11-01
Also published as: JP2004154014A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、耐熱性コージビオースホスホリラーゼに関し、更に詳細には、無機質のリン酸及び／又はその塩（以下、不都合が生じない限り、本明細書を通じて「無機リン酸」と略称する。）の存在下コージビオースを分解してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩（以下、不都合が生じない限り、本明細書を通じて「β−Ｄ−グルコース−１リン酸」と略称する。）を生成し、また、逆に、β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースからコージビオースと無機リン酸を生成する作用を示す酵素コージビオースホスホリラーゼのアミノ酸配列中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換させることによって、反応至適温度及び温度安定性が向上した耐熱性コージビオースホスホリラーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
【特許文献１】
特開平１０−３０４８８２号公報
【非特許文献１】
『酵素ハンドブック』朝倉書店（１９８２年）
【０００３】
近年、マルトース、トレハロースなどのオリゴ糖とその機能が注目され、これらオリゴ糖の多様な生産方法が各方面から広く検討されるようになってきた。これらオリゴ糖を生産する方法としてマルトースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、ラミナリビオースホスホリラーゼなど種々のホスホリラーゼの利用が知られている。これらホスホリラーゼとその作用については非特許文献１にまとめられている。しかしながら、当時、コージビオースを生成しうるホスホリラーゼは学術的にも未報告で、その存在さえ知られておらず、その提供が望まれていた。
【０００４】
斯かる状況下、本発明者等は、当時、未知のコージビオースホスホリラーゼを求めて、その酵素を産生する微生物を広く検索し、その結果、特許文献１に明らかにされているように、サーモアナエロビウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）に属する微生物サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍｂｒｏｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ３５０４７）が、新規酵素コージビオースホスホリラーゼを産生することを見いだし、下記の理化学的性質を有することを明らかにするとともに、その製造方法を確立した。
（１）作用
（ａ）無機リン酸存在下でコージビオースを分解してＤ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を生成する。
（ｂ）β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとからコージビオースと無機リン酸を生成し、さらにβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として、他の糖質にグルコース基の転移を触媒する。
（２）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、８３，０００±５，０００ダルトン
（３）等電点
アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ４．４±０．５
（４）至適温度
ｐＨ５．５、３０分間反応で６５℃付近
（５）至適ｐＨ
６０℃、３０分間反応でｐＨ５．５付近
（６）温度安定性
ｐＨ５．５、１時間保持の条件で６５℃付近まで安定
（７）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件でｐＨ約５．５乃至１０．０
さらに、本コージビオースホスホリラーゼが配列表における配列番号３に記載の塩基配列にコードされており、配列表における配列番号４に記載されているアミノ酸配列を有することも見いだした。また、本酵素をβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として各種糖質共存下で作用させることにより得られるグルコ転移糖含有糖質並びに該糖質を含有せしめた組成物の製造方法を確立した。
【０００５】
酵素の耐熱性は、酵素反応の利用の際、極めて重要な因子で、耐熱性の高い酵素は、少量の酵素量で長時間反応できるため、酵素反応における酵素量が低減でき、糖質の製造上、経済的に有利である。酵素はタンパク質から出来上がっており、酵素が示す諸特性はその酵素タンパク質のアミノ酸一次配列に起因しており、酵素の耐熱性も、アミノ酸一次配列やその一次配列で形成される高次構造によって生み出されることは一般的に認識されているところである。現在では、遺伝子操作技術を用いて、酵素タンパク質をコードするＤＮＡをクローニングし、ＤＮＡ配列を解読することにより、一義的に酵素タンパク質のアミノ酸配列を決定することができる。また、遺伝子ＤＮＡの塩基配列中の塩基を他の塩基に人為的に置換し、コードされるアミノ酸残基を変え、他のアミノ酸残基に置換した変異酵素タンパク質を作製することが可能であり、いくつかの酵素タンパク質においては、人為的に遺伝子変異を与えることによって耐熱化酵素が得られている。しかしながら、コージビオースホスホリラーゼにおいては、転移糖質の生成反応に経済的に有利な耐熱性の高い酵素が望まれていたものの、その耐熱性コージビオースホスホリラーゼは実現していなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況に鑑み、本発明の課題は、コージビオースホスホリラーゼのアミノ酸配列中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換させることによって、反応至適温度及び温度安定性が向上した耐熱性コージビオースホスホリラーゼ及びその製造方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、本発明者等は、先ず、サーモアナエロビウム・ブロッキイＡＴＣＣ３５０４７由来の、配列表における配列番号３に記載の塩基配列を有するコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡをそのアミノ酸配列を変えることなく変異させ制限酵素切断部位などを導入し、それを大腸菌での発現プラスミドベクターｐＫＫ２２３−３に組換え、配列表における配列番号５に記載の塩基配列を有するコージビオースホスホリラーゼ高産生組換えプラスミドを作製した。次いで、得られた組換えプラスミドからコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡを取り出し、試験管内でランダムにＤＮＡ変異を与え、様々なアミノ酸置換が起こっているコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡ混合物を作製した。その変異ＤＮＡを組換えプラスミドに戻した後、大腸菌に形質転換して、変異コージビオースホスホリラーゼ遺伝子ライブラリーを作製した。次に、得られた遺伝子ライブラリーから組換え大腸菌を単離し、培養し、得られた培養菌体から変異コージビオースホスホリラーゼを抽出し、その変異酵素の熱安定性を調べることによって、熱安定性が向上した変異コージビオースホスホリラーゼを産生する形質転換体をスクリーニングした。その結果、目的とする形質転換株を１株得ることができた。さらに、その形質転換体から組換えＤＮＡを抽出し、ＤＮＡの塩基配列を決定してコージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡの変異箇所を調べたところ、該ＤＮＡは配列表における配列番号２に記載の塩基配列を有しており、ランダム変異前の配列表における配列番号５に記載の塩基配列と異同を調べたところ、第１，５３７番目の塩基であるＧがＡに変異し、その変異によって配列表における配列番号４に記載のアミノ酸配列の第５１３番目のアミノ酸残基であるＡｓｐ（アスパラギン酸）が、配列表における配列番号２の塩基配列に併記したアミノ酸配列に見られるとおり、Ａｓｎ（アスパラギン）に置換していたことがわかった。
【０００８】
得られた耐熱性コージビオースホスホリラーゼ産生組換え体を培養したところ、産生するコージビオースホスホリラーゼ活性は変異前の組換え体とほぼ同じ活性量であり、耐熱性コージビオースホスホリラーゼも大腸菌内で高発現し容易に製造できることがわかった。得られた耐熱性コージビオースホスホリラーゼの諸特性を調べたところ、至適ｐＨなどには変化はなく、熱安定性及び至適温度が、変異前の酵素よりも約５℃上昇して耐熱化していることがわかった。
【０００９】
得られた耐熱性コージビオースホスホリラーゼは高い耐熱性を有することから、該酵素を調製する工程で大腸菌由来の他の酵素タンパク質などを熱失活させる際、コージビオースホスホリラーゼ活性を失活させることなく安心して熱処理ができ、また、酵素剤の保存においても、より長期間の保存でも失活が少ない。さらに、変異のない酵素と比べ、より高い温度で反応することができ、すなわち約７５℃までで反応することができ、熱による失活が少ないため、より長時間の反応ができることから、少量の酵素量で反応ができるため、該酵素によって生成するコージオリゴ糖などの糖質製造において有利に利用できる。
【００１０】
次に実験により本発明をさらに具体的に説明する。
【００１１】
【実験１】
＜コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドの作製＞
配列表における配列番号６に示す５０塩基の合成ＤＮＡと配列表における配列番号７に示す４２塩基の合成ＤＮＡとを常法に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した後、その混合液を常法に従って熱処理して両ＤＮＡをアニーリングした。予め、制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素ＰｓｔＩとで切断したプラスミドｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社販売）と、アニーリングした合成ＤＮＡとを混合した後、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造株式会社販売）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換することによって、ｐＫＫ２２３−３のＥｃｏＲＩ切断部位とＰｓｔＩ切断部位の間に合成ＤＮＡを挿入して新たにＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位を有するプラスミドｐＫＳＳ２を得た。
【００１２】
特許文献１に記載のコージビオースホスホリラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＴＫＰ１を鋳型として、配列表における配列番号８に示す塩基配列を有するプライマー１と、配列表における配列番号９に示す塩基配列を有するプライマー２とを用いて、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社販売）をＰＣＲ酵素として、ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＰＪ２０００（パーキン・エルマ社製造）を用いて、９５℃で１分間保持した後、９８℃で２０秒と７２℃で４分３０秒のサイクルを２５回した後、７２℃で１０分間保持することで、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡをＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ増幅したＤＮＡを常法に従って精製した後、制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＳｐｅＩとで切断し、予め、同じ酵素で切断したプラスミドｐＫＳＳ２と混合し、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造株式会社販売）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換することによって、ｐＫＳＳ２のＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位の間にコージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有し、且つ、配列表における配列番号３に記載の塩基配列において、第１番目のＭｅｔ（メチオニン）をコードする塩基配列ＧＴＧがＡＴＧに置換したコージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドｐＫＢＫ１４を得た。
【００１３】
コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドｐＫＢＫ１４を鋳型として、配列表における配列番号１０に示す塩基配列を有するプライマー３と、配列表における配列番号１１に示す塩基配列を有するプライマー４とを用いて、先に記述したＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼのＮ−末端側をコードし、且つ、ＸｈｏＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。別途、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４を鋳型として、配列表における配列番号１２に示す塩基配列を有するプライマー５と、配列表における配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー６とを用いて、同様にＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼのＣ−末端側をコードし、且つ、ＸｈｏＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。得られたコージビオースホスホリラーゼのＮ−末端側をコードするＤＮＡと、コージビオースホスホリラーゼのＣ−末端側をコードするＤＮＡとを混合し、その混合物を鋳型として、配列表における配列番号８に示す塩基配列を有するプライマー１と、配列表における配列番号９に示す塩基配列を有するプライマー２とを用いて、同様にＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼの全域をコードし、且つ、ＸｈｏＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。この増幅したＤＮＡを上記と同様に操作しｐＫＳＳ２のＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位の間に挿入し、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４Ｘを得た。
【００１４】
次いで、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４Ｘを鋳型として、配列表における配列番号１０に示す塩基配列を有するプライマー３と、配列表における配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー７とを用いて、先に記述したＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼのＮ−末端側をコードし、且つ、ＫｐｎＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。別途、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４Ｘを鋳型として、配列表における配列番号１２に示す塩基配列を有するプライマー５と、配列表における配列番号１５に示す塩基配列を有するプライマー８とを用いて、同様にＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼのＣ−末端側をコードし、且つ、ＫｐｎＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。得られたコージビオースホスホリラーゼのＮ−末端側をコードするＤＮＡと、コージビオースホスホリラーゼのＣ−末端側をコードするＤＮＡとを混合し、その混合物を鋳型として、配列表における配列番号８に示す塩基配列を有するプライマー１と、配列表における配列番号９に示す塩基配列を有するプライマー２とを用いて、同様にＰＣＲ法でコージビオースホスホリラーゼの全域をコードし、且つ、ＫｐｎＩ切断部位が導入されたＤＮＡを増幅した。この増幅したＤＮＡを上記と同様に操作しｐＫＳＳ２のＳａｃＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位の間に挿入し、組換えプラスミドｐＫＢＫ１４ＸＫを得た。このようにして得られた組換えプラスミドｐＫＢＫ１４ＸＫを通常のジデオキシ法により分析したところ、配列表における配列番号５に記載の塩基配列を有していた。配列表における配列番号３に記載の塩基配列及びアミノ酸配列と異同を調べたところ、コードするアミノ酸配列は同一で、即ち、配列表における配列番号４に記載のアミノ酸配列中の第１番目のＭｅｔ（メチオニン）をコードする塩基配列ＧＴＧが同じくＭｅｔをコードする塩基配列ＡＴＧに置換しており、且つ、第２６９番目のＳｅｒ（セリン）をコードする塩基配列ＴＣＡが同じくＳｅｒをコードする塩基配列ＴＣＧに置換していることによりＸｈｏＩ切断部位（ＣＴＣＧＡＧ）が導入され、第７００番目のＴｈｒ（スレオニン）をコードする塩基配列ＡＣＡが同じくＴｈｒをコードする塩基配列ＡＣＣに置換していることによりＫｐｎＩ切断部位（ＧＧＴＡＣＣ）が導入されたコージビオースホスホリラーゼ遺伝子であることが判明した。本プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して得られた形質転換体を『ＫＢＫ１４ＸＫ』と名付けた。
【００１５】
【実験２】
＜コージビオースホスホリラーゼ遺伝子への変異導入＞
組換えプラスミドｐＫＢＫ１４ＸＫを制限酵素ＳａｃＩと制限酵素ＳｐｅＩとで切断し、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を常法に従って精製した後、このＤＮＡを鋳型として、配列表における配列番号１３に示す塩基配列を有するプライマー６と配列表における配列番号１４に示す塩基配列を有するプライマー７とを用い、ＰＣＲ変異キット（商品名『ＧｅｎｅＭｏｒｐｈＰＣＲＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ』、ストラスジーン社販売）を用い、そのキットに添付されていたプロトコールに従って、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡにランダムな変異を導入した。変異処理したＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩと制限酵素ＫｐｎＩとで切断した後、ランダム変異が導入された約１．３ＫｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って精製した。別途、ｐＫＢＫ１４ＸＫを同じ制限酵素で切断した後、約５．６ＫｂｐＤＮＡ断片を常法に従って精製した後、ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造株式会社販売）を用いて上記の変異導入された約１．３ＫｂｐのＤＮＡ断片と連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換することによって、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子にランダムな変異が導入された組換えプラスミドを有する組換え大腸菌ライブラリーを作製した。
【００１６】
【実験３】
＜耐熱性コージビオースホスホリラーゼのスクリーニング＞
実験２の方法で作製した組換え大腸菌ライブラリーを用いて、１％トリプトン（バクト社製造）、０．５％酵母エキス（バクト社製造）、１％塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌアンピシリンＮａ塩、及び１．５％寒天を含む培養プレート上で組換え大腸菌をコロニーとして分離し、この分離したコロニーのうち、１，１４０個を別々に同じ培地組成のスラント培地に移植し３７℃で２４時間培養した。培養した菌体を１白金耳採り、１．６％トリプトン、１％酵母エキス（バクト社製造）、０．５％塩化ナトリウム、及び、１００μｇ／ｍｌアンピシリンＮａ塩からなる液体培地（５ｍｌ）が入った試験管に移植し、３７℃で２４時間振とう培養した。得られた培養液の１ｍｌを、０．４ｍｇ／ｍｌリゾチーム及び５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）からなる水溶液（３ｍｌ）が入った試験管に加え、３７℃で３時間振とうし溶菌した後、７０℃で３０分間保持して熱処理した。対照として、ランダム変異が導入されていないプラスミドｐＫＢＫ１４ＸＫを有する組換え大腸菌『ＫＢＫ１４ＸＫ』を同様に培養し処理した。得られた酵素液について、熱処理前後のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定し、熱処理後の該酵素活性が比較的に残存する酵素液を選ぶことによって、変異により耐熱化したコージビオースホスホリラーゼを産生する組換え大腸菌をスクリーニングした結果、試験した１，１４０コロニーのうち、Ｎｏ．１０−５４が高い残存酵素活性を示すことがわかった。この耐熱性コージビオースホスホリラーゼ変異組換え体を『ＫＢＫＴＳ』と名付けた。結果を表１に示す。
【００１７】
【表１】

【００１８】
なお、コージビオースホスホリラーゼの活性は次のようにして測定する。基質として１．０ｗ／ｖ％コージビオースを含む２０ｍＭマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌに酵素液０．２ｍｌを加え、６０℃で３０分間反応させた後、反応液０．５ｍｌを１００℃、１０分間加熱し反応を停止させる。この反応停止液にＤ−グルコースオキシダーゼ／パーオキシダーゼ試薬０．５ｍｌを添加、攪拌し、４０℃で３０分間放置した後、５Ｎ塩酸２．５ｍｌを添加、攪拌し、５２５ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素活性１単位は、前記反応条件下で、１分間当たり１μｍｏｌのＤ−グルコースを生成する酵素量とする。
【００１９】
【実験４】
＜ＤＮＡ分析＞
実験３の方法で得た組換え体ＫＢＫＴＳを常法に従い、１００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム塩を含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振とう培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、配列表における配列番号２に示す塩基配列のＤＮＡを含んでおり、併記したアミノ酸配列、すなわち配列番号１に記載したアミノ酸配列をコードしていることが判明した。ランダム変異前の配列表における配列番号５に示す塩基配列と異同を調べたところ、第１，５３７番目の塩基であるＧがＡに変異し、その変異によって第５１３番目のアミノ酸残基であるＡｓｐ（アスパラギン酸）がＡｓｎ（アスパラギン）に置換していることがわかった。
【００２０】
【実験５】
＜耐熱性コージビオースホスホリラーゼの産生＞
１６ｇ／ｌポリペプトン、１０ｇ／ｌ酵母エキス及び塩化ナトリウムを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調整した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験３の方法で得た組換え体ＫＢＫＴＳを接種し、２７℃で約２４時間回転振とう培養したものを種培養液とした。次に、５ｇ／ｌデキストリン、２０ｇ／ｌ酵母エキス、２０ｇ／ｌポリペプトン及び１ｇ／ｌリン酸１水素ナトリウムを含む水溶液をｐＨ７．０に調整し、１０ｌ容ジャーファメンターに７ｌ入れ、１２０℃で２０分間加熱処理し、冷却した後、アンピシリンナトリウム塩７００ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製し、種培養液を７０ｍｌ接種し、２７℃で約２４時間通気攪拌培養した。この培養物を、常法にしたがい、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して湿重量約２０１ｇの菌体を回収し、それを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）６７０ｍｌに懸濁し、リゾチーム２７０ｍｇを加えて３７℃で１時間静置した後、菌体破砕装置（商品名『ＵＨ−６００』、エスエムティー社製造）を用いて超音波処理して菌体を破砕した。それを６０℃で１時間熱処理し、冷却後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、３０分間）して不溶物を除去し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４８時間透析し、再度、遠心分離して不溶物を除去して、酵素液約７５０ｍｌを得た。酵素液のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定したところ、培養物１ｍｌ当たりに換算すると約１２．８単位の当該酵素が産生されていた。
【００２１】
第一の対照として、実験１の方法で得たアミノ酸置換のないコージビオースホスホリラーゼ産生組換え体ＫＢＫ１４ＸＫ株を、上述の場合と同一条件で、培養し、培養菌体（約２２０ｇ）から菌体破砕物の上清を採取し、透析して酵素液を調製した。酵素液のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定したところ、対照の酵素産生は培養物１ｍｌ当たり約１４単位であり、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼ産生組換え体ＫBＫＴＳの場合と比較してほぼ同じ値であった。
【００２２】
第二の対照として、遺伝子供与体であるサーモアナエロビウム・ブロッキイＡＴＣＣ３５０４７を特許文献１に記載の方法に準じて、温度６０℃、約４０時間嫌気培養し、培養液約４０ｌを遠心分離して採取した湿重量９２ｇの培養菌体を上述と同一の条件で処理して、酵素液を調製した。酵素液のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定したところ、遺伝子供与体であるサーモアナエロビウム・ブロッキイＡＴＣＣ３５０４７の酵素産生は培養物１ｍｌ当たり約０．１単位であり、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼ産生組換え体ＫＢＫＴＳの場合と比較して約１／１０００以下の値であった。
【００２３】
【実験６】
＜耐熱性コージビオースホスホリラーゼの性質＞
実験５の方法で得た本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼと対照（第一）のアミノ酸置換のないコージビオースホスホリラーゼを用いて、酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を、活性測定方法に準じて調べた。即ち、温度の影響を調べる際には、活性測定方法における反応温度６０℃に代えて約４０℃乃至８０℃のいずれかの温度で反応を行い、ｐＨの影響を調べる際には、活性測定において用いられる緩衝液に代えて、ｐＨ約４乃至８のいずれかのｐＨに緩衝能を有する緩衝液を用いて反応を行い、この後、活性測定方法と同様に反応停止し、グルコース生成量を測定した。それらの測定結果を、図１（温度の影響）、図２（ｐＨの影響）に示した。図中、「○」は本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼを示し、「●」は対照を示す（以下、同じ）。至適温度は、ｐＨ５．５、３０分間反応の条件で、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼの場合、７０℃付近で、対照の酵素の場合、６５℃付近であった。至適ｐＨは、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼと対照の酵素とも、５．５付近であった。酵素の温度安定性は、酵素を溶解せしめた１０ｍＭマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．５）を約４０乃至８０℃のいずれかの温度に１時間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を活性測定法にしたがって求めた。また、ｐＨ安定性は、ｐＨ約３．５乃至約１０のいずれかのｐＨに緩衝能を有する緩衝液に酵素を溶解せしめ、４℃で２４時間保持した後、ｐＨ５．５に調整し、残存する酵素活性を活性測定法にしたがって求めた。それらの結果を、図３（温度安定性）、図４（ｐＨ安定性）に示した。本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼの温度安定性は７０℃付近までで、対照の酵素は６５℃付近までであった。ｐＨ安定性は、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼと対照の酵素とも、約５．５乃至１０．０であった。
【００２４】
この実験５の方法で得た酵素液を、さらに特許文献１に記載の方法に準じて、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０ゲル、ウルトロゲルＡｃＡ４４を用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、得られた精製酵素を分析したところ、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼの比活性は蛋白質ｍｇ当たり６５．３単位で、対照（第二）の遺伝子供与体であるサーモアナエロビウム・ブロッキイＡＴＣＣ３５０４７由来の精製コージビオースホスホリラーゼの比活性（蛋白質ｍｇ当たり７１．４単位）と比べるとほぼ同等（約９１％）であった。また、精製された耐熱性コージビオースホスホリラーゼは、上述した結果と同様に、至適温度７０℃付近、至適ｐＨ５．５付近、温度安定性７０℃付近まで、及びｐＨ安定性約５．５乃至１０．０を示した。
【００２５】
【実験７】
＜コージビオース生成＞
濃度１０％β−Ｄ−グルコース−１リン酸、濃度７％Ｄ−グルコース及び１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を含む水溶液に、実験５の方法で得た本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり６単位加え、７０℃で２４時間反応した後、１００℃で１０分間熱処理して反応を停止した。反応液を孔径０．４５μｍのフィルターで濾過し、その濾過液を電気透析器（商品名『ＭＩＣＲＯＡＣＩＬＹＥＲＧ０』、旭化成株式会社製造）で脱塩した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法で糖組成を分析した。対照として、実験５の方法で得た組換え体ＫＢＫ１４ＸＫ株由来のアミノ酸置換のないコージビオースホスホリラーゼを用いて、同一条件で反応し分析した。ＨＰＬＣカラムはＭＣＩＧＥＬＣＫ０４ＳＳカラム（三菱化学株式会社製造）を用い、カラム温度８５℃で、溶出溶媒が水で流速０．４ｍｌ／分の条件で通液し、示差屈折計（商品名『ＲＩ−８０２０』、東ソー株式会社製造）を用いて検出した。これらの結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】

【００２７】
表２の結果から明らかなように、反応温度７０℃の試験条件で本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼと対照のコージビオースホスホリラーゼとを比較したところ、耐熱性のコージビオースホスホリラーゼの場合、生成物のコージビオースが３４．２％で、さらにそのコージビオースに転移したコージトリオースが８．５％で合計４２．７％が総生成物量であるのに対して、対照のアミノ酸置換のないコージビオースホスホリラーゼの場合、生成物のコージビオースが２０．５％で、さらにそのコージビオースに転移したコージトリオースが３．０％で合計２３．５％が総生成物量と本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼの約１／２であることがわかり、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼは高い反応温度条件でもコージビオースやコージトリオースの生成率が高いことが判明した。
【００２８】
以上の実験の結果は、本来、コージビオースホスホリラーゼを産生する微生物から該酵素遺伝子をクローン化し、それに人為的な変異を与え、ＤＮＡの塩基を置換することによって、それがコードするアミノ酸残基を置換し、適当なベクターに組換え、適当な宿主に形質転換し組換え微生物を得、その組換え微生物を培養し、酵素を生産させ採取することによって、本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼを製造できることを示している。本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼは、組換えＤＮＡ技術によって作製された組換え体の酵素生産性が高く、酵素製造が容易であり、高い反応温度でも失活が少ないため、コージビオースやコージトリオースなどオリゴ糖の生産に有利に利用できることを示している。
【００２９】
【発明の効果】
叙上のように本発明は、組換えＤＮＡ技術を利用し、コージビオースホスホリラーゼ遺伝子ＤＮＡに変異を与え、コードするアミノ酸残基を置換し、これまで得ることができなかった耐熱性コージビオースホスホリラーゼを作製するものである。本発明の耐熱性コージビオースホスホリラーゼは、至適温度、温度安定性における温度が高く、更に組換え微生物からの酵素生産も高い。したがって、本発明の酵素を利用すれば、コージビオースやコージトリオースなどのコージオリゴ糖を大量且つ安価に製造できることから、本発明は、食品、化粧品、医薬品分野のみならず、農水畜産業や、化学工業等の産業界に貢献すること誠に多大な意義ある発明といえる。
【００３０】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のコージビオースホスホリラーゼの酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図２】本発明のコージビオースホスホリラーゼの酵素活性に及ぼすpHの影響を示す図である。
【図３】本発明のコージビオースホスホリラーゼの安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図４】本発明のコージビオースホスホリラーゼの安定性に及ぼすpHの影響を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a thermostable cordobiose phosphorylase, and more specifically, inorganic phosphoric acid and / or a salt thereof (hereinafter, abbreviated as “inorganic phosphoric acid” throughout the present specification unless inconvenience occurs). Cozybiose is decomposed in the presence of D-glucose and β-D-glucose-1-phosphate and / or a salt thereof (hereinafter referred to as “β-D-glucose-1-phosphate” throughout the present specification unless inconvenience occurs). In contrast, the amino acid residue in the amino acid sequence of the enzyme cordobiose phosphorylase, which shows the action of producing cordobiose and inorganic phosphate from β-D-glucose-1 phosphate and D-glucose, The present invention relates to a thermostable cordobiose phosphorylase having an optimum reaction temperature and improved temperature stability by substituting a group with another amino acid residue.
[0002]
[Prior art]
[Patent Document 1]
JP-A-10-304882
[Non-Patent Document 1]
"Enzyme Handbook" Asakura Shoten (1982)
[0003]
In recent years, oligosaccharides such as maltose and trehalose and their functions have attracted attention, and various production methods of these oligosaccharides have been widely studied from various fields. As methods for producing these oligosaccharides, utilization of various phosphorylases such as maltose phosphorylase, trehalose phosphorylase, sucrose phosphorylase, cellobiose phosphorylase, laminaribiose phosphorylase is known. These phosphorylases and their actions are summarized in Non-Patent Document 1. However, at that time, phosphorylase capable of producing cordobiose has not been reported academically, even its existence has not been known, and its provision has been desired.
[0004]
Under such circumstances, the present inventors searched for an unknown cordobiose phosphorylase and searched for microorganisms producing the enzyme widely. As a result, as disclosed in Patent Document 1, It was found that the microorganism Thermoanaerobium blockii (ATCC 35047) belonging to Anaerobium produces a novel enzyme, Codybiose phosphorylase, and has the following physicochemical properties: At the same time, the manufacturing method was established.
(1) Action
(A) Cozybiose is decomposed in the presence of inorganic phosphate to produce D-glucose and β-D-glucose-1 phosphate.
(B) Cozybiose and inorganic phosphate are produced from β-D-glucose-1-phosphate and D-glucose, and β-D-glucose-1 phosphate is used as a sugar donor, and glucose is added to other carbohydrates. Catalyzes the transfer of
(2) Molecular weight
83,000 ± 5,000 daltons by SDS-gel electrophoresis
(3) Isoelectric point
PI 4.4 ± 0.5 by an ampholine-containing electrophoresis
(4) Optimal temperature
pH 5.5, around 65 ° C for 30 minutes reaction
(5) Optimum pH
PH around 5.5 after reaction at 60 ° C for 30 minutes
(6) Temperature stability
Stable up to around 65 ° C under pH 5.5 and 1 hour holding conditions
(7) pH stability
PH of about 5.5 to 10.0 at 4 ° C. for 24 hours
Furthermore, it was also found that the present cordobiose phosphorylase is encoded by the base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and has the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. In addition, a glucosyltransferase-containing saccharide obtained by allowing the present enzyme to act in the presence of various saccharides using β-D-glucose-1-phosphate as a sugar donor, and a method for producing a composition containing the saccharide Established.
[0005]
Enzyme heat resistance is an extremely important factor in the use of enzyme reactions. Enzymes with high heat resistance can be reacted for a long time with a small amount of enzyme, so the amount of enzyme in the enzyme reaction can be reduced, and carbohydrates are produced. Moreover, it is economically advantageous. Enzymes are made from proteins, and the properties that enzymes exhibit are due to the primary amino acid sequence of the enzyme protein, and the heat resistance of the enzyme is also generated by the primary amino acid sequence and the higher order structure formed by the primary sequence. That's what is generally recognized. At present, it is possible to uniquely determine the amino acid sequence of an enzyme protein by cloning DNA encoding the enzyme protein and decoding the DNA sequence using genetic manipulation techniques. In addition, it is possible to artificially substitute bases in the base sequence of gene DNA with other bases, change the encoded amino acid residues, and produce mutant enzyme proteins substituted with other amino acid residues, In some enzyme proteins, a thermostable enzyme is obtained by artificially giving a gene mutation. However, in the case of cordobiose phosphorylase, although a thermostable enzyme having high thermostability that is economically advantageous for the transfer sugar production reaction has been desired, the thermostable cordobiose phosphorylase has not been realized.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
In view of such circumstances, an object of the present invention is to provide a thermostable cord that has an optimum reaction temperature and improved temperature stability by substituting an amino acid residue in the amino acid sequence of cordobiose phosphorylase with another amino acid residue. It is to provide biose phosphorylase and a method for producing the same.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors firstly prepared Codybiose phosphorylase gene DNA derived from Thermoanaerobium brokkii ATCC 35047 and having the base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing as its amino acid. Mutating without changing the sequence, introducing a restriction enzyme cleavage site and the like, recombining it into an expression plasmid vector pKK223-3 in Escherichia coli, and producing high-quality Combibiose phosphorylase having the base sequence described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing A recombinant plasmid was produced. Next, cordobiose phosphorylase gene DNA was taken out from the obtained recombinant plasmid, and randomly mutated in a test tube to prepare a cordobiose phosphorylase gene DNA mixture in which various amino acid substitutions occurred. The mutated DNA was returned to a recombinant plasmid, and then transformed into E. coli to produce a mutated cordobiose phosphorylase gene library. Next, the recombinant Escherichia coli is isolated and cultured from the obtained gene library, and the mutant Cozybiose phosphorylase is extracted from the obtained cultured cells, and the thermostability of the mutant enzyme is examined. Transformants producing mutant Cozybiose phosphorylase with improved properties were screened. As a result, one target transformant was obtained. Furthermore, when the recombinant DNA was extracted from the transformant, the nucleotide sequence of the DNA was determined and the mutation site of the cordobiose phosphorylase gene DNA was examined, the DNA was sequenced in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. When the difference between the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing before random mutation was examined, G, which is the 1st, 537th base, was mutated to A, and the mutation resulted in the sequence listing. Asp (aspartic acid) which is the 513th amino acid residue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 is replaced with Asn (asparagine) as seen in the amino acid sequence written in the base sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. I understood that I was doing.
[0008]
When the obtained heat-stable Cozybiose phosphorylase-producing recombinant was cultured, the produced Cozybiose phosphorylase activity was almost the same as that of the pre-mutation recombinant, and the heat-resistant Cozybiose phosphorylase was also produced in E. coli. It was found that it was highly expressed and could be easily manufactured. The various properties of the resulting thermostable cordobiose phosphorylase were examined. As a result, there was no change in the optimum pH, etc., and the heat stability and the optimum temperature were increased by about 5 ° C. compared to the enzyme before mutation. I found out.
[0009]
Since the obtained thermostable cordobiose phosphorylase has high thermostability, when other enzyme proteins derived from Escherichia coli are heat-inactivated in the step of preparing the enzyme, it is necessary to inactivate cordobiose phosphorylase activity. Heat treatment can be performed with peace of mind, and there is little inactivation even when the enzyme agent is stored for longer periods. Furthermore, it can react at a higher temperature compared to an enzyme without mutation, that is, it can react up to about 75 ° C., and since it is less deactivated by heat, it can be reacted for a longer time. Since it can react with the amount of enzyme, it can be advantageously used in the production of carbohydrates such as cordierigosaccharides produced by the enzyme.
[0010]
Next, the present invention will be described more specifically by experiments.
[0011]
[Experiment 1]
<Preparation of a recombinant plasmid having a cordobiose phosphorylase gene>
The 50-base synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing and the 42-base synthetic DNA shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing are phosphorylated with T4 polynucleotide kinase according to a conventional method, and then the mixed solution is heat-treated according to a conventional method. Both DNAs were annealed. In advance, the plasmid pKK223-3 (sold by Pharmacia) cleaved with the restriction enzymes EcoRI and PstI and the annealed synthetic DNA were mixed, and then ligated using a DNA ligation kit (sold by Takara Shuzo Co., Ltd.) By transforming into E. coli JM109, a synthetic DNA was inserted between the EcoRI cleavage site and the PstI cleavage site of pKK223-3 to obtain a plasmid pKSS2 having a new SacI cleavage site and a SpeI cleavage site.
[0012]
Primer 1 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing, and primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, using the recombinant plasmid pTKP1 containing the Kojibiose phosphorylase gene described in Patent Document 1 as a template 2 and Pyrobest DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) as a PCR enzyme and DNA Thermal Cycler PJ2000 (manufactured by Perkin Elma Co.) for 1 minute at 95 ° C., then at 98 ° C. for 20 seconds. After 25 cycles of 4 minutes and 30 seconds at 72 ° C., the DNA containing the cordobiose phosphorylase gene was PCR amplified by holding at 72 ° C. for 10 minutes. This PCR-amplified DNA is purified according to a conventional method, cleaved with restriction enzyme SacI and restriction enzyme SpeI, mixed with plasmid pKSS2 previously cleaved with the same enzyme, and a DNA ligation kit (available from Takara Shuzo Co., Ltd.) is used. In the base sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, the gene has a Kojibiose phosphorylase gene between the SacI cleavage site and SpeI cleavage site of pKSS2 and transformed into Escherichia coli JM109. A recombinant plasmid pKBK14 having a cordobiose phosphorylase gene in which the base sequence GTG encoding the first Met (methionine) was replaced with ATG was obtained.
[0013]
Using a recombinant plasmid pKBK14 having a cordobiose phosphorylase gene as a template, using primer 3 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing and primer 4 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing, The DNA encoding the N-terminal side of cordobiose phosphorylase and introducing the XhoI cleavage site was amplified by the PCR method described above. Separately, using the recombinant plasmid pKBK14 as a template, a primer 5 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing and a primer 6 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing are similarly used in the PCR method. A DNA encoding the C-terminal side of cordobiose phosphorylase and having an XhoI cleavage site introduced therein was amplified. The DNA encoding the N-terminal side of the obtained cordobiose phosphorylase is mixed with the DNA encoding the C-terminal side of cordobiose phosphorylase, and the mixture is used as a template to show SEQ ID NO: 8 in the sequence listing. Using the primer 1 having the base sequence and the primer 2 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, the entire region of cordobiose phosphorylase is similarly encoded by the PCR method, and the XhoI cleavage site is introduced. DNA was amplified. This amplified DNA was manipulated in the same manner as described above, and inserted between the SacI cleavage site and SpeI cleavage site of pKSS2 to obtain a recombinant plasmid pKBK14X.
[0014]
Then, using the recombinant plasmid pKBK14X as a template, PCR described above using primer 3 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing and primer 7 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing By the method, DNA encoding the N-terminal side of cordobiose phosphorylase and having a KpnI cleavage site introduced was amplified. Separately, using the recombinant plasmid pKBK14X as a template, a primer 5 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing and a primer 8 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing are similarly used in the PCR method. A DNA encoding the C-terminal side of cordobiose phosphorylase and having a KpnI cleavage site introduced therein was amplified. The DNA encoding the N-terminal side of the obtained cordobiose phosphorylase is mixed with the DNA encoding the C-terminal side of cordobiose phosphorylase, and the mixture is used as a template to show SEQ ID NO: 8 in the sequence listing. Using the primer 1 having the base sequence and the primer 2 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, the entire region of cordobiose phosphorylase is similarly encoded by the PCR method, and a KpnI cleavage site is introduced. DNA was amplified. This amplified DNA was manipulated in the same manner as described above and inserted between the SacI cleavage site and SpeI cleavage site of pKSS2 to obtain a recombinant plasmid pKBK14XK. When the recombinant plasmid pKBK14XK thus obtained was analyzed by a normal dideoxy method, it had the base sequence described in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing. When the nucleotide sequence and amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing were examined for differences, the encoded amino acid sequence was the same, that is, the first Met in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing ( The base sequence GTG encoding methionine is also replaced with the base sequence ATG encoding Met, and the base sequence TCA encoding the 269th Ser (serine) is also replaced with the base sequence TCG encoding Ser. Thus, the XhoI cleavage site (CTCGAG) was introduced, and the base sequence ACA encoding the 700th Thr (threonine) was replaced with the base sequence ACC also encoding Thr, whereby the KpnI cleavage site (GGTACC) ) Was found to be an introduced Cozybiose phosphorylase gene . The transformant obtained by transforming this plasmid into Escherichia coli JM109 was named “KBK14XK”.
[0015]
[Experiment 2]
<Introduction of mutations into the Kojibiose phosphorylase gene>
The recombinant plasmid pKBK14XK was cleaved with restriction enzyme SacI and restriction enzyme SpeI, and a DNA fragment containing the cordobiose phosphorylase gene was purified according to a conventional method, and then the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing using this DNA as a template A PCR mutation kit (trade name “GeneMorph PCR Mutagenesis Kit”, sold by Strathgene) and a primer 6 having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 in the Sequence Listing are attached to the kit. Random mutations were introduced into the Combibiose phosphorylase gene DNA. The mutated DNA was cleaved with the restriction enzyme XhoI and the restriction enzyme KpnI, and then a DNA fragment of about 1.3 Kbp into which the random mutation was introduced was purified according to a conventional method. Separately, after pKBK14XK was cleaved with the same restriction enzyme, an about 5.6 Kbp DNA fragment was purified according to a conventional method, and then the above-described mutated DNA of about 1.3 Kbp was introduced using a DNA ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). By ligating the fragments and transforming into E. coli JM109, a recombinant E. coli library having a recombinant plasmid in which random mutations were introduced into the cordobiose phosphorylase gene was prepared.
[0016]
[Experiment 3]
<Screening for thermostable cordobiose phosphorylase>
1% tryptone (manufactured by Bacto), 0.5% yeast extract (manufactured by Bacto), 1% sodium chloride, 100 μg / ml ampicillin Na salt, and Recombinant Escherichia coli was isolated as a colony on a culture plate containing 1.5% agar, and 1,140 of the separated colonies were separately transferred to a slant medium having the same medium composition and cultured at 37 ° C. for 24 hours. . One platinum loop of the cultured cells, 1.6% tryptone, 1% yeast extract (manufactured by Bact), 0.5% sodium chloride, and liquid medium (5 ml) consisting of 100 μg / ml ampicillin Na salt The cells were transplanted to a test tube and cultured with shaking at 37 ° C. for 24 hours. 1 ml of the obtained culture solution was added to a test tube containing an aqueous solution (3 ml) consisting of 0.4 mg / ml lysozyme and 50 mM acetate buffer (pH 6.0), and shaken at 37 ° C. for 3 hours for lysis. And kept at 70 ° C. for 30 minutes for heat treatment. As a control, recombinant E. coli “KBK14XK” having plasmid pKBK14XK into which no random mutation was introduced was cultured and treated in the same manner. About the obtained enzyme solution, Cozybiose phosphorylase activity before and after heat treatment is measured, and by selecting an enzyme solution in which the enzyme activity remains relatively after heat treatment, Codybiose phosphorylase that is heat-resistant by mutation is produced. As a result of screening recombinant Escherichia coli, no. 10-54 was found to show high residual enzyme activity. This thermostable cordobiose phosphorylase mutant recombinant was named “KBKTS”. The results are shown in Table 1.
[0017]
[Table 1]

[0018]
The activity of cordobiose phosphorylase is measured as follows. After adding 0.2 ml of the enzyme solution to 2 ml of 20 mM McKilvein buffer (pH 5.5) containing 1.0 w / v% cordobiose as a substrate and reacting at 60 ° C. for 30 minutes, 0.5 ml of the reaction solution was added at 100 ° C., 10 ° C. Heat for minutes to stop the reaction. To this reaction stop solution, 0.5 ml of D-glucose oxidase / peroxidase reagent is added and stirred, and allowed to stand at 40 ° C. for 30 minutes, then 2.5 ml of 5N hydrochloric acid is added and stirred, and the absorbance at 525 nm is measured. One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that produces 1 μmol of D-glucose per minute under the above reaction conditions.
[0019]
[Experiment 4]
<DNA analysis>
Recombinant KBKTS obtained by the method of Experiment 3 was inoculated in an L-broth medium (pH 7.0) containing 100 μg / ml ampicillin sodium salt according to a conventional method, and cultured with shaking at 37 ° C. for 24 hours. After completion of the culture, the cells were collected from the culture by centrifugation, and the recombinant DNA was extracted by the usual alkali-SDS method. When the base sequence of this recombinant DNA was analyzed by a normal dideoxy method, it contained DNA of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and the amino acid sequence described in parallel, that is, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 It turns out that it is coding. When the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing before random mutation was examined, G, which is the first 537th base, was mutated to A, and Asp, which is the 513rd amino acid residue due to the mutation. It was found that (aspartic acid) was substituted with Asn (asparagine).
[0020]
[Experiment 5]
<Production of thermostable cordobiose phosphorylase>
100 ml of an aqueous solution containing 16 g / l polypeptone, 10 g / l yeast extract and sodium chloride is placed in a 500 ml Erlenmeyer flask, treated in an autoclave at 121 ° C. for 15 minutes, cooled and aseptically adjusted to pH 7.0, and then ampicillin. A liquid medium was prepared by aseptically adding 10 mg of sodium salt. This liquid medium was inoculated with the recombinant KBKTS obtained by the method of Experiment 3, and cultured at 27 ° C. for about 24 hours with rotation and shaken. Next, an aqueous solution containing 5 g / l dextrin, 20 g / l yeast extract, 20 g / l polypeptone and 1 g / l sodium monohydrogen phosphate was adjusted to pH 7.0, and 7 l in a 10 l jar fermenter was added at 120 ° C. After heat treatment for 20 minutes and cooling, 700 mg of ampicillin sodium salt was aseptically added to prepare a liquid medium, inoculated with 70 ml of seed culture, and cultured at 27 ° C. for about 24 hours with aeration and agitation. This culture was centrifuged (10,000 rpm, 30 minutes) according to a conventional method to recover about 201 g of wet cells, and suspended in 670 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.0). After adding 270 mg of lysozyme and allowing to stand at 37 ° C. for 1 hour, the microbial cells were crushed by sonication using a microbial cell crusher (trade name “UH-600”, manufactured by SMT). It is heat-treated at 60 ° C. for 1 hour, cooled, centrifuged (10,000 rpm, 30 minutes) to remove insoluble matters, dialyzed against 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) for 48 hours, and again The insoluble matter was removed by centrifugation to obtain about 750 ml of enzyme solution. When the Cozybiose phosphorylase activity of the enzyme solution was measured, about 12.8 units of the enzyme were produced in terms of 1 ml of the culture.
[0021]
As a first control, the Kojibiose phosphorylase-producing recombinant KBK14XK strain without amino acid substitution obtained by the method of Experiment 1 is cultured under the same conditions as described above, and the cultured cells (about 220 g) are cultured. The supernatant of the crushed material was collected and dialyzed to prepare an enzyme solution. As a result of measuring the Cozybiose phosphorylase activity of the enzyme solution, the enzyme production of the control was about 14 units per 1 ml of the culture, which was almost the same as in the case of the heat-resistant Combibiose phosphorylase-producing recombinant KBKTS of the present invention. Value.
[0022]
As a second control, Thermoanaerobium brokkii ATCC 35047, a gene donor, was anaerobically cultured at a temperature of 60 ° C. for about 40 hours according to the method described in Patent Document 1, and about 40 l of the culture solution was centrifuged. The cultured bacterial cells with a wet weight of 92 g collected in the above were treated under the same conditions as described above to prepare an enzyme solution. Cozybiose phosphorylase activity of the enzyme solution was measured. As a result, the enzyme production of the gene donor Thermoanaerobium brokkii ATCC 35047 was about 0.1 unit per 1 ml of the culture, and the thermostable cordobiose of the present invention The value was about 1/1000 or less compared to the phosphorylase-producing recombinant KBKTS.
[0023]
[Experiment 6]
<Properties of thermostable cordobiose phosphorylase>
Using the thermostable cordobiose phosphorylase of the present invention obtained by the method of Experiment 5 and the control (first) cordierbiose phosphorylase without amino acid substitution, the effects of temperature and pH on the enzyme activity were measured in the activity measurement method. It investigated according to. That is, when investigating the influence of temperature, the reaction is carried out at a temperature of about 40 ° C. to 80 ° C. instead of the reaction temperature of 60 ° C. in the activity measuring method. In place of the buffer solution used, the reaction is performed using a buffer solution having a buffer capacity at any pH of about 4 to 8, and thereafter, the reaction is stopped in the same manner as in the activity measurement method, and the amount of glucose produced is measured. did. The measurement results are shown in FIG. 1 (effect of temperature) and FIG. 2 (effect of pH). In the figure, “◯” indicates the thermostable cordobiose phosphorylase of the present invention, and “●” indicates a control (hereinafter the same). The optimum temperature was approximately 5.5 ° C. for the thermostable cordobiose phosphorylase of the present invention and about 65 ° C. for the control enzyme under the reaction conditions of pH 5.5 and 30 minutes. The optimum pH of both the thermostable cordobiose phosphorylase of the present invention and the control enzyme was around 5.5. The temperature stability of the enzyme is determined by measuring the remaining enzyme activity after maintaining a 10 mM McBain buffer solution (pH 5.5) in which the enzyme is dissolved at a temperature of about 40 to 80 ° C. for 1 hour and cooling with water. It was calculated according to In addition, the pH stability is adjusted by adjusting the pH to 5.5 after dissolving the enzyme in a buffer solution having a buffer capacity at any pH of about 3.5 to about 10 and holding at 4 ° C. for 24 hours. The enzyme activity was determined according to the activity measurement method. The results are shown in FIG. 3 (temperature stability) and FIG. 4 (pH stability). The thermostability of the thermostable cordobiose phosphorylase of the present invention was up to about 70 ° C., and the control enzyme was up to about 65 ° C. The pH stability was about 5.5 to 10.0 for both the thermostable cordobiose phosphorylase of the present invention and the control enzyme.
[0024]
The enzyme solution obtained by the method of Experiment 5 was further purified by column chromatography using DEAE-Toyopearl 650 gel and Ultrogel AcA44 according to the method described in Patent Document 1, and the purified enzyme thus obtained was purified. As a result of analysis, the specific activity of the thermostable cordobiose phosphorylase of the present invention was 65.3 units per mg of protein, and purified Combibi derived from Thermoanaerobium brokkii ATCC 35047 which is a control (second) gene donor. Compared with the specific activity of aus phosphorylase (71.4 units per mg of protein), it was almost equivalent (about 91%). In addition, the purified thermostable cordobiose phosphorylase has an optimum temperature of around 70 ° C., an optimum pH of around 5.5, a temperature stability of around 70 ° C., and a pH stability of about 5.5. To 10.0.
[0025]
[Experiment 7]
<Corgebiose generation>
The thermostable cordobiose phosphorylase of the present invention obtained by the method of Experiment 5 in an aqueous solution containing 10% β-D-glucose-1-phosphate, 7% D-glucose and 100 mM acetate buffer (pH 5.5) 6 units per gram of β-D-glucose-1-phosphate, reacted at 70 ° C. for 24 hours, and then heat treated at 100 ° C. for 10 minutes to stop the reaction. The reaction solution is filtered through a filter having a pore size of 0.45 μm, and the filtrate is desalted with an electrodialyzer (trade name “MICRO ACILYER G0” manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.), and then subjected to high-performance liquid chromatography (HPLC). The composition was analyzed. As a control, Kojibiose phosphorylase without amino acid substitution derived from the recombinant KBK14XK strain obtained by the method of Experiment 5 was reacted and analyzed under the same conditions. As the HPLC column, a MCIGEL CK04SS column (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) was used, and the column temperature was 85 ° C., the elution solvent was water and the flow rate was 0.4 ml / min, and a differential refractometer (trade name “RI-8020” was used. ], Manufactured by Tosoh Corporation). These results are shown in Table 2.
[0026]
[Table 2]

[0027]
As is clear from the results in Table 2, when the thermostable cordobiose phosphorylase of the present invention was compared with the control cordobiose phosphorylase under the test conditions of a reaction temperature of 70 ° C., in the case of the thermostable cordobiose phosphorylase, The cordierbiose of the product is 34.2%, the cordierose that has transferred to the cordobiose is 8.5%, and the total product amount is 42.7%. In the case of ausphosphorylase, the cordierobiose of the product is 20.5%, the corditriose transferred to the cordierose is 3.0%, and the total product amount is 23.5%, and the thermostable cordobiose phosphorylase of the present invention. It can be seen that the thermostable cordobiose phosphorylase of the present invention is high even under high reaction temperature conditions. It was found that high Jibiosu and Koji maltotriose of the production rate.
[0028]
As a result of the above experiment, the enzyme gene was originally cloned from a microorganism that produces Kojibiose phosphorylase, artificially mutated to it, and the amino acid residue encoded by it was replaced by substituting the DNA base. Substitution, recombination into an appropriate vector, transformation into an appropriate host to obtain a recombinant microorganism, culturing the recombinant microorganism, producing and collecting the enzyme, the thermostable cordobiose phosphorylase of the present invention It shows that it can be manufactured. The thermostable cordobiose phosphorylase of the present invention has high enzyme productivity of recombinants produced by recombinant DNA technology, is easy to produce enzymes, and has little inactivation even at high reaction temperatures. This shows that it can be used advantageously for the production of oligosaccharides such as ausose.
[0029]
【The invention's effect】
As described above, the present invention uses a recombinant DNA technique, mutates the Kojibiose phosphorylase gene DNA, replaces the encoded amino acid residue, and has not been obtained so far. It produces phosphorylase. The thermostable cordobiose phosphorylase of the present invention has a high temperature at the optimum temperature and temperature stability, and also has high enzyme production from recombinant microorganisms. Therefore, if the enzyme of the present invention is used, cordier oligosaccharides such as cordobiose and cordiertriose can be produced in large quantities and at low cost, the present invention is not limited to the fields of food, cosmetics and pharmaceuticals, Contributing to industry such as industry is truly an invention of great significance.
[0030]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a graph showing the influence of temperature on the enzyme activity of the cordobiose phosphorylase of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the influence of pH on the enzyme activity of the cordobiose phosphorylase of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the influence of temperature on the stability of the cordobiose phosphorylase of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the influence of pH on the stability of the cordobiose phosphorylase of the present invention.

Claims

In optimum temperature 70 ° C. under conditions of reaction pH5.5,30 minutes, the temperature stability of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 at 70 ° C. until in stable Sequence Listing under conditions of pH5.5,1 hour hold A thermostable cordobiose phosphorylase having.

A DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing encoding the thermostable cordobiose phosphorylase according to claim 1 or a base sequence complementary to the base sequence.

The transformant obtained by introducing the DNA encoding the thermostable Koji cellobiose phosphorylase according to inn mainly to claim 2 by culturing nutrient medium, and collecting the thermostable Koji cellobiose phosphorylase produced from cultures A method for producing a thermostable cordobiose phosphorylase, which is characterized.