JP4222664B2

JP4222664B2 - Epi-illumination microscope

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Publication number: JP4222664B2
Application number: JP30223798A
Authority: JP
Inventors: 幸雄野々田; 寧青野; 勝行阿部
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1997-10-24
Filing date: 1998-10-23
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2018-10-23
Also published as: JPH11223773A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は落射蛍光顕微鏡に係り、特に、細胞生理学分野において細胞操作の手段として用いられるレーザートラップ法やＣａｇｅｄ試薬解除法を採用した落射蛍光顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
落射蛍光顕微鏡による落射蛍光観察は、生物学の分野において、細胞内部の特定の物質の形態観察を行う為の手段として、現在広く一般的に行われている方法である。
【０００３】
ところで、最近、特に細胞生理学の分野においては、顕微鏡の落射照明手段を利用した細胞内部物質の操作方法として、レーザートラップ法やＣａｇｅｄ試薬解除法が広く採用されている。
【０００４】
ここで、レーザートラップ法（光ピンセット法）は、標本中の任意の物質にレーザー光を照射して光学的に捕捉する方法であり、細胞内のタンパク質が運動する際の力量を測定する手段として用いられ、照射手段としては、赤外レーザーが使用される。一方、Ｃａｇｅｄ試薬解除法は、生理活性を持つ分子にＣａｇｅｄ試薬を結合して活性を抑制した状態で細胞内に投与し、光を照射することで結合を解除させてその分子の活性を回復させる方法であり、照射手段としては、紫外光が使用される。
【０００５】
このように、これらレーザートラップ法やＣａｇｅｄ試薬解除法を採用する落射蛍光顕微鏡では、通常の落射蛍光照明の他に、細胞操作のための各種の光源が必要になってくる。
【０００６】
しかして、従来、一般的に用いられている落射蛍光顕微鏡として、図１２に示すように対物レンズ１０１と接眼レンズ１０２を結ぶ観察光学系光路１０３中にバリアフィルターＢＡとともに配置される第１ダイクロイックミラーＤＭ１に対して蛍光観察用の励起光源１０４を配置するとともに、これら第１ダイクロイックミラーＤＭ１と励起光源１０４の間に第２ダイクロイックミラーＤＭ２を配し、この第２ダイクロイックミラーＤＭ２と励起光源１０４の間にバンドパスフィルタＢＰを配置し、第２ダイクロイックミラーＤＭ２から直交する光路上に標本操作用光源１０５を配置したものがある。
【０００７】
また、特開平８−２３４１１０号公報には、落射蛍光顕微鏡として、図１３に示すように、観察光学系光路１０７に蛍光観察用の励起光源１０８から励起光を導入する第１ダイクロイックミラーＤＭ１と、レーザー光源１０９からレーザートラップのレーザー光を導入する第２ダイクロイックミラーＤＭ２を２段に配置したものが開示されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、図１２に示した従来のものは、励起光源１０４を、励起波長を切換えて蛍光観察を行うことを考えると、バンドパスフィルタＢＰは勿論のこと、第１ダイクロイックミラーＤＭ１をも交換しなければならないが、このとき、第１ダイクロイックミラーＤＭ１とバンドパスフィルタＢＰは、別々に配置されているので、これらを各別に交換しなければならず、このための作業が煩雑で面倒になるという問題がある。
【０００９】
一方、特開平０８−２３４１１０号公報に開示されているものは、第１ダイクロイックミラーＤＭ１が、第２ダイクロイックミラーＤＭ２よりも標本側に配置される場合、例えば、レーザー光源１０９のレーザー波長域を紫外域に切換えてＣａｇｅｄ試薬解除用として使用すると、第２ダイクロイックミラーＤＭ２を反射したレーザー光を確実に標本側に導入するためには、第１ダイクロイックミラーＤＭ１およびバリアフィルタＢＡとして、レーザー光源１０９からのレーザー波長を透過する特性を有していなければならず、その度に第１ダイクロイックミラーＤＭ１およびバリアフィルタＢＡを最適なものに取り替えるなどの面倒な作業が必要となり、実現性がうすい。現実的に見てレーザー光源１０９は、レーザートラップ用の赤外領域以外の使用目的には対応できず、汎用性に乏しい。また、第２ダイクロイックミラーＤＭ２は観察光学系光路１０７の中に固定されているので、通常の蛍光観察においては問題はないが、１分子レベルの測光を行うような微弱蛍光観察においては光量ロスの要因となり好ましくない。
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、落射照明光学系の独立した光路を複数有し、各々の落射照明光路の用途が限定されない、汎用性に富んだ落射蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の一観点によれば、複数の落射照明光を選択的に標本に照射することにより、標本の光学的操作と蛍光観察を同時に可能にした落射蛍光顕微鏡において、前記標本に対する観察光学系光路に交点を介して交差する方向に配置された第１の落射照明光学系光路と、前記観察光学系光路の前記第１の落射照明光学系光路と同一の交点で前記観察光学系光路と交差する方向に配置された第２の落射照明光学系光路と、前記観察光学系光路に、前記第１および第２の落射照明光学系光路と異なる交点を介して交差する方向に配置された第３の落射照明光学系光路とにより構成している。
【００１２】
これにより、例えば第１の落射照明光学系光路にＣａｇｅｄ試薬解除用のレーザー光源、第２の落射照明光学系光路に励起光照射用の水銀ランプを、さらに第３の落射照明光学系光路にレーザートラップ用のレーザー光源または励起光照射用の水銀ランプをそれぞれ配して、これら第１乃至第３の落射照明光学系光路を選択し、Ｃａｇｅｄ試薬解除用のレーザー光源、励起光照射用の水銀ランプおよびレーザートラップ用のレーザー光源を組み合わせることにより、Ｃａｇｅｄ解除と蛍光観察によるＣａｇｅｄ試薬解除実験や蛍光観察とレーザートラップによる微小物体の捕捉および微小力計測などのレーザートラップ実験を選択的に行うことができる。
【００１３】
前記落射蛍光顕微鏡において、前記観察光学系光路と前記第３落射照明光学系光路との交点に、波長分別手段を挿脱可能に配置していることが望ましい。
【００１４】
これにより、レーザートラップを行わず通常の蛍光観察のみを行う場合、例えば、ダイクロックミラーなどの波長分別手段を観察光路から除外することにより、微弱蛍光観察時の光量ロスを除外した観察像を得ることができる。また、波長分別手段を観察光路に挿入することにより、例えば第３の落射照明光学系光路に配したレーザートラップ用のレーザー光源または励起光照射用の水銀ランプによるレーザートラップ用レーザーと蛍光観察用の励起光を選択的に観察光学系光路に導入できるので、この場合も、必要に応じてレーザートラップ実験やＣａｇｅｄ試薬解除実験を選択的に行うことができ、汎用性に富んだ実験系を構成することができる。
【００１５】
前記落射蛍光顕微鏡において、前記観察光学系光路に、さらに前記第１および第２の落射照明光学系光路および前記第３落射照明光学系光路と異なる交点を介して交差する方向に第４の落射照明光学系光路を配置してもよい。
【００１６】
これにより、例えば第１の落射照明光学系光路に励起光照射用のレーザー光源、第２の落射照明光学系光路に励起光照射用の水銀ランプを、さらに第３の落射照明光学系光路にレーザートラップ用のレーザー光源を配し、さらに、第４の落射照明光学系光路にＣａｇｅｄ試薬解除用のレーザー光源を配し、第１乃至第２の落射照明光学系光路を選択し、励起光源の水銀ランプおよびレーザー光源を選択的に使用し、レーザートラップ用のレーザーとＣａｇｅｄ試薬解除用のレーザーを使用することで、細胞内の任意のタンパク質に紫外レーザーを照射してＣａｇｅｄ試薬を解除し、活性化したタンパク質に赤外レーザーを照射してトラップし、微小計測を行うような操作が可能となり、細胞内物質の挙動を分子レベルで解析する細胞生理学の分野において非常に有効な実験系を構築することが可能となる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００１８】
（第１の実施の形態）
図１および図２は、本発明が適用される倒立型の落射蛍光顕微鏡の概略構成を示している。図において、１は観察すべき標本で、この標本１の下方に対物レンズ２を配置し、この対物レンズ２を通る観察光学系光路の光軸３１上に破線で示すキューブターレットＣＴを設けている。
【００１９】
このキューブターレットＣＴは、光軸３１に対して４５°の斜度を持つダイクロイックミラーＤＭ１を有するキューブＣＶ１と、光軸３１に対して４５°の斜度を持つダイクロイックミラーＤＭ１′、バリアフィルタＢＡ１′および励起フィルタＥＸ１′を有するキューブＣＶ１′を備えていて、光軸３１に対して垂直平面内を図示しない回転軸を中心に回転することにより、キューブＣＶ１またはキューブＣＶ１′を選択的に光軸３１の交わる点Ｏ１に位置合わせさせるようにしている。
【００２０】
なお、図１に示すキューブターレットＣＴは、２つのキューブしか表示されていないが、キューブＣＶ１，ＣＶ１′と同一構成、同一形状のキューブを少なくとも４つ挿脱することができ、ターレットの回転と図示しない位置決め機構により、任意のキューブのダイクロイックミラーの反射面を光軸３１の交わる点Ｏ１に合わせることができる。例えば、図２では、キューブターレット内部ＣＴにダイクロイックミラーＤＭ１″、バリアフィルタＢＡ１″を有するキューブＣＶ１″を挿入した例を示しており、後述するレーザー光源３および水銀光源６の波長を変えた場合に適用できるようにしている。また、キューブＣＶ１′は、光軸３１に挿入された時にダイクロイックミラーＤＭ１′の反射面が後述する水銀光源６の方に向くようにダイクロイックミラーＤＭ１′を保持している。
【００２１】
そして、キューブターレットＣＴの点Ｏ１から光軸３１に対して垂直方向の第１の落射照明光学系光路の光軸３２上にリレーレンズ５、コレクタレンズ４およびレーザー光源３を同一直線上に配置し、また、点Ｏ１から光軸３１に対して垂直で、さらに点Ｏ１からレーザー光源３への方向に対して垂直方向の第２の落射照明光学系光路の光軸３３上にリレーレンズ８、コレクタレンズ７および水銀光源６を同一直線上に配置している。
【００２２】
キューブターレットＣＴの下方には、破線で示すスライダーＳＶを後述する光軸３４に沿って移動可能に設けている。
【００２３】
このスライダーＳＶは、光軸３２に対して４５°の斜度を持つダイクロイックミラーＤＭ２、バリアフィルタＢＡ２および励起フィルタＥＸ２を有するキューブＣＶ２と、このダイクロイックミラーＤＭ２と平行に配置したダイクロイックミラーＤＭ２′を有するキューブＣＶ２′を、ダイクロイックミラーＤＭ２により光軸３２が反射される方向（光軸３４の方向）に並べて設けている。これらキューブＣＶ２とＣＶ２′は、スライダーＳＶに挿脱可能になっている。また、スライダーＳＶのキューブＣＶ２の真下には、結像レンズ１５を配置し、キューブＣＶ２′の真下には、結像レンズ１６を配置している。
【００２４】
そして、スライダーＳＶを光軸３４方向に沿って移動することで、キューブＣＶ２のダイクロイックミラーＤＭ２の反射面またはキューブＣＶ２′のダイクロイックミラーＤＭ２′の反射面を選択的に光軸３１と交わる点Ｏ２に位置合わせさせるようにしている。
【００２５】
なお、スライダーＳＶ上のダイクロイックミラーＤＭ２，ＤＭ２′の切り換え停止位置は、図示しない位置決め機構により設定される。
【００２６】
そして、スライダーＳＶの点Ｏ２から反射された第３の落射照明光学系光路の光軸３４上には、リレーレンズ１１、コレクタレンズ１０および水銀光源９を配置している。また、リレーレンズ１１とコレクタレンズ１０の間の光軸３４上には、光軸３４と交わる点Ｏ３に、スライダーＳＶ′を挿脱可能に配置し、このスライダーＳＶ′を介して光軸３４に対し垂直方向にコレクタレンズ１３およびレーザー光源１２を配置している。
【００２７】
この場合、スライダーＳＶ′には、全反射ミラー１４を設けており、スライダーＳＶ′の図中矢印方向への移動により、全反射ミラー１４の反射面を点Ｏ３に挿脱し、レーザー光源１２からの光束を光軸３１と交わる点Ｏ２方向へ導くことができるようにしている。なお、スライダーＳＶ′の挿脱位置は、図示しない位置決め機構により自動的に設定される。
【００２８】
一方、スライダーＳＶ下方の光軸３１上には、光路分割のためのハーフプリズム１７、光軸３１を接眼部へと導く全反射ミラー１８を配置している。
【００２９】
結像レンズ１５又は１６を透過した観察光は、ビームスプリッタ１７によって２分割される。ビームスプリッタ１７で反射した光は撮影光路に導かれ、写真撮影装置又はＴＶカメラの受光面Ｐｈ上で結像する。
【００３０】
また、ビームスプリッタ１７を透過した光は全反射ミラー１８で反射され、観察光路に導かれる。観察光路上の中間結像点Ａでいったん結像した後、リレーレンズＲ１でリレーされて点Ｂで再び結像し、この像が接眼レンズＯｃによって観察される。
【００３１】
次に、このように構成した実施の形態の動作を説明する。
【００３２】
いま、レーザー光源３にＣａｇｅｄ試薬解除用の波長３３７ｎｍのＮ₂ レーザーを使用し、水銀光源６に励起光照射用で蛍光観察用の波長４８８ｎｍの光を取り出すための水銀光を使用し、水銀光源９に励起光照射用で蛍光観察用の波長５３２ｎｍの光を取り出すための水銀光を使用し、レーザー光源１２にレーザートラップ用の波長１０６４ｎｍのＩＲレーザーを使用するものとする。
【００３３】
まず、図１に示すように、キューブターレットＣＴのキューブＣＶ１を光軸３１上に位置させるとともに、スライダーＳＶのキューブＣＶ２を観察光学系光路の光軸３１に挿入し、スライダーＳＶ′を光軸３４から取り外す。
【００３４】
この状態で、レーザー光源３の波長３３７ｎｍのＣａｇｅｄ試薬解除用のＮ₂レーザーが、コレクタレンズ４、リレーレンズ５を介してキューブＣＶ１のダイクロイックミラーＤＭ１に入射される。ここで、ダイクロイックミラーＤＭ１に波長が４００ｎｍ以下の光を反射し、４００ｎｍを超える光を透過する図３に示す分光透過率特性を有するものが用いられると、レーザー光源３のＮ₂ レーザーは、ダイクロイックミラーＤＭ１で反射し、対物レンズ２を通して標本１の観察視野内の所定位置に照射され、Ｃａｇｅｄ試薬解除が行われる。
【００３５】
一方、この状態では、スライダーＳＶのキューブＣＶ２のダイクロイックミラーＤＭ２が光軸３１と交わる点Ｏ２に位置され、スライダーＳＶ′が光軸３４から外れているので、水銀光源９の波長５３２ｎｍの水銀光が、コレクタレンズ１０、リレーレンズ１１を介して、ダイクロイックミラーＤＭ２′に入射される。ここで、ダイクロイックミラーＤＭ２′に波長が８００ｎｍ以下の光を透過し８００ｎｍを超える光を反射する図４に示す分光透過率特性を有するものが用いられると、水銀光源９からの光は、ダイクロイックミラーＤＭ２′を透過し、キューブＣＶ２の励起フィルタＥＸ２に入射され、さらに、この励起フィルタＥＸ２に励起光波長５１０ｎｍ以上５５０ｎｍ以下の光を透過する図５に示す分光透過率特性を有するものが用いられると、励起光のみが透過し、ダイクロイックミラーＤＭ２に入射される。さらに、ダイクロイックミラーＤＭ２に、波長が５７０ｎｍ以下の光を反射し、５７０ｎｍを超える光を透過する図５に示す分光透過率特性を有するものが用いられると、励起フィルタＥＸ２からの励起光は、ダイクロイックミラーＤＭ２で上方に反射し、ダイクロイックミラーＤＭ１を透過して対物レンズ２を介して標本１の観察視野に照射される。
【００３６】
そして、励起光の照射により、標本１から蛍光が発すると、この蛍光は、対物レンズ２を通り、ダイクロイックミラーＤＭ１、ＤＭ２を介してキューブＣＶ２のバリアフィルタＢＡ２に入射される。ここで、バリアフィルタＢＡ２に、波長５９０ｎｍ以下の光を反射し、５９０ｎｍを超える光を透過する図５に示す分光透過率特性を有するものが用いられると、蛍光は、透過して、ハーフプリズム１７、全反射ミラー１８を通して蛍光観察が行なわれる。
【００３７】
これにより、Ｃａｇｅｄ試薬解除及び蛍光観察を同時に行なうことができる。
【００３８】
ここで、Ｃａｇｅｄ試薬解除及び蛍光観察を同時に行なう際に使用されるダイクロイックミラーＤＭ１，ＤＭ２の特性に関してまとめると次のようになる。
【００３９】
すなわち、ダイクロイックミラーＤＭ１としては、レーザー光源３からのレーザー光（波長が４００ｎｍ以下）を反射する一方、水銀光源９からの励起光や標本１から発せられる光（波長が４００ｎｍ超）を透過するものが使用される（図３参照）。また、ダイクロイックミラーＤＭ２としては、水銀光源９からの励起光（波長が５７０ｎｍ以下）を反射する一方、標本１から発せられる光（波長が５７０ｎｍ超）を透過するものが使用される（図５参照）。
【００４０】
次に、図２に示すように、キューブターレットＣＴを図示矢印方向に回転して、キューブＣＶ１′を光軸３１上に位置させ、また、スライダーＳＶの切り換えにより、キューブＣＶ２′を光軸３１に挿入し、さらに、スライダーＳＶ′を切り換えて全反射ミラー１４を光軸３４に挿入する。
【００４１】
この状態で、水銀光源６の蛍光観察用の波長４８８ｎｍの水銀光が、コレクタレンズ７、リレーレンズ８を介してキューブＣＶ１′の励起フィルタＥＸ１′に入射される。ここで、励起フィルタＥＸ１′に波長が４７０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下の光を透過する図６に示す分光透過率特性を有するものが用いられると、励起光のみがダイクロイックミラーＤＭ１′に入射され、さらに、ダイクロイックミラーＤＭ１′として波長が５００ｎｍ以下の光を反射し５００ｎｍを超える光を透過する図６に示す分光透過率特性を有するものが用いられると、励起フィルタＥＸ１′の励起光は、ダイクロイックミラーＤＭ１′で上方に反射し、対物レンズ２を介して標本１の観察視野に照射される。
【００４２】
そして、励起光の照射により標本１から蛍光が発すると、この蛍光は、対物レンズ２を通りダイクロイックミラーＤＭ１′を透過して、キューブＣＶ１′のバリアフィルタＢＡ１′に入射される。ここで、バリアフィルタＢＡ１′に波長５１５ｎｍ以下の光を反射し、５１５ｎｍを超える光を透過する図６に示す分光透過率特性を有するものが用いられると、蛍光は、透過して、スライダーＳＶのダイクロイックミラーＤＭ２′に入射される。この時の蛍光の波長は８００ｎｍ以下なので、ダイクロイックミラーＤＭ２′を透過し、ハーフプリズム１７、全反射ミラー１８を通して蛍光観察が行なわれる。
【００４３】
一方、スライダーＳＶ′が光軸３４上に挿入されていることで、レーザー光源１２にレーザートラップ用の波長１０６４ｎｍのＩＲレーザーが、コレクタレンズ１３を通って全反射ミラー１４に入射し、ここで全反射され、キューブＣＶ２′のダイクロイックミラーＤＭ２′に入射される。すると、ダイクロイックミラーＤＭ２′の分光透過率特性により上方に反射し、キューブＣＶ１′のバリアフィルタＢＡ１′に入射されるが、このバリアフィルタＢＡ１′の分光透過率特性により透過し、さらに、ダイクロイックミラーＤＭ１′の分光透過率特性により透過し、対物レンズ２に入射される。
【００４４】
すると、対物レンズ２に入射されたレーザー光は、集光され、標本１上の所定位置にレーザースポットとして照射され、この照射されたレーザー集光点の近傍において、標本１中の微小物体を光学的に捕捉することができる。
【００４５】
これにより、蛍光観察及びレーザートラップによる微小物体の捕捉・微小力計測等を同時に行なうことができる。
【００４６】
ここで、蛍光観察及びレーザートラップによる微小物体の捕捉・微小力計測等を同時に行なう際に使用されるダイクロイックミラーＤＭ１′，ＤＭ２′の特性に関してまとめると次のようになる。
【００４７】
すなわち、ダイクロイックミラーＤＭ１′としては、水銀光源６からの励起光（波長が５００ｎｍ以下）を反射する一方、レーザー光源１２から送られてくるレーザー光や標本１から発せられる光（波長が５００ｎｍ超）を透過するものが使用される（図６参照）。また、ダイクロイックミラーＤＭ２′としては、レーザー光源１２からのレーザー光（波長が８００ｎｍ以下）を反射する一方、標本１から発せられる光（波長が８００ｎｍ超）を透過するものが使用される（図４参照）。
【００４８】
従って、このような構成とすれば、第１の落射照明光学系光路のＣａｇｅｄ試薬解除用のレーザー光源３からのレーザー光をキューブＣＶ１のダイクロイックミラーＤＭ１を介して標本１側に導入し、同時に、第３の落射照明光学系光路の励起光照射用の水銀ランプ９からの励起光をキューブＣＶ２′のダイクロイックミラーＤＭ２′およびキューブＣＶ２のダイクロイックミラーＤＭ２を介して標本１側に導入することにより、Ｃａｇｅｄ試薬解除及び蛍光観察によるＣａｇｅｄ試薬解除実験を行うことができ、一方、第２の落射照明光学系光路の励起光照射用の水銀ランプ６からの励起光をキューブＣＶ１′のダイクロイックミラーＤＭ１′を介して標本１側に導入し、同時に、第３の落射照明光学系光路のレーザートラップ用のレーザー光源１２からのレーザー光をキューブＣＶ２′のダイクロイックミラーＤＭ２′を介して標本１側に導入することにより蛍光観察及びレーザートラップによる微小物体の捕捉・微小力計測などのレーザートラップ実験を選択的に行うことができるようになり、標本操作をともない、これら２種類の実験が選択的に可能で、汎用性のある落射蛍光顕微鏡が提供できる。
【００４９】
なお、この第１の実施の形態では、倒立型顕微鏡について述べたが、一般の正立型顕微鏡にも適用することができる。また、今回用いた光源の種類、波長、数、配置については必ずしも同一でなくてもよい。また、各照明光学系光路と観察光学系光路（光軸３１）との交差角度は、９０°である必要はなく、また、互いに異なった角度であってもよい。さらに、今回用いたダイクロイックミラーの特性は必ずしも同一でなくてもよく、所望の光束の波長特性に適したものであれば、ダイクロイックプリズムや他の適当な波長分別手段を適用してもよい。また、ダイクロイックミラーの光軸への挿脱機構は、キューブターレットＣＴおよびスライダーＳＶと同一でなくてもよく、他のどのような挿脱機構であってもよい。そして結像レンズ１５，１６をスライダーＳＶに取り付けずに、どちらか一方を顕微鏡本体の光軸上の所定位置に固定するようにしてもよい。
【００５０】
（第２の実施の形態）
図７は、本発明の第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００５１】
この場合、図７は、図１の構成からレーザー光源１２、コレクタレンズ１３、全反射ミラー１４、スライダーＳＶ′、ダイクロイックミラーＤＭ２′、キューブＣＶ２′を除去したもので、その他は、図１と同様である。
【００５２】
このように構成した第２の実施の形態は、端的に言えば図１の構成からレーザー光源１２を取り外し、キューブＣＶ２′を外したものである。
【００５３】
このため、スライダーＳＶ′を切り換えて結像レンズ１６を光軸３１に挿入し、また、キューブターレットＣＴのターレットを回転し、キューブの入っていない部分を光軸３１の位置に合わせるか、もしくは、キューブＣＶ１を外すことによって観察光学系の平行光束光路中（対物レンズ２から結像レンズ１６の間）に余分な光学素子の入らない状態を作り出せば、簡易的な操作のみで通常の倒立型顕微鏡に切り換えることができる。
【００５４】
このようにすれば、単一の励起光のみを標本に照射する通常の蛍光観察では使用しないダイクロイックミラーやバリアフィルタを観察光路から取り除くことにより、使われないキューブが観察光路に入っているが故に、ある範囲の波長帯の蛍光は観察光路から反射され、除去されてしまうような予期せぬ不具合を未然に防ぐことができる。また、余分な光学素子を除去することで、微弱蛍光観察時の光量ロスを未然に防ぎ、その他蛍光観察と他の検鏡法とを組み合わせた観察像の劣化も防ぐことが出来る。
【００５５】
なお、図７に示す構成で、レーザートラップを使用したい場合には、図７のスライダーＳＶのキューブＣＶ２を、図８に示すようにキューブＣＶ２′に変更し、また、水銀光源９に代えてレーザー光源１２を用いればよい。
【００５６】
このような構成にすれば、レーザートラップ及び蛍光観察が同時に行えるとともに、上述したと同様な効果を期待することができる。また、このような実施の形態においては、使用したい光源に合わせてスライダーＳＶに取り付けるキューブを他のものに変えてもよい。
【００５７】
なお、この第２の実施の形態では、倒立型顕微鏡について述べたが、一般の正立型顕微鏡にも適用することができる。また、今回用いた光源の種類、波長、数、配置については必ずしも同一でなくてもよい。また、各照明光学系光路と観察光学系光路（光軸３１）との交差角度は、９０°である必要はなく、また、互いに異なった角度であってもよい。さらに、今回用いたダイクロイックミラーの特性は必ずしも同一でなくてもよく、所望の光束の波長特性に適したものであれば、ダイクロイックプリズムや他の適当な波長分別手段を適用してもよい。また、ダイクロイックミラーの光軸への挿脱機構は、キューブターレットＣＴおよびスライダーＳＶと同一でなくてもよく、他のどのような挿脱機構であってもよい。そして結像レンズ１５，１６をスライダーＳＶに取り付けずに、どちらか一方を顕微鏡本体の光軸上の所定位置に固定するようにしてもよい。
【００５８】
（第３の実施の形態）
図９は、本発明の第３の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。
【００５９】
この場合、図９は、図１に示すスライダーＳＶに代え、スライダーＳＶを延長して結像レンズ１９を新たに加えたスライダーＳＶ″を設けたもので、その他は、図１と同様である。
【００６０】
このように構成した第３の実施の形態は、スライダーＳＶ″を切り換えることにより、図示しない位置決め機構によりキューブＣＶ２，ＣＶ２′および結像レンズ１９を観察光学系の平行光束光路中に挿入することができる。
【００６１】
このようにすれば、第１の実施の形態で述べた効果を何ら損なうことなく、さらに第２の実施の形態で述べた効果を得ることができる。すなわち、簡単に述べると簡易的切り換えのみで、様々な光束の選択的使用が可能で、通常の倒立型顕微鏡としての使用も可能な倒立型顕微鏡を提供できる。
【００６２】
また、この第３の実施の形態では、倒立型顕微鏡について述べたが、一般の正立型顕微鏡にも適用することができる。また、今回用いた光源の種類、波長、数、配置については必ずしも同一でなくてもよい。また、各照明光学系光路と観察光学系光路（光軸３１）との交差角度は、９０°である必要はなく、また、互いに異なった角度であってもよい。さらに、今回用いたダイクロイックミラーの特性は必ずしも同一でなくてもよく、所望の光束の波長特性に適したものであれば、ダイクロイックプリズムや他の適当な波長分別手段を適用してもよい。また、ダイクロイックミラーの光軸への挿脱機構は、キューブターレットＣＴおよびスライダーＳＶ″と同一でなくてもよく、他のどのような挿脱機構であってもよい。そして結像レンズ１５，１６，１９はスライダーＳＶ″に取り付けられている必要はなく、例えば、結像レンズ１５，１６，１９のうち、いずれか一つを顕微鏡本体の光軸上に固定し、他の２つを除外しても良い。
【００６３】
（第４の実施の形態）
図１０は、本発明の第４の実施の形態の概略構成を示すもので、図２と同一部分には、同符号を付している。
【００６４】
この場合、図１０は、図２の構成の対物レンズ２と点Ｏ１との間の観察光学系光路の光軸３１上に点Ｏ４を設け、この点Ｏ４が光軸の反射点となるようにダイクロイックミラーＤＭ１を有するキューブＣＶ１を配置し、このダイクロイックミラーＤＭ１により反射された第４の落射照明光学系光路の光軸３５上にリレーレンズ２２、コレクタレンズ２１、レーザー光源２０を同一直線上に配置している。その他は、図２と同様である。
【００６５】
このように構成した第４の実施の形態では、レーザー光源２０として、Ｃａｇｅｄ試薬解除用の波長３３７ｎｍのＮ₂ レーザー光源を用いると、レーザー光源２０より発振されたレーザー光は、コレクタレンズ２１、リレーレンズ２２を通って、上述したダイクロイックミラーＤＭ１の特性により上方に反射され、標本１の観察視野内の所定位置を照射する。
【００６６】
つまり、このようにすることで、蛍光観察、レーザートラップ使用時にＣａｇｅｄ試薬解除を追加できるようにし、第１の実施の形態で説明した各光学素子の波長特性を利用して３つの光源を同時に使用することができる。
【００６７】
これにより、励起光を照射し、細胞内部の蛍光観察を行いながら、細胞内の任意のタンパク質にＮ₂ レーザーを照射して、Ｃａｇｅｄ試薬を解除し、活性化したタンパク質にＩＲレーザーを照射して光学的に捕捉し、微小力計測を行なうようなことが可能になり、細胞内物質の挙動を分子レベルで解析する細胞生理学の分野において非常に有効である。つまり、このように専門分野の探求においては、様々な光源を同時にいくつも使用したいことが多々あるが、図１０のような構成をとることにより、上述した学問的メリットの大きい装置を提供することができる。
【００６８】
なお、第４の実施の形態ではレーザートラップ用のダイクロイックミラーＤＭ２′は、その他の光軸上のダイクロイックミラーの中で一番下に配置されているが、どの位置に配置されていてもよい。また、光軸上のダイクロイックミラーは追加してもよい。キューブＣＶ１は、単独で存在するが、なんらかの機構を用いてキューブＣＶ１の位置に複数のキューブが挿脱できるようにしてもよい。
【００６９】
また、この第４の実施の形態では、倒立型顕微鏡について述べたが、一般の正立型顕微鏡にも適用することができる。また、今回用いた光源の種類、波長、数、配置については必ずしも同一でなくてもよい。また、各照明光学系光路と観察光学系光路（光軸３１）との交差角度は、９０°である必要はなく、また、互いに異なった角度であってもよい。さらに、今回用いたダイクロイックミラーの特性は必ずしも同一でなくてもよく、所望の光束の波長特性に適したものであれば、ダイクロイックプリズムや他の適当な波長分別手段を適用してもよい。また、ダイクロイックミラーの光軸への挿脱機構は、キューブターレットＣＴおよびスライダーＳＶと同一でなくてもよく、他のどのような挿脱機構であってもよい。そして結像レンズ１５，１６をスライダーＳＶに取り付けずに、どちらか一方を顕微鏡本体の光軸上の所定位置に固定するようにしてもよい。
【００７０】
（第５の実施の形態）
前述した各実施の形態が正立型顕微鏡にも適用可能である旨は既に述べた通りである。そこで、本発明をその正立型顕微鏡で構成した場合の一実施形態を図１１を参照して説明する。
【００７１】
図１１は、本発明を正立型顕微鏡で構成した実施の形態の概略構成を示している。図において、１は観察すべき標本であり、この標本の上方に、対物レンズをはじめとする落射照明および観察光学系が配置されている。
【００７２】
ここに示した結像レンズ１５より対物レンズ側にある落射照明光学系の構成要素に付した記号は、図１において示した構成要素の記号に対応して同一の構成要素であることを示している。すなわち、第１の実施の形態で示した図１の倒立型顕微鏡における落射照明光学系をおおよそ反転した態様で構成されている。
【００７３】
結像レンズ１５の上方には光路分割プリズムＰｒが配置され、この光路分割プリズムＰｒを透過した観察光は、写真装置やＴＶカメラ等の撮像面Ｐｈ上で結像される。一方、光路分割プリズムＰｒを反射した観察光は、接眼レンズＯｃの手前で結像され、接眼レンズＯｃを通した目視観察を行うようにしている。
【００７４】
このように構成した実施の形態の動作は、前述の第１の実施の形態で示した動作と全く同じであり、すなわち、正立型顕微鏡においても同様の効果を得ることができる。
【００７５】
以上、各実施の形態で述べたことをまとめると以下の通りとなる。
本発明の落射蛍光顕微鏡は、複数の落射照明光を選択的に標本に照射することにより、標本の光学的操作と蛍光観察を同時に可能にした落射蛍光顕微鏡において、前記標本に対する観察光学系光路に交点を介して交差する方向に配置された第１の落射照明光学系光路と、前記観察光学系光路の前記第１の落射照明光学系光路と同一の交点で前記観察光学系光路と交差する方向に配置された第２の落射照明光学系光路と、第１のダイクロイックミラーを有するキューブおよび第２のダイクロイックミラーを有するキューブを備え、前記観察光学系光路と前記第１および第２落射照明光学系光路との交点に所望のキューブを挿脱可能に配置する第１の可動体と、前記観察光学系光路に、前記第１および第２の落射照明光学系光路と異なる交点を介して交差する方向に配置された第３の落射照明光学系光路と、第３のダイクロイックミラーを有するキューブを備え、前記観察光学系光路と前記第３の落射照明光学系光路との交点にそのキューブを挿脱可能に配置する第２の可動体とにより構成している。
【００７６】
前記落射蛍光顕微鏡において、前記第１のダイクロイックミラーは、前記第１の落射照明光学系光路からの光を前記標本の方へ反射する一方、前記標本から発せられる蛍光を透過するものであることが望ましい。また、前記第２のダイクロイックミラーは、前記第２の落射照明光学系光路からの光を前記標本の方へ反射する一方、前記標本から発せられる蛍光を透過するものであることが望ましい。また、前記第３のダイクロイックミラーは、前記第３の落射照明光学系光路からの光を前記標本の方へ反射する一方、前記標本から発せられる蛍光を透過するものであることが望ましい。
【００７７】
前記落射蛍光顕微鏡において、前記第１の可動体は例えばキューブターレットである。また、前記第２の可動体は例えばスライダーである。
【００７８】
前記落射蛍光顕微鏡は、前記第１の落射照明光学系光路を形成するレーザー光源をさらに具備していてもよい。また、前記落射蛍光顕微鏡は、前記第２の落射照明光学系光路を形成する水銀光源をさらに具備していてもよい。また、前記落射蛍光顕微鏡は、前記第３の落射照明光学系光路を形成するレーザー光源および水銀光源のうちの少なくとも一方をさらに具備していてもよい。
【００７９】
前記落射蛍光顕微鏡は、前記第３の落射照明光学系光路に交点を介して交差する方向に配置された第４の落射照明光学系光路をさらに具備していてもよい。この場合、前記落射蛍光顕微鏡は、前記第３の落射照明光学系光路と前記第４の落射照明光学系光路との交点に全反射ミラーを挿脱可能に配置するスライダーをさらに具備していてもよい。
【００８０】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、落射照明光学系の独立した光路を複数有し、これら落射照明光学系光路を選択し、Ｃａｇｅｄ試薬解除用のレーザー光源、励起光照射用の水銀ランプおよびレーザートラップ用のレーザー光源などを組み合わせることにより、各々の落射照明光路の用途が限定されない、汎用性に富んだ落射蛍光顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図３】第１の実施の形態に用いられるダイクロイックミラーＤＭ１の分光透過率特性を示す図。
【図４】第１の実施の形態に用いられるダイクロイックミラーＤＭ２′の分光透過率特性図。
【図５】第１の実施の形態に用いられるダイクロイックミラーＤＭ２、励起フィルタＥＸ２、バリアフィルタＢＡ２の分光透過率特性図。
【図６】第１の実施の形態に用いられるダイクロイックミラーＤＭ１′、励起フィルタＥＸ１′、バリアフィルタＢＡ１′の分光透過率特性図。
【図７】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【図８】第２の実施の形態を一部変形した概略構成を示す図。
【図９】本発明の第３の実施の形態の概略構成を示す図。
【図１０】本発明の第４の実施の形態の概略構成を示す図。
【図１１】本発明の第５の実施の形態の概略構成を示す図。
【図１２】従来の落射蛍光顕微鏡の一例の概略構成を示す図。
【図１３】従来の落射蛍光顕微鏡の他の例の概略構成を示す図。
【符号の説明】
１…標本、
２…対物レンズ、
３…レーザー光源、
４…コレクタレンズ、
５…リレーレンズ、
６…水銀光源、
７…コレクタレンズ、
８…リレーレンズ、
９…水銀光源、
１０…コレクタレンズ、
１１…リレーレンズ、
１２…レーザー光源、
１３…コレクタレンズ、
１４…全反射ミラー、
１５，１６…結像レンズ、
１７…ハーフプリズム、
１８…全反射ミラー、
１９…結像レンズ、
２０…レーザー光源、
２１…コレクタレンズ、
２２…リレーレンズ、
３１，３２，３３，３４，３５…光軸、
ＢＡ１′，ＢＡ１″，ＢＡ２…バリアフィルタ、
ＣＴ…キューブターレット、
ＣＶ１，ＣＶ１′，ＣＶ１″，ＣＶ２，ＣＶ２′…キューブ、
ＤＭ１，ＤＭ１′，ＤＭ２，ＤＭ２′…ダイクロイックミラー、
ＥＸ１′，ＥＸ２…励起フィルタ、
Ｏｃ…接眼レンズ、
Ｐｈ…受光面、
Ｐｒ…光路分割プリズム、
Ｒ１…リレーレンズ、
ＳＶ，ＳＶ′，ＳＶ″…スライダー。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an epifluorescence microscope, and more particularly to an epifluorescence microscope that employs a laser trap method or a caged reagent release method used as a means for cell manipulation in the field of cell physiology.
[0002]
[Prior art]
Epifluorescence observation with an epifluorescence microscope is a method that is currently widely used as a means for observing the morphology of a specific substance inside a cell in the field of biology.
[0003]
Recently, especially in the field of cell physiology, a laser trap method and a Caged reagent release method have been widely adopted as a method for manipulating intracellular substances using epi-illumination means of a microscope.
[0004]
Here, the laser trap method (optical tweezers method) is a method of optically capturing an arbitrary substance in a specimen by irradiating a laser beam, and as a means of measuring the ability of a protein in a cell to move. An infrared laser is used as the irradiation means. On the other hand, in the Caged reagent release method, a Caged reagent is bound to a physiologically active molecule and administered into the cell in a state in which the activity is suppressed, and the binding is released by irradiating light to restore the activity of the molecule. In this method, ultraviolet light is used as the irradiation means.
[0005]
Thus, in the epifluorescence microscope employing these laser trap method and Caged reagent release method, various light sources for cell manipulation are required in addition to normal epifluorescence illumination.
[0006]
Thus, as a conventional epi-illumination microscope, as shown in FIG. 12, the first dichroic mirror disposed with the barrier filter BA in the observation optical system optical path 103 connecting the objective lens 101 and the eyepiece lens 102 as shown in FIG. An excitation light source 104 for fluorescence observation is arranged with respect to DM1, and a second dichroic mirror DM2 is arranged between the first dichroic mirror DM1 and the excitation light source 104, and between the second dichroic mirror DM2 and the excitation light source 104. The band-pass filter BP is disposed in the second dichroic mirror DM2, and the sample manipulation light source 105 is disposed on the optical path orthogonal to the second dichroic mirror DM2.
[0007]
JP-A-8-234110 discloses, as an epifluorescence microscope, a first dichroic mirror DM1 for introducing excitation light from an excitation light source 108 for fluorescence observation into an observation optical system optical path 107, as shown in FIG. A second dichroic mirror DM2 for introducing laser light from a laser trap from a laser light source 109 is disclosed in two stages.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the conventional apparatus shown in FIG. 12, considering the excitation light source 104 to perform fluorescence observation by switching the excitation wavelength, not only the bandpass filter BP but also the first dichroic mirror DM1 must be replaced. However, since the first dichroic mirror DM1 and the bandpass filter BP are separately arranged at this time, they must be exchanged separately, and the work for this is complicated and troublesome. There is.
[0009]
On the other hand, what is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 08-234110 is that when the first dichroic mirror DM1 is arranged closer to the sample than the second dichroic mirror DM2, for example, the laser wavelength range of the laser light source 109 is changed to the ultraviolet wavelength range. In order to reliably introduce the laser beam reflected by the second dichroic mirror DM2 to the specimen side, the first dichroic mirror DM1 and the barrier filter BA are used as the first dichroic mirror DM1 and the barrier filter BA. It must have a characteristic of transmitting the laser wavelength, and each time a troublesome operation such as replacing the first dichroic mirror DM1 and the barrier filter BA with an optimum one is required, and the feasibility is low. In reality, the laser light source 109 cannot be used for purposes other than the infrared region for laser trapping, and is not versatile. Further, since the second dichroic mirror DM2 is fixed in the optical path 107 of the observation optical system, there is no problem in normal fluorescence observation, but there is no light loss in weak fluorescence observation that performs single-molecule level photometry. It becomes a factor and is not preferable.
[0010]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a versatile epifluorescence microscope that has a plurality of independent optical paths of the epi-illumination optical system, and uses of each epi-illumination optical path are not limited. With the goal.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
According to an aspect of the present invention, an observation optical system optical path for the specimen in an epifluorescence microscope that enables optical manipulation and fluorescence observation of the specimen simultaneously by selectively irradiating the specimen with a plurality of epi-illumination lights. Crossing the observation optical system optical path at the same intersection point as the first epi-illumination optical system optical path of the observation optical system optical path and the first epi-illumination optical system optical path arranged in a direction intersecting with each other through the intersection A second epi-illumination optical system optical path arranged in a direction, and a third inter-axis arranged in a direction intersecting the observation optical system optical path via a different intersection with the first and second epi-illumination optical system optical paths It is comprised by the epi-illumination optical system optical path.
[0012]
Accordingly, for example, a laser light source for releasing the caged reagent in the first incident illumination optical system optical path, a mercury lamp for exciting light irradiation in the second incident illumination optical system optical path, and a laser in the third incident illumination optical system optical path. A laser light source for trapping or a mercury lamp for irradiating excitation light is arranged, and the first to third epi-illumination optical system optical paths are selected, and a laser light source for releasing the caged reagent and a mercury lamp for irradiating excitation light. In addition, by combining a laser light source for laser trapping, laser trap experiments such as Caged reagent release experiment by Caged release and fluorescence observation and capture of minute objects and measurement of micro force by fluorescence observation and laser trap can be selectively performed. .
[0013]
In the epi-illumination fluorescence microscope, it is desirable that wavelength separation means be detachably disposed at the intersection of the observation optical system optical path and the third epi-illumination optical system optical path.
[0014]
As a result, when only normal fluorescence observation is performed without performing laser trapping, for example, an observation image excluding light loss during weak fluorescence observation is obtained by excluding wavelength sorting means such as a dichroic mirror from the observation optical path. be able to. In addition, by inserting wavelength sorting means into the observation optical path, for example, a laser light source for laser traps arranged in the optical path of the third epi-illumination optical system or a laser for laser traps using a mercury lamp for irradiation of excitation light and a fluorescent light observation Since the excitation light can be selectively introduced into the optical path of the observation optical system, a laser trap experiment and a Caged reagent release experiment can be selectively performed as necessary in this case as well, thereby forming a versatile experimental system. be able to.
[0015]
In the epi-illumination fluorescent microscope, a fourth epi-illumination is provided in a direction intersecting the observation optical system optical path through an intersection different from the first and second epi-illumination optical system optical paths and the third epi-illumination optical system optical path. An optical path of the optical system may be arranged.
[0016]
Thus, for example, a laser light source for exciting light irradiation in the first epi-illumination optical system optical path, a mercury lamp for excitation light irradiation in the second epi-illumination optical system optical path, and a laser in the third epi-illumination optical system optical path. A laser light source for trapping is arranged, and further, a laser light source for releasing the Caged reagent is arranged in the fourth epi-illumination optical system optical path, the first to second epi-illumination optical system optical paths are selected, and the excitation light source mercury By selectively using a lamp and a laser light source and using a laser for laser trap and a laser for releasing the Caged reagent, the ultraviolet light is irradiated to any protein in the cell to release the Caged reagent and activate it. It is possible to perform operations such as trapping the irradiated protein by irradiating it with an infrared laser and analyzing the behavior of intracellular substances at the molecular level. It is possible to construct a highly effective experimental system in the field.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
[0018]
(First embodiment)
1 and 2 show a schematic configuration of an inverted epifluorescence microscope to which the present invention is applied. In the figure, reference numeral 1 denotes a specimen to be observed. An objective lens 2 is arranged below the specimen 1 and a cube turret CT indicated by a broken line is provided on an optical axis 31 of an observation optical system optical path passing through the objective lens 2. .
[0019]
The cube turret CT includes a cube CV1 having a dichroic mirror DM1 having an inclination of 45 ° with respect to the optical axis 31, a dichroic mirror DM1 ′ having an inclination of 45 ° with respect to the optical axis 31, and a barrier filter BA1 ′. And a cube CV 1 ′ having an excitation filter EX 1 ′, and the cube CV 1 or the cube CV 1 ′ is selectively selected by rotating in a plane perpendicular to the optical axis 31 around a rotation axis (not shown). The position is aligned with the point O1 where the two intersect.
[0020]
The cube turret CT shown in FIG. 1 shows only two cubes, but at least four cubes having the same configuration and the same shape as the cubes CV1 and CV1 ′ can be inserted / removed. The reflecting mechanism of the dichroic mirror of an arbitrary cube can be adjusted to the point O1 where the optical axes 31 intersect by the positioning mechanism that does not. For example, FIG. 2 shows an example in which a cube CV1 ″ having a dichroic mirror DM1 ″ and a barrier filter BA1 ″ is inserted in the cube turret internal CT, and when the wavelengths of a laser light source 3 and a mercury light source 6 described later are changed. The cube CV1 ′ holds the dichroic mirror DM1 ′ so that the reflection surface of the dichroic mirror DM1 ′ is directed toward the mercury light source 6 described later when inserted into the optical axis 31. .
[0021]
Then, the relay lens 5, the collector lens 4 and the laser light source 3 are arranged on the same straight line on the optical axis 32 of the first epi-illumination optical system optical path perpendicular to the optical axis 31 from the point O1 of the cube turret CT. In addition, the relay lens 8 and the collector are arranged on the optical axis 33 of the second incident illumination optical system optical path perpendicular to the optical axis 31 from the point O1 and perpendicular to the direction from the point O1 to the laser light source 3. The lens 7 and the mercury light source 6 are arranged on the same straight line.
[0022]
A slider SV indicated by a broken line is provided below the cube turret CT so as to be movable along an optical axis 34 described later.
[0023]
The slider SV has a dichroic mirror DM2 having a 45 ° inclination with respect to the optical axis 32, a cube CV2 having a barrier filter BA2 and an excitation filter EX2, and a dichroic mirror DM2 ′ arranged in parallel with the dichroic mirror DM2. The cubes CV2 'are arranged side by side in the direction in which the optical axis 32 is reflected by the dichroic mirror DM2 (the direction of the optical axis 34). These cubes CV2 and CV2 'can be inserted into and removed from the slider SV. Further, an imaging lens 15 is disposed directly below the cube CV2 of the slider SV, and an imaging lens 16 is disposed directly below the cube CV2 ′.
[0024]
Then, by moving the slider SV along the direction of the optical axis 34, the reflective surface of the dichroic mirror DM2 of the cube CV2 or the reflective surface of the dichroic mirror DM2 'of the cube CV2' is selectively crossed with the optical axis 31. I try to align them.
[0025]
The switching stop position of the dichroic mirrors DM2 and DM2 ′ on the slider SV is set by a positioning mechanism (not shown).
[0026]
The relay lens 11, the collector lens 10, and the mercury light source 9 are disposed on the optical axis 34 of the third epi-illumination optical system optical path reflected from the point O2 of the slider SV. On the optical axis 34 between the relay lens 11 and the collector lens 10, a slider SV ′ is detachably disposed at a point O 3 that intersects the optical axis 34, and the optical axis 34 is connected via the slider SV ′. On the other hand, the collector lens 13 and the laser light source 12 are arranged in the vertical direction.
[0027]
In this case, a total reflection mirror 14 is provided on the slider SV ′. By moving the slider SV ′ in the direction of the arrow in the drawing, the reflection surface of the total reflection mirror 14 is inserted into and removed from the point O3, and the laser SV 12 The light beam can be guided in the direction of the point O2 where the optical axis 31 intersects. The insertion / removal position of the slider SV ′ is automatically set by a positioning mechanism (not shown).
[0028]
On the other hand, on the optical axis 31 below the slider SV, a half prism 17 for dividing the optical path and a total reflection mirror 18 for guiding the optical axis 31 to the eyepiece are arranged.
[0029]
The observation light transmitted through the imaging lens 15 or 16 is divided into two by the beam splitter 17. The light reflected by the beam splitter 17 is guided to the photographing optical path and forms an image on the light receiving surface Ph of the photographic apparatus or TV camera.
[0030]
The light transmitted through the beam splitter 17 is reflected by the total reflection mirror 18 and guided to the observation optical path. An image is formed once at the intermediate image formation point A on the observation optical path, then relayed by the relay lens R1 and formed again at the point B, and this image is observed by the eyepiece Oc.
[0031]
Next, the operation of the embodiment configured as described above will be described.
[0032]
Now, the laser light source 3 has an N wavelength of 337 nm for releasing the Caged reagent. ₂ Using a laser, the mercury light source 6 is used for the excitation light irradiation and the mercury light for extracting the light with a wavelength of 488 nm is used for the fluorescence observation, and the mercury light source 9 is the light for the excitation light irradiation with a wavelength of 532 nm for the fluorescence observation. It is assumed that mercury light for extraction is used, and an IR laser with a wavelength of 1064 nm for laser trap is used for the laser light source 12.
[0033]
First, as shown in FIG. 1, the cube CV1 of the cube turret CT is positioned on the optical axis 31, the cube CV2 of the slider SV is inserted into the optical axis 31 of the observation optical system optical path, and the slider SV ′ is inserted into the optical axis 34. Remove from.
[0034]
In this state, N for releasing the Caged reagent having a wavelength of 337 nm of the laser light source 3. ₂ The laser is incident on the dichroic mirror DM1 of the cube CV1 through the collector lens 4 and the relay lens 5. Here, if a dichroic mirror DM1 having a spectral transmittance characteristic shown in FIG. 3 that reflects light having a wavelength of 400 nm or less and transmits light having a wavelength of more than 400 nm is used, N of the laser light source 3 is used. ₂ The laser beam is reflected by the dichroic mirror DM1 and irradiated to a predetermined position in the observation field of the specimen 1 through the objective lens 2 to release the Caged reagent.
[0035]
On the other hand, in this state, the dichroic mirror DM2 of the cube CV2 of the slider SV is positioned at the point O2 where the optical axis 31 intersects, and the slider SV ′ is off the optical axis 34. The light enters the dichroic mirror DM2 ′ via the collector lens 10 and the relay lens 11. Here, if the dichroic mirror DM2 ′ having a spectral transmittance characteristic shown in FIG. 4 that transmits light having a wavelength of 800 nm or less and reflects light exceeding 800 nm is used, the light from the mercury light source 9 is transmitted to the dichroic mirror DM2 ′. When the one having the spectral transmittance characteristic shown in FIG. 5 is used, which passes through DM2 ′, is incident on the excitation filter EX2 of the cube CV2, and further transmits light having an excitation light wavelength of 510 nm or more and 550 nm or less to the excitation filter EX2. Only the excitation light is transmitted and incident on the dichroic mirror DM2. Further, when the dichroic mirror DM2 having a spectral transmittance characteristic shown in FIG. 5 that reflects light having a wavelength of 570 nm or less and transmits light having a wavelength of more than 570 nm is used, the excitation light from the excitation filter EX2 is dichroic. The light is reflected upward by the mirror DM 2, passes through the dichroic mirror DM 1, and is irradiated onto the observation field of the specimen 1 through the objective lens 2.
[0036]
Then, when fluorescence is emitted from the specimen 1 by irradiation of excitation light, this fluorescence passes through the objective lens 2 and enters the barrier filter BA2 of the cube CV2 via the dichroic mirrors DM1 and DM2. Here, when the barrier filter BA2 having the spectral transmittance characteristic shown in FIG. 5 that reflects light having a wavelength of 590 nm or less and transmits light having a wavelength of 590 nm or less is used, the fluorescence is transmitted and the half prism 17 is transmitted. Fluorescence observation is performed through the total reflection mirror 18.
[0037]
Thereby, Caged reagent cancellation | release and fluorescence observation can be performed simultaneously.
[0038]
Here, the characteristics of the dichroic mirrors DM1 and DM2 used when simultaneously releasing the Caged reagent and observing the fluorescence are summarized as follows.
[0039]
That is, the dichroic mirror DM1 reflects the laser light (wavelength of 400 nm or less) from the laser light source 3 and transmits the excitation light from the mercury light source 9 and the light emitted from the specimen 1 (wavelength is over 400 nm). Is used (see FIG. 3). As the dichroic mirror DM2, a mirror that reflects the excitation light (wavelength of 570 nm or less) from the mercury light source 9 and transmits the light emitted from the sample 1 (wavelength of more than 570 nm) is used (see FIG. 5). ).
[0040]
Next, as shown in FIG. 2, the cube turret CT is rotated in the direction indicated by the arrow to place the cube CV1 'on the optical axis 31, and the cube CV2' is moved to the optical axis 31 by switching the slider SV. Further, the total reflection mirror 14 is inserted into the optical axis 34 by switching the slider SV ′.
[0041]
In this state, mercury light having a wavelength of 488 nm for fluorescence observation of the mercury light source 6 is incident on the excitation filter EX1 ′ of the cube CV1 ′ via the collector lens 7 and the relay lens 8. Here, if the excitation filter EX1 ′ having a spectral transmittance characteristic shown in FIG. 6 that transmits light having a wavelength of 470 nm or more and 490 nm or less is used, only the excitation light is incident on the dichroic mirror DM1 ′, and further, the dichroic When the mirror DM1 ′ having a spectral transmittance characteristic shown in FIG. 6 that reflects light having a wavelength of 500 nm or less and transmits light having a wavelength exceeding 500 nm is used, the excitation light of the excitation filter EX1 ′ is transmitted by the dichroic mirror DM1 ′. Reflected upward and irradiated onto the observation field of the specimen 1 through the objective lens 2.
[0042]
Then, when fluorescence is emitted from the specimen 1 by irradiation of excitation light, this fluorescence passes through the objective lens 2 and passes through the dichroic mirror DM1 ′, and is incident on the barrier filter BA1 ′ of the cube CV1 ′. Here, if the barrier filter BA1 ′ is used which has a spectral transmittance characteristic shown in FIG. 6 that reflects light having a wavelength of 515 nm or less and transmits light having a wavelength of more than 515 nm, the fluorescence is transmitted, and the slider SV The light enters the dichroic mirror DM2 ′. Since the fluorescence wavelength at this time is 800 nm or less, the fluorescence observation is performed through the half prism 17 and the total reflection mirror 18 through the dichroic mirror DM2 ′.
[0043]
On the other hand, since the slider SV ′ is inserted on the optical axis 34, an IR laser with a wavelength of 1064 nm for laser trapping enters the laser light source 12 through the collector lens 13 and enters the total reflection mirror 14. Reflected and incident on the dichroic mirror DM2 'of the cube CV2'. Then, the light is reflected upward by the spectral transmittance characteristic of the dichroic mirror DM2 ′ and is incident on the barrier filter BA1 ′ of the cube CV1 ′, but is transmitted by the spectral transmittance characteristic of the barrier filter BA1 ′, and further, the dichroic mirror DM1. The light is transmitted by the spectral transmittance characteristic of ′ and is incident on the objective lens 2.
[0044]
Then, the laser beam incident on the objective lens 2 is condensed and irradiated as a laser spot at a predetermined position on the specimen 1, and a minute object in the specimen 1 is optically optically adjacent to the irradiated laser condensing point. Can be captured.
[0045]
As a result, it is possible to simultaneously perform fluorescence observation, capture of a minute object by a laser trap, measurement of a minute force, and the like.
[0046]
Here, the characteristics of the dichroic mirrors DM1 'and DM2' used when simultaneously performing fluorescence observation and capturing of a minute object by a laser trap and measurement of a minute force are summarized as follows.
[0047]
That is, the dichroic mirror DM1 ′ reflects the excitation light (wavelength of 500 nm or less) from the mercury light source 6 while the laser light sent from the laser light source 12 or the light emitted from the specimen 1 (wavelength exceeds 500 nm). Is used (see FIG. 6). Further, as the dichroic mirror DM2 ′, one that reflects the laser light (wavelength of 800 nm or less) from the laser light source 12 and transmits the light emitted from the sample 1 (wavelength of more than 800 nm) is used (FIG. 4). reference).
[0048]
Accordingly, with such a configuration, the laser light from the laser light source 3 for releasing the Caged reagent in the first incident illumination optical system optical path is introduced to the sample 1 side through the dichroic mirror DM1 of the cube CV1, and at the same time, By introducing the excitation light from the mercury lamp 9 for irradiating excitation light in the third epi-illumination optical system optical path to the specimen 1 side through the dichroic mirror DM2 'of the cube CV2' and the dichroic mirror DM2 of the cube CV2, the Caged Caged reagent release experiment by reagent release and fluorescence observation can be performed, while excitation light from the mercury lamp 6 for excitation light irradiation of the second epi-illumination optical system optical path is passed through the dichroic mirror DM1 'of the cube CV1'. At the same time, the laser is used for the laser trap of the third epi-illumination optical system optical path. By introducing the laser beam from the light source 12 to the specimen 1 side through the dichroic mirror DM2 'of the cube CV2', laser trap experiments such as fluorescence observation and capture of minute objects by laser trap and measurement of minute force are selectively performed. These two types of experiments can be selectively performed with sample operation, and a versatile epifluorescence microscope can be provided.
[0049]
In the first embodiment, the inverted microscope has been described. However, the first embodiment can also be applied to a general upright microscope. Further, the type, wavelength, number, and arrangement of the light sources used this time are not necessarily the same. Further, the intersection angle between each illumination optical system optical path and the observation optical system optical path (optical axis 31) is not necessarily 90 °, and may be different from each other. Furthermore, the characteristics of the dichroic mirror used this time do not necessarily have to be the same, and a dichroic prism or other appropriate wavelength sorting means may be applied as long as it is suitable for the wavelength characteristics of a desired light beam. Further, the insertion / removal mechanism of the dichroic mirror with respect to the optical axis may not be the same as that of the cube turret CT and the slider SV, and may be any other insertion / removal mechanism. Then, either one of the imaging lenses 15 and 16 may be fixed to a predetermined position on the optical axis of the microscope main body without being attached to the slider SV.
[0050]
(Second Embodiment)
FIG. 7 shows a schematic configuration of the second embodiment of the present invention, and the same parts as those in FIG.
[0051]
In this case, FIG. 7 is obtained by removing the laser light source 12, the collector lens 13, the total reflection mirror 14, the slider SV ′, the dichroic mirror DM2 ′, and the cube CV2 ′ from the configuration of FIG. It is.
[0052]
In short, the second embodiment configured as described above is obtained by removing the laser light source 12 from the configuration shown in FIG. 1 and removing the cube CV2 ′.
[0053]
For this reason, the image forming lens 16 is inserted into the optical axis 31 by switching the slider SV ′, and the turret of the cube turret CT is rotated so that the portion without the cube is aligned with the position of the optical axis 31. If the cube CV1 is removed to create a state in which no extra optical element enters the parallel light beam path (between the objective lens 2 and the imaging lens 16) of the observation optical system, a normal inverted microscope can be obtained by simple operation. Can be switched to.
[0054]
In this way, by removing dichroic mirrors and barrier filters that are not used in normal fluorescence observation that irradiates the specimen with only a single excitation light from the observation optical path, unused cubes are in the observation optical path. Fluorescence in a certain range of wavelength bands can be prevented in advance from an unexpected failure that is reflected and removed from the observation optical path. Further, by removing an extra optical element, it is possible to prevent a loss of light amount during weak fluorescence observation, and to prevent deterioration of an observation image that combines other fluorescence observation and other spectroscopic methods.
[0055]
If it is desired to use a laser trap with the configuration shown in FIG. 7, the cube CV2 of the slider SV in FIG. 7 is changed to a cube CV2 ′ as shown in FIG. The light source 12 may be used.
[0056]
With such a configuration, laser trapping and fluorescence observation can be performed simultaneously, and the same effect as described above can be expected. In such an embodiment, the cube attached to the slider SV may be changed to another one according to the light source to be used.
[0057]
In the second embodiment, the inverted microscope has been described, but the present invention can also be applied to a general upright microscope. Further, the type, wavelength, number, and arrangement of the light sources used this time are not necessarily the same. Further, the intersection angle between each illumination optical system optical path and the observation optical system optical path (optical axis 31) is not necessarily 90 °, and may be different from each other. Furthermore, the characteristics of the dichroic mirror used this time do not necessarily have to be the same, and a dichroic prism or other appropriate wavelength sorting means may be applied as long as it is suitable for the wavelength characteristics of a desired light beam. Further, the insertion / removal mechanism of the dichroic mirror with respect to the optical axis may not be the same as that of the cube turret CT and the slider SV, and may be any other insertion / removal mechanism. Then, either one of the imaging lenses 15 and 16 may be fixed to a predetermined position on the optical axis of the microscope main body without being attached to the slider SV.
[0058]
(Third embodiment)
FIG. 9 shows a schematic configuration of the third embodiment of the present invention, and the same parts as those in FIG.
[0059]
In this case, FIG. 9 is similar to FIG. 1 except that a slider SV ″ is provided by adding the imaging lens 19 by extending the slider SV instead of the slider SV shown in FIG.
[0060]
In the third embodiment configured as described above, by switching the slider SV ″, the cubes CV2, CV2 ′ and the imaging lens 19 can be inserted into the parallel light beam path of the observation optical system by a positioning mechanism (not shown). it can.
[0061]
In this way, the effects described in the second embodiment can be obtained without impairing the effects described in the first embodiment. That is, in brief, it is possible to provide an inverted microscope that can selectively use various light beams only by simple switching and can be used as a normal inverted microscope.
[0062]
In the third embodiment, the inverted microscope has been described. However, the third embodiment can be applied to a general upright microscope. Further, the type, wavelength, number, and arrangement of the light sources used this time are not necessarily the same. Further, the intersection angle between each illumination optical system optical path and the observation optical system optical path (optical axis 31) is not necessarily 90 °, and may be different from each other. Furthermore, the characteristics of the dichroic mirror used this time do not necessarily have to be the same, and a dichroic prism or other appropriate wavelength sorting means may be applied as long as it is suitable for the wavelength characteristics of a desired light beam. Further, the insertion / removal mechanism of the dichroic mirror with respect to the optical axis may not be the same as that of the cube turret CT and the slider SV ″, and may be any other insertion / removal mechanism. , 19 need not be attached to the slider SV ″. For example, any one of the imaging lenses 15, 16, 19 is fixed on the optical axis of the microscope body, and the other two are excluded. May be.
[0063]
(Fourth embodiment)
FIG. 10 shows a schematic configuration of the fourth embodiment of the present invention, and the same parts as those in FIG.
[0064]
In this case, in FIG. 10, a point O4 is provided on the optical axis 31 of the observation optical system optical path between the objective lens 2 configured as shown in FIG. 2 and the point O1, and the point O4 is a reflection point of the optical axis. The cube CV1 having the dichroic mirror DM1 is arranged, and the relay lens 22, the collector lens 21, and the laser light source 20 are arranged on the same straight line on the optical axis 35 of the fourth incident illumination optical system reflected by the dichroic mirror DM1. is doing. Others are the same as in FIG.
[0065]
In the fourth embodiment configured as described above, the laser light source 20 is N with wavelength 337 nm for releasing the Caged reagent. ₂ When the laser light source is used, the laser light oscillated from the laser light source 20 passes through the collector lens 21 and the relay lens 22 and is reflected upward by the characteristics of the dichroic mirror DM1 described above, so that a predetermined position in the observation field of the specimen 1 is obtained. Irradiate.
[0066]
In other words, this makes it possible to add Caged reagent release when using fluorescence observation and a laser trap, and simultaneously using three light sources using the wavelength characteristics of each optical element described in the first embodiment. can do.
[0067]
As a result, while irradiating excitation light and observing fluorescence inside the cell, N ₂ It is possible to release the Caged reagent by irradiating a laser, irradiate the activated protein with an IR laser to optically capture it, and measure the microforce, and the behavior of intracellular substances can be measured at the molecular level. It is very effective in the field of cell physiology analyzed in In other words, in the quest for specialized fields, there are many cases where it is desired to use various light sources at the same time. By adopting the configuration as shown in FIG. 10, the above-described apparatus having great academic merit is provided. Can do.
[0068]
In the fourth embodiment, the laser trap dichroic mirror DM2 ′ is disposed at the bottom of the other dichroic mirrors on the optical axis, but may be disposed at any position. A dichroic mirror on the optical axis may be added. Although the cube CV1 exists alone, a plurality of cubes may be inserted into and removed from the position of the cube CV1 using some mechanism.
[0069]
In the fourth embodiment, the inverted microscope has been described, but the present invention can also be applied to a general upright microscope. Further, the type, wavelength, number, and arrangement of the light sources used this time are not necessarily the same. Further, the intersection angle between each illumination optical system optical path and the observation optical system optical path (optical axis 31) is not necessarily 90 °, and may be different from each other. Furthermore, the characteristics of the dichroic mirror used this time do not necessarily have to be the same, and a dichroic prism or other appropriate wavelength sorting means may be applied as long as it is suitable for the wavelength characteristics of a desired light beam. Further, the insertion / removal mechanism of the dichroic mirror with respect to the optical axis may not be the same as that of the cube turret CT and the slider SV, and may be any other insertion / removal mechanism. Then, either one of the imaging lenses 15 and 16 may be fixed to a predetermined position on the optical axis of the microscope main body without being attached to the slider SV.
[0070]
(Fifth embodiment)
As described above, each of the above-described embodiments can be applied to an upright microscope. Therefore, an embodiment in which the present invention is constituted by the upright microscope will be described with reference to FIG.
[0071]
FIG. 11 shows a schematic configuration of an embodiment in which the present invention is configured by an upright microscope. In the figure, reference numeral 1 denotes a specimen to be observed, and an epi-illumination and an observation optical system including an objective lens are arranged above the specimen.
[0072]
The symbols attached to the components of the epi-illumination optical system on the objective lens side from the imaging lens 15 shown here indicate that they are the same components corresponding to the symbols of the components shown in FIG. Yes. That is, the epi-illumination optical system in the inverted microscope of FIG. 1 shown in the first embodiment is configured in a substantially inverted manner.
[0073]
An optical path splitting prism Pr is disposed above the imaging lens 15, and the observation light transmitted through the optical path splitting prism Pr is imaged on an imaging surface Ph of a photographic apparatus, a TV camera, or the like. On the other hand, the observation light reflected by the optical path splitting prism Pr is imaged in front of the eyepiece lens Oc and is visually observed through the eyepiece lens Oc.
[0074]
The operation of the embodiment configured in this way is exactly the same as the operation shown in the first embodiment, that is, the same effect can be obtained even in an upright microscope.
[0075]
As described above, what has been described in each embodiment is summarized as follows.
The epi-fluorescence microscope of the present invention is an epi-illumination fluorescence microscope that enables optical operation and fluorescence observation of a specimen at the same time by selectively irradiating the specimen with a plurality of epi-illumination lights. The first incident illumination optical system optical path disposed in a direction intersecting with the intersection, and the direction intersecting the observation optical system optical path at the same intersection as the first incident illumination optical path of the observation optical system optical path A second epi-illumination optical system optical path, a cube having a first dichroic mirror, and a cube having a second dichroic mirror, the observation optical system optical path and the first and second epi-illumination optical systems A first movable body that allows a desired cube to be inserted / removed at an intersection with the optical path, and an observation optical system optical path through an intersection different from the first and second epi-illumination optical system optical paths. And a cube having a third epi-illumination optical system optical path disposed in a crossing direction and a third dichroic mirror, and the cube at the intersection of the observation optical system optical path and the third epi-illumination optical system optical path And a second movable body that is detachably disposed.
[0076]
In the epi-fluorescence microscope, the first dichroic mirror reflects light from the first epi-illumination optical system optical path toward the specimen and transmits fluorescence emitted from the specimen. desirable. The second dichroic mirror preferably reflects light emitted from the second epi-illumination optical system optical path toward the sample and transmits fluorescence emitted from the sample. The third dichroic mirror desirably reflects light from the third epi-illumination optical system optical path toward the sample while transmitting fluorescence emitted from the sample.
[0077]
In the epi-fluorescence microscope, the first movable body is, for example, a cube turret. The second movable body is a slider, for example.
[0078]
The epi-fluorescence microscope may further include a laser light source that forms the first epi-illumination optical system optical path. The epifluorescence microscope may further include a mercury light source that forms the second epi-illumination optical system optical path. The epi-fluorescence microscope may further include at least one of a laser light source and a mercury light source that form the third epi-illumination optical system optical path.
[0079]
The epi-illumination fluorescent microscope may further include a fourth epi-illumination optical system optical path arranged in a direction intersecting the third epi-illumination optical system optical path via an intersection. In this case, the incident-light fluorescent microscope may further include a slider that removably arranges a total reflection mirror at the intersection of the third incident-light illumination optical system optical path and the fourth incident-light illumination optical system optical path. Good.
[0080]
【The invention's effect】
As described above in detail, according to the present invention, there are a plurality of independent optical paths of the epi-illumination optical system, these epi-illumination optical system optical paths are selected, the laser light source for releasing the Caged reagent, and the mercury for excitation light irradiation. By combining a lamp, a laser light source for a laser trap, and the like, it is possible to provide a versatile epifluorescence microscope in which the use of each epi-illumination light path is not limited.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of a first embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing a schematic configuration of the first embodiment.
FIG. 3 is a diagram showing spectral transmittance characteristics of a dichroic mirror DM1 used in the first embodiment.
FIG. 4 is a spectral transmittance characteristic diagram of a dichroic mirror DM2 ′ used in the first embodiment.
FIG. 5 is a spectral transmittance characteristic diagram of the dichroic mirror DM2, the excitation filter EX2, and the barrier filter BA2 used in the first embodiment.
FIG. 6 is a spectral transmittance characteristic diagram of a dichroic mirror DM1 ′, an excitation filter EX1 ′, and a barrier filter BA1 ′ used in the first embodiment.
FIG. 7 is a diagram showing a schematic configuration of a second embodiment of the present invention.
FIG. 8 is a diagram showing a schematic configuration obtained by partially modifying the second embodiment.
FIG. 9 is a diagram showing a schematic configuration of a third embodiment of the present invention.
FIG. 10 is a diagram showing a schematic configuration of a fourth embodiment of the present invention.
FIG. 11 is a diagram showing a schematic configuration of a fifth embodiment of the present invention.
FIG. 12 is a diagram showing a schematic configuration of an example of a conventional epifluorescence microscope.
FIG. 13 is a diagram showing a schematic configuration of another example of a conventional epi-fluorescence microscope.
[Explanation of symbols]
1 ... Sample,
2 ... Objective lens,
3 ... Laser light source,
4 ... Collector lens,
5 ... Relay lens,
6 ... mercury light source,
7 ... Collector lens,
8 ... Relay lens,
9 ... Mercury light source,
10 ... collector lens,
11 ... Relay lens,
12 ... Laser light source,
13 ... Collector lens,
14 ... Total reflection mirror,
15, 16 ... imaging lens,
17 ... Half prism,
18 ... Total reflection mirror,
19 ... imaging lens,
20 ... Laser light source,
21 ... Collector lens,
22 ... Relay lens,
31, 32, 33, 34, 35 ... optical axis,
BA1 ', BA1 ", BA2 ... barrier filter,
CT ... Cube turret,
CV1, CV1 ', CV1 ", CV2, CV2' ... Cube,
DM1, DM1 ', DM2, DM2' ... Dichroic mirror,
EX1 ', EX2 ... excitation filter,
Oc ... eyepiece,
Ph: light receiving surface,
Pr: optical path splitting prism,
R1 ... Relay lens,
SV, SV ′, SV ″... Slider.

Claims

In the epi-fluorescence microscope that enables simultaneous optical operation of the specimen and fluorescence observation by selectively irradiating the specimen with multiple epi-illumination lights.
A first epi-illumination optical system optical path disposed in a direction intersecting the observation optical system optical path with respect to the specimen via an intersection;
A second epi-illumination optical system optical path disposed in a direction intersecting the observation optical system optical path at the same intersection as the first epi-illumination optical system optical path of the observation optical system optical path;
The observation optical system optical path includes a third epi-illumination optical system optical path disposed in a direction intersecting with the first and second epi-illumination optical system optical paths through an intersection point different from the first and second epi-illumination optical system optical paths. Fluorescence microscope.

2. The epi-illumination fluorescent microscope according to claim 1, wherein wavelength separation means is detachably disposed at an intersection between the observation optical system optical path and the third epi-illumination optical system optical path.

In the observation optical system optical path, a fourth epi-illumination optical system optical path is further disposed in a direction intersecting with the first and second epi-illumination optical system optical paths and the third epi-illumination optical system optical path through different intersections. The epi-illumination fluorescence microscope according to claim 1 or 2.