JP4217499B2

JP4217499B2 - Novel aldoxime dehydrase and method of using the same

Info

Publication number: JP4217499B2
Application number: JP2003041682A
Authority: JP
Inventors: 達彦小林; 義輝橋本; 啓貴東端
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 2003-02-19
Filing date: 2003-02-19
Publication date: 2009-02-04
Anticipated expiration: 2023-02-19
Also published as: JP2004248572A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シュードモナス属に属する微生物由来の新規アルドキシム脱水酵素タンパク質およびその遺伝子、ならびにこれらの利用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物のニトリル代謝経路にはニトリルから直接カルボン酸を生成するニトリラーゼ系と、ニトリルからアミドを経てカルボン酸を生成するニトリルヒドラターゼ系が存在する。このニトリル代謝経路ではたらく各酵素は、学術研究上重要であると同時に、工業的にも高い利用価値を有する。
【０００３】
ニトリルヒドラターゼは、温和な条件下でニトリルをアミド化合物に変換できるため、従来からアミド化合物の工業的生産に利用されてきた。例えば、ロドコッカス・ロドクロスＪ−１株（Rhodococcus rhodochrous J-1）由来のニトリルヒドラターゼを利用した、アクリルアミドやニコチンアミドの工業的生産（例えば、非特許文献１および２参照）；シュードモナス・クロロラフィスB23株（Pseudomonas chlororaphis B23）由来のニトリルヒドラターゼを利用した、5−シアノ吉草酸アミド（ヘルビシド（herbicide）の中間体）の工業的生産（例えば、前記非特許文献２および非特許文献３参照）等が公知である。
【０００４】
ニトリル代謝経路ではたらく一連の酵素：例えば、ニトリルをアミドに変換するニトリルヒドラターゼとアミドをカルボン酸に変換するアミダーゼやこれらのアクセサリータンパク等は、ゲノム上クラスターを形成する（例えば、非特許文献４参照）。このようにニトリルの分解経路については、タンパクや遺伝子レベルでその詳細が明らかになってきたが、ニトリルの合成経路については、未だ不明な点が多い。
【０００５】
アルドキシムは、ニトリル生合成の中間体候補物質の１つとして知られている（例えば、非特許文献５参照）。例えば、ある種の高等植物においては、トリプトファン由来のインドールアセトアルドキシムが脱水されてインドールアセトニトリルになることが報告されている（例えば、前記非特許文献５および非特許文献６−８参照）。また、アルドキシムを青酸グリコシドやグルコシノレートに変換する微生物も知られている（例えば、フェニルプロピオンアルドキシムをフェニルエチルグルコシノレートに変換するNasturtium officinale等：非特許文献９参照）。さらに、これらのアルドキシム以外にも、いくつかの天然のアルドキシム化合物が微生物中から見出されている（例えば、真菌Penicillium olsoniiにおける2-(4-hydroxyphenyl)-2-oxoacetaldehyde oxime等：非特許文献１０参照）。
【０００６】
しかしながら、アルドキシムに作用する酵素については、アルドキシムからニトリル合成を行う２つの酵素しか精製されてはいない。これらの遺伝子は異なるスーパーファミリーに属し、１つは、CYP71E1：ソルガムのdhurrin生合成に関与するチトクロームP450であり（例えば、非特許文献１１参照）、p-フェニルアセトアルドキシムからp-ヒドロキシフェニツアセトニトリルへの変換を触媒する。もう１つは、Bacillus sp. OxB-1株のニトリル代謝で機能するフェニルアセトアルドキシム脱水酵素（例えば、非特許文献１２参照）であり、フェニルアセトアルドキシムからフェニルアセトニトリルへの脱水を触媒する。バシラス属由来のフェニルアセトアルドキシム脱水酵素はヘムとの結合が弱く、酵素活性にはFMNを必要とすることがわかっているが、共因子の機能等、詳細な性質はまだわかっていない。このように、ニトリル合成経路で作用する酵素の生化学的、遺伝子情報はまだ限られたものである。
【０００７】
アルドキシムからニトリルへの化学的変換には厳しい条件を必要とすることが知られている（例えば、非特許文献１３参照）。したがって、生物学的に温和な条件でニトリルを合成することができれば、ニトリル化合物の工業的生産、ひいてはアミド化合物の工業的生産にとって、重要な意味を持つ。
【０００８】
【非特許文献１】
Kobayashi, M., and Shimizu, S. (1998) Nature Biotechnol. 1 6 , p733-736
【非特許文献２】
Yamada, H., and Kobayashi, M. (1996) Biosci. Biotechnol. Biochem. 6 0 , p1391-1400
【非特許文献３】
Yamada, H., Shimizu, S., and Kobayashi, M. (2001) Chemical Records 1 , p152-161
【非特許文献４】
Nishiyama, M., Horinouchi, S . , Kobayashi, M., Nagasawa, T., Yamada, H., and Beppu, T. (1991) J. Bacteriol. 173 , p2465-2472
【非特許文献５】
Sibbesen, O., Koch, B., Rouze, P., Moller, B. L., and Halkier, B. A. (1995) in Amino Acids and Their Derivatives in Higher Plants (Wallsgrove, R. M., ed.), pp. 227-241, Cambridge University Press, Cambridge
【非特許文献６】
Mahadevan, S. (1973) Ann. Rev. Plant Physiol. 24 , p69-88
【非特許文献７】
Hansen, C. H., Du, L., Naur, P., Olsen, C. E., Axelsen, K. B., Hick, A. J., Pickett, J. A., and Halkier, B. A. (2001) J. Biol. Chem. 276 , p24790-24796
【非特許文献８】
Bak, S . , Tax, F. E., Feldmann, K. A., Galbraith, D. W., and Feyereisen, R. (2001) Plant Cell 13 , p101-111
【非特許文献９】
Underhill, E. W. (1967) Eur. J. Biochem. 2 , p61-63
【非特許文献１０】
Amade, P., Mallea, M., and Bouaicha, N. (1994) J. Antibiotics 47 , p201-207
【非特許文献１１】
Bak, S., Kahn, R. A., Nielsen, H. L., Moller, B. L., and Halkier, B. A. (1998) Plant Mol. Biol. 36 , p393-405
【非特許文献１２】
Kato, Y., Nakamura, K., Sakiyama, H., Mayhew, S. G., and Asano, Y. (2000) Biochemistry 39 , p800-809
【非特許文献１３】
Xie, S. X., Kato, Y., and Asano, Y. (2001) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65 , p2666-2672
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、微生物のニトリル合成経路で作用するアルドキシム脱水酵素を単離し、これを利用することにより、アミド化合物の出発物質であるニトリル化合物の生物学的合成を可能にすることを目的とする。
【００１０】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究し、Pseudomonas chlororaphis B23株のニトリルヒドラターゼ遺伝子近傍の配列からアルドキシム脱水酵素をコードする新規遺伝子の単離に成功した。さらに、該遺伝子を用いて、アルドキシム脱水酵素の遺伝子工学的生産に成功した。このアルドキシム脱水酵素を利用すれば、アミド化合物の出発物質であるニトリル化合物をアルドキシムから温和な条件で製造することが可能になる。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（９）を提供するものである。
（１）以下の（a）および/または（b）のタンパク質のホモダイマーから構成されるアルドキシム脱水酵素タンパク質。
（a）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）以下の（a）または（b）のタンパク質をコードする遺伝子。
（a）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルドキシム脱水酵素のサブユニットとして機能しうるタンパク質
（３）以下の（c）または（d）のDNAからなる遺伝子。
（c）配列番号１で表される塩基配列からなるDNA
（d）配列番号１で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルドキシム脱水酵素のサブユニットとして機能しうるタンパク質をコードするシュードモナス属に属する微生物由来のDNA
（４）上記（２）または（３）記載の遺伝子を含有する、組換えベクター。
（５）上記（４）記載のベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体。
（６）上記（５）記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からあるアルドキシム脱水酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、アルドキシム脱水酵素の製造方法。
（７）上記（１）記載の酵素タンパク質、または請求項５記載の形質転換体をアルドキシム化合物に作用させてニトリル化合物を得ることを特徴とする、ニトリル化合物の製造方法。
（８）酵素タンパク質または形質転換体をｐＨ５〜１０、温度２０〜５０℃、および嫌気的還元条件下でアルドキシム化合物に作用させることを特徴とする、上記（７）記載の方法。
（９）アルドキシム化合物が脂肪族アルドキシム化合物である、上記（７）または（８）記載の方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．アルドキシム脱水酵素
本発明にかかるタンパク質は、Pseudomonas chlororaphis B23株から単離されたアルドキシム脱水酵素（Aldoxim dehydratase）活性を有する新規タンパク質である。該タンパク質は、アルドキシム化合物を脱水して、対応するニトリル化合物に変換する「アルドキシム脱水酵素活性」を有する。
【００１３】
本発明のアルドキシム脱水酵素タンパクは、以下のような性質を有する。
構造について：
▲１▼分子量は約76.2kDa、352アミノ酸残基からなる2つの同一サブユニットから構成されるホモダイマーである。
▲２▼酵素中にヘムを含むヘムタンパクである。
▲３▼還元条件下でのラマンスペクトルから予測される構造は、還元状態のデオキシミオグロビンや還元状態のホースラディッシュパーオキシダーゼに類似している。
▲３▼酵素中には、鉄以外の金属として、カルシウムが含まれる。
酵素活性について：
▲１▼酵素はヘムがフェロフェム（２価鉄）状態にあるとき触媒作用を示す。すなわち、酵素は還元状態で活性である。
▲２▼酵素活性にはFMNを必要としない（この点で、公知のBacillus属由来のフェニルアセトアルドキシム脱水酵素と異なる）。
▲３▼酵素活性は、ヒドロキシルアミン、硝酸銀により強い阻害を受ける。
基質特異性について：
基質としては、脂肪族アルドキシム、特にＣ１〜Ｃ６の脂肪族アルドキシムが好ましく、ブチルアルドキシムが最も好適である。芳香族アルドキシムに対してはほとんど酵素活性を示さない。
【００１４】
本発明のアルドキシム脱水酵素タンパク質を構成するサブユニットは配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。しかしながらこの配列に限定されず、配列番号２に示すアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された他のアミノ酸配列からなるタンパク質も、それがアルドキシム脱水酵素のホモダイマーを構成するサブユニットの１つとして機能する限り、本発明のアルドキシム脱水酵素タンパク質のサブユニットに含まれる。なお、前記欠失、置換、付加等の変異の数は、全アミノ酸数に対して好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。
【００１５】
本発明のアルドキシム脱水酵素タンパク質は、２つの同一サブユニットから構成されるホモダイマーである。しかしながら、ホモダイマーは厳密に完全同一のアミノ酸配列を有するサブユニットからなる二量体に限定されず、１または数個程度の微細なアミノ酸の違いを有する実質的に等価なサブユニット間のダイマーであってもよい。
【００１６】
２．アルドキシム脱水酵素遺伝子
本発明のアルドキシム脱水酵素遺伝子は、前記アルドキシム脱水酵素タンパク質をコードする遺伝子である。より詳細には、アルドキシム脱水酵素タンパク質ホモダイマーの各サブユニットをコードする遺伝子である。
【００１７】
該遺伝子は、Pseudomonas chlororaphis B23株のゲノム中において、アミダーゼ遺伝子の上流域に存在し、該微生物のニトリル代謝経路で働く一連の遺伝子（ニトリルヒドラターゼ遺伝子、アミダーゼ遺伝子、約47kDaのニトリルヒドラターゼアクセリータンパク（P47K）等）と、クラスターを形成する。
【００１８】
本発明の遺伝子は、配列番号１に示される1662ヌクレオチドからなる塩基配列を有し、352アミノ酸残基のタンパクをコードする。
【００１９】
しかしながら、本発明にかかるアルドキシム脱水酵素タンパク質をコードする遺伝子は、上記配列に限定されず、この遺伝子（配列番号1）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる他の遺伝子も、該遺伝子がアルドキシム脱水酵素のサブユニットとして機能しうるタンパク質をコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。なお、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が300-2000mMで温度が40-75℃、好ましくはナトリウム濃度が600-900mMで温度が65℃の条件をいう。
【００２０】
３．組換えベクター
本発明の組換えベクターは、プラスミド等の公知のベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）して得ることができる。前記ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。
【００２１】
前記プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば pBR322, pBR325, pUC18, pUC119, pTrcHis, pBlueBacHis 等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば pUB110, pTP5 等）、酵母由来のプラスミド（例えば YEp13, YEp24, YCp50, pYE52 等）などが、ファージ DNAとしてはλファージ等が挙げられる。
【００２２】
前記ベクターへの本発明の遺伝子の挿入は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、ベクターDNAの適当な制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用される。
【００２３】
宿主内で外来遺伝子を発現させるためには、構造遺伝子の前に、適当なプロモーターを配置させる必要がある。前記プロモーターは特に限定されず、宿主内で機能することが知られている任意のものを用いることができる。なおプロモーターについては、後述する形質転換体において、宿主ごとに詳述する。また、必要であればエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配列）、ターミネーター配列等を配置させてもよい。
【００２４】
前記ベクターは、ニトリル代謝系で機能する他の酵素の遺伝子を含んでいてもよい。そのような遺伝子としては、例えば、各種生物由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子若しくはアミダーゼ遺伝子（例えば、Pseudomonas Chlororaphis B23のニトリルヒドラターゼ遺伝子、アミダーゼ遺伝子（D90216）、Rhodococcus rhodochrous J1のＨ型ニトリルヒドラターゼ遺伝子（X64359）、Rhodococcus rhodochrous J1のL型ニトリルヒドラターゼ遺伝子（X64360）、Rhodococcus sp. N774のニトリルヒドラターゼ遺伝子、アミダーゼ遺伝子（X54074）等）、またはニトリラーゼ遺伝子（例えば、Rhodococcus rhodochrous J1のニトリラーゼ遺伝子（D67026）、Rhodococcus rhodochrous K22のニトリラーゼ遺伝子（D12583）、Arabidopsis thaliana（シロイヌナズナ）のニトリラーゼ遺伝子（BT000040）、Alcaligenes faecalisのニトリラーゼ遺伝子（D13419）等）等を挙げることができる。なお、カッコ内の番号は各遺伝子のGenBank Accession Numberを示す。
【００２５】
４．形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを目的遺伝子が発現しうるように宿主中に導入することによって得ることができる。ここで宿主としては、本発明のDNAを発現できるのもであれば特に限定されず、例えば、エッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ（Saccharomyces cervisiae）、チゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces. pombe）等の酵母、その他COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf19、Sf21等の昆虫細胞を挙げることができる。
【００２６】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが各細菌中で自律複製可能であるとともにプロモーター、リボゾーム結合配列、本発明遺伝子、転写終結配列により構成されていることが望ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていても良い。大腸菌としてはエッシェリヒア・コリ（E. coli）K12、DH1、DH10B（Invitrogen社）、BL21-CodonPlus(DE3)-RIL（ストラタジーン社）、TOP10F等が挙げられ、枯草菌としてはバチルス・ズブチリス（B. subtilis）MI114、207-21 等が挙げられる。
【００２７】
大腸菌等の宿主で発現できるものであれば特に限定されず、例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の大腸菌由来のプロモータや、T7プロモーター等のファージ由来のプロモーターを用いることができる。
【００２８】
細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入できる方法であれば特に限定されないが、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, SN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 : 2110 (1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２９】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セルビシエ（S. cervisiae）、チゾサッカロミセス・ポンベ（Shizosaccharomyces. pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等が用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母で発現しうるもの、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、AOXプロモーター等を挙げることができる。
【００３０】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法（Becker, D.M. et al. : Methods. Enzymol., 194 : 180 (1990)）、スフェロプラスト法（Hinnen, A. et al. : Proc Natl. Acad. Sci. USA, 75 : 1929 (1978)）、酢酸リチウム法（Itoh, H. : J. Bacteriol., 153 : 163 (1983)）等を挙げることができる。
【００３１】
本発明の形質転換体は、本発明のアルドキシム脱水酵素遺伝子とともに、ニトリル代謝系で機能する他の酵素の遺伝子を同時に導入されてもよい。そのような遺伝子としては、前述したような、各種生物由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子、アミダーゼ遺伝子、またはニトリラーゼ遺伝子等を挙げることができる。
【００３２】
これらの遺伝子は１つのベクターにより本発明のアルドキシム脱水酵素遺伝子と同時に導入されても、あるいは異なるベクターにより別個に導入されてもよいが、協調して機能するために同じプロモーターの支配下に配置されることが必要である。これらの遺伝子は形質転換体内で協調して発現することにより、アルドキシム脱水酵素によって生成したニトリル化合物を、さらにアミド化合物やカルボン酸化合物に変換することができる。
【００３３】
５．本発明のアルドキシム脱水酵素の製造
本発明の酵素は、本発明の形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から該酵素活性を有するタンパク質を採取することによって得ることができる。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主に応じて、決定すればよい。例えば、大腸菌や酵母等の微生物を宿主とする形質転換体の場合は、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を効率的に培養しうる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。
【００３４】
培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加しても良い。プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加しても良い。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（IPTG）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インドールアクリル酸（IAA）等を培地に添加しても良い。なお、大腸菌を宿主する形質転換体の培養においては、15℃で7日間培養することにより最大量の酵素タンパク質が得られることが確認されている。
【００３５】
培養後、本発明の酵素タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合は、菌体内または細胞を破砕する。一方、本発明のタンパク質が菌体外または細胞外に分泌される場合は、培養液をそのまま用いるか、遠心分離等によって回収する。
【００３６】
タンパク質の単離・精製には、例えば硫安沈澱、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独であるいは適宜組み合わせて用いればよい。
【００３７】
また本発明のアルドキシム脱水酵素活性は、基質となりうる適当なアルドキシム化合物を含む反応液に該酵素を添加し、生成するニトリルを検出することにより確認することができる。ニトリル化合物の確認は、例えば、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を用いることができる。あるいは、本発明のアルドキシム脱水酵素に特異的に結合する抗体を作製し、該抗体を用いたウェスタンブロッティングによって発現を確認することもできる。
【００３８】
６．ニトリル化合物、およびアミド化合物の生物学的生産
本発明のアルドキシム脱水酵素タンパク質を利用すれば、温和な条件下でアルドキシム化合物を対応するニトリル化合物に変換することができる。すなわち、本発明は、本発明のアルドキシム脱水酵素タンパク質または、本発明のアルドキシム脱水酵素遺伝子を含む形質転換体を利用した、ニトリル化合物の製造方法を提供する。
【００３９】
例えば、前述の形質転換体（例えば、本発明のアルドキシム脱水酵素遺伝子を含む大腸菌）によって大量生産された組換えアルドキシム脱水酵素タンパク質を該酵素が機能しうる条件下で基質であるアルドキシム化合物に作用させる。あるいは、前記形質転換体を含む培地に基質であるアルドキシム化合物を添加し、本発明の酵素が機能しうる条件下で培養する。これにより、アルドキシム化合物は対応するニトリル化合物に変換される。
【００４０】
なお、「酵素が機能しうる条件下」とは、本発明のアルドキシム脱水酵素がその酵素活性を適切に発揮しうる条件を意味する。具体的にいえば、本発明の酵素は還元条件下（嫌気的条件）で酵素活性を示すため、前記条件は少なくともそのような還元的条件であることが必要である。還元条件は、例えば、Na₂S₂O₄等の還元剤を、酵素反応液中あるいは培地中に添加することによって達成される。この他、例えば温度は０〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃、さらに好ましくは１５℃付近、またｐＨは３〜１２、好ましくは５〜１０、さらに好ましくは、ｐＨ６〜９程度である。
【００４１】
基質としては、脂肪族アルドキシム、特にＣ１〜Ｃ６程度の脂肪族アルドキシムが好ましく、ブチルアルドキシムが最も好ましい。
【００４２】
こうして製造されるニトリルは、ニトリルヒドラターゼによるアミド化合物製造の出発物質となる。したがって、本発明の方法はニトリル化合物のみならず、アミド化合物の工業的生産にも利用できる。
【００４３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００４４】
〔実施例１〕アルドキシム脱水酵素コーディング領域の探索
Pseudomonas chlororaphis B23由来のニトリルヒドラターゼ系に関連する遺伝子のコーディング領域はクラスター化しており、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を中心として、その上流域にアミダーゼ遺伝子が、また下流域に約47kDaのニトリルヒドラターゼアクセリータンパク（P47K）、機能未知のOrfEが存在する（図９）。一方、大腸菌においてニトリルヒドラターゼを最大限に発現させるためには推定38kDaのタンパクが必要であることがわかっている（Nishiyama M. et al, (1991) J. Bacteriol. 173, p2465-2472）。そこで、アミダーゼ遺伝子の上流域より、前述のニトリルヒドラターゼ系遺伝子とクラスター化する分子量約38kDaのタンパクをコードするORFを探索した。
【００４５】
その結果、図1に示す、1056ヌクレオチド、352アミノ酸残基からなり、推定約40127Daの分子量を有するORF（配列番号１）が見つかった。以下、このORFをoxdAと呼ぶ。このoxdAの開始コドンから8ヌクレオチド上流にはリボゾーム結合サイト（GAGGA）が存在することが確認された。またBLASTを用いた検索により、oxdAはBacillus sp. OxB-1株由来のフェニルアセトアルドキシム脱水酵素遺伝子：OxB-1（Kato Y., etr al, (2000) Biochemistry 39, p800-809）と約32％の相同性を有することが確認された（図２）。
【００４６】
〔実施例２〕oxdA（アルドキシム脱水酵素遺伝子）の大腸菌における発現
Maniatis T. らの方法（Maniatis T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, N.Y.）に従い、oxdAの大腸菌における発現を試みた。
【００４７】
（１）pPCN4の調製
ニトリルヒドラターゼ遺伝子近傍の配列を含むプラスミドpPCN4を、これを含む大腸菌JM105/pPCN4株（寄託番号FERM BP-2779；特開平３−２５１１８４号）より、常法に従って調製した。
【００４８】
（２）oxdAの増幅
実施例１で選択されたoxdAの塩基配列を基に、以下のプライマーを合成し、pPCN4を鋳型としてPCRを行った。
Forward Primer：5'-CATATGGAATCTGCGATCGACACGC-3'（配列番号３）
Reverse Primer：5'-ACGCGTCGACTCAGGTGGGCGCGACAACGGC-3'（配列番号４）
PCR条件：94℃ 30sec、55℃ 30sec、68℃ 30sec を30サイクル
Forward PrimerはNdeI認識配列（下線部）を含み、oxdAの開始コドンから22塩基に対応する。Reverse Primerは、SalI認識配列（下線部）を含み、oxdA の3'末端の配列に相補的な21塩基に対応する。
【００４９】
（３）発現ベクターの構築
得られた増幅断片はpUC18ベクターにサブクローニングし、DNA配列をABI Prism 310 genetic analyzer（Applied Biosystems製）を用いて確認した。次いで、このベクターをNdeIとSalIで切断し、pET-24a(+)（Novagen製）のNdeI‐SalI領域に挿入し、得られたプラスミドをpET-oxdAと命名した。pET-oxdA中において、oxdAはT7プロモーターの支配下にある。
【００５０】
（４）形質転換体による発現実験
次いで、pET-oxdAを大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL（ストラタジーン社）に導入し、得られた形質転換体を用いて発現実験を行った。形質転換体は50μg/mlカナマイシンと34μg/mlクロラムフェニコールを含む2×YT 培地240ml中37℃で振とう培養した。オーバーナイトで培養後、全培養物を同じ培地48Lに接種し、37℃で2時間振とう培養した。ここにIPTGを最終濃度0.1mMとなるように添加して、T7プロモーターを誘導し、さらに15℃で7日間培養した。
【００５１】
37℃の培養条件下では、oxdA遺伝子産物は完全な封入体として発現した。可溶性酵素の収量を増やすために培養条件を検討した結果、15℃で7日間培養することにより、可溶性タンパク中、約10％の遺伝子産物を発現させることに成功した。
【００５２】
〔実施例３〕 oxdA（アルドキシム脱水酵素遺伝子）産物の精製
実施例２で得られたoxdA遺伝子産物の精製は、0-4℃で、5mM 2MEを含むリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）を用いて行った。まず、遠心（15,000×g、30分）により菌体を集め、1mMのジチオスレイトールを含む100mM緩衝液で2回洗浄し、ソニケーション（Insonator Model 201M：KUBOTA製）により菌体を破壊し、菌体を含まない抽出物を集めた。さらに遠心して残った菌体を取り除き、上清を硫酸アンモニウム（40〜60％）で分画し、10mM緩衝液に透析した。透析後の液は10mM緩衝液で等張化したDEAE-Sephacelカラム（5×25cm：Amersham Pharmacia製）に供し、KCl 0.1-0.4Mの直線グラジエントをかけた10mM緩衝液1.2Lでタンパクを溶出させた。
【００５３】
活性が認められたフラクションを集め、硫酸アンモニウムを70％飽和まで加え、遠心した。得られた沈殿は0.1M緩衝液に溶かし、硫酸アンモニウム（20％飽和）溶液に移した。酵素溶液は硫酸アンモニウム（20％飽和）を含む10mM緩衝液で等張化したTSK gel Butyl-Toyopeal 650Mカラム（5×22cm：東ソー製）にかけ、硫酸アンモニウムの濃度を20％〜5％に下げた同様のバッファー1.2Lで溶出させた。活性画分を集め、70％飽和硫酸アンモニウムで沈殿させた。生じた沈澱を遠心して集め、0.1M緩衝液に溶かし、0.5％硫酸アンモニウムを含む10mM緩衝液に透析した。これを同様の緩衝液で等張化したPhenyl-Sepharose CL-4Bカラム（5×22cm：Amersham Pharmacia製）にかけ、0.5％硫酸アンモニウムを含む10mM緩衝液で完全にウォッシュした後、10mM緩衝液で溶出させた。活性画分を集め、固形の硫酸アンモニウムを70％飽和まで加えて遠心した。得られた沈殿は0.1M緩衝液に溶かし、1mM緩衝液（pH6.8）2Lで3回透析した。
【００５４】
透析後の酵素溶液は、遠心後、1mM緩衝液で等張化したCellulofine HApカラム（5×22cm：生化学工業製）にかけた。カラムは1-100mMの直線グラジエントをかけた緩衝液（pH6.8）で溶出し、さらに硫酸アンモニウム（50-60％飽和）で再分画した。沈殿を遠心して集め、0.1M緩衝液に溶かして10mM緩衝液に再度透析し、遠心した。
【００５５】
〔実施例４〕 oxdA（アルドキシム脱水酵素遺伝子）産物の分子量の測定
（１）SDS-PAGE
精製された酵素をSDS-PAGEに供した（図３）。分子量マーカーとしては、フォスフォリラ-ゼｂ（94kDa）、BSA（67kDa）、卵白アルブミン（43kDa）、炭酸脱水酵素（30kDa）、大豆トリプシンインヒビター（20.1kDa）、αラクトアルブミン（14.4kDa）を用いた。図３に示すように、oxdA遺伝子産物は約38kDaの分子量を示した。
【００５６】
（２）ゲルろ過
次に、未変性の酵素の分子量をゲルろ過により確認した。精製された酵素は、AKTA Purifier（Amersham Biosciences製）に接続させたSuperose 12 HR10/30カラム（Amersham Biosciences製）にかけ、0.15M KClを含む100mM緩衝液を用いて0.5ml/minの流速で溶出した。溶出液の吸収は280〜422nmで記録し、スタンダード：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（290kDa）、乳酸デヒドロゲナーゼ（142kDa）、エノラーゼ（67kDa）、アデニレートキナーゼ（32kDa）、およびチトクロームｃ（12.4kDa）の動きから酵素の分子量を測定した。その結果、未変性の酵素は76.4kDaの分子量を有することが確認された。この結果とSDS-PAGEによる結果から、oxdA遺伝子産物は2つの同一サブユニットから構成されることが示唆された。
【００５７】
〔実施例５〕アルドキシム脱水酵素活性の確認
反応用混合物として、全量200μl中に20μmolのリン酸カリウム緩衝液（pH7．0）、1μmolのブチルアルドキシム（東京化成製）、および適当量の酵素を含むものを用いた。反応はブチルアルドキシムを加えて開始させ、30℃、好気的条件下で5分間行った。100μlのIM KOHを加えて反応を止め、上清を遠心（10,000×g、5分）により集めた。反応生成物は、水素炎イオン化検出器とガスクロパック56（80/100％1メッシュ；GL-Science製）を充填したガラスカラム（3.2mm by 2.1m）を装備したガスクロマトグラフィー（GC-14BPF;SHIMAZU製）で解析した。
【００５８】
アルドキシムデヒドラターゼ活性1ユニットは、ブチルアルドキシムからブチロニトリル 1μmol/minの生成を触媒する酵素量として定義し、特異的活性（Specific activity）はタンパク1mgあたりのユニット数で評価した。
【００５９】
表１に各精製工程におけるoxdA遺伝子産物（アルドキシム脱水酵素）の酵素活性を示す。最終的に精製された酵素の活性は、好気的条件下で0.758 units/mgであった。
【００６０】
【表１】

【００６１】
〔実施例６〕アルドキシム脱水酵素の補欠分子の解析
（１）ヘム染色
精製されたアルドキシム脱水酵素は溶液中で赤茶色をしており、酵素中にヘムの存在が予測されたため、未変性でのポリアクリルアミドゲル電気泳動後の酵素について、Klattらの方法（Klatt P. et al., J. Biol. Chem. 271, p7336-7342）にしたがってヘム染色を実施した。すなわち、泳動後のゲルを3,3'-ジメトキシベンチジン/H₂O₂およびクーマシーブリリアントブルーで染色した。いずれの染色においても、単一バンドが同じ位置に確認された。さらに、この酵素の吸収スペクトルをShimazu UV-1700 PharmaSpec （SHIMAZU製）を用いて測定したところ、415nmにヘムタンパクに特異的なピークが確認された（図４Ａ）。
【００６２】
（２）ピリジンヘモクロムのスペクトル
ヘムをピリジンヘモクロムに変換することにより、補欠分子の同定とヘムの定量を行った（Falk, J.E., (1964) Porphyrins and Metalloporphyrins, p.240, Elsevier, Amsterdam）。すなわち、酵素にピリジン（最終濃度20％）と少量のNa₂S₂O₄を加え、15分後に生成するピリジンヘモクロムのスペクトルを測定した。図５に示すよう、418.5nm(Soret)、524nm(β-band)、556nm(α-band)の位置にピークが確認された。さらに、HCl-Aceton処理により補欠分子を抽出し、抽出物中のピリジンヘモクロムのスペクトルを測定したところ、得られたスペクトルは酵素中のピリジンヘモクロムのスペクトルと同じであった。
【００６３】
酸-アセトン抽出によりピリジンヘモクロムが抽出できることと、ピリジンヘモクロムのスペクトルの形から、このアルドキシム脱水酵素は補欠分子としてプロトヘムIXを含むことが確認された。そこで、酵素中のヘム含有量を、プロトヘムIXのヘモクロムのモル吸収係数（ε：34.4mM^-1cm^-1 at 557nm）から計算したところ、１モルのサブユニットに0.69モルのヘムが含まれることが確認された。
【００６４】
（３）鉄イオンの定量
以下の方法により金属分析を行った。全てのガラス器具は2M HClで一晩洗浄し、使用前に蒸留水でよくすすいだ。分析に先立って、酵素は1mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）に透析した。0.94mgタンパク/mlを含む酵素試料を高周波プラズマ発光分析装置ICPS-8000（27.120MHz：SHIMAZU製）を用いて分析した。酵素の金属含量は標準溶液から検量線を描くことによって求めた。その結果、ホモダイマーを形成している酵素は1モルあたり1.62モルの鉄を含むことが確認された。この結果から、本発明のアルドキシム脱水酵素は鉄とヘムを1：1の比率で含み、すべての鉄イオンはヘム分子中に存在すると考えられた。なお、測定されたヘム含量はタンパクより少ないが、これは精製工程中で一部のヘムが失われたことを示すものであった。同様の結果はバシラス属由来のフェニルアセトアルドキシム脱水酵素の精製工程についても報告されている。ちなみに、該酵素の精製工程では、最終的に酵素１モルあたり0.35モルのヘムしか検出されなかったことが報告されている（Kato Y. et al., (2000) Biochemistry 39, p800-809）。
【００６５】
金属分析の結果、この酵素は鉄イオンのほかには１モルあたり1.58モルのカルシウムイオンを含むことが確認されたが、それ以外の金属は検出されなかった。
【００６６】
〔実施例７〕酸化還元による酵素活性の変化
表２に示すように、好気的条件下におけるアルドキシム脱水酵素は不活性な状態にあり、酵素の特異的活性は非常に弱いもの（0.758 units/mg）である。この精製された酵素にNa₂S₂O₄をに添加すると、415nmのピークが428nmにシフトし（図４Ａ）、同時に酵素の特異的活性は250倍増加する。
【００６７】
【表２】

【００６８】
Na₂S₂O₄で還元した酵素にさらにCOを加えると428nmのピークは419nmにシフトし（図４Ａ）、酵素の特異的活性は49％を阻害されるが、基質はCO存在下でも脱水される。これらの知見は、酵素中のフェロフェム（２価鉄）状態のヘムに結合したCOは、酵素反応中にブチルアルドキシムによって置換されることを示すものである。他方、好気的条件下では、精製酵素の吸収スペクトルはCOによって変化しないが、酵素に酸化剤であるK₃[Fe(CN)₆]を加えると、415nmから419nmに吸収のピークがシフトし（図４Ｂ）、酵素の活性は全くなくなってしまう。これらのスペクトル特性は、精製された酵素のヘム鉄はフェリフェム（３価鉄）状態にあるが、酵素は還元状態：フェロフェム（２価鉄）状態でなければ活性を示さないことを示すものである。
【００６９】
〔実施例８〕還元状態における酵素の特性
以下の実験は、全てNa₂S₂O₄による還元状態下で実施した。
（１）分子量の測定
0.15M KClと10mMのNa₂S₂O₄を含む100mM緩衝液を用いる以外は実施例４と同様にして、Na₂S₂O₄還元後の酵素について、その分子量をゲルろ過により求めた。その結果、酵素の分子量は76.2kDaと測定された。このことから、活性状態（すなわち、還元状態）にある酵素もまたホモダイマーであることが確認された。
【００７０】
（２）ラマンスペクトル
Na₂S₂O₄で還元後の酵素について室温でTRS-600/S single monochromator（日本分光製）を用いてラマンスペクトルを測定した。励起にはHe-Cdレーザーからの441.6nm lineを用い、ラマン散乱をレーザー光に対して垂直方向に集めた。分散するラマン散乱はCCD検出機：LN/CCD-1100PBUVAR（Princeton Instruments製）を用いて測定した。
【００７１】
還元状態のアルドキシム脱水酵素の高周波数領域（1250-1700cm^-1）におけるラマンスペクトル（図６）を既知のヘムタンパクと比較することにより解析した。
【００７２】
アルドキシム脱水酵素では1357cm^-1にポルフィリンバンドが認められた。この位置はデオキシミオグロビン（1355cm^-1）、還元状態のホースラディッシュパーオキシダーゼ（1358cm^-1）のポルフィリンバンドと似ている。さらに、他のライン（例えば、1470、1565、1618cm^-1）についても、還元状態のデオキシミオグロビン（1472、1563、1618cm^-1）、および還元状態のホースラディッシュパーオキシダーゼ（1473、1565、1627cm^-1）と近似していた。
【００７３】
（３）化学量論
酵素反応におけるアルドキシム消費量とニトリル生成量の関係を測定した。反応は、40μmolのリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）、2μmolのブチルアルドキシム、2μmolのNa₂S₂O₄、１μg（12.5pmol）の酵素を含む反応混合物中、30℃、嫌気的条件下で行った。その結果、アルドキシム消費量とニトリル生成量は化学量論的関係にあることが確認された。
【００７４】
（４）基質特異性と反応速度
種々のアルドキシムを基質として酵素の脱水活性を調べた。なお、酵素活性の確認は、実施例５に記載した方法を基に、Na₂S₂O₄(最終濃度5mM)を緩衝液に加え、還元条件下で嫌気的に実施した（標準アッセイ B）。結果を表３に示す。
【００７５】
【表３】

【００７６】
実験に供したアルドキシムのうち、３種のアルドキシムが本酵素の基質となった。また、本実験で用いた芳香族アルドキシムは基質とはならなかった。基質となった３種のアルドキシムのうち、ブチルアルドキシムに対する酵素活性は特に高いものであった。また、E-ブチルアルドキシムとZ-ブチルアルドキシムの各光学活性体に対する基質特異性を調べたところ、本酵素はいずれのアルドキシムについても同様に活性を示すことが確認された。
【００７７】
バシラス属由来のフェニルアセトアルドキシム脱水酵素は本酵素に比べてブチルアルドキシムに対して非常に弱い酵素活性しか示さない（表２）。
【００７８】
（５）温度とpHによる影響
pH4.0〜11.0の領域における酵素活性を調べた（図７）。その結果、最大の活性はpH5.5で得られ（図７Ａ）、それ以外にはpH9.4で高い酵素活性が得られることが確認された（図７Ｂ）。これはバシラス属由来のフェニルアセトアルドキシム脱水酵素ではみられない特性である。さらに、酵素の最適温度は45℃であると確認された。
【００７９】
さらに、種々の温度およびpHにおける酵素の安定性を調べた。温度については、20℃、100％；25℃、94％；30℃、91％；35℃、78％；40℃、51％；45℃、14％；50℃、3.2％の結果が得られた。一方、pHについては、クエン酸/クエン酸ナトリウム（pH4.4-6.5）、リン酸カルシウム緩衝液（pH6.7-7.9）、Tris/HCl緩衝液（pH7.9-8.8）およびNH₄Cl/NH₄OH緩衝液（pH8.9-10.4）を用いて試験を行ったところ、酵素は6.0-8.0の領域で最も安定であり、pH10においても、最初の酵素活性の40％の活性を維持していた。
【００８０】
（６）酵素活性の阻害物質
表４に挙げる種々の化合物について、酵素活性阻害効果を調べた。
【００８１】
【表４】

【００８２】
その結果、酵素は硝酸銀に非常に感受性が高いことが確認された。一方、ヨード酢酸のようなチオール試薬、N-エチルマレイミド、p-クロロ安息香酸水銀、および5,5'-ジチオビス2-ニトロ安息香酸にはほとんど阻害効果を示さなかった。酵素活性はヒドロキシルアミンによって完全に阻害された。また、酵素はEDTA等のキレート剤には感受性を示さず、フッ化フェニルメタンスルフォニルのようなセリン修飾剤にもほとんど影響を受けなかった。
【００８３】
（７）アルドキシムによるスペクトル変化
ブチルアルドキシムの添加（最終濃度50mM）により、還元状態にある酵素（最終濃度mg/ml）のスペクトルがどのように変化するかを観察した。
【００８４】
図８に示すように、ブチルアルドキシムを添加するとすぐに、416nmにピークが現れるが、ブチロニトリルを添加しても416nmにピークは現れなかった。このことは、基質であるアルドキシムは酵素中のフェロフェム（２価鉄）状態のヘムに作用することを示す。酵素反応が進むにつれ、416nmのピークは消失し、10分後には開始時と同じスペクトルが現れる。この状態では、反応液中のブチルアルドキシムは完全に消費されていることから、416nmのピークはブチロニトリル合成反応における中間体に由来するものであることが示唆される。よく似た結果が、アセトアルドキシムを基質として添加したときにも観察された。
【００８５】
これらの結果より、本酵素のヘム分子はフェロフェム（２価鉄）状態において、触媒作用の必須部分として機能することが確認された。
【００８６】
【発明の効果】
本発明は、シュードモナス属に属する微生物由来の新規アルドキシム脱水酵素およびその遺伝子を提供する。該酵素やその遺伝子を利用すれば、アミド合成の出発物質であるニトリル化合物を温和な条件で製造することができる。
【００８７】
【配列表】

【００８８】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３−人工配列の説明：プライマー
配列番号４−人工配列の説明：プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のアルドキシム脱水酵素遺伝子とその近傍の配列を示す。
【図２】図２は、Pseudomonas chlororaphis B23のアルドキシム脱水酵素とバシラス属由来のフェニルアセトアルドキシム脱水酵素（OxB-1）のアミノ酸配列を比較したものである。
【図３】図３は、アルドキシム脱水酵素タンパク質のSDS-PAGEの結果を示す写真である。
【図４】図４は、アルドキシム脱水酵素（最終濃度0.56mg/ml）の吸収スペクトルを示す。
４Ａ：実線は精製酵素、破線はNa₂S₂O₄還元後の酵素、細線はNa₂S₂O₄還元後にCOを添加した酵素の結果を示す。
４Ｂ：実線は精製酵素、破線はK₃[Fe(CN)₆]酸化後の酵素、細線はKCNを添加した酵素の結果を示す。
右上の挿入図は、Na₂S₂O₄還元後にCOを添加した酵素の結果からNa₂S₂O₄還元後の酵素の結果を差し引いたものである。
【図５】図５は、アルドキシム脱水酵素のピリジンヘモクロムの吸収スペクトルを示す。
【図６】図６は、高周波数領域におけるアルドキシム脱水酵素（還元状態：最終濃度0.50mg/ml）のラマンスペクトルを示す。
【図７】図７は、アルドキシム脱水酵素活性に対する、pHと温度の影響をみたグラフである。
７Ａ：30℃で5分間反応を行った結果を示す。図中、●：クエン酸/クエン酸ナトリウム、◆：リン酸カルシウム、■：Tris/HCl、▲：NH₄Cl/NH₄OH。
７Ｂ：種々の温度で5分間反応を行った結果を示す。
【図８】図８は、基質の添加によるアルドキシム脱水酵素の吸収スペクトルの変化をみた結果である。実線はNa₂S₂O₄還元後の酵素、破線は添加直後、細線は添加10分後の結果を示す。
【図９】図９は、アルドキシム代謝に作用する遺伝子クラスターと、対応する代謝経路を示す図である。B23はPseudomonas chlororaphis B23株を、OxB-1はBacillus sp. OxB-1株を、Psyrは、P. syringae pv. syringae B728a株を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel aldoxime dehydrase protein derived from a microorganism belonging to the genus Pseudomonas, a gene thereof, and a method for using them.
[0002]
[Prior art]
Microbial nitrile metabolic pathways include a nitrilase system that produces carboxylic acid directly from nitrile and a nitrile hydratase system that produces carboxylic acid from nitrile via amide. Each enzyme working in this nitrile metabolic pathway is important for academic research and has high industrial utility value.
[0003]
Nitrile hydratase has been conventionally used for industrial production of amide compounds because it can convert nitriles to amide compounds under mild conditions. For example, industrial production of acrylamide and nicotinamide using nitrile hydratase derived from Rhodococcus rhodochrous J-1 (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2); Pseudomonas chlorolafis B23 Industrial production of 5-cyanovaleric acid amide (an intermediate of herbicide) using nitrile hydratase derived from a strain (Pseudomonas chlororaphis B23) (for example, see Non-patent Document 2 and Non-patent Document 3) Is known.
[0004]
A series of enzymes that work in the nitrile metabolic pathway: for example, nitrile hydratase that converts nitrile to amide, amidase that converts amide to carboxylic acid, and accessory proteins thereof form clusters on the genome (for example, Non-Patent Document 4). reference). As described above, details of the degradation pathway of nitrile have been clarified at the protein and gene level, but there are still many unclear points regarding the synthesis pathway of nitrile.
[0005]
Aldoxime is known as one of intermediate candidates for nitrile biosynthesis (see, for example, Non-Patent Document 5). For example, in certain higher plants, it has been reported that tryptophan-derived indoleacetoaldoxime is dehydrated into indoleacetonitrile (see, for example, Non-Patent Document 5 and Non-Patent Documents 6-8). In addition, microorganisms that convert aldoxime into cyanate glycoside or glucosinolate are also known (for example, Nasturtium officinale etc. that converts phenylpropionaldoxime into phenylethylglucosinolate: see Non-Patent Document 9). In addition to these aldoximes, some natural aldoxime compounds have been found in microorganisms (for example, 2- (4-hydroxyphenyl) -2-oxoacetaldehyde oxime in the fungus Penicillium olsonii: Non-patent document 10 reference).
[0006]
However, as for the enzyme that acts on aldoxime, only two enzymes that perform nitrile synthesis from aldoxime have been purified. These genes belong to different super families, and one is CYP71E1: cytochrome P450 involved in dhurrin biosynthesis of sorghum (see, for example, Non-Patent Document 11), from p-phenylacetoaldoxime to p-hydroxyphenitz Catalyze conversion to acetonitrile. The other is phenylacetaldoxime dehydrase (see, for example, Non-Patent Document 12) that functions in nitrile metabolism of Bacillus sp. OxB-1 strain, which catalyzes the dehydration of phenylacetoaldoxime to phenylacetonitrile. Phenylacetoaldoxime dehydrase from the genus Bacillus is weakly bound to heme and is known to require FMN for enzyme activity, but detailed properties such as the function of cofactors are not yet known. Thus, the biochemical and genetic information of enzymes acting in the nitrile synthesis pathway is still limited.
[0007]
It is known that chemical conversion from aldoxime to nitrile requires severe conditions (see, for example, Non-Patent Document 13). Therefore, if a nitrile can be synthesized under biologically mild conditions, it has an important meaning for industrial production of a nitrile compound, and thus for industrial production of an amide compound.
[0008]
[Non-Patent Document 1]
Kobayashi, M., and Shimizu, S. (1998) Nature Biotechnol. 1 6, p733-736
[Non-Patent Document 2]
Yamada, H., and Kobayashi, M. (1996) Biosci. Biotechnol. Biochem. 60, p1391-1400
[Non-Patent Document 3]
Yamada, H., Shimizu, S., and Kobayashi, M. (2001) Chemical Records 1, p152-161
[Non-Patent Document 4]
Nishiyama, M., Horinouchi, S., Kobayashi, M., Nagasawa, T., Yamada, H., and Beppu, T. (1991) J. Bacteriol. 173, p2465-2472
[Non-Patent Document 5]
Sibbesen, O., Koch, B., Rouze, P., Moller, BL, and Halkier, BA (1995) in Amino Acids and Their Derivatives in Higher Plants (Wallsgrove, RM, ed.), Pp. 227-241, Cambridge University Press, Cambridge
[Non-Patent Document 6]
Mahadevan, S. (1973) Ann. Rev. Plant Physiol. 24, p69-88
[Non-Patent Document 7]
Hansen, CH, Du, L., Naur, P., Olsen, CE, Axelsen, KB, Hick, AJ, Pickett, JA, and Halkier, BA (2001) J. Biol. Chem. 276, p24790-24796
[Non-Patent Document 8]
Bak, S., Tax, FE, Feldmann, KA, Galbraith, DW, and Feyereisen, R. (2001) Plant Cell 13, p101-111
[Non-patent document 9]
Underhill, EW (1967) Eur. J. Biochem. 2, p61-63
[Non-Patent Document 10]
Amade, P., Mallea, M., and Bouaicha, N. (1994) J. Antibiotics 47, p201-207
[Non-Patent Document 11]
Bak, S., Kahn, RA, Nielsen, HL, Moller, BL, and Halkier, BA (1998) Plant Mol. Biol. 36, p393-405
[Non-Patent Document 12]
Kato, Y., Nakamura, K., Sakiyama, H., Mayhew, SG, and Asano, Y. (2000) Biochemistry 39, p800-809
[Non-Patent Document 13]
Xie, SX, Kato, Y., and Asano, Y. (2001) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, p2666-2672
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
The object of the present invention is to isolate the aldoxime dehydrase that acts in the nitrile synthesis pathway of microorganisms and to use it to enable biological synthesis of the nitrile compound that is the starting material of the amide compound.
[0010]
[Means for Solving the Invention]
The present inventors have intensively studied to solve the above problems and succeeded in isolating a novel gene encoding aldoxime dehydrase from a sequence in the vicinity of the nitrile hydratase gene of Pseudomonas chlororaphis B23 strain. Furthermore, the gene was successfully used for genetic engineering production of aldoxime dehydrase. By using this aldoxime dehydrase, it becomes possible to produce a nitrile compound, which is a starting material of an amide compound, from aldoxime under mild conditions.
[0011]
That is, the present invention provides the following (1) to (9).
(1) An aldoxime dehydrase protein composed of a homodimer of the following protein (a) and / or (b):
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
(B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
(2) A gene encoding the following protein (a) or (b).
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
(B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and which can function as a subunit of aldoxime dehydrase
(3) A gene comprising the following DNA (c) or (d):
(C) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1
(D) encodes a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and can function as a subunit of aldoxime dehydrase DNA from microorganisms belonging to the genus Pseudomonas
(4) A recombinant vector containing the gene according to (2) or (3) above.
(5) A transformant obtained by introducing the vector described in (4) above into a host.
(6) A method for producing aldoxime dehydrase, comprising culturing the transformant according to (5) and collecting a protein having aldoxime dehydrase activity from the obtained culture.
(7) A method for producing a nitrile compound, wherein the enzyme protein according to (1) or the transformant according to claim 5 is allowed to act on an aldoxime compound to obtain a nitrile compound.
(8) The method according to (7) above, wherein the enzyme protein or transformant is allowed to act on the aldoxime compound under pH 5 to 10, temperature 20 to 50 ° C., and anaerobic reduction conditions.
(9) The method according to (7) or (8) above, wherein the aldoxime compound is an aliphatic aldoxime compound.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Aldoxime dehydrase
The protein according to the present invention is a novel protein having aldoxim dehydratase activity isolated from Pseudomonas chlororaphis B23 strain. The protein has “aldoxime dehydrase activity” which dehydrates aldoxime compounds and converts them into the corresponding nitrile compounds.
[0013]
The aldoxime dehydrase protein of the present invention has the following properties.
About structure:
(1) A molecular weight of about 76.2 kDa and a homodimer composed of two identical subunits consisting of 352 amino acid residues.
(2) Heme protein containing heme in the enzyme.
(3) The structure predicted from the Raman spectrum under reducing conditions is similar to reduced deoxymyoglobin and reduced horseradish peroxidase.
(3) The enzyme contains calcium as a metal other than iron.
About enzyme activity:
(1) The enzyme exhibits a catalytic action when heme is in a ferrofem (divalent iron) state. That is, the enzyme is active in the reduced state.
(2) FMN is not required for enzyme activity (in this respect, it differs from the known phenylacetaldoxime dehydrase derived from the genus Bacillus).
(3) The enzyme activity is strongly inhibited by hydroxylamine and silver nitrate.
About substrate specificity:
The substrate is preferably an aliphatic aldoxime, particularly a C1-C6 aliphatic aldoxime, and most preferably butyl aldoxime. Little enzyme activity is shown against aromatic aldoximes.
[0014]
The subunit constituting the aldoxime dehydrase protein of the present invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. However, the present invention is not limited to this sequence. In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, a protein consisting of another amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added constitutes a homodimer of aldoxime dehydrase. As long as it functions as one of the subunits, the aldoxime dehydrase protein subunit of the present invention is included. The number of mutations such as deletion, substitution and addition is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, with respect to the total number of amino acids.
[0015]
The aldoxime dehydrase protein of the present invention is a homodimer composed of two identical subunits. However, homodimers are not limited to dimers composed of subunits having exactly the same amino acid sequence, but are dimers between substantially equivalent subunits having a difference of one or several minute amino acids. May be.
[0016]
2. Aldoxime dehydrase gene
The aldoxime dehydrase gene of the present invention is a gene encoding the aldoxime dehydrase protein. More specifically, it is a gene encoding each subunit of aldoxime dehydrase protein homodimer.
[0017]
The gene is a series of genes (nitrile hydratase gene, amidase gene, about 47 kDa nitrile hydratase acceptor protein that exist in the upstream region of the amidase gene in the genome of the Pseudomonas chlororaphis B23 strain and work in the nitrile metabolic pathway of the microorganism. (P47K) etc.) and a cluster.
[0018]
The gene of the present invention has a base sequence consisting of 1662 nucleotides shown in SEQ ID NO: 1, and encodes a protein of 352 amino acid residues.
[0019]
However, the gene encoding the aldoxime dehydrase protein according to the present invention is not limited to the above sequence, and other genes that can hybridize with this gene (SEQ ID NO: 1) under stringent conditions are also included in the gene. As long as it encodes a protein that can function as a subunit of aldoxime dehydrase. The stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is 300-2000 mM and the temperature is 40-75 ° C., preferably the sodium concentration is 600-900 mM and the temperature is 65 ° C.
[0020]
3. Recombinant vector
The recombinant vector of the present invention can be obtained by linking (inserting) the gene of the present invention to a known vector such as a plasmid. The vector is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and examples thereof include plasmid DNA and phage DNA.
[0021]
Examples of the plasmid DNA include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC18, pUC119, pTrcHis, pBlueBacHis, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5 etc.), and plasmids derived from yeast (eg, YEp13, YEp24, YCp50). , pYE52, etc.), and phage DNA includes λ phage.
[0022]
For insertion of the gene of the present invention into the vector, first, the purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into an appropriate restriction enzyme site or a multicloning site of the vector DNA, and then ligated to the vector. Is done.
[0023]
In order to express a foreign gene in a host, it is necessary to arrange an appropriate promoter before the structural gene. The promoter is not particularly limited, and any promoter known to function in the host can be used. The promoter will be described in detail for each host in the transformant described later. If necessary, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a ribosome binding sequence (SD sequence), a terminator sequence and the like may be arranged.
[0024]
The vector may contain genes for other enzymes that function in the nitrile metabolism system. Examples of such genes include nitrile hydratase gene or amidase gene derived from various organisms (for example, nitrile hydratase gene of Pseudomonas Chlororaphis B23, amidase gene (D90216), H-type nitrile hydratase gene of Rhodococcus rhodochrous J1 (X64359) ), L-type nitrile hydratase gene of Rhodococcus rhodochrous J1 (X64360), nitrile hydratase gene of Rhodococcus sp. Examples include Rhodococcus rhodochrous K22 nitrilase gene (D12583), Arabidopsis thaliana nitrilase gene (BT000040), Alcaligenes faecalis nitrilase gene (D13419), and the like. The numbers in parentheses indicate the GenBank Accession Number of each gene.
[0025]
4). Transformant
The transformant of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host so that the target gene can be expressed. The host is not particularly limited as long as it can express the DNA of the present invention. For example, Escherichia such as Escherichia coli, Bacillus such as Bacillus subtilis, Pseudomonas -Bacteria belonging to the genus Pseudomonas putida, Pseudomonas, Rhizobium meliloti, Rhizobium, Saccharomyces cervisiae, Schizosaccharomyces pombe, and others Examples thereof include animal cells such as COS cells and CHO cells, and insect cells such as Sf19 and Sf21.
[0026]
When a bacterium such as Escherichia coli is used as a host, it is desirable that the recombinant vector of the present invention is capable of autonomous replication in each bacterium and is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the gene of the present invention, and a transcription termination sequence. Moreover, the gene which controls a promoter may be contained. Examples of Escherichia coli include Escherichia coli K12, DH1, DH10B (Invitrogen), BL21-CodonPlus (DE3) -RIL (Stratagene), TOP10F, and Bacillus subtilis (B subtilis) MI114, 207-21 and the like.
[0027]
It is not particularly limited as long as it can be expressed in a host such as E. coli, and for example, promoters derived from E. coli such as trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, and promoters derived from phage such as T7 promoter can be used.
[0028]
The method for introducing a recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it can introduce DNA into bacteria. For example, a method using calcium ions (Cohen, SN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 : 2110 (1972)), electroporation method and the like.
[0029]
When yeast is used as a host, for example, S. cervisiae, Sizosaccharomyces. Pombe, Pichia pastoris and the like are used. In this case, examples of promoters that can be expressed in yeast include gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MFα1 promoter, PHO5 promoter, AOX promoter and the like.
[0030]
Examples of methods for introducing a recombinant vector into yeast include the electroporation method (Becker, DM et al .: Methods. Enzymol., 194: 180 (1990)) and the spheroplast method (Hinnen, A. et al. : Proc Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978)), lithium acetate method (Itoh, H .: J. Bacteriol., 153: 163 (1983)) and the like.
[0031]
The transformant of the present invention may be simultaneously introduced with genes of other enzymes that function in the nitrile metabolism system together with the aldoxime dehydrase gene of the present invention. Examples of such genes include nitrile hydratase gene, amidase gene, nitrilase gene and the like derived from various organisms as described above.
[0032]
These genes may be introduced simultaneously with the aldoxime dehydrase gene of the present invention by one vector or separately by different vectors, but are placed under the control of the same promoter to function in concert. It is necessary to By expressing these genes in a transformant in a coordinated manner, a nitrile compound produced by aldoxime dehydrase can be further converted into an amide compound or a carboxylic acid compound.
[0033]
5. Production of aldoxime dehydrase of the present invention
The enzyme of the present invention can be obtained by culturing the transformant of the present invention in an appropriate medium and collecting a protein having the enzyme activity from the culture. The method for culturing the transformant of the present invention may be determined according to the host. For example, in the case of a transformant whose host is a microorganism such as Escherichia coli or yeast, any medium containing a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganism and capable of efficiently culturing the transformant. For example, either a natural medium or a synthetic medium may be used.
[0034]
During the culture, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as necessary. When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter, cultivate a microorganism transformed with an expression vector using isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG) or the like with the trp promoter. In this case, indole acrylic acid (IAA) or the like may be added to the medium. It has been confirmed that the maximum amount of enzyme protein can be obtained by culturing a transformant hosting Escherichia coli at 15 ° C. for 7 days.
[0035]
After culturing, when the enzyme protein of the present invention is produced in the microbial cells or cells, the microbial cells or cells are disrupted. On the other hand, when the protein of the present invention is secreted outside the cells or cells, the culture solution is used as it is or collected by centrifugation or the like.
[0036]
For protein isolation / purification, for example, ammonium sulfate precipitation, SDS-PAGE, gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like may be used alone or in appropriate combination.
[0037]
The aldoxime dehydrase activity of the present invention can be confirmed by adding the enzyme to a reaction solution containing an appropriate aldoxime compound that can serve as a substrate and detecting the nitrile produced. For confirmation of the nitrile compound, for example, gas chromatography, high performance liquid chromatography or the like can be used. Alternatively, an antibody that specifically binds to the aldoxime dehydrase of the present invention can be prepared, and expression can be confirmed by Western blotting using the antibody.
[0038]
6). Biological production of nitrile and amide compounds
If the aldoxime dehydrase protein of the present invention is used, an aldoxime compound can be converted to the corresponding nitrile compound under mild conditions. That is, the present invention provides a method for producing a nitrile compound using the aldoxime dehydrase protein of the present invention or a transformant containing the aldoxime dehydrase gene of the present invention.
[0039]
For example, a recombinant aldoxime dehydrase protein produced in large quantities by the aforementioned transformant (for example, Escherichia coli containing the aldoxime dehydrase gene of the present invention) is allowed to act on an aldoxime compound as a substrate under conditions where the enzyme can function. . Or the aldoxime compound which is a substrate is added to the culture medium containing the said transformant, and it culture | cultivates on the conditions which the enzyme of this invention can function. Thereby, an aldoxime compound is converted into a corresponding nitrile compound.
[0040]
The “conditions under which the enzyme can function” mean conditions under which the aldoxime dehydrase of the present invention can appropriately exert its enzyme activity. Specifically, since the enzyme of the present invention exhibits enzyme activity under reducing conditions (anaerobic conditions), the conditions must be at least such reducing conditions. The reducing conditions are, for example, Na ₂ S ₂ O _Four It is achieved by adding a reducing agent such as an enzyme reaction solution or a medium. In addition, for example, the temperature is 0 to 70 ° C., preferably 20 to 50 ° C., more preferably around 15 ° C., and the pH is 3 to 12, preferably 5 to 10, and more preferably about 6 to 9.
[0041]
As the substrate, aliphatic aldoximes, particularly C1-C6 aliphatic aldoximes are preferred, and butyl aldoxime is most preferred.
[0042]
The nitrile thus produced is a starting material for the production of amide compounds with nitrile hydratase. Therefore, the method of the present invention can be used not only for nitrile compounds but also for industrial production of amide compounds.
[0043]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited thereto.
[0044]
[Example 1] Search for coding region of aldoxime dehydrase
The coding region of the gene related to the nitrile hydratase system derived from Pseudomonas chlororaphis B23 is clustered, with the nitrile hydratase gene as the center, the amidase gene in the upstream region, and the nitrile hydratase accessory protein of about 47 kDa in the downstream region (P47K), OrfE with unknown function exists (FIG. 9). On the other hand, it is known that a protein of putative 38 kDa is required for maximum expression of nitrile hydratase in E. coli (Nishiyama M. et al, (1991) J. Bacteriol. 173, p2465-2472). Therefore, an ORF encoding a protein having a molecular weight of about 38 kDa clustered with the nitrile hydratase gene described above was searched from the upstream region of the amidase gene.
[0045]
As a result, an ORF (SEQ ID NO: 1) consisting of 1056 nucleotides and 352 amino acid residues and having a molecular weight of approximately 40127 Da as shown in FIG. 1 was found. Hereinafter, this ORF is referred to as oxdA. It was confirmed that a ribosome binding site (GAGGA) was present 8 nucleotides upstream from the start codon of oxdA. In addition, as a result of searching using BLAST, oxdA was approximately the same as the phenylacetoaldoxime dehydrase gene derived from Bacillus sp. It was confirmed to have 32% homology (FIG. 2).
[0046]
[Example 2] Expression of oxdA (aldoxime dehydrase gene) in Escherichia coli
Expression of oxdA in Escherichia coli was attempted according to the method of Maniatis T. et al. (Maniatis T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, NY).
[0047]
(1) Preparation of pPCN4
Plasmid pPCN4 containing a sequence in the vicinity of the nitrile hydratase gene was prepared from E. coli JM105 / pPCN4 strain containing the same (deposit number FERM BP-2779; Japanese Patent Laid-Open No. 3-251184) according to a conventional method.
[0048]
(2) Amplification of oxdA
Based on the base sequence of oxdA selected in Example 1, the following primers were synthesized and PCR was performed using pPCN4 as a template.
Forward Primer: 5'- CATATG GAATCTGCGATCGACACGC-3 '(SEQ ID NO: 3)
Reverse Primer: 5'-ACGC GTCGAC TCAGGTGGGCGCGACAACGGC-3 '(SEQ ID NO: 4)
PCR conditions: 94 ° C 30sec, 55 ° C 30sec, 68 ° C 30sec 30 cycles
The Forward Primer contains an NdeI recognition sequence (underlined) and corresponds to 22 bases from the start codon of oxdA. The Reverse Primer contains a SalI recognition sequence (underlined) and corresponds to 21 bases complementary to the sequence at the 3 ′ end of oxdA.
[0049]
(3) Construction of expression vector
The obtained amplified fragment was subcloned into the pUC18 vector, and the DNA sequence was confirmed using ABI Prism 310 genetic analyzer (Applied Biosystems). Next, this vector was digested with NdeI and SalI, inserted into the NdeI-SalI region of pET-24a (+) (Novagen), and the resulting plasmid was named pET-oxdA. In pET-oxdA, oxdA is under the control of the T7 promoter.
[0050]
(4) Expression experiment using transformants
Subsequently, pET-oxdA was introduced into Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3) -RIL (Stratagene), and an expression experiment was performed using the obtained transformant. The transformant was cultured with shaking at 37 ° C. in 240 ml of 2 × YT medium containing 50 μg / ml kanamycin and 34 μg / ml chloramphenicol. After culturing overnight, the whole culture was inoculated into 48 L of the same medium and cultured with shaking at 37 ° C. for 2 hours. IPTG was added thereto to a final concentration of 0.1 mM to induce the T7 promoter, and further cultured at 15 ° C. for 7 days.
[0051]
Under 37 ° C. culture conditions, the oxdA gene product was expressed as a complete inclusion body. As a result of examining the culture conditions in order to increase the yield of soluble enzyme, we succeeded in expressing about 10% of the gene product in soluble protein by culturing at 15 ° C for 7 days.
[0052]
[Example 3] Purification of oxdA (aldoxime dehydrase gene) product
The oxdA gene product obtained in Example 2 was purified at 0-4 ° C. using a potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 5 mM 2ME. First, the cells are collected by centrifugation (15,000 × g, 30 minutes), washed twice with 100 mM buffer containing 1 mM dithiothreitol, and disrupted by sonication (Insonator Model 201M: manufactured by KUBOTA) Extracts that did not contain cells were collected. Further, the remaining cells were removed by centrifugation, and the supernatant was fractionated with ammonium sulfate (40-60%) and dialyzed against 10 mM buffer. The dialyzed solution was applied to a DEAE-Sephacel column (5 x 25 cm: Amersham Pharmacia) made isotonic with 10 mM buffer, and the protein was eluted with 1.2 L of 10 mM buffer with a linear gradient of KCl 0.1-0.4M. It was.
[0053]
Fractions with recognized activity were collected, ammonium sulfate was added to 70% saturation and centrifuged. The resulting precipitate was dissolved in 0.1 M buffer and transferred to an ammonium sulfate (20% saturated) solution. The enzyme solution was applied to a TSK gel Butyl-Toyopeal 650M column (5 × 22 cm: manufactured by Tosoh) made isotonic with 10 mM buffer containing ammonium sulfate (20% saturation), and the concentration of ammonium sulfate was lowered to 20% to 5%. Elute with 1.2 L of buffer. The active fractions were collected and precipitated with 70% saturated ammonium sulfate. The resulting precipitate was collected by centrifugation, dissolved in 0.1 M buffer, and dialyzed against 10 mM buffer containing 0.5% ammonium sulfate. This was applied to a Phenyl-Sepharose CL-4B column (5 × 22 cm: manufactured by Amersham Pharmacia) made isotonic with the same buffer, washed thoroughly with 10 mM buffer containing 0.5% ammonium sulfate, and then eluted with 10 mM buffer. It was. The active fractions were collected and solid ammonium sulfate was added to 70% saturation and centrifuged. The obtained precipitate was dissolved in 0.1 M buffer and dialyzed 3 times against 2 L of 1 mM buffer (pH 6.8).
[0054]
The enzyme solution after dialysis was centrifuged and then applied to a Cellulofine HAp column (5 × 22 cm: Seikagaku Corporation) that was made isotonic with 1 mM buffer. The column was eluted with a buffer (pH 6.8) with a linear gradient of 1-100 mM and further re-fractionated with ammonium sulfate (50-60% saturation). The precipitate was collected by centrifugation, dissolved in 0.1 M buffer, dialyzed again into 10 mM buffer, and centrifuged.
[0055]
[Example 4] Measurement of molecular weight of oxdA (aldoxime dehydrase gene) product
(1) SDS-PAGE
The purified enzyme was subjected to SDS-PAGE (FIG. 3). As molecular weight markers, phosphorylase b (94 kDa), BSA (67 kDa), ovalbumin (43 kDa), carbonic anhydrase (30 kDa), soybean trypsin inhibitor (20.1 kDa), α-lactalbumin (14.4 kDa) were used. As shown in FIG. 3, the oxdA gene product showed a molecular weight of about 38 kDa.
[0056]
(2) Gel filtration
Next, the molecular weight of the native enzyme was confirmed by gel filtration. The purified enzyme was applied to a Superose 12 HR10 / 30 column (Amersham Biosciences) connected to AKTA Purifier (Amersham Biosciences) and eluted with 100 mM buffer containing 0.15 M KCl at a flow rate of 0.5 ml / min. . Elution absorption was recorded from 280 to 422 nm, standard: enzyme from movement of glutamate dehydrogenase (290 kDa), lactate dehydrogenase (142 kDa), enolase (67 kDa), adenylate kinase (32 kDa), and cytochrome c (12.4 kDa) The molecular weight of was measured. As a result, it was confirmed that the native enzyme had a molecular weight of 76.4 kDa. These results and SDS-PAGE results suggested that the oxdA gene product is composed of two identical subunits.
[0057]
[Example 5] Confirmation of aldoxime dehydrase activity
As a reaction mixture, a mixture containing 20 μmol of potassium phosphate buffer (pH 7.0), 1 μmol of butylaldoxime (manufactured by Tokyo Chemical Industry), and an appropriate amount of enzyme in a total volume of 200 μl was used. The reaction was started by adding butyl aldoxime and was carried out at 30 ° C. under aerobic conditions for 5 minutes. The reaction was stopped by adding 100 μl IM KOH, and the supernatant was collected by centrifugation (10,000 × g, 5 min). The reaction product was gas chromatography (GC-14BPF; equipped with a glass column (3.2 mm by 2.1 m) packed with a flame ionization detector and Gasclopack 56 (80/100% 1 mesh; manufactured by GL-Science). (Manufactured by SHIMAZU).
[0058]
One unit of aldoxime dehydratase activity was defined as the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 μmol / min of butyronitrile from butyl aldoxime, and the specific activity was evaluated by the number of units per 1 mg of protein.
[0059]
Table 1 shows the enzyme activity of the oxdA gene product (aldoxime dehydrase) in each purification step. The activity of the final purified enzyme was 0.758 units / mg under aerobic conditions.
[0060]
[Table 1]

[0061]
[Example 6] Analysis of prosthetic molecule of aldoxime dehydrase
(1) Heme staining
Since the purified aldoxime dehydrase has a reddish brown color in the solution and the presence of heme in the enzyme is predicted, the enzyme after native polyacrylamide gel electrophoresis was analyzed by the method of Klatt et al. et al., J. Biol. Chem. 271, p7336-7342). That is, the gel after electrophoresis was subjected to 3,3′-dimethoxybenzidine / H ₂ O ₂ And stained with Coomassie Brilliant Blue. In any staining, a single band was confirmed at the same position. Furthermore, when the absorption spectrum of this enzyme was measured using Shimazu UV-1700 PharmaSpec (manufactured by SHIMAZU), a peak specific to heme protein was confirmed at 415 nm (FIG. 4A).
[0062]
(2) Spectrum of pyridine hemochrome
By converting heme to pyridine hemochrome, prosthetic molecules were identified and heme was quantified (Falk, JE, (1964) Porphyrins and Metalloporphyrins, p.240, Elsevier, Amsterdam). That is, the enzyme contains pyridine (final concentration 20%) and a small amount of Na. ₂ S ₂ O _Four And the spectrum of pyridine hemochrome formed after 15 minutes was measured. As shown in FIG. 5, peaks were confirmed at positions of 418.5 nm (Soret), 524 nm (β-band), and 556 nm (α-band). Further, when the prosthetic molecule was extracted by HCl-Aceton treatment and the spectrum of pyridine hemochrome in the extract was measured, the spectrum obtained was the same as the spectrum of pyridine hemochrome in the enzyme.
[0063]
From the fact that pyridine hemochrome can be extracted by acid-acetone extraction and the spectrum of pyridine hemochrome, this aldoxime dehydrase was confirmed to contain protoheme IX as a prosthetic molecule. Therefore, the heme content in the enzyme was changed to the molar absorption coefficient of hemochrome in protoheme IX (ε: 34.4 mM). ^-1 cm ^-1 calculated from (at 557 nm), it was confirmed that 0.69 mol of heme was contained in 1 mol of subunit.
[0064]
(3) Determination of iron ions
Metal analysis was performed by the following method. All glassware was washed overnight with 2M HCl and rinsed thoroughly with distilled water before use. Prior to analysis, the enzyme was dialyzed against 1 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). An enzyme sample containing 0.94 mg protein / ml was analyzed using a high-frequency plasma emission analyzer ICPS-8000 (27.120 MHz: manufactured by SHIMAZU). The metal content of the enzyme was determined by drawing a calibration curve from a standard solution. As a result, it was confirmed that the enzyme forming the homodimer contained 1.62 mol of iron per mol. From these results, it was considered that the aldoxime dehydrase of the present invention contains iron and heme in a ratio of 1: 1, and all iron ions are present in the heme molecule. Note that the measured heme content was less than that of protein, indicating that some heme was lost during the purification process. Similar results have been reported for the purification process of phenylacetaldoxime dehydrase from the genus Bacillus. Incidentally, it has been reported that in the purification step of the enzyme, only 0.35 mol of heme was finally detected per mol of the enzyme (Kato Y. et al., (2000) Biochemistry 39, p800-809).
[0065]
As a result of metal analysis, it was confirmed that this enzyme contained 1.58 moles of calcium ions per mole in addition to iron ions, but no other metals were detected.
[0066]
[Example 7] Change in enzyme activity by redox
As shown in Table 2, aldoxime dehydrase under aerobic conditions is in an inactive state, and the specific activity of the enzyme is very weak (0.758 units / mg). This purified enzyme has Na ₂ S ₂ O _Four Is added to shifts the peak at 415 nm to 428 nm (FIG. 4A) and at the same time increases the specific activity of the enzyme by a factor of 250.
[0067]
[Table 2]

[0068]
Na ₂ S ₂ O _Four When CO is further added to the enzyme reduced in step 4, the peak at 428 nm shifts to 419 nm (FIG. 4A), and the specific activity of the enzyme is inhibited by 49%, but the substrate is dehydrated even in the presence of CO. These findings indicate that CO bound to ferrophem (divalent iron) heme in the enzyme is replaced by butylaldoxime during the enzyme reaction. On the other hand, under aerobic conditions, the absorption spectrum of the purified enzyme does not change with CO, but the enzyme has an oxidizing agent, K _Three [Fe (CN) ₆ ], The absorption peak shifts from 415 nm to 419 nm (FIG. 4B), and the enzyme activity is completely lost. These spectral characteristics indicate that the purified enzyme heme iron is in ferrifem (trivalent iron) state, but the enzyme is active only in the reduced state: ferrofem (divalent iron) state. .
[0069]
[Example 8] Characteristics of enzyme in reduced state
The following experiments are all Na ₂ S ₂ O _Four Performed under reduced conditions by
(1) Measurement of molecular weight
0.15M KCl and 10mM Na ₂ S ₂ O _Four Na was used in the same manner as in Example 4 except that 100 mM buffer solution was used. ₂ S ₂ O _Four The molecular weight of the reduced enzyme was determined by gel filtration. As a result, the molecular weight of the enzyme was measured to be 76.2 kDa. From this, it was confirmed that the enzyme in the active state (that is, the reduced state) is also a homodimer.
[0070]
(2) Raman spectrum
Na ₂ S ₂ O _Four The Raman spectrum of the enzyme after reduction was measured using a TRS-600 / S single monochromator (manufactured by JASCO) at room temperature. For excitation, a 441.6 nm line from a He-Cd laser was used, and Raman scattering was collected in a direction perpendicular to the laser beam. The dispersive Raman scattering was measured using a CCD detector: LN / CCD-1100PBUVAR (Princeton Instruments).
[0071]
High frequency range of reduced aldoxime dehydrase (1250-1700cm ^-1 ) Was analyzed by comparing the Raman spectrum (FIG. 6) with known heme proteins.
[0072]
1357cm for aldoxime dehydrase ^-1 A porphyrin band was observed. This position is deoxymyoglobin (1355cm ^-1 ), Reduced horseradish peroxidase (1358cm) ^-1 ) Is similar to porphyrin band. In addition, other lines (eg 1470, 1565, 1618cm ^-1 ), Reduced deoxymyoglobin (1472, 1563, 1618cm) ^-1 ), And reduced horseradish peroxidase (1473, 1565, 1627 cm) ^-1 ).
[0073]
(3) Stoichiometry
The relationship between aldoxime consumption and nitrile production in the enzyme reaction was measured. The reaction consisted of 40 μmol potassium phosphate buffer (pH 7.0), 2 μmol butyl aldoxime, 2 μmol Na ₂ S ₂ O _Four The reaction was carried out at 30 ° C. under anaerobic conditions in a reaction mixture containing 1 μg (12.5 pmol) of enzyme. As a result, it was confirmed that aldoxime consumption and nitrile production had a stoichiometric relationship.
[0074]
(4) Substrate specificity and reaction rate
The dehydration activity of the enzyme was examined using various aldoximes as substrates. The enzyme activity was confirmed based on the method described in Example 5 with Na. ₂ S ₂ O _Four (Final concentration 5 mM) was added to the buffer and performed anaerobically under reducing conditions (standard assay B). The results are shown in Table 3.
[0075]
[Table 3]

[0076]
Three types of aldoxime used in the experiment Aldoxime Became the substrate for this enzyme. In addition, the aromatic aldoxime used in this experiment did not become a substrate. Of the three aldoximes that served as substrates, the enzyme activity for butyl aldoxime was particularly high. In addition, when the substrate specificity of each optically active substance of E-butyl aldoxime and Z-butyl aldoxime was examined, it was confirmed that this enzyme shows activity in any aldoxime as well.
[0077]
Phenylacetoaldoxime dehydrase from the genus Bacillus exhibits very weak enzyme activity against butylaldoxime compared to this enzyme (Table 2).
[0078]
(5) Influence of temperature and pH
The enzyme activity in the region of pH 4.0 to 11.0 was examined (FIG. 7). As a result, it was confirmed that the maximum activity was obtained at pH 5.5 (FIG. 7A), and otherwise high enzyme activity was obtained at pH 9.4 (FIG. 7B). This is a characteristic that is not observed with phenylacetoaldoxime dehydrase derived from Bacillus. Furthermore, the optimum temperature of the enzyme was confirmed to be 45 ° C.
[0079]
In addition, the stability of the enzyme at various temperatures and pH was investigated. For temperatures, 20 ° C, 100%; 25 ° C, 94%; 30 ° C, 91%; 35 ° C, 78%; 40 ° C, 51%; 45 ° C, 14%; 50 ° C, 3.2%. It was. On the other hand, for pH, citrate / sodium citrate (pH 4.4-6.5), calcium phosphate buffer (pH 6.7-7.9), Tris / HCl buffer (pH 7.9-8.8) and NH _Four Cl / NH _Four When tested using OH buffer (pH 8.9-10.4), the enzyme was most stable in the range of 6.0-8.0 and maintained 40% of the initial enzyme activity even at pH 10. .
[0080]
(6) Inhibitors of enzyme activity
The various compounds listed in Table 4 were examined for enzyme activity inhibitory effects.
[0081]
[Table 4]

[0082]
As a result, it was confirmed that the enzyme was very sensitive to silver nitrate. On the other hand, thiol reagents such as iodoacetic acid, N-ethylmaleimide, mercury p-chlorobenzoate, and 5,5′-dithiobis-2-nitrobenzoic acid showed little inhibitory effect. Enzymatic activity was completely inhibited by hydroxylamine. Furthermore, the enzyme was not sensitive to chelating agents such as EDTA and was hardly affected by serine modifying agents such as phenylmethanesulfonyl fluoride.
[0083]
(7) Spectral changes due to aldoxime
It was observed how the spectrum of the enzyme in the reduced state (final concentration mg / ml) changed with the addition of butylaldoxime (final concentration 50 mM).
[0084]
As shown in FIG. 8, a peak appeared at 416 nm as soon as butylaldoxime was added, but no peak appeared at 416 nm even when butyronitrile was added. This indicates that the substrate, aldoxime, acts on ferrophem (divalent iron) hem in the enzyme. As the enzyme reaction proceeds, the peak at 416 nm disappears, and after 10 minutes, the same spectrum as at the start appears. In this state, butyl aldoxime in the reaction solution is completely consumed, suggesting that the peak at 416 nm is derived from an intermediate in the butyronitrile synthesis reaction. Similar results were observed when acetoaldoxime was added as a substrate.
[0085]
From these results, it was confirmed that the heme molecule of this enzyme functions as an essential part of the catalytic action in the ferrofem (divalent iron) state.
[0086]
【The invention's effect】
The present invention provides a novel aldoxime dehydrase derived from a microorganism belonging to the genus Pseudomonas and its gene. By using the enzyme and its gene, a nitrile compound that is a starting material for amide synthesis can be produced under mild conditions.
[0087]
[Sequence Listing]

[0088]
[Sequence Listing Free Text]
SEQ ID NO: 3-description of artificial sequence: primer
SEQ ID NO: 4-description of artificial sequence: primer
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the aldoxime dehydrase gene of the present invention and the sequence in the vicinity thereof.
FIG. 2 compares the amino acid sequences of aldoxime dehydrase from Pseudomonas chlororaphis B23 and phenylacetoaldoxime dehydrase (OxB-1) from the genus Bacillus.
FIG. 3 is a photograph showing the results of SDS-PAGE of aldoxime dehydrase protein.
FIG. 4 shows the absorption spectrum of aldoxime dehydrase (final concentration 0.56 mg / ml).
4A: Solid line is purified enzyme, dashed line is Na ₂ S ₂ O _Four Enzyme after reduction, thin line is Na ₂ S ₂ O _Four The result of the enzyme which added CO after reduction | restoration is shown.
4B: Solid line is purified enzyme, broken line is K _Three [Fe (CN) ₆ ] Oxidized enzyme, thin line shows the result of enzyme added with KCN.
The inset on the top right is Na ₂ S ₂ O _Four From the result of enzyme with CO added after reduction, Na ₂ S ₂ O _Four The result of the enzyme after reduction is subtracted.
FIG. 5 shows the absorption spectrum of pyridine hemochrome, an aldoxime dehydrase.
FIG. 6 shows a Raman spectrum of aldoxime dehydrase (reduced state: final concentration 0.50 mg / ml) in the high frequency region.
FIG. 7 is a graph showing the effect of pH and temperature on aldoxime dehydrase activity.
7A: shows the result of reaction at 30 ° C. for 5 minutes. In the figure, ●: citric acid / sodium citrate, ◆: calcium phosphate, ■: Tris / HCl, ▲: NH _Four Cl / NH _Four OH.
7B: shows the result of reaction for 5 minutes at various temperatures.
FIG. 8 shows the results of changes in the absorption spectrum of aldoxime dehydrase by the addition of a substrate. Solid line is Na ₂ S ₂ O _Four The enzyme after reduction, the broken line shows the result immediately after the addition, and the thin line shows the result 10 minutes after the addition.
FIG. 9 is a diagram showing gene clusters acting on aldoxime metabolism and the corresponding metabolic pathways. B23 indicates the Pseudomonas chlororaphis B23 strain, OxB-1 indicates the Bacillus sp. OxB-1 strain, and Psyr indicates the P. syringae pv. Syringae B728a strain.

Claims

An aldoxime dehydrase protein composed of the following protein dimers (a) and / or (b):
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (b) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2

A method for producing a nitrile compound, wherein the enzyme protein according to claim 1 is allowed to act on an aldoxime compound to obtain a nitrile compound.

The method according to claim 2, wherein the enzyme protein is allowed to act on the aldoxime compound under pH 5 to 10, temperature 20 to 50 ° C., and anaerobic reduction conditions.

The method according to claim 2 or 3, wherein the aldoxime compound is an aliphatic aldoxime compound.